JP2004509640A - Pde7活性を示すポリペプチドおよびpde7酵素活性を阻害する化合物を選択するためのその使用 - Google Patents

Pde7活性を示すポリペプチドおよびpde7酵素活性を阻害する化合物を選択するためのその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2004509640A
JP2004509640A JP2002530718A JP2002530718A JP2004509640A JP 2004509640 A JP2004509640 A JP 2004509640A JP 2002530718 A JP2002530718 A JP 2002530718A JP 2002530718 A JP2002530718 A JP 2002530718A JP 2004509640 A JP2004509640 A JP 2004509640A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
polypeptide
pde7
amino acid
activity
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Abandoned
Application number
JP2002530718A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2004509640A5 (ja
Inventor
パトリシア・スーラール
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Warner Lambert Co LLC
Original Assignee
Warner Lambert Co LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Warner Lambert Co LLC filed Critical Warner Lambert Co LLC
Publication of JP2004509640A publication Critical patent/JP2004509640A/ja
Publication of JP2004509640A5 publication Critical patent/JP2004509640A5/ja
Abandoned legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/16Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00Drugs for disorders of the respiratory system
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06Antiasthmatics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • A61P35/04Antineoplastic agents specific for metastasis
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02Immunomodulators
    • A61P37/04Immunostimulants
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02Immunomodulators
    • A61P37/06Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01KANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00Genetically modified animals
    • A01K2217/07Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本発明は内因性完全長PDE7よりも高いPDE7ホスホジエステラーゼ活性を示すポリペプチドおよびPDE7酵素活性を阻害する化合物を選択するためのその使用に関する。

Description

【0001】
【技術分野】
本発明はホスホジエステラーゼ7(PDE7)活性を示す新規ポリペプチドに関する。これらの新規ポリペプチドはPDE7阻害剤のスクリーニングのために有用である。
【0002】
【背景技術】
環状cAMPがシグナル伝達経路において重要な役割を有し、cAMP依存性蛋白質キナーゼのファミリーを活性化する遍在性の第二メッセンジャーである。細胞内cAMP濃度は、この第二メッセンジャーをその不活性代謝産物である5′AMPに分解することが主な機能であるホスホジエステラーゼ(PDE)として知られている酵素のスーパーファミリーにより調節される。従って、これらの酵素の活性はホルモンおよび神経伝達物質のような種々の細胞外物質に対する細胞の機能的応答を調節する際に重要である。PDEは、特に基質cAMPおよびcGMPに対するその構造、組織発現、局在化およびPDE阻害剤に対する感受性により特徴付けられる11のファミリーに分けられる酵素の複雑な群を構成する。
【0003】
これらのファミリーの4種の酵素、即ち、PDE3、PDE4、PDE7およびPDE8はcAMPに対して高度に選択的であり、そして、最も生理学的に関連性の高いcAMP代謝酵素であると考えられる。
【0004】
PDE4およびPDE3の触媒特性並びにこれらの調節は広範に研究されている。しかしながら、より最近発見されたPDE7Aに関してはほとんど知られていない。この酵素はcAMPに対するその特異性、その基質に対する高い親和性、そしてPDE4およびPDE3とは異なるその薬物動態および薬理学的特性により特徴付けられる。
【0005】
PDE7Aには2種のスプライス変異体、即ちPDE7A1(Michaeli et al. 1993)およびPDE7A2(Bloom T.J.and Beavo J.A.et al. 1996)が存在し、そして相当する蛋白質はそのアミノ末端配列が異なるのみである。PDE7A1は55〜57kDaの蛋白質であり、そして主に可溶性細胞画分中に局在する。PDE7A2は疎水性のN末端を有する53kDaの蛋白質であり、細胞の粒子/膜画分にのみ存在する。
【0006】
【発明の開示】
本発明はPDE7の触媒活性を驚くべきことに保持しており、そして、内因性の完全長PDE7A1およびPDE7A2蛋白質の活性よりも高い活性を示す完全長PDE7Aに由来するポリペプチドを始めて提供する。
より詳しくは、本発明は内因性の完全長PDE7A1およびPDE7A2蛋白の活性よりも高い活性を意外にも示す完全長PDE7Aに由来するポリペプチドを始めて提供する。
【0007】
本発明はまたPDE7A酵素の触媒部位の局在化を始めて示す。
本発明はまた、完全長PDE7酵素の触媒活性を制御または制限すると考えられる、PDE7、特にPDE7Aにおける調節ドメイン、特に阻害ドメインの存在を始めて同定している。実際、本発明者等はこの調節ドメインの欠失により、得られるトランケートされたPDE7A酵素の酵素活性が有意に改善されることを明らかにした。
【0008】
PDE7(A)内のこの阻害/調節ドメインの存在を認識することは、この阻害ドメインの影響をブロックするか低減することによりPDE7(A)の触媒活性を改善できるという可能性をもたらす。特に、本発明は完全長PDE7の触媒活性を調節するのに必須であるPDE7(A)阻害ドメインの一部を含まないPDE7(A)の突然変異体を包含する。これらの突然変異体は完全長PDE7(A)と比較して進歩したPDE触媒活性を示す。
【0009】
本発明は、
PDE7の触媒ドメインを少なくとも有する、内因性完全長PDE7蛋白質のホスホジエステラーゼ触媒活性より少なくとも約6倍、好ましくは約8または10倍、最も好ましくは15〜20倍高値のホスホジエステラーゼ触媒活性を保有するポリペプチド;
最初のATGコドンから残基81(L22M2)までの配列の逐次的欠失により発生するHCP1のNH末端欠失よりなる配列としてミカエリ等(1993)により開示されたアミノ酸配列を例外としてPDE7の触媒ドメインを少なくとも有する、内因性完全長PDE7蛋白質のホスホジエステラーゼ触媒活性より少なくとも約6倍、好ましくは約8または10倍、最も好ましくは15〜20倍高値のホスホジエステラーゼ触媒活性を保有するポリペプチド;
である。
【0010】
本発明はまた、ホスホジエステラーゼ7触媒ドメインを保有し、そして配列番号1、2または3のアミノ酸配列よりなる群から選択される配列の連続するアミノ酸少なくとも312個を有する、約427アミノ酸長までの前述のポリペプチド;またはその相同ポリペプチドに関する。
【0011】
該ポリペプチドは、配列番号1、2または3の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64位に位置するアミノ酸残基から始まり、
配列番号1、2または3の375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427位に位置するアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列;またはその相同ポリペプチドを有する。
【0012】
配列番号1、2または3の5位のアミノ酸残基で始まり、427位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有するポリペプチド;および/または、配列番号1、2または3の25位のアミノ酸残基で始まり、427位のアミノ酸残基で終わるもの;および/または配列番号1、2または3の45位のアミノ酸残基で始まり、394位のアミノ酸残基で終わるもの;および/または配列番号1、2または3の45位のアミノ酸残基で始まり、427位のアミノ酸残基で終わるものが好ましい。
【0013】
配列番号1、2または3の45位のアミノ酸残基で始まり、394位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有するポリペプチド;および配列番号1、2または3の45位のアミノ酸残基で始まり、427位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有するポリペプチドが最も好ましい。
【0014】
本発明はまた、前述したポリペプチドと少なくとも80%の相同性または同一性、好ましくは85%の相同性または同一性を有するポリペプチドにも関する。
より好ましくは、本発明は前述したポリペプチドと少なくとも90%の相同性または同一性、好ましくは95%の相同性または同一性、最も好ましくは99%の相同性または同一性を有するポリペプチドに関する。
【0015】
本発明の別の要件は前述したポリペプチドをコードする核酸配列またはそれに相補的な配列である。
本発明の別の特徴は配列番号4、5または6の核酸配列よりなる群から選択される核酸配列;またはそれに相補的な配列である。
これに加えて、前述したポリペプチドをコードする核酸の一部が欠失しているPDE7ホスホジエステラーゼをコードするゲノムポリヌクレオチドを有する核酸配列もまた本発明に含まれる。
【0016】
1つの実施態様において、本発明は前述した核酸配列の欠失の後に残存する完全長PDE7の配列の部分を有する核酸配列に関する。
好ましい実施態様において、完全長PDE7はゲノム起源である。
該核酸の欠失した核酸部分は、異種ポリヌクレオチド配列により起きかえられる。
該核酸において、ゲノムポリヌクレオチドが哺乳類PDE7ホスホジエステラーゼ、好ましくはヒト、マウスまたはラットのホスホジエステラーゼ、最も好ましくはヒトのPDE7ホスホジエステラーゼである。
該核酸において、異種ポリヌクレオチドは選択マーカーを有する。
【0017】
該核酸において、異種ポリヌクレオチドはその5′末端に少なくともloxP配列およびその3′末端に少なくともloxP配列を有する。
該核酸において、前述したポリペプチドをコードする核酸配列は、好ましくは誘導性プロモーターであり、最も好ましくはポナステロンのようなインデューサーにより誘導可能なプロモーターである調節配列に作動可能に連結している。
本発明はまた前述した核酸を有する組み換えベクター、並びに、該核酸を有する組み換え宿主細胞に関する。
組み換え宿主細胞は組み換えベクターを有してよい。
【0018】
該組み換え宿主細胞は真核生物であり、そして、接合体、胚、胎仔または成体の多能性幹細胞、哺乳類の分割球または胚盤胞に由来する組み換え宿主細胞およびES細胞よりなる組み換え宿主細胞の群から選択される。
【0019】
本発明の別の特徴は、前述したポリペプチドの製造方法であって下記工程:
a)前述の組み換え宿主細胞を適切な培地中で培養すること、
b)このようにコンディショニングされた培地を採取すること、または、組み換え宿主細胞を溶解すること;
c)該培地から、または、得られた細胞溶解物から、上記のとおり製造されたポリペプチドを分離または精製すること、
を有する上記方法である。
【0020】
本発明はまた、PDE7ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニング方法であって、該方法は下記工程:
a)前述のポリペプチドの所望の量を準備すること;
b)工程a)において準備したポリペプチドの所望の量を試験すべき候補化合物の所望の量を含有する緩衝溶液に添加すること;
c)ホスホジエステラーゼ酵素活性を測定すること;および、
d)工程c)で得られた測定された酵素活性を候補化合物の非存在下に得られた酵素活性と比較すること;
を包含する上記方法である。
【0021】
該方法において、工程a)で準備したポリペプチドは、配列番号1の45位のアミノ酸残基で始まり、427位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列またはその相同ポリペプチドよりなる。
該方法において、ポリペプチドは前述した核酸により、または、前述した組み換えベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞の細胞溶解物に由来する。
該方法において、ホスホジエステラーゼ触媒活性はcAMPの加水分解の水準として測定される。
【0022】
PDE7ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニング方法も本発明に包含され、該方法は下記工程:
a)適切な培地中で前述した組み換え宿主細胞を培養すること;
b)試験すべき候補化合物の所望の濃度を該培地に添加すること;
c)細胞内ホスホジエステラーゼ酵素活性を測定すること;および、
d)工程c)で得られた酵素活性を工程b)を省略した場合に得られる酵素活性と比較すること;
を包含する。
【0023】
該方法において、組み換え宿主細胞は2量体エクジソン受容体を発現するCHO細胞系統よりなる。
該方法において、誘導性調節配列に作動可能に連結した前述したポリペプチドをコードする核酸を有する組み換えベクターで組み換え宿主細胞はトランスフェクトされており、好ましくは調節配列はポナステロンのようなインデューサーにより誘導可能である。
【0024】
該方法において、工程b)の前に、組み換え宿主細胞を、工程a)の間に誘導性調節配列を活性化するインデューサーの存在下に培養する。
該方法において、アデニル酸シクラーゼ活性化物質を工程b)の終了時、停止溶液の添加前に添加する。
該方法において、工程b)の間に生成した細胞内cAMPの量の測定を介して細胞溶解後にホスホジエステラーゼ酵素活性を測定する。
【0025】
本発明はまた、PDE7活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニング方法を包含し、該方法は下記工程:
a)適切な培地中に本発明のポリペプチドおよびレポーター遺伝子を同時発現する組み換え宿主細胞を準備すること;
b)試験すべき候補化合物の所望の濃度を該培地に添加すること;
c)レポーター遺伝子発現を測定すること;および、
d)工程c)で得られた酵素活性を工程b)を省略した場合に得られる酵素活性と比較すること;
を包含する。
【0026】
該方法において、組み換え宿主細胞は2量体エクジソン受容体を発現するCHO細胞系統よりなる。
該方法において、誘導性調節配列に作動可能に連結した前述のポリペプチドをコードする核酸を有する組み換えベクターで組み換え宿主細胞はトランスフェクトされている。
該方法において、調節配列はポナステロンのようなインデューサーにより誘導可能である。
【0027】
該方法において、工程b)の前に、組み換え宿主細胞は、工程a)の間に誘導性調節配列を活性化するインデューサーの存在下に培養される。
該方法において、アデニル酸シクラーゼ活性化物質は、工程b)の終了時、停止溶液の添加前に添加される。
該方法において、レポーター遺伝子はβ−ラクタマーゼ遺伝子である。
一般的に工程a)で培養される宿主細胞は前述した如何なる培養可能な宿主細胞であってもよく、そして好ましくは、哺乳類起源の宿主細胞である。
【0028】
本発明の別の特徴は、PDE7ホスホジエステラーゼ触媒活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニングのためのキットであり、該キットは下記成分:
a)前述のポリペプチド;
b)場合により、ホスホジエステラーゼ触媒活性測定を行なうために必要な試薬;
を包含する。
【0029】
本発明の別の実施態様は、PDE7ホスホジエステラーゼ触媒活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニングのためのキットであり、該キットは下記成分:
a)前述の組み換え宿主細胞;
b)場合により、ホスホジエステラーゼ触媒活性測定を行なうために必要な試薬;
を包含する。
【0030】
本発明の更に別の実施態様は、PDE7ホスホジエステラーゼ触媒活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニングのためのキットであり、該キットは下記成分:
a)前述のポリペプチドおよびレポーター遺伝子を同時発現する組み換え宿主細胞;
b)場合により、レポーター遺伝子発現測定を行なうために必要な試薬;
を包含する。
【0031】
本発明の別の特徴は、PDE7ホスホジエステラーゼ触媒活性を阻害する化合物をインビトロで選択するための方法であり、該方法は下記工程:
a)候補化合物を用いて前述の方法の1つを実施すること;および、該候補化合物がホスホジエステラーゼ活性を阻害することがわかった場合は、次に、
b)工程a)で選択された阻害剤化合物を用いて使用した方法とは異なる本発明の別の方法を実施すること;
を包含する。
【0032】
本発明の更に別の特徴は、PDE7ホスホジエステラーゼ触媒活性を阻害する化合物をインビトロで選択するための方法であり、該方法は下記工程:
a)前述の方法を実施することによりPDE7ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物を選択すること;および、
b)PDE7以外のPDE酵素少なくとも1つのホスホジエステラーゼ活性を阻害する能力がないことを、選択された阻害剤化合物について調べること;
を包含する。
【0033】
該方法において、PDE3およびPDE4酵素のホスホジエステラーゼ活性を阻害する能力がないことを選択された阻害剤について調べ、そして、好ましくは該方法において、PDE1、PDE2、PDE3、PDE4、PDE5およびPDE6酵素のホスホジエステラーゼ活性を阻害する能力がないことを、選択された阻害剤について調べる。
【0034】
本発明はまた前述の方法に従って選択されたホスホジエステラーゼ阻害剤に関する。
本発明はまた、医薬組成物の製造のための前述の方法に従って選択されたホスホジエステラーゼ阻害剤化合物の使用に関する。
本発明はまた、前述の核酸の欠失の後に残存する完全長PDE7の部分を伴った配列を有するポリヌクレオチド構築物を有するベクターの使用により発生したノックアウト動物であって、該構築物が即ちこの動物のゲノム内の天然のPDE7配列の部分を置き換えている。
好ましくは、該ノックアウト動物は哺乳類起源である。
より好ましくは、該ノックアウト動物はネズミまたはラット起源である。
より好ましくは、該ノックアウト動物はネズミ起源である。
【0035】
本発明はまた下記特徴:
1)最初のATGコドンから残基81(L22M2)までの配列の逐次的欠失により発生するHCP1のNH末端欠失よりなる配列としてミカエリ等(Michaeli et al.,1993,J.Biol.Chem.,268,12925−12932)により開示されたアミノ酸配列を例外としてPDE7の触媒ドメインを少なくとも有する、内因性の完全長PDE7蛋白質のホスホジエステラーゼ触媒活性より少なくとも約6倍、好ましくは約8または10倍、最も好ましくは15〜20倍高値のホスホジエステラーゼ触媒活性を保有するポリペプチド;
【0036】
2)ホスホジエステラーゼ7触媒ドメインを保有し、そして、配列番号1、2または3のアミノ酸配列よりなる群から選択される配列の連続するアミノ酸少なくとも312個を有する、約427アミノ酸長までの上記1)記載のポリペプチド;またはその相同ポリペプチド;
【0037】
3)配列番号1、2または3の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64位に位置するアミノ酸残基から始まり、
【0038】
配列番号1、2または3の375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427位に位置するアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する上記2記載のポリペプチド;またはその相同ポリペプチド;
【0039】
4)配列番号1、2または3の5位のアミノ酸残基で始まり、427位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する上記3)記載のポリペプチド;またはその相同ポリペプチド;
5)配列番号1、2または3の25位のアミノ酸残基で始まり、427位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する上記3)記載のポリペプチド;またはその相同ポリペプチド;
【0040】
6)配列番号1、2または3の45位のアミノ酸残基で始まり、427位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する上記3)記載のポリペプチド;またはその相同ポリペプチド;
7)配列番号1、2または3の5位のアミノ酸残基で始まり、394位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する上記3)記載のポリペプチド;またはその相同ポリペプチド;
【0041】
8)配列番号1、2または3の25位のアミノ酸残基で始まり、394位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する上記3)記載のポリペプチド;またはその相同ポリペプチド;
9)配列番号1、2または3の45位のアミノ酸残基で始まり、394位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する上記3)記載のポリペプチド;またはその相同ポリペプチド;
【0042】
10)上記1)〜9)の何れか1つに記載のポリペプチドと少なくとも80%の相同性または同一性、好ましくは85%の相同性または同一性を有するポリペプチド;
11)上記1)〜9)の何れか1つに記載のポリペプチドと少なくとも90%の相同性または同一性、好ましくは95%の相同性または同一性、最も好ましくは99%の相同性または同一性を有するポリペプチド;
【0043】
12)最初のATGコドンから残基81(L22M2)までの配列の逐次的欠失により発生するHCP1のNH末端欠失よりなる配列としてミカエリ等(Michaeli et al.,1993,J.Biol.Chem.,268,12925−12932)により開示されたアミノ酸配列を例外として、完全長PDE7(A)蛋白質のアミノ酸57〜100の間のアミノ酸で始まり、アミノ酸450〜483の間で終わる、アミノ酸配列を有するポリペプチド;
【0044】
13)PDE7A蛋白質がヒトPDE7A1またはPDE7A2である上記12)記載のポリペプチド;
14)上記1)〜13)の何れか1つに記載のポリペプチドをコードする核酸配列またはそれに相補的な配列;
15)配列番号4、5または6の核酸配列よりなる群から選択される上記14)記載の核酸配列;またはそれに相補的な配列;
16)上記14)〜15)記載の核酸配列の欠失の後に残存する完全長PDE7(A)の配列の部分を有する核酸配列;
17)ゲノム起源の上記14)〜16)の何れか1つに記載の核酸配列;
【0045】
18)欠失した核酸部分が異種ポリヌクレオチド配列により起きかえられている上記16)または17)に記載の核酸配列;
19)PDE7(A)がヒト、マウスまたはラット起源、最も好ましくはヒト起源のものである、上記1)〜3)の何れか1つに記載のポリペプチドまたは、上記14)〜18)の何れか1つに記載の核酸配列;
20)異種ポリヌクレオチドが選択マーカーを有する上記18)記載の核酸;
21)異種ポリヌクレオチドがその5′末端に少なくともloxP配列およびその3′末端に少なくともloxP配列を有する上記18)記載の核酸;
22)上記2のポリペプチドをコードする核酸配列が調節配列に作動可能に連結している上記14)〜21)の何れか1つに記載の核酸;
【0046】
23)調節配列が誘導性プロモーターよりなる上記22)記載の核酸;
24)調節配列がポナステロンのようなインデューサーにより誘導可能なプロモーターよりなる上記23)記載の核酸;
25)上記14)〜24)に記載の核酸配列を有する組み換えベクター;
26)上記14)〜24)に記載の核酸を有する組み換え宿主;
27)上記25)記載の組み換えベクターを有する組み換え宿主;
【0047】
28)真核生物である上記26)または27)に記載の組み換え宿主;
29)接合体、胚、胎仔または成体の多能性幹細胞、哺乳類の分割球または胚盤胞に由来する組み換え宿主細胞およびES細胞よりなる組み換え宿主細胞の群から選択される上記26)〜28)の何れか1つに記載の組み換え宿主細胞;
30)上記14)〜24)の何れか1つに記載の核酸の欠失の後に残存する完全長PDE7の部分を伴った配列を有するポリヌクレオチド構築物を有するベクターの使用により発生したノックアウト動物であって、該構築物が即ちこの動物のゲノム内の天然のPDE7配列の部分を置き換えている、上記動物;
【0048】
31)哺乳類起源の上記30)記載のノックアウト動物;
32)ネズミまたはラット起源の上記31)記載のノックアウト動物;
33)上記1)〜13)に記載のポリペプチドの製造方法であって下記工程:
a)上記26)〜29)に記載の組み換え宿主細胞を適切な培地中で培養すること、
b)このように条件付けされた培地を採取すること、または、組み換え宿主細胞を溶解すること;
c)該培地から、または、得られた細胞溶解物から、上記のとおり製造されたポリペプチドを分離または精製すること、
を有する上記方法;
【0049】
34)PDE7ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニング方法であって、該方法は下記工程:
a)上記1)〜13)に記載のポリペプチドの所望の量を準備すること;
b)工程a)において準備したポリペプチドの所望の量を試験すべき候補化合物の所望の量を含有する緩衝溶液に添加すること;
c)ホスホジエステラーゼ酵素活性を測定すること;および、
d)工程c)で得られた測定値酵素活性を候補化合物の非存在下に得られた酵素活性と比較すること;
を包含する上記方法;
【0050】
35)工程a)で準備したポリペプチドが配列番号1の45位のアミノ酸残基で始まり、427位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列またはその相同ポリペプチドよりなる上記34)記載の方法;
36)ポリペプチドが上記14)〜24)に記載の核酸により、または、上記25)記載の組み換えベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞の細胞溶解物に由来する上記34)または35)記載の方法;
37)ホスホジエステラーゼ触媒活性がcAMPの加水分解の水準として測定される上記34)または36)記載の方法;
【0051】
38)PDE7ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニング方法であって、該方法が下記工程:
a)適切な培地中で上記26)〜29)に記載の組み換え宿主細胞を培養すること;
b)試験すべき候補化合物の所望の濃度を該培地に添加すること;
c)細胞内ホスホジエステラーゼ酵素活性を測定すること;および、
d)工程c)で得られた酵素活性を工程b)を省略した場合に得られる酵素活性と比較すること;
を包含する上記工程;
【0052】
39)組み換え宿主細胞が2量体エクジソン受容体を発現するCHO細胞系統よりなる上記38)記載の方法;
40)誘導性調節配列に作動可能に連結した上記1)〜13)に記載のポリペプチドをコードする核酸を有する組み換えベクターで組み換え宿主細胞がトランスフェクトされている上記38)記載の方法;
41)調節配列がインデューサーにより誘導可能である上記40)記載の方法;
42)インデューサーがポナステロンである上記41)記載の方法;
【0053】
43)工程b)の前に、組み換え宿主細胞を、工程a)の間に誘導性調節配列を活性化するインデューサーの存在下に培養する上記38)〜42)の何れか1つに記載の方法;
44)アデニル酸シクラーゼ活性化物質を工程b)の終了時、停止溶液の添加前に添加する上記38)〜43)の何れか1つに記載の方法;
45)工程b)の間に生成した細胞内cAMPの量の測定を介して細胞溶解後にホスホジエステラーゼ酵素活性を測定する上記38)〜43)の何れか1つに記載の方法;
【0054】
46)PDE7活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニング方法であって、該方法が下記工程:
a)適切な培地中に上記1)〜13)の何れか1つに記載のポリペプチドおよびレポーター遺伝子を同時発現する組み換え宿主細胞を準備すること;
b)試験すべき候補化合物の所望の濃度を該培地に添加すること;
c)レポーター遺伝子発現を測定すること;および、
d)工程c)で得られた酵素活性を工程b)を省略した場合に得られる酵素活性と比較すること;
を包含する上記方法;
【0055】
47)組み換え宿主細胞が2量体エクジソン受容体を発現するCHO細胞系統よりなる上記46)記載の方法;
48)誘導性調節配列に作動可能に連結した上記1)〜13)に記載のポリペプチドをコードする核酸を有する組み換えベクターで組み換え宿主細胞がトランスフェクトされている上記46)または47)に記載の方法;
49)調節配列がポナステロンのようなインデューサーにより誘導可能である上記48)記載の方法;
50)工程b)の前に、組み換え宿主細胞を、工程a)の間に誘導性調節配列を活性化するインデューサーの存在下に培養する上記46)〜49)の何れか1つに記載の方法;
【0056】
51)アデニル酸シクラーゼ活性化物質を工程b)の終了時、停止溶液の添加前に添加する上記46)〜50)の何れか1つに記載の方法;
52)レポーター遺伝子がβ−ラクタマーゼ遺伝子である上記46)〜51)の方法;
53)PDE7ホスホジエステラーゼ触媒活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニングのためのキットであって、該キットが下記成分:
a)上記1)〜13)記載のポリペプチド;
b)場合により、ホスホジエステラーゼ触媒活性測定を行なうために必要な試薬;
を包含する上記キット;
【0057】
54)PDE7ホスホジエステラーゼ触媒活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニングのためのキットであって、該キットが下記成分:
a)上記26)〜29)記載の組み換え宿主細胞;
b)場合により、ホスホジエステラーゼ触媒活性測定を行なうために必要な試薬;
を包含する上記キット;
55)PDE7ホスホジエステラーゼ触媒活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニングのためのキットであって、該キットが下記成分:
a)上記1)〜13)記載のポリペプチドおよびレポーター遺伝子を同時発現する本発明の組み換え宿主細胞;
b)場合により、レポーター遺伝子発現測定を実施するために必要な試薬;
を包含する上記キット;
【0058】
56)PDE7ホスホジエステラーゼ触媒活性を阻害する化合物をインビトロで選択するための方法であって、該方法が下記工程:
a)候補化合物を用いて上記34)〜37)に記載の方法を実施すること;および、該候補化合物がホスホジエステラーゼ活性を阻害することがわかった場合は、次に、
b)工程a)で選択された阻害剤化合物を用いて上記38)〜52)に記載の方法を実施すること;
を包含する上記方法;
【0059】
57)PDE7ホスホジエステラーゼ触媒活性を選択的に阻害する化合物を選択するための方法であって、該方法が下記工程:
a)上記34)〜37)、38)〜52)および56)に記載の方法を実施することによりPDE7ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物を選択すること;および、
b)PDE7以外のPDE酵素少なくとも1つのホスホジエステラーゼ活性を阻害する能力がないことを、選択された阻害剤化合物について調べること;
を包含する上記方法;
【0060】
58)PDE3およびPDE4酵素のホスホジエステラーゼ活性を阻害する能力がないことを、選択された阻害剤化合物について調べる、上記)57記載の方法;
59)PDE1、PDE2、PDE3、PDE4、PDE5およびPDE6酵素のホスホジエステラーゼ活性を阻害する能力がないことを、選択された阻害剤化合物について調べる、上記57)記載の方法;
60)上記34)〜37)、38)〜52)、56)および57)〜59)に記載の方法に従って選択されたホスホジエステラーゼ阻害剤化合物;
【0061】
61)医薬組成物の製造のための上記34)〜37)、38)〜52)、56)および57)〜59)に記載の方法に従って選択されたホスホジエステラーゼ阻害剤化合物の使用;
62)ヒトまたは動物の治療、診断または手術において使用するための医薬組成物の製造のための上記34)〜52)および56)〜59)の何れか1つに記載の方法により入手可能、同定可能、選択可能または特性化可能な化合物の使用;
64)ヒトまたは動物の治療、診断または手術において使用するための医薬組成物の製造のための上記34)〜52)および56)〜59)の何れか1つに記載の方法により入手、同定、選択または特性化される化合物の使用;
【0062】
65)免疫系に影響する疾患、例えば、AIDS、移植片拒絶反応、自己免疫疾患、例えばT細胞関連疾患、例えば慢性関節リューマチ;炎症性疾患、例えば呼吸器炎症性疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息;胃腸炎症性疾患、例えばクローン病、結腸炎、膵臓炎、並びに白血病を含む種々の癌のような種々の病理学的状態の治療または予防のための医薬組成物の製造のための、上記34)〜52)および56)〜59)の何れか1つに記載の方法により入手、同定、選択または特性化される化合物の使用;
【0063】
66)免疫系に影響する疾患、例えば、AIDS、移植片拒絶反応、自己免疫疾患、例えばT細胞関連疾患、例えば慢性関節リューマチ;炎症性疾患、例えば呼吸器炎症性疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息;胃腸炎症性疾患、例えばクローン病、結腸炎、膵臓炎、並びに白血病を含む種々の癌のような種々の病理学的状態の治療または予防のための医薬組成物の製造のための上記34)〜52)および56)〜59)の何れか1つに記載の方法により入手可能、同定可能、選択可能または特性化可能である化合物の使用;
【0064】
67)免疫系に影響する疾患、例えば、AIDS、移植片拒絶反応、自己免疫疾患、例えばT細胞関連疾患、例えば慢性関節リューマチ;炎症性疾患、例えば呼吸器炎症性疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息;胃腸炎症性疾患、例えばクローン病、結腸炎、膵臓炎、並びに白血病を含む種々の癌のような種々の病理学的状態の治療または予防のための化合物の合成における、上記34)〜52)および56)〜59)の何れか1つに記載の方法により入手、同定、選択または特性化される化合物の使用;
に関する。
【0065】
本発明は、最初のATGコドンから残基81(L22M2)までの配列の逐次的欠失により発生するHCP1のNH末端欠失よりなる配列としてミカエリ等(1993)により開示されたアミノ酸配列には関係しない。
【0066】
次に添付の図面について説明する。
図1はヒトPDE7イソ型の2種、即ちPDE7A1(h7A1.PROと表示)およびPDE7A2(h7A2.PROと表示)、並びにマウスPDE7A2(mou7A2.PROと表示)およびラットPDE7A1(rat7.a.PROと表示)の蛋白質のアミノ酸配列の間のアライメントを示している。ボックス内に入っていないアミノ酸残基はアミノ酸配列4つにおいて相同ではないアミノ酸を示す。
図2は本発明に従って得られた異なるトランケートされたPDE7蛋白質の構造を示す。上段はヒトPDE7A1の完全長イソ型を示す。他の例は種々の試験したトランケート蛋白質を示す。左側に示した数字は完全長PDE7A1蛋白質と照合させた蛋白質のN末端およびC末端のアミノ酸残基を示す。
図3は図2で示した種々のPDE7トランケート蛋白質を発現するために用いられている組み換えベクターPcDNA4HisMax Aを示す。
この図よりわかるとおり、トランケートされたPDE7蛋白質をコードするDNAインサートは該ベクターのBamHIおよびXbaI間のクローニング部位に挿入される。
【0067】
図4は組み換えCHO細胞系統およびSf21組み換え細胞系統によるPDE7A1の発現の結果を示す。
「模倣(mocked)CHO」とは空の組み換えベクターによりトランスフェクトされているCHO細胞を示す。
「CHOrPDE7A1」とはヒトPDE7A1蛋白質をコードするインサートを含むベクターでトランスフェクトされたCHO細胞を示す。
「Sf21rPDE7A1」とはヒトPDE7A1蛋白質をコードするインサートを含むベクターでトランスフェクトされたSf21細胞を示す。
「rPDE7A2」とはヒトPDE7A2蛋白質をコードするインサートを含むベクターでトランスフェクトされた組み換えCHOまたはSf21細胞を示す。
「rPDE4B2」とはヒトPDE4B2蛋白質をコードするインサートを含むベクターでトランスフェクトされた組み換えSf21細胞を示す。
各群左側の棒グラフはロリプラムPDE4阻害剤を用いることなく得られたホスホジエステラーゼ触媒活性を示す。
各群右側の棒グラフはロリプラムPDE4阻害剤の存在下に得られたホスホジエステラーゼ触媒活性を示す。
【0068】
図5は、それぞれ、空のベクターで、または、PDE4B2蛋白質、PDE7A1蛋白質、至適Kozak配列を有するインサートをコードするPDE7A1またはcDNAの5′および3′のUTRを有するインサートをコードするPDE7A1をコードするインサート含むベクターでトランスフェクトしたCHO細胞を用いて得られたホスホジエステラーゼ触媒活性を示す。
図6は、空のベクター(対照)、PDE4B2蛋白質、完全長PDE7A1蛋白質または13−483、31−483、61−483、81−483、101−483および171−483トランケート蛋白質(数は完全長PDE7A1酵素配列と照合)をコードするベクターによりそれぞれトランスフェクトされた組み換えCHO細胞により発現されたホスホジエステラーゼ触媒活性を示す。
【0069】
図7は、空のベクター(対照)、PDE4B2蛋白質、PDE7A1完全長蛋白質または101−483、121−483、141−483、101−483、101−450、101−420および101−430トランケートPDE7A1ポリペプチド(数は完全長PDE7A1酵素配列と照合)をコードするベクターによりそれぞれトランスフェクトされた組み換えCHO細胞により発現されたホスホジエステラーゼ触媒活性を示す。
図8はPDE7ノックアウトマウスを作成するために用いることができる相同組み換えのためのターゲティングベクターの構築を示す。
図9はCHOトランスフェクト細胞における組み換えヒトPDE7A発現のトランケート型のウエスタンブロット分析を示す。
【0070】
図10は、種々の濃度におけるフォルスコリンの存在下のPDE7触媒部位の好ましい実施態様を発現する種々のEcrCHOクローンにおけるβ−ラクタマーゼの発現の用量応答を示す。即ち、完全長PDE7Aのアミノ酸配列101−483に相当するPDE7突然変異体(「Fors」はフォルスコリンを意味する)である。
図11は、PDE7触媒部位の好ましい実施態様を発現する種々のEcrCHOクローン20(30000細胞)(n=2、即ち実験は2回実施した)におけるβ−ラクタマーゼの発現の測定を示す。即ち、PDE阻害剤投与後の完全長ヒトPDE7A1のアミノ酸配列101−483に相当するPDE7突然変異体である。
図12は、完全長ヒトPDE7A1の第1のN末端100アミノ酸(Nter7A1)をコードする核酸のトランスフェクションを行った場合と行わない場合の完全長ヒトPDE7A1(Δ1007A1)のアミノ酸配列101−483に相当するPDE7突然変異体をコードする核酸でトランスフェクトしたCHO細胞におけるPDE活性を示す。
【0071】
図13は、PDE7触媒部位の好ましい実施態様をコードする核酸配列によりトランスフェクトされたCHO細胞(リポフェクタミン)においてPDE活性を測定したものを示している。即ち、種々の濃度比の完全長ヒトPDE7A1のアミノ酸配列101−483および完全長ヒトPDE7A1の第1のN末端100アミノ酸をコードする核酸配列に相当するPDE7突然変異体である。
図14はPDE7ノックアウトC57BL/6マウスを作成するために用いることができる相同組み換えのためのターゲティングベクターを示す。
図15はPDE7ノックアウト129マウスを作成するために用いることができる相同組み換えのためのターゲティングベクターを示す。
【0072】
【発明の詳述】
本発明はPDE7の触媒活性を驚くべきことに保持しており、そして、内因性の完全長PDE7A1およびPDE7A2蛋白質の活性よりも高い活性を示す完全長PDE7、そして好ましくはPDE7Aに由来するポリペプチドを始めて提供する。
より詳しくは、本発明は内因性の完全長PDE7A1およびPDE7A2蛋白質の活性よりも高い活性を驚くべきことに示す完全長PDE7、そして好ましくはPDE7Aに由来するポリペプチドを始めて提供する。
【0073】
本発明はまたPDE7A酵素の触媒部位の局在化を始めて示す。
本発明はまた、完全長PDE7酵素の触媒活性を制御または制限すると考えられる、PDE7、特にPDE7Aにおける調節ドメイン、特に阻害ドメインの存在を始めて同定している。実際、本発明者等はこの調節ドメインの欠失により、得られるトランケートされたPDE7A酵素の酵素活性が有意に改善されることを明らかにした。
【0074】
PDE7(A)内のこの阻害/調節ドメインの存在を認識することは、この阻害ドメインの影響をブロックするか低減することによりPDE7(A)の触媒活性を改善できるという可能性をもたらす。特に、本発明は完全長PDE7の触媒活性を調節するのに必須であるPDE7(A)阻害ドメインの一部を含まないPDE7(A)の突然変異体を包含する。これらの突然変異体は完全長PDE7(A)と比較して進歩したPDE触媒活性を示す。阻害/調節ドメインは完全長PDE7(A)のN末端に位置すると思われることから、好ましい突然変異体はPDE7(A)のN末端部分において突然変異を含む。より詳しくは、阻害/調節ドメインは完全長PDE7(A)蛋白質のアミノ酸31〜100の間に含まれると思われる。従って、完全長PDE7(A)蛋白質のアミノ酸31〜100の間に含まれるいかなる突然変異も野生型または完全長PDE7(A)と比較した場合の相当するPDE7(A)突然変異体の活性の進歩をもたらす。即ち、完全長PDE7(A)蛋白質のアミノ酸57〜100の間に含まれるアミノ酸から始まり、アミノ酸450〜483の間に含まれるアミノ酸で終わるPDE7(A)のN末端欠失突然変異体を作成した。これらの突然変異体は相当する完全長PDE7(A)の活性の6〜20倍のPDE7(A)活性またはPDE触媒活性を示す。
【0075】
PDE7Aの一次アミノ酸配列は比較的弱いアミノ酸同一性にもかかわらず、PDEのPDE4ファミリーに最も緊密に関連している。実際、PDE7AおよびPDE4の間のアミノ酸配列同一性は全体の配列の約25%である。しかしながら、PDE7とPDE4の間のアミノ酸配列の同一性は最も保存された領域内では約35%に達する。
【0076】
PDE7Aはまたビンポセチン、SKF94836、ミルリノン、ロリプラムまたはサプリナストを含む他の知られたPDEファミリーの標準的な選択的阻害剤に対するその非感受性も特徴としている。今日まで、PDE7Aの選択的阻害剤は報告されていない。
【0077】
PDE7AのmRNAは種々の組織および免疫細胞に渡って広範に存在しており、そして、PDE7酵素活性は高濃度でリンパ球中に検出されているため、PDE7Aは潜在的には数種の疾患に関わっていると考えられる。これらには免疫系に影響する疾患、例えば、AIDS、移植片拒絶反応、自己免疫疾患、例えばT細胞関連疾患、例えば慢性関節リューマチ;炎症性疾患、例えば呼吸器炎症性疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息;胃腸炎症性疾患、例えばクローン病、結腸炎、膵臓炎、並びに白血病を含む種々の癌が包含される。
【0078】
即ち、PDE7A酵素活性を阻害する化合物が必要とされる。これらはPDE7A細胞活性の変動に関わる疾患を予防または治療するために有用であると考えられることから、大きな薬理学的価値を有する。
ホスホジエステラーゼ7活性の価値ある阻害剤化合物の選択には、高度な感受性および高度な選択性を共に有する適切なスクリーニング試験の設計が必要である。
【0079】
本発明者等は、PDE7の阻害剤の高感度スクリーニング試験法は天然のPDE7A1またはPDE7A2イソ型で観察される触媒活性よりも高いPDE7触媒活性を示すポリペプチドを必要とすると考える。明らかに、天然のPDE7A1またはPDE7A2イソ型よりも高いPDE7触媒活性を示すポリペプチドはこれらの酵素の強力な阻害剤を選択するために有用である。
本発明者等はまた、このようなPDE7酵素阻害剤のスクリーニング方法は、特に選択された化合物が酵素の触媒ドメインと特異的に相互作用することを確認できれば、達成可能であると考える。
【0080】
従来の技術に撚れば、PDE7の触媒ドメインは未知であり、PDE7の単なるアミノ酸配列を出発点としては簡単に位置を決定することができない。これは主に、この酵素がPDE4を含むPDEファミリーの他の構成員に対して弱いアミノ酸相同性を持っているためである。更にまた、Conti等(1995)によれば、cAMP−PDE類をコードする種々のcDNA類をスクリーニングしたところ、これらのクローンの5′末端における難解な異質性が示された。
【0081】
本発明者等は、完全長PDE7A1およびPDE7A2蛋白質に由来し、本発明により特性化される触媒ドメインを少なくとも含むポリペプチドは、天然のPDE7A酵素で観察されるKm値よりも幾分低値のKm値を示し、そして、天然の酵素よりも大きいcAMP基質に対する親和性、すなわち、天然の酵素よりも高値のVmax基質を有することを発見した。更にまた、本発明者等は、今回、PDE7活性を示す新しいポリペプチドを特性化した、これはこの酵素の触媒ドメインを主に含み、そして、cAMP基質に対するKm値は、PDE7A1およびPDE7A2の本来の蛋白質でそれぞれ観察された値は約0.2μMおよび約0.12μmのKm値とは対照的に、約0.06μMであった(Ichimura M.and Kase H.,1993;Michaeli等、1993;Bloom T.J.and Beavo J.A.等,1996)。
【0082】
更にまた、本発明によれば、新しく特性化されたポリペプチドは内因性の完全長PDE7A1およびPDE7A2蛋白質で観察される触媒活性よりも少なくとも6倍、好ましくは8倍、より好ましくは15倍のホスホジエステラーゼ触媒活性を有し、そして、新しく特性化されたポリペプチドの一部は内因性の完全長PDE7A1およびPDE7A2蛋白質で観察される触媒活性約15〜20倍のホスホジエステラーゼ触媒活性を有することがわかった。
【0083】
生物学的関連用語の一般的定義
本発明によれば、当業者の知る従来の分子生物学、微生物学および組み換えDNA技術を用いる。このような技術は文献に十分記載されている。例えばSambrook等、(1989);Glover,(1985);Gait,(1984);Hames and Higgins,(1984);Freshney,(1986) およびPerbal,(1984) が参照される。
【0084】
従って、本明細書においては、以下の用語は以下に記載するとおり定義されるものとする。
「単離された」という用語は本発明の目的のためにはその本来の環境(元々存在していた環境)から取り出された生物学的材料(核酸または蛋白質)を指すものとする。
「単離されたポリペプチドまたは蛋白質」とは、天然の状態において通常それに付随している化合物(例えば他の蛋白質またはポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質)を実質的に含まないものである。
「単離された」とは他の化合物との人工または合成の混合物や生物学的活性を妨害せずそして例えば不完全な精製、安定化剤の添加または製薬上許容しうる製剤への配合等のために存在しても良い不純物の存在を排除するものではない。
例えば、植物または動物に天然の状態で存在するポリヌクレオチドは単離されない。
【0085】
「精製された」という用語は他の化合物の存在を排除する絶対的な純度を示す形態で物質が存在することを必要としない。これはむしろ相対的な定義である。
ポリヌクレオチドは出発物質または天然物の精製後に少なくとも1桁、好ましくは2または3桁、そして好ましくは4または5桁「精製された」状態にある。
本発明の目的のためには、「ヌクレオチド配列」という表現はポリヌクレオチドまたは核酸の何れかをさすために使用してよい。「ヌクレオチド配列」という表現は遺伝物質そのものを包含し、このため、その配列に関連する情報に限定されない。
【0086】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」という用語は、RNA、DNA、gDNA、cDNA、合成DNAまたは半合成DNAの配列または一重鎖型または二重らせん、二重鎖型の何れかのヌクレオチド1個より多いRNA/DNAハイブリッド配列を包含する。
「ヌクレオチド」という用語は天然のヌクレオチド(A、T、G、C)並びに(1)プリン類縁体、(2)ピリミジン類縁体、または、(3)糖類縁体のような修飾少なくとも1つを含む修飾ヌクレオチドの双方を指し、このような修飾ヌクレオチドの例は例えばPCT出願WO95/04064に記載されている。
「相同組み換え」とは染色体内へのベクターの外来性DNA配列の挿入を指す。好ましくは、ベクターは相同組み換えのための特異的な染色体部位をターゲティングする。特異的相同組み換えのためには、ベクターは染色体内へのベクターの相補結合と取りこみを可能にするために十分長い染色体配列との相同性領域を含む。
【0087】
本明細書においては、「相同組み換え動物」という用語はある遺伝子を含む動物を記述するものであり、その際その遺伝子は、その遺伝子と、その動物またはその先祖の胚細胞内に導入されたDNA分子との間の相同組み換えにより修飾されているものとする。即ち、相同組み換え動物は一種のトランスジェニックな動物であり、それは、相同組み換えによりその動物のゲノム内の所定の染色体位置内にトランスジーンが導入されているものである。
【0088】
「調節領域」または「調節配列」とは核酸の発現を調節する核酸配列を意味する。調節領域は特定の核酸を発現するために本来必要な配列を含んでよく(相同領域)、或いは、異なる起源の配列を含んでもよい(異なる蛋白質の発現に関わるかまたは合成蛋白質)。特に配列は特異的または非特異的な態様で、そして、誘導性または非誘導性の態様である遺伝子の転写を促進または抑制する真核生物またはウィルスの遺伝子の配列または誘導配列であることができる。調節領域は複製起点、RNAスプライス部位、エンハンサー、転写終止配列、標的細胞の分泌経路にポリペプチドを指向させるシグナル配列およびプロモーターを包含する。
【0089】
「異種起源」から得られる調節領域は発現された核酸には本来伴わない調節領域である。異種調節領域に含まれるものとしては、異なる種由来の調節領域、異なる遺伝子由来の調節領域、ハイブリッド調節配列、および、天然には存在しないが当業者により設計される調節配列が挙げられる。
【0090】
「プロモーター配列」とは細胞内でRNAポリメラーゼに結合し、下流(3′側)コード配列の転写を開始する事のできるDNA調節領域である。プロモーター配列中には、転写開始部位(例えばヌクレアーゼS1を用いたマッピングにより好都合に定義される)、並びに、RNAポリメラーゼの結合に関わる蛋白質結合ドメイン(コンセンサス配列)が存在する。
【0091】
ポリペプチドは共有結合したアミノ酸残基よりなる重合体物質である。
本発明の「相同」ポリペプチドは、機能的に等価なアミノ酸残基が配列内部で残基を置換している結果保存的なアミノ酸置換がもたらされている変化した配列を含む本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の全てまたは部分を一次アミノ酸配列として含んでいるものを包含するがこれらに限定されない。例えば、配列内部のアミノ酸残基1個以上が、機能的等価物として作用する結果サイレントな変化をもたらす同じ極性の別のアミノ酸により置換されていることができる。配列内部のアミノ酸の置換物としてはそのアミノ酸が属するクラスの他の構成員から選択してよい。例えば、非極性(疎水性)アミノ酸にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。芳香族環構造を含むアミノ酸はフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンである。極性中性アミノ酸にはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが包含される。陽荷電(塩基性)アミノ酸にはアルギニン、リジンおよびヒスチジンが包含される。陰荷電(酸性)アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が包含される。このような変化はポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される見かけの分子量や等電点に影響しないと推測される。
【0092】
特に好ましい置換は:
− LysとArgの相互であって、陽荷電が維持されるもの;
− GluとAspの相互であって、陰荷電が維持されるもの;
− SerによるThrの置換であって、遊離の−OHが維持できるようなもの;
− GlnによるAsnの置換であって、遊離のCONHが維持できるようなもの;
である。
【0093】
アミノ酸置換はまた、特に好ましい特性でアミノ酸を置換するために導入してもよい。例えば、Cysは別のCysとのジスルフィド結合のための潜在的部位に導入してよい。Hisは特に「触媒的な」部位として導入してよい(即ち、Hisは酸または塩基として作用することができ、生化学的触媒分解における最も共通したアミノ酸である)。Proは蛋白質構造中にβターンを導入するその特徴的な平面構造により導入してよい。
【0094】
「ベクター」とは別のDNAセグメントを連結させることにより連結させたセグメントの複製が行なえるようになるプラスミド、ウィルス、ファージ、コスミドまたはバクミドのようなレプリコンである。これは環状または線状のDNAまたはRNA分子であり、二重鎖または一重鎖の何れかである。「レプリコン」とはインビボでDNA複製の自律的単位として機能する、即ち、自らの制御下に複製することが可能な何れかの遺伝子要素(例えばプラスミド、染色体、ウィルス)である。
【0095】
2種の核酸またはアミノ酸配列間の同一性
「同一性」とは2種のペプチド間、または、2種の核酸分子の間の配列の同一性を指す。配列間の同一性は比較のために整列させた配列の各々における位置を比較することにより調べることができる。比較する配列内の位置が同じ塩基またはアミノ酸で占有されている場合は、配列はその位置において同一である。核酸配列間の同一性の程度はこれらの配列により共有される位置における同一のヌクレオチドの数の関数である。アミノ酸配列間の同一性の程度はこれらの配列により共有される位置における同一のアミノ酸の数の関数である。2種のポリヌクレオチドが各々、(1)2種のポリヌクレオチドの間で同じ配列(即ち完全なポリヌクレオチド配列の一部)を有し、そして、(2)更に2種のポリヌクレオチド間で多様である配列を有するため、2種(またはこれ以上)のポリヌクレオチドの間の配列比較は典型的には、局所的領域の配列の同様性を同定して比較するための「比較ウインドウ」全体に渡り2種のポリヌクレオチドの配列を比較することにより行なわれる。「比較ウインドウ」とは、ポリヌクレオチド配列を少なくとも20個の近隣ヌクレオチドの比較対照配列と比較し、そして、2つの配列の至適アライメントについて、比較ウインドウ内のポリヌクレオチド配列の部分が、比較対照配列(これは付加や欠失は含まない)と比べた場合に20%以下の付加または欠失(即ちギャップ)を含む、少なくとも20個の近隣ヌクレオチドの位置の概念的セグメントを指す。比較ウインドウを決定するための配列の至適アライメントは、Smith and Waterman(1981)の局所的相同性アルゴリズムによるか、Needlenan and Wunsch(1972)の相同性アライメントアルゴリズムによるか、Pearson and Lipman(1988)の同様性検索方法によるか、これらのアルゴリズムのコンピューター操作(Wisconsin Gentics Software Package Release 7.0のGAP,BESTFIT,FASTAおよびTFASTA,Genetics Computer Group,575,Science Dr.Madison,W1)によるか、または、目視検討により行なってよい。種々の方法により得られた最良のアライメント(即ち比較ウインドウ全体に渡り最も高い比率の同一性を与えるもの)を選択する。「配列同一性」という用語は比較ウインドウ全体に渡り2種のポリヌクレオチド配列が同一(即ちヌクレオチド−ヌクレオチド基準で同一)であることを意味する。
特段の記載が無い限り、ポリペプチド中のアミノ酸の位置はヒト完全長PDE7A1との照合において記載するものとする。
【0096】
本発明のポリペプチドおよび核酸
本発明の新しく特性化されたポリペプチドの高いcAMP親和性および高いホスホジエステラーゼ触媒活性、並びに、PDE7A酵素の少なくとも触媒ドメインをそれらが有するという事実を考慮すると、本発明のポリペプチドは今回、PDE7A阻害剤のスクリーニングのための高感受性かつ高選択性の方法の設計を可能とする。
本明細書において、触媒ドメインまたは部位とは、完全長PDE7酵素のPDE活性と比較した場合に増大しているPDE活性を得るために必要な最小限のフラグメントを指すものとする。
【0097】
後に記載する実施例において示すアミノ酸欠失実験を介して、本発明者等はヒトPDE7A1アミノ酸配列の61位または81において始まり、483位において終わる配列よりなるポリペプチドが、内因性PDE7A1またはPDE7A2完全長蛋白質のホスホジエステラーゼ触媒活性と比較してそれぞれ8倍または9倍増大したホスホジエステラーゼ触媒活性を有することを明らかにした。更にまた、本発明者等は、更に増大したホスホジエステラーゼ触媒活性がより短いポリペプチドで観察されることを明らかにした。例えば、ヒトPDE7A1のアミノ酸配列の101位で始まり450位で終わるアミノ酸配列よりなるポリペプチドは内因性PDE7A1またはPDE7A2完全長蛋白質の触媒活性よりも約15倍高値のホスホジエステラーゼ触媒活性を示した。
本明細書においては、内因性PDE7A1またはPDE7A2という用語は哺乳類細胞内で自然に発現されるPDE7A1またはPDE7A2を意味するものとする。
【0098】
ポリペプチド
結果的に、本発明の第1の目的はホスホジエステラーゼ7触媒ドメインを保有し、そして、配列番号1のアミノ酸配列の連続するアミノ酸少なくとも312個を有する、約427アミノ酸長までのポリペプチド、またはその相同ポリペプチドである。
ヒトPDE7A1またはPDE7A2アミノ酸配列とマウスおよびラットをそれぞれ起源とするPDE7アミノ酸配列との間のアミノ酸配列アライメントはヒトとマウスまたはラットの配列の間に高いアミノ酸同一性があることを示した。より厳密には、ヒトPDE7A1の57位のアミノ酸と483位のアミノ酸の間には、相当するマウスPDE7A2アミノ酸配列に対して93.7%のアミノ酸同一性、そして、ラットPDE7A1アミノ酸配列に対しては94.1%のアミノ酸同一性が観察されている。
【0099】
従ってPDE7Aのマウスおよびラットアミノ酸配列からそれぞれ誘導され、そして配列番号1のヒト配列と高いアミノ酸同一性を共有するアミノ酸配列はまた、マウスまたはラットPDE7酵素の触媒ドメインを有する。
マウスPDE7A2配列より誘導され、配列番号1のヒト配列と整列させたマウスアミノ酸配列を配列番号2のアミノ酸配列と称する。
ラットPDE7A1配列より誘導され、配列番号1のヒト配列と整列させたラットアミノ酸配列を配列番号3のアミノ酸配列と称する。
【0100】
本発明の別の目的は、ホスホジエステラーゼ7触媒ドメインを保有し、そして配列番号2または3のアミノ酸配列よりなる群から選択される配列の連続するアミノ酸少なくとも312個を有する、約427アミノ酸長までのポリペプチド、またはその相同ポリペプチドよりなる。
【0101】
本発明の目的のためには、「相同ポリペプチド」とは、上記配列番号1、2または3のアミノ酸配列に関し、少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、最も好ましくは90または95%のアミノ酸の同一性を有するポリペプチドを包含するものとする。本発明の相同ポリペプチドのアミノ酸残基の変化は、比較対照ポリペプチドに関して、1つのアミノ酸の、1、2、3、4、5、10〜20の置換、付加または欠失の範囲内でのアミノ酸の変化よりなる。
【0102】
全ての場合において「相同ポリペプチド」は配列番号1のアミノ酸配列を有するポリペプチドについて測定したホスホジエステラーゼ触媒活性と少なくとも同じ桁数のPDE7ホスホジエステラーゼ触媒活性を示す。言いかえれば、本発明の「相同ポリペプチド」は内因性完全長ヒトPDE7A1またはPDE7A2蛋白質で観察される触媒活性の好ましくは少なくとも6倍、最も好ましくは少なくとも8倍のホスホジエステラーゼ活性を有する。
【0103】
本発明に含まれるポリペプチドの何れのホスホジエステラーゼ触媒活性も、後に記載する実施例中のホスホジエステラーゼ試験法等を用いて当業者により測定される。
【0104】
本発明の「相同ポリペプチド」の特定の実施態様は蛋白質分解に耐性であるポリペプチド分子、−CONH−ペプチド結合が修飾され、(CHNH)還元結合、(NHCO)レトロ逆結合、(CHO)メチレンオキシ結合、(CHS)チオメチレン結合、(CHCH)炭素結合、(CO−CH)ケトメチレン結合、(CHOH−CH)ヒドロキシエチレン結合、(N−N)結合および−CH=CH−結合で置きかえられているペプチドを包含する。
【0105】
本発明の別の目的は、配列番号1、2または3の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64位に位置するアミノ酸残基から始まり、
配列番号1、2または3の375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427位に位置するアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する前述のポリペプチド、またはその相同ポリペプチドである。
【0106】
本発明の好ましいポリペプチドは:
配列番号1、2または3の5位のアミノ酸残基で始まり、427位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその相同ポリペプチド;
配列番号1、2または3の25位のアミノ酸残基で始まり、427位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する請求項3記載のポリペプチド;またはその相同ポリペプチド;
配列番号1、2または3の45位のアミノ酸残基で始まり、427位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する請求項3記載のポリペプチド、またはその相同ポリペプチド;
配列番号1、2または3の45位のアミノ酸残基で始まり、394位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する請求項3記載のポリペプチド、またはその相同ポリペプチド;
である。
【0107】
本発明の最も好ましいポリペプチドは:
配列番号1、2または3の45位のアミノ酸残基で始まり、427位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する請求項3記載のポリペプチド、またはその相同ポリペプチド;
配列番号1、2または3の45位のアミノ酸残基で始まり、394位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する請求項3記載のポリペプチド、またはその相同ポリペプチド;
である。
本発明によれば、配列番号1のアミノ酸配列から誘導したポリペプチド45−427および45−394は、内因性完全長PDE7A1またはPDE7A2蛋白質よりも約15倍高値のホスホジエステラーゼ触媒活性を示すことがわかっている。
【0108】
核酸
本発明の更に別の目的は、ホスホジエステラーゼ7触媒ドメインを保有し、そして、配列番号1、2または3のアミノ酸配列よりなる群から選択される配列の連続するアミノ酸少なくとも312個を有する、約427アミノ酸長までのポリペプチド;またはその相同ポリペプチドをコードする核酸配列である。
【0109】
以下の好ましい核酸:
− 配列番号1、2または3の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64位に位置するアミノ酸残基から始まり、
配列番号1、2または3の375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427位に位置するアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する前述のポリペプチド、またはその相同ポリペプチドをコードする核酸;
【0110】
配列番号1、2または3の5位のアミノ酸残基で始まり、427位のアミノ酸残基で終わるポリペプチドまたはその相同ポリペプチドをコードする核酸およびそれに相補的な核酸配列;
配列番号1、2または3の25位のアミノ酸残基で始まり、427位のアミノ酸残基で終わるポリペプチドまたはその相同ポリペプチドをコードする核酸およびそれに相補的な核酸配列;
配列番号1、2または3の45位のアミノ酸残基で始まり、427位のアミノ酸残基で終わるポリペプチドまたはその相同ポリペプチドをコードする核酸およびそれに相補的な核酸配列;
配列番号1、2または3の45位のアミノ酸残基で始まり、394位のアミノ酸残基で終わるポリペプチドまたはその相同ポリペプチドをコードする核酸およびそれに相補的な核酸配列;
が本発明に包含される。
【0111】
第1の好ましい実施態様において、核酸配列は配列番号1のヒトポリペプチドをコードする配列番号4のもの、またはそれに相補的な核酸配列番号である。
第2の好ましい実施態様において、核酸配列は配列番号2のマウスポリペプチドをコードする配列番号5もの、またはそれに相補的な核酸配列番号である。
第3の好ましい実施態様において、核酸配列は配列番号3のラットポリペプチドをコードする配列番号6のもの、またはそれに相補的な核酸配列番号である。
好ましくは、本発明のポリペプチドおよび核酸配列の何れも、単離された、および/または精製された形態にある。
【0112】
ベクター
発現ベクター
本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は適切な発現ベクター、即ち、挿入された蛋白質コード配列の転写および翻訳のための必要な要素を含むベクターに挿入することができる。このような要素は本明細書では「プロモーター」と称する。即ち、本発明のポリペプチドをコードする核酸は本発明の発現ベクター内のプロモーターに作動可能に連結されている。cDNAおよびゲノム配列の何れもクローニングして、このような調節配列の制御下に発現させることができる。発現ベクターはまた好ましくは複製起点を含む。
必要な転写および翻訳のシグナルを組み換え発現ベクター上に与えることができる。
【0113】
第1の実施態様において、本発明の組み換えベクターを用いて前記したポリペプチドを発現させ、次にそれを精製する。
別の実施態様において、発現ベクターを用いてトランスジェニックな動物を構築する。好ましいベクターは触媒ドメインの部分のみを含むかこれをまったく含まない、そして、欠失した核酸部分が異種のポリヌクレオチド配列により起きかえられている、PDE7ホスホジエステラーゼをコードするゲノムポリヌクレオチドを有する核酸配列を含むものである。
【0114】
本発明の配列を発現するために用いることができる潜在的な宿主/ベクター系としては、例えば、ウィルス(例えばワクシニアウィルス、アデノウィルス等)を感染させた哺乳類細胞系; ウィルス(例えばバキュロウィルス)を感染させた昆虫細胞系;酵母ベクターを含む酵母のような微生物;またはバクテリオファージ、DNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNAで形質転換した細菌が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターの発現要素はその強度および特異性が異なる。使用する宿主/ベクター系に応じて、数多くの適当な転写および翻訳要素の何れか1つを用いてよい。
【0115】
本発明の組み換えポリペプチドまたはその相同ポリペプチドは組み換えによりコード配列を組み込んだ後に染色体で発現させてよい。この点に関し、多くの増幅系の何れかを用いて高濃度の安定な遺伝子発現を達成してよい(Sambrook等、1989参照)。
クローニングベクター内へのDNAフラグメントの挿入のための記載した方法の何れかを用いて、適切な転写/翻訳制御シグナルおよび蛋白質コード配列よりなる遺伝子を含む発現ベクターを構築してよい。これらの方法はインビトロの組み換えDNAおよび合成方法およびインビボの組み換え(遺伝子組み換え)を包含する。
【0116】
a)プロモーター
本発明のポリペプチドの発現は当該分野で知られた如何なるプロモーター/エンハンサー要素により制御してもよいが、これらの調節要素は発現のために選択された宿主において機能可能でなければならない。本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の発現を制御するために使用してよいプロモーターとしては、例えば、SV40初期プロモーター領域(Benoist and Chambon,1981)、ラウス肉腫ウィルスの3′LTR中に含まれるプロモーター(Yamamoto等、1980)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner等、1981)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinster等、1982);原核生物発現ベクター、例えばβ−ラクタマーゼプロモーター(Villa−Kaumaroff等、1978)、またはtacプロモーター(DeBoer等、1983);参考文献“Useful Proteins from recombinant bacteria”, Scientific American,1980,242:74−94記載のもの;Gal4プロモーターのような酵母または他のカビ類由来のプロモーター要素、ADC(アルコールデヒドロゲナーゼ)プロモーター、PGK(ホスホグリセロールキナーゼ)プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター;および組織特異性を示しトランスジェニック動物において利用されている動物転写制御領域が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の好ましいプロモーターは誘導性プロモーターである。本発明の最も好ましいプロモーターはポナステロンのようなインデューサーにより誘導可能なプロモーターである。
【0117】
b)宿主発現ベクター
広範な種類の宿主/発現ベクター組み合わせを本発明の核酸の発現において用いてよい。適当なベクターには知られた細菌プラスミドの誘導物が包含され、例えば、Escherichia coliプラスミドcol EI、pCR1、pBR322、pMalC2、pET、pGEX(Smith等、1988)、pMB9およびその誘導物、PR4のようなプラスミド;ファージDNA、例えば、ファージIの多くの誘導物、例えばMN989、および他のファージDNA、例えばM13およびフィラメント状一重鎖ファージDNA;2mプラスミドまたはその誘導物のような酵母プラスミド;真核細胞で有用なベクター、例えば昆虫または哺乳類細胞で有用なベクター;プラスミドとファージDNAの組み合わせから誘導されたベクター、例えばファージDNAまたは他の発現制御配列を用いるように修飾されているプラスミド等が挙げられる。
【0118】
本発明の好ましい宿主発現ベクター組み合わせはpGEXとPBR322である。
特定の組み換えDNA分子を同定して単離した後、当該分野で知られている数種類の方法を用いてこれを増幅してよい。適当な宿主系および生育条件が確立された後、組み換え発現ベクターを増幅し、定量的に調製する。
【0119】
ベクターを当該分野で知られた方法、例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈降、リポフェクション(リソゾーム融合)、遺伝子銃の使用またはDNAベクタートランスポーター等により所望の宿主細胞に導入する(例えばWu等、1992;Wu and Wu,1988;Hartmut等、1990年3月15日出願のカナダ特許出願2,012,311号参照)。
【0120】
外因性または異種のDNAが細胞内に導入されると、細胞はこのようなDNAにより「トランスフェクト」されている。トランスフェクトされたDNAが表現型の変化を起こした場合に、外因性または異種のDNAにより細胞は「形質転換」されている。好ましくは形質転換DNAは細胞のゲノムを構成する染色体DNA内に組み込まれる(共有結合される)。
【0121】
c)バキュロウィルス発現系
発現系はまた本発明の関連においてバキュロウィルスも包含する。
例えば、バキュロウィルス発現系において、非融合転移ベクター、例えばpVL941(BamHIクローニング部位;Summers)、pVL1393(BamHI,SmaI,XbaI,EcoRI,NotI, XmaIII,BglIIおよびPstIクローニング部位;Invitrogen)、pVL1392(BglII,PstI,NotI,XmaIII,EcoRI,XbaI,SmaIおよびBamHIクローニング部位;SummersおよびInvitrogen)、およびpBlueBacIII(BamHI,BglII,PstI,NcoIおよびHindIIIクローニング部位でブルー/ホワイト組み換えスクリーニングが可能なもの;Invitrogen)、並びに、融合転移ベクター、例えばpAc700(BamHIおよびKpnIクローニング部位、ここでBamHI認識部位は開始コドンから始まる;Summers)、pAc701およびpAc702(pAc700と同様であるが読み枠が異なる)、pAc360(ポリへドリン開始コドンの36塩基対下流のBamHIクローニング部位;Invitrogen(195))およびpBlueBacHisA、B、C(3種の読み枠、BamHI,BglII,PstI,NcoIおよびHindIIIクローニング部位、ProBond精製用のN末端ペプチドおよびプラークのブルー/ホワイト組み換え体スクリーニング;Invitrogen(220))の両方を使用できる。
【0122】
本発明のバキュロウィルス発現系における好ましい転移ベクターはBackPak(Clontech)およびpBlueBacHisA、B、Cである。
本発明の配列を発現するための組み換え転移ベクターの別の好ましい種類はSpodoptera frugiperda由来のSF9細胞系統(ATCC No.CRL 1711)をトランスフェクトするために使用してよいpVL1392/1393バキュロウィルス転移ベクター(Pharmingen)のようなバキュロウィルスベクターよりなる。
本発明の最も好ましいバキュロウィルス組み換え発現ベクターはSf21細胞系統をトランスフェクトするために使用してよいAcMNPVベクター(Invitrogen)よりなる(Cawley P.等、1977)。
バキュロウィルス発現系における本発明のポリペプチドの発現のための別の適当なベクターはCHAI等(1993)、VLASAK(1983)およびLENHARD等(1996)に記載されたものである。
【0123】
d)哺乳類発現系
本発明において使用するために挙げられる哺乳類発現ベクターには、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)プロモーターのような誘導性プロモーターを有するベクター、例えばDHFR発現ベクターを有する何れかの発現ベクター、またはDHFR/メトトレキセート同時増幅ベクター、例えばpED(PstI,SalI,SbaI,SmaIおよびEcoRIクローニング部位、クローニングされた遺伝子とDHFRの両方を発現するベクター(Kaufman等、1991)が包含される。或いは、グルタミン合成酵素/メチオニンスルホキシミン同時増幅ベクター、例えばpEE14(HindIII,XbaI,SmaI,SbaI,EcoRIおよびBclIクローニング部位、ここでベクターはグルタミン合成酵素とクローニングされた遺伝子を発現する)を用いることもできる。別の実施態様において、エプスタイン・バーウィルス(EBV)の制御下のエピソーム発現を指向するベクターも使用でき、例えば、pREP4(BanHI,SfiI,XhoI,NotI,NheI,HindIII,NheI,PvuIIおよびKpnIクローニング部位、構成的RSV−LTRプロモーター、ハイグロマイシン選択性マーカー;Invitrogen)、pCEP4(BamHI,SfiI,Xhol,NotI,NheI,HindIII,NheI,PvuIIおよびKpnIクローニング部位、構成的hCMV前初期遺伝子、ハイグロマイシン選択性マーカー;Invitrogen)、pMEP4(KpnI,PvuI,NheI,HindIII,NotI,XhoI,SfiI,BanHIクローニング部位、誘導性メタロチオネインIIa遺伝子プロモーター、ハイグロマイシン選択性マーカー:Invitrogen)、pREP8(BamHI,XhoI,NotI,HindIII,NheIおよびKpnIクローニング部位、RSV−LTRプロモーター、ヒスチジノール選択性マーカー;Invitrogen)、pREP9(KpnI, NheI,HindIII,NotI,XhoI,SfiIおよびBamHIクローニング部位、RSV−LTRプロモーター、G418選択性マーカー;Invitrogen)およびpEBVHis(RSV−LTRプロモーター、ハイグロマイシン選択性マーカー、N末端ペプチドはProBond樹脂精製可能であり、エンテロキナーゼにより切断される;Invitrogen)が挙げられる。本発明において使用するための選択可能な哺乳類発現ベクターにはpRc/CMV (HindIII, BstXI, NotI, SbaIおよびApaIクローニング部位、G418選択;Invitrogen)、pRc/RSV(HindIII,SpeI,BstXI,NotI,Xbalクローニング部位、G418選択;Invitrogen)その他が包含される。本発明により使用するためのワクシニアウィルス哺乳類発現ベクター(Kaufman,1991参照、前出)には例えばpSC11(Smalクローニング部位、TK−およびβ−gal選択)、pMJ601(SalI,SmaI,AflI,NarI,BspMII,BamHI,ApaI,NheI,SacII,KpnIおよびHindIIIクローニング部位;TK−およびβ−gal選択)、および、pTKgptF1S(EcoRI,PstI,SalI,AccI,HindII,SbaI,BamHIおよびHpaクローニング部位、TKまたはXPRT選択)が包含される。
好ましい哺乳類発現ベクターはpIND、pcDNA3、PcDNA4HisA,B,C,Dである。
【0124】
e)酵母発現系
酵母発現系もまたABC1ポリペプチドを発現するために本発明により使用できる。例えば、非融合pYES2ベクター(Xbal,SphI,ShoI,NotI,GstXI,EcoRI,BstXI,BamHI,SacI,Kpn1およびHindIIIクローニング部位;Invitrogen)または融合pYESHisA,B,C(XbaI,SphI,ShoI,NotI,BstXI,EcoRI,BamHI,SacI,KpnIおよびHindIIIクローニング部位、N末端ペプチドはProBond樹脂精製可能であり、エンテロキナーゼにより切断される;Invitrogen)を僅か2種の例として挙げたが、これらは本発明により使用することができる。
本発明の他の好ましい組み換えベクターは当業者のよく知る哺乳類において機能可能な発現ベクターを包含する。
【0125】
相同組み換えベクター
ノックアウト動物
PDE7酵素の触媒ドメインの本発明による決定により、今回、PDE7酵素の触媒ドメインをコードする部分またはその一部が欠失しているポリヌクレオチド構築物の設計が可能になる。
好ましい実施態様において、上記定義したポリヌクレオチド構築物は非機能性触媒ドメインを有するPDE7をコードし、欠失した核酸部分が異種ポリヌクレオチド配列により置き換えられている、ゲノムポリヌクレオチドを含んでいる。
該構築物は、相同組み換えにより哺乳類のゲノム内部に天然に存在するPDE7配列の部分を置きかえるために、ベクター内に含まれていてよい。
この特定の実施態様によれば、このような本発明の組み換えベクターを用いてトランスジェニックなノックアウト動物、好ましくはトランスジェニックなノックアウト哺乳類、最も好ましくはトランスジェニックなノックアウトマウスおよびラットを作成してよい。該トランスジェニックなノックアウト哺乳類は触媒ドメインよりも大きい核酸部分の相同組み換えによる欠失を介して作成されたトランスジェニックなノックアウト哺乳類よりも、薬物の作用の良好なモデルを与える。
【0126】
ヒト、マウスまたはラットのPDE7蛋白質をコードするゲノムポリヌクレオチドを単離するためには、当業者の知るとおり、以下のもの:
− 参照番号L12052のもとにGenBank/EBIデータベース中に開示されているヒトPDE7A1の配列;
− 参照番号U67932のもとにGenBank/EBIデータベース中に開示されているヒトPDE7A2の配列;
− 参照番号U68171のもとにGenBank/EBIデータベース中に開示されているマウスPDE7A2の配列;
− 参照番号AJ251860のもとにGenBank/EBIデータベース中に開示されているマウスPDE7ABの配列;および、
− 参照番号U77880のもとにGenBank/EBIデータベース中に開示されているラットPDE7A1の配列;
をそれぞれ挙げることができる。
【0127】
上記核酸の第1の実施態様において、ゲノムポリヌクレオチドは、触媒ドメインまたはその一部が欠失しているヒト、マウスまたはラットPDE7をコードする。
上記核酸の第2の実施態様において、異種ポリヌクレオチドは選択マーカーを有する。
上記核酸の第3の実施態様において、異種ポリヌクレオチドはその5′末端に少なくともloxP配列およびその3′末端に少なくともloxP配列を有する。loxP配列は8bpの保存された配列により分断された13bpの2つの回文配列を有する(HOESS等、1986)。
【0128】
同一の方向を有する2つのloxP部位の間のCre酵素による組み換えにより、DNAフラグメントの欠失が起こる。相同組み換え法と組み合わせて用いるCre−loxP系はGU等(1993,1994)により記載されている。
触媒ドメインをコードする配列またはその一部を欠失しているゲノムPDE7配列を有するベクターは、同じ方向のloxP部位により選択マーカーが隣接するような方法で設計する。Cre酵素により処理により、選択性マーカーを排除しつつ、相同組み換え事象により挿入されている目的のPDE7ゲノムポリヌクレオチドを移動させることが可能である。
【0129】
2種の選択性マーカー、即ち、組み換え事象を選択するために陽性選択マーカーおよび相同組み換え事象を選択するための陰性選択マーカーが必要である。
Cre−loxP系を用いるベクターおよび方法はZOU等(1994)により記載されている。
触媒ドメインをコードする核酸部分またはその一部が欠失しているマウスPDE7ホスホジエステラーゼをコードするゲノムポリヌクレオチドを該核酸が有する本発明の核酸の特定の実施態様においては、当業者は後に記載する実施例を好都合に参照してよい。
【0130】
本発明の「相同組み換えベクター」の構築例を図8に示す。
本発明の更に別の特徴において、上記定義したポリペプチドをコードする核酸は調節配列に作動可能に連結している。
好ましくは、調節配列は誘導性プロモーターよりなる。
より好ましくは、調節配列はポナステロンのようなインデューサーにより誘導可能なプロモーターよりなる。
【0131】
その他の種類の相同組み換え動物
相同組み換え動物の別の種類は、修飾されていないPDE7酵素をコードし、そして本発明のポリペプチドをコードするトランスジーンが相同組み換えにより付加されている遺伝子を含む動物である。即ち、該相同組み換え動物において、PDE7酵素が過剰発現される。
【0132】
宿主細胞
本発明の別の目的は上記した組み換えベクターの1つにより形質転換またはトランスフェクトされている本発明の核酸により形質転換またはトランスフェクトさている宿主細胞よりなる。
即ち、第1の実施態様において、本発明の組み換え宿主細胞は、ホスホジエステラーゼ7触媒ドメインを保有し、そして、配列番号1、2または3のアミノ酸配列よりなる群から選択される配列の連続するアミノ酸少なくとも312個を有する、約427アミノ酸長までのポリペプチド;またはその相同ポリペプチドをコードする核酸を有する。
【0133】
第2の実施態様において、本発明の組み換え宿主細胞は、機能的触媒ドメインを含まないPDE7をコードし、欠失した核酸部分が異種ポリヌクレオチド配列により置き換えられている、ゲノムポリヌクレオチドを有する核酸配列を有する。
本発明に記載したもののような組み換えベクターで形質転換(原核細胞)された、またはトランスフェクト(真核細胞)された宿主細胞が包含される。
【0134】
本発明の発現ベクターのレシピエントとして使用する好ましい宿主細胞は:
a)原核生物宿主細胞:Escherichia coli菌株、Bacillus subtilisまたはSalmonella typhimurium,Sf9細胞(ATCC No.CRL 1711)、Sf21細胞(Cawley P.等、1977);b)真核生物宿主細胞:Hela細胞(ATCC No.CCL2)、COS細胞(ATCC No.CRL 1650;No.CRL 1651)またはCHO細胞(ATCC No.CCL−61);
である。
【0135】
本発明のホスホジエステラーゼ触媒活性を有するポリペプチドの発現のために用いられる最も好ましい細胞系統は二量体エクジソン受容体を発現するCHO細胞系統よりなる(Invitrogen Inc.)。
【0136】
機能的触媒ドメインを含まないPDE7をコードし、欠失した核酸部分が異種ポリヌクレオチド配列により置き換えられている、ゲノムポリヌクレオチドを有する核酸配列を含む相同組み換えベクターを用いて宿主細胞のトランスフェクションを行なう場合は、使用してよい好ましい宿主細胞は、哺乳類の接合体、例えばネズミまたはラットの接合体、例えばBRINSTER等(1985)の記載するものである。
【0137】
ベクターはCapecchi等(1991)の記載するもののような胚、胎仔または成体の多能性幹細胞に取りこむことができる。胚性幹細胞はインビトロで培養されている胚盤胞または分割球から単離することができ、そして多くの細胞世代に渡り安定して、即ち分化を行なうことなく、保持することができる。外来性のDNAはエレクトロポレーションにより胚性幹細胞内に取りこむことができる。所望の外来性DNAを保有する幹細胞を選択した後、これを胚盤胞の内細胞塊内に注入する。
【0138】
本発明による好ましいES細胞系統はES−E14 TG2a(ATCC No.CRL−1821)、ES−D3(ATCC No.CRL 1934およびNo.CRL−11632)、TS001(ATCC No.CRL−11776)、36.5(ATCC No.CRL−11116)である。未介入状態にES細胞を維持するためには、この胚性表現型を温存するような適切なシグナルを与え、ES細胞付着のためのマトリックスとなるような生育抑制支持細胞の存在下にこれらを培養する。好ましい支持細胞はAbbondanzo等(1993)により記載されているもののような培地中に維持された実質的に如何なるマウス系統の13日〜14日齢の胚の組織から樹立された、またはPEASEおよびWILLIAMS(1990)に記載されているもののようなLIFの抑制濃度の存在下における、一次胚性線維芽細胞よりなるものであってよい。
【0139】
PDE7活性を阻害する化合物を選択するための方法/過程
本発明の新しいポリペプチドはPDE7酵素活性を阻害する化合物をスクリーニングまたは選択するための方法に含められる強力な手段を与える。
即ち、本発明の更に別の目的は、PDE7活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニングのための第1の方法であって、該方法は下記工程:
a)PDE7酵素の触媒ドメインを少なくとも有する本発明のポリペプチドの所望の量を準備すること;
b)工程a)において準備したポリペプチドの所望の量を試験すべき候補化合物の所望の量を含有する緩衝溶液に添加すること;
c)ホスホジエステラーゼ酵素活性を測定すること;および、
d)工程c)で得られた測定値酵素活性を候補化合物の非存在下に得られた酵素活性と比較すること;
を包含する上記方法よりなる。
【0140】
上記したスクリーニングの第1の方法の好ましい実施態様において、工程a)で添加したポリペプチドは、配列番号1の45位のアミノ酸残基で始まり、427位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列、またはその相同ポリペプチドよりなる。
【0141】
好ましくは、PDE7蛋白質触媒ドメインを少なくとも有する本発明のポリペプチドは上記したように組み換え宿主細胞により、最も好ましくは組み換えCHO細胞系統によるか、または、Sf9およびSf21細胞系統のようなSpodoptera frugiperdaに由来する細胞系統により組み換え生産される。
【0142】
最も好ましくは、上記したスクリーニングにおいて使用される本発明のポリペプチドは、該ポリペプチドを発現する組み換え宿主細胞の細胞溶解物に由来する。細胞溶解物は例えば培養した組み換え宿主の超音波処理により得てよい。
【0143】
本発明のポリペプチドは更に、例えば、当業者の知る逆相および/またはカチオン交換HPLCのような高速液体クロマトグラフィーにより精製してよい。
或いは、上記したスクリーニング方法を実施するために用いる本発明のポリペプチドは、均質な溶液中または固相中のいずれかの化学合成の従来法により調製してもよい。
【0144】
このような化学的ポリペプチド合成法の例示される実施態様としては、HOUBEN WEYL(1974)により記載された均質溶液法を参照できる。該ポリペプチドはまたMERRIFIELD(1965a;1965b)により記載された固相合成法に従って調製してもよい。
上記したスクリーニング法に従って、ホスホジエステラーゼ活性の程度をPDE7のcAMP基質の加水分解の測定により調べる。
【0145】
好ましくは、上記スクリーニング方法の工程a)において添加する本発明のポリペプチドの量は、基質の初期濃度の低下を15%未満とする、例えば本発明のポリペプチドの添加前のcAMPをもとにして15%未満とする試験混合物中の終濃度をもたらす量として定義される。好ましくは、酵素基質として使用するcAMPは例えば[H]−cAMPの形態のもとに放射標識される。
【0146】
スクリーニング法の好ましい実施態様において、候補阻害剤化合物の所望の量の存在下または非存在下の本発明のポリペプチドの所望の量を含有する試験混合物およびcAMPを適当な緩衝溶液中37℃でインキュベートしたのちに、酵素反応を停止させる試薬を添加する。
【0147】
好ましくは、インキュベーション時間は5〜20分であり、好ましくは約10分である。
好ましくは、酵素反応を停止させるために使用する試薬はケイ酸塩ビーズよりなる。
好ましくは、各試験混合物中の酵素活性は放射能の濃度を測定することにより調べる。
【0148】
次に、候補化合物の存在下に得られたホスホジエステラーゼ触媒活性の測定値および工程b)を省略した場合(即ち候補化合物の非存在下)に得られた数値を比較し、IC50値を測定する。IC50値は上記候補化合物の非存在下に行なった対照実験において得られたcAMPの加水分解と比較した場合に、cAMPの加水分解の50%抑制をもたらす試験した候補化合物の濃度を示す。IC50値は、当業者のよく知るHill傾きを有するシグモイドモデルを用いて計算してよい。
【0149】
本発明はまたPDE7活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニングのためのキットに関し、該キットは下記成分:
a)PDE7蛋白質の触媒ドメインを少なくとも有する本発明のポリペプチド;b)場合により、ホスホジエステラーゼ触媒活性測定を行なうために必要な試薬;
を包含する。
【0150】
好ましくは、上記キットに含まれる本発明のポリペプチドは水溶液または凍結乾燥された粉末の形態である。
ホスホジエステラーゼ触媒活性の測定を行なうために必要な試薬は適切な緩衝液および放射標識cAMPを包含する。
【0151】
本発明の更に別の目的はPDE7活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニングのための第2の方法よりなり、該方法は下記工程:
a)適切な培地中にPDE7の触媒ドメインを少なくとも有する本発明のポリペプチドを発現する組み換え宿主細胞を準備すること;
b)試験すべき候補化合物の所望の濃度を該培地に添加すること;
c)細胞内ホスホジエステラーゼ酵素活性を測定すること;および、
d)工程c)で得られた酵素活性を工程b)を省略した場合に得られる酵素活性と比較すること;
を包含する。
【0152】
一般的に、工程a)で培養する宿主細胞は、上記した何れかの培養可能な宿主細胞、そして好ましくは哺乳類起源の宿主細胞であってよい。
上記したスクリーニング方法の第1の好ましい実施態様において、組み換え宿主細胞は二量体エクジソン受容体を発現するCHO細胞系統よりなる。
上記したスクリーニング方法の別の好ましい実施態様において、使用する組み換え宿主細胞は、本発明のポリペプチドをコードする核酸を有する組み換えベクターでトランスフェクトされており、ここで該核酸は誘導性調節配列に作動可能に連結されている。
【0153】
この好ましい実施態様において、誘導性調節配列が応答するインデューサー化合物をスクリーニング方法の工程a)において添加してよく、これにより、本発明のポリペプチドの高い発現濃度を達成でき、即ち、スクリーニング方法の感度を高めることができる。
【0154】
最も好ましくは、誘導性調節配列は誘導性ベクターpIND(Invitrogen)中に含まれるもののようなポナステロンに応答する。
上記したスクリーニング方法によれば、工程a)の間に誘導性調節配列を活性化するインデューサー化合物の存在下に組み換え宿主細胞を培養する。
好都合には、インデューサー化合物存在下の宿主細胞のインキュベーション時間は1〜20時間、好ましくは4〜15時間、最も好ましくは6〜10時間である。
誘導の後、培地を除去し、新しい培地を添加して試験を行う。候補化合物を所望の濃度(例えば一連の漸増濃度)で新しい培地に添加し、細胞を10〜60分、好ましくは、20〜45分、最も好ましくは約30分間37℃でインキュベートする。
【0155】
好ましくは、停止溶液の添加の前に工程b)の終了時にアデニル酸シクラーゼ活性化剤を添加することにより反応を停止する。
最も好ましくは、アデニル酸シクラーゼ活性化剤は化合物フォルスコリンよりなる。
アデニル酸シクラーゼ活性化剤存在下のインキュベーションの時間は、好都合には5〜30分間、好ましくは10〜20分間、最も好ましくは約15分間である。
上記したス2次スクリーニング方法によれば、ホスホジエステラーゼ酵素活性は、工程b)の間に生産される細胞内cAMPの量を測定することにより細胞溶解の後に測定する。
【0156】
細胞溶解物中のcAMP濃度の測定は、cAMPに対する抗体を用いて行なってよい。
最も好ましくは、工程b)の間に生産される細胞内cAMPの量の測定は、競合試験においてcAMPに対するポリクローナル抗体を用いて細胞溶解物中において行ない、この試験では、細胞溶解物中のcAMPは、cAMPを自らに共有結合させて保有しているアルカリホスファターゼ分子と、上記抗cAMPポリクローナル抗体への結合に関して競合する。
最も好ましくは、細胞質ゾルを細胞溶解物の粒状画分から、例えば遠心分離により分離した後、上記したとおり細胞質ゾル画分に対するcAMPの含量を測定する。
【0157】
次に、試験した候補化合物の漸増濃度の存在下に測定した細胞内cAMPの値と工程b)を省略した場合(即ち候補化合物の非存在下)のcAMP測定値とを比較し、候補化合物のAUC(曲線下部面積)値を求める。
所定の候補化合物のAUC値はスクリーニング方法の工程b)の間に生産された細胞内cAMPの量の100〜2000%の増大をもたらす上記候補化合物の濃度を示す。
【0158】
本発明はまた、PDE7ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニングのためのキットに関し、該キットは下記成分:
a)本発明のポリペプチドを発現する本発明の組み換え宿主細胞;および、
b)場合により、ホスホジエステラーゼ触媒活性測定を行なうために必要な試薬;
を包含する。
【0159】
PDE7活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニングのための上記した第2の方法の別の実施態様においては、上記方法は、下記工程:
a)適切な培地中のPDE7の触媒ドメインを少なくとも有する本発明のポリペプチドを同時発現する組み換え宿主細胞およびレポーター遺伝子を準備すること;
b)試験すべき候補化合物の所望の濃度を該培地に添加すること;
c)レポーター遺伝子発現を測定すること;および、
d)工程c)で得られた酵素活性を工程b)を省略した場合に得られる酵素活性と比較すること;
を包含する。
【0160】
一般的に、工程a)で培養する宿主細胞は、上記した何れかの培養可能な宿主細胞、そして好ましくは哺乳類起源の宿主細胞であってよい。
上記したスクリーニング方法の第1の好ましい実施態様において、組み換え宿主細胞は二量体エクジソン受容体を発現するCHO細胞系統よりなる。
上記したスクリーニング方法の別の好ましい実施態様において、使用する組み換え宿主細胞は、本発明のポリペプチドをコードする核酸を有する組み換えベクターでトランスフェクトされており、ここで該核酸は誘導性調節配列に作動可能に連結されている。
【0161】
この好ましい実施態様において、誘導性調節配列が応答するインデューサー化合物をスクリーニング方法の工程a)において添加してよく、これにより、本発明のポリペプチドの高い発現濃度を達成でき、即ち、スクリーニング方法の感度を高めることができる。
最も好ましくは、誘導性調節配列は誘導性ベクターpIND(Invitrogen)中に含まれるもののようなポナステロンに応答する。
最も好ましくはレポーター遺伝子はβ−ラクタマーゼ遺伝子である。
上記したスクリーニング方法によれば、工程a)の間に誘導性調節配列を活性化するインデューサー化合物の存在下に組み換え宿主細胞を培養する。
好都合には、インデューサー化合物存在下の宿主細胞のインキュベーション時間は1〜20時間、好ましくは4〜15時間、最も好ましくは6〜10時間である。
【0162】
誘導の後、培地を除去し、新しい培地を添加して試験を行う。候補化合物を所望の濃度(例えば一連の漸増濃度)で新しい培地に添加し、細胞を10〜60分、好ましくは、20〜45分、最も好ましくは約30分間37℃でインキュベートする。
好ましくは、使用する細胞の濃度はウェルあたり15000〜40000個、最も好ましくは、ウェル当たり30000〜40000個であり、そしてより好ましくはウェル当たり30000個である。
好ましくは、停止溶液の添加の前に工程b)の終了時にアデニル酸シクラーゼ活性化剤を添加することにより反応を停止する。
最も好ましくは、アデニル酸シクラーゼ活性化剤は化合物フォルスコリンよりなる。
アデニル酸シクラーゼ活性化剤存在下のインキュベーションの時間は、好都合には5〜30分間、好ましくは10〜20分間、最も好ましくは約15分間である。
【0163】
本発明はまた、PDE7ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニングのためのキットに関し、該キットは下記成分:
a)本発明のポリペプチドおよびレポーター遺伝子を同時発現する本発明の組み換え宿主細胞;
b)場合により、レポーター遺伝子発現測定を行なうために必要な試薬;
を包含する。
【0164】
前記した第1のインビトロのスクリーニング方法は、緩衝溶液中に含まれるPDE7の触媒ドメインを少なくとも有する本発明のポリペプチドを使用する。本発明の特定の実施態様において、上記した第1のインビトロのスクリーニング方法をPDE7またはホスホジエステラーゼ活性の阻害剤に関する一次スクリーニング試験として用いる。
【0165】
本発明の上記第1のスクリーニング方法に従って陽性として選別された候補化合物は次に、PDE7触媒ドメインを少なくとも有する本発明のポリペプチドを発現ずる組み換え宿主細胞を使用する上記した第2のスクリーニング方法に従って試験される。該第2のスクリーニング方法により、細胞内、即ち、生理学的な環境における、PDE7阻害剤の選択が可能になる。
【0166】
従って本発明はPDE7活性を阻害する化合物をインビトロで選択するための方法に関し、該方法は下記工程:
a)候補化合物を用いて上記した本発明の第1のスクリーニング方法を実施すること;および、該候補化合物がホスホジエステラーゼ活性を阻害することがわかった場合は、次に、
b)工程a)で選択された阻害剤化合物を用いて本発明の第2のスクリーニング方法を実施すること;
を包含する。
【0167】
本発明の第1および第2のスクリーニング方法を組み合わせた上記方法に従って陽性として選択された候補化合物は治療上の価値のある潜在的な薬剤であることは言うまでもない。
本発明によれば、上記したスクリーニングまたは選択方法のいずれか1つに従って選択されたPDE7阻害剤化合物がPDE7に対して選択的であり、他のホスホジエステラーゼ酵素の1つ以上を阻害しないことを確認してもよい。
【0168】
即ち、本発明はPDE7活性を選択的に阻害する化合物を選択するための方法に関し、該方法は下記工程:
a)上記した第1および/または第2のスクリーニング方法を実施することによりPDE7ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物を選択すること;および、
b)PDE7以外の少なくとも1つのPDE酵素のホスホジエステラーゼ活性を阻害する能力がないことを、選択された阻害剤化合物について調べること;
を包含する。
【0169】
上記選択方法の第1の好ましい実施態様において、PDE3およびPDE4酵素のホスホジエステラーゼ活性を阻害する能力がないことを、選択された阻害剤化合物について調べる。
上記選択方法の第2の好ましい実施態様において、PDE1、PDE2、PDE3、PDE4、PDE5およびPDE6酵素のホスホジエステラーゼ活性を阻害する能力がないことを、選択された阻害剤化合物について調べる。
実施例で示すとおり、当業者はPDE4の触媒活性の測定方法を開示しているTORPHY等(1993)の文献またはKOVALA等(1997)の文献を好都合に参照してよい。
【0170】
当業者はPDE3の触媒活性の測定方法を開示しているManganellio等の文献を好都合に参照してよい。
当業者はPDE5の触媒活性の測定方法を開示しているFINK等(1999)の文献を好都合に参照してよい。
当業者はPDE1の触媒活性の測定のための試験法を開示しているSONNENBURG等(1995)の文献を好都合に参照してよい。
当業者はPDE2の触媒活性の測定のための試験法を開示しているBEAVO等(1970)の文献を好都合に参照してよい。
当業者はPDE6の触媒活性の測定のための試験法を開示しているBAEHR等(1979)およびFUNG等(1990)の文献を好都合に参照してよい。
【0171】
本発明はまた上記した方法の何れか1つにより選択されたPDE7阻害剤化合物に関する。
本発明は更にまた医薬組成物の製造のための上記した方法の何れか1つにより選択されたPDE7阻害剤化合物の使用に関する。
本発明は、最初のATGコドンから残基81(L22M2)までの配列の逐次的欠失により発生するHCP1のNH末端欠失よりなる配列としてミカエリ等(1993)により開示されたアミノ酸配列には関係しない。
本発明を図面および以下の実施例により更に詳述するが、これらに限定されない。
【0172】
【実施例】
A.材料および方法
材料
制限酵素はRoche Molecular Biochemicalsより購入した。蛋白質濃度は標準物質としてBSAを用いながらBradfordの方法に従って測定した。配列決定はプラスミドDNA2μgおよび適切な配列決定オリゴヌクレオチド5pmol(DNA sequencing Kit,Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction,Perkin Elmer)を用いて自動配列決定装置(ABIモデル373;Perkin Elmer)上で行なった。SDS/PAGEはLaemmli(1970)の方法に従って行なった。
【0173】
PDE7A1cDNAのクローニング
全RNAをStratageneのクローニングシステムキット(La Jolla CA,USA)の試薬を用いて、製造元の取扱説明書に従って、ヒトリンパ球T細胞(CD4+)から抽出した。cDNAは、オリゴd(T)プライマーおよびMMLV逆転写酵素を終濃度50μL(Roshe−Molecular System Branchburg,NJ)を用いながら全RNA10μgから合成した。次にAmplitaq cDNAポリメラーゼ(Roche−Molecular System,Branchburg,NJ)を用いたPCR増幅の鋳型として第1の鎖cDNA産物1μLを用いることにより、オープンリーディングフレームを隣接する公開された配列(Michaeli等、1997;Bloom and Beavo,1996)から設計したオリゴヌクレオチドを用いてヒトPDE7A1をコードするcDNAを作成した。プライマーの配列は以下に示すとおりである。
PDE7A1 CGGGGATCCATGGAAGTGTGTTACCAG (配列番号12)
PDE7A2 CGCGTCTAGATTATGATAACCGATTTTCCTGAGGTAA (配列番号13)
【0174】
上記プライマーにおいて下線を付した制限酵素部位BamHIおよびXbalを用いてバキュロウィルス発現ベクターpBlueBacHisAまたはpcDNA4ベクター(Invitrogen,San Diego,Ca)内にPCR産物をサブクローニングした。PDE7Aコード配列のPCR増幅産物をタグ6×Hisに隣接して位置させ、組み換え酵素のアミノ末端にタグを有する融合蛋白質を作成した。全ての構築物を配列決定し、使用前にチェックした。これらのクローンはpcDNA4his7A1およびpBacHis7A1と命名した。
【0175】
PDE7A1の完全なオープン読み枠はKozak配列GCCACCATG(Kozak M.,JBC,266,1991)を含むpcDNA3にもクローニングし、これをPDE7A1の開始コドンの直ぐ上流に付加した。このクローンはpcDNAKoz7Aと命名した。プライマーは以下の配列を有していた。
PDE7AK1  CGGGATCCGCCACCATGGAAGTGTGTTACC (配列番号14)
PDE7AK2 CGCGTCTAGATTATGATAACCGATTTTCCTGAGGTAA (配列番号13)
【0176】
更に、PDE7A1の3′および5′の未翻訳領域(UTR)の配列(Michaeli等,(1997)をpcDNA3の内のPDE7A1の全オープンリーディングフレームに付加した。即ち、PDE7A1の3′UTRの1050bpおよびPDE7A2の5′UTRの152bpを以下のプライマーを用いてヒトCD4+T細胞由来のcDNAからRT−PCRにより増幅した。
UCR3′1 CCGGGGGTACCGGCGGCCGCGGCAGGGCGGGCGCCG (配列番号15)
UCR3′2 GGGGGATCCTGAATACGCCCGCCCTGCCTCCG (配列番号16)
UCR5′1 GGGTCTAGACCCCAGAACCAGTGGGACAAACTGCCTCCT (配列番号17)
UCR5′2 GGCGGGCCCTGGAGAAACATAACATGCACGTCAC(配列番号18)
【0177】
PDE7A1コード配列の開始コドンの直ぐ上流に5′UTR配列を、そして終止コドンの直ぐ下流3′UTRに付加した。上記プライマーにおいて下線を付している制限酵素部位はそれぞれKpnI,BamHI,XbaIおよびSmaIであり、pcDNAKoz7Aへのサブクローニングを容易にするために用いた。このクローンをpcDNA3′5′7Aと命名した。
全構築物の配列は使用する前に確認した。
【0178】
PDE7Aのアミノおよびカルボキシ末端の欠失の構築
PDE7A1のNおよびC末端を連続的に欠失させて触媒ドメインをマッピングし、推定阻害ドメインを同定した。鋳型としての完全長PDE7A1cDNAおよびヒスチジンタグから下流のpcDNA4(Invitrogen)のBamHI/XbaI部位へのサブクローニングを可能にする制限部位(BamHIおよびXbaI)を含むプライマーを用いたPCR増幅により11の構築物(図2)を作成した。
【0179】
アミノ末端欠失
以下のプライマーを用いて最初の12アミノ酸を欠失する構築物PDE7Δ12を作成し、PDE7A;13−483とした。
H1  CCGGGATCCGACAGGCCGGTCCCCCAGCACGTCCTC (配列番号19)
H2 CGCGTCTAGATTATGATAACCGATTTTCCTGAGG (配列番号20)
以下のプライマーを用いて最初の30アミノ酸を欠失する構築物PDE7Δ30を作成し、PDE7A;31−483とした。
A1  CCGGGATCCCCCCGGCAGCTCTCTCAGAGGCGT (配列番号21)
H2 CGCGTCTAGATTATGATAACCGATTTTCCTGAGG (配列番号20)
【0180】
以下のプライマーを用いて最初の60アミノ酸を欠失する構築物PDE7Δ60を作成し、PDE7A;61−483とした。
B1   CCGGGATCCTTATACATTCGTATGCTAGGAG (配列番号22)
H2 CGCGTCTAGATTATGATAACCGATTTTCCTGAGG (配列番号20)
以下のプライマーを用いて最初の80アミノ酸を欠失する構築物PDE7Δ80を作成し、PDE7A;81−483とした。
C1  CCGGGATCCAGAAGAGGTTCTCACCCATATA (配列番号23)
H2 CGCGTCTAGATTATGATAACCGATTTTCCTGAGG (配列番号20)
【0181】
以下のプライマーを用いて最初の100アミノ酸を欠失する構築物PDE7Δ100を作成し、PDE7A;101−483とした。
D1  CCGGGGATCCGTGTCTGTCTCTGCAAGGAATATCAGA (配列番号24)
H2 CGCGTCTAGATTATGATAACCGATTTTCCTGAGG (配列番号20)
以下のプライマーを用いて最初の120アミノ酸を欠失する構築物PDE7Δ120を作成し、PDE7A;121−483とした。
E1  CCGGGGATCCATGTCACGCTTTTTTCGTGGTACTG (配列番号25)
H2 CGCGTCTAGATTATGATAACCGATTTTCCTGAGG (配列番号20)
【0182】
以下のプライマーを用いて最初の140アミノ酸を欠失する構築物PDE7Δ140を作成し、PDE7A;141−483とした。
F1  CCGGGGATCCAATGGACAAGCCAAGTGTATGCT (配列番号26)
H2 CGCGTCTAGATTATGATAACCGATTTTCCTGAGG (配列番号20)
以下のプライマーを用いて最初の170アミノ酸を欠失する構築物PDE7Δ170を作成し、PDE7A;171−483とした。
G1  CCGGGGATCCATGGTAAGCTTAACCTTTCATTTA (配列番号27)
H2 CGCGTCTAGATTATGATAACCGATTTTCCTGAGG (配列番号20)
【0183】
カルボキシ末端欠失
PDE7Aのカルボキシ末端領域の逐次的欠失をPDE7Δ100を鋳型として用いながら行なった。
構築物PDE7;101−450は以下のプライマーを用いて作成した。
D1  CCGGGGATCCGTGTCTGTCTCTGCAAGGAATATCAGA (配列番号24)
I2    CGCGTCTAGATTAGCTGGCTTTATTCAGCC (配列番号28)
構築物PDE7;101−430は以下のプライマーを用いて作成した。
D1  CCGGGGATCCGTGTCTGTCTCTGCAAGGAATATCAGA (配列番号24)
J2  CGCGTCTAGATTACCTGGCCCATTCTGTAAATAAA (配列番号29)
構築物PDE7;101−420は以下のプライマーを用いて作成した。
(数は完全長PDE7A1酵素配列と照合させたものである。)
D1  CCGGGGATCCGTGTCTGTCTCTGCAAGGAATATCAGA (配列番号24)
K2 CGCGTCTAGATTATAGGTAAGTCATAAAACCAATCT (配列番号30)
【0184】
CHO細胞培養
二量体エクジソン受容体を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞(EcrCHO)(Invitrogen)を、146mg/l L−グルタミン、10%(v/v)ウシ胎児血清(FCS)、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mMヒポキサンチン、0.4μMアミノプテリン、16μMチミジンおよび100μg/mlゲンタマイシンを添加したHam’s F−12栄養混合物(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)を含有する完全生育培地中、5%二酸化炭素/95%空気の雰囲気下37℃で培養した。培地は3〜5日おきに交換し、細胞は1週間に1回の割合でトリプシン処理後1:2に分割した。
【0185】
トランスフェクション試験および細胞抽出液の調製
トランスフェクションの3日前にCHO細胞を150cmのフラスコ当たり2×10個の細胞密度でプレーティングした。製造元の取扱説明書(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)に従ってリポフェクタミンを用いて内毒素非含有プラスミドDNA20μgで細胞をトランスフェクトした。48時間インキュベートした後、細胞をリン酸塩緩衝食塩水(PBS)で2回洗浄し、トリプシン処理し、遠心分離により回収し、終濃度で2mMベンズアミジン、2μg/mlダイズトリプシン阻害剤、50μMPMSFおよび100μg/mlバシトラシンの蛋白質分解酵素阻害剤の混合物を添加したPDE抽出緩衝液(Bis Tris 20mM(pH6.5),EDTA 10mM,DTT 2.5M)300μL中に再懸濁した。細胞を超音波処理し、14000gで20分間遠心分離し、得られた上澄みのcAMPホスホジエステラーゼ活性を分析した。
【0186】
Molt4細胞の培養および細胞抽出液の調製
37℃の10%(v/v)ウシ胎児血清(Gibco)、1mMピルビン酸ナトリウムおよび100μg/mlゲンタマイシン添加RPMI1640培地グルタミン中でMolt4を培養した。培養した細胞(4×108)を遠心分離し、冷リン酸塩緩衝食塩水で1回洗浄した。次に細胞を終濃度で2mMベンズアミジン、2μg/mlダイズトリプシン阻害剤、50μMPMSFおよび100μg/mlバシトラシンの蛋白質分解酵素阻害剤の混合物を添加したPDE抽出緩衝液(Bis Tris 20mM(pH6.5),EDTA 10mM,DTT 2.5M)300μL中に再懸濁した。細胞を超音波処理し、4℃、30000gで60分間遠心分離した。得られた上澄みをHPCLで分析した。
【0187】
イオン交換HPCL分析
得られた上澄みを酢酸セルロースフィルター(孔径0.45ミクロン)を通して濾過した。約1mlを、終濃度で2mMベンズアミジン、2μg/mlダイズトリプシン阻害剤、50μMPMSFおよび100μg/mlバシトラシンの蛋白質分解酵素阻害剤の混合物を添加した緩衝液A(Bis Tris 20mM(pH6.5),EDTA 10mM,DTT 2.5M)で予め平衡化したMono−Qイオン交換カラムHR5/5(Pharmacia)上に適用した。緩衝液Aで線状した後、PDE活性画分を0.5ml/分の流量で緩衝液A中0M〜1.0Mの酢酸ナトリウムの直線勾配を用いて溶離した。クロマトグラフィーの間、カラムおよび溶離画分は4℃に維持した。1.0mlの画分を採取し、−80℃に保存し、cAMPホスホジエステラーゼ活性の分析に付した。
【0188】
Sf21細胞培養、感染試験
Sf21細胞を発現ベクターおよび線状AcMNPV DNA(親ウィルス、Invitrogenより入手)で同時トランスフェクトした。細胞培養、組み換えウィルスの精製およびウィルス価測定は製造元の取扱説明書に従って行なった(Gibco BRL,Gaithersburg,MD;Invitrogen,San Diego,CA)。蛋白質発現のために、2×10個/mlの密度の細胞をmoi=5で組み換えウィルスに感染させた。感染後3日目に、細胞を遠心分離により沈殿させ、終濃度で2mMベンズアミジン、2μg/mlダイズトリプシン阻害剤、50μMPMSFおよび100μg/mlバシトラシンの蛋白質分解酵素阻害剤の混合物を添加したホモゲナイズ用緩衝液(Bis Tris 20mM(pH6.5),EDTA 10mM,DTT 2.5M)中に回収した。グリセロールを終濃度20〜30%で全ホモジネートに添加し、これらを小分けにして−20℃で保存した。
【0189】
PDE試験
ホスホジエステラーゼ活性は5′ヌクレオチドがアルミナに極めて強固に結合するが環状ヌクレオチドは中性または僅かにアルカリ性のpHで容易に溶離する観察条件を用いてSmith等(Manganellio等、1991)の記載した方法の変法を用いて調べた。試験は総容量200μlで37℃で96穴プレート中で行なった。各ウェルには試験緩衝液(終濃度で40mMトリス塩酸;pH8;0.5mM MgCl;4mMβ−メルカプトエタノール;10nM[H]cAMP(Amersham)および1μMcAMP)および構築物の活性に応じて希釈したCHO溶解物上澄み10μLを入れた。60分のインキュベートの後、TFA(0.5%)中1μM[14C]AMPを添加することにより反応を停止した。アルミナ50mgをいれた膜底部を有するマイクロプレート(Silent monitor,Nalgen Nunc)を0.1M TES−NaOH,p8.0で平衡化した。次に反応混合物をこれらのカラムに適用した。未加水分解cAMPを平衡化緩衝液3mlで溶離した。次に[H]cAMPおよび[14C]AMPを2mM NaOHで直接、アルカリ適合性シンチラント(Ultima gold,Packard)の入ったシンチレーションバイアルに溶出させた。分離した[H]cAMPを分離および非分離の[14C]値を用いて回収率に付いて逆補正し、全[H]cAMPの分数として表示し、加水分解された基質の量を求めた。
【0190】
速度論と阻害剤の検討
IC50測定のためのPDE試験
PDE7A1(完全長またはトランケートされた形態)を含む細胞溶解物を酵素源として用いた。PDE試験は96穴のプレート中、8つの異なった濃度のDMSO中に溶解した化合物2μL(40mMトリス、10mM MgCl、50nM[H]−cAMP(Amersham)および適切な濃度の酵素)を含む最終容量100ml中でpH8において行なった。加熱器/振とう器中10分間37℃でプレートをインキュベートし、ケイ酸イットリウムビーズ(Scintillation Proximity Assay,Amersham)20μLを添加することにより停止させた。酵素活性はTopcount reader(Packard)上で読み取った。基質の枯渇は初期量の15%を超えなかった。示したIC50値は対照と比較してcAMP加水分解の50%抑制をもたらす化合物の濃度を示す。これらはHill勾配を1に固定した従来のシグモイドモデルを用いて計算する。
【0191】
Km測定のためのPDE試験
PDE7A1(完全長またはトランケートされた形態)を含む細胞溶解物を酵素源として用いた。PDE試験は96穴のプレート中、10μMロリプラム、10μMPDE3阻害剤、40mMトリス、10mM MgCl、基質[H]−cAMPおよび適切な濃度の酵素を含む最終容量100μl中でpH8において行なった。加熱器/振とう器中37℃でプレートをインキュベートし、ケイ酸イットリウムビーズ(Scintillation Proximity Assay,Amersham)20μLを添加することにより停止させた。酵素活性はTopcount reader(Packard)上で読み取った。基質の枯渇は初期量の15%を超えなかった。次に飽和曲線をHill勾配1に固定した従来のシグモイドモデルを用いて計算した。
【0192】
ウエスタンブロット分析
Hisタグ付PDE7A1またはPDE7A1のタグ付トランケート版でトランスフェクトしたCHO細胞の溶解物を液体窒素中に凍結し、3回解凍し、次に10分間15000gで遠心分離する事により細胞破砕物と核を除去した。次に上澄みを1時間100,000gで遠心分離することにより細胞質ゾル画分(高速上澄み)から原形質膜画分(ペレット)を単離した。
Laemmli緩衝液中に蛋白質(10μg)を再懸濁し、5分間煮沸する事により変性した。試料を4〜15%の一次勾配トリス塩酸ポリアクリルアミドゲル上で泳動(100mA/ゲル)し、ウエスタンブロットにより融合蛋白質を検出するために、ニトロセルロース膜に移し取った。膜をリン酸塩緩衝食塩水(PBS)Tween20(0.1%)中の5%(w/v)低脂肪乳で1時間ブロッキングした。ブロットは、アミノ末端Xpressタグエピトープに対して特に指向されたモノクローナル抗体抗−his(Invitrogen)(1%無脂肪乳および0.1%Tween20を含有するPBS中に1μg/mlに希釈)を用いて1時間プローブした。洗浄後、結合した抗体を抗マウスIgGパーオキシダーゼコンジュゲート二次抗体(Sigma)および増強化学ルミネセンス(ECL Plus,Amersham,Arlington Heights,IL)検出システムを用いて検出した。
【0193】
統計学的分析
PDE活性の測定値は平均±SEMとして表示する。ノンパラメトリックなマン・ホイットニー試験を全てに渡り使用した。
【0194】
B.結果
実施例1:完全長PDE7A1のCHOおよびバキュロウィルスによる発現
cAMP加水分解の速度は、組み換え完全長PDE7A1でトランスフェクトした後48時間、CHO細胞細胞質ゾル抽出液中で測定し、非トランスフェクト細胞で観察されたものと比較した。比較のためには、組み換えPDE4B2で細胞をトランスフェクトした。
組み換えPDE4B2で観察されたものと比較して、完全長PDE7A1でトランスフェクトした細胞の細胞質ゾルでは極めて低値のPDE7A活性が観察された(図4)。
図4は組み換えCHO細胞系統およびSf21組み換え細胞系統によるPDE7A1の発現の結果を示している。最終希釈度は括弧内に示した。
【0195】
cAMP活性は対照細胞と比較して組み換えPDE7A1を発現しているCHO細胞では約2倍に上昇していた。これと比較して、組み換えPDE4B2でトランスフェクトした細胞では17倍高値であった(図5)。ウエスタンブロットにより検出された各組み換え蛋白質の濃度は同様であった。PDE7A1でトランスフェクトされた細胞における基礎的数値を超えたcAMP活性の増大はロリプラム(10μM)に非感受性であったのに対し、PDE4B2の場合はロリプラムに感受性であった(図4)。これらのデータによれば、活性なPDE7A1はCHO細胞中で発現されるが極めて低い濃度であることが確認された。同様のデータがPDE7A2においても得られた。
【0196】
翻訳を至適化するために、更に別の構築物を作成して至適Kozak配列を導入した。更に、3′および5′UTR配列をPDE7A1コード配列に付加することにより組み換えPDE7のRNAの安定性の至適化を試みた。CHO細胞内のこれらの2つの別の構築物の一過性の発現は細胞質ゾル中で測定したPDE7活性の水準を上昇させなかった(図5)。
【0197】
完全長PDE7A1をN末端タグバキュロウィルス発現ベクター(pBlueBacHisA)にサブクローニングし、Sf21にトランスフェクトして組み換えウィルスを作成した。感染3日後、PDE7A1組み換えウィルスで感染させたSf21細胞のPDE活性を測定し、未感染のSf21細胞または組み換えPDE4B2で感染させた細胞で観察されたものと比較した。未感染の細胞と比較してPDE7A1構築物を感染させた細胞の溶解物中ではPDE活性が増大していた。しかしながら、CHO細胞で得られた結果と合致して、組み換えPDE7A1を発現しているSf21細胞におけるPDE活性は、組み換えPDE4B2を発現している細胞で測定された数値と比較して極めて低値であった(図4)。組み換えPDE7A1ウィルスを感染させたSf21細胞のホモジネートは組み換えPDE4B2ウィルスを感染させたものよりも約100倍低値のcAMP活性を有していた。組み換えPDE7A2ウィルスを感染させたSf21細胞のホモジネートは組み換えPDE4B2ウィルスを感染させたものよりも約50倍低値のcAMP活性を有していた。
【0198】
実施例2:アミノ末端欠失の発現とPDE活性
CHO細胞中のPDE7A1構築物の完全高コード領域の一過性発現の後に得られたPDE活性が極めて低値であったことを考慮して、種々のアミノ末端欠失を作成し、次にこれらをCHO細胞内で発現させた。生じたPDE活性を測定し、PDE7A1の完全長コード領域および非トランスフェクト細胞の場合の数値と比較した。最も高いPDE活性はPDE7Δ100を発現している細胞で観察された(図6)。即ち、PDE7:101−483を有するこのクローンは、完全長オープンリーディングフレーム1−483を発現している細胞と比較して、PDE触媒活性が15倍増大し、そして、擬似トランスフェクト細胞と比較して8倍であった。このトランケートされたPDE7構築物のPDE活性は10μMのロリプラムに対して非感受性であり、同じトランスフェクション条件下に得られた組み換えPDE4B2活性と同様である。最初の100個のアミノ酸は発現されたPDE7酵素の触媒活性に対して影響すると考えられる。
【0199】
PDE7Δ60およびPDE7Δ80の発現もまた、完全長cDNAの発現と比較してPDE活性の増大をもたらした。内因性完全長PDE7A1を超えたPDE7Δ60およびPDE7Δ80の活性の増大は、それぞれ、8倍および9倍であった(図6)。より短いトランケーションであるPDE7Δ12およびPDE7Δ30の発現は完全長クローンで観察されたものと同等の低水準のPDE7活性をもたらした。これらの結果を合わせて考えると、残基31および100の間にあるPDE7Aの領域が発現されたPDE7酵素の触媒活性に対して影響していると考えられる。
【0200】
PDE7Aの別のアミノ末端欠失を作成した。これらの構築物、PDE7Δ120、PDE7Δ140およびPDE7Δ170の発現は、細胞質ゾル中のPDE7活性の消失をもたらした(図6および7)。このことは、PDE7Aの触媒ドメインの開始点が残基81〜120の間に位置することを示唆していている(図2)。
【0201】
PDE7Aのアミノ末端トランケート版は全て同じ濃度でCHO細胞中に発現されたことが、これらの融合蛋白質のヒスチジンタグを認識する抗体を用いたウエスタンブロットで調べたところ、判明した(図9)。
【0202】
図9はCHOトランスフェクト細胞中の組み換えヒトPDE7Aの発現のトランケート型のウエスタンブロット分析を示す。Xpressタグ付完全長およびm末端トランケート型の組み換えヒトPDE7AでトランスフェクトしたCHOの溶解物の上澄み画分を前述の通り調製した。蛋白質溶解物(10μg)を4〜15%の一次勾配トリス塩酸ポリアクリルアミドゲル上で泳動させ、ニトロセルロース膜に移し取った。ブロットをNH末端エピトープに対して指向させた抗Xpressモノクローナル抗体でプローブした。
【0203】
図9(A):レーンは(1)分子量マーカー、(2)Met1−483、(3)Met13−483、(4)Met31−483、(5)Met61−483、(6)Met81−483、(7)Met101−483、(8)Met121−483、(9)Met141−483、(10)Met171−483。
図9(B):レーンは(1)分子量マーカー、(11)Met101−483、(12)Met101−450、(13)Met101−430、(14)Met101−420。
【0204】
単一の免疫反応性のバンドが6kDaおよび35kDaの間に観察され、これはトランケーションの各々に対して適切であった。これらのデータは明らかに、PDE7A1蛋白質がCHO細胞内で発現され、そして蛋白質発現の極めて微小な変化のみが種々の突然変異体構築の間に認められたことを示している。
【0205】
実施例2B:最初の100のN末端アミノ酸の調節的役割の確認
我々は発現されたPDE7遺伝子の触媒活性に対して最初の100個のアミノ酸が影響することを上記のとおり示した。蛋白質のこの部分は自己阻害ドメインとして機能すると考えられている。最初の100個のアミノ酸の過剰発現が触媒部位のPDE7活性を阻害できることを明らかにするためには、この触媒フラグメントである(101−482)フラグメントが別のプラスミドのフラグメント1−101と共に、または、このインサートを持たないプラスミドpCDNA3(ネガティブコントロール)とともに同時発現させた。細胞を各プラスミドDNA15μgでトランスフェクトした。触媒部位の活性はフラグメント1−101の存在下では僅か約40〜50%のみ阻害された(図12)。作用の用量応答を確認することにより、触媒ドメインのPDE7活性における最初の100個のアミノ酸の関与を評価した。
【0206】
用量作用曲線は同じ同時発現条件下に求めた。触媒フラグメント(101−482)15μgを別のプラスミドのフラグメント1−101の漸増量と同時発現させた。DNA量は各トランスフェクション毎に空のベクターを用いて規格化した(図13)。PDE7活性に対する100N末端アミノ酸の作用用量応答を観察した(n=3)。触媒ドメインの活性は最高濃度のフラグメント1〜100の存在下60%となるまで阻害された。
この結果はヒトPDE7A1の最初の100個のN末端アミノ酸の調節的役割を確認したものと考えられる。
【0207】
実施例3:カルボキシ末端欠失の発現とPDE活性−PDE7Aの触媒ドメインのマッピング
PDE7Aの触媒ドメインの開始点の領域を明らかにした後、酵素PDE7Δ100における3つのカルボキシ末端欠失を構築することによりPDE7Aの触媒領域をマッピングした。PDE7A;101−450の発現はPDE7Δ100(PDE7;101−483)で観察されたものと同等のPDE活性をもたらし、このことは、カルボキシ末端の33個のアミノ酸が触媒作用および酵素活性の調節の何れにおいても関与していないことを示唆している(図7)。しかしながら、PDE7A;101−420およびPDE7A;101−430の発現は、適切な分子量の融合蛋白質の濃度は容易に検出できたにもかかわらず、完全長PDE7Aと比較して細胞抽出液中のPDE7活性の検出可能な増大をもたらさなかった(図7)。
【0208】
これらの結果はPDE7のカルボキシ側33個のアミノ酸の部分(451〜483)は酵素活性の調節に直接関与していないことを強力に示している。しかしながら、触媒部位はアミノ酸431番と450番との間に位置していると考えられる。即ち、アミノ酸101番と450番との間にある本試験において定義されたPDE7触媒ドメインは分子量の計算値42kDaを有しており、これはSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で推定された数値(40.5kDa)とよく合致している。これらの結果はPDE7蛋白質のグリコシル化を予測させるものではない。
【0209】
実施例4:速度論的試験
速度論的試験とKmの測定を前述の通り実施することにより、CHO細胞中で発現される完全長PDE7A1およびトランケートされた101−450PDE7A1組み換え蛋白質のそれぞれのKm値を測定し、以下の表1に示した。
【0210】
【表1】
Figure 2004509640
【0211】
PDE7(101−450)、PDE7(101−483)のcAMPに対するKm値が測定され、ヒトリンパ細胞系(Molt4)および全長の野生型組換えPDE7A1中で内生的に発現されたPDE7のものと比較された(表1)。
PDE(101−450)、PDE7(101−483)は、全長の組換え体と比較した触媒効率において1.5〜2倍の増加が実証された。
バキュロウイルスまたは真核細胞にて産生されたPDE(101−450)および全長のPDE7Aは、PDE1阻害剤(ビンポセチン)、PDE4阻害剤(ロリプラム)、PDE3阻害剤(SKF94836)またはPDE5阻害剤(ザピリナスト)に非感受性であった。
さらに、PDE7(101−450)、PDE(101−483)および全長の組換えPDE7A1は、阻害剤である3イソブチル−1−メチルキサンチン(IBMX)に対して、似通ったIC50値(13〜14μM)を実証しており、これは阻害剤の見地からN末端ペプチドの役割は小さいということを示すものである。
【0212】
実施例5:PDE7ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物のスクリーニング
A.材料および方法
PDE7A1(完全長またはトランケートされた形態)を含む細胞溶解物を酵素源として用いた。PDE試験は96穴のプレート中、8つの異なった濃度のDMSO中に溶解した化合物2μL、40mMトリス、10mM MgCl、50nM[H]−cAMPおよび適切な濃度の酵素を含む最終容量100ml中でpH8において行なった。
加熱器/振とう器中37℃でプレートをインキュベートし、ケイ酸イットリウムビーズ(Scintillation Proximity Assay,Amersham)20μLを添加することにより停止させた。
酵素活性はTopcount reader(Packard)上で放射活性を測定することにより求めた。
基質の枯渇は初期量の15%を超えなかった。示したIC50値は対照と比較してcAMP加水分解の50%抑制をもたらす化合物の濃度を示す。これらはHill勾配を用いて従来のシグモイドモデルを用いて計算する。
【0213】
B.結果
一部のトランケート型のPDE7A1、特にN末端トランケート構築物[101−483]および[101−450]は前の実施例における完全長の酵素よりも約15倍高活性であることがわかった。
従って、種々の候補化合物の完全長PDE7A1蛋白質(1−483)および2種のトランケートされたPDE7A1ポリペプチド、すなわち(101−483)および(101−450)の各々のホスホジエステラーゼ活性に対するその阻害特性について調べた。
9種の候補化合物が前述の本発明の第1のスクリーニング方法により陽性として選択された。
これらの化合物は全て、興味深いIC50値を示し、その一部はきわめて興味深いIC50値を示した。化合物はトランケートされたPDE7A1ポリペプチド、即ち(101−483)および(101−450)および完全長PDE7A1に対し同様な挙動を示すと考えられた。本発明者等は阻害剤の見地からN末端の100個のアミノ酸のペプチドの役割は小さいと結論した。アミノ酸1番〜30番の間の欠失はPDE7の酵素活性を変化させず、これらの残基がcAMPの加水分解や調節に影響しないことを示している。しかしながら、アミノ酸31版〜100番の間の連続した欠失は触媒活性の明らかな増大をもたらし、この領域がPDE7触媒に対する阻害的束縛を行なっていることが示唆された。PDE7活性は最初の100アミノ酸が欠失した場合に最大となった。トランケートされた蛋白質(101−450)は完全長組み換えPDE7(Km=0.11μM)と比較して幾分高値のcAMP加水分解親和性(Km=0.07μM)を有している。
【0214】
実施例6:全細胞に対して実施した本発明のPDE7阻害剤の二次スクリーニング
誘導性プロモーター下の触媒部位のサブクローニング
全細胞に対するPDE7阻害剤のIC50を測定するために、誘導性プロモーター下でPDE7A1触媒部位を発現する安定な細胞系統(CHO)を樹立した。ヒトトランケートPDE7A1(101−450)をコードするcDNAを真核生物誘導性ベクターpIND(Invitrogen)内にサブクローニングした。制限酵素部位BamHIおよびXbaIを用いてpINDベクター内へのPDE7A1触媒部位のサブクローニングを促進した。このクローンはpIND7A 101− 450 と命名した。
【0215】
EcrCHO細胞培養
二量体エクジソン受容体を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞(EcrCHO)(Invitrogen Inc.)を、146mg/L L−グルタミン、10%(v/v)ウシ胎児血清(FCS)、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mMヒポキサンチン、0.4μMアミノプテリン、16μMチミジン,100μg/mlゲンタマイシンおよび50μg/mlのゼオシンを添加したHam’s F−12栄養混合物(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)を含有する完全生育培地中、5%二酸化炭素/95%空気の雰囲気下37℃で培養した。培地は3〜5日おきに交換し、細胞は1週間に1回の割合でトリプシン処理後1:2に分割した。
【0216】
トランスフェクション試験および安定な細胞系統の樹立
トランスフェクションの3日前にEcrCHO細胞を75cmのフラスコ当たり10個の細胞密度でプレーティングした。製造元の取扱説明書(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)に従ってリポフェクタミンを用いて内毒素非含有プラスミドDNA10μgで細胞をトランスフェクトした。48時間インキュベートした後、細胞をトリプシン処理し、遠心分離により回収し、加圧選択のための選択抗生物質ゲネチシン(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)を添加した完全生育培地中に再懸濁し、10枚のペトリ皿に分割した。1週間後、ゲネチシン耐性クローンを単離した。ポナステロン誘導(10μM、8時間)の後、各々につきPDE活性を測定する。非トランスフェクト細胞よりも高値のPDE7触媒活性を示すクローンを選択して未損傷の細胞中のcAMP濃度に対するPDE7阻害剤の作用を試験する。
【0217】
触媒部位PDE7を発現しているCHO細胞を1.5×10個/ml培地の濃度で24穴プレートに播種した。プレートを95%空気−5%COの湿潤雰囲気下に37℃で48時間インキュベートする。36時間後、ポナステロン(10μM)を培地に添加し、8時間の誘導時間を設ける。誘導時間の後、培地を吸引除去し、各ウェルをPBSで洗浄する。候補分子は、試験すべき所望の濃度が得られるように150mMトリス/HCl緩衝液、2mM EDTA、pH7.4中に希釈してウェルに添加する。次に細胞を穏やかに振とうしながら37℃で30分間インキュベートし、その後15分間10μMフォルスコリン、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を添加する。活性化時間の後、プレートを氷上に保存し、0.2M HCl、1%Triton X100、0.2mM IBMXよりなる停止溶液200μlを各ウェルに添加する。次に細胞を超音波処理により破砕し、反応の間に生産された細胞内cAMPの測定を可能にした。
【0218】
cAMP測定
候補分子を投与した各細胞集団におけるcAMP濃度をEuromedexのEIAキットを用いて評価した。このキットは0.1MHClで処理した試料中のcAMPの定量的測定のための競合的免疫試験法である。キットは、試料中のcAMPまたはcAMPを自らに共有結合させて保有しているアルカリホスファターゼ分子に競合的に結合するためにcAMPに対するポリクローナル抗体を使用している。各試料280μLを96穴プレートに移し、15分間3500rpm、4℃で遠心分離することにより粒状画分から細胞質ゾルを分離した。次に沈殿物と分離した細胞質ゾル画分を「転移96穴プレート」に移し、これを蛋白質とcAMPの測定まで氷上に保存した。各試料およびキットに含まれていたcAMP標準曲線用の試料195μLを1:1/2トリエチルアミン:無水酢酸混合物10μlでアセチル化し、競合的cAMP−EIAに付した。
【0219】
実施例6B:PDE7阻害剤の二次スクリーニングの至適化:PDE7触媒部位と遺伝子レポーターを同時発現する安定な細胞におけるPDE7阻害剤の二次スクリーニング
全細胞に対してPDE7阻害剤を調べるための細胞試験法を設定するために、CRE4Xプロモーター下においてPDE7触媒ドメイン(活性型)およびレポーター遺伝子β−ラクタマーゼを同時発現する安定な細胞系統(EcrCHO)を創生した。CRE4Xプロモーター下のレポーター遺伝子の組込みは、細胞に基づいた試験においてcAMPの測定を旨適化するものでなければならない。
前の試験により、PDEの過剰発現は細胞にとって致命的であることがわかっており、従って、哺乳類細胞における誘導性発現のためにpINDベクターにPDE7(101−450)の触媒部位のcDNAをクローニングした。
【0220】
誘導性プロモーター下の触媒部位のサブクローニング
ヒトトランケートPDE7A1(101−450)をコードするcDNAを真核生物誘導性ベクターpIND(Invitrogen)内にサブクローニングした。制限酵素部位BamHIおよびXbaIを用いてpINDベクター内へのPDE7A触媒部位のサブクローニングを促進した。このクローンはpIND7A(101−450)と命名した。新しい構築物はRT−PCRにより得られ、突然変異がないことは配列決定により確認した。
【0221】
EcrCHO細胞培養
二量体エクジソン受容体を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞(EcrCHO)(Invitrogen)を、146mg/L L−グルタミン、10%(v/v)ウシ胎児血清(FCS)、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mMヒポキサンチン、0.4μMアミノプテリン、16μMチミジン、100μg/mlゲンタマイシンおよび250μg/mlのゼオシン(Invitrogen,cat R250−05)を添加したHam’s F−12栄養混合物(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)を含有する完全生育培地中、5%二酸化炭素/95%空気の雰囲気下37℃で培養した。培地は3〜5日おきに交換し、細胞は1週間に1回の割合でトリプシン処理後1:2に分割した。
【0222】
トランスフェクション試験および安定な細胞系統の樹立
トランスフェクションの3日前にEcrCHO細胞を75cmのフラスコ当たり10個の細胞密度でプレーティングした。pIND(ハイグロマイシン選択)中のPDE7(101−450)およびβ−ラクタマーゼ遺伝子(ネオマイシン選択)をEcrCHO細胞に同時トランスフェクトした(ゼオシン選択)。
製造元の取扱説明書(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)に従ってリポフェクタミンを用いて内毒素非含有プラスミド10μgで細胞をトランスフェクトした。48時間インキュベートした後、選択抗生物質ゲネチシン(Gibco BRL,Gaithersburg,MD ref 10131−027)800μg/mlおよびハイグロマイシンB300μg/ml(Clontech cat:8067−1)を添加した完全生育培地中で細胞を培養した。2週間後、ゲネチシンおよびハイグロマイシン耐性クローンを4時間10μMのフォルスコリンで処理する。β−ラクタマーゼ遺伝子を発現している細胞をFacsを用いて96穴中で単離する。
【0223】
3週間後、ゲネチシンおよびハイグロマイシン耐性のクローンを選択する。PDE活性はポナステロンA(Invitrogen cat H101−01)誘導(10μM、8時間)の後に各々につき測定する。非トランスフェクト細胞より高値のPDE7触媒活性を示すクローンを選択し、各々における遺伝子レポーターの発現濃度を測定することにより、未損傷の細胞中のPDE7阻害剤の作用を試験するのに最も適するものを選択する。
【0224】
細胞をリン酸塩緩衝食塩水(PBS)で2回洗浄し、トリプシン処理し、遠心分離により回収し、終濃度で2mMベンズアミジン、2μg/mlダイズトリプシン阻害剤、50μM PMSFおよび100μg/mlバシトラシンの蛋白質分解酵素阻害剤の混合物を添加したPDE抽出緩衝液(Bis Tris 20mM(pH6.5), EDTA 10mM,DTT 2.5M)300μL中に再懸濁した。細胞を超音波処理し、14000gで20分間遠心分離し、得られた上澄みのcAMPホスホジエステラーゼ活性を分析した。
【0225】
ホスホジエステラーゼ試験
PDE活性は5′ヌクレオチドがアルミナに極めて強固に結合するが環状ヌクレオチドは中性または僅かにアルカリ性のpHで容易に溶離する観察条件を用いてSmith等の記載した方法の変法を用いて調べた。試験は総容量200μlで37℃で96穴プレート中で行なった。各ウェルには試験緩衝液(終濃度で40mMトリス塩酸;pH8;0.5mM MgCl;4mMβ−メルカプトエタノール;10nM[H]cAMPおよび1μMcAMP)および発現された蛋白の活性に応じて希釈したCHO溶解物上澄み10μLを入れた。60分のインキュベートの後、TFA(0.5%)中1μM[14C]AMPを添加することにより反応を停止した。アルミナ50mgを充填した膜底部を有するマイクロプレート(Silent Monitor,Nalgen Nunc)を0.1M TES−NaOH,p8.0で平衡化した。次に反応混合物をこれらのカラムに適用した。未加水分解cAMPを平衡化緩衝液3mlで溶離した。次に[H]cAMPおよび[14C]AMPを2mM NaOHで直接、アルカリ適合性シンチラント(Ultima gold,Packard)の入ったシンチレーションバイアルに溶出させた。分離した[H]cAMPを分離および非分離の[14C]値を用いて回収率に付いてバックグラウンド補正し、全[H]cAMPの分数として表示し、加水分解された基質の量を求めた。
【0226】
触媒部位PDE7を発現するEcrCHO7細胞におけるβ−ラクタマーゼ発現 細胞を1.3×10または2.6×10個/ml培地の濃度で96穴プレートに播種した。プレートを 95%空気−5%COの湿潤雰囲気下に37℃で1.3×10の濃度または2.6×10個/mlの濃度となるまで24時間または8時間それぞれインキュベートする。8〜24時間の後、ポナステロン(10μM、100%エタノールに溶解した1mM保存溶液)を培地に添加して16時間の誘導時間を設ける。誘導時間の後、培地を吸引除去し、各ウェルをPBSで洗浄する。候補分子は、試験すべき所望の濃度が得られるようにHam’s F−12栄養混合物(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)を含有する生育培地で希釈してウェルに添加する。50nMフォルスコリン(Sigma cat:F6886)、アデニレートサイクラーゼ活性化剤の存在下に化合物を試験する。陽性対照は50nMのフォルスコリンの存在下の500μMのIBMXとする。陰性対照は50nMのフォルスコリンのみとする。次に細胞を37℃で4時間インキュベートする。活性化時間の後、細胞に溶液B(60μl)および溶液C(1ml)で希釈した基質CCF4(12μl)を添加する。この溶液20μLを各ウェルに添加する。細胞を25℃で1時間30分遮光しながらインキュベートする。PDE阻害剤処理によりもたらされた細胞内cAMPの増大の測定はβ−ラクタマーゼの発現の誘導と相関する。
【0227】
β−ラクタマーゼ発現測定
候補分子を投与した各細胞集団におけるcAMP濃度は細胞内のcAMP濃度に感受性の遺伝子レポーター発現β−ラクタマーゼを用いて評価した。
結果
Facsを用いたクローンの選択
トランスフェクション10日後、フォルスコリン投与後にβ−ラクタマーゼを発現している細胞をFACSを用いてクローニングした。ネオマイシン、ゼオシンおよびハイグロマイシン耐性の25クローンを取得し、ポナステロン誘導後の各々のPDE7活性を測定した。
【0228】
β−ラクタマーゼ遺伝子を発現するEcrCHO細胞におけるPDE7活性
ポナステロン誘導(8時間、10μM)の後にPDE7酵素を発現している3クローンを選択した。総PDE活性は非トランスフェクト細胞の3〜6倍高値であった。PDE7活性はPDE7阻害剤およびPDE4阻害剤(ロリプラム、60μM)を用いて測定した。
【0229】
レポーター遺伝子(β−ラクタマーゼ)の発現
β−ラクタマーゼ発現はフォルスコリン(50nM〜50μM)刺激後に各クローンについて評価した(図10)。PDE阻害剤を試験するための基礎cAMP濃度を増大させるために、フォルスコリンの未最大濃度(50nM)を選択した。PDE7阻害剤およびロリプラムの濃度曲線を種々の細胞濃度(15000および20000個/ウェル;および30000および40000個/ウェル)において3クローンにつき求めた。図11はクローンの1つにおいて得られた結果を示す。予備試験により、β−ラクタマーゼ発現に対してPDE7阻害剤は濃度依存性があるが、PDE4阻害剤の作用はないことがわかっている。
【0230】
実施例7:PDE7ノックアウトトランスジェニックマウスを作成するために設計された本発明の相同組み換えベクターの構築
ヒトPDE7A1およびPDE7A2は高親和性cAMP特異的PDE7A酵素のスプライス型である。示差的スプライシングにより、N末端ペプチド配列の2種の変異体(PDE7A1:M1−Q46、PDE7A2:M1−K20)が得られ、そして、それは代替コードエクソン使用の結果である(Bloom等、1996;Han等,1997)。
酵素の触媒ドメインに影響するPDE7A1のQ46およびPDE7A2のK20の3′側のスプライス変異体は報告されておらず;この点を超えたヌクレオチドおよびペプチド配列はPDE7A1およびPDE7A2と同一である。
従ってPDE7Aの触媒作用に重要なドメインおよびPDE7Aの下流部分を相同組み換えによりマウスES細胞におけるターゲティングのために選択した。
ヒトPDE7Aの触媒作用に重要な領域は上記した実施例において決定している。
【0231】
相同組み換えベクター(ターゲティングベクター)の構築
重要な触媒領域の内部でありマウスとヒトとの間で高度に保存されているエクソンをコードする2.4kbのC57BL/6マウスEcoRIゲノムフラグメントを133O20BACクローンから調製したEcoRIミニライブラリからクローニングした(RPCI−23/C57BL/6マウスBACライブラリ、Pieter DeJong,Research Genetics,Roswell Park Cancer Research Institute)。プローブは放射標識オリゴヌクレオチド(プローブC 1100−1177−配列番号9)とした。
2.4kbのEcoRIゲノムフラグメント上にある、配列決定により同定されたエクソンおよびスプライス部位の配列を図8に示す。ターゲティングベクターの構築のために、3′側隣接5.1kb EcoRIゲノムフラグメントを放射標識オリゴヌクレオチドプローブ(プローブD 1267−1297 −配列番号10)を用いてクローニングし、部分的に配列決定した。配列の分析によれば、このフラグメントは3′隣接エクソンの全てを含んでいることがわかった。
【0232】
5.1KbのEcoRIフラグメントはターゲティングベクターの3′相同アームとして機能する。5′相同アームを得るために、PCRのプライマー(アッパープライマー−A,494−513−配列番号7、ロアープライマー−B 831−807−配列番号8)を合成し、PCR反応で用いて2.4KbのEcoRIフラグメントの上流の2.75Kbのゲノムフラグメントを増幅した。2.75Kbのフラグメントを133O20 BAC DNAより増幅した。
同様の方法を用いて5′および3′相同アーム(それぞれ5.0および2.75kb)を129マウス系統のゲノムより得た。これらの実験において、125 B 22 BACクローンを用いたが、これはC57BL6系統に関する上記したRPCI−22 BACライブラリからクローニングした。
* 数はマウスPDE7A2cDNA(配列番号11)のヌクレオチド番号を参照。
【0233】
2つの相同アームをpSV−loxPベクターに挿入する事により図14(C57BL/6ベクター)および図15(129ベクター)に示すターゲティングベクターを作成した。
C57BL/6に含まれるPDE7の触媒部分は配列番号35の配列を有している。
C57BL/6マウスにおける所望のターゲティング現象を確認するために、サザンブロット法を開発した。これらの試験は野生型の対立遺伝子は未損傷のままとしながら全体のベクターのランダムな組込みから各アームの相同組み換えを識別する。5′相同アームの組み換えを検出するために、オリゴ1およびオリゴ2を用いてPCRにより400bpのプローブを作成した。オリゴヌクレオチド配列1(GGGTTTACTGTGCTCTCCA、配列番号31)および2(GCCACCACACTCTGCTCT、配列番号32)はBACクローンの配列決定により得られたアームから上流のDNA配列に基づいて設計した。同様にして、3′相同アームの下流の以下のオリゴ、即ち、3(AAAAACTAACTAACTAACTAAA、配列番号33)および4(CTTCTATACATTGGCTTGATTG、配列番号34)を用いてPCRにより600bpのプローブを作成した。これらのプローブは以下の表2に示す制限酵素の選択されたセットを用いたサザンブロット実験において組み換え体から野生型対立遺伝子を識別すると期待される。
【0234】
【表2】
サイズはkbで表し、2とおりのサイズはWT/KOで表示する。
Figure 2004509640
【0235】
ターゲティング現象が成功すればPDE7A酵素活性に不可欠のペプチド配列を欠いた突然変異体のPDE7A対立遺伝子が生成すると予測される。
【0236】
PDE7のノックアウトマウスを作成するためのベクターの使用
エレクトロポレーションまたは他の方法によりターゲティングベクターをES細胞に導入する。ネオマイシン耐性コロニーにつき、特異的ターゲティング現象が同定されるものを選別する。
実験の可能性のある変異体において、ES細胞における一過性のCreリコンビナーゼの発現を用いて、loxPフランキングTN−5ネオマイシン耐性遺伝子をターゲティングされた対立遺伝子より除去する。
ターゲティングされた対立遺伝子を有するES細胞のコロニーが同定された後、胚盤胞にこれらのコロニーからES細胞を注入する。
高水準のES細胞寄与度を示しているマウスをコートカラー試験によりスクリーニングし、育種および尾部DNA試験により生殖系列伝達マウスを選択する。半接合のターゲティングされたマウス(PDE7A−/+)が得られた後、これらを、育種により作成したホモ接合のヌル対立遺伝子(PDE7A−/−)マウス(生存している場合)とともに生物学的実験において試験する(Gene targeting,1993,Ed.A.L.Joyner IRL Press,Oxford参照)。
【0237】
更に別の実験において、2.4kbのゲノムフラグメントをLoxP部位に隣接させ、5′および3′の相同アームの間にそのゲノム状態において導入する。片方のLoxP部位の内側に、Tn−5 neoカセットも導入する。ホモ接合の挿入要請マウスを作成し、組織特異的Creリコンビナーゼ発現トランスジェニックマウスと交配する。この実験の予測される結果はPDE7遺伝子の組織特異的な欠失である。Creリコンビナーゼが誘導性プロモーターにより制御される場合、PDE7Aの欠失は誘導可能である。
プローブおよびPCRプライマー:
プライマー−A: AAATGGAAATAGTCTAGTAA (配列番号7)
プライマー−B: AATTCTTGTATAAAGTTGCTAGATA (配列番号8)
プローブ−C: ACATGGGTTACAAATATCAGCACA (配列番号9)
プローブ−D: CTTTATTTACAGAGTGGGCCAGGTTTTCAGC (配列番号10)
【0238】
参考文献
・Abbondanzo SJ et al., 1993, Methods in Enzymology, Academic Press, New York, pp.803−823.
・Adams et al., 1985, Nature 318:533−538.
・Ausubel et al., 1989. Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.
・Baehr, W., Devlin, M. J., and Applebury, M. L. (1979) J. Biol. Chem. 254, 11669−11677.
・Beavo JA, Hardman JG, Sutherland EW (1970) Hydrolysis of cyclic guanosine and adenosine 3’,5’−monophosphates by rat and bovine tissues. J Biol Chem 245:5649−5655.
・Beavo, J. A. (1995) Physiol. Rev. 75, 725−748,
・Benoist and Chambon, 1981, Nature 290:304−310.
・Bloom J. et. al. PNAS 93:14188−14192 (1996).
・Brinster et al., 1982, Nature 296:39−42.
・Brinster et al., 1985 Annu. Rev. Genet. 1986 20: 465−499.
・CAPECCI M et al., 1991, Science, vol.244: 1288−1292.
・Cawley P. et al, In vitro, 1977.
・CONTI ET AL., 1995, Endocrine Review, vol 16 (3):370−389.
・CHAI H. et al. , 1993, Biotechnol. Appl. Biochem, vol.18: 259−273.
・DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21−25.
・FINK TL et al., 1999, The Journal of Biological Chemistry, vol.274 (49): 34.613−34.620.
・Freshney (ed.), 1986. Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press.
・Fung, B. K.−K., Young, J. M., Yamane, H. K., and Griswold−Prenner, I. (1990) Biochemistry 29, 2657−2664.
・Gait (ed.), 1984. Nucleic Acid Hybridization.
・Gene targeting. Ed. A.L. Joyner IRL press /Oxford (1993).
・Glover (ed.), 1985. DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II Oligonucleotide Synthesis, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K.
・Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647−658.
・GU H. et al., 1993, Cell, viol.73:1155−1164.
・GU H. et al. 1994, Science, vol.265:103−106.
・Hames andHiggins (eds.), 1985. Transcription And Translation.
・Hames BD and Higgins SJ, 1985. Nucleic acid hybridization : a practical approach, Hames and Higgins Ed., IRL Press, Oxford.
・Han P. et. al. JBC. 272:16152−16157 (1997).
・Hanahan, 1985, Nature 315:115−122.
・HOESS et al., 1986, Nucleic Acids Research, vol.14:2287−2300.
・HOUBEN WEYL, 1974, In Meuthode der Organischen Chemie, E. WUNSCH Ed., vol.15−I and 15−II, THIME, Stuttgart.
・Ichimura M. and Kase H., 1993;
・Jaeseung Lim, Gudrun Pahlke, and Marco Conti J. Biol. Chem. 1999 274: 19677−19685), PDE1 (Beavo et al., 1995).
・Jin, S. L., Swinnen, J. V., and Conti, M. (1992) J. Biol. Chem. 267, 18929−18939.
・Kaufman, 1991, Current Protocols in Molecular Biology, 16.12.
・Kelsey et al., 1987.
・Kollias et al., 1986, Cell 46:89−94.
・Kovala, T., Sanwal, B. D., and Ball, E. H. (1997) Biochemistry 36, 2968−2976;
・Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639−1648.
・Laemmli, UK, (1970) Nature, 55, 680−685.
・Leder et al., 1986, Cell 45:485−495.
・LENHARD T. et al., 1996, Gene, vol.169:187−190.
・MacDonald, 1987, Hepatology 7:425−515.
・Manganellio et al.(1991) J. Biol. Chem., 266, 13385−13390.
・Mason et al., 1986, Science 234:1372−1378.
・MERRIFIELD Rb, 1965, Science, vol.150(693): 178−185.
・MERRIFIELD RB, 1965a, Nature, Vol.207 (996):522−523.
・MICHAELI et al, 1993, J. Biol. Chem., 268, 12925−12932.
・Michaeli et al., (1997), J. Biol. Chem. 268, 12925−12932.
・Mogram et al., 1985, Nature 315:338−340.
・Needleman and Wunsch (1972) J. Mol. Biol. 48:442.
・Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399−409.
・Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 85:2444.
・PEASE S and WILLIAMS RS, 1990, Exp. Cell. Res. vol. 190:209−211.
・Perbal, 1984. A Practical Guide To Molecular Cloning.
・Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268−276.
・Readhead et al., 1987, Cell 48:703−712.
・Sambrook, J. Fritsch, E. F., and T. Maniatis, 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. 2ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold spring Harbor, New York.
・Sani, 1985, Nature 314:283−286.
・Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 483, by the homology alignment algorithm of Needleman and Wunsch (19720) J. Mol. Biol. 48:442.
・Smith et al., 1988, Gene 67:31−40.
・SONNENBURG WK et al., 1995, The Journal of Biological Chemistry, vol.270 (52): 30.989−31.000.
・STROOP, S. D., CHARBONNEAU, H., and BEAVO, J. A. (1989) J. Biol. Chem. 264, 13718−13725.
・Swift et al., 1984, Cell 38:639−646.
・TORPHY TJ et al. 1993, in New drugs in allergy and asthma, Birkhaeuser Verlag editors, Basel, Switzerland, pages 51−71).
・TUCKER, M. M., ROBINSON, J. B., Jr., and STELLWAGEN, E. (1981) J. Biol. Chem. 256, 9051−9058.
・Useful proteins from recombinant bacteria” in Scientific American, 1980, 242:74−94.
・Villa−Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727−3731.
・VLASAK R et al., 1983, Eur. J. Biochem., vol.135:123−
・Wagner et al., 1981.
・Wu and Wu, 1987. J. Biol. Chem. 262:4429−4432.
・Wu and Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263:14621−14624.
・WU et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:963−967.
・Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787−797.
・ZOU YR et al., 1994, Current Biology, vol.4:1099−1103.

【図面の簡単な説明】
【図1A】
ヒトPDE7イソ型の2種、即ちPDE7A(h7A1.PROと表示)およびPDE7A2(h7A2.PROと表示)、並びにマウスPDE7A2(mou7A2.PROと表示)およびラットPDE7A1(rat7.a.PROと表示)の蛋白質のアミノ酸配列の間のアライメントを示す。
【図1B】
図1Aの続きである。
【図2】
本発明に従って得られた異なるトランケートされたPDE7蛋白質の構造を示す。上段はヒトPDE7A1の完全長イソ型を示す。他の例は種々の試験したトランケート蛋白質を示す。左側に示した数字は完全長PDE7A1蛋白質と照合させた蛋白質のN末端およびC末端のアミノ酸残基を示す。
【図3】
図2で示した種々のPDE7トランケート蛋白質を発現するために用いられている組み換えベクターPcDNA4HisMax Aを示す。
【図4】
組み換えCHO細胞系統およびSf21組み換え細胞系統によるPDE7A1の発現の結果を示す。
「模倣(mocked)CHO」とは空の組み換えベクターによりトランスフェクトされているCHO細胞を示す。
【図5】
それぞれ、空のベクターで、または、PDE4B2蛋白質、PDE7A1蛋白質、至適Kozak配列を有するインサートをコードするPDE7A1またはcDNAの5′および3′のUTRを有するインサートをコードするPDE7A1をコードするインサート含むベクターでトランスフェクトしたCHO細胞を用いて得られたホスホジエステラーゼ触媒活性を示す。
【図6】
空のベクター(対照)、PDE4B2蛋白質、完全長PDE7A1蛋白質または13−483、31−483、61−483、81−483、101−483および171−483トランケート蛋白質(数は完全長PDE7A1酵素配列と照合)をコードするベクターによりそれぞれトランスフェクトされた組み換えCHO細胞により発現されたホスホジエステラーゼ触媒活性を示す。
【図7】
空のベクター(対照)、PDE4B2蛋白質、PDE7A1完全長蛋白質または101−483、121−483、141−483、101−483、101−450、101−420および101−430トランケートPDE7A1ポリペプチド(数は完全長PDE7A1酵素配列と照合)をコードするベクターによりそれぞれトランスフェクトされた組み換えCHO細胞により発現されたホスホジエステラーゼ触媒活性を示す。
【図8】
PDE7ノックアウトマウスを作成するために用いることができる相同組み換えのためのターゲティングベクターの構築を示す。
【図9】
CHOトランスフェクト細胞における組み換えヒトPDE7A発現のトランケート型のウエスタンブロット分析を示す。
【図10】
種々の濃度におけるフォルスコリンの存在下のPDE7触媒部位の好ましい実施態様を発現する種々のEcrCHOクローンにおけるβ−ラクタマーゼの発現の用量応答を示す。
【図11】
PDE7触媒部位の好ましい実施態様を発現する種々のEcrCHOクローン20(30000細胞)(n=2、即ち実験は2回実施した)におけるβ−ラクタマーゼの発現の測定を示す。
【図12】
完全長ヒトPDE7A1の第1のN末端100アミノ酸(Nter7A1)をコードする核酸のトランスフェクションを行った場合と行わない場合の完全長ヒトPDE7A1(Δ1007A1)のアミノ酸配列101−483に相当するPDE7突然変異体をコードする核酸でトランスフェクトしたCHO細胞におけるPDE活性を示す。
【図13】
PDE7触媒部位の好ましい実施態様をコードする核酸配列によりトランスフェクトされたCHO細胞(リポフェクタミン)においてPDE活性を測定したものを示す。
【図14】
PDE7ノックアウトC57BL/6マウスを作成するために用いることができる相同組み換えのためのターゲティングベクターを示す。
【図15】
PDE7ノックアウト129マウスを作成するために用いることができる相同組み換えのためのターゲティングベクターを示す。

Claims (66)

  1. 最初のATGコドンから残基81(L22M2)までの配列の逐次的欠失により発生するHCP1のNH末端欠失よりなる配列としてミカエリ等(Michaeli et al.,1993,J.Biol.Chem.,268,12925−12932)により開示されたアミノ酸配列を例外としてPDE7の触媒ドメインを少なくとも有する、内因性完全長PDE7蛋白のホスホジエステラーゼ触媒活性より少なくとも約6倍、好ましくは約8または10倍、最も好ましくは15〜20倍高値のホスホジエステラーゼ触媒活性を保有するポリペプチド。
  2. ホスホジエステラーゼ7触媒ドメインを保有し、そして、配列番号1、2または3のアミノ酸配列よりなる群から選択される配列の連続するアミノ酸少なくとも312個を有する、約427アミノ酸長までの請求項1記載のポリペプチド;またはその相同ポリペプチド。
  3. 配列番号1、2または3の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64位に位置するアミノ酸残基から始まり、
    配列番号1、2または3の375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427位に位置するアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する請求項2記載のポリペプチド;またはその相同ポリペプチド。
  4. 配列番号1、2または3の5位のアミノ酸残基で始まり、427位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する請求項3記載のポリペプチド;またはその相同ポリペプチド。
  5. 配列番号1、2または3の25位のアミノ酸残基で始まり、427位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する請求項3記載のポリペプチド;またはその相同ポリペプチド。
  6. 配列番号1、2または3の45位のアミノ酸残基で始まり、427位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する請求項3記載のポリペプチド;またはその相同ポリペプチド。
  7. 配列番号1、2または3の5位のアミノ酸残基で始まり、394位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する請求項3記載のポリペプチド;またはその相同ポリペプチド。
  8. 配列番号1、2または3の25位のアミノ酸残基で始まり、394位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する請求項3記載のポリペプチド;またはその相同ポリペプチド。
  9. 配列番号1、2または3の45位のアミノ酸残基で始まり、394位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する請求項3記載のポリペプチド;またはその相同ポリペプチド。
  10. 請求項1〜9の何れか1項に記載のポリペプチドと少なくとも80%の相同性または同一性、好ましくは85%の相同性または同一性を有するポリペプチド。
  11. 請求項1〜9の何れか1項に記載のポリペプチドと少なくとも90%の相同性または同一性、好ましくは95%の相同性または同一性、最も好ましくは99%の相同性または同一性を有するポリペプチド。
  12. 最初のATGコドンから残基81(L22M2)までの配列の逐次的欠失により発生するHCP1のNH末端欠失よりなる配列としてミカエリ等(Michaeli et al.,1993,J.Biol.Chem.,268,12925−12932)により開示されたアミノ酸配列を例外として、完全長PDE7(A)蛋白質のアミノ酸57〜100の間のアミノ酸で始まり、アミノ酸450〜483の間で終わる、アミノ酸配列を有するポリペプチド。
  13. PDE7A蛋白質がヒトPDE7A1またはPDE7A2である請求項12記載のポリペプチド。
  14. 請求項1〜13の何れか1項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列またはそれに相補的な配列。
  15. 配列番号4、5または6の核酸配列よりなる群から選択される請求項14記載の核酸配列;またはそれに相補的な配列。
  16. 請求項14〜15記載の核酸配列の欠失の後に残存する完全長PDE7(A)の配列の部分を有する核酸配列。
  17. ゲノム起源の請求項14〜16の何れか1項に記載の核酸配列。
  18. 欠失した核酸部分が異種ポリヌクレオチド配列により置き換えられている請求項16または17に記載の核酸配列。
  19. PDE7(A)がヒト、マウスまたはラット起源、最も好ましくはヒト起源のものである、請求項1〜13の何れか1項に記載のポリペプチドまたは、請求項14〜18の何れか1項に記載の核酸配列。
  20. 異種ポリヌクレオチドが選択マーカーを有する請求項18記載の核酸。
  21. 異種ポリヌクレオチドがその5′末端に少なくともloxP配列およびその3′末端に少なくともloxP配列を有する請求項18記載の核酸。
  22. 請求項2のポリペプチドをコードする核酸配列が調節配列に作動可能に連結している請求項14〜21の何れか1項に記載の核酸。
  23. 調節配列が誘導性プロモーターよりなる請求項22記載の核酸。
  24. 調節配列がポナステロンのようなインデューサーにより誘導可能なプロモーターよりなる請求項23記載の核酸。
  25. 請求項14〜24に記載の核酸配列を有する組み換えベクター。
  26. 請求項14〜24に記載の核酸を有する組み換え宿主細胞。
  27. 請求項25記載の組み換えベクターを有する組み換え宿主細胞。
  28. 真核生物である請求項26または27に記載の組み換え宿主細胞。
  29. 接合体、胚、胎仔または成体の多能性幹細胞、哺乳類の分割球または胚盤胞に由来する組み換え宿主細胞およびES細胞よりなる組み換え宿主細胞の群から選択される請求項26〜28の何れか1項に記載の組み換え宿主細胞。
  30. 請求項14〜24の何れか1項に記載の核酸の欠失の後に残存する完全長PDE7の部分を伴った配列を有するポリヌクレオチド構築物を有するベクターの使用により発生したノックアウト動物であって、該構築物が即ちこの動物のゲノム内の天然のPDE7配列の部分を置き換えている、上記動物。
  31. 哺乳類起源の請求項30記載のノックアウト動物。
  32. ネズミまたはラット起源の請求項31記載のノックアウト動物。
  33. 請求項1〜13に記載のポリペプチドの製造方法であって、下記工程:
    a)請求項26〜29に記載の組み換え宿主細胞を適切な培地中で培養すること、
    b)このように条件付けされた培地を採取すること、または、組み換え宿主細胞を溶解すること;
    c)該培地から、または、得られた細胞溶解物から、上記のとおり製造されたポリペプチドを分離または精製すること、
    を有する上記方法。
  34. PDE7ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニング方法であって、該方法は下記工程:
    a)請求項1〜13に記載のポリペプチドの所望の量を準備すること;
    b)工程a)において準備したポリペプチドの所望の量を試験すべき候補化合物の所望の量を含有する緩衝溶液に添加すること;
    c)ホスホジエステラーゼ酵素活性を測定すること;および、
    d)工程c)で得られた測定値酵素活性を候補化合物の非存在下に得られた酵素活性と比較すること
    を包含する上記方法。
  35. 工程a)で準備したポリペプチドが配列番号1の45位のアミノ酸残基で始まり、427位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列またはその相同ポリペプチドよりなる請求項34記載の方法。
  36. ポリペプチドが請求項14〜24に記載の核酸により、または、請求項25記載の組み換えベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞の細胞溶解物に由来する請求項34または35記載の方法。
  37. ホスホジエステラーゼ触媒活性がcAMPの加水分解の水準として測定される請求項34または36記載の方法。
  38. PDE7ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニング方法であって、該方法が下記工程:
    a)適切な培地中で請求項26〜29に記載の組み換え宿主細胞を培養すること;
    b)試験すべき候補化合物の所望の濃度を該培地に添加すること;
    c)細胞内ホスホジエステラーゼ酵素活性を測定すること;および、
    d)工程c)で得られた酵素活性を工程b)を省略した場合に得られる酵素活性と比較すること
    を包含する上記工程。
  39. 組み換え宿主細胞が2量体エクジソン受容体を発現するCHO細胞系統よりなる請求項38記載の方法。
  40. 誘導性調節配列に作動可能に連結した請求項1〜13に記載のポリペプチドをコードする核酸を有する組み換えベクターで組み換え宿主細胞がトランスフェクトされている請求項38記載の方法。
  41. 調節配列がインデューサーにより誘導可能である請求項40記載の方法。
  42. インデューサーがポナステロンである請求項41記載の方法。
  43. 工程b)の前に、組み換え宿主細胞を、工程a)の間に誘導性調節配列を活性化するインデューサーの存在下に培養する請求項38〜42の何れか1項に記載の方法。
  44. アデニレートサイクラーゼ活性化物質を工程b)の終了時、停止溶液の添加前に添加する請求項38〜43の何れか1項に記載の方法。
  45. 工程b)の間に生成した細胞内cAMPの量の測定を介して細胞溶解後にホスホジエステラーゼ酵素活性を測定する請求項38〜44の何れか1項に記載の方法。
  46. PDE7活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニング方法であって、該方法が下記工程:
    a)適切な培地中に請求項1〜13の何れか1項に記載のポリペプチドおよびレポーター遺伝子を同時発現する組み換え宿主細胞を準備すること;
    b)試験すべき候補化合物の所望の濃度を該培地に添加すること;
    c)レポーター遺伝子発現を測定すること;および、
    d)工程c)で得られた酵素活性を工程b)を省略した場合に得られる酵素活性と比較すること
    を包含する上記方法。
  47. 組み換え宿主細胞が2量体エクジソン受容体を発現するCHO細胞系統よりなる請求項46記載の方法。
  48. 誘導性調節配列に作動可能に連結した請求項1〜13に記載のポリペプチドをコードする核酸を有する組み換えベクターで組み換え宿主細胞がトランスフェクトされている請求項46または47に記載の方法。
  49. 調節配列がポナステロンのようなインデューサーにより誘導可能である請求項48記載の方法。
  50. 工程b)の前に、組み換え宿主細胞を、工程a)の間に誘導性調節配列を活性化するインデューサーの存在下に培養する請求項46〜49の何れか1項に記載の方法。
  51. アデニル酸シクラーゼ活性化物質を工程b)の終了時、停止溶液の添加前に添加する請求項46〜50の何れか1項に記載の方法。
  52. レポーター遺伝子がβ−ラクタマーゼ遺伝子である請求項46〜51の方法。
  53. PDE7ホスホジエステラーゼ触媒活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニングのためのキットであって、該キットが下記成分:a)請求項1〜13記載のポリペプチド;
    b)場合により、ホスホジエステラーゼ触媒活性測定を行なうために必要な試薬;
    を包含する上記キット。
  54. PDE7ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニングのためのキットであって、該キットが下記成分:
    a)請求項26〜29記載の組み換え宿主細胞;
    b)場合により、ホスホジエステラーゼ触媒活性測定を行なうために必要な試薬;
    を包含する上記キット。
  55. PDE7ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニングのためのキットであって、該キットが下記成分:a)請求項1〜13記載のポリペプチドおよびレポーター遺伝子を同時発現する本発明の組み換え宿主細胞;
    b)場合により、レポーター遺伝子発現測定を実施するために必要な試薬;
    を包含する上記キット。
  56. PDE7ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物をインビトロで選択するための方法であって、該方法が下記工程:
    a)候補化合物を用いて請求項34〜37に記載の方法を実施すること;および、該候補化合物がホスホジエステラーゼ活性を阻害することがわかった場合は、次に、
    b)工程a)で選択された阻害剤化合物を用いて請求項38〜52に記載の方法を実施すること;
    を包含する上記方法。
  57. PDE7ホスホジエステラーゼ活性を選択的に阻害する化合物を選択するための方法であって、該方法が下記工程:
    a)請求項34〜37、38〜52および56に記載の方法を実施することによりPDE7ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物を選択すること;および、
    b)PDE7以外のPDE酵素の少なくとも1つのホスホジエステラーゼ活性を阻害する能力がないことを、選択された阻害剤化合物について調べること;
    を包含する上記方法。
  58. PDE3およびPDE4酵素のホスホジエステラーゼ活性を阻害する能力がないことを、選択された阻害剤について調べる、請求項57記載の方法。
  59. PDE1、PDE2、PDE3、PDE4、PDE5およびPDE6酵素のホスホジエステラーゼ活性を阻害する能力がないことを、選択された阻害剤について調べる、請求項57記載の方法。
  60. 請求項34〜37、38〜52、56および57〜59に記載の方法に従って選択されたホスホジエステラーゼ阻害剤化合物。
  61. 医薬組成物の製造のための請求項34〜37、38〜52、56および57〜59に記載の方法に従って選択されたホスホジエステラーゼ阻害剤化合物の使用。
  62. ヒトまたは動物の治療、診断または手術において使用するための医薬組成物の製造のための請求項34〜52および56〜59の何れか1項に記載の方法により入手可能、同定可能、選択可能または特性化可能な化合物の使用。
  63. ヒトまたは動物の治療、診断または手術において使用するための医薬組成物の製造のための請求項34〜52および56〜59の何れか1項に記載の方法により入手、同定、選択または特性化される化合物の使用。
  64. 免疫系に影響する疾患、例えば、AIDS、移植片拒絶反応、自己免疫疾患、例えばT細胞関連疾患、例えば慢性関節リューマチ;炎症性疾患、例えば呼吸器炎症性疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息;胃腸炎症性疾患、例えばクローン病、結腸炎、膵臓炎、並びに白血病を含む種々の癌のような種々の病理学的状態の治療または予防のための医薬組成物の製造のための、請求項34〜52および56〜59の何れか1項に記載の方法により入手、同定、選択または特性化される化合物の使用。
  65. 免疫系に影響する疾患、例えば、AIDS、移植片拒絶反応、自己免疫疾患、例えばT細胞関連疾患、例えば慢性関節リューマチ;炎症性疾患、例えば呼吸器炎症性疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息;胃腸炎症性疾患、例えばクローン病、結腸炎、膵臓炎、並びに白血病を含む種々の癌のような種々の病理学的状態の治療または予防のための医薬組成物の製造のための請求項34〜52および56〜59の何れか1項に記載の方法により入手可能、同定可能、選択可能または特性化可能である化合物の使用。
  66. 免疫系に影響する疾患、例えば、AIDS、移植片拒絶反応、自己免疫疾患、例えばT細胞関連疾患、例えば慢性関節リューマチ;炎症性疾患、例えば呼吸器炎症性疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息;胃腸炎症性疾患、例えばクローン病、結腸炎、膵臓炎、並びに白血病を含む種々の癌のような種々の病理学的状態の治療または予防のための化合物の合成における、請求項34〜52および56〜59の何れか1項に記載の方法により入手、同定、選択または特性化される化合物の使用。
JP2002530718A 2000-09-28 2001-09-28 Pde7活性を示すポリペプチドおよびpde7酵素活性を阻害する化合物を選択するためのその使用 Abandoned JP2004509640A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP00402683A EP1195435A1 (en) 2000-09-28 2000-09-28 Truncated phosphodiesterase-7 polypeptides
PCT/EP2001/011303 WO2002026954A2 (en) 2000-09-28 2001-09-28 Truncated phosphodiesterase-7 polypeptides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2004509640A true JP2004509640A (ja) 2004-04-02
JP2004509640A5 JP2004509640A5 (ja) 2008-11-27

Family

ID=8173884

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2002530718A Abandoned JP2004509640A (ja) 2000-09-28 2001-09-28 Pde7活性を示すポリペプチドおよびpde7酵素活性を阻害する化合物を選択するためのその使用

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20030036184A1 (ja)
EP (2) EP1195435A1 (ja)
JP (1) JP2004509640A (ja)
AU (1) AU2002218199A1 (ja)
WO (1) WO2002026954A2 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004044229A2 (en) * 2002-11-13 2004-05-27 Bayer Healthcare Ag DIAGNOSTICS AND THERAPEUTICS FOR DISEASES ASSOCIATED WITH HUMAN PHOSPHODIESTERASE 7A2 (PDE7a2)
WO2004044196A1 (en) * 2002-11-13 2004-05-27 Bayer Healthcare Ag DIAGNOSTICS AND THERAPEUTICS FOR DISEASES ASSOCIATED WITH HUMAN PHOSPHODIESTERASE 7B (PDE7b)
WO2004069989A2 (en) * 2003-02-07 2004-08-19 Affinium Pharmaceuticals, Inc. Novel purified phosphodiesterase polypeptides
US8637528B2 (en) 2007-03-27 2014-01-28 Omeros Corporation Use of PDE7 inhibitors for the treatment of movement disorders

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002026954A2 (en) 2002-04-04
EP1325137A2 (en) 2003-07-09
EP1195435A1 (en) 2002-04-10
AU2002218199A1 (en) 2002-04-08
WO2002026954A3 (en) 2002-09-26
US20030036184A1 (en) 2003-02-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6486299B1 (en) Genes and proteins predictive and therapeutic for stroke, hypertension, diabetes and obesity
Wu et al. MEK-2, a Caenorhabditis elegans MAP kinase kinase, functions in Ras-mediated vulval induction and other developmental events.
KR20080003780A (ko) 부위-특이적 세린 리콤비나제 및 그의 이용 방법
JP2001136987A (ja) ホスホジエステラーゼ酵素
JP2003502046A (ja) 新規ヒト環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ
CA2377662A1 (en) Novel protein phosphatases and diagnosis and treatment of phosphatase-related disorders
JP2003512072A (ja) ヒトスフィンゴシンキナーゼ遺伝子
JP2004509640A (ja) Pde7活性を示すポリペプチドおよびpde7酵素活性を阻害する化合物を選択するためのその使用
US20060286622A1 (en) Polypeptides exhibiting PDE7 activity and their use for selecting compounds which inhibit PDE 7 enzyme activity
JP2000506396A (ja) ホスファチジルイノシトール―3′―キナーゼ関連タンパク質をコードするヌクレオチド配列及びその利用
JP2004531207A (ja) 単離ヒト薬剤−代謝タンパク質、ヒト薬剤−代謝タンパク質をコード化する核酸分子及びその使用
EP1368462B1 (en) Bfit (brown fat inducible thioesterase) polypeptides and polynucleotides and their use
JP2003503049A (ja) 新規なヒトアミノペプチダーゼである17867
WO1999002724A2 (en) Methods for identifying genes expressed in selected lineages, and a novel genes identified using the methods
US20090162848A1 (en) Noxin, a novel stress-induced gene involved in cell cycle and apoptosis
AU2004223739A1 (en) Cyclic AMP response element activator proteins and uses related thereto
US20030130485A1 (en) Novel human genes and methods of use thereof
CA2389852A1 (en) Congenic animal models of non-insulin dependent diabetes mellitus
AU735296B2 (en) Mammalian and human REC2
JP2005503757A (ja) 単離ヒトキナーゼタンパク質、ヒトキナーゼタンパク質をコードする核酸分子、及びそれらの使用方法
JP2003510085A (ja) 新規ヒトユビキチンプロテアーゼ23413
JP2005526516A (ja) ヒト精神分裂病における欠損遺伝子1のマウスオルソログ
JP2003503050A (ja) 新規なヒトカルボキシペプチダーゼである22012
US20020165208A1 (en) Compositions and methods relating to hypertension
US20040092441A1 (en) Tyrosine kinase modulators

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20080929

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20080929

A762 Written abandonment of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A762

Effective date: 20090210