JP2004511803A - バニロイド受容体についての改良リガンド結合アッセイ - Google Patents
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Abstract
Description
(発明の背景)
本出願は、2000年10月16日に出願されかつ“Improved Ligand Binding Assays for Vanilloid Receptors(バニロイド受容体についての改良リガンド結合アッセイ)”と題された米国仮出願第60/240,628号明細書からの優先権を主張する。
【0002】
有害な化学的、熱的および機械的刺激は、知覚神経節(例えば後根、節状および三叉神経節)中の小径の知覚ニューロン(侵害受容器)の末梢神経末端を興奮させ、そして疼痛として認識されるシグナルを発する。これらのニューロンは、炎症もしくは虚血状態の間に細胞外間隙中で変化を生じさせる、有害なもしくは潜在的に有害な刺激(例えば熱)、局所組織アシドーシスにより引き起こされる組織損傷、および物理的動き(例えば組織伸長)の検出に決定的に重要である(WallとMelzack、1994)。
【0003】
「辛い」トウガラシ中の主刺激成分、カプサイシン(8−メチル−N−バニリル−6−ノネンアミド)およびその類似物は、バニロイド受容体と呼ばれる特定の膜認識部位で相互作用する。これらの受容体は侵害受容および神経因性炎症に関与する一次知覚ニューロンによりほとんど独占的に発現される(BevanとSzolcsanyi、1990)。カプサイシンは、薄くもしくは無鞘の侵害受容求心体(afferent)の非常に選択的な活性化物質である(Szolcsanyi、1993;Szolcsanyi、1996)。カプサイシンは選択的アンタゴニスト、カプサゼピンにより封鎖されることができる。別のリガンドは、ナノモル濃度の親和性でカプサイシン結合部位で結合する分子、強力な三環性ジテルペン、レシニフェラトキシン(RTX)(Szolcsanyiら、1991)である。
【0004】
最近、カプサイシンの1受容体(VR1)がラットからクローン化され(Caterinaら、1997)、そしてH+(低pH)および熱の同時検出体(coincidense detector)であることが示された(Tominagaら、1998)。VR1は後根神経節の小型の侵害受容ニューロン中で発現され、末梢疼痛の調節におけるその役割と矛盾しない(Tominagaら、1998)。VR1は、顕著な外への整流性を示すリガンド依存性の非選択的陽イオンチャンネルである(Caterinaら、1997)。バニロイド(「カプサイシン」)受容体VR1はカプサイシンおよびRTXにより活性化され、また、VR1の活性化はアンタゴニスト、カプサゼピン(CPZ);(Bevanら、1992)およびルテニウムレッド(RR;(Woodら、1998))により封鎖される。最近、ラットVR1およびVR2、ならびにヒト配列の部分的cDNA配列が、WIPO公開第WO 99/09140号明細書に開示された。
【0005】
VR1受容体の密度は、[3H]RTX結合アッセイ(SzallasiとBlumberg、1990;SzallasiとBlumberg、1993)を使用して試験することができる。事実、VR1受容体の高発現がラットおよびヒトの脊髄および後根神経節で観察された(Szallasiら、1993;SzallasiとGoso、1994;Acsら、1994)。プロトンはVR1受容体への[3H]RTX結合を阻害した(Szallasiら、1995)。
【0006】
VR−1受容体を使用する以前のリガンド結合アッセイは、pHが生理学的条件に近いはずであることを教示する。これらのアッセイにおいて、リガンド結合は、pH8.0およびpH9.0でそれぞれ50%および70%だけ低下された(SzallasiとBlumberg、1993)。
【0007】
(発明の要約)
当該技術分野で示唆されるものと対照的に、本発明は、バニロイド受容体のある種のリガンドの結合能力がpH7.4より大きいpH値で増大するという驚くべき発見を提供する。本発明は、約7.5〜10.0の範囲のpHの水性緩衝液中で結合する既知の放射標識リガンドおよび試験化合物の競争的バニロイド受容体結合を測定するための改良アッセイを提供する。本発明はまた、二価陽イオンもまたバニロイド受容体のある種のリガンドの結合能力を増大させるという発見も提供する。従って、本発明の方法に使用される水性溶液は、一成分として二価陽イオンを有利に包含してよい。
【0008】
本発明の方法はバニロイド受容体に結合する化合物を見出すのに有用である。
【0009】
(発明の詳細な記述)
カプサイシンは、式:
【0010】
【化1】
【0011】
の化合物である。
【0012】
カプサゼピンは、式:
【0013】
【化2】
【0014】
の化合物である。
【0015】
レシニフェラトキシンは、式:
【0016】
【化3】
【0017】
の化合物である。
【0018】
本発明は、段階
(a)約7.5ないし約10.0の範囲のpHを有する水性溶液中で、試験化合物、標識リガンドおよびバニロイド受容体タンパク質の少なくともリガンドと相互作用する部分を含んで成る液体組成物を形成すること;
(b)試験化合物および標識リガンドをバニロイド受容体と接触させるのに十分な時間の間、該溶液をインキュベートすること;
(c)タンパク質に結合された標識リガンドの量を測定すること;ならびに
(d)期待される標識リガンドの量の減少を観察することにより、試験化合物が受容体に結合したかどうか決定すること
を含んで成る、バニロイド受容体への化合物の結合を測定するための改良アッセイを提供する。
【0019】
該方法は、場合によっては、結合されない標識リガンド溶液からを除去する段階、およびまた場合によっては受容体タンパク質を単離する段階も包含することができる。
【0020】
本発明の水性溶液は、適するpHを提供するいかなる緩衝種より構成されてもよい。適するpHを提供する緩衝剤の選択は当該技術分野で公知である。本発明の方法に適するpHは、約7.5ないし約10.0の範囲、好ましくは約pH8.0から約9.5まで、より好ましくは約pH8.1から約9.1まで、そしてとりわけ約pH8.6である。
【0021】
本発明の方法に使用することができる、当該技術分野で公知の多様な緩衝剤が存在する。好ましい緩衝剤は、約7.55のpkaをもつHEPES(N−[2−ヒドロキシエチル]ピペラジン−N’−2−エタンスルホン酸である。他の緩衝剤は、限定されるものでないがMES(モルホリノエタンスルホン酸、pka約6.2);MOPS(モルホリノプロパンスルホン酸、pka約7.2);PIPES(ピペラジン−N,N’−ビス(2−エタンスルホン酸、pka約6.8);およびTES(N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−2−アミノエタンスルホン酸、pka約7.5)を挙げることができる。
【0022】
該溶液は、溶液を含有する容器の表面上へのタンパク質吸着を最小限にする作用物質を含有してよい。こうした作用物質は公知であり、かつ、例えばウシ血清アルブミンもしくは免疫グロブリンのようなタンパク質、またはグリシンのようなアミノ酸を包含する。
【0023】
有利には、該溶液は二価陽イオンを含有してよい。二価陽イオンの使用は、バニロイド受容体とのリガンド相互作用を高めるためにここで立証されている。とりわけ好ましい二価陽イオンはマグネシウムおよびカルシウムである。他の二価陽イオンを、過度の実験なしにこれらのアッセイで試験かつ使用することができる。二価陽イオンは、好ましくは約0.1mMないし約10mMの範囲の濃度で使用する。EDTAもしくはEGTAのような二価陽イオンをキレート化する作用物質は、好ましくは該水性溶液中で使用しない。
【0024】
「試験化合物」という用語は、標識リガンドおよびバニロイド受容体のリガンドと相互作用する部分の結合を妨害する潜在的能力を有する候補分子を指すのに本明細書で使用する。
【0025】
本発明のアッセイに関連して本明細書で使用されるところの「標識リガンド」という用語は、限定されるものでないが蛍光分子もしくは放射活性標識を挙げることができる検出可能な標識を有するバニロイド受容体タンパク質に結合することが既知のリガンドである。本発明での使用に適する蛍光分子の例は、限定されるものでないが、クマリン、フルオレセインのようなキサンテン色素、ロドールおよびローダミン、レソルフィン、シアニン色素ビマン、アクリジン、イソインドール、ダンシル色素、ルミノールおよびイソルミノール誘導体のようなアミノフタル酸ヒドラジド、アミノフタルイミド、アミノナフタルイミド、アミノベンゾフラン、アミノキノリン、ジカノヒドロキノン(dicanohydroquinones)、ならびにユーロピウムおよびテルビウム錯体、ならびに関連化合物を挙げることができる。リガンドを標識するのに使用される放射活性標識の型は、[3H]、[14C]、[35S]、[33P]、[32P]、[125I]および[131I]を包含する多様な既知のβ−粒子放射体もしくはオージェ電子のいずれかを包含し、[3H]がその相対的安全性のため一般に好ましい。本発明の最も好ましい一態様において、使用される標識リガンドの濃度は、その受容体に対する天然のリガンドの親和性(Kd)に緊密に合致される。好ましい一標識リガンドは、レシニフェラトキシンもしくはRTXであり、そのトリチウム化された形態は公知である。
【0026】
「バニロイド受容体タンパク質のリガンドと相互作用する部分」という用語は、該アッセイで使用されているリガンドと相互作用するバニロイド受容体タンパク質の領域(1個もしくは複数)を指す。タンパク質は、典型的には、膜貫通領域、1個もしくはそれ以上の結合ドメイン、細胞内領域、細胞外領域、特定のフォールディングの特徴を包含する領域などを包含する機能領域に分割される。当業者は、これらの機能領域を定義するのに使用することができる、短縮されたフラグメント、変えられた配列をもつ受容体タンパク質、およびキメラタンパク質を創製することが可能である。この場合、該アッセイは、該アッセイで使用されるリガンドに結合するバニロイド受容体の少なくともその部分を組み込むことを企図している。
【0027】
本発明の方法に適するバニロイド受容体は、いずれかの哺乳動物、とりわけヒト、マウス、ラットおよびサル由来の受容体を包含する。多様なバニロイド受容体タンパク質をコードするいくつかの別個の遺伝子が存在する。それらの多数が本明細書で引用される刊行物で言及されている。好ましいバニロイド受容体は、限定されるものでないがVR−1を挙げることができる、レシニフェラトキシンを結合するものを包含する。VR−1受容体はヒトVR−1配列(ジェンバンク(GenBank)受託番号NM_018727として提供されるような)を使用することを包含する当該技術分野で公知の方法を使用して得てよい。
【0028】
バニロイド受容体は多数の供給源から得ることができる。一例において、バニロイド受容体は、限定されるものでないが、SzallasiとBlumberg、1993により記述されたようなバニロイド受容体を発現する後根神経節を挙げることができる天然の細胞から単離される。別の態様において、バニロイド受容体は、組換えバニロイド受容体をコードするcDNAを発現する細胞から得られる。好ましくは、バニロイド受容体タンパク質の少なくともリガンドと相互作用する部分を使用する。しかしながら、タンパク質全体を使用してよいか、もしくは、受容体タンパク質のリガンドと相互作用する部分を他のタンパク質の他の部分、例えば他のタンパク質からの1種もしくはそれ以上の膜結合ドメインと組合せてよい。これらのキメラタンパク質は、それでもなおバニロイド受容体タンパク質のリガンド結合特性を保持する。
【0029】
段階(a)の水性溶液の形成後に、リガンドおよびバニロイド受容体、もしくは試験化合物およびバニロイド受容体を接触させるのに十分な時間の間、該溶液をインキュベートする。適するインキュベーション時間の決定方法は、本明細書に記述されるところの実施例を使用して決定することができる。
【0030】
次に、好ましい一態様においては、結合されない標識リガンドを溶液から除去する。溶液からの結合されない標識リガンドの除去方法は、適する吸着戦略、バニロイド受容体タンパク質が膜結合型である場合は膜分離技術のような当該技術分野で既知の多様な技術のいずれかを使用して、もしくはα1酸糖タンパク質のような分子の使用などにより実施することができる。
【0031】
本発明のアッセイのさらなる一段階においては、受容体タンパク質を水性溶液から単離する。一態様において、バニロイド受容体タンパク質のリガンド結合ドメインは、細胞膜もしくは人工的膜調製物のような膜と会合する。別の態様においては、バニロイド受容体を可溶性タンパク質として創製する。膜の除去方法もしくは受容体タンパク質の単離方法は当該技術分野で既知であり、そして例えば選択的遠心分離法、吸着段階、カラムクロマトグラフィー、抗体に媒介される沈殿などを包含する。
【0032】
好ましくは、本発明のアッセイ方法は順序正しく実施するが、しかしながら、当業者は、一例として除去段階および単離段階を一段階として組合せてよいか、もしくは標識された受容体タンパク質からの結合されない標識の除去を助長するいずれかの適する順序で実施してよいことを理解するであろう。従って、一アッセイにおいて、除去段階を単離段階の前に実施してよい一方、別のアッセイにおいては、単離段階および除去段階が単一段階として組合せられる場合にアッセイの形式がより良好に実施されるかもしれな。
【0033】
本発明のアッセイにおける最終段階として、試験化合物がバニロイド受容体のリガンドと相互作用する部分に結合したかどうかを決定するために、適切な対照などを使用して適する計算および比較がなされる。好ましい一例においては、適する対照が、試験化合物を包含しないアッセイに包含され、そして試験化合物を包含しない対照と試験化合物を包含するサンプルとの間の比較を可能にする。期待される標識リガンドの量の減少が試験化合物の結合を暗示する。
【0034】
本発明の好ましい一アッセイにおいては、バニロイド受容体タンパク質のリガンドと相互作用する部分が細胞膜と会合され、そして受容体タンパク質を単離する段階は水性溶液から膜を除去することを含んで成る。
【0035】
本発明は以下の実施例によってより良好に理解することができる。これらの例は好ましい態様の代表であるが、しかし、本発明の範囲を制限するとして解釈されるべきでない。
【0036】
実施例1
材料
レシニフェラトキシン、カプサイシンおよびカプサゼピンはリサーチ バイオケミカル インターナショナル(Research Biochemical International)(マサチューセッツ州ナティック)から購入した。HEPESおよびCASPOはシグマ(Sigma)(ミズーリ州セントルイス)から購入した。[3H]レシニフェラトキシン(RTX)はNEN(マサチューセッツ州ボストン)から購入した。HEK293細胞はヒトバニロイド受容体(VR1)でトランスフェクトした。
方法
細胞培養。HEK293細胞は、37℃で5%CO2の雰囲気を含むインキュベータ中、10%ウシ胎児血清および1×PSA(カスケード バイオロジックス(Cascade Biologics))を含有するDMEM(ギブコ(GIBCO))中で単層として成長させた。HEK293−hVR1細胞は200μg/mlのゼオシン(インヴィトロジェン(Invitrogen))を含有する同一培地中で成長させた。
膜調製。細胞をハンクス液で洗浄し、解離緩衝液(シグマ(Sigma))で解離させ、そしてその後1000×gで5分間遠心分離した。細胞ペレットを、5.8mM NaCl、320mMショ糖、2mM MgCl2、0.75 CaCl2および5mM KClを含有する冷20mM HEPES緩衝液、pH7.4中でホモジェナイズし、そして1000×gで15分間遠心分離した。その後、結果として生じる上清を4000×gで15分間遠心分離した。ペレットにされた膜は−80℃の冷凍庫中に保った。
[3H]RTX結合アッセイ。アッセイ手順は以前に記述された(SzallasiとBlumberg、1993)ものから改変した。膜からの約120μgタンパク質/mlを、0.25mg/mlの脂肪酸を含まないウシ血清アルブミンを含有する0.5mlのHEPES緩衝液(pH4.1ないしpH8.6)もしくはCASPO緩衝液(pH8.6ないしpH10.6)中で、示された濃度の[3H]RTXとともに37℃で60分間インキュベートした。その後、反応混合物を4℃に冷却し、そして0.1mgのα1−酸糖タンパク質を各サンプルに添加し、そして4℃で15分間インキュベートした。サンプルを18500×gで15分間遠心分離した。ペレットを含有する微小遠心管の先端を切り離した。非特異的結合は200nMの未標識RTXの存在下で試験した。結合された放射活性はシンチレーション計数により定量した。
結果
hVR1受容体への[3H]RTX結合に対するpHの影響。プロトンはVR1受容体を介するカルシウム流入を刺激することが既知である。プロトンが[3H]RTX結合に影響を及ぼすかどうかを研究するため、膜を、4.2から10.6までの多様なpH値で[3H]RTXとともにインキュベートした。結果は二相性の影響を示した(図1)。[3H]RTX結合はpH4.2からpH8.6までで増大したが、しかしpH8.6からpH10.6まで減少した。非特異的結合は有意に変化しなかった。
[3H]RTX結合に影響を及ぼすpHの機構。観察されたpH変化が結合親和性もしくは結合部位の見かけの密度の変化から生じたかどうかを検討するため、われわれは、pH5.2、pH7.4、pH8.6およびpH9.6で[3H]RTXの飽和結合を実施した(図2)。データは各点を二重でアッセイした2回の実験の代表である。該結果は、hVR1受容体に対する[3H]RTXの親和性(Kd値)が、結合部位の数(Bmax)の変化を伴わずに5.2から8.6までの増大するpHとともに増大した一方、親和性は、結合部位の数の減少を伴い8.6から9.6までの増大するpHをとともに減少したことを立証した。
【0037】
[3H]RTXのKd値およびBmax値を表1に要約する。
【0038】
【表1】
【0039】
KdおよびBmax値は図2から得た。ND:決定可能でない。
hVR1受容体へのバニロイドリガンドの結合に対するpHの影響。多数のバニロイドリガンドを、pH7.4およびpH8.6の緩衝液中でのhVR1受容体への[3H]RTXの結合を阻害するそれらの能力について試験した。pH7.4の緩衝液中で、[3H]RTXについての競争は、順序:RTX>>カプサイシン=カプサゼピンにあった(図3a)。同様に、pH8.6の緩衝液中では、[3H]RTXについての競争は、順序:RTX>>カプサイシン>カプサゼピンであった(図3b)。RTXおよびカプサイシンのIC50値はpH7.4からpH8.6までわずかに減少した(表2)。カプサゼピンのIC50値はpH7.4からpH8.6まで有意に増大した(表2)。黄色が、pH8.6のカプサゼピンからの膜ペレット中で見られ、カプサゼピンがその二重(double)フェノール構造から二重キノール構造まで酸化されたかもしれないことを示唆する。
【0040】
【表2】
【0041】
IC50値は図3から得た。
[3H]RTX結合に対するカルシウムおよびマグネシウムの影響。アッセイへのカルシウムおよびマグネシウムの添加は結合を増大させることが見出され、そしてアッセイをさらに至適化するのに使用した。結合アッセイを、二価陽イオンの包含もしくはキレート化を伴い、pH8.0の緩衝液を使用して以前に記述されたとおり実施した。図4に見られるとおり、0.75mM CaCl2もしくは2mM MgCl2のいずれかの存在は、非特異的リガンド結合を増大させることなく、二価陽イオンを欠く緩衝液に比較して総リガンド結合を増大させた。双方の陽イオンの存在はリガンド結合を増大させた。対照的に、二価陽イオンキレート化剤EGTAの存在は、リガンド結合の総量を減少させた。
【0042】
当業者に明白であろう開示された発明の多様な改変、改良および応用が存在することができ、また、本開示はこうした態様を包括することを意図している。本発明はある好ましい態様の情況で記述されたとは言え、該開示の完全な範囲は以下の請求の範囲への参照により判断されることを意図している。
【0043】
【表3】
【0044】
【表4】
【図面の簡単な説明】
【図1】
発明にかかる、hVR1受容体への[3H]RTX結合に対するpHの影響。細胞膜(60μgタンパク質/ml)を、異なるpHをもつ緩衝液サンプル中で[3H]RTX(0.4nM)とともに25℃で60分間インキュベートした。結果は、各点を三重でアッセイした2回の実験の代表である。
【図2】
発明にかかる、pHはhVR1受容体への[3H]RTXの親和性を変える。図2A 細胞膜(60μgタンパク質/ml)を、異なるpHをもつ緩衝液サンプル中で、変動する濃度の[3H]RTXとともに25℃で60分間インキュベートした。(pH5.2、pH7.4およびpH8.6)
図2B:細胞膜(60μgタンパク質/ml)を、異なるpHをもつ緩衝液サンプル中で、変動する濃度の[3H]RTXとともに25℃で60分間インキュベートした。(pH7.4、pH8.6およびpH9.6)。
【図3】
発明にかかる、pH7.4およびpH8.6でのhVR1受容体への[3H]RTX結合に対するバニロイド類似物の影響。膜を、[3H]RTX(0.4nM)および変動する濃度のバニロイド類似物とともに37℃で60分間インキュベートした。データは各点を二重でアッセイした2回の実験の代表である。結果は、この研究で使用されたバニロイド類似物が、pH7.4(図3A)およびpH8.6(図3B)双方で[3H]RTX結合を用量依存的に阻害したことを立証する。RTXおよびカプサイシンのEC50値はpH7.4からpH8.6までわずかに減少した。対照的に、カプサゼピンのEC50値は有意に増大した。
【図4】
発明にかかる、カルシウムおよびマグネシウムは[3H]RTX結合を増大させた。膜をpH8で[3H]RTX(0.25nM)とともにインキュベートした。カルシウムおよびマグネシウムなしではシグナルが20%だけ低下した。EGTA(10mM)は[3H]RTX結合を70%だけ阻害した。
Claims (18)
- (a)約7.5ないし約10.0の範囲のpHを有する水性溶液中で、試験化合物、標識リガンドおよびバニロイド受容体タンパク質の少なくともリガンドと相互作用する部分を含んで成る液体組成物を形成すること;
(b)試験化合物および標識リガンドをバニロイド受容体と接触させるのに十分な時間の間、該溶液をインキュベートすること;
(c)タンパク質に結合された標識リガンドの量を測定すること;ならびに
(d)期待される標識リガンドの量の減少を観察することにより、試験化合物が受容体に結合したかどうかを決定すること
の段階を含んで成る、バニロイド受容体へのリガンド結合の測定方法。 - バニロイド受容体タンパク質のリガンドと相互作用する部分が、無傷のバニロイド受容体タンパク質である、請求項2記載の方法。
- バニロイド受容体がヒトバニロイド受容体である、請求項1記載の方法。
- pHが約8.0ないし約9.5の範囲にある、請求項1記載の方法。
- pHが約8.1ないし約9.1の範囲にある、請求項1記載の方法。
- 標識リガンドが放射標識リガンドである、請求項1記載の方法。
- 放射標識リガンドがトリチウム化レシニフェラトキシンである、請求項6記載の方法。
- 結合されない標識リガンドを溶液から除去すること;および受容体タンパク質を単離すること
の、インキュベート段階後の段階を付加的に含んで成る、請求項1記載の方法。 - 水性緩衝液が、
(a)約1ないし約5mMの間の最終濃度のマグネシウム;および
(b)約0.1mMないし約2mMの最終濃度のカルシウム
よりなる群から選択される二価陽イオンをさらに含んで成る、請求項1記載の方法。 - マグネシウム濃度が約2mMである、請求項9記載の方法。
- カルシウム濃度が約0.8mMである、請求項9記載の方法。
- バニロイド受容体がヒトバニロイド受容体である、請求項9記載の方法。
- 除去段階が、十分な量のα1酸糖タンパク質を水性溶液に添加して結合されない標識リガンドを吸着させることを含んで成る、請求項1記載の方法。
- 段階が順序正しく実施される、請求項1記載の方法。
- 単離段階が除去段階の前に実施される、請求項9記載の方法。
- 正しい順序の段階
(a)約7.5ないし約10.0の範囲のpHを有する水性溶液中で、試験化合物、標識リガンドおよびバニロイド受容体タンパク質(前記タンパク質は細胞膜の一部と会合される)を組合せること;
(b)試験化合物およびリガンドがバニロイド受容体と接触するのに十分な時間の間、該溶液をインキュベートすること;
(c)十分な量のα1糖タンパク質を該溶液に添加して結合されない標識リガンドを吸着させること;
(d)水性溶液から膜を単離すること;
(e)膜中のタンパク質に結合された標識リガンドの量を測定すること;ならびに
(f)期待される標識リガンドの量の減少を観察することにより、試験化合物が受容体に結合したかどうかを決定すること
を含んで成る、バニロイド受容体へのリガンド結合の測定方法。 - 正しい順序の段階
(a)約8.6のpHを有する水性溶液中で、試験化合物、放射標識レシニフェラトキシンおよびヒトバニロイド受容体−1(VR1)タンパク質(前記タンパク質は細胞膜の一部である)を組合せること;
(b)試験化合物およびレシニフェラトキシンがバニロイド受容体と接触するのに十分な時間の間、該溶液をインキュベートすること;
(c)十分な量のα1酸糖タンパク質を該溶液に添加して結合されないレシニフェラトキシンを吸着させること;
(d)膜を水性溶液から単離すること;
(e)膜中のタンパク質に結合されたレシニフェラトキシンの量を測定すること;ならびに
(f)期待されるレシニフェラトキシンの量の減少を観察することにより、試験化合物が受容体に結合したかどうかを決定すること
を含んで成る、バニロイド受容体への化合物の結合の測定方法。 - 緩衝液が、
(a)約2mMの最終濃度のマグネシウム;および
(b)約0.8mMの最終濃度のカルシウム
よりなる群から選択される二価陽イオンもまた含有する、請求項17記載の方法。
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