JP2004509640A - Ｐｄｅ７活性を示すポリペプチドおよびｐｄｅ７酵素活性を阻害する化合物を選択するためのその使用 - Google Patents

Ｐｄｅ７活性を示すポリペプチドおよびｐｄｅ７酵素活性を阻害する化合物を選択するためのその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は内因性完全長ＰＤＥ７よりも高いＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ活性を示すポリペプチドおよびＰＤＥ７酵素活性を阻害する化合物を選択するためのその使用に関する。

Description

【０００１】
【技術分野】
本発明はホスホジエステラーゼ７（ＰＤＥ７）活性を示す新規ポリペプチドに関する。これらの新規ポリペプチドはＰＤＥ７阻害剤のスクリーニングのために有用である。
【０００２】
【背景技術】
環状ｃＡＭＰがシグナル伝達経路において重要な役割を有し、ｃＡＭＰ依存性蛋白質キナーゼのファミリーを活性化する遍在性の第二メッセンジャーである。細胞内ｃＡＭＰ濃度は、この第二メッセンジャーをその不活性代謝産物である５′ＡＭＰに分解することが主な機能であるホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）として知られている酵素のスーパーファミリーにより調節される。従って、これらの酵素の活性はホルモンおよび神経伝達物質のような種々の細胞外物質に対する細胞の機能的応答を調節する際に重要である。ＰＤＥは、特に基質ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰに対するその構造、組織発現、局在化およびＰＤＥ阻害剤に対する感受性により特徴付けられる１１のファミリーに分けられる酵素の複雑な群を構成する。
【０００３】
これらのファミリーの４種の酵素、即ち、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４、ＰＤＥ７およびＰＤＥ８はｃＡＭＰに対して高度に選択的であり、そして、最も生理学的に関連性の高いｃＡＭＰ代謝酵素であると考えられる。
【０００４】
ＰＤＥ４およびＰＤＥ３の触媒特性並びにこれらの調節は広範に研究されている。しかしながら、より最近発見されたＰＤＥ７Ａに関してはほとんど知られていない。この酵素はｃＡＭＰに対するその特異性、その基質に対する高い親和性、そしてＰＤＥ４およびＰＤＥ３とは異なるその薬物動態および薬理学的特性により特徴付けられる。
【０００５】
ＰＤＥ７Ａには２種のスプライス変異体、即ちＰＤＥ７Ａ１（Ｍｉｃｈａｅｌｉ ｅｔ ａｌ． １９９３）およびＰＤＥ７Ａ２（Ｂｌｏｏｍ Ｔ．Ｊ．ａｎｄ Ｂｅａｖｏ Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ． １９９６）が存在し、そして相当する蛋白質はそのアミノ末端配列が異なるのみである。ＰＤＥ７Ａ１は５５〜５７ｋＤａの蛋白質であり、そして主に可溶性細胞画分中に局在する。ＰＤＥ７Ａ２は疎水性のＮ末端を有する５３ｋＤａの蛋白質であり、細胞の粒子／膜画分にのみ存在する。
【０００６】
【発明の開示】
本発明はＰＤＥ７の触媒活性を驚くべきことに保持しており、そして、内因性の完全長ＰＤＥ７Ａ１およびＰＤＥ７Ａ２蛋白質の活性よりも高い活性を示す完全長ＰＤＥ７Ａに由来するポリペプチドを始めて提供する。
より詳しくは、本発明は内因性の完全長ＰＤＥ７Ａ１およびＰＤＥ７Ａ２蛋白の活性よりも高い活性を意外にも示す完全長ＰＤＥ７Ａに由来するポリペプチドを始めて提供する。
【０００７】
本発明はまたＰＤＥ７Ａ酵素の触媒部位の局在化を始めて示す。
本発明はまた、完全長ＰＤＥ７酵素の触媒活性を制御または制限すると考えられる、ＰＤＥ７、特にＰＤＥ７Ａにおける調節ドメイン、特に阻害ドメインの存在を始めて同定している。実際、本発明者等はこの調節ドメインの欠失により、得られるトランケートされたＰＤＥ７Ａ酵素の酵素活性が有意に改善されることを明らかにした。
【０００８】
ＰＤＥ７（Ａ）内のこの阻害／調節ドメインの存在を認識することは、この阻害ドメインの影響をブロックするか低減することによりＰＤＥ７（Ａ）の触媒活性を改善できるという可能性をもたらす。特に、本発明は完全長ＰＤＥ７の触媒活性を調節するのに必須であるＰＤＥ７（Ａ）阻害ドメインの一部を含まないＰＤＥ７（Ａ）の突然変異体を包含する。これらの突然変異体は完全長ＰＤＥ７（Ａ）と比較して進歩したＰＤＥ触媒活性を示す。
【０００９】
本発明は、
ＰＤＥ７の触媒ドメインを少なくとも有する、内因性完全長ＰＤＥ７蛋白質のホスホジエステラーゼ触媒活性より少なくとも約６倍、好ましくは約８または１０倍、最も好ましくは１５〜２０倍高値のホスホジエステラーゼ触媒活性を保有するポリペプチド；
最初のＡＴＧコドンから残基８１（Ｌ２２Ｍ２）までの配列の逐次的欠失により発生するＨＣＰ１のＮＨ２末端欠失よりなる配列としてミカエリ等（１９９３）により開示されたアミノ酸配列を例外としてＰＤＥ７の触媒ドメインを少なくとも有する、内因性完全長ＰＤＥ７蛋白質のホスホジエステラーゼ触媒活性より少なくとも約６倍、好ましくは約８または１０倍、最も好ましくは１５〜２０倍高値のホスホジエステラーゼ触媒活性を保有するポリペプチド；
である。
【００１０】
本発明はまた、ホスホジエステラーゼ７触媒ドメインを保有し、そして配列番号１、２または３のアミノ酸配列よりなる群から選択される配列の連続するアミノ酸少なくとも３１２個を有する、約４２７アミノ酸長までの前述のポリペプチド；またはその相同ポリペプチドに関する。
【００１１】
該ポリペプチドは、配列番号１、２または３の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４位に位置するアミノ酸残基から始まり、
配列番号１、２または３の３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７位に位置するアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列；またはその相同ポリペプチドを有する。
【００１２】
配列番号１、２または３の５位のアミノ酸残基で始まり、４２７位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有するポリペプチド；および／または、配列番号１、２または３の２５位のアミノ酸残基で始まり、４２７位のアミノ酸残基で終わるもの；および／または配列番号１、２または３の４５位のアミノ酸残基で始まり、３９４位のアミノ酸残基で終わるもの；および／または配列番号１、２または３の４５位のアミノ酸残基で始まり、４２７位のアミノ酸残基で終わるものが好ましい。
【００１３】
配列番号１、２または３の４５位のアミノ酸残基で始まり、３９４位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有するポリペプチド；および配列番号１、２または３の４５位のアミノ酸残基で始まり、４２７位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有するポリペプチドが最も好ましい。
【００１４】
本発明はまた、前述したポリペプチドと少なくとも８０％の相同性または同一性、好ましくは８５％の相同性または同一性を有するポリペプチドにも関する。
より好ましくは、本発明は前述したポリペプチドと少なくとも９０％の相同性または同一性、好ましくは９５％の相同性または同一性、最も好ましくは９９％の相同性または同一性を有するポリペプチドに関する。
【００１５】
本発明の別の要件は前述したポリペプチドをコードする核酸配列またはそれに相補的な配列である。
本発明の別の特徴は配列番号４、５または６の核酸配列よりなる群から選択される核酸配列；またはそれに相補的な配列である。
これに加えて、前述したポリペプチドをコードする核酸の一部が欠失しているＰＤＥ７ホスホジエステラーゼをコードするゲノムポリヌクレオチドを有する核酸配列もまた本発明に含まれる。
【００１６】
１つの実施態様において、本発明は前述した核酸配列の欠失の後に残存する完全長ＰＤＥ７の配列の部分を有する核酸配列に関する。
好ましい実施態様において、完全長ＰＤＥ７はゲノム起源である。
該核酸の欠失した核酸部分は、異種ポリヌクレオチド配列により起きかえられる。
該核酸において、ゲノムポリヌクレオチドが哺乳類ＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ、好ましくはヒト、マウスまたはラットのホスホジエステラーゼ、最も好ましくはヒトのＰＤＥ７ホスホジエステラーゼである。
該核酸において、異種ポリヌクレオチドは選択マーカーを有する。
【００１７】
該核酸において、異種ポリヌクレオチドはその５′末端に少なくともｌｏｘＰ配列およびその３′末端に少なくともｌｏｘＰ配列を有する。
該核酸において、前述したポリペプチドをコードする核酸配列は、好ましくは誘導性プロモーターであり、最も好ましくはポナステロンのようなインデューサーにより誘導可能なプロモーターである調節配列に作動可能に連結している。
本発明はまた前述した核酸を有する組み換えベクター、並びに、該核酸を有する組み換え宿主細胞に関する。
組み換え宿主細胞は組み換えベクターを有してよい。
【００１８】
該組み換え宿主細胞は真核生物であり、そして、接合体、胚、胎仔または成体の多能性幹細胞、哺乳類の分割球または胚盤胞に由来する組み換え宿主細胞およびＥＳ細胞よりなる組み換え宿主細胞の群から選択される。
【００１９】
本発明の別の特徴は、前述したポリペプチドの製造方法であって下記工程：
ａ）前述の組み換え宿主細胞を適切な培地中で培養すること、
ｂ）このようにコンディショニングされた培地を採取すること、または、組み換え宿主細胞を溶解すること；
ｃ）該培地から、または、得られた細胞溶解物から、上記のとおり製造されたポリペプチドを分離または精製すること、
を有する上記方法である。
【００２０】
本発明はまた、ＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニング方法であって、該方法は下記工程：
ａ）前述のポリペプチドの所望の量を準備すること；
ｂ）工程ａ）において準備したポリペプチドの所望の量を試験すべき候補化合物の所望の量を含有する緩衝溶液に添加すること；
ｃ）ホスホジエステラーゼ酵素活性を測定すること；および、
ｄ）工程ｃ）で得られた測定された酵素活性を候補化合物の非存在下に得られた酵素活性と比較すること；
を包含する上記方法である。
【００２１】
該方法において、工程ａ）で準備したポリペプチドは、配列番号１の４５位のアミノ酸残基で始まり、４２７位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列またはその相同ポリペプチドよりなる。
該方法において、ポリペプチドは前述した核酸により、または、前述した組み換えベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞の細胞溶解物に由来する。
該方法において、ホスホジエステラーゼ触媒活性はｃＡＭＰの加水分解の水準として測定される。
【００２２】
ＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニング方法も本発明に包含され、該方法は下記工程：
ａ）適切な培地中で前述した組み換え宿主細胞を培養すること；
ｂ）試験すべき候補化合物の所望の濃度を該培地に添加すること；
ｃ）細胞内ホスホジエステラーゼ酵素活性を測定すること；および、
ｄ）工程ｃ）で得られた酵素活性を工程ｂ）を省略した場合に得られる酵素活性と比較すること；
を包含する。
【００２３】
該方法において、組み換え宿主細胞は２量体エクジソン受容体を発現するＣＨＯ細胞系統よりなる。
該方法において、誘導性調節配列に作動可能に連結した前述したポリペプチドをコードする核酸を有する組み換えベクターで組み換え宿主細胞はトランスフェクトされており、好ましくは調節配列はポナステロンのようなインデューサーにより誘導可能である。
【００２４】
該方法において、工程ｂ）の前に、組み換え宿主細胞を、工程ａ）の間に誘導性調節配列を活性化するインデューサーの存在下に培養する。
該方法において、アデニル酸シクラーゼ活性化物質を工程ｂ）の終了時、停止溶液の添加前に添加する。
該方法において、工程ｂ）の間に生成した細胞内ｃＡＭＰの量の測定を介して細胞溶解後にホスホジエステラーゼ酵素活性を測定する。
【００２５】
本発明はまた、ＰＤＥ７活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニング方法を包含し、該方法は下記工程：
ａ）適切な培地中に本発明のポリペプチドおよびレポーター遺伝子を同時発現する組み換え宿主細胞を準備すること；
ｂ）試験すべき候補化合物の所望の濃度を該培地に添加すること；
ｃ）レポーター遺伝子発現を測定すること；および、
ｄ）工程ｃ）で得られた酵素活性を工程ｂ）を省略した場合に得られる酵素活性と比較すること；
を包含する。
【００２６】
該方法において、組み換え宿主細胞は２量体エクジソン受容体を発現するＣＨＯ細胞系統よりなる。
該方法において、誘導性調節配列に作動可能に連結した前述のポリペプチドをコードする核酸を有する組み換えベクターで組み換え宿主細胞はトランスフェクトされている。
該方法において、調節配列はポナステロンのようなインデューサーにより誘導可能である。
【００２７】
該方法において、工程ｂ）の前に、組み換え宿主細胞は、工程ａ）の間に誘導性調節配列を活性化するインデューサーの存在下に培養される。
該方法において、アデニル酸シクラーゼ活性化物質は、工程ｂ）の終了時、停止溶液の添加前に添加される。
該方法において、レポーター遺伝子はβ−ラクタマーゼ遺伝子である。
一般的に工程ａ）で培養される宿主細胞は前述した如何なる培養可能な宿主細胞であってもよく、そして好ましくは、哺乳類起源の宿主細胞である。
【００２８】
本発明の別の特徴は、ＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ触媒活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニングのためのキットであり、該キットは下記成分：
ａ）前述のポリペプチド；
ｂ）場合により、ホスホジエステラーゼ触媒活性測定を行なうために必要な試薬；
を包含する。
【００２９】
本発明の別の実施態様は、ＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ触媒活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニングのためのキットであり、該キットは下記成分：
ａ）前述の組み換え宿主細胞；
ｂ）場合により、ホスホジエステラーゼ触媒活性測定を行なうために必要な試薬；
を包含する。
【００３０】
本発明の更に別の実施態様は、ＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ触媒活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニングのためのキットであり、該キットは下記成分：
ａ）前述のポリペプチドおよびレポーター遺伝子を同時発現する組み換え宿主細胞；
ｂ）場合により、レポーター遺伝子発現測定を行なうために必要な試薬；
を包含する。
【００３１】
本発明の別の特徴は、ＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ触媒活性を阻害する化合物をインビトロで選択するための方法であり、該方法は下記工程：
ａ）候補化合物を用いて前述の方法の１つを実施すること；および、該候補化合物がホスホジエステラーゼ活性を阻害することがわかった場合は、次に、
ｂ）工程ａ）で選択された阻害剤化合物を用いて使用した方法とは異なる本発明の別の方法を実施すること；
を包含する。
【００３２】
本発明の更に別の特徴は、ＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ触媒活性を阻害する化合物をインビトロで選択するための方法であり、該方法は下記工程：
ａ）前述の方法を実施することによりＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物を選択すること；および、
ｂ）ＰＤＥ７以外のＰＤＥ酵素少なくとも１つのホスホジエステラーゼ活性を阻害する能力がないことを、選択された阻害剤化合物について調べること；
を包含する。
【００３３】
該方法において、ＰＤＥ３およびＰＤＥ４酵素のホスホジエステラーゼ活性を阻害する能力がないことを選択された阻害剤について調べ、そして、好ましくは該方法において、ＰＤＥ１、ＰＤＥ２、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４、ＰＤＥ５およびＰＤＥ６酵素のホスホジエステラーゼ活性を阻害する能力がないことを、選択された阻害剤について調べる。
【００３４】
本発明はまた前述の方法に従って選択されたホスホジエステラーゼ阻害剤に関する。
本発明はまた、医薬組成物の製造のための前述の方法に従って選択されたホスホジエステラーゼ阻害剤化合物の使用に関する。
本発明はまた、前述の核酸の欠失の後に残存する完全長ＰＤＥ７の部分を伴った配列を有するポリヌクレオチド構築物を有するベクターの使用により発生したノックアウト動物であって、該構築物が即ちこの動物のゲノム内の天然のＰＤＥ７配列の部分を置き換えている。
好ましくは、該ノックアウト動物は哺乳類起源である。
より好ましくは、該ノックアウト動物はネズミまたはラット起源である。
より好ましくは、該ノックアウト動物はネズミ起源である。
【００３５】
本発明はまた下記特徴：
１）最初のＡＴＧコドンから残基８１（Ｌ２２Ｍ２）までの配列の逐次的欠失により発生するＨＣＰ１のＮＨ２末端欠失よりなる配列としてミカエリ等（Ｍｉｃｈａｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，１２９２５−１２９３２）により開示されたアミノ酸配列を例外としてＰＤＥ７の触媒ドメインを少なくとも有する、内因性の完全長ＰＤＥ７蛋白質のホスホジエステラーゼ触媒活性より少なくとも約６倍、好ましくは約８または１０倍、最も好ましくは１５〜２０倍高値のホスホジエステラーゼ触媒活性を保有するポリペプチド；
【００３６】
２）ホスホジエステラーゼ７触媒ドメインを保有し、そして、配列番号１、２または３のアミノ酸配列よりなる群から選択される配列の連続するアミノ酸少なくとも３１２個を有する、約４２７アミノ酸長までの上記１）記載のポリペプチド；またはその相同ポリペプチド；
【００３７】
３）配列番号１、２または３の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４位に位置するアミノ酸残基から始まり、
【００３８】
配列番号１、２または３の３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７位に位置するアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する上記２記載のポリペプチド；またはその相同ポリペプチド；
【００３９】
４）配列番号１、２または３の５位のアミノ酸残基で始まり、４２７位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する上記３）記載のポリペプチド；またはその相同ポリペプチド；
５）配列番号１、２または３の２５位のアミノ酸残基で始まり、４２７位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する上記３）記載のポリペプチド；またはその相同ポリペプチド；
【００４０】
６）配列番号１、２または３の４５位のアミノ酸残基で始まり、４２７位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する上記３）記載のポリペプチド；またはその相同ポリペプチド；
７）配列番号１、２または３の５位のアミノ酸残基で始まり、３９４位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する上記３）記載のポリペプチド；またはその相同ポリペプチド；
【００４１】
８）配列番号１、２または３の２５位のアミノ酸残基で始まり、３９４位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する上記３）記載のポリペプチド；またはその相同ポリペプチド；
９）配列番号１、２または３の４５位のアミノ酸残基で始まり、３９４位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する上記３）記載のポリペプチド；またはその相同ポリペプチド；
【００４２】
１０）上記１）〜９）の何れか１つに記載のポリペプチドと少なくとも８０％の相同性または同一性、好ましくは８５％の相同性または同一性を有するポリペプチド；
１１）上記１）〜９）の何れか１つに記載のポリペプチドと少なくとも９０％の相同性または同一性、好ましくは９５％の相同性または同一性、最も好ましくは９９％の相同性または同一性を有するポリペプチド；
【００４３】
１２）最初のＡＴＧコドンから残基８１（Ｌ２２Ｍ２）までの配列の逐次的欠失により発生するＨＣＰ１のＮＨ２末端欠失よりなる配列としてミカエリ等（Ｍｉｃｈａｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，１２９２５−１２９３２）により開示されたアミノ酸配列を例外として、完全長ＰＤＥ７（Ａ）蛋白質のアミノ酸５７〜１００の間のアミノ酸で始まり、アミノ酸４５０〜４８３の間で終わる、アミノ酸配列を有するポリペプチド；
【００４４】
１３）ＰＤＥ７Ａ蛋白質がヒトＰＤＥ７Ａ１またはＰＤＥ７Ａ２である上記１２）記載のポリペプチド；
１４）上記１）〜１３）の何れか１つに記載のポリペプチドをコードする核酸配列またはそれに相補的な配列；
１５）配列番号４、５または６の核酸配列よりなる群から選択される上記１４）記載の核酸配列；またはそれに相補的な配列；
１６）上記１４）〜１５）記載の核酸配列の欠失の後に残存する完全長ＰＤＥ７（Ａ）の配列の部分を有する核酸配列；
１７）ゲノム起源の上記１４）〜１６）の何れか１つに記載の核酸配列；
【００４５】
１８）欠失した核酸部分が異種ポリヌクレオチド配列により起きかえられている上記１６）または１７）に記載の核酸配列；
１９）ＰＤＥ７（Ａ）がヒト、マウスまたはラット起源、最も好ましくはヒト起源のものである、上記１）〜３）の何れか１つに記載のポリペプチドまたは、上記１４）〜１８）の何れか１つに記載の核酸配列；
２０）異種ポリヌクレオチドが選択マーカーを有する上記１８）記載の核酸；
２１）異種ポリヌクレオチドがその５′末端に少なくともｌｏｘＰ配列およびその３′末端に少なくともｌｏｘＰ配列を有する上記１８）記載の核酸；
２２）上記２のポリペプチドをコードする核酸配列が調節配列に作動可能に連結している上記１４）〜２１）の何れか１つに記載の核酸；
【００４６】
２３）調節配列が誘導性プロモーターよりなる上記２２）記載の核酸；
２４）調節配列がポナステロンのようなインデューサーにより誘導可能なプロモーターよりなる上記２３）記載の核酸；
２５）上記１４）〜２４）に記載の核酸配列を有する組み換えベクター；
２６）上記１４）〜２４）に記載の核酸を有する組み換え宿主；
２７）上記２５）記載の組み換えベクターを有する組み換え宿主；
【００４７】
２８）真核生物である上記２６）または２７）に記載の組み換え宿主；
２９）接合体、胚、胎仔または成体の多能性幹細胞、哺乳類の分割球または胚盤胞に由来する組み換え宿主細胞およびＥＳ細胞よりなる組み換え宿主細胞の群から選択される上記２６）〜２８）の何れか１つに記載の組み換え宿主細胞；
３０）上記１４）〜２４）の何れか１つに記載の核酸の欠失の後に残存する完全長ＰＤＥ７の部分を伴った配列を有するポリヌクレオチド構築物を有するベクターの使用により発生したノックアウト動物であって、該構築物が即ちこの動物のゲノム内の天然のＰＤＥ７配列の部分を置き換えている、上記動物；
【００４８】
３１）哺乳類起源の上記３０）記載のノックアウト動物；
３２）ネズミまたはラット起源の上記３１）記載のノックアウト動物；
３３）上記１）〜１３）に記載のポリペプチドの製造方法であって下記工程：
ａ）上記２６）〜２９）に記載の組み換え宿主細胞を適切な培地中で培養すること、
ｂ）このように条件付けされた培地を採取すること、または、組み換え宿主細胞を溶解すること；
ｃ）該培地から、または、得られた細胞溶解物から、上記のとおり製造されたポリペプチドを分離または精製すること、
を有する上記方法；
【００４９】
３４）ＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニング方法であって、該方法は下記工程：
ａ）上記１）〜１３）に記載のポリペプチドの所望の量を準備すること；
ｂ）工程ａ）において準備したポリペプチドの所望の量を試験すべき候補化合物の所望の量を含有する緩衝溶液に添加すること；
ｃ）ホスホジエステラーゼ酵素活性を測定すること；および、
ｄ）工程ｃ）で得られた測定値酵素活性を候補化合物の非存在下に得られた酵素活性と比較すること；
を包含する上記方法；
【００５０】
３５）工程ａ）で準備したポリペプチドが配列番号１の４５位のアミノ酸残基で始まり、４２７位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列またはその相同ポリペプチドよりなる上記３４）記載の方法；
３６）ポリペプチドが上記１４）〜２４）に記載の核酸により、または、上記２５）記載の組み換えベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞の細胞溶解物に由来する上記３４）または３５）記載の方法；
３７）ホスホジエステラーゼ触媒活性がｃＡＭＰの加水分解の水準として測定される上記３４）または３６）記載の方法；
【００５１】
３８）ＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニング方法であって、該方法が下記工程：
ａ）適切な培地中で上記２６）〜２９）に記載の組み換え宿主細胞を培養すること；
ｂ）試験すべき候補化合物の所望の濃度を該培地に添加すること；
ｃ）細胞内ホスホジエステラーゼ酵素活性を測定すること；および、
ｄ）工程ｃ）で得られた酵素活性を工程ｂ）を省略した場合に得られる酵素活性と比較すること；
を包含する上記工程；
【００５２】
３９）組み換え宿主細胞が２量体エクジソン受容体を発現するＣＨＯ細胞系統よりなる上記３８）記載の方法；
４０）誘導性調節配列に作動可能に連結した上記１）〜１３）に記載のポリペプチドをコードする核酸を有する組み換えベクターで組み換え宿主細胞がトランスフェクトされている上記３８）記載の方法；
４１）調節配列がインデューサーにより誘導可能である上記４０）記載の方法；
４２）インデューサーがポナステロンである上記４１）記載の方法；
【００５３】
４３）工程ｂ）の前に、組み換え宿主細胞を、工程ａ）の間に誘導性調節配列を活性化するインデューサーの存在下に培養する上記３８）〜４２）の何れか１つに記載の方法；
４４）アデニル酸シクラーゼ活性化物質を工程ｂ）の終了時、停止溶液の添加前に添加する上記３８）〜４３）の何れか１つに記載の方法；
４５）工程ｂ）の間に生成した細胞内ｃＡＭＰの量の測定を介して細胞溶解後にホスホジエステラーゼ酵素活性を測定する上記３８）〜４３）の何れか１つに記載の方法；
【００５４】
４６）ＰＤＥ７活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニング方法であって、該方法が下記工程：
ａ）適切な培地中に上記１）〜１３）の何れか１つに記載のポリペプチドおよびレポーター遺伝子を同時発現する組み換え宿主細胞を準備すること；
ｂ）試験すべき候補化合物の所望の濃度を該培地に添加すること；
ｃ）レポーター遺伝子発現を測定すること；および、
ｄ）工程ｃ）で得られた酵素活性を工程ｂ）を省略した場合に得られる酵素活性と比較すること；
を包含する上記方法；
【００５５】
４７）組み換え宿主細胞が２量体エクジソン受容体を発現するＣＨＯ細胞系統よりなる上記４６）記載の方法；
４８）誘導性調節配列に作動可能に連結した上記１）〜１３）に記載のポリペプチドをコードする核酸を有する組み換えベクターで組み換え宿主細胞がトランスフェクトされている上記４６）または４７）に記載の方法；
４９）調節配列がポナステロンのようなインデューサーにより誘導可能である上記４８）記載の方法；
５０）工程ｂ）の前に、組み換え宿主細胞を、工程ａ）の間に誘導性調節配列を活性化するインデューサーの存在下に培養する上記４６）〜４９）の何れか１つに記載の方法；
【００５６】
５１）アデニル酸シクラーゼ活性化物質を工程ｂ）の終了時、停止溶液の添加前に添加する上記４６）〜５０）の何れか１つに記載の方法；
５２）レポーター遺伝子がβ−ラクタマーゼ遺伝子である上記４６）〜５１）の方法；
５３）ＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ触媒活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニングのためのキットであって、該キットが下記成分：
ａ）上記１）〜１３）記載のポリペプチド；
ｂ）場合により、ホスホジエステラーゼ触媒活性測定を行なうために必要な試薬；
を包含する上記キット；
【００５７】
５４）ＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ触媒活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニングのためのキットであって、該キットが下記成分：
ａ）上記２６）〜２９）記載の組み換え宿主細胞；
ｂ）場合により、ホスホジエステラーゼ触媒活性測定を行なうために必要な試薬；
を包含する上記キット；
５５）ＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ触媒活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニングのためのキットであって、該キットが下記成分：
ａ）上記１）〜１３）記載のポリペプチドおよびレポーター遺伝子を同時発現する本発明の組み換え宿主細胞；
ｂ）場合により、レポーター遺伝子発現測定を実施するために必要な試薬；
を包含する上記キット；
【００５８】
５６）ＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ触媒活性を阻害する化合物をインビトロで選択するための方法であって、該方法が下記工程：
ａ）候補化合物を用いて上記３４）〜３７）に記載の方法を実施すること；および、該候補化合物がホスホジエステラーゼ活性を阻害することがわかった場合は、次に、
ｂ）工程ａ）で選択された阻害剤化合物を用いて上記３８）〜５２）に記載の方法を実施すること；
を包含する上記方法；
【００５９】
５７）ＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ触媒活性を選択的に阻害する化合物を選択するための方法であって、該方法が下記工程：
ａ）上記３４）〜３７）、３８）〜５２）および５６）に記載の方法を実施することによりＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物を選択すること；および、
ｂ）ＰＤＥ７以外のＰＤＥ酵素少なくとも１つのホスホジエステラーゼ活性を阻害する能力がないことを、選択された阻害剤化合物について調べること；
を包含する上記方法；
【００６０】
５８）ＰＤＥ３およびＰＤＥ４酵素のホスホジエステラーゼ活性を阻害する能力がないことを、選択された阻害剤化合物について調べる、上記）５７記載の方法；
５９）ＰＤＥ１、ＰＤＥ２、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４、ＰＤＥ５およびＰＤＥ６酵素のホスホジエステラーゼ活性を阻害する能力がないことを、選択された阻害剤化合物について調べる、上記５７）記載の方法；
６０）上記３４）〜３７）、３８）〜５２）、５６）および５７）〜５９）に記載の方法に従って選択されたホスホジエステラーゼ阻害剤化合物；
【００６１】
６１）医薬組成物の製造のための上記３４）〜３７）、３８）〜５２）、５６）および５７）〜５９）に記載の方法に従って選択されたホスホジエステラーゼ阻害剤化合物の使用；
６２）ヒトまたは動物の治療、診断または手術において使用するための医薬組成物の製造のための上記３４）〜５２）および５６）〜５９）の何れか１つに記載の方法により入手可能、同定可能、選択可能または特性化可能な化合物の使用；
６４）ヒトまたは動物の治療、診断または手術において使用するための医薬組成物の製造のための上記３４）〜５２）および５６）〜５９）の何れか１つに記載の方法により入手、同定、選択または特性化される化合物の使用；
【００６２】
６５）免疫系に影響する疾患、例えば、ＡＩＤＳ、移植片拒絶反応、自己免疫疾患、例えばＴ細胞関連疾患、例えば慢性関節リューマチ；炎症性疾患、例えば呼吸器炎症性疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息；胃腸炎症性疾患、例えばクローン病、結腸炎、膵臓炎、並びに白血病を含む種々の癌のような種々の病理学的状態の治療または予防のための医薬組成物の製造のための、上記３４）〜５２）および５６）〜５９）の何れか１つに記載の方法により入手、同定、選択または特性化される化合物の使用；
【００６３】
６６）免疫系に影響する疾患、例えば、ＡＩＤＳ、移植片拒絶反応、自己免疫疾患、例えばＴ細胞関連疾患、例えば慢性関節リューマチ；炎症性疾患、例えば呼吸器炎症性疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息；胃腸炎症性疾患、例えばクローン病、結腸炎、膵臓炎、並びに白血病を含む種々の癌のような種々の病理学的状態の治療または予防のための医薬組成物の製造のための上記３４）〜５２）および５６）〜５９）の何れか１つに記載の方法により入手可能、同定可能、選択可能または特性化可能である化合物の使用；
【００６４】
６７）免疫系に影響する疾患、例えば、ＡＩＤＳ、移植片拒絶反応、自己免疫疾患、例えばＴ細胞関連疾患、例えば慢性関節リューマチ；炎症性疾患、例えば呼吸器炎症性疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息；胃腸炎症性疾患、例えばクローン病、結腸炎、膵臓炎、並びに白血病を含む種々の癌のような種々の病理学的状態の治療または予防のための化合物の合成における、上記３４）〜５２）および５６）〜５９）の何れか１つに記載の方法により入手、同定、選択または特性化される化合物の使用；
に関する。
【００６５】
本発明は、最初のＡＴＧコドンから残基８１（Ｌ２２Ｍ２）までの配列の逐次的欠失により発生するＨＣＰ１のＮＨ２末端欠失よりなる配列としてミカエリ等（１９９３）により開示されたアミノ酸配列には関係しない。
【００６６】
次に添付の図面について説明する。
図１はヒトＰＤＥ７イソ型の２種、即ちＰＤＥ７Ａ１（ｈ７Ａ１．ＰＲＯと表示）およびＰＤＥ７Ａ２（ｈ７Ａ２．ＰＲＯと表示）、並びにマウスＰＤＥ７Ａ２（ｍｏｕ７Ａ２．ＰＲＯと表示）およびラットＰＤＥ７Ａ１（ｒａｔ７．ａ．ＰＲＯと表示）の蛋白質のアミノ酸配列の間のアライメントを示している。ボックス内に入っていないアミノ酸残基はアミノ酸配列４つにおいて相同ではないアミノ酸を示す。
図２は本発明に従って得られた異なるトランケートされたＰＤＥ７蛋白質の構造を示す。上段はヒトＰＤＥ７Ａ１の完全長イソ型を示す。他の例は種々の試験したトランケート蛋白質を示す。左側に示した数字は完全長ＰＤＥ７Ａ１蛋白質と照合させた蛋白質のＮ末端およびＣ末端のアミノ酸残基を示す。
図３は図２で示した種々のＰＤＥ７トランケート蛋白質を発現するために用いられている組み換えベクターＰｃＤＮＡ４ＨｉｓＭａｘ　Ａを示す。
この図よりわかるとおり、トランケートされたＰＤＥ７蛋白質をコードするＤＮＡインサートは該ベクターのＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ間のクローニング部位に挿入される。
【００６７】
図４は組み換えＣＨＯ細胞系統およびＳｆ２１組み換え細胞系統によるＰＤＥ７Ａ１の発現の結果を示す。
「模倣（ｍｏｃｋｅｄ）ＣＨＯ」とは空の組み換えベクターによりトランスフェクトされているＣＨＯ細胞を示す。
「ＣＨＯｒＰＤＥ７Ａ１」とはヒトＰＤＥ７Ａ１蛋白質をコードするインサートを含むベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を示す。
「Ｓｆ２１ｒＰＤＥ７Ａ１」とはヒトＰＤＥ７Ａ１蛋白質をコードするインサートを含むベクターでトランスフェクトされたＳｆ２１細胞を示す。
「ｒＰＤＥ７Ａ２」とはヒトＰＤＥ７Ａ２蛋白質をコードするインサートを含むベクターでトランスフェクトされた組み換えＣＨＯまたはＳｆ２１細胞を示す。
「ｒＰＤＥ４Ｂ２」とはヒトＰＤＥ４Ｂ２蛋白質をコードするインサートを含むベクターでトランスフェクトされた組み換えＳｆ２１細胞を示す。
各群左側の棒グラフはロリプラムＰＤＥ４阻害剤を用いることなく得られたホスホジエステラーゼ触媒活性を示す。
各群右側の棒グラフはロリプラムＰＤＥ４阻害剤の存在下に得られたホスホジエステラーゼ触媒活性を示す。
【００６８】
図５は、それぞれ、空のベクターで、または、ＰＤＥ４Ｂ２蛋白質、ＰＤＥ７Ａ１蛋白質、至適Ｋｏｚａｋ配列を有するインサートをコードするＰＤＥ７Ａ１またはｃＤＮＡの５′および３′のＵＴＲを有するインサートをコードするＰＤＥ７Ａ１をコードするインサート含むベクターでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を用いて得られたホスホジエステラーゼ触媒活性を示す。
図６は、空のベクター（対照）、ＰＤＥ４Ｂ２蛋白質、完全長ＰＤＥ７Ａ１蛋白質または１３−４８３、３１−４８３、６１−４８３、８１−４８３、１０１−４８３および１７１−４８３トランケート蛋白質（数は完全長ＰＤＥ７Ａ１酵素配列と照合）をコードするベクターによりそれぞれトランスフェクトされた組み換えＣＨＯ細胞により発現されたホスホジエステラーゼ触媒活性を示す。
【００６９】
図７は、空のベクター（対照）、ＰＤＥ４Ｂ２蛋白質、ＰＤＥ７Ａ１完全長蛋白質または１０１−４８３、１２１−４８３、１４１−４８３、１０１−４８３、１０１−４５０、１０１−４２０および１０１−４３０トランケートＰＤＥ７Ａ１ポリペプチド（数は完全長ＰＤＥ７Ａ１酵素配列と照合）をコードするベクターによりそれぞれトランスフェクトされた組み換えＣＨＯ細胞により発現されたホスホジエステラーゼ触媒活性を示す。
図８はＰＤＥ７ノックアウトマウスを作成するために用いることができる相同組み換えのためのターゲティングベクターの構築を示す。
図９はＣＨＯトランスフェクト細胞における組み換えヒトＰＤＥ７Ａ発現のトランケート型のウエスタンブロット分析を示す。
【００７０】
図１０は、種々の濃度におけるフォルスコリンの存在下のＰＤＥ７触媒部位の好ましい実施態様を発現する種々のＥｃｒＣＨＯクローンにおけるβ−ラクタマーゼの発現の用量応答を示す。即ち、完全長ＰＤＥ７Ａのアミノ酸配列１０１−４８３に相当するＰＤＥ７突然変異体（「Ｆｏｒｓ」はフォルスコリンを意味する）である。
図１１は、ＰＤＥ７触媒部位の好ましい実施態様を発現する種々のＥｃｒＣＨＯクローン２０（３００００細胞）（ｎ＝２、即ち実験は２回実施した）におけるβ−ラクタマーゼの発現の測定を示す。即ち、ＰＤＥ阻害剤投与後の完全長ヒトＰＤＥ７Ａ１のアミノ酸配列１０１−４８３に相当するＰＤＥ７突然変異体である。
図１２は、完全長ヒトＰＤＥ７Ａ１の第１のＮ末端１００アミノ酸（Ｎｔｅｒ７Ａ１）をコードする核酸のトランスフェクションを行った場合と行わない場合の完全長ヒトＰＤＥ７Ａ１（Δ１００７Ａ１）のアミノ酸配列１０１−４８３に相当するＰＤＥ７突然変異体をコードする核酸でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞におけるＰＤＥ活性を示す。
【００７１】
図１３は、ＰＤＥ７触媒部位の好ましい実施態様をコードする核酸配列によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（リポフェクタミン）においてＰＤＥ活性を測定したものを示している。即ち、種々の濃度比の完全長ヒトＰＤＥ７Ａ１のアミノ酸配列１０１−４８３および完全長ヒトＰＤＥ７Ａ１の第１のＮ末端１００アミノ酸をコードする核酸配列に相当するＰＤＥ７突然変異体である。
図１４はＰＤＥ７ノックアウトＣ５７ＢＬ／６マウスを作成するために用いることができる相同組み換えのためのターゲティングベクターを示す。
図１５はＰＤＥ７ノックアウト１２９マウスを作成するために用いることができる相同組み換えのためのターゲティングベクターを示す。
【００７２】
【発明の詳述】
本発明はＰＤＥ７の触媒活性を驚くべきことに保持しており、そして、内因性の完全長ＰＤＥ７Ａ１およびＰＤＥ７Ａ２蛋白質の活性よりも高い活性を示す完全長ＰＤＥ７、そして好ましくはＰＤＥ７Ａに由来するポリペプチドを始めて提供する。
より詳しくは、本発明は内因性の完全長ＰＤＥ７Ａ１およびＰＤＥ７Ａ２蛋白質の活性よりも高い活性を驚くべきことに示す完全長ＰＤＥ７、そして好ましくはＰＤＥ７Ａに由来するポリペプチドを始めて提供する。
【００７３】
本発明はまたＰＤＥ７Ａ酵素の触媒部位の局在化を始めて示す。
本発明はまた、完全長ＰＤＥ７酵素の触媒活性を制御または制限すると考えられる、ＰＤＥ７、特にＰＤＥ７Ａにおける調節ドメイン、特に阻害ドメインの存在を始めて同定している。実際、本発明者等はこの調節ドメインの欠失により、得られるトランケートされたＰＤＥ７Ａ酵素の酵素活性が有意に改善されることを明らかにした。
【００７４】
ＰＤＥ７（Ａ）内のこの阻害／調節ドメインの存在を認識することは、この阻害ドメインの影響をブロックするか低減することによりＰＤＥ７（Ａ）の触媒活性を改善できるという可能性をもたらす。特に、本発明は完全長ＰＤＥ７の触媒活性を調節するのに必須であるＰＤＥ７（Ａ）阻害ドメインの一部を含まないＰＤＥ７（Ａ）の突然変異体を包含する。これらの突然変異体は完全長ＰＤＥ７（Ａ）と比較して進歩したＰＤＥ触媒活性を示す。阻害／調節ドメインは完全長ＰＤＥ７（Ａ）のＮ末端に位置すると思われることから、好ましい突然変異体はＰＤＥ７（Ａ）のＮ末端部分において突然変異を含む。より詳しくは、阻害／調節ドメインは完全長ＰＤＥ７（Ａ）蛋白質のアミノ酸３１〜１００の間に含まれると思われる。従って、完全長ＰＤＥ７（Ａ）蛋白質のアミノ酸３１〜１００の間に含まれるいかなる突然変異も野生型または完全長ＰＤＥ７（Ａ）と比較した場合の相当するＰＤＥ７（Ａ）突然変異体の活性の進歩をもたらす。即ち、完全長ＰＤＥ７（Ａ）蛋白質のアミノ酸５７〜１００の間に含まれるアミノ酸から始まり、アミノ酸４５０〜４８３の間に含まれるアミノ酸で終わるＰＤＥ７（Ａ）のＮ末端欠失突然変異体を作成した。これらの突然変異体は相当する完全長ＰＤＥ７（Ａ）の活性の６〜２０倍のＰＤＥ７（Ａ）活性またはＰＤＥ触媒活性を示す。
【００７５】
ＰＤＥ７Ａの一次アミノ酸配列は比較的弱いアミノ酸同一性にもかかわらず、ＰＤＥのＰＤＥ４ファミリーに最も緊密に関連している。実際、ＰＤＥ７ＡおよびＰＤＥ４の間のアミノ酸配列同一性は全体の配列の約２５％である。しかしながら、ＰＤＥ７とＰＤＥ４の間のアミノ酸配列の同一性は最も保存された領域内では約３５％に達する。
【００７６】
ＰＤＥ７Ａはまたビンポセチン、ＳＫＦ９４８３６、ミルリノン、ロリプラムまたはサプリナストを含む他の知られたＰＤＥファミリーの標準的な選択的阻害剤に対するその非感受性も特徴としている。今日まで、ＰＤＥ７Ａの選択的阻害剤は報告されていない。
【００７７】
ＰＤＥ７ＡのｍＲＮＡは種々の組織および免疫細胞に渡って広範に存在しており、そして、ＰＤＥ７酵素活性は高濃度でリンパ球中に検出されているため、ＰＤＥ７Ａは潜在的には数種の疾患に関わっていると考えられる。これらには免疫系に影響する疾患、例えば、ＡＩＤＳ、移植片拒絶反応、自己免疫疾患、例えばＴ細胞関連疾患、例えば慢性関節リューマチ；炎症性疾患、例えば呼吸器炎症性疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息；胃腸炎症性疾患、例えばクローン病、結腸炎、膵臓炎、並びに白血病を含む種々の癌が包含される。
【００７８】
即ち、ＰＤＥ７Ａ酵素活性を阻害する化合物が必要とされる。これらはＰＤＥ７Ａ細胞活性の変動に関わる疾患を予防または治療するために有用であると考えられることから、大きな薬理学的価値を有する。
ホスホジエステラーゼ７活性の価値ある阻害剤化合物の選択には、高度な感受性および高度な選択性を共に有する適切なスクリーニング試験の設計が必要である。
【００７９】
本発明者等は、ＰＤＥ７の阻害剤の高感度スクリーニング試験法は天然のＰＤＥ７Ａ１またはＰＤＥ７Ａ２イソ型で観察される触媒活性よりも高いＰＤＥ７触媒活性を示すポリペプチドを必要とすると考える。明らかに、天然のＰＤＥ７Ａ１またはＰＤＥ７Ａ２イソ型よりも高いＰＤＥ７触媒活性を示すポリペプチドはこれらの酵素の強力な阻害剤を選択するために有用である。
本発明者等はまた、このようなＰＤＥ７酵素阻害剤のスクリーニング方法は、特に選択された化合物が酵素の触媒ドメインと特異的に相互作用することを確認できれば、達成可能であると考える。
【００８０】
従来の技術に撚れば、ＰＤＥ７の触媒ドメインは未知であり、ＰＤＥ７の単なるアミノ酸配列を出発点としては簡単に位置を決定することができない。これは主に、この酵素がＰＤＥ４を含むＰＤＥファミリーの他の構成員に対して弱いアミノ酸相同性を持っているためである。更にまた、Ｃｏｎｔｉ等（１９９５）によれば、ｃＡＭＰ−ＰＤＥ類をコードする種々のｃＤＮＡ類をスクリーニングしたところ、これらのクローンの５′末端における難解な異質性が示された。
【００８１】
本発明者等は、完全長ＰＤＥ７Ａ１およびＰＤＥ７Ａ２蛋白質に由来し、本発明により特性化される触媒ドメインを少なくとも含むポリペプチドは、天然のＰＤＥ７Ａ酵素で観察されるＫｍ値よりも幾分低値のＫｍ値を示し、そして、天然の酵素よりも大きいｃＡＭＰ基質に対する親和性、すなわち、天然の酵素よりも高値のＶｍａｘ基質を有することを発見した。更にまた、本発明者等は、今回、ＰＤＥ７活性を示す新しいポリペプチドを特性化した、これはこの酵素の触媒ドメインを主に含み、そして、ｃＡＭＰ基質に対するＫｍ値は、ＰＤＥ７Ａ１およびＰＤＥ７Ａ２の本来の蛋白質でそれぞれ観察された値は約０．２μＭおよび約０．１２μｍのＫｍ値とは対照的に、約０．０６μＭであった（Ｉｃｈｉｍｕｒａ　Ｍ．ａｎｄ Ｋａｓｅ Ｈ．，１９９３；Ｍｉｃｈａｅｌｉ等、１９９３；Ｂｌｏｏｍ Ｔ．Ｊ．ａｎｄ Ｂｅａｖｏ Ｊ．Ａ．等，１９９６）。
【００８２】
更にまた、本発明によれば、新しく特性化されたポリペプチドは内因性の完全長ＰＤＥ７Ａ１およびＰＤＥ７Ａ２蛋白質で観察される触媒活性よりも少なくとも６倍、好ましくは８倍、より好ましくは１５倍のホスホジエステラーゼ触媒活性を有し、そして、新しく特性化されたポリペプチドの一部は内因性の完全長ＰＤＥ７Ａ１およびＰＤＥ７Ａ２蛋白質で観察される触媒活性約１５〜２０倍のホスホジエステラーゼ触媒活性を有することがわかった。
【００８３】
生物学的関連用語の一般的定義
本発明によれば、当業者の知る従来の分子生物学、微生物学および組み換えＤＮＡ技術を用いる。このような技術は文献に十分記載されている。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等、（１９８９）；Ｇｌｏｖｅｒ，（１９８５）；Ｇａｉｔ，（１９８４）；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８４）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，（１９８６） およびＰｅｒｂａｌ，（１９８４） が参照される。
【００８４】
従って、本明細書においては、以下の用語は以下に記載するとおり定義されるものとする。
「単離された」という用語は本発明の目的のためにはその本来の環境（元々存在していた環境）から取り出された生物学的材料（核酸または蛋白質）を指すものとする。
「単離されたポリペプチドまたは蛋白質」とは、天然の状態において通常それに付随している化合物（例えば他の蛋白質またはポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質）を実質的に含まないものである。
「単離された」とは他の化合物との人工または合成の混合物や生物学的活性を妨害せずそして例えば不完全な精製、安定化剤の添加または製薬上許容しうる製剤への配合等のために存在しても良い不純物の存在を排除するものではない。
例えば、植物または動物に天然の状態で存在するポリヌクレオチドは単離されない。
【００８５】
「精製された」という用語は他の化合物の存在を排除する絶対的な純度を示す形態で物質が存在することを必要としない。これはむしろ相対的な定義である。
ポリヌクレオチドは出発物質または天然物の精製後に少なくとも１桁、好ましくは２または３桁、そして好ましくは４または５桁「精製された」状態にある。
本発明の目的のためには、「ヌクレオチド配列」という表現はポリヌクレオチドまたは核酸の何れかをさすために使用してよい。「ヌクレオチド配列」という表現は遺伝物質そのものを包含し、このため、その配列に関連する情報に限定されない。
【００８６】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」という用語は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは半合成ＤＮＡの配列または一重鎖型または二重らせん、二重鎖型の何れかのヌクレオチド１個より多いＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を包含する。
「ヌクレオチド」という用語は天然のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）並びに（１）プリン類縁体、（２）ピリミジン類縁体、または、（３）糖類縁体のような修飾少なくとも１つを含む修飾ヌクレオチドの双方を指し、このような修飾ヌクレオチドの例は例えばＰＣＴ出願ＷＯ９５／０４０６４に記載されている。
「相同組み換え」とは染色体内へのベクターの外来性ＤＮＡ配列の挿入を指す。好ましくは、ベクターは相同組み換えのための特異的な染色体部位をターゲティングする。特異的相同組み換えのためには、ベクターは染色体内へのベクターの相補結合と取りこみを可能にするために十分長い染色体配列との相同性領域を含む。
【００８７】
本明細書においては、「相同組み換え動物」という用語はある遺伝子を含む動物を記述するものであり、その際その遺伝子は、その遺伝子と、その動物またはその先祖の胚細胞内に導入されたＤＮＡ分子との間の相同組み換えにより修飾されているものとする。即ち、相同組み換え動物は一種のトランスジェニックな動物であり、それは、相同組み換えによりその動物のゲノム内の所定の染色体位置内にトランスジーンが導入されているものである。
【００８８】
「調節領域」または「調節配列」とは核酸の発現を調節する核酸配列を意味する。調節領域は特定の核酸を発現するために本来必要な配列を含んでよく（相同領域）、或いは、異なる起源の配列を含んでもよい（異なる蛋白質の発現に関わるかまたは合成蛋白質）。特に配列は特異的または非特異的な態様で、そして、誘導性または非誘導性の態様である遺伝子の転写を促進または抑制する真核生物またはウィルスの遺伝子の配列または誘導配列であることができる。調節領域は複製起点、ＲＮＡスプライス部位、エンハンサー、転写終止配列、標的細胞の分泌経路にポリペプチドを指向させるシグナル配列およびプロモーターを包含する。
【００８９】
「異種起源」から得られる調節領域は発現された核酸には本来伴わない調節領域である。異種調節領域に含まれるものとしては、異なる種由来の調節領域、異なる遺伝子由来の調節領域、ハイブリッド調節配列、および、天然には存在しないが当業者により設計される調節配列が挙げられる。
【００９０】
「プロモーター配列」とは細胞内でＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３′側）コード配列の転写を開始する事のできるＤＮＡ調節領域である。プロモーター配列中には、転写開始部位（例えばヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングにより好都合に定義される）、並びに、ＲＮＡポリメラーゼの結合に関わる蛋白質結合ドメイン（コンセンサス配列）が存在する。
【００９１】
ポリペプチドは共有結合したアミノ酸残基よりなる重合体物質である。
本発明の「相同」ポリペプチドは、機能的に等価なアミノ酸残基が配列内部で残基を置換している結果保存的なアミノ酸置換がもたらされている変化した配列を含む本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の全てまたは部分を一次アミノ酸配列として含んでいるものを包含するがこれらに限定されない。例えば、配列内部のアミノ酸残基１個以上が、機能的等価物として作用する結果サイレントな変化をもたらす同じ極性の別のアミノ酸により置換されていることができる。配列内部のアミノ酸の置換物としてはそのアミノ酸が属するクラスの他の構成員から選択してよい。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。芳香族環構造を含むアミノ酸はフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンである。極性中性アミノ酸にはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが包含される。陽荷電（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リジンおよびヒスチジンが包含される。陰荷電（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が包含される。このような変化はポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される見かけの分子量や等電点に影響しないと推測される。
【００９２】
特に好ましい置換は：
−　ＬｙｓとＡｒｇの相互であって、陽荷電が維持されるもの；
−　ＧｌｕとＡｓｐの相互であって、陰荷電が維持されるもの；
−　ＳｅｒによるＴｈｒの置換であって、遊離の−ＯＨが維持できるようなもの；
−　ＧｌｎによるＡｓｎの置換であって、遊離のＣＯＮＨ２が維持できるようなもの；
である。
【００９３】
アミノ酸置換はまた、特に好ましい特性でアミノ酸を置換するために導入してもよい。例えば、Ｃｙｓは別のＣｙｓとのジスルフィド結合のための潜在的部位に導入してよい。Ｈｉｓは特に「触媒的な」部位として導入してよい（即ち、Ｈｉｓは酸または塩基として作用することができ、生化学的触媒分解における最も共通したアミノ酸である）。Ｐｒｏは蛋白質構造中にβターンを導入するその特徴的な平面構造により導入してよい。
【００９４】
「ベクター」とは別のＤＮＡセグメントを連結させることにより連結させたセグメントの複製が行なえるようになるプラスミド、ウィルス、ファージ、コスミドまたはバクミドのようなレプリコンである。これは環状または線状のＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり、二重鎖または一重鎖の何れかである。「レプリコン」とはインビボでＤＮＡ複製の自律的単位として機能する、即ち、自らの制御下に複製することが可能な何れかの遺伝子要素（例えばプラスミド、染色体、ウィルス）である。
【００９５】
２種の核酸またはアミノ酸配列間の同一性
「同一性」とは２種のペプチド間、または、２種の核酸分子の間の配列の同一性を指す。配列間の同一性は比較のために整列させた配列の各々における位置を比較することにより調べることができる。比較する配列内の位置が同じ塩基またはアミノ酸で占有されている場合は、配列はその位置において同一である。核酸配列間の同一性の程度はこれらの配列により共有される位置における同一のヌクレオチドの数の関数である。アミノ酸配列間の同一性の程度はこれらの配列により共有される位置における同一のアミノ酸の数の関数である。２種のポリヌクレオチドが各々、（１）２種のポリヌクレオチドの間で同じ配列（即ち完全なポリヌクレオチド配列の一部）を有し、そして、（２）更に２種のポリヌクレオチド間で多様である配列を有するため、２種（またはこれ以上）のポリヌクレオチドの間の配列比較は典型的には、局所的領域の配列の同様性を同定して比較するための「比較ウインドウ」全体に渡り２種のポリヌクレオチドの配列を比較することにより行なわれる。「比較ウインドウ」とは、ポリヌクレオチド配列を少なくとも２０個の近隣ヌクレオチドの比較対照配列と比較し、そして、２つの配列の至適アライメントについて、比較ウインドウ内のポリヌクレオチド配列の部分が、比較対照配列（これは付加や欠失は含まない）と比べた場合に２０％以下の付加または欠失（即ちギャップ）を含む、少なくとも２０個の近隣ヌクレオチドの位置の概念的セグメントを指す。比較ウインドウを決定するための配列の至適アライメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによるか、Ｎｅｅｄｌｅｎａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７２）の相同性アライメントアルゴリズムによるか、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）の同様性検索方法によるか、これらのアルゴリズムのコンピューター操作（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０のＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５，Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｄｒ．Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗ１）によるか、または、目視検討により行なってよい。種々の方法により得られた最良のアライメント（即ち比較ウインドウ全体に渡り最も高い比率の同一性を与えるもの）を選択する。「配列同一性」という用語は比較ウインドウ全体に渡り２種のポリヌクレオチド配列が同一（即ちヌクレオチド−ヌクレオチド基準で同一）であることを意味する。
特段の記載が無い限り、ポリペプチド中のアミノ酸の位置はヒト完全長ＰＤＥ７Ａ１との照合において記載するものとする。
【００９６】
本発明のポリペプチドおよび核酸
本発明の新しく特性化されたポリペプチドの高いｃＡＭＰ親和性および高いホスホジエステラーゼ触媒活性、並びに、ＰＤＥ７Ａ酵素の少なくとも触媒ドメインをそれらが有するという事実を考慮すると、本発明のポリペプチドは今回、ＰＤＥ７Ａ阻害剤のスクリーニングのための高感受性かつ高選択性の方法の設計を可能とする。
本明細書において、触媒ドメインまたは部位とは、完全長ＰＤＥ７酵素のＰＤＥ活性と比較した場合に増大しているＰＤＥ活性を得るために必要な最小限のフラグメントを指すものとする。
【００９７】
後に記載する実施例において示すアミノ酸欠失実験を介して、本発明者等はヒトＰＤＥ７Ａ１アミノ酸配列の６１位または８１において始まり、４８３位において終わる配列よりなるポリペプチドが、内因性ＰＤＥ７Ａ１またはＰＤＥ７Ａ２完全長蛋白質のホスホジエステラーゼ触媒活性と比較してそれぞれ８倍または９倍増大したホスホジエステラーゼ触媒活性を有することを明らかにした。更にまた、本発明者等は、更に増大したホスホジエステラーゼ触媒活性がより短いポリペプチドで観察されることを明らかにした。例えば、ヒトＰＤＥ７Ａ１のアミノ酸配列の１０１位で始まり４５０位で終わるアミノ酸配列よりなるポリペプチドは内因性ＰＤＥ７Ａ１またはＰＤＥ７Ａ２完全長蛋白質の触媒活性よりも約１５倍高値のホスホジエステラーゼ触媒活性を示した。
本明細書においては、内因性ＰＤＥ７Ａ１またはＰＤＥ７Ａ２という用語は哺乳類細胞内で自然に発現されるＰＤＥ７Ａ１またはＰＤＥ７Ａ２を意味するものとする。
【００９８】
ポリペプチド
結果的に、本発明の第１の目的はホスホジエステラーゼ７触媒ドメインを保有し、そして、配列番号１のアミノ酸配列の連続するアミノ酸少なくとも３１２個を有する、約４２７アミノ酸長までのポリペプチド、またはその相同ポリペプチドである。
ヒトＰＤＥ７Ａ１またはＰＤＥ７Ａ２アミノ酸配列とマウスおよびラットをそれぞれ起源とするＰＤＥ７アミノ酸配列との間のアミノ酸配列アライメントはヒトとマウスまたはラットの配列の間に高いアミノ酸同一性があることを示した。より厳密には、ヒトＰＤＥ７Ａ１の５７位のアミノ酸と４８３位のアミノ酸の間には、相当するマウスＰＤＥ７Ａ２アミノ酸配列に対して９３．７％のアミノ酸同一性、そして、ラットＰＤＥ７Ａ１アミノ酸配列に対しては９４．１％のアミノ酸同一性が観察されている。
【００９９】
従ってＰＤＥ７Ａのマウスおよびラットアミノ酸配列からそれぞれ誘導され、そして配列番号１のヒト配列と高いアミノ酸同一性を共有するアミノ酸配列はまた、マウスまたはラットＰＤＥ７酵素の触媒ドメインを有する。
マウスＰＤＥ７Ａ２配列より誘導され、配列番号１のヒト配列と整列させたマウスアミノ酸配列を配列番号２のアミノ酸配列と称する。
ラットＰＤＥ７Ａ１配列より誘導され、配列番号１のヒト配列と整列させたラットアミノ酸配列を配列番号３のアミノ酸配列と称する。
【０１００】
本発明の別の目的は、ホスホジエステラーゼ７触媒ドメインを保有し、そして配列番号２または３のアミノ酸配列よりなる群から選択される配列の連続するアミノ酸少なくとも３１２個を有する、約４２７アミノ酸長までのポリペプチド、またはその相同ポリペプチドよりなる。
【０１０１】
本発明の目的のためには、「相同ポリペプチド」とは、上記配列番号１、２または３のアミノ酸配列に関し、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは９０または９５％のアミノ酸の同一性を有するポリペプチドを包含するものとする。本発明の相同ポリペプチドのアミノ酸残基の変化は、比較対照ポリペプチドに関して、１つのアミノ酸の、１、２、３、４、５、１０〜２０の置換、付加または欠失の範囲内でのアミノ酸の変化よりなる。
【０１０２】
全ての場合において「相同ポリペプチド」は配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドについて測定したホスホジエステラーゼ触媒活性と少なくとも同じ桁数のＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ触媒活性を示す。言いかえれば、本発明の「相同ポリペプチド」は内因性完全長ヒトＰＤＥ７Ａ１またはＰＤＥ７Ａ２蛋白質で観察される触媒活性の好ましくは少なくとも６倍、最も好ましくは少なくとも８倍のホスホジエステラーゼ活性を有する。
【０１０３】
本発明に含まれるポリペプチドの何れのホスホジエステラーゼ触媒活性も、後に記載する実施例中のホスホジエステラーゼ試験法等を用いて当業者により測定される。
【０１０４】
本発明の「相同ポリペプチド」の特定の実施態様は蛋白質分解に耐性であるポリペプチド分子、−ＣＯＮＨ−ペプチド結合が修飾され、（ＣＨ２ＮＨ）還元結合、（ＮＨＣＯ）レトロ逆結合、（ＣＨ２Ｏ）メチレンオキシ結合、（ＣＨ２Ｓ）チオメチレン結合、（ＣＨ２ＣＨ２）炭素結合、（ＣＯ−ＣＨ２）ケトメチレン結合、（ＣＨＯＨ−ＣＨ２）ヒドロキシエチレン結合、（Ｎ−Ｎ）結合および−ＣＨ＝ＣＨ−結合で置きかえられているペプチドを包含する。
【０１０５】
本発明の別の目的は、配列番号１、２または３の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４位に位置するアミノ酸残基から始まり、
配列番号１、２または３の３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７位に位置するアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する前述のポリペプチド、またはその相同ポリペプチドである。
【０１０６】
本発明の好ましいポリペプチドは：
配列番号１、２または３の５位のアミノ酸残基で始まり、４２７位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその相同ポリペプチド；
配列番号１、２または３の２５位のアミノ酸残基で始まり、４２７位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する請求項３記載のポリペプチド；またはその相同ポリペプチド；
配列番号１、２または３の４５位のアミノ酸残基で始まり、４２７位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する請求項３記載のポリペプチド、またはその相同ポリペプチド；
配列番号１、２または３の４５位のアミノ酸残基で始まり、３９４位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する請求項３記載のポリペプチド、またはその相同ポリペプチド；
である。
【０１０７】
本発明の最も好ましいポリペプチドは：
配列番号１、２または３の４５位のアミノ酸残基で始まり、４２７位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する請求項３記載のポリペプチド、またはその相同ポリペプチド；
配列番号１、２または３の４５位のアミノ酸残基で始まり、３９４位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する請求項３記載のポリペプチド、またはその相同ポリペプチド；
である。
本発明によれば、配列番号１のアミノ酸配列から誘導したポリペプチド４５−４２７および４５−３９４は、内因性完全長ＰＤＥ７Ａ１またはＰＤＥ７Ａ２蛋白質よりも約１５倍高値のホスホジエステラーゼ触媒活性を示すことがわかっている。
【０１０８】
核酸
本発明の更に別の目的は、ホスホジエステラーゼ７触媒ドメインを保有し、そして、配列番号１、２または３のアミノ酸配列よりなる群から選択される配列の連続するアミノ酸少なくとも３１２個を有する、約４２７アミノ酸長までのポリペプチド；またはその相同ポリペプチドをコードする核酸配列である。
【０１０９】
以下の好ましい核酸：
−　配列番号１、２または３の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４位に位置するアミノ酸残基から始まり、
配列番号１、２または３の３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７位に位置するアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する前述のポリペプチド、またはその相同ポリペプチドをコードする核酸；
【０１１０】
配列番号１、２または３の５位のアミノ酸残基で始まり、４２７位のアミノ酸残基で終わるポリペプチドまたはその相同ポリペプチドをコードする核酸およびそれに相補的な核酸配列；
配列番号１、２または３の２５位のアミノ酸残基で始まり、４２７位のアミノ酸残基で終わるポリペプチドまたはその相同ポリペプチドをコードする核酸およびそれに相補的な核酸配列；
配列番号１、２または３の４５位のアミノ酸残基で始まり、４２７位のアミノ酸残基で終わるポリペプチドまたはその相同ポリペプチドをコードする核酸およびそれに相補的な核酸配列；
配列番号１、２または３の４５位のアミノ酸残基で始まり、３９４位のアミノ酸残基で終わるポリペプチドまたはその相同ポリペプチドをコードする核酸およびそれに相補的な核酸配列；
が本発明に包含される。
【０１１１】
第１の好ましい実施態様において、核酸配列は配列番号１のヒトポリペプチドをコードする配列番号４のもの、またはそれに相補的な核酸配列番号である。
第２の好ましい実施態様において、核酸配列は配列番号２のマウスポリペプチドをコードする配列番号５もの、またはそれに相補的な核酸配列番号である。
第３の好ましい実施態様において、核酸配列は配列番号３のラットポリペプチドをコードする配列番号６のもの、またはそれに相補的な核酸配列番号である。
好ましくは、本発明のポリペプチドおよび核酸配列の何れも、単離された、および／または精製された形態にある。
【０１１２】
ベクター
発現ベクター
本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は適切な発現ベクター、即ち、挿入された蛋白質コード配列の転写および翻訳のための必要な要素を含むベクターに挿入することができる。このような要素は本明細書では「プロモーター」と称する。即ち、本発明のポリペプチドをコードする核酸は本発明の発現ベクター内のプロモーターに作動可能に連結されている。ｃＤＮＡおよびゲノム配列の何れもクローニングして、このような調節配列の制御下に発現させることができる。発現ベクターはまた好ましくは複製起点を含む。
必要な転写および翻訳のシグナルを組み換え発現ベクター上に与えることができる。
【０１１３】
第１の実施態様において、本発明の組み換えベクターを用いて前記したポリペプチドを発現させ、次にそれを精製する。
別の実施態様において、発現ベクターを用いてトランスジェニックな動物を構築する。好ましいベクターは触媒ドメインの部分のみを含むかこれをまったく含まない、そして、欠失した核酸部分が異種のポリヌクレオチド配列により起きかえられている、ＰＤＥ７ホスホジエステラーゼをコードするゲノムポリヌクレオチドを有する核酸配列を含むものである。
【０１１４】
本発明の配列を発現するために用いることができる潜在的な宿主／ベクター系としては、例えば、ウィルス（例えばワクシニアウィルス、アデノウィルス等）を感染させた哺乳類細胞系；　ウィルス（例えばバキュロウィルス）を感染させた昆虫細胞系；酵母ベクターを含む酵母のような微生物；またはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡで形質転換した細菌が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターの発現要素はその強度および特異性が異なる。使用する宿主／ベクター系に応じて、数多くの適当な転写および翻訳要素の何れか１つを用いてよい。
【０１１５】
本発明の組み換えポリペプチドまたはその相同ポリペプチドは組み換えによりコード配列を組み込んだ後に染色体で発現させてよい。この点に関し、多くの増幅系の何れかを用いて高濃度の安定な遺伝子発現を達成してよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９参照）。
クローニングベクター内へのＤＮＡフラグメントの挿入のための記載した方法の何れかを用いて、適切な転写／翻訳制御シグナルおよび蛋白質コード配列よりなる遺伝子を含む発現ベクターを構築してよい。これらの方法はインビトロの組み換えＤＮＡおよび合成方法およびインビボの組み換え（遺伝子組み換え）を包含する。
【０１１６】
ａ）プロモーター
本発明のポリペプチドの発現は当該分野で知られた如何なるプロモーター／エンハンサー要素により制御してもよいが、これらの調節要素は発現のために選択された宿主において機能可能でなければならない。本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の発現を制御するために使用してよいプロモーターとしては、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１）、ラウス肉腫ウィルスの３′ＬＴＲ中に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ等、１９８０）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ等、１９８１）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ等、１９８２）；原核生物発現ベクター、例えばβ−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｕｍａｒｏｆｆ等、１９７８）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ等、１９８３）；参考文献“Ｕｓｅｆｕｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ”， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ，１９８０，２４２：７４−９４記載のもの；Ｇａｌ４プロモーターのような酵母または他のカビ類由来のプロモーター要素、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター；および組織特異性を示しトランスジェニック動物において利用されている動物転写制御領域が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の好ましいプロモーターは誘導性プロモーターである。本発明の最も好ましいプロモーターはポナステロンのようなインデューサーにより誘導可能なプロモーターである。
【０１１７】
ｂ）宿主発現ベクター
広範な種類の宿主／発現ベクター組み合わせを本発明の核酸の発現において用いてよい。適当なベクターには知られた細菌プラスミドの誘導物が包含され、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉプラスミドｃｏｌ ＥＩ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌＣ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈ等、１９８８）、ｐＭＢ９およびその誘導物、ＰＲ４のようなプラスミド；ファージＤＮＡ、例えば、ファージＩの多くの誘導物、例えばＭＮ９８９、および他のファージＤＮＡ、例えばＭ１３およびフィラメント状一重鎖ファージＤＮＡ；２ｍプラスミドまたはその誘導物のような酵母プラスミド；真核細胞で有用なベクター、例えば昆虫または哺乳類細胞で有用なベクター；プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせから誘導されたベクター、例えばファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を用いるように修飾されているプラスミド等が挙げられる。
【０１１８】
本発明の好ましい宿主発現ベクター組み合わせはｐＧＥＸとＰＢＲ３２２である。
特定の組み換えＤＮＡ分子を同定して単離した後、当該分野で知られている数種類の方法を用いてこれを増幅してよい。適当な宿主系および生育条件が確立された後、組み換え発現ベクターを増幅し、定量的に調製する。
【０１１９】
ベクターを当該分野で知られた方法、例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈降、リポフェクション（リソゾーム融合）、遺伝子銃の使用またはＤＮＡベクタートランスポーター等により所望の宿主細胞に導入する（例えばＷｕ等、１９９２；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９８８；Ｈａｒｔｍｕｔ等、１９９０年３月１５日出願のカナダ特許出願２，０１２，３１１号参照）。
【０１２０】
外因性または異種のＤＮＡが細胞内に導入されると、細胞はこのようなＤＮＡにより「トランスフェクト」されている。トランスフェクトされたＤＮＡが表現型の変化を起こした場合に、外因性または異種のＤＮＡにより細胞は「形質転換」されている。好ましくは形質転換ＤＮＡは細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡ内に組み込まれる（共有結合される）。
【０１２１】
ｃ）バキュロウィルス発現系
発現系はまた本発明の関連においてバキュロウィルスも包含する。
例えば、バキュロウィルス発現系において、非融合転移ベクター、例えばｐＶＬ９４１（ＢａｍＨＩクローニング部位；Ｓｕｍｍｅｒｓ）、ｐＶＬ１３９３（ＢａｍＨＩ，ＳｍａＩ，ＸｂａＩ，ＥｃｏＲＩ，ＮｏｔＩ， ＸｍａＩＩＩ，ＢｇｌＩＩおよびＰｓｔＩクローニング部位；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＶＬ１３９２（ＢｇｌＩＩ，ＰｓｔＩ，ＮｏｔＩ，ＸｍａＩＩＩ，ＥｃｏＲＩ，ＸｂａＩ，ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩクローニング部位；ＳｕｍｍｅｒｓおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ＢａｍＨＩ，ＢｇｌＩＩ，ＰｓｔＩ，ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位でブルー／ホワイト組み換えスクリーニングが可能なもの；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、並びに、融合転移ベクター、例えばｐＡｃ７００（ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩクローニング部位、ここでＢａｍＨＩ認識部位は開始コドンから始まる；Ｓｕｍｍｅｒｓ）、ｐＡｃ７０１およびｐＡｃ７０２（ｐＡｃ７００と同様であるが読み枠が異なる）、ｐＡｃ３６０（ポリへドリン開始コドンの３６塩基対下流のＢａｍＨＩクローニング部位；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（１９５））およびｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（３種の読み枠、ＢａｍＨＩ，ＢｇｌＩＩ，ＰｓｔＩ，ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、ＰｒｏＢｏｎｄ精製用のＮ末端ペプチドおよびプラークのブルー／ホワイト組み換え体スクリーニング；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（２２０））の両方を使用できる。
【０１２２】
本発明のバキュロウィルス発現系における好ましい転移ベクターはＢａｃｋＰａｋ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃである。
本発明の配列を発現するための組み換え転移ベクターの別の好ましい種類はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来のＳＦ９細胞系統（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ １７１１）をトランスフェクトするために使用してよいｐＶＬ１３９２／１３９３バキュロウィルス転移ベクター（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）のようなバキュロウィルスベクターよりなる。
本発明の最も好ましいバキュロウィルス組み換え発現ベクターはＳｆ２１細胞系統をトランスフェクトするために使用してよいＡｃＭＮＰＶベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）よりなる（Ｃａｗｌｅｙ Ｐ．等、１９７７）。
バキュロウィルス発現系における本発明のポリペプチドの発現のための別の適当なベクターはＣＨＡＩ等（１９９３）、ＶＬＡＳＡＫ（１９８３）およびＬＥＮＨＡＲＤ等（１９９６）に記載されたものである。
【０１２３】
ｄ）哺乳類発現系
本発明において使用するために挙げられる哺乳類発現ベクターには、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）プロモーターのような誘導性プロモーターを有するベクター、例えばＤＨＦＲ発現ベクターを有する何れかの発現ベクター、またはＤＨＦＲ／メトトレキセート同時増幅ベクター、例えばｐＥＤ（ＰｓｔＩ，ＳａｌＩ，ＳｂａＩ，ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩクローニング部位、クローニングされた遺伝子とＤＨＦＲの両方を発現するベクター（Ｋａｕｆｍａｎ等、１９９１）が包含される。或いは、グルタミン合成酵素／メチオニンスルホキシミン同時増幅ベクター、例えばｐＥＥ１４（ＨｉｎｄＩＩＩ，ＸｂａＩ，ＳｍａＩ，ＳｂａＩ，ＥｃｏＲＩおよびＢｃｌＩクローニング部位、ここでベクターはグルタミン合成酵素とクローニングされた遺伝子を発現する）を用いることもできる。別の実施態様において、エプスタイン・バーウィルス（ＥＢＶ）の制御下のエピソーム発現を指向するベクターも使用でき、例えば、ｐＲＥＰ４（ＢａｎＨＩ，ＳｆｉＩ，ＸｈｏＩ，ＮｏｔＩ，ＮｈｅＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＮｈｅＩ，ＰｖｕＩＩおよびＫｐｎＩクローニング部位、構成的ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ハイグロマイシン選択性マーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４（ＢａｍＨＩ，ＳｆｉＩ，Ｘｈｏｌ，ＮｏｔＩ，ＮｈｅＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＮｈｅＩ，ＰｖｕＩＩおよびＫｐｎＩクローニング部位、構成的ｈＣＭＶ前初期遺伝子、ハイグロマイシン選択性マーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＥＰ４（ＫｐｎＩ，ＰｖｕＩ，ＮｈｅＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＮｏｔＩ，ＸｈｏＩ，ＳｆｉＩ，ＢａｎＨＩクローニング部位、誘導性メタロチオネインＩＩａ遺伝子プロモーター、ハイグロマイシン選択性マーカー：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ８（ＢａｍＨＩ，ＸｈｏＩ，ＮｏｔＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＮｈｅＩおよびＫｐｎＩクローニング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ヒスチジノール選択性マーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ９（ＫｐｎＩ，　ＮｈｅＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＮｏｔＩ，ＸｈｏＩ，ＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩクローニング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、Ｇ４１８選択性マーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＥＢＶＨｉｓ（ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ハイグロマイシン選択性マーカー、Ｎ末端ペプチドはＰｒｏＢｏｎｄ樹脂精製可能であり、エンテロキナーゼにより切断される；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。本発明において使用するための選択可能な哺乳類発現ベクターにはｐＲｃ／ＣＭＶ　（ＨｉｎｄＩＩＩ，　ＢｓｔＸＩ，　ＮｏｔＩ，　ＳｂａＩおよびＡｐａＩクローニング部位、Ｇ４１８選択；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲｃ／ＲＳＶ（ＨｉｎｄＩＩＩ，ＳｐｅＩ，ＢｓｔＸＩ，ＮｏｔＩ，Ｘｂａｌクローニング部位、Ｇ４１８選択；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）その他が包含される。本発明により使用するためのワクシニアウィルス哺乳類発現ベクター（Ｋａｕｆｍａｎ，１９９１参照、前出）には例えばｐＳＣ１１（Ｓｍａｌクローニング部位、ＴＫ−およびβ−ｇａｌ選択）、ｐＭＪ６０１（ＳａｌＩ，ＳｍａＩ，ＡｆｌＩ，ＮａｒＩ，ＢｓｐＭＩＩ，ＢａｍＨＩ，ＡｐａＩ，ＮｈｅＩ，ＳａｃＩＩ，ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位；ＴＫ−およびβ−ｇａｌ選択）、および、ｐＴＫｇｐｔＦ１Ｓ（ＥｃｏＲＩ，ＰｓｔＩ，ＳａｌＩ，ＡｃｃＩ，ＨｉｎｄＩＩ，ＳｂａＩ，ＢａｍＨＩおよびＨｐａクローニング部位、ＴＫまたはＸＰＲＴ選択）が包含される。
好ましい哺乳類発現ベクターはｐＩＮＤ、ｐｃＤＮＡ３、ＰｃＤＮＡ４ＨｉｓＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄである。
【０１２４】
ｅ）酵母発現系
酵母発現系もまたＡＢＣ１ポリペプチドを発現するために本発明により使用できる。例えば、非融合ｐＹＥＳ２ベクター（Ｘｂａｌ，ＳｐｈＩ，ＳｈｏＩ，ＮｏｔＩ，ＧｓｔＸＩ，ＥｃｏＲＩ，ＢｓｔＸＩ，ＢａｍＨＩ，ＳａｃＩ，Ｋｐｎ１およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ，Ｂ，Ｃ（ＸｂａＩ，ＳｐｈＩ，ＳｈｏＩ，ＮｏｔＩ，ＢｓｔＸＩ，ＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩ，ＳａｃＩ，ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、Ｎ末端ペプチドはＰｒｏＢｏｎｄ樹脂精製可能であり、エンテロキナーゼにより切断される；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を僅か２種の例として挙げたが、これらは本発明により使用することができる。
本発明の他の好ましい組み換えベクターは当業者のよく知る哺乳類において機能可能な発現ベクターを包含する。
【０１２５】
相同組み換えベクター
ノックアウト動物
ＰＤＥ７酵素の触媒ドメインの本発明による決定により、今回、ＰＤＥ７酵素の触媒ドメインをコードする部分またはその一部が欠失しているポリヌクレオチド構築物の設計が可能になる。
好ましい実施態様において、上記定義したポリヌクレオチド構築物は非機能性触媒ドメインを有するＰＤＥ７をコードし、欠失した核酸部分が異種ポリヌクレオチド配列により置き換えられている、ゲノムポリヌクレオチドを含んでいる。
該構築物は、相同組み換えにより哺乳類のゲノム内部に天然に存在するＰＤＥ７配列の部分を置きかえるために、ベクター内に含まれていてよい。
この特定の実施態様によれば、このような本発明の組み換えベクターを用いてトランスジェニックなノックアウト動物、好ましくはトランスジェニックなノックアウト哺乳類、最も好ましくはトランスジェニックなノックアウトマウスおよびラットを作成してよい。該トランスジェニックなノックアウト哺乳類は触媒ドメインよりも大きい核酸部分の相同組み換えによる欠失を介して作成されたトランスジェニックなノックアウト哺乳類よりも、薬物の作用の良好なモデルを与える。
【０１２６】
ヒト、マウスまたはラットのＰＤＥ７蛋白質をコードするゲノムポリヌクレオチドを単離するためには、当業者の知るとおり、以下のもの：
−　参照番号Ｌ１２０５２のもとにＧｅｎＢａｎｋ／ＥＢＩデータベース中に開示されているヒトＰＤＥ７Ａ１の配列；
−　参照番号Ｕ６７９３２のもとにＧｅｎＢａｎｋ／ＥＢＩデータベース中に開示されているヒトＰＤＥ７Ａ２の配列；
−　参照番号Ｕ６８１７１のもとにＧｅｎＢａｎｋ／ＥＢＩデータベース中に開示されているマウスＰＤＥ７Ａ２の配列；
−　参照番号ＡＪ２５１８６０のもとにＧｅｎＢａｎｋ／ＥＢＩデータベース中に開示されているマウスＰＤＥ７ＡＢの配列；および、
−　参照番号Ｕ７７８８０のもとにＧｅｎＢａｎｋ／ＥＢＩデータベース中に開示されているラットＰＤＥ７Ａ１の配列；
をそれぞれ挙げることができる。
【０１２７】
上記核酸の第１の実施態様において、ゲノムポリヌクレオチドは、触媒ドメインまたはその一部が欠失しているヒト、マウスまたはラットＰＤＥ７をコードする。
上記核酸の第２の実施態様において、異種ポリヌクレオチドは選択マーカーを有する。
上記核酸の第３の実施態様において、異種ポリヌクレオチドはその５′末端に少なくともｌｏｘＰ配列およびその３′末端に少なくともｌｏｘＰ配列を有する。ｌｏｘＰ配列は８ｂｐの保存された配列により分断された１３ｂｐの２つの回文配列を有する（ＨＯＥＳＳ等、１９８６）。
【０１２８】
同一の方向を有する２つのｌｏｘＰ部位の間のＣｒｅ酵素による組み換えにより、ＤＮＡフラグメントの欠失が起こる。相同組み換え法と組み合わせて用いるＣｒｅ−ｌｏｘＰ系はＧＵ等（１９９３，１９９４）により記載されている。
触媒ドメインをコードする配列またはその一部を欠失しているゲノムＰＤＥ７配列を有するベクターは、同じ方向のｌｏｘＰ部位により選択マーカーが隣接するような方法で設計する。Ｃｒｅ酵素により処理により、選択性マーカーを排除しつつ、相同組み換え事象により挿入されている目的のＰＤＥ７ゲノムポリヌクレオチドを移動させることが可能である。
【０１２９】
２種の選択性マーカー、即ち、組み換え事象を選択するために陽性選択マーカーおよび相同組み換え事象を選択するための陰性選択マーカーが必要である。
Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を用いるベクターおよび方法はＺＯＵ等（１９９４）により記載されている。
触媒ドメインをコードする核酸部分またはその一部が欠失しているマウスＰＤＥ７ホスホジエステラーゼをコードするゲノムポリヌクレオチドを該核酸が有する本発明の核酸の特定の実施態様においては、当業者は後に記載する実施例を好都合に参照してよい。
【０１３０】
本発明の「相同組み換えベクター」の構築例を図８に示す。
本発明の更に別の特徴において、上記定義したポリペプチドをコードする核酸は調節配列に作動可能に連結している。
好ましくは、調節配列は誘導性プロモーターよりなる。
より好ましくは、調節配列はポナステロンのようなインデューサーにより誘導可能なプロモーターよりなる。
【０１３１】
その他の種類の相同組み換え動物
相同組み換え動物の別の種類は、修飾されていないＰＤＥ７酵素をコードし、そして本発明のポリペプチドをコードするトランスジーンが相同組み換えにより付加されている遺伝子を含む動物である。即ち、該相同組み換え動物において、ＰＤＥ７酵素が過剰発現される。
【０１３２】
宿主細胞
本発明の別の目的は上記した組み換えベクターの１つにより形質転換またはトランスフェクトされている本発明の核酸により形質転換またはトランスフェクトさている宿主細胞よりなる。
即ち、第１の実施態様において、本発明の組み換え宿主細胞は、ホスホジエステラーゼ７触媒ドメインを保有し、そして、配列番号１、２または３のアミノ酸配列よりなる群から選択される配列の連続するアミノ酸少なくとも３１２個を有する、約４２７アミノ酸長までのポリペプチド；またはその相同ポリペプチドをコードする核酸を有する。
【０１３３】
第２の実施態様において、本発明の組み換え宿主細胞は、機能的触媒ドメインを含まないＰＤＥ７をコードし、欠失した核酸部分が異種ポリヌクレオチド配列により置き換えられている、ゲノムポリヌクレオチドを有する核酸配列を有する。
本発明に記載したもののような組み換えベクターで形質転換（原核細胞）された、またはトランスフェクト（真核細胞）された宿主細胞が包含される。
【０１３４】
本発明の発現ベクターのレシピエントとして使用する好ましい宿主細胞は：
ａ）原核生物宿主細胞：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ菌株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ １７１１）、Ｓｆ２１細胞（Ｃａｗｌｅｙ Ｐ．等、１９７７）；ｂ）真核生物宿主細胞：Ｈｅｌａ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ２）、ＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ １６５０；Ｎｏ．ＣＲＬ １６５１）またはＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ−６１）；
である。
【０１３５】
本発明のホスホジエステラーゼ触媒活性を有するポリペプチドの発現のために用いられる最も好ましい細胞系統は二量体エクジソン受容体を発現するＣＨＯ細胞系統よりなる（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）。
【０１３６】
機能的触媒ドメインを含まないＰＤＥ７をコードし、欠失した核酸部分が異種ポリヌクレオチド配列により置き換えられている、ゲノムポリヌクレオチドを有する核酸配列を含む相同組み換えベクターを用いて宿主細胞のトランスフェクションを行なう場合は、使用してよい好ましい宿主細胞は、哺乳類の接合体、例えばネズミまたはラットの接合体、例えばＢＲＩＮＳＴＥＲ等（１９８５）の記載するものである。
【０１３７】
ベクターはＣａｐｅｃｃｈｉ等（１９９１）の記載するもののような胚、胎仔または成体の多能性幹細胞に取りこむことができる。胚性幹細胞はインビトロで培養されている胚盤胞または分割球から単離することができ、そして多くの細胞世代に渡り安定して、即ち分化を行なうことなく、保持することができる。外来性のＤＮＡはエレクトロポレーションにより胚性幹細胞内に取りこむことができる。所望の外来性ＤＮＡを保有する幹細胞を選択した後、これを胚盤胞の内細胞塊内に注入する。
【０１３８】
本発明による好ましいＥＳ細胞系統はＥＳ−Ｅ１４　ＴＧ２ａ（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ−１８２１）、ＥＳ−Ｄ３（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ　１９３４およびＮｏ．ＣＲＬ−１１６３２）、ＴＳ００１（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ−１１７７６）、３６．５（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ−１１１１６）である。未介入状態にＥＳ細胞を維持するためには、この胚性表現型を温存するような適切なシグナルを与え、ＥＳ細胞付着のためのマトリックスとなるような生育抑制支持細胞の存在下にこれらを培養する。好ましい支持細胞はＡｂｂｏｎｄａｎｚｏ等（１９９３）により記載されているもののような培地中に維持された実質的に如何なるマウス系統の１３日〜１４日齢の胚の組織から樹立された、またはＰＥＡＳＥおよびＷＩＬＬＩＡＭＳ（１９９０）に記載されているもののようなＬＩＦの抑制濃度の存在下における、一次胚性線維芽細胞よりなるものであってよい。
【０１３９】
ＰＤＥ７活性を阻害する化合物を選択するための方法／過程
本発明の新しいポリペプチドはＰＤＥ７酵素活性を阻害する化合物をスクリーニングまたは選択するための方法に含められる強力な手段を与える。
即ち、本発明の更に別の目的は、ＰＤＥ７活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニングのための第１の方法であって、該方法は下記工程：
ａ）ＰＤＥ７酵素の触媒ドメインを少なくとも有する本発明のポリペプチドの所望の量を準備すること；
ｂ）工程ａ）において準備したポリペプチドの所望の量を試験すべき候補化合物の所望の量を含有する緩衝溶液に添加すること；
ｃ）ホスホジエステラーゼ酵素活性を測定すること；および、
ｄ）工程ｃ）で得られた測定値酵素活性を候補化合物の非存在下に得られた酵素活性と比較すること；
を包含する上記方法よりなる。
【０１４０】
上記したスクリーニングの第１の方法の好ましい実施態様において、工程ａ）で添加したポリペプチドは、配列番号１の４５位のアミノ酸残基で始まり、４２７位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列、またはその相同ポリペプチドよりなる。
【０１４１】
好ましくは、ＰＤＥ７蛋白質触媒ドメインを少なくとも有する本発明のポリペプチドは上記したように組み換え宿主細胞により、最も好ましくは組み換えＣＨＯ細胞系統によるか、または、Ｓｆ９およびＳｆ２１細胞系統のようなＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａに由来する細胞系統により組み換え生産される。
【０１４２】
最も好ましくは、上記したスクリーニングにおいて使用される本発明のポリペプチドは、該ポリペプチドを発現する組み換え宿主細胞の細胞溶解物に由来する。細胞溶解物は例えば培養した組み換え宿主の超音波処理により得てよい。
【０１４３】
本発明のポリペプチドは更に、例えば、当業者の知る逆相および／またはカチオン交換ＨＰＬＣのような高速液体クロマトグラフィーにより精製してよい。
或いは、上記したスクリーニング方法を実施するために用いる本発明のポリペプチドは、均質な溶液中または固相中のいずれかの化学合成の従来法により調製してもよい。
【０１４４】
このような化学的ポリペプチド合成法の例示される実施態様としては、ＨＯＵＢＥＮ　ＷＥＹＬ（１９７４）により記載された均質溶液法を参照できる。該ポリペプチドはまたＭＥＲＲＩＦＩＥＬＤ（１９６５ａ；１９６５ｂ）により記載された固相合成法に従って調製してもよい。
上記したスクリーニング法に従って、ホスホジエステラーゼ活性の程度をＰＤＥ７のｃＡＭＰ基質の加水分解の測定により調べる。
【０１４５】
好ましくは、上記スクリーニング方法の工程ａ）において添加する本発明のポリペプチドの量は、基質の初期濃度の低下を１５％未満とする、例えば本発明のポリペプチドの添加前のｃＡＭＰをもとにして１５％未満とする試験混合物中の終濃度をもたらす量として定義される。好ましくは、酵素基質として使用するｃＡＭＰは例えば［３Ｈ］−ｃＡＭＰの形態のもとに放射標識される。
【０１４６】
スクリーニング法の好ましい実施態様において、候補阻害剤化合物の所望の量の存在下または非存在下の本発明のポリペプチドの所望の量を含有する試験混合物およびｃＡＭＰを適当な緩衝溶液中３７℃でインキュベートしたのちに、酵素反応を停止させる試薬を添加する。
【０１４７】
好ましくは、インキュベーション時間は５〜２０分であり、好ましくは約１０分である。
好ましくは、酵素反応を停止させるために使用する試薬はケイ酸塩ビーズよりなる。
好ましくは、各試験混合物中の酵素活性は放射能の濃度を測定することにより調べる。
【０１４８】
次に、候補化合物の存在下に得られたホスホジエステラーゼ触媒活性の測定値および工程ｂ）を省略した場合（即ち候補化合物の非存在下）に得られた数値を比較し、ＩＣ５０値を測定する。ＩＣ５０値は上記候補化合物の非存在下に行なった対照実験において得られたｃＡＭＰの加水分解と比較した場合に、ｃＡＭＰの加水分解の５０％抑制をもたらす試験した候補化合物の濃度を示す。ＩＣ５０値は、当業者のよく知るＨｉｌｌ傾きを有するシグモイドモデルを用いて計算してよい。
【０１４９】
本発明はまたＰＤＥ７活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニングのためのキットに関し、該キットは下記成分：
ａ）ＰＤＥ７蛋白質の触媒ドメインを少なくとも有する本発明のポリペプチド；ｂ）場合により、ホスホジエステラーゼ触媒活性測定を行なうために必要な試薬；
を包含する。
【０１５０】
好ましくは、上記キットに含まれる本発明のポリペプチドは水溶液または凍結乾燥された粉末の形態である。
ホスホジエステラーゼ触媒活性の測定を行なうために必要な試薬は適切な緩衝液および放射標識ｃＡＭＰを包含する。
【０１５１】
本発明の更に別の目的はＰＤＥ７活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニングのための第２の方法よりなり、該方法は下記工程：
ａ）適切な培地中にＰＤＥ７の触媒ドメインを少なくとも有する本発明のポリペプチドを発現する組み換え宿主細胞を準備すること；
ｂ）試験すべき候補化合物の所望の濃度を該培地に添加すること；
ｃ）細胞内ホスホジエステラーゼ酵素活性を測定すること；および、
ｄ）工程ｃ）で得られた酵素活性を工程ｂ）を省略した場合に得られる酵素活性と比較すること；
を包含する。
【０１５２】
一般的に、工程ａ）で培養する宿主細胞は、上記した何れかの培養可能な宿主細胞、そして好ましくは哺乳類起源の宿主細胞であってよい。
上記したスクリーニング方法の第１の好ましい実施態様において、組み換え宿主細胞は二量体エクジソン受容体を発現するＣＨＯ細胞系統よりなる。
上記したスクリーニング方法の別の好ましい実施態様において、使用する組み換え宿主細胞は、本発明のポリペプチドをコードする核酸を有する組み換えベクターでトランスフェクトされており、ここで該核酸は誘導性調節配列に作動可能に連結されている。
【０１５３】
この好ましい実施態様において、誘導性調節配列が応答するインデューサー化合物をスクリーニング方法の工程ａ）において添加してよく、これにより、本発明のポリペプチドの高い発現濃度を達成でき、即ち、スクリーニング方法の感度を高めることができる。
【０１５４】
最も好ましくは、誘導性調節配列は誘導性ベクターｐＩＮＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に含まれるもののようなポナステロンに応答する。
上記したスクリーニング方法によれば、工程ａ）の間に誘導性調節配列を活性化するインデューサー化合物の存在下に組み換え宿主細胞を培養する。
好都合には、インデューサー化合物存在下の宿主細胞のインキュベーション時間は１〜２０時間、好ましくは４〜１５時間、最も好ましくは６〜１０時間である。
誘導の後、培地を除去し、新しい培地を添加して試験を行う。候補化合物を所望の濃度（例えば一連の漸増濃度）で新しい培地に添加し、細胞を１０〜６０分、好ましくは、２０〜４５分、最も好ましくは約３０分間３７℃でインキュベートする。
【０１５５】
好ましくは、停止溶液の添加の前に工程ｂ）の終了時にアデニル酸シクラーゼ活性化剤を添加することにより反応を停止する。
最も好ましくは、アデニル酸シクラーゼ活性化剤は化合物フォルスコリンよりなる。
アデニル酸シクラーゼ活性化剤存在下のインキュベーションの時間は、好都合には５〜３０分間、好ましくは１０〜２０分間、最も好ましくは約１５分間である。
上記したス２次スクリーニング方法によれば、ホスホジエステラーゼ酵素活性は、工程ｂ）の間に生産される細胞内ｃＡＭＰの量を測定することにより細胞溶解の後に測定する。
【０１５６】
細胞溶解物中のｃＡＭＰ濃度の測定は、ｃＡＭＰに対する抗体を用いて行なってよい。
最も好ましくは、工程ｂ）の間に生産される細胞内ｃＡＭＰの量の測定は、競合試験においてｃＡＭＰに対するポリクローナル抗体を用いて細胞溶解物中において行ない、この試験では、細胞溶解物中のｃＡＭＰは、ｃＡＭＰを自らに共有結合させて保有しているアルカリホスファターゼ分子と、上記抗ｃＡＭＰポリクローナル抗体への結合に関して競合する。
最も好ましくは、細胞質ゾルを細胞溶解物の粒状画分から、例えば遠心分離により分離した後、上記したとおり細胞質ゾル画分に対するｃＡＭＰの含量を測定する。
【０１５７】
次に、試験した候補化合物の漸増濃度の存在下に測定した細胞内ｃＡＭＰの値と工程ｂ）を省略した場合（即ち候補化合物の非存在下）のｃＡＭＰ測定値とを比較し、候補化合物のＡＵＣ（曲線下部面積）値を求める。
所定の候補化合物のＡＵＣ値はスクリーニング方法の工程ｂ）の間に生産された細胞内ｃＡＭＰの量の１００〜２０００％の増大をもたらす上記候補化合物の濃度を示す。
【０１５８】
本発明はまた、ＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニングのためのキットに関し、該キットは下記成分：
ａ）本発明のポリペプチドを発現する本発明の組み換え宿主細胞；および、
ｂ）場合により、ホスホジエステラーゼ触媒活性測定を行なうために必要な試薬；
を包含する。
【０１５９】
ＰＤＥ７活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニングのための上記した第２の方法の別の実施態様においては、上記方法は、下記工程：
ａ）適切な培地中のＰＤＥ７の触媒ドメインを少なくとも有する本発明のポリペプチドを同時発現する組み換え宿主細胞およびレポーター遺伝子を準備すること；
ｂ）試験すべき候補化合物の所望の濃度を該培地に添加すること；
ｃ）レポーター遺伝子発現を測定すること；および、
ｄ）工程ｃ）で得られた酵素活性を工程ｂ）を省略した場合に得られる酵素活性と比較すること；
を包含する。
【０１６０】
一般的に、工程ａ）で培養する宿主細胞は、上記した何れかの培養可能な宿主細胞、そして好ましくは哺乳類起源の宿主細胞であってよい。
上記したスクリーニング方法の第１の好ましい実施態様において、組み換え宿主細胞は二量体エクジソン受容体を発現するＣＨＯ細胞系統よりなる。
上記したスクリーニング方法の別の好ましい実施態様において、使用する組み換え宿主細胞は、本発明のポリペプチドをコードする核酸を有する組み換えベクターでトランスフェクトされており、ここで該核酸は誘導性調節配列に作動可能に連結されている。
【０１６１】
この好ましい実施態様において、誘導性調節配列が応答するインデューサー化合物をスクリーニング方法の工程ａ）において添加してよく、これにより、本発明のポリペプチドの高い発現濃度を達成でき、即ち、スクリーニング方法の感度を高めることができる。
最も好ましくは、誘導性調節配列は誘導性ベクターｐＩＮＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に含まれるもののようなポナステロンに応答する。
最も好ましくはレポーター遺伝子はβ−ラクタマーゼ遺伝子である。
上記したスクリーニング方法によれば、工程ａ）の間に誘導性調節配列を活性化するインデューサー化合物の存在下に組み換え宿主細胞を培養する。
好都合には、インデューサー化合物存在下の宿主細胞のインキュベーション時間は１〜２０時間、好ましくは４〜１５時間、最も好ましくは６〜１０時間である。
【０１６２】
誘導の後、培地を除去し、新しい培地を添加して試験を行う。候補化合物を所望の濃度（例えば一連の漸増濃度）で新しい培地に添加し、細胞を１０〜６０分、好ましくは、２０〜４５分、最も好ましくは約３０分間３７℃でインキュベートする。
好ましくは、使用する細胞の濃度はウェルあたり１５０００〜４００００個、最も好ましくは、ウェル当たり３００００〜４００００個であり、そしてより好ましくはウェル当たり３００００個である。
好ましくは、停止溶液の添加の前に工程ｂ）の終了時にアデニル酸シクラーゼ活性化剤を添加することにより反応を停止する。
最も好ましくは、アデニル酸シクラーゼ活性化剤は化合物フォルスコリンよりなる。
アデニル酸シクラーゼ活性化剤存在下のインキュベーションの時間は、好都合には５〜３０分間、好ましくは１０〜２０分間、最も好ましくは約１５分間である。
【０１６３】
本発明はまた、ＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニングのためのキットに関し、該キットは下記成分：
ａ）本発明のポリペプチドおよびレポーター遺伝子を同時発現する本発明の組み換え宿主細胞；
ｂ）場合により、レポーター遺伝子発現測定を行なうために必要な試薬；
を包含する。
【０１６４】
前記した第１のインビトロのスクリーニング方法は、緩衝溶液中に含まれるＰＤＥ７の触媒ドメインを少なくとも有する本発明のポリペプチドを使用する。本発明の特定の実施態様において、上記した第１のインビトロのスクリーニング方法をＰＤＥ７またはホスホジエステラーゼ活性の阻害剤に関する一次スクリーニング試験として用いる。
【０１６５】
本発明の上記第１のスクリーニング方法に従って陽性として選別された候補化合物は次に、ＰＤＥ７触媒ドメインを少なくとも有する本発明のポリペプチドを発現ずる組み換え宿主細胞を使用する上記した第２のスクリーニング方法に従って試験される。該第２のスクリーニング方法により、細胞内、即ち、生理学的な環境における、ＰＤＥ７阻害剤の選択が可能になる。
【０１６６】
従って本発明はＰＤＥ７活性を阻害する化合物をインビトロで選択するための方法に関し、該方法は下記工程：
ａ）候補化合物を用いて上記した本発明の第１のスクリーニング方法を実施すること；および、該候補化合物がホスホジエステラーゼ活性を阻害することがわかった場合は、次に、
ｂ）工程ａ）で選択された阻害剤化合物を用いて本発明の第２のスクリーニング方法を実施すること；
を包含する。
【０１６７】
本発明の第１および第２のスクリーニング方法を組み合わせた上記方法に従って陽性として選択された候補化合物は治療上の価値のある潜在的な薬剤であることは言うまでもない。
本発明によれば、上記したスクリーニングまたは選択方法のいずれか１つに従って選択されたＰＤＥ７阻害剤化合物がＰＤＥ７に対して選択的であり、他のホスホジエステラーゼ酵素の１つ以上を阻害しないことを確認してもよい。
【０１６８】
即ち、本発明はＰＤＥ７活性を選択的に阻害する化合物を選択するための方法に関し、該方法は下記工程：
ａ）上記した第１および／または第２のスクリーニング方法を実施することによりＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物を選択すること；および、
ｂ）ＰＤＥ７以外の少なくとも１つのＰＤＥ酵素のホスホジエステラーゼ活性を阻害する能力がないことを、選択された阻害剤化合物について調べること；
を包含する。
【０１６９】
上記選択方法の第１の好ましい実施態様において、ＰＤＥ３およびＰＤＥ４酵素のホスホジエステラーゼ活性を阻害する能力がないことを、選択された阻害剤化合物について調べる。
上記選択方法の第２の好ましい実施態様において、ＰＤＥ１、ＰＤＥ２、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４、ＰＤＥ５およびＰＤＥ６酵素のホスホジエステラーゼ活性を阻害する能力がないことを、選択された阻害剤化合物について調べる。
実施例で示すとおり、当業者はＰＤＥ４の触媒活性の測定方法を開示しているＴＯＲＰＨＹ等（１９９３）の文献またはＫＯＶＡＬＡ等（１９９７）の文献を好都合に参照してよい。
【０１７０】
当業者はＰＤＥ３の触媒活性の測定方法を開示しているＭａｎｇａｎｅｌｌｉｏ等の文献を好都合に参照してよい。
当業者はＰＤＥ５の触媒活性の測定方法を開示しているＦＩＮＫ等（１９９９）の文献を好都合に参照してよい。
当業者はＰＤＥ１の触媒活性の測定のための試験法を開示しているＳＯＮＮＥＮＢＵＲＧ等（１９９５）の文献を好都合に参照してよい。
当業者はＰＤＥ２の触媒活性の測定のための試験法を開示しているＢＥＡＶＯ等（１９７０）の文献を好都合に参照してよい。
当業者はＰＤＥ６の触媒活性の測定のための試験法を開示しているＢＡＥＨＲ等（１９７９）およびＦＵＮＧ等（１９９０）の文献を好都合に参照してよい。
【０１７１】
本発明はまた上記した方法の何れか１つにより選択されたＰＤＥ７阻害剤化合物に関する。
本発明は更にまた医薬組成物の製造のための上記した方法の何れか１つにより選択されたＰＤＥ７阻害剤化合物の使用に関する。
本発明は、最初のＡＴＧコドンから残基８１（Ｌ２２Ｍ２）までの配列の逐次的欠失により発生するＨＣＰ１のＮＨ２末端欠失よりなる配列としてミカエリ等（１９９３）により開示されたアミノ酸配列には関係しない。
本発明を図面および以下の実施例により更に詳述するが、これらに限定されない。
【０１７２】
【実施例】
Ａ．材料および方法
材料
制限酵素はＲｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓより購入した。蛋白質濃度は標準物質としてＢＳＡを用いながらＢｒａｄｆｏｒｄの方法に従って測定した。配列決定はプラスミドＤＮＡ２μｇおよび適切な配列決定オリゴヌクレオチド５ｐｍｏｌ（ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ，Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて自動配列決定装置（ＡＢＩモデル３７３；Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）上で行なった。ＳＤＳ／ＰＡＧＥはＬａｅｍｍｌｉ（１９７０）の方法に従って行なった。
【０１７３】
ＰＤＥ７Ａ１ｃＤＮＡのクローニング
全ＲＮＡをＳｔｒａｔａｇｅｎｅのクローニングシステムキット（Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ，ＵＳＡ）の試薬を用いて、製造元の取扱説明書に従って、ヒトリンパ球Ｔ細胞（ＣＤ４＋）から抽出した。ｃＤＮＡは、オリゴｄ（Ｔ）プライマーおよびＭＭＬＶ逆転写酵素を終濃度５０μＬ（Ｒｏｓｈｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）を用いながら全ＲＮＡ１０μｇから合成した。次にＡｍｐｌｉｔａｑ　ｃＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）を用いたＰＣＲ増幅の鋳型として第１の鎖ｃＤＮＡ産物１μＬを用いることにより、オープンリーディングフレームを隣接する公開された配列（Ｍｉｃｈａｅｌｉ等、１９９７；Ｂｌｏｏｍ ａｎｄ Ｂｅａｖｏ，１９９６）から設計したオリゴヌクレオチドを用いてヒトＰＤＥ７Ａ１をコードするｃＤＮＡを作成した。プライマーの配列は以下に示すとおりである。
ＰＤＥ７Ａ１　ＣＧＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＡＧＴＧＴＧＴＴＡＣＣＡＧ （配列番号１２）
ＰＤＥ７Ａ２　ＣＧＣＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＡＴＡＡＣＣＧＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＧＧＴＡＡ　（配列番号１３）
【０１７４】
上記プライマーにおいて下線を付した制限酵素部位ＢａｍＨＩおよびＸｂａｌを用いてバキュロウィルス発現ベクターｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＡまたはｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ）内にＰＣＲ産物をサブクローニングした。ＰＤＥ７Ａコード配列のＰＣＲ増幅産物をタグ６×Ｈｉｓに隣接して位置させ、組み換え酵素のアミノ末端にタグを有する融合蛋白質を作成した。全ての構築物を配列決定し、使用前にチェックした。これらのクローンはｐｃＤＮＡ４ｈｉｓ７Ａ１およびｐＢａｃＨｉｓ７Ａ１と命名した。
【０１７５】
ＰＤＥ７Ａ１の完全なオープン読み枠はＫｏｚａｋ配列ＧＣＣＡＣＣＡＴＧ（Ｋｏｚａｋ Ｍ．，ＪＢＣ，２６６，１９９１）を含むｐｃＤＮＡ３にもクローニングし、これをＰＤＥ７Ａ１の開始コドンの直ぐ上流に付加した。このクローンはｐｃＤＮＡＫｏｚ７Ａと命名した。プライマーは以下の配列を有していた。
ＰＤＥ７ＡＫ１　 ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＴＧＴＧＴＴＡＣＣ （配列番号１４）
ＰＤＥ７ＡＫ２　ＣＧＣＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＡＴＡＡＣＣＧＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＧＧＴＡＡ （配列番号１３）
【０１７６】
更に、ＰＤＥ７Ａ１の３′および５′の未翻訳領域（ＵＴＲ）の配列（Ｍｉｃｈａｅｌｉ等，（１９９７）をｐｃＤＮＡ３の内のＰＤＥ７Ａ１の全オープンリーディングフレームに付加した。即ち、ＰＤＥ７Ａ１の３′ＵＴＲの１０５０ｂｐおよびＰＤＥ７Ａ２の５′ＵＴＲの１５２ｂｐを以下のプライマーを用いてヒトＣＤ４＋Ｔ細胞由来のｃＤＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。
ＵＣＲ３′１　ＣＣＧＧＧＧＧＴＡＣＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＡＧＧＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧ （配列番号１５）
ＵＣＲ３′２　ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＧＡＡＴＡＣＧＣＣＣＧＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＧ （配列番号１６）
ＵＣＲ５′１　ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＣＣＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＴＧＧＧＡＣＡＡＡＣＴＧＣＣＴＣＣＴ （配列番号１７）
ＵＣＲ５′２　ＧＧＣＧＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＡＡＡＣＡＴＡＡＣＡＴＧＣＡＣＧＴＣＡＣ（配列番号１８）
【０１７７】
ＰＤＥ７Ａ１コード配列の開始コドンの直ぐ上流に５′ＵＴＲ配列を、そして終止コドンの直ぐ下流３′ＵＴＲに付加した。上記プライマーにおいて下線を付している制限酵素部位はそれぞれＫｐｎＩ，ＢａｍＨＩ，ＸｂａＩおよびＳｍａＩであり、ｐｃＤＮＡＫｏｚ７Ａへのサブクローニングを容易にするために用いた。このクローンをｐｃＤＮＡ３′５′７Ａと命名した。
全構築物の配列は使用する前に確認した。
【０１７８】
ＰＤＥ７Ａのアミノおよびカルボキシ末端の欠失の構築
ＰＤＥ７Ａ１のＮおよびＣ末端を連続的に欠失させて触媒ドメインをマッピングし、推定阻害ドメインを同定した。鋳型としての完全長ＰＤＥ７Ａ１ｃＤＮＡおよびヒスチジンタグから下流のｐｃＤＮＡ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ部位へのサブクローニングを可能にする制限部位（ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ）を含むプライマーを用いたＰＣＲ増幅により１１の構築物（図２）を作成した。
【０１７９】
アミノ末端欠失
以下のプライマーを用いて最初の１２アミノ酸を欠失する構築物ＰＤＥ７Δ１２を作成し、ＰＤＥ７Ａ；１３−４８３とした。
Ｈ１　 ＣＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＧＧＣＣＧＧＴＣＣＣＣＣＡＧＣＡＣＧＴＣＣＴＣ （配列番号１９）
Ｈ２　ＣＧＣＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＡＴＡＡＣＣＧＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＧＧ （配列番号２０）
以下のプライマーを用いて最初の３０アミノ酸を欠失する構築物ＰＤＥ７Δ３０を作成し、ＰＤＥ７Ａ；３１−４８３とした。
Ａ１　 ＣＣＧＧＧＡＴＣＣＣＣＣＣＧＧＣＡＧＣＴＣＴＣＴＣＡＧＡＧＧＣＧＴ （配列番号２１）
Ｈ２　ＣＧＣＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＡＴＡＡＣＣＧＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＧＧ （配列番号２０）
【０１８０】
以下のプライマーを用いて最初の６０アミノ酸を欠失する構築物ＰＤＥ７Δ６０を作成し、ＰＤＥ７Ａ；６１−４８３とした。
Ｂ１　　　ＣＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＡＣＡＴＴＣＧＴＡＴＧＣＴＡＧＧＡＧ （配列番号２２）
Ｈ２　ＣＧＣＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＡＴＡＡＣＣＧＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＧＧ （配列番号２０）
以下のプライマーを用いて最初の８０アミノ酸を欠失する構築物ＰＤＥ７Δ８０を作成し、ＰＤＥ７Ａ；８１−４８３とした。
Ｃ１　　ＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＧＡＡＧＡＧＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＡＴＡＴＡ （配列番号２３）
Ｈ２　ＣＧＣＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＡＴＡＡＣＣＧＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＧＧ （配列番号２０）
【０１８１】
以下のプライマーを用いて最初の１００アミノ酸を欠失する構築物ＰＤＥ７Δ１００を作成し、ＰＤＥ７Ａ；１０１−４８３とした。
Ｄ１　 ＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＧＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡＡＧＧＡＡＴＡＴＣＡＧＡ （配列番号２４）
Ｈ２　ＣＧＣＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＡＴＡＡＣＣＧＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＧＧ （配列番号２０）
以下のプライマーを用いて最初の１２０アミノ酸を欠失する構築物ＰＤＥ７Δ１２０を作成し、ＰＤＥ７Ａ；１２１−４８３とした。
Ｅ１　　ＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＡＣＧＣＴＴＴＴＴＴＣＧＴＧＧＴＡＣＴＧ （配列番号２５）
Ｈ２　ＣＧＣＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＡＴＡＡＣＣＧＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＧＧ （配列番号２０）
【０１８２】
以下のプライマーを用いて最初の１４０アミノ酸を欠失する構築物ＰＤＥ７Δ１４０を作成し、ＰＤＥ７Ａ；１４１−４８３とした。
Ｆ１　 ＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＧＡＣＡＡＧＣＣＡＡＧＴＧＴＡＴＧＣＴ （配列番号２６）
Ｈ２　ＣＧＣＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＡＴＡＡＣＣＧＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＧＧ （配列番号２０）
以下のプライマーを用いて最初の１７０アミノ酸を欠失する構築物ＰＤＥ７Δ１７０を作成し、ＰＤＥ７Ａ；１７１−４８３とした。
Ｇ１　 ＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＡＡＧＣＴＴＡＡＣＣＴＴＴＣＡＴＴＴＡ （配列番号２７）
Ｈ２　ＣＧＣＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＡＴＡＡＣＣＧＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＧＧ （配列番号２０）
【０１８３】
カルボキシ末端欠失
ＰＤＥ７Ａのカルボキシ末端領域の逐次的欠失をＰＤＥ７Δ１００を鋳型として用いながら行なった。
構築物ＰＤＥ７；１０１−４５０は以下のプライマーを用いて作成した。
Ｄ１　 ＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＧＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡＡＧＧＡＡＴＡＴＣＡＧＡ （配列番号２４）
Ｉ２　　　 ＣＧＣＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＣＴＧＧＣＴＴＴＡＴＴＣＡＧＣＣ　（配列番号２８）
構築物ＰＤＥ７；１０１−４３０は以下のプライマーを用いて作成した。
Ｄ１　 ＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＧＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡＡＧＧＡＡＴＡＴＣＡＧＡ （配列番号２４）
Ｊ２　　ＣＧＣＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＣＴＧＧＣＣＣＡＴＴＣＴＧＴＡＡＡＴＡＡＡ （配列番号２９）
構築物ＰＤＥ７；１０１−４２０は以下のプライマーを用いて作成した。
（数は完全長ＰＤＥ７Ａ１酵素配列と照合させたものである。）
Ｄ１　 ＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＧＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡＡＧＧＡＡＴＡＴＣＡＧＡ （配列番号２４）
Ｋ２　ＣＧＣＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＡＧＧＴＡＡＧＴＣＡＴＡＡＡＡＣＣＡＡＴＣＴ （配列番号３０）
【０１８４】
ＣＨＯ細胞培養
二量体エクジソン受容体を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＥｃｒＣＨＯ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１４６ｍｇ／ｌ　Ｌ−グルタミン、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、１６μＭチミジンおよび１００μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したＨａｍ’ｓ Ｆ−１２栄養混合物（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含有する完全生育培地中、５％二酸化炭素／９５％空気の雰囲気下３７℃で培養した。培地は３〜５日おきに交換し、細胞は１週間に１回の割合でトリプシン処理後１：２に分割した。
【０１８５】
トランスフェクション試験および細胞抽出液の調製
トランスフェクションの３日前にＣＨＯ細胞を１５０ｃｍ２のフラスコ当たり２×１０６個の細胞密度でプレーティングした。製造元の取扱説明書（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に従ってリポフェクタミンを用いて内毒素非含有プラスミドＤＮＡ２０μｇで細胞をトランスフェクトした。４８時間インキュベートした後、細胞をリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、トリプシン処理し、遠心分離により回収し、終濃度で２ｍＭベンズアミジン、２μｇ／ｍｌダイズトリプシン阻害剤、５０μＭＰＭＳＦおよび１００μｇ／ｍｌバシトラシンの蛋白質分解酵素阻害剤の混合物を添加したＰＤＥ抽出緩衝液（Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ ２０ｍＭ（ｐＨ６．５），ＥＤＴＡ １０ｍＭ，ＤＴＴ ２．５Ｍ）３００μＬ中に再懸濁した。細胞を超音波処理し、１４０００ｇで２０分間遠心分離し、得られた上澄みのｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性を分析した。
【０１８６】
Ｍｏｌｔ４細胞の培養および細胞抽出液の調製
３７℃の１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１００μｇ／ｍｌゲンタマイシン添加ＲＰＭＩ１６４０培地グルタミン中でＭｏｌｔ４を培養した。培養した細胞（４×１０８）を遠心分離し、冷リン酸塩緩衝食塩水で１回洗浄した。次に細胞を終濃度で２ｍＭベンズアミジン、２μｇ／ｍｌダイズトリプシン阻害剤、５０μＭＰＭＳＦおよび１００μｇ／ｍｌバシトラシンの蛋白質分解酵素阻害剤の混合物を添加したＰＤＥ抽出緩衝液（Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ ２０ｍＭ（ｐＨ６．５），ＥＤＴＡ １０ｍＭ，ＤＴＴ ２．５Ｍ）３００μＬ中に再懸濁した。細胞を超音波処理し、４℃、３００００ｇで６０分間遠心分離した。得られた上澄みをＨＰＣＬで分析した。
【０１８７】
イオン交換ＨＰＣＬ分析
得られた上澄みを酢酸セルロースフィルター（孔径０．４５ミクロン）を通して濾過した。約１ｍｌを、終濃度で２ｍＭベンズアミジン、２μｇ／ｍｌダイズトリプシン阻害剤、５０μＭＰＭＳＦおよび１００μｇ／ｍｌバシトラシンの蛋白質分解酵素阻害剤の混合物を添加した緩衝液Ａ（Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ ２０ｍＭ（ｐＨ６．５），ＥＤＴＡ １０ｍＭ，ＤＴＴ ２．５Ｍ）で予め平衡化したＭｏｎｏ−Ｑイオン交換カラムＨＲ５／５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に適用した。緩衝液Ａで線状した後、ＰＤＥ活性画分を０．５ｍｌ／分の流量で緩衝液Ａ中０Ｍ〜１．０Ｍの酢酸ナトリウムの直線勾配を用いて溶離した。クロマトグラフィーの間、カラムおよび溶離画分は４℃に維持した。１．０ｍｌの画分を採取し、−８０℃に保存し、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性の分析に付した。
【０１８８】
Ｓｆ２１細胞培養、感染試験
Ｓｆ２１細胞を発現ベクターおよび線状ＡｃＭＮＰＶ　ＤＮＡ（親ウィルス、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより入手）で同時トランスフェクトした。細胞培養、組み換えウィルスの精製およびウィルス価測定は製造元の取扱説明書に従って行なった（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。蛋白質発現のために、２×１０６個／ｍｌの密度の細胞をｍｏｉ＝５で組み換えウィルスに感染させた。感染後３日目に、細胞を遠心分離により沈殿させ、終濃度で２ｍＭベンズアミジン、２μｇ／ｍｌダイズトリプシン阻害剤、５０μＭＰＭＳＦおよび１００μｇ／ｍｌバシトラシンの蛋白質分解酵素阻害剤の混合物を添加したホモゲナイズ用緩衝液（Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ ２０ｍＭ（ｐＨ６．５），ＥＤＴＡ １０ｍＭ，ＤＴＴ ２．５Ｍ）中に回収した。グリセロールを終濃度２０〜３０％で全ホモジネートに添加し、これらを小分けにして−２０℃で保存した。
【０１８９】
ＰＤＥ試験
ホスホジエステラーゼ活性は５′ヌクレオチドがアルミナに極めて強固に結合するが環状ヌクレオチドは中性または僅かにアルカリ性のｐＨで容易に溶離する観察条件を用いてＳｍｉｔｈ等（Ｍａｎｇａｎｅｌｌｉｏ等、１９９１）の記載した方法の変法を用いて調べた。試験は総容量２００μｌで３７℃で９６穴プレート中で行なった。各ウェルには試験緩衝液（終濃度で４０ｍＭトリス塩酸；ｐＨ８；０．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２；４ｍＭβ−メルカプトエタノール；１０ｎＭ［３Ｈ］ｃＡＭＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）および１μＭｃＡＭＰ）および構築物の活性に応じて希釈したＣＨＯ溶解物上澄み１０μＬを入れた。６０分のインキュベートの後、ＴＦＡ（０．５％）中１μＭ［１４Ｃ］ＡＭＰを添加することにより反応を停止した。アルミナ５０ｍｇをいれた膜底部を有するマイクロプレート（Ｓｉｌｅｎｔ ｍｏｎｉｔｏｒ，Ｎａｌｇｅｎ Ｎｕｎｃ）を０．１Ｍ　ＴＥＳ−ＮａＯＨ，ｐ８．０で平衡化した。次に反応混合物をこれらのカラムに適用した。未加水分解ｃＡＭＰを平衡化緩衝液３ｍｌで溶離した。次に［３Ｈ］ｃＡＭＰおよび［１４Ｃ］ＡＭＰを２ｍＭ　ＮａＯＨで直接、アルカリ適合性シンチラント（Ｕｌｔｉｍａ ｇｏｌｄ，Ｐａｃｋａｒｄ）の入ったシンチレーションバイアルに溶出させた。分離した［３Ｈ］ｃＡＭＰを分離および非分離の［１４Ｃ］値を用いて回収率に付いて逆補正し、全［３Ｈ］ｃＡＭＰの分数として表示し、加水分解された基質の量を求めた。
【０１９０】
速度論と阻害剤の検討
ＩＣ５０測定のためのＰＤＥ試験
ＰＤＥ７Ａ１（完全長またはトランケートされた形態）を含む細胞溶解物を酵素源として用いた。ＰＤＥ試験は９６穴のプレート中、８つの異なった濃度のＤＭＳＯ中に溶解した化合物２μＬ（４０ｍＭトリス、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５０ｎＭ［３Ｈ］−ｃＡＭＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）および適切な濃度の酵素）を含む最終容量１００ｍｌ中でｐＨ８において行なった。加熱器／振とう器中１０分間３７℃でプレートをインキュベートし、ケイ酸イットリウムビーズ（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ａｓｓａｙ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）２０μＬを添加することにより停止させた。酵素活性はＴｏｐｃｏｕｎｔ　ｒｅａｄｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ）上で読み取った。基質の枯渇は初期量の１５％を超えなかった。示したＩＣ５０値は対照と比較してｃＡＭＰ加水分解の５０％抑制をもたらす化合物の濃度を示す。これらはＨｉｌｌ勾配を１に固定した従来のシグモイドモデルを用いて計算する。
【０１９１】
Ｋｍ測定のためのＰＤＥ試験
ＰＤＥ７Ａ１（完全長またはトランケートされた形態）を含む細胞溶解物を酵素源として用いた。ＰＤＥ試験は９６穴のプレート中、１０μＭロリプラム、１０μＭＰＤＥ３阻害剤、４０ｍＭトリス、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、基質［３Ｈ］−ｃＡＭＰおよび適切な濃度の酵素を含む最終容量１００μｌ中でｐＨ８において行なった。加熱器／振とう器中３７℃でプレートをインキュベートし、ケイ酸イットリウムビーズ（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ａｓｓａｙ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）２０μＬを添加することにより停止させた。酵素活性はＴｏｐｃｏｕｎｔ　ｒｅａｄｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ）上で読み取った。基質の枯渇は初期量の１５％を超えなかった。次に飽和曲線をＨｉｌｌ勾配１に固定した従来のシグモイドモデルを用いて計算した。
【０１９２】
ウエスタンブロット分析
Ｈｉｓタグ付ＰＤＥ７Ａ１またはＰＤＥ７Ａ１のタグ付トランケート版でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の溶解物を液体窒素中に凍結し、３回解凍し、次に１０分間１５０００ｇで遠心分離する事により細胞破砕物と核を除去した。次に上澄みを１時間１００，０００ｇで遠心分離することにより細胞質ゾル画分（高速上澄み）から原形質膜画分（ペレット）を単離した。
Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中に蛋白質（１０μｇ）を再懸濁し、５分間煮沸する事により変性した。試料を４〜１５％の一次勾配トリス塩酸ポリアクリルアミドゲル上で泳動（１００ｍＡ／ゲル）し、ウエスタンブロットにより融合蛋白質を検出するために、ニトロセルロース膜に移し取った。膜をリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）中の５％（ｗ／ｖ）低脂肪乳で１時間ブロッキングした。ブロットは、アミノ末端Ｘｐｒｅｓｓタグエピトープに対して特に指向されたモノクローナル抗体抗−ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１％無脂肪乳および０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ中に１μｇ／ｍｌに希釈）を用いて１時間プローブした。洗浄後、結合した抗体を抗マウスＩｇＧパーオキシダーゼコンジュゲート二次抗体（Ｓｉｇｍａ）および増強化学ルミネセンス（ＥＣＬ Ｐｌｕｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）検出システムを用いて検出した。
【０１９３】
統計学的分析
ＰＤＥ活性の測定値は平均±ＳＥＭとして表示する。ノンパラメトリックなマン・ホイットニー試験を全てに渡り使用した。
【０１９４】
Ｂ．結果
実施例１：完全長ＰＤＥ７Ａ１のＣＨＯおよびバキュロウィルスによる発現
ｃＡＭＰ加水分解の速度は、組み換え完全長ＰＤＥ７Ａ１でトランスフェクトした後４８時間、ＣＨＯ細胞細胞質ゾル抽出液中で測定し、非トランスフェクト細胞で観察されたものと比較した。比較のためには、組み換えＰＤＥ４Ｂ２で細胞をトランスフェクトした。
組み換えＰＤＥ４Ｂ２で観察されたものと比較して、完全長ＰＤＥ７Ａ１でトランスフェクトした細胞の細胞質ゾルでは極めて低値のＰＤＥ７Ａ活性が観察された（図４）。
図４は組み換えＣＨＯ細胞系統およびＳｆ２１組み換え細胞系統によるＰＤＥ７Ａ１の発現の結果を示している。最終希釈度は括弧内に示した。
【０１９５】
ｃＡＭＰ活性は対照細胞と比較して組み換えＰＤＥ７Ａ１を発現しているＣＨＯ細胞では約２倍に上昇していた。これと比較して、組み換えＰＤＥ４Ｂ２でトランスフェクトした細胞では１７倍高値であった（図５）。ウエスタンブロットにより検出された各組み換え蛋白質の濃度は同様であった。ＰＤＥ７Ａ１でトランスフェクトされた細胞における基礎的数値を超えたｃＡＭＰ活性の増大はロリプラム（１０μＭ）に非感受性であったのに対し、ＰＤＥ４Ｂ２の場合はロリプラムに感受性であった（図４）。これらのデータによれば、活性なＰＤＥ７Ａ１はＣＨＯ細胞中で発現されるが極めて低い濃度であることが確認された。同様のデータがＰＤＥ７Ａ２においても得られた。
【０１９６】
翻訳を至適化するために、更に別の構築物を作成して至適Ｋｏｚａｋ配列を導入した。更に、３′および５′ＵＴＲ配列をＰＤＥ７Ａ１コード配列に付加することにより組み換えＰＤＥ７のＲＮＡの安定性の至適化を試みた。ＣＨＯ細胞内のこれらの２つの別の構築物の一過性の発現は細胞質ゾル中で測定したＰＤＥ７活性の水準を上昇させなかった（図５）。
【０１９７】
完全長ＰＤＥ７Ａ１をＮ末端タグバキュロウィルス発現ベクター（ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＡ）にサブクローニングし、Ｓｆ２１にトランスフェクトして組み換えウィルスを作成した。感染３日後、ＰＤＥ７Ａ１組み換えウィルスで感染させたＳｆ２１細胞のＰＤＥ活性を測定し、未感染のＳｆ２１細胞または組み換えＰＤＥ４Ｂ２で感染させた細胞で観察されたものと比較した。未感染の細胞と比較してＰＤＥ７Ａ１構築物を感染させた細胞の溶解物中ではＰＤＥ活性が増大していた。しかしながら、ＣＨＯ細胞で得られた結果と合致して、組み換えＰＤＥ７Ａ１を発現しているＳｆ２１細胞におけるＰＤＥ活性は、組み換えＰＤＥ４Ｂ２を発現している細胞で測定された数値と比較して極めて低値であった（図４）。組み換えＰＤＥ７Ａ１ウィルスを感染させたＳｆ２１細胞のホモジネートは組み換えＰＤＥ４Ｂ２ウィルスを感染させたものよりも約１００倍低値のｃＡＭＰ活性を有していた。組み換えＰＤＥ７Ａ２ウィルスを感染させたＳｆ２１細胞のホモジネートは組み換えＰＤＥ４Ｂ２ウィルスを感染させたものよりも約５０倍低値のｃＡＭＰ活性を有していた。
【０１９８】
実施例２：アミノ末端欠失の発現とＰＤＥ活性
ＣＨＯ細胞中のＰＤＥ７Ａ１構築物の完全高コード領域の一過性発現の後に得られたＰＤＥ活性が極めて低値であったことを考慮して、種々のアミノ末端欠失を作成し、次にこれらをＣＨＯ細胞内で発現させた。生じたＰＤＥ活性を測定し、ＰＤＥ７Ａ１の完全長コード領域および非トランスフェクト細胞の場合の数値と比較した。最も高いＰＤＥ活性はＰＤＥ７Δ１００を発現している細胞で観察された（図６）。即ち、ＰＤＥ７：１０１−４８３を有するこのクローンは、完全長オープンリーディングフレーム１−４８３を発現している細胞と比較して、ＰＤＥ触媒活性が１５倍増大し、そして、擬似トランスフェクト細胞と比較して８倍であった。このトランケートされたＰＤＥ７構築物のＰＤＥ活性は１０μＭのロリプラムに対して非感受性であり、同じトランスフェクション条件下に得られた組み換えＰＤＥ４Ｂ２活性と同様である。最初の１００個のアミノ酸は発現されたＰＤＥ７酵素の触媒活性に対して影響すると考えられる。
【０１９９】
ＰＤＥ７Δ６０およびＰＤＥ７Δ８０の発現もまた、完全長ｃＤＮＡの発現と比較してＰＤＥ活性の増大をもたらした。内因性完全長ＰＤＥ７Ａ１を超えたＰＤＥ７Δ６０およびＰＤＥ７Δ８０の活性の増大は、それぞれ、８倍および９倍であった（図６）。より短いトランケーションであるＰＤＥ７Δ１２およびＰＤＥ７Δ３０の発現は完全長クローンで観察されたものと同等の低水準のＰＤＥ７活性をもたらした。これらの結果を合わせて考えると、残基３１および１００の間にあるＰＤＥ７Ａの領域が発現されたＰＤＥ７酵素の触媒活性に対して影響していると考えられる。
【０２００】
ＰＤＥ７Ａの別のアミノ末端欠失を作成した。これらの構築物、ＰＤＥ７Δ１２０、ＰＤＥ７Δ１４０およびＰＤＥ７Δ１７０の発現は、細胞質ゾル中のＰＤＥ７活性の消失をもたらした（図６および７）。このことは、ＰＤＥ７Ａの触媒ドメインの開始点が残基８１〜１２０の間に位置することを示唆していている（図２）。
【０２０１】
ＰＤＥ７Ａのアミノ末端トランケート版は全て同じ濃度でＣＨＯ細胞中に発現されたことが、これらの融合蛋白質のヒスチジンタグを認識する抗体を用いたウエスタンブロットで調べたところ、判明した（図９）。
【０２０２】
図９はＣＨＯトランスフェクト細胞中の組み換えヒトＰＤＥ７Ａの発現のトランケート型のウエスタンブロット分析を示す。Ｘｐｒｅｓｓタグ付完全長およびｍ末端トランケート型の組み換えヒトＰＤＥ７ＡでトランスフェクトしたＣＨＯの溶解物の上澄み画分を前述の通り調製した。蛋白質溶解物（１０μｇ）を４〜１５％の一次勾配トリス塩酸ポリアクリルアミドゲル上で泳動させ、ニトロセルロース膜に移し取った。ブロットをＮＨ２末端エピトープに対して指向させた抗Ｘｐｒｅｓｓモノクローナル抗体でプローブした。
【０２０３】
図９（Ａ）：レーンは（１）分子量マーカー、（２）Ｍｅｔ１−４８３、（３）Ｍｅｔ１３−４８３、（４）Ｍｅｔ３１−４８３、（５）Ｍｅｔ６１−４８３、（６）Ｍｅｔ８１−４８３、（７）Ｍｅｔ１０１−４８３、（８）Ｍｅｔ１２１−４８３、（９）Ｍｅｔ１４１−４８３、（１０）Ｍｅｔ１７１−４８３。
図９（Ｂ）：レーンは（１）分子量マーカー、（１１）Ｍｅｔ１０１−４８３、（１２）Ｍｅｔ１０１−４５０、（１３）Ｍｅｔ１０１−４３０、（１４）Ｍｅｔ１０１−４２０。
【０２０４】
単一の免疫反応性のバンドが６ｋＤａおよび３５ｋＤａの間に観察され、これはトランケーションの各々に対して適切であった。これらのデータは明らかに、ＰＤＥ７Ａ１蛋白質がＣＨＯ細胞内で発現され、そして蛋白質発現の極めて微小な変化のみが種々の突然変異体構築の間に認められたことを示している。
【０２０５】
実施例２Ｂ：最初の１００のＮ末端アミノ酸の調節的役割の確認
我々は発現されたＰＤＥ７遺伝子の触媒活性に対して最初の１００個のアミノ酸が影響することを上記のとおり示した。蛋白質のこの部分は自己阻害ドメインとして機能すると考えられている。最初の１００個のアミノ酸の過剰発現が触媒部位のＰＤＥ７活性を阻害できることを明らかにするためには、この触媒フラグメントである（１０１−４８２）フラグメントが別のプラスミドのフラグメント１−１０１と共に、または、このインサートを持たないプラスミドｐＣＤＮＡ３（ネガティブコントロール）とともに同時発現させた。細胞を各プラスミドＤＮＡ１５μｇでトランスフェクトした。触媒部位の活性はフラグメント１−１０１の存在下では僅か約４０〜５０％のみ阻害された（図１２）。作用の用量応答を確認することにより、触媒ドメインのＰＤＥ７活性における最初の１００個のアミノ酸の関与を評価した。
【０２０６】
用量作用曲線は同じ同時発現条件下に求めた。触媒フラグメント（１０１−４８２）１５μｇを別のプラスミドのフラグメント１−１０１の漸増量と同時発現させた。ＤＮＡ量は各トランスフェクション毎に空のベクターを用いて規格化した（図１３）。ＰＤＥ７活性に対する１００Ｎ末端アミノ酸の作用用量応答を観察した（ｎ＝３）。触媒ドメインの活性は最高濃度のフラグメント１〜１００の存在下６０％となるまで阻害された。
この結果はヒトＰＤＥ７Ａ１の最初の１００個のＮ末端アミノ酸の調節的役割を確認したものと考えられる。
【０２０７】
実施例３：カルボキシ末端欠失の発現とＰＤＥ活性−ＰＤＥ７Ａの触媒ドメインのマッピング
ＰＤＥ７Ａの触媒ドメインの開始点の領域を明らかにした後、酵素ＰＤＥ７Δ１００における３つのカルボキシ末端欠失を構築することによりＰＤＥ７Ａの触媒領域をマッピングした。ＰＤＥ７Ａ；１０１−４５０の発現はＰＤＥ７Δ１００（ＰＤＥ７；１０１−４８３）で観察されたものと同等のＰＤＥ活性をもたらし、このことは、カルボキシ末端の３３個のアミノ酸が触媒作用および酵素活性の調節の何れにおいても関与していないことを示唆している（図７）。しかしながら、ＰＤＥ７Ａ；１０１−４２０およびＰＤＥ７Ａ；１０１−４３０の発現は、適切な分子量の融合蛋白質の濃度は容易に検出できたにもかかわらず、完全長ＰＤＥ７Ａと比較して細胞抽出液中のＰＤＥ７活性の検出可能な増大をもたらさなかった（図７）。
【０２０８】
これらの結果はＰＤＥ７のカルボキシ側３３個のアミノ酸の部分（４５１〜４８３）は酵素活性の調節に直接関与していないことを強力に示している。しかしながら、触媒部位はアミノ酸４３１番と４５０番との間に位置していると考えられる。即ち、アミノ酸１０１番と４５０番との間にある本試験において定義されたＰＤＥ７触媒ドメインは分子量の計算値４２ｋＤａを有しており、これはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で推定された数値（４０．５ｋＤａ）とよく合致している。これらの結果はＰＤＥ７蛋白質のグリコシル化を予測させるものではない。
【０２０９】
実施例４：速度論的試験
速度論的試験とＫｍの測定を前述の通り実施することにより、ＣＨＯ細胞中で発現される完全長ＰＤＥ７Ａ１およびトランケートされた１０１−４５０ＰＤＥ７Ａ１組み換え蛋白質のそれぞれのＫｍ値を測定し、以下の表１に示した。
【０２１０】
【表１】
Figure 2004509640
【０２１１】
ＰＤＥ７（１０１−４５０）、ＰＤＥ７（１０１−４８３）のｃＡＭＰに対するＫｍ値が測定され、ヒトリンパ細胞系（Ｍｏｌｔ４）および全長の野生型組換えＰＤＥ７Ａ１中で内生的に発現されたＰＤＥ７のものと比較された（表１）。
ＰＤＥ（１０１−４５０）、ＰＤＥ７（１０１−４８３）は、全長の組換え体と比較した触媒効率において１．５〜２倍の増加が実証された。
バキュロウイルスまたは真核細胞にて産生されたＰＤＥ（１０１−４５０）および全長のＰＤＥ７Ａは、ＰＤＥ１阻害剤（ビンポセチン）、ＰＤＥ４阻害剤（ロリプラム）、ＰＤＥ３阻害剤（ＳＫＦ９４８３６）またはＰＤＥ５阻害剤（ザピリナスト）に非感受性であった。
さらに、ＰＤＥ７（１０１−４５０）、ＰＤＥ（１０１−４８３）および全長の組換えＰＤＥ７Ａ１は、阻害剤である３イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）に対して、似通ったＩＣ５０値（１３〜１４μＭ）を実証しており、これは阻害剤の見地からＮ末端ペプチドの役割は小さいということを示すものである。
【０２１２】
実施例５：ＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物のスクリーニング
Ａ．材料および方法
ＰＤＥ７Ａ１（完全長またはトランケートされた形態）を含む細胞溶解物を酵素源として用いた。ＰＤＥ試験は９６穴のプレート中、８つの異なった濃度のＤＭＳＯ中に溶解した化合物２μＬ、４０ｍＭトリス、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５０ｎＭ［３Ｈ］−ｃＡＭＰおよび適切な濃度の酵素を含む最終容量１００ｍｌ中でｐＨ８において行なった。
加熱器／振とう器中３７℃でプレートをインキュベートし、ケイ酸イットリウムビーズ（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ａｓｓａｙ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）２０μＬを添加することにより停止させた。
酵素活性はＴｏｐｃｏｕｎｔ　ｒｅａｄｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ）上で放射活性を測定することにより求めた。
基質の枯渇は初期量の１５％を超えなかった。示したＩＣ５０値は対照と比較してｃＡＭＰ加水分解の５０％抑制をもたらす化合物の濃度を示す。これらはＨｉｌｌ勾配を用いて従来のシグモイドモデルを用いて計算する。
【０２１３】
Ｂ．結果
一部のトランケート型のＰＤＥ７Ａ１、特にＮ末端トランケート構築物［１０１−４８３］および［１０１−４５０］は前の実施例における完全長の酵素よりも約１５倍高活性であることがわかった。
従って、種々の候補化合物の完全長ＰＤＥ７Ａ１蛋白質（１−４８３）および２種のトランケートされたＰＤＥ７Ａ１ポリペプチド、すなわち（１０１−４８３）および（１０１−４５０）の各々のホスホジエステラーゼ活性に対するその阻害特性について調べた。
９種の候補化合物が前述の本発明の第１のスクリーニング方法により陽性として選択された。
これらの化合物は全て、興味深いＩＣ５０値を示し、その一部はきわめて興味深いＩＣ５０値を示した。化合物はトランケートされたＰＤＥ７Ａ１ポリペプチド、即ち（１０１−４８３）および（１０１−４５０）および完全長ＰＤＥ７Ａ１に対し同様な挙動を示すと考えられた。本発明者等は阻害剤の見地からＮ末端の１００個のアミノ酸のペプチドの役割は小さいと結論した。アミノ酸１番〜３０番の間の欠失はＰＤＥ７の酵素活性を変化させず、これらの残基がｃＡＭＰの加水分解や調節に影響しないことを示している。しかしながら、アミノ酸３１版〜１００番の間の連続した欠失は触媒活性の明らかな増大をもたらし、この領域がＰＤＥ７触媒に対する阻害的束縛を行なっていることが示唆された。ＰＤＥ７活性は最初の１００アミノ酸が欠失した場合に最大となった。トランケートされた蛋白質（１０１−４５０）は完全長組み換えＰＤＥ７（Ｋｍ＝０．１１μＭ）と比較して幾分高値のｃＡＭＰ加水分解親和性（Ｋｍ＝０．０７μＭ）を有している。
【０２１４】
実施例６：全細胞に対して実施した本発明のＰＤＥ７阻害剤の二次スクリーニング
誘導性プロモーター下の触媒部位のサブクローニング
全細胞に対するＰＤＥ７阻害剤のＩＣ５０を測定するために、誘導性プロモーター下でＰＤＥ７Ａ１触媒部位を発現する安定な細胞系統（ＣＨＯ）を樹立した。ヒトトランケートＰＤＥ７Ａ１（１０１−４５０）をコードするｃＤＮＡを真核生物誘導性ベクターｐＩＮＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にサブクローニングした。制限酵素部位ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いてｐＩＮＤベクター内へのＰＤＥ７Ａ１触媒部位のサブクローニングを促進した。このクローンはｐＩＮＤ７Ａ（ １０１− ４５０ ）と命名した。
【０２１５】
ＥｃｒＣＨＯ細胞培養
二量体エクジソン受容体を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＥｃｒＣＨＯ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）を、１４６ｍｇ／Ｌ　Ｌ−グルタミン、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、１６μＭチミジン，１００μｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび５０μｇ／ｍｌのゼオシンを添加したＨａｍ’ｓ Ｆ−１２栄養混合物（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含有する完全生育培地中、５％二酸化炭素／９５％空気の雰囲気下３７℃で培養した。培地は３〜５日おきに交換し、細胞は１週間に１回の割合でトリプシン処理後１：２に分割した。
【０２１６】
トランスフェクション試験および安定な細胞系統の樹立
トランスフェクションの３日前にＥｃｒＣＨＯ細胞を７５ｃｍ２のフラスコ当たり１０６個の細胞密度でプレーティングした。製造元の取扱説明書（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に従ってリポフェクタミンを用いて内毒素非含有プラスミドＤＮＡ１０μｇで細胞をトランスフェクトした。４８時間インキュベートした後、細胞をトリプシン処理し、遠心分離により回収し、加圧選択のための選択抗生物質ゲネチシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を添加した完全生育培地中に再懸濁し、１０枚のペトリ皿に分割した。１週間後、ゲネチシン耐性クローンを単離した。ポナステロン誘導（１０μＭ、８時間）の後、各々につきＰＤＥ活性を測定する。非トランスフェクト細胞よりも高値のＰＤＥ７触媒活性を示すクローンを選択して未損傷の細胞中のｃＡＭＰ濃度に対するＰＤＥ７阻害剤の作用を試験する。
【０２１７】
触媒部位ＰＤＥ７を発現しているＣＨＯ細胞を１．５×１０６個／ｍｌ培地の濃度で２４穴プレートに播種した。プレートを９５％空気−５％ＣＯ２の湿潤雰囲気下に３７℃で４８時間インキュベートする。３６時間後、ポナステロン（１０μＭ）を培地に添加し、８時間の誘導時間を設ける。誘導時間の後、培地を吸引除去し、各ウェルをＰＢＳで洗浄する。候補分子は、試験すべき所望の濃度が得られるように１５０ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４中に希釈してウェルに添加する。次に細胞を穏やかに振とうしながら３７℃で３０分間インキュベートし、その後１５分間１０μＭフォルスコリン、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を添加する。活性化時間の後、プレートを氷上に保存し、０．２Ｍ　ＨＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、０．２ｍＭ　ＩＢＭＸよりなる停止溶液２００μｌを各ウェルに添加する。次に細胞を超音波処理により破砕し、反応の間に生産された細胞内ｃＡＭＰの測定を可能にした。
【０２１８】
ｃＡＭＰ測定
候補分子を投与した各細胞集団におけるｃＡＭＰ濃度をＥｕｒｏｍｅｄｅｘのＥＩＡキットを用いて評価した。このキットは０．１ＭＨＣｌで処理した試料中のｃＡＭＰの定量的測定のための競合的免疫試験法である。キットは、試料中のｃＡＭＰまたはｃＡＭＰを自らに共有結合させて保有しているアルカリホスファターゼ分子に競合的に結合するためにｃＡＭＰに対するポリクローナル抗体を使用している。各試料２８０μＬを９６穴プレートに移し、１５分間３５００ｒｐｍ、４℃で遠心分離することにより粒状画分から細胞質ゾルを分離した。次に沈殿物と分離した細胞質ゾル画分を「転移９６穴プレート」に移し、これを蛋白質とｃＡＭＰの測定まで氷上に保存した。各試料およびキットに含まれていたｃＡＭＰ標準曲線用の試料１９５μＬを１：１／２トリエチルアミン：無水酢酸混合物１０μｌでアセチル化し、競合的ｃＡＭＰ−ＥＩＡに付した。
【０２１９】
実施例６Ｂ：ＰＤＥ７阻害剤の二次スクリーニングの至適化：ＰＤＥ７触媒部位と遺伝子レポーターを同時発現する安定な細胞におけるＰＤＥ７阻害剤の二次スクリーニング
全細胞に対してＰＤＥ７阻害剤を調べるための細胞試験法を設定するために、ＣＲＥ４Ｘプロモーター下においてＰＤＥ７触媒ドメイン（活性型）およびレポーター遺伝子β−ラクタマーゼを同時発現する安定な細胞系統（ＥｃｒＣＨＯ）を創生した。ＣＲＥ４Ｘプロモーター下のレポーター遺伝子の組込みは、細胞に基づいた試験においてｃＡＭＰの測定を旨適化するものでなければならない。
前の試験により、ＰＤＥの過剰発現は細胞にとって致命的であることがわかっており、従って、哺乳類細胞における誘導性発現のためにｐＩＮＤベクターにＰＤＥ７（１０１−４５０）の触媒部位のｃＤＮＡをクローニングした。
【０２２０】
誘導性プロモーター下の触媒部位のサブクローニング
ヒトトランケートＰＤＥ７Ａ１（１０１−４５０）をコードするｃＤＮＡを真核生物誘導性ベクターｐＩＮＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にサブクローニングした。制限酵素部位ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いてｐＩＮＤベクター内へのＰＤＥ７Ａ触媒部位のサブクローニングを促進した。このクローンはｐＩＮＤ７Ａ（１０１−４５０）と命名した。新しい構築物はＲＴ−ＰＣＲにより得られ、突然変異がないことは配列決定により確認した。
【０２２１】
ＥｃｒＣＨＯ細胞培養
二量体エクジソン受容体を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＥｃｒＣＨＯ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１４６ｍｇ／Ｌ　Ｌ−グルタミン、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、１６μＭチミジン、１００μｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび２５０μｇ／ｍｌのゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｃａｔ　Ｒ２５０−０５）を添加したＨａｍ’ｓ Ｆ−１２栄養混合物（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含有する完全生育培地中、５％二酸化炭素／９５％空気の雰囲気下３７℃で培養した。培地は３〜５日おきに交換し、細胞は１週間に１回の割合でトリプシン処理後１：２に分割した。
【０２２２】
トランスフェクション試験および安定な細胞系統の樹立
トランスフェクションの３日前にＥｃｒＣＨＯ細胞を７５ｃｍ２のフラスコ当たり１０６個の細胞密度でプレーティングした。ｐＩＮＤ（ハイグロマイシン選択）中のＰＤＥ７（１０１−４５０）およびβ−ラクタマーゼ遺伝子（ネオマイシン選択）をＥｃｒＣＨＯ細胞に同時トランスフェクトした（ゼオシン選択）。
製造元の取扱説明書（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に従ってリポフェクタミンを用いて内毒素非含有プラスミド１０μｇで細胞をトランスフェクトした。４８時間インキュベートした後、選択抗生物質ゲネチシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ ｒｅｆ　１０１３１−０２７）８００μｇ／ｍｌおよびハイグロマイシンＢ３００μｇ／ｍｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ｃａｔ：８０６７−１）を添加した完全生育培地中で細胞を培養した。２週間後、ゲネチシンおよびハイグロマイシン耐性クローンを４時間１０μＭのフォルスコリンで処理する。β−ラクタマーゼ遺伝子を発現している細胞をＦａｃｓを用いて９６穴中で単離する。
【０２２３】
３週間後、ゲネチシンおよびハイグロマイシン耐性のクローンを選択する。ＰＤＥ活性はポナステロンＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃａｔ　Ｈ１０１−０１）誘導（１０μＭ、８時間）の後に各々につき測定する。非トランスフェクト細胞より高値のＰＤＥ７触媒活性を示すクローンを選択し、各々における遺伝子レポーターの発現濃度を測定することにより、未損傷の細胞中のＰＤＥ７阻害剤の作用を試験するのに最も適するものを選択する。
【０２２４】
細胞をリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、トリプシン処理し、遠心分離により回収し、終濃度で２ｍＭベンズアミジン、２μｇ／ｍｌダイズトリプシン阻害剤、５０μＭ　ＰＭＳＦおよび１００μｇ／ｍｌバシトラシンの蛋白質分解酵素阻害剤の混合物を添加したＰＤＥ抽出緩衝液（Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ ２０ｍＭ（ｐＨ６．５），　ＥＤＴＡ １０ｍＭ，ＤＴＴ ２．５Ｍ）３００μＬ中に再懸濁した。細胞を超音波処理し、１４０００ｇで２０分間遠心分離し、得られた上澄みのｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性を分析した。
【０２２５】
ホスホジエステラーゼ試験
ＰＤＥ活性は５′ヌクレオチドがアルミナに極めて強固に結合するが環状ヌクレオチドは中性または僅かにアルカリ性のｐＨで容易に溶離する観察条件を用いてＳｍｉｔｈ等の記載した方法の変法を用いて調べた。試験は総容量２００μｌで３７℃で９６穴プレート中で行なった。各ウェルには試験緩衝液（終濃度で４０ｍＭトリス塩酸；ｐＨ８；０．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２；４ｍＭβ−メルカプトエタノール；１０ｎＭ［３Ｈ］ｃＡＭＰおよび１μＭｃＡＭＰ）および発現された蛋白の活性に応じて希釈したＣＨＯ溶解物上澄み１０μＬを入れた。６０分のインキュベートの後、ＴＦＡ（０．５％）中１μＭ［１４Ｃ］ＡＭＰを添加することにより反応を停止した。アルミナ５０ｍｇを充填した膜底部を有するマイクロプレート（Ｓｉｌｅｎｔ Ｍｏｎｉｔｏｒ，Ｎａｌｇｅｎ Ｎｕｎｃ）を０．１Ｍ　ＴＥＳ−ＮａＯＨ，ｐ８．０で平衡化した。次に反応混合物をこれらのカラムに適用した。未加水分解ｃＡＭＰを平衡化緩衝液３ｍｌで溶離した。次に［３Ｈ］ｃＡＭＰおよび［１４Ｃ］ＡＭＰを２ｍＭ　ＮａＯＨで直接、アルカリ適合性シンチラント（Ｕｌｔｉｍａ ｇｏｌｄ，Ｐａｃｋａｒｄ）の入ったシンチレーションバイアルに溶出させた。分離した［３Ｈ］ｃＡＭＰを分離および非分離の［１４Ｃ］値を用いて回収率に付いてバックグラウンド補正し、全［３Ｈ］ｃＡＭＰの分数として表示し、加水分解された基質の量を求めた。
【０２２６】
触媒部位ＰＤＥ７を発現するＥｃｒＣＨＯ７細胞におけるβ−ラクタマーゼ発現　細胞を１．３×１０５または２．６×１０５個／ｍｌ培地の濃度で９６穴プレートに播種した。プレートを　９５％空気−５％ＣＯ２の湿潤雰囲気下に３７℃で１．３×１０５の濃度または２．６×１０５個／ｍｌの濃度となるまで２４時間または８時間それぞれインキュベートする。８〜２４時間の後、ポナステロン（１０μＭ、１００％エタノールに溶解した１ｍＭ保存溶液）を培地に添加して１６時間の誘導時間を設ける。誘導時間の後、培地を吸引除去し、各ウェルをＰＢＳで洗浄する。候補分子は、試験すべき所望の濃度が得られるようにＨａｍ’ｓ Ｆ−１２栄養混合物（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含有する生育培地で希釈してウェルに添加する。５０ｎＭフォルスコリン（Ｓｉｇｍａ ｃａｔ：Ｆ６８８６）、アデニレートサイクラーゼ活性化剤の存在下に化合物を試験する。陽性対照は５０ｎＭのフォルスコリンの存在下の５００μＭのＩＢＭＸとする。陰性対照は５０ｎＭのフォルスコリンのみとする。次に細胞を３７℃で４時間インキュベートする。活性化時間の後、細胞に溶液Ｂ（６０μｌ）および溶液Ｃ（１ｍｌ）で希釈した基質ＣＣＦ４（１２μｌ）を添加する。この溶液２０μＬを各ウェルに添加する。細胞を２５℃で１時間３０分遮光しながらインキュベートする。ＰＤＥ阻害剤処理によりもたらされた細胞内ｃＡＭＰの増大の測定はβ−ラクタマーゼの発現の誘導と相関する。
【０２２７】
β−ラクタマーゼ発現測定
候補分子を投与した各細胞集団におけるｃＡＭＰ濃度は細胞内のｃＡＭＰ濃度に感受性の遺伝子レポーター発現β−ラクタマーゼを用いて評価した。
結果
Ｆａｃｓを用いたクローンの選択
トランスフェクション１０日後、フォルスコリン投与後にβ−ラクタマーゼを発現している細胞をＦＡＣＳを用いてクローニングした。ネオマイシン、ゼオシンおよびハイグロマイシン耐性の２５クローンを取得し、ポナステロン誘導後の各々のＰＤＥ７活性を測定した。
【０２２８】
β−ラクタマーゼ遺伝子を発現するＥｃｒＣＨＯ細胞におけるＰＤＥ７活性
ポナステロン誘導（８時間、１０μＭ）の後にＰＤＥ７酵素を発現している３クローンを選択した。総ＰＤＥ活性は非トランスフェクト細胞の３〜６倍高値であった。ＰＤＥ７活性はＰＤＥ７阻害剤およびＰＤＥ４阻害剤（ロリプラム、６０μＭ）を用いて測定した。
【０２２９】
レポーター遺伝子（β−ラクタマーゼ）の発現
β−ラクタマーゼ発現はフォルスコリン（５０ｎＭ〜５０μＭ）刺激後に各クローンについて評価した（図１０）。ＰＤＥ阻害剤を試験するための基礎ｃＡＭＰ濃度を増大させるために、フォルスコリンの未最大濃度（５０ｎＭ）を選択した。ＰＤＥ７阻害剤およびロリプラムの濃度曲線を種々の細胞濃度（１５０００および２００００個／ウェル；および３００００および４００００個／ウェル）において３クローンにつき求めた。図１１はクローンの１つにおいて得られた結果を示す。予備試験により、β−ラクタマーゼ発現に対してＰＤＥ７阻害剤は濃度依存性があるが、ＰＤＥ４阻害剤の作用はないことがわかっている。
【０２３０】
実施例７：ＰＤＥ７ノックアウトトランスジェニックマウスを作成するために設計された本発明の相同組み換えベクターの構築
ヒトＰＤＥ７Ａ１およびＰＤＥ７Ａ２は高親和性ｃＡＭＰ特異的ＰＤＥ７Ａ酵素のスプライス型である。示差的スプライシングにより、Ｎ末端ペプチド配列の２種の変異体（ＰＤＥ７Ａ１：Ｍ１−Ｑ４６、ＰＤＥ７Ａ２：Ｍ１−Ｋ２０）が得られ、そして、それは代替コードエクソン使用の結果である（Ｂｌｏｏｍ等、１９９６；Ｈａｎ等，１９９７）。
酵素の触媒ドメインに影響するＰＤＥ７Ａ１のＱ４６およびＰＤＥ７Ａ２のＫ２０の３′側のスプライス変異体は報告されておらず；この点を超えたヌクレオチドおよびペプチド配列はＰＤＥ７Ａ１およびＰＤＥ７Ａ２と同一である。
従ってＰＤＥ７Ａの触媒作用に重要なドメインおよびＰＤＥ７Ａの下流部分を相同組み換えによりマウスＥＳ細胞におけるターゲティングのために選択した。
ヒトＰＤＥ７Ａの触媒作用に重要な領域は上記した実施例において決定している。
【０２３１】
相同組み換えベクター（ターゲティングベクター）の構築
重要な触媒領域の内部でありマウスとヒトとの間で高度に保存されているエクソンをコードする２．４ｋｂのＣ５７ＢＬ／６マウスＥｃｏＲＩゲノムフラグメントを１３３Ｏ２０ＢＡＣクローンから調製したＥｃｏＲＩミニライブラリからクローニングした（ＲＰＣＩ−２３／Ｃ５７ＢＬ／６マウスＢＡＣライブラリ、Ｐｉｅｔｅｒ ＤｅＪｏｎｇ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）。プローブは放射標識オリゴヌクレオチド（プローブＣ　１１００−１１７７＊−配列番号９）とした。
２．４ｋｂのＥｃｏＲＩゲノムフラグメント上にある、配列決定により同定されたエクソンおよびスプライス部位の配列を図８に示す。ターゲティングベクターの構築のために、３′側隣接５．１ｋｂ　ＥｃｏＲＩゲノムフラグメントを放射標識オリゴヌクレオチドプローブ（プローブＤ　１２６７−１２９７＊ −配列番号１０）を用いてクローニングし、部分的に配列決定した。配列の分析によれば、このフラグメントは３′隣接エクソンの全てを含んでいることがわかった。
【０２３２】
５．１ＫｂのＥｃｏＲＩフラグメントはターゲティングベクターの３′相同アームとして機能する。５′相同アームを得るために、ＰＣＲのプライマー（アッパープライマー−Ａ，４９４−５１３−配列番号７、ロアープライマー−Ｂ　８３１−８０７＊−配列番号８）を合成し、ＰＣＲ反応で用いて２．４ＫｂのＥｃｏＲＩフラグメントの上流の２．７５Ｋｂのゲノムフラグメントを増幅した。２．７５Ｋｂのフラグメントを１３３Ｏ２０　ＢＡＣ　ＤＮＡより増幅した。
同様の方法を用いて５′および３′相同アーム（それぞれ５．０および２．７５ｋｂ）を１２９マウス系統のゲノムより得た。これらの実験において、１２５　Ｂ　２２　ＢＡＣクローンを用いたが、これはＣ５７ＢＬ６系統に関する上記したＲＰＣＩ−２２　ＢＡＣライブラリからクローニングした。
＊　数はマウスＰＤＥ７Ａ２ｃＤＮＡ（配列番号１１）のヌクレオチド番号を参照。
【０２３３】
２つの相同アームをｐＳＶ−ｌｏｘＰベクターに挿入する事により図１４（Ｃ５７ＢＬ／６ベクター）および図１５（１２９ベクター）に示すターゲティングベクターを作成した。
Ｃ５７ＢＬ／６に含まれるＰＤＥ７の触媒部分は配列番号３５の配列を有している。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける所望のターゲティング現象を確認するために、サザンブロット法を開発した。これらの試験は野生型の対立遺伝子は未損傷のままとしながら全体のベクターのランダムな組込みから各アームの相同組み換えを識別する。５′相同アームの組み換えを検出するために、オリゴ１およびオリゴ２を用いてＰＣＲにより４００ｂｐのプローブを作成した。オリゴヌクレオチド配列１（ＧＧＧＴＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＣＴＣＣＡ、配列番号３１）および２（ＧＣＣＡＣＣＡＣＡＣＴＣＴＧＣＴＣＴ、配列番号３２）はＢＡＣクローンの配列決定により得られたアームから上流のＤＮＡ配列に基づいて設計した。同様にして、３′相同アームの下流の以下のオリゴ、即ち、３（ＡＡＡＡＡＣＴＡＡＣＴＡＡＣＴＡＡＣＴＡＡＡ、配列番号３３）および４（ＣＴＴＣＴＡＴＡＣＡＴＴＧＧＣＴＴＧＡＴＴＧ、配列番号３４）を用いてＰＣＲにより６００ｂｐのプローブを作成した。これらのプローブは以下の表２に示す制限酵素の選択されたセットを用いたサザンブロット実験において組み換え体から野生型対立遺伝子を識別すると期待される。
【０２３４】
【表２】
サイズはｋｂで表し、２とおりのサイズはＷＴ／ＫＯで表示する。
Figure 2004509640
【０２３５】
ターゲティング現象が成功すればＰＤＥ７Ａ酵素活性に不可欠のペプチド配列を欠いた突然変異体のＰＤＥ７Ａ対立遺伝子が生成すると予測される。
【０２３６】
ＰＤＥ７のノックアウトマウスを作成するためのベクターの使用
エレクトロポレーションまたは他の方法によりターゲティングベクターをＥＳ細胞に導入する。ネオマイシン耐性コロニーにつき、特異的ターゲティング現象が同定されるものを選別する。
実験の可能性のある変異体において、ＥＳ細胞における一過性のＣｒｅリコンビナーゼの発現を用いて、ｌｏｘＰフランキングＴＮ−５ネオマイシン耐性遺伝子をターゲティングされた対立遺伝子より除去する。
ターゲティングされた対立遺伝子を有するＥＳ細胞のコロニーが同定された後、胚盤胞にこれらのコロニーからＥＳ細胞を注入する。
高水準のＥＳ細胞寄与度を示しているマウスをコートカラー試験によりスクリーニングし、育種および尾部ＤＮＡ試験により生殖系列伝達マウスを選択する。半接合のターゲティングされたマウス（ＰＤＥ７Ａ−／＋）が得られた後、これらを、育種により作成したホモ接合のヌル対立遺伝子（ＰＤＥ７Ａ−／−）マウス（生存している場合）とともに生物学的実験において試験する（Ｇｅｎｅ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９３，Ｅｄ．Ａ．Ｌ．Ｊｏｙｎｅｒ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ参照）。
【０２３７】
更に別の実験において、２．４ｋｂのゲノムフラグメントをＬｏｘＰ部位に隣接させ、５′および３′の相同アームの間にそのゲノム状態において導入する。片方のＬｏｘＰ部位の内側に、Ｔｎ−５　ｎｅｏカセットも導入する。ホモ接合の挿入要請マウスを作成し、組織特異的Ｃｒｅリコンビナーゼ発現トランスジェニックマウスと交配する。この実験の予測される結果はＰＤＥ７遺伝子の組織特異的な欠失である。Ｃｒｅリコンビナーゼが誘導性プロモーターにより制御される場合、ＰＤＥ７Ａの欠失は誘導可能である。
プローブおよびＰＣＲプライマー：
プライマー−Ａ： ＡＡＡＴＧＧＡＡＡＴＡＧＴＣＴＡＧＴＡＡ　（配列番号７）
プライマー−Ｂ： ＡＡＴＴＣＴＴＧＴＡＴＡＡＡＧＴＴＧＣＴＡＧＡＴＡ　（配列番号８）
プローブ−Ｃ： ＡＣＡＴＧＧＧＴＴＡＣＡＡＡＴＡＴＣＡＧＣＡＣＡ　（配列番号９）
プローブ−Ｄ： ＣＴＴＴＡＴＴＴＡＣＡＧＡＧＴＧＧＧＣＣＡＧＧＴＴＴＴＣＡＧＣ （配列番号１０）
【０２３８】
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【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
ヒトＰＤＥ７イソ型の２種、即ちＰＤＥ７Ａ（ｈ７Ａ１．ＰＲＯと表示）およびＰＤＥ７Ａ２（ｈ７Ａ２．ＰＲＯと表示）、並びにマウスＰＤＥ７Ａ２（ｍｏｕ７Ａ２．ＰＲＯと表示）およびラットＰＤＥ７Ａ１（ｒａｔ７．ａ．ＰＲＯと表示）の蛋白質のアミノ酸配列の間のアライメントを示す。
【図１Ｂ】
図１Ａの続きである。
【図２】
本発明に従って得られた異なるトランケートされたＰＤＥ７蛋白質の構造を示す。上段はヒトＰＤＥ７Ａ１の完全長イソ型を示す。他の例は種々の試験したトランケート蛋白質を示す。左側に示した数字は完全長ＰＤＥ７Ａ１蛋白質と照合させた蛋白質のＮ末端およびＣ末端のアミノ酸残基を示す。
【図３】
図２で示した種々のＰＤＥ７トランケート蛋白質を発現するために用いられている組み換えベクターＰｃＤＮＡ４ＨｉｓＭａｘ　Ａを示す。
【図４】
組み換えＣＨＯ細胞系統およびＳｆ２１組み換え細胞系統によるＰＤＥ７Ａ１の発現の結果を示す。
「模倣（ｍｏｃｋｅｄ）ＣＨＯ」とは空の組み換えベクターによりトランスフェクトされているＣＨＯ細胞を示す。
【図５】
それぞれ、空のベクターで、または、ＰＤＥ４Ｂ２蛋白質、ＰＤＥ７Ａ１蛋白質、至適Ｋｏｚａｋ配列を有するインサートをコードするＰＤＥ７Ａ１またはｃＤＮＡの５′および３′のＵＴＲを有するインサートをコードするＰＤＥ７Ａ１をコードするインサート含むベクターでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を用いて得られたホスホジエステラーゼ触媒活性を示す。
【図６】
空のベクター（対照）、ＰＤＥ４Ｂ２蛋白質、完全長ＰＤＥ７Ａ１蛋白質または１３−４８３、３１−４８３、６１−４８３、８１−４８３、１０１−４８３および１７１−４８３トランケート蛋白質（数は完全長ＰＤＥ７Ａ１酵素配列と照合）をコードするベクターによりそれぞれトランスフェクトされた組み換えＣＨＯ細胞により発現されたホスホジエステラーゼ触媒活性を示す。
【図７】
空のベクター（対照）、ＰＤＥ４Ｂ２蛋白質、ＰＤＥ７Ａ１完全長蛋白質または１０１−４８３、１２１−４８３、１４１−４８３、１０１−４８３、１０１−４５０、１０１−４２０および１０１−４３０トランケートＰＤＥ７Ａ１ポリペプチド（数は完全長ＰＤＥ７Ａ１酵素配列と照合）をコードするベクターによりそれぞれトランスフェクトされた組み換えＣＨＯ細胞により発現されたホスホジエステラーゼ触媒活性を示す。
【図８】
ＰＤＥ７ノックアウトマウスを作成するために用いることができる相同組み換えのためのターゲティングベクターの構築を示す。
【図９】
ＣＨＯトランスフェクト細胞における組み換えヒトＰＤＥ７Ａ発現のトランケート型のウエスタンブロット分析を示す。
【図１０】
種々の濃度におけるフォルスコリンの存在下のＰＤＥ７触媒部位の好ましい実施態様を発現する種々のＥｃｒＣＨＯクローンにおけるβ−ラクタマーゼの発現の用量応答を示す。
【図１１】
ＰＤＥ７触媒部位の好ましい実施態様を発現する種々のＥｃｒＣＨＯクローン２０（３００００細胞）（ｎ＝２、即ち実験は２回実施した）におけるβ−ラクタマーゼの発現の測定を示す。
【図１２】
完全長ヒトＰＤＥ７Ａ１の第１のＮ末端１００アミノ酸（Ｎｔｅｒ７Ａ１）をコードする核酸のトランスフェクションを行った場合と行わない場合の完全長ヒトＰＤＥ７Ａ１（Δ１００７Ａ１）のアミノ酸配列１０１−４８３に相当するＰＤＥ７突然変異体をコードする核酸でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞におけるＰＤＥ活性を示す。
【図１３】
ＰＤＥ７触媒部位の好ましい実施態様をコードする核酸配列によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（リポフェクタミン）においてＰＤＥ活性を測定したものを示す。
【図１４】
ＰＤＥ７ノックアウトＣ５７ＢＬ／６マウスを作成するために用いることができる相同組み換えのためのターゲティングベクターを示す。
【図１５】
ＰＤＥ７ノックアウト１２９マウスを作成するために用いることができる相同組み換えのためのターゲティングベクターを示す。

Claims (66)

  1. 最初のＡＴＧコドンから残基８１（Ｌ２２Ｍ２）までの配列の逐次的欠失により発生するＨＣＰ１のＮＨ２末端欠失よりなる配列としてミカエリ等（Ｍｉｃｈａｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，１２９２５−１２９３２）により開示されたアミノ酸配列を例外としてＰＤＥ７の触媒ドメインを少なくとも有する、内因性完全長ＰＤＥ７蛋白のホスホジエステラーゼ触媒活性より少なくとも約６倍、好ましくは約８または１０倍、最も好ましくは１５〜２０倍高値のホスホジエステラーゼ触媒活性を保有するポリペプチド。
  2. ホスホジエステラーゼ７触媒ドメインを保有し、そして、配列番号１、２または３のアミノ酸配列よりなる群から選択される配列の連続するアミノ酸少なくとも３１２個を有する、約４２７アミノ酸長までの請求項１記載のポリペプチド；またはその相同ポリペプチド。
  3. 配列番号１、２または３の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４位に位置するアミノ酸残基から始まり、
    配列番号１、２または３の３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７位に位置するアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する請求項２記載のポリペプチド；またはその相同ポリペプチド。
  4. 配列番号１、２または３の５位のアミノ酸残基で始まり、４２７位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する請求項３記載のポリペプチド；またはその相同ポリペプチド。
  5. 配列番号１、２または３の２５位のアミノ酸残基で始まり、４２７位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する請求項３記載のポリペプチド；またはその相同ポリペプチド。
  6. 配列番号１、２または３の４５位のアミノ酸残基で始まり、４２７位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する請求項３記載のポリペプチド；またはその相同ポリペプチド。
  7. 配列番号１、２または３の５位のアミノ酸残基で始まり、３９４位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する請求項３記載のポリペプチド；またはその相同ポリペプチド。
  8. 配列番号１、２または３の２５位のアミノ酸残基で始まり、３９４位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する請求項３記載のポリペプチド；またはその相同ポリペプチド。
  9. 配列番号１、２または３の４５位のアミノ酸残基で始まり、３９４位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する請求項３記載のポリペプチド；またはその相同ポリペプチド。
  10. 請求項１〜９の何れか１項に記載のポリペプチドと少なくとも８０％の相同性または同一性、好ましくは８５％の相同性または同一性を有するポリペプチド。
  11. 請求項１〜９の何れか１項に記載のポリペプチドと少なくとも９０％の相同性または同一性、好ましくは９５％の相同性または同一性、最も好ましくは９９％の相同性または同一性を有するポリペプチド。
  12. 最初のＡＴＧコドンから残基８１（Ｌ２２Ｍ２）までの配列の逐次的欠失により発生するＨＣＰ１のＮＨ２末端欠失よりなる配列としてミカエリ等（Ｍｉｃｈａｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，１２９２５−１２９３２）により開示されたアミノ酸配列を例外として、完全長ＰＤＥ７（Ａ）蛋白質のアミノ酸５７〜１００の間のアミノ酸で始まり、アミノ酸４５０〜４８３の間で終わる、アミノ酸配列を有するポリペプチド。
  13. ＰＤＥ７Ａ蛋白質がヒトＰＤＥ７Ａ１またはＰＤＥ７Ａ２である請求項１２記載のポリペプチド。
  14. 請求項１〜１３の何れか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列またはそれに相補的な配列。
  15. 配列番号４、５または６の核酸配列よりなる群から選択される請求項１４記載の核酸配列；またはそれに相補的な配列。
  16. 請求項１４〜１５記載の核酸配列の欠失の後に残存する完全長ＰＤＥ７（Ａ）の配列の部分を有する核酸配列。
  17. ゲノム起源の請求項１４〜１６の何れか１項に記載の核酸配列。
  18. 欠失した核酸部分が異種ポリヌクレオチド配列により置き換えられている請求項１６または１７に記載の核酸配列。
  19. ＰＤＥ７（Ａ）がヒト、マウスまたはラット起源、最も好ましくはヒト起源のものである、請求項１〜１３の何れか１項に記載のポリペプチドまたは、請求項１４〜１８の何れか１項に記載の核酸配列。
  20. 異種ポリヌクレオチドが選択マーカーを有する請求項１８記載の核酸。
  21. 異種ポリヌクレオチドがその５′末端に少なくともｌｏｘＰ配列およびその３′末端に少なくともｌｏｘＰ配列を有する請求項１８記載の核酸。
  22. 請求項２のポリペプチドをコードする核酸配列が調節配列に作動可能に連結している請求項１４〜２１の何れか１項に記載の核酸。
  23. 調節配列が誘導性プロモーターよりなる請求項２２記載の核酸。
  24. 調節配列がポナステロンのようなインデューサーにより誘導可能なプロモーターよりなる請求項２３記載の核酸。
  25. 請求項１４〜２４に記載の核酸配列を有する組み換えベクター。
  26. 請求項１４〜２４に記載の核酸を有する組み換え宿主細胞。
  27. 請求項２５記載の組み換えベクターを有する組み換え宿主細胞。
  28. 真核生物である請求項２６または２７に記載の組み換え宿主細胞。
  29. 接合体、胚、胎仔または成体の多能性幹細胞、哺乳類の分割球または胚盤胞に由来する組み換え宿主細胞およびＥＳ細胞よりなる組み換え宿主細胞の群から選択される請求項２６〜２８の何れか１項に記載の組み換え宿主細胞。
  30. 請求項１４〜２４の何れか１項に記載の核酸の欠失の後に残存する完全長ＰＤＥ７の部分を伴った配列を有するポリヌクレオチド構築物を有するベクターの使用により発生したノックアウト動物であって、該構築物が即ちこの動物のゲノム内の天然のＰＤＥ７配列の部分を置き換えている、上記動物。
  31. 哺乳類起源の請求項３０記載のノックアウト動物。
  32. ネズミまたはラット起源の請求項３１記載のノックアウト動物。
  33. 請求項１〜１３に記載のポリペプチドの製造方法であって、下記工程：
    ａ）請求項２６〜２９に記載の組み換え宿主細胞を適切な培地中で培養すること、
    ｂ）このように条件付けされた培地を採取すること、または、組み換え宿主細胞を溶解すること；
    ｃ）該培地から、または、得られた細胞溶解物から、上記のとおり製造されたポリペプチドを分離または精製すること、
    を有する上記方法。
  34. ＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニング方法であって、該方法は下記工程：
    ａ）請求項１〜１３に記載のポリペプチドの所望の量を準備すること；
    ｂ）工程ａ）において準備したポリペプチドの所望の量を試験すべき候補化合物の所望の量を含有する緩衝溶液に添加すること；
    ｃ）ホスホジエステラーゼ酵素活性を測定すること；および、
    ｄ）工程ｃ）で得られた測定値酵素活性を候補化合物の非存在下に得られた酵素活性と比較すること
    を包含する上記方法。
  35. 工程ａ）で準備したポリペプチドが配列番号１の４５位のアミノ酸残基で始まり、４２７位のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列またはその相同ポリペプチドよりなる請求項３４記載の方法。
  36. ポリペプチドが請求項１４〜２４に記載の核酸により、または、請求項２５記載の組み換えベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞の細胞溶解物に由来する請求項３４または３５記載の方法。
  37. ホスホジエステラーゼ触媒活性がｃＡＭＰの加水分解の水準として測定される請求項３４または３６記載の方法。
  38. ＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニング方法であって、該方法が下記工程：
    ａ）適切な培地中で請求項２６〜２９に記載の組み換え宿主細胞を培養すること；
    ｂ）試験すべき候補化合物の所望の濃度を該培地に添加すること；
    ｃ）細胞内ホスホジエステラーゼ酵素活性を測定すること；および、
    ｄ）工程ｃ）で得られた酵素活性を工程ｂ）を省略した場合に得られる酵素活性と比較すること
    を包含する上記工程。
  39. 組み換え宿主細胞が２量体エクジソン受容体を発現するＣＨＯ細胞系統よりなる請求項３８記載の方法。
  40. 誘導性調節配列に作動可能に連結した請求項１〜１３に記載のポリペプチドをコードする核酸を有する組み換えベクターで組み換え宿主細胞がトランスフェクトされている請求項３８記載の方法。
  41. 調節配列がインデューサーにより誘導可能である請求項４０記載の方法。
  42. インデューサーがポナステロンである請求項４１記載の方法。
  43. 工程ｂ）の前に、組み換え宿主細胞を、工程ａ）の間に誘導性調節配列を活性化するインデューサーの存在下に培養する請求項３８〜４２の何れか１項に記載の方法。
  44. アデニレートサイクラーゼ活性化物質を工程ｂ）の終了時、停止溶液の添加前に添加する請求項３８〜４３の何れか１項に記載の方法。
  45. 工程ｂ）の間に生成した細胞内ｃＡＭＰの量の測定を介して細胞溶解後にホスホジエステラーゼ酵素活性を測定する請求項３８〜４４の何れか１項に記載の方法。
  46. ＰＤＥ７活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニング方法であって、該方法が下記工程：
    ａ）適切な培地中に請求項１〜１３の何れか１項に記載のポリペプチドおよびレポーター遺伝子を同時発現する組み換え宿主細胞を準備すること；
    ｂ）試験すべき候補化合物の所望の濃度を該培地に添加すること；
    ｃ）レポーター遺伝子発現を測定すること；および、
    ｄ）工程ｃ）で得られた酵素活性を工程ｂ）を省略した場合に得られる酵素活性と比較すること
    を包含する上記方法。
  47. 組み換え宿主細胞が２量体エクジソン受容体を発現するＣＨＯ細胞系統よりなる請求項４６記載の方法。
  48. 誘導性調節配列に作動可能に連結した請求項１〜１３に記載のポリペプチドをコードする核酸を有する組み換えベクターで組み換え宿主細胞がトランスフェクトされている請求項４６または４７に記載の方法。
  49. 調節配列がポナステロンのようなインデューサーにより誘導可能である請求項４８記載の方法。
  50. 工程ｂ）の前に、組み換え宿主細胞を、工程ａ）の間に誘導性調節配列を活性化するインデューサーの存在下に培養する請求項４６〜４９の何れか１項に記載の方法。
  51. アデニル酸シクラーゼ活性化物質を工程ｂ）の終了時、停止溶液の添加前に添加する請求項４６〜５０の何れか１項に記載の方法。
  52. レポーター遺伝子がβ−ラクタマーゼ遺伝子である請求項４６〜５１の方法。
  53. ＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ触媒活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニングのためのキットであって、該キットが下記成分：ａ）請求項１〜１３記載のポリペプチド；
    ｂ）場合により、ホスホジエステラーゼ触媒活性測定を行なうために必要な試薬；
    を包含する上記キット。
  54. ＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニングのためのキットであって、該キットが下記成分：
    ａ）請求項２６〜２９記載の組み換え宿主細胞；
    ｂ）場合により、ホスホジエステラーゼ触媒活性測定を行なうために必要な試薬；
    を包含する上記キット。
  55. ＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物のインビトロのスクリーニングのためのキットであって、該キットが下記成分：ａ）請求項１〜１３記載のポリペプチドおよびレポーター遺伝子を同時発現する本発明の組み換え宿主細胞；
    ｂ）場合により、レポーター遺伝子発現測定を実施するために必要な試薬；
    を包含する上記キット。
  56. ＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物をインビトロで選択するための方法であって、該方法が下記工程：
    ａ）候補化合物を用いて請求項３４〜３７に記載の方法を実施すること；および、該候補化合物がホスホジエステラーゼ活性を阻害することがわかった場合は、次に、
    ｂ）工程ａ）で選択された阻害剤化合物を用いて請求項３８〜５２に記載の方法を実施すること；
    を包含する上記方法。
  57. ＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ活性を選択的に阻害する化合物を選択するための方法であって、該方法が下記工程：
    ａ）請求項３４〜３７、３８〜５２および５６に記載の方法を実施することによりＰＤＥ７ホスホジエステラーゼ活性を阻害する化合物を選択すること；および、
    ｂ）ＰＤＥ７以外のＰＤＥ酵素の少なくとも１つのホスホジエステラーゼ活性を阻害する能力がないことを、選択された阻害剤化合物について調べること；
    を包含する上記方法。
  58. ＰＤＥ３およびＰＤＥ４酵素のホスホジエステラーゼ活性を阻害する能力がないことを、選択された阻害剤について調べる、請求項５７記載の方法。
  59. ＰＤＥ１、ＰＤＥ２、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４、ＰＤＥ５およびＰＤＥ６酵素のホスホジエステラーゼ活性を阻害する能力がないことを、選択された阻害剤について調べる、請求項５７記載の方法。
  60. 請求項３４〜３７、３８〜５２、５６および５７〜５９に記載の方法に従って選択されたホスホジエステラーゼ阻害剤化合物。
  61. 医薬組成物の製造のための請求項３４〜３７、３８〜５２、５６および５７〜５９に記載の方法に従って選択されたホスホジエステラーゼ阻害剤化合物の使用。
  62. ヒトまたは動物の治療、診断または手術において使用するための医薬組成物の製造のための請求項３４〜５２および５６〜５９の何れか１項に記載の方法により入手可能、同定可能、選択可能または特性化可能な化合物の使用。
  63. ヒトまたは動物の治療、診断または手術において使用するための医薬組成物の製造のための請求項３４〜５２および５６〜５９の何れか１項に記載の方法により入手、同定、選択または特性化される化合物の使用。
  64. 免疫系に影響する疾患、例えば、ＡＩＤＳ、移植片拒絶反応、自己免疫疾患、例えばＴ細胞関連疾患、例えば慢性関節リューマチ；炎症性疾患、例えば呼吸器炎症性疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息；胃腸炎症性疾患、例えばクローン病、結腸炎、膵臓炎、並びに白血病を含む種々の癌のような種々の病理学的状態の治療または予防のための医薬組成物の製造のための、請求項３４〜５２および５６〜５９の何れか１項に記載の方法により入手、同定、選択または特性化される化合物の使用。
  65. 免疫系に影響する疾患、例えば、ＡＩＤＳ、移植片拒絶反応、自己免疫疾患、例えばＴ細胞関連疾患、例えば慢性関節リューマチ；炎症性疾患、例えば呼吸器炎症性疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息；胃腸炎症性疾患、例えばクローン病、結腸炎、膵臓炎、並びに白血病を含む種々の癌のような種々の病理学的状態の治療または予防のための医薬組成物の製造のための請求項３４〜５２および５６〜５９の何れか１項に記載の方法により入手可能、同定可能、選択可能または特性化可能である化合物の使用。
  66. 免疫系に影響する疾患、例えば、ＡＩＤＳ、移植片拒絶反応、自己免疫疾患、例えばＴ細胞関連疾患、例えば慢性関節リューマチ；炎症性疾患、例えば呼吸器炎症性疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息；胃腸炎症性疾患、例えばクローン病、結腸炎、膵臓炎、並びに白血病を含む種々の癌のような種々の病理学的状態の治療または予防のための化合物の合成における、請求項３４〜５２および５６〜５９の何れか１項に記載の方法により入手、同定、選択または特性化される化合物の使用。
JP2002530718A 2000-09-28 2001-09-28 Ｐｄｅ７活性を示すポリペプチドおよびｐｄｅ７酵素活性を阻害する化合物を選択するためのその使用 Abandoned JP2004509640A (ja)

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