JP2005526516A - ヒト精神分裂病における欠損遺伝子１のマウスオルソログ - Google Patents
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Abstract
本発明は、Ｄｉｓｃ１ポリペプチド、Ｄｉｓｃ１核酸及び組換えＤｉｓｃ１改変マウスに関する。配列番号１のＤｉｓｃ１アミノ酸配列及び配列番号２の核酸配列はヒトＤＩＳＣ１アミノ酸配列及び核酸配列に対するマウスオルソログを提供する。
Description
本明細書中に引用されている文献は本発明に対する従来技術とは認められない。
精神分裂病は、思考の障害、幻覚及び認識機能不全により特徴づけられる重度の精神障害である（Ｆｒａｎｃｅｓら編，「精神病の診断及び統計マニュアル(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders)」，第４版，ワシントン・ディー・シーに所在のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（１９９４年）発行）。家族、双生児及び養子の研究で、精神分裂病を発症する危険の〜５０％が遺伝性であることが示唆された。
ヒト精神分裂病における欠損（ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ−ｉｎ−ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ）１（ＤＩＳＣ１）及び精神分裂病における欠損２（ＤＩＳＣ２）遺伝子は精神病に対する感受性において役割を果たし得る遺伝子として同定されている（Ｍｉｌｌａｒら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，９（９）：１４１５−１４２３（２０００））。
ＤＩＳＣ１及びＤＩＳＣ２遺伝子異常は精神分裂病及び関連疾患に関連している。スコットランド人一族では、ＤＩＳＣ１オープンリーディングフレームは平衡（１：１１）（ｑ４２．１；ｑ１４．３）転座により短小化されていることが判明した。この一族では、転座は精神分裂病を区別するだけでなく、分裂情緒的異常症、双極性異常症や単極性異常症のような他の主要な精神病を区別している。この観察された家族性疾患群は突発性精神分裂病の典型的なものである（Ｍｉｌｌａｒら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，９（９）：１４１５−１４２３（２０００））。
精神病において役割を果たしているＤＩＳＣ１についての追加の支持が染色体上の位置に関してある。ＤＩＳＣ１は、染色体マーカーＤＩＳ２５１の次に位置づけられることが知見され、このことはＤＩＳＣ１が精神病に関与している領域に配置されていることを示す（Ｍｉｌｌａｒら，Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，６（２）：１７３−１７８（２００１））。
ＤＩＳＣ１は３００ｋｂであると推定され、１３エキソンを含む（Ｍｉｌｌａｒら，Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，６（２）：１７３−１７８（２００１））。ＤＩＳＣ１の同定されたオープンリーディングは８５４アミノ酸の推定タンパク質をコードする（Ｍｉｌｌａｒら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，９（９）：１４１５−１４２３（２０００））。この推定ＤＩＳＣ１タンパク質は、１つ以上の球状ドメインからなると推定されるＮ末端領域（アミノ酸１〜１４７）及び完全に７つの短ループが間隔をおいて配置されたα−ヘリックスから構成されると推定されるＣ末端領域を含む（Ｍｉｌｌａｒら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，９（９）：１４１５−１４２３（２０００））。
ＤＩＳＣ２はＤＩＳＣ１エキソン９と重複している（Ｍｉｌｌａｒら，Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，６（２）：１７３−１７８（２００１））。ＤＩＳＣ２はＤＩＳＣ１に対してアンチセンスであるコードＲＮＡ分子を特定すると示唆されている（Ｍｉｌｌａｒら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，９（９）：１４１５−１４２３（２０００））。
本発明は、Ｄｉｓｃ１ポリペプチド、Ｄｉｓｃ１核酸及び組換えＤｉｓｃ１改変マウスに関する。配列番号１のＤｉｓｃ１アミノ酸配列及び配列番号２の核酸配列はヒトＤＩＳＣ１アミノ酸配列及び核酸配列のマウスオルソログである。
配列番号１はＤｉｓｃ１ポリペプチドに対する基準配列である。Ｄｉｓｃ１ポリペプチドは配列番号１中に存在する少なくとも１８連続アミノ酸の領域を含む。Ｄｉｓｃ１ポリペプチドは配列番号１中に存在する１８連続アミノ酸を越えて追加領域を含み得、配列番号１中に存在しないアミノ酸領域を含み得る。
配列番号２はＤｉｓｃ１核酸に対する基準配列である。Ｄｉｓｃ１核酸はＤｉｓｃ１ポリペプチドをコードするかまたは配列番号２またはその相補体中に存在する少なくとも３０連続ヌクレオチドを含む領域を含む。前記Ｄｉｓｃ１核酸はＤｉｓｃ１をコードする核酸中に存在するか存在しない、または配列番号２またはその相補体中に存在する追加領域を含み得る。
よって、本発明の第１態様は精製Ｄｉｓｃ１ポリペプチドである。このポリペプチドは配列番号１の少なくとも１８連続アミノ酸を含む。
「精製ポリペプチド」はサンプルまたは調製物中に存在する全タンパク質の少なくとも１０％を占める。好ましい実施態様では、精製ポリペプチドはサンプルまたは調製物中の全タンパク質の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％または少なくとも約９５％を占める。「精製ポリペプチド」を指すとき、ポリペプチドが何らかの精製が行われている必要はなく、この中には例えば精製されていない化学合成したポリペプチドが含まれ得る。
本発明の別の態様は、ａ）Ｄｉｓｃ１ポリペプチドをコードし、外因性プロモーターに転写的に連結されている；ｂ）Ｄｉｓｃ１ヌクレオチド配列またはその相補体であり、固体支持体に結合している；ｃ）配列番号２で規定される；ｄ）修飾配列番号２配列で規定される；またはｅ）配列番号４で規定される；のいずれかである組換え核酸に関する。
組換え核酸は、本来相互に関連しない２つ以上の核酸領域を含み及び／または天然に存在する以外の別の環境中に存在する核酸に関する。組換え核酸の例には、コード領域及び該コード領域に本来関連しない１つ以上の調節配列、ＤＮＡ中に一緒に結合したエキソン、発現ベクター及び固体支持体に結合した核酸を含む核酸が含まれる。組換え領域を含む組換え核酸はゲノムの内側またはゲノムの外側に存在し得る。
本発明の別の態様は、外因性プロモーターに転写的に連結されているＤｉｓｃ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え細胞に関する。外因性プロモーターはヌクレオチド配列に本来関連しないプロモーターである。前記細胞は前記プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを含む。
本発明の別の態様は、配列番号１の少なくとも１８連続塩基をコードする組換え核酸をマウス細胞ゲノムに導入するステップを含む方法により作成した組換え細胞に関する。
本発明の別の態様は、ヒトＤＩＳＣ１（ポリペプチド５）よりも配列番号１のポリペプチドに選択的に結合する抗体を含む精製抗体調製物に関する。前記抗体は配列番号１の断片及び／または変異体にも結合し得る。
「精製抗体調製物」は、存在する抗体の少なくとも１０％が配列番号１のポリペプチドに結合する調製物である。前記調製物はポリクローナルまたはモノクローナル抗体を含み得る。好ましい実施態様では、Ｄｉｓｃ１に結合する抗体は存在する全抗体の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％または少なくとも約９５％を占める。「精製抗体調製物」を指すとき、調製物中の抗体は何らかの精製を受けていなくてもよい。
本発明の別の態様は、組換えＤｉｓｃ１改変マウスに関する。前記マウスでは、配列番号１の少なくとも２０連続アミノ酸を含むＤｉｓｃ１ポリペプチドをコードする対立遺伝子が改変されており、前記改変により対立遺伝子からのＤｉｓｃ１の完全長発現が実質的に低下または増加する。配列番号１の少なくとも２０連続アミノ酸をコードする核酸の存在により、核酸はＤｉｓｃ１対立遺伝子として特徴づけられる。
本発明の別の態様は、Ｄｉｓｃ１ポリペプチドに結合し得る化合物のスクリーニング方法に関する。前記方法は化合物のポリペプチドに結合する能力を調べるステップを含む。
本発明の他の特徴及び作用効果は複数の実施例を含めた本明細書の追加記載から自明である。ここに記載されている実施例は本発明を実施する際に有用な各種構成要素及び方法を例示している。これらの実施例は本発明を限定しない。本明細書の記載に基づいて、当業者は本発明を実施するために有用な他の構成要素及び方法を同定、使用することができる。
ヒトＤＩＳＣ１に対するマウスオルソログであるＤｉｓｃ１が同定され、クローン化された。ヒトＤＩＳＣ１転位は精神分裂病、分裂情緒的異常症、双極性異常症や単極性異常症のような精神病に関連している。
本発明は、Ｄｉｓｃ１ポリペプチド及び核酸を包含する。Ｄｉｓｃ１ポリペプチド及び核酸は細胞におけるＤｉｓｃ１ポリペプチド機能及び発現を研究するための研究ツールの提供；Ｄｉｓｃ１の精神病との関与の研究；Ｄｉｓｃ１ヌクレオチド多型の同定；及び組換えＤｉｓｃ１欠乏マウスの作成のような多種多様の用途を有する。
組換えＤｉｓｃ１欠乏マウスは、例えばＤｉｓｃ１の精神病との関与及びＤｉｓｃ１改変の影響を補う化合物の能力を調べるためのモデルとして使用され得る。
Ｉ． Ｄｉｓｃ１ポリペプチド
Ｄｉｓｃ１ポリペプチドは、配列番号１中に存在する少なくとも１８連続アミノ酸の領域を含む。Ｄｉｓｃ１ポリペプチドはＤｉｓｃ１に結合する抗体を産生するための免疫原としての使用及びＤｉｓｃ１に結合する化合物を同定するための標的としての使用のような各種用途を有する。
Ｄｉｓｃ１ポリペプチドは、配列番号１中に存在する少なくとも１８連続アミノ酸の領域を含む。Ｄｉｓｃ１ポリペプチドはＤｉｓｃ１に結合する抗体を産生するための免疫原としての使用及びＤｉｓｃ１に結合する化合物を同定するための標的としての使用のような各種用途を有する。
配列番号１の少なくとも１８連続アミノ酸の存在により、Ｄｉｓｃ１ポリペプチドに対するユニークな構造タグ及び有用な目的を達成するのに十分なポリペプチド領域が与えられる。少なくとも１８連続アミノ酸により、例えば抗体を産生するための免疫原が提供される。別の実施態様では、Ｄｉｓｃ１ポリペプチドは、配列番号１の少なくとも２０連続アミノ酸、配列番号１の少なくとも４０連続アミノ酸または配列番号１の少なくとも８０連続アミノ酸のタグを含み、或いは配列番号１を含むかまたは配列番号１から構成されている。
Ｄｉｓｃ１ポリペプチドは、Ｄｉｓｃ１タグに加えて追加の配列番号１の領域を含み得、配列番号１中に存在しないアミノ酸領域を含み得る。Ｄｉｓｃ１ポリペプチドには、配列番号１の完全長Ｄｉｓｃ１、Ｄｉｓｃ１タグを含む配列番号１の変異体、及びＤｉｓｃ１ポリペプチド及び配列番号１とは異なるアミノ酸領域を含むキメラポリペプチドが含まれる。
Ｄｉｓｃ１タグを含む配列番号１の変異体には、スプライス変異体及び／または多型変異体のような天然変異体が含まれる。配列番号３はアミノ酸改変を有するスプライス変異体の配列である。配列番号１の変異体の例は以下の実施例２の表３にも示されている。表３に示す変異体はスプライス変異体及び別のＰＣＲ産物反応から得た。
Ｄｉｓｃ１ポリペプチド変異体に関する別の実施態様では、配列番号１は以下の修飾の１つ以上：
アミノ酸４６：Ａ→Ｖ、
アミノ酸５８：Ｇ→Ｄ、
アミノ酸１１１：Ｅ→Ｄ、
アミノ酸２１４：Ｆ〜Ｌ、及び
アミノ酸２３１：Ｃ→Ｒ
で修飾されている。修飾の好ましい組合せは、特定ＰＣＲ産物（アミノ酸４６、５８、１１１及び２０１は１つのＰＣＲ産物に由来し、アミノ酸２１４は１つのＰＣＲ産物に由来し、アミノ酸２３１及び３９７はスプライス変異体に由来した）中に見られるものに相当する。
アミノ酸４６：Ａ→Ｖ、
アミノ酸５８：Ｇ→Ｄ、
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アミノ酸２３１：Ｃ→Ｒ
で修飾されている。修飾の好ましい組合せは、特定ＰＣＲ産物（アミノ酸４６、５８、１１１及び２０１は１つのＰＣＲ産物に由来し、アミノ酸２１４は１つのＰＣＲ産物に由来し、アミノ酸２３１及び３９７はスプライス変異体に由来した）中に見られるものに相当する。
Ｄｉｓｃ１タグを含むキメラポリペプチドは、特定の目的を達成するようにまたはＤｉｓｃ１に代わり得るポリペプチドまたはその断片を産生するように選択された非−Ｄｉｓｃ１領域を含み得る。適当な非−Ｄｉｓｃ１領域を用いて達成され得る特定目的には、単離のためのマーカー及び免疫応答の強化を与えることが含まれる。
追加の実施態様では、Ｄｉｓｃ１ポリペプチドは少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも４０または少なくとも８０連続アミノ酸を含み、コード化核酸は２つ以上のエキソンに及んでいる。特定エキソンに相応する連続アミノ酸の量は異なり得る。別の実施態様では、Ｄｉｓｃ１ポリペプチドは２つ以上の異なるエキソンに相応する少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０または少なくとも４０連続アミノ酸を含む。
各種エキソンによりコードされる配列番号１中のアミノ酸配列は次のように割り当てられる。
ポリペプチドは、化学合成を含めた技術及び生化学的合成を含めた技術のような一般的技術を用いて生産し得る。ポリペプチドの化学合成の技術は当業界で公知である（例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔ，「ペプチド及びタンパク質ドラッグデリバリー(Peptide and Protein Drug Delivery)」，ニューヨーク州ニューヨークに所在のＤｅｃｋｅｒ（１９９０年）発行参照）。
ポリペプチドの生化学合成技術も当業界で公知である。前記技術はポリペプチド合成のために核酸鋳型を用いる。特定アミノ酸をコードする核酸トリプレットの配列を与える遺伝子コードが当業界で公知である（例えば、Ｌｅｗｉｓ，ＧＥＮＥＳ ＩＶ，ｐ．１１９，オックスフォード大学出版局（１９９０年）発行参照）。核酸を細胞に導入し、その核酸を発現させてタンパク質を生産する技術の例は、Ａｕｓｕｂｅｌ，「分子生物学における現在のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ（１９８７−１９９８年）発行及びＳａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニング 実験マニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Mannual)」，第２版，コールド・スプリング・ハーバー出版局（１９８９年）発行のような文献に記載されている。
ＩＩ． Ｄｉｓｃ１抗体
Ｄｉｓｃ１を認識する抗体は、免疫原として配列番号１を含むポリペプチドまたはその断片を用いて作成し得る。Ｄｉｓｃ１を認識する抗体は、Ｄｉｓｃ１の存在の同定、Ｄｉｓｃ１ポリペプチドの単離やＤｉｓｃ１発現の研究のような各種用途を有する。
Ｄｉｓｃ１を認識する抗体は、免疫原として配列番号１を含むポリペプチドまたはその断片を用いて作成し得る。Ｄｉｓｃ１を認識する抗体は、Ｄｉｓｃ１の存在の同定、Ｄｉｓｃ１ポリペプチドの単離やＤｉｓｃ１発現の研究のような各種用途を有する。
抗体の作成・使用するための技術は当業界で公知である。前記技術の例は、Ａｕｓｕｂｅｌ，「分子生物学の現在のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ（１９８７−１９９８年）発行；Ｈａｒｌｏｗら，「抗体 実験マニュアル(Antibodies, A Laboratory Manual)」，コールド・スプリング・ハーバー出版局（１９８８年）発行；Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）；及びＳｃｈｗｅｑｔｚｅｒら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：１４−１９（２００２）に記載されている。
ＩＩＩ． 結合アッセイ
Ｄｉｓｃ１ポリペプチドは、受容体に結合する化合物を同定するための結合研究において使用し得る。好ましくは、結合研究は組換え核酸から発現させたＤｉｓｃ１を用いて実施される。より好ましくは、組換え発現させたＤｉｓｃ１は配列番号１、配列番号３、または[アミノ酸４６：Ａ→Ｖ、アミノ酸５８：Ｇ→Ｄ、アミノ酸１１１：Ｅ→Ｄ、アミノ酸２１４：Ｆ→Ｌ及びアミノ酸２３１：Ｃ→Ｒからなる群から選択される１つ以上の修飾を含む]修飾配列番号１からなる。
Ｄｉｓｃ１ポリペプチドは、受容体に結合する化合物を同定するための結合研究において使用し得る。好ましくは、結合研究は組換え核酸から発現させたＤｉｓｃ１を用いて実施される。より好ましくは、組換え発現させたＤｉｓｃ１は配列番号１、配列番号３、または[アミノ酸４６：Ａ→Ｖ、アミノ酸５８：Ｇ→Ｄ、アミノ酸１１１：Ｅ→Ｄ、アミノ酸２１４：Ｆ→Ｌ及びアミノ酸２３１：Ｃ→Ｒからなる群から選択される１つ以上の修飾を含む]修飾配列番号１からなる。
結合アッセイは、個々の化合物または多数の化合物を含有する調製物を用いて実施し得る。Ｄｉｓｃ１ポリペプチドに結合する能力を有する複数の化合物を含有する調製物はＤｉｓｃ１ポリペプチドに結合する化合物を同定すべく試験にかけられ得る小群の化合物に分割し得る。
結合アッセイは、異なる環境中に存在するＤｉｓｃ１を用いて実施し得る。前記環境には、例えばＤｉｓｃ１組換え核酸を含む細胞抽出物及び精製細胞抽出物が含まれ、例えば異なる環境に導入される組換え手段により生産される精製Ｄｉｓｃ１ポリペプチドの使用も含まれる。
ＩＶ． Ｄｉｓｃ１核酸
Ｄｉｓｃ１核酸は、Ｄｉｓｃ１ポリペプチドをコードする領域を含むかまたは配列番号２またはその相補体中に存在する少なくとも３０連続ヌクレオチドを含む。Ｄｉｓｃ１核酸は、Ｄｉｓｃ１変異体及びオルソログの存在を同定するためのハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとしての使用；Ｄｉｓｃ１発現をモニターするためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用；Ｄｉｓｃ１機能を試験するためのアンチセンス核酸としての使用；Ｄｉｓｃ１ポリペプチドの組換え発現のための使用；及び／または改変Ｄｉｓｃ１対立遺伝子を有する組換えマウスの構築における使用のような各種用途を有する。
Ｄｉｓｃ１核酸は、Ｄｉｓｃ１ポリペプチドをコードする領域を含むかまたは配列番号２またはその相補体中に存在する少なくとも３０連続ヌクレオチドを含む。Ｄｉｓｃ１核酸は、Ｄｉｓｃ１変異体及びオルソログの存在を同定するためのハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとしての使用；Ｄｉｓｃ１発現をモニターするためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用；Ｄｉｓｃ１機能を試験するためのアンチセンス核酸としての使用；Ｄｉｓｃ１ポリペプチドの組換え発現のための使用；及び／または改変Ｄｉｓｃ１対立遺伝子を有する組換えマウスの構築における使用のような各種用途を有する。
Ｄｉｓｃ１ポリペプチドをコードするかまたは配列番号２またはその相補体中に存在する少なくとも３０連続ヌクレオチドを含む領域の存在により、ユニークな構造タグ及び有用な目的を達成するのに十分な核酸領域が与えられる。特定目的の例には、Ｄｉｓｃ１ポリペプチドをコードする配列の提供及び／または適当な緊縮条件下でＤｉｓｃ１ ｍＲＮＡに選択的にハイブリダイズし得る配列の提供が含まれる。選択的ハイブリダイゼーションとは、前記核酸領域が少なくともヒトＤＩＳＣ１ ｍＲＮＡよりもマウスＤｉｓｃ１ ｍＲＮＡに優先的にハイブリダイズし得ることを指す。
Ｄｉｓｃ１核酸は、Ｄｉｓｃ１タグを与える領域に加えて追加領域を含み得る。追加領域には、配列番号１ポリペプチドまたはその変異体をコードする追加領域、追加の配列番号３領域またはその変異体、配列番号３及びその変異体に相補的な追加領域のようなＤｉｓｃ１関連領域並びに非−Ｄｉｓｃ１関連領域が含まれる。
非−Ｄｉｓｃ１関連領域を特定目的を達成するように選択することが好ましい。特定目的を達成するために使用し得る非−Ｄｉｓｃ１関連領域の例には、サンドイッチアッセイの一部として使用し得る捕捉領域、核酸の存在を示すようにプローブされ得るレポーター領域、発現ベクター領域及び免疫強化ポリペプチドをコードする領域が含まれる。配列番号１の変異体はセクション１に上記されている。
配列番号２の変異体はＤｉｓｃ１タグを含み、この変異体には配列番号２のスプライス変異体及び／または多型変異体のような天然に存在する変異体が含まれる。配列番号４はスプライス変異体の配列である。配列番号２変異体の例も以下の実施例２の表３に記載されている。表２に記載されている変異体はスプライス変異体及び各種ＰＣＲ産物反応から得られる。
Ｄｉｓｃ１核酸変異体に関する追加実施例では、配列番号２は以下の修飾の１つ以上：ヌクレオチド１３７：Ｃ→Ｔ、
ヌクレオチド１７３：Ｇ→Ａ、
ヌクレオチド３３３：Ｇ→Ｔ、
ヌクレオチド６０６：Ｃ→Ｔ、
ヌクレオチド６４０：Ｔ→Ｃ、
ヌクレオチド６９１：Ｔ→Ｃ、及び
ヌクレオチド１１９１：Ｇ→Ａ
で修飾されている。修飾の好ましい組合せは特定ＰＣＲ産物（ヌクレオチド１３７、１７３、３３３及び６０６は１つのＰＣＲ産物に由来し、ヌクレオチド６４０は１つのＰＣＲ産物に由来し、ヌクレオチド６９１及び１１９１はスプライス変異体に由来する）中に見られるものに相当する。
ヌクレオチド１７３：Ｇ→Ａ、
ヌクレオチド３３３：Ｇ→Ｔ、
ヌクレオチド６０６：Ｃ→Ｔ、
ヌクレオチド６４０：Ｔ→Ｃ、
ヌクレオチド６９１：Ｔ→Ｃ、及び
ヌクレオチド１１９１：Ｇ→Ａ
で修飾されている。修飾の好ましい組合せは特定ＰＣＲ産物（ヌクレオチド１３７、１７３、３３３及び６０６は１つのＰＣＲ産物に由来し、ヌクレオチド６４０は１つのＰＣＲ産物に由来し、ヌクレオチド６９１及び１１９１はスプライス変異体に由来する）中に見られるものに相当する。
追加の実施態様では、Ｄｉｓｃ１核酸は少なくとも３０、少なくとも６０または少なくとも９０連続ヌクレオチドを含み、これらのヌクレオチドは少なくとも２つのエキソンに広がるアミノ酸をコードするか、２つ以上のエキソン中に存在するか、または２つ以上のエキソン中に存在するヌクレオチドに相補的である。特定エキソンに対応する核酸の量は異なり得る。別の実施態様では、Ｄｉｓｃ１核酸は２つ以上のエキソンに由来する少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０または少なくとも４０連続アミノ酸をコードし、Ｄｉｓｃ１核酸は２種以上のエキソン由来の少なくとも１５、少なくとも３０または少なくとも４５連続塩基、またはその相補体を含む。
表１はＤｉｓｃ１遺伝子のイントロン／エキソン境界及びゲノム構造を示す。
所望配列を有する核酸は化学的及び生化学的技術を用いて合成し得る。化学的技術の例はＡｕｓｕｂｅｌ，「分子生物学における現在のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ（１９８７−１９９８年）発行及びＳａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニング 実験マニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Mannual)」，第２版，コールド・スプリング・ハーバー出版局（１９８９年）発行に記載されている。
特定のアミノ酸配列から遺伝子コードの公知の縮重を用いて、多種多様のコード化核酸配列を入手することができる。遺伝子コードの縮重は、殆どすべてのアミノ酸がヌクレオチドトリプレット、すなわちコドンのいろいろな組合せによりコードされるために生ずる。アミノ酸は以下のようにコドンによりコードされる：
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドン ＧＣＡ，ＧＣＣ，ＧＣＧ，ＧＣＵ；
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドン ＵＧＣ，ＵＧＵ；
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドン ＧＡＣ，ＧＡＵ；
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドン ＧＡＡ，ＧＡＧ；
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドン ＵＵＣ，ＵＵＵ；
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドン ＧＧＡ，ＧＧＣ，ＧＧＧ，ＧＧＵ；
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドン ＣＡＣ，ＣＡＵ；
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドン ＡＵＡ，ＡＵＣ，ＡＵＵ；
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン：コドン ＡＡＡ，ＡＡＧ；
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドン ＵＵＡ，ＵＵＧ，ＣＵＡ，ＣＵＣ，ＣＵＧ，ＣＵＵ；
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドン ＡＵＧ；
Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン：コドン ＡＡＣ，ＡＡＵ；
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドン ＣＣＡ，ＣＣＣ，ＣＣＧ，ＣＣＵ；
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドン ＣＡＡ，ＣＡＧ；
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドン ＡＧＡ，ＡＧＧ，ＣＧＡ，ＣＧＣ，ＣＧＧ，ＣＧＵ；
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドン ＡＧＣ，ＡＧＵ，ＵＣＡ，ＵＣＣ，ＵＣＧ，ＵＣＵ；
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン：コドン ＡＣＡ，ＡＣＣ，ＡＣＧ，ＡＣＵ；
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドン ＧＵＡ，ＧＵＣ，ＧＵＧ，ＧＵＵ；
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドン ＵＣＧ；及び
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドン ＵＡＣ，ＵＡＵ。
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドン ＧＣＡ，ＧＣＣ，ＧＣＧ，ＧＣＵ；
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドン ＵＧＣ，ＵＧＵ；
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドン ＧＡＣ，ＧＡＵ；
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドン ＧＡＡ，ＧＡＧ；
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドン ＵＵＣ，ＵＵＵ；
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドン ＧＧＡ，ＧＧＣ，ＧＧＧ，ＧＧＵ；
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドン ＣＡＣ，ＣＡＵ；
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドン ＡＵＡ，ＡＵＣ，ＡＵＵ；
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン：コドン ＡＡＡ，ＡＡＧ；
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドン ＵＵＡ，ＵＵＧ，ＣＵＡ，ＣＵＣ，ＣＵＧ，ＣＵＵ；
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドン ＡＵＧ；
Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン：コドン ＡＡＣ，ＡＡＵ；
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドン ＣＣＡ，ＣＣＣ，ＣＣＧ，ＣＣＵ；
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドン ＣＡＡ，ＣＡＧ；
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドン ＡＧＡ，ＡＧＧ，ＣＧＡ，ＣＧＣ，ＣＧＧ，ＣＧＵ；
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドン ＡＧＣ，ＡＧＵ，ＵＣＡ，ＵＣＣ，ＵＣＧ，ＵＣＵ；
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン：コドン ＡＣＡ，ＡＣＣ，ＡＣＧ，ＡＣＵ；
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドン ＧＵＡ，ＧＵＣ，ＧＵＧ，ＧＵＵ；
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドン ＵＣＧ；及び
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドン ＵＡＣ，ＵＡＵ。
生化学的合成技術は核酸鋳型及び適当な酵素（例えば、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡポリメラーゼ）の使用を含む。前記技術の例には、ＰＣＲや転写ベース増幅のようなインビトロ増幅技術及びインビボ核酸複製が含まれる。適当な技術はＡｕｓｕｂｅｌ，「分子生物学における現在のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ（１９８７−１９９８年）発行；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニング 実験マニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Mannual)」，第２版，コールド・スプリング・ハーバー出版局（１９８９年）発行；及びＫａｃｉａｎらの米国特許第５，４８０，７８４号明細書に記載されている。
Ｖ． Ｄｉｓｃ１に関連する追加核酸の入手
本明細書に記載されているガイダンスは、各種ソースからＤｉｓｃ１関連ポリペプチドをコードする核酸を入手するために使用し得る。前記核酸は、プローブ及びプライマーを用い、ハイブリダイゼーション条件の適当な選択により容易に入手できる。
本明細書に記載されているガイダンスは、各種ソースからＤｉｓｃ１関連ポリペプチドをコードする核酸を入手するために使用し得る。前記核酸は、プローブ及びプライマーを用い、ハイブリダイゼーション条件の適当な選択により容易に入手できる。
プローブ及びプライマーはＤｉｓｃ１核酸及びアミノ酸配列に基づいて設計し得る。プローブまたはプライマー特異性を調節するためにハイブリダイゼーション条件の調節は有用である。
ハイブリダイゼーション検出及びＰＣＲクローニングのために使用される技術は当業界で公知である。核酸検出技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニング 実験マニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Mannual)」，第２版，コールド・スプリング・ハーバー出版局（１９８９年）発行に記載されている。ＰＣＲクローニング技術は、例えばＷｈｉｔｅ，「分子クローニング方法(Methods in Molecular Cloning)」，第６７巻，ヒュマーナ出版局（１９９７年）発行に記載されている。
Ｄｉｓｃ１プローブ及びプライマーは、例えばゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む核酸ライブラリーをスクリーニングするために使用し得る。前記ライブラリーは市販されており、Ａｕｓｕｂｅｌ，「分子生物学における現在のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ（１９８７−１９９８年）発行に記載されているような技術を用いて作成し得る。
ＶＩ． Ｄｉｓｃ１プローブ
Ｄｉｓｃ１プローブは適当なハイブリダイゼーション条件でＤｉｓｃ１標的核酸に特異的にハイブリダイズし得、Ｄｉｓｃ１核酸と非標的核酸を区別できる領域を含む。Ｄｉｓｃ１用プローブはＤｉｓｃ１核酸に相補的でない核酸をも含み得る。
Ｄｉｓｃ１プローブは適当なハイブリダイゼーション条件でＤｉｓｃ１標的核酸に特異的にハイブリダイズし得、Ｄｉｓｃ１核酸と非標的核酸を区別できる領域を含む。Ｄｉｓｃ１用プローブはＤｉｓｃ１核酸に相補的でない核酸をも含み得る。
プローブは溶液中に遊離していても固体支持体に結合していてもよい。固体支持体に共有的または非共有的に結合したプローブは、例えば各種遺伝子の発現をモニターするために使用し得る。プローブは、支持体上に合成プローブをスポットするかまたは支持体上でプローブを段階的に合成するなどの各種技術により固体支持体に結合し得る。遺伝子発現をモニターする技術は米国特許第５，９６５，３５２号明細書及び同第６，２０３，９８７号明細書のような文献中に見つけることができる。
プローブは核酸またはその誘導体、例えば修飾核酸及びペプチド核酸から構成される。修飾核酸には、１つ以上の改変糖基、改変ヌクレオチド間結合及び／または改変ヌクレオチドプリンまたはピリミジン塩基を有する核酸が含まれる。修飾核酸を記載している文献には、いずれも援用により本明細書に含まれるとする国際特許出願公開第９８／０２５８２号パンフレット、米国特許第５，８５９，２２１号明細書及び同第５，８５２，１８８号明細書が含まれる。
ハイブリダイゼーションは相補的ヌクレオチド塩基を介して起こる。ハイブリダイゼーション条件が２つの分子または領域が相互に十分に強い相互作用を有して安定なハイブリッドを形成するかどうかを決定する。
相互にハイブリダイズする２つの分子間の相互作用の程度は産生ハイブリッドのＴｍにより反映される。Ｔｍが高ければ、相互作用は強くなり、ハイブリッドはより安定となる。Ｔｍは当業界で公知の各種因子、例えば相補性の程度、存在する相補塩基のタイプ（例えば、Ａ−Ｔハイブリダイゼーション対Ｇ−Ｃハイブリダイゼーション）、修飾核酸の存在及び溶液成分により影響される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニング 実験マニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Mannual)」，第２版，コールド・スプリング・ハーバー出版局（１９８９年）発行）。
ハイブリッドのＴｍが特定組のハイブリダイゼーションアッセイ条件で使用される温度よりも高いときには安定なハイブリッドが形成される。プローブの特異性の程度は、ハイブリダイゼーション緊縮条件を調節することにより変えられ得る。プローブハイブリダイゼーションは検出可能な標識を用いると容易に検出される。検出可能な標識の例には、発光、酵素及び放射性標識が含まれる。
ＶＩＩ． 組換え発現
Ｄｉｓｃポリペプチドは適当な宿主または試験管において翻訳系を用いて組換え核酸から発現され得る。好ましくは、発現は発現ベクターを用いて宿主細胞において達成される。
Ｄｉｓｃポリペプチドは適当な宿主または試験管において翻訳系を用いて組換え核酸から発現され得る。好ましくは、発現は発現ベクターを用いて宿主細胞において達成される。
発現ベクターは、適正な転写及びプロセシングのための調節要素と共にポリペプチドをコードする領域を含む組換え核酸を含む。存在し得る調節要素には、組換え核酸に本来関連する調節要素及び組換え核酸に本来関連しない外因性調節要素が含まれる。外因性プロモーターのような外因性調節要素は特定宿主において組換え核酸を発現するために有用であり得る。
通常、発現ベクター中に存在する調節要素には転写プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター及び任意に存在するオペレーターが含まれる。別の好ましい要素は真核細胞におけるプロセシングを与えるポリアデニル化シグナルである。好ましくは、発現ベクターは宿主細胞における自律複製のための複製起源、選択マーカー、限定数の有用な制限酵素部位及び高コピー数のポテンシャルをも含む。発現ベクターの例はクローニングベクター、修飾クローニングベクター、特に設計されたプラスミド及びウイルスである。
各種宿主において適当レベルのポリペプチド発現を与える発現ベクターは当業界で公知である。当業界で公知の哺乳動物発現ベクターには、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２（ＡＴＣＣ ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ ３７４６０）、ｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びラムダ．ＺＤ３５（ＡＴＣＣ ３７５６５）が含まれる。当業界で公知の細菌発現ベクターには、ｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ラムダｇｔ１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｐＫＫ２２３−３（ＰＨａｒｍａｃｉａ）が含まれる。当業界で公知の真菌細胞発現ベクターには、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びピチア発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる。当業界で公知の昆虫細胞発現ベクターには、Ｂｌｕｅ Ｂａｃ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる。
組換え宿主細胞は原核細胞または真核細胞であり得る。組換え宿主細胞の例には、大腸菌のような細菌；酵母のような真菌細胞；ヒト、ウシ、ブタ、サルやげっ歯類のような哺乳動物細胞；及びショウジョウバエ属及びカイコ由来の細胞株のような昆虫細胞が含まれる。市販されている哺乳動物細胞株には、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ．ｓｕｐ．−）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．２）、２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６）、ＢＳ−Ｃ−（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）及びＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）が含まれる。
特定宿主における発現を高めるために、宿主のコドン使用法を考慮して特定のコード化配列を修飾させることが有用であり得る。各種生物のコドン使用法は当業界で公知である（Ａｕｓｕｂｅｌ，「分子生物学における現在のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」，補遺３３，付録１Ｃ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ（１９８７−１９９８）年発行参照）。
発現ベクターは一般的な方法を用いて宿主細胞に導入し得る。前記技術の例には形質転換、トランスフェクション、リポフェクション、プロトプラスト融合及びエレクトロポレーションが含まれる。
ポリペプチドをコードする核酸は発現ベクターを用いずに細胞において発現され得る。更に、ｍＲＮＡは各種無細胞系（例えば、小麦胚芽抽出物及び網状赤血球抽出物）及び細胞系（例えば、カエル卵母細胞）において翻訳され得る。ｍＲＮＡの細胞系への導入は、例えばマイクロインジェクションにより達成し得る。
ＶＩＩＩ． Ｄｉｓｃ１欠乏トランスジェニックマウスの作成
本明細書に記載されているガイダンスに基づいて、Ｄｉｓｃ１が欠乏しているかまたは野生型、短小化もしくは他の方法の変異Ｄｉｓｃ１を過剰発現する各種タイプのマウス（ノックアウト、トランスジェニックまたはノックインマウスと称される）が作成され得る。前記マウスは、ヒト精神分裂病表現型または全体として精神分裂病の局面のためのマウスモデルを提供するようにＭｉｌｌａｒら（２０００）に記載されているＤＩＳＣ１短小化を有するヒト精神分裂病患者中に存在する短小化に似ていることがある。Ｄｉｓｃ１欠乏マウスを産生するためのスキームは改変Ｄｉｓｃ１対立遺伝子を有する雄及び雌マウスを作成し、そのマウスを飼育して両対立遺伝子が改変されているマウスを作成することを含む。
本明細書に記載されているガイダンスに基づいて、Ｄｉｓｃ１が欠乏しているかまたは野生型、短小化もしくは他の方法の変異Ｄｉｓｃ１を過剰発現する各種タイプのマウス（ノックアウト、トランスジェニックまたはノックインマウスと称される）が作成され得る。前記マウスは、ヒト精神分裂病表現型または全体として精神分裂病の局面のためのマウスモデルを提供するようにＭｉｌｌａｒら（２０００）に記載されているＤＩＳＣ１短小化を有するヒト精神分裂病患者中に存在する短小化に似ていることがある。Ｄｉｓｃ１欠乏マウスを産生するためのスキームは改変Ｄｉｓｃ１対立遺伝子を有する雄及び雌マウスを作成し、そのマウスを飼育して両対立遺伝子が改変されているマウスを作成することを含む。
改変ゲノムを有するマウスを作成する技術は当業界で公知である（Ａｕｓｕｂｅｌ，「分子生物学における現在のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」，第２３章，「マウスゲノムの操作(Manipulating the Mouse Genome)」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ（２００１年）発行）。改変Ｄｉｓｃ１対立遺伝子を有するマウスを作成するためのスキームの例は、
（ａ）導入遺伝子を用いる相同組換えによりマウス胚性幹細胞中のＤｉｓｃ１対立遺伝子を改変させて改変胚性幹細胞を作成し、
（ｂ）前記改変胚性幹細胞をマウス胚盤胞に導入して改変胚盤胞を作成し、
（ｃ）前記改変胚盤胞を偽妊娠マウスに導入して妊娠マウスを作成し、
（ｄ）前記妊娠マウスから子孫を作成し、
（ｅ）前記子孫を改変Ｄｉｓｃ１対立遺伝子の存在についてスクリーニングにかけてＤｉｓｃ１欠乏マウスを同定する
ことを含む。
（ａ）導入遺伝子を用いる相同組換えによりマウス胚性幹細胞中のＤｉｓｃ１対立遺伝子を改変させて改変胚性幹細胞を作成し、
（ｂ）前記改変胚性幹細胞をマウス胚盤胞に導入して改変胚盤胞を作成し、
（ｃ）前記改変胚盤胞を偽妊娠マウスに導入して妊娠マウスを作成し、
（ｄ）前記妊娠マウスから子孫を作成し、
（ｅ）前記子孫を改変Ｄｉｓｃ１対立遺伝子の存在についてスクリーニングにかけてＤｉｓｃ１欠乏マウスを同定する
ことを含む。
遺伝子発現に関わる遺伝子要素には、プロモーター、スプライシング部位、ポリアデニル化領域やリボソーム結合部位のような転写／翻訳要素が含まれる。前記要素を除去または改変すると、Ｄｉｓｃ１遺伝子からＤｉｓｃ１タンパク質が生産される。
対立遺伝子からのポリペプチドの完全長発現を実質的に減少または無くすためにＤｉｓｃ１構造遺伝子改変が使用され得る。Ｄｉｓｃ１構造遺伝子への好ましい改変には、遺伝子のノッアウトまたは転座切断点までのアミノ領域に相当する塩基１〜５９３をコードする遺伝子の産生が含まれる。
Ｄｉｓｃ１対立遺伝子の欠失は、追加核酸の挿入により達成し得る。挿入し得る追加核酸には、独立プロモーターを有する選択マーカーをコードする核酸及びＤｉｓｃ１プロモーターに転写的に連結したレポータータンパク質をコードする核酸が含まれる。キメラマウスにおいて使用し得るレポータータンパク質の例はβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはその誘導体である。
初期改変は、相同組換えによる挿入のために１つ以上の選択マーカー及びＤｉｓｃ１を標的とする核酸を含む導入遺伝子を用いて生じさせることが好ましい。相同組換えはＤｉｓｃ１を改変する及び／またはＤｉｓｃ１領域を除去するように実施し得る。マーカーは、マウスゲノムへの挿入及び相同組換えにより起こる挿入のスクリーニングを容易とすべく使用し得る（Ａｕｓｕｂｅｌ，「分子生物学における現在のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」，第２３章，「マウスゲノムの操作(Manipulating the Mouse Genome)」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ（２００１年）発行）。
相同組換えのために使用される導入遺伝子は、挿入核酸を切除するために使用し得るリコンビナーゼ系を含み得る。リコンビナーゼ系の例には、バクテリオファージリコビナーゼＣｒｅ／ｌｏｘＰ系及び酵母リコビナーゼＦｌｐ／ＦＲＴ系が含まれる（Ａｕｓｕｂｅｌ，「分子生物学における現在のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」，第２３章，「マウスゲノムの操作(Manipulating the Mouse Genome)」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ（２００１年）発行及び米国特許第５，５６４，１８２号明細書）。ｌｏｘＰ認識部位はＣｒｅリコンビナーゼにより除去及び切除される領域の３’及び５’に位置し得る。また、ｆｒｔ認識部位はＦｌｐリコンビナーゼにより除去及び切除される領域の３’及び５’に位置し得る。
改変Ｄｉｓｃ１対立遺伝子を含むマウスのスクリーニングは、Ｄｉｓｃ１ ｍＲＮＡ転写物の産生を測定する技術及び産生されたＤｉｓｃ１転写物が野生型転写物とは異なるかどうかを調べる技術等の技術を用いて達成し得る。Ｄｉｓｃ１ ｍＲＮＡ転写物及び転写物のタイプを測定する技術には、転写物の産生及びサイズを検出し得るサザン分析のような核酸ハイブリダイゼーション分析及び特定配列に対して特異的な小さい核酸プローブの使用が含まれる。ＰＣＲもＤｉｓｃ１ ｍＲＮＡ転写物を調べるためにも使用し得る。ウェスタンブロッティング及び免疫組織化学も前記動物中の完全長または部分Ｄｉｓｃ１タンパク質を検出するために使用し得る。
本発明の諸要件を更に説明するために下記実施例を提示する。これらの実施例は本発明を実施するために有用な方法をも説明する。これらの実施例は本発明を限定しない。
材料及び方法
本実施例はＤｉｓｃ１をクローン化し、研究するために使用した各種材料及び方法を記載する。
本実施例はＤｉｓｃ１をクローン化し、研究するために使用した各種材料及び方法を記載する。
（ゲノム同定）
ドラフトマウスゲノム配列の生命情報科学分析により、ヒトＤＩＳＣ１に相同性を有する４つのマウスゲノム配列が同定された。このマウス配列を、公開マウスゲノムショットガン配列をＢｌａｓｔ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５（１７）：３３８９−４０２（１９９７））を用いて検索することにより同定した。
ドラフトマウスゲノム配列の生命情報科学分析により、ヒトＤＩＳＣ１に相同性を有する４つのマウスゲノム配列が同定された。このマウス配列を、公開マウスゲノムショットガン配列をＢｌａｓｔ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５（１７）：３３８９−４０２（１９９７））を用いて検索することにより同定した。
（ｃＤＮＡクローニング）
マウスゲノム配列に基づいてプライマーを設計した。１７７９ｂｐ及び１５９０ｂｐ産物を、鋳型としてマウスの心または脳Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、プライマーＴＴＣＡＴＣＣＡＡＣＴＣＴＣＣＣＴＴＧＣ（配列番号３５）及びＧＡＧＡＧＣＴＴＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧ（配列番号３６）を用いるＰＣＲにより得た。ＰＣＲはＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実施した。各５０μｌ反応物は２．５Ｕ 酵素、０．２μＭ 各プライマー、０．２ｍＭ 各ｄＮＴＰ、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ トリス−Ｃｌ（ｐＨ８．７５）、２０ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ トリトンＸ−１００、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び２％ ＤＭＳＯを含んでいた。反応物を、９４℃×２０秒間の変性ステップ、６０℃×１分間のアニーリングステップ及び７２℃×３分間の合成ステップのサイクルに３５回かけた。ＰＣＲ産物を一般的な方法を用いてＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、配列決定した。
マウスゲノム配列に基づいてプライマーを設計した。１７７９ｂｐ及び１５９０ｂｐ産物を、鋳型としてマウスの心または脳Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、プライマーＴＴＣＡＴＣＣＡＡＣＴＣＴＣＣＣＴＴＧＣ（配列番号３５）及びＧＡＧＡＧＣＴＴＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧ（配列番号３６）を用いるＰＣＲにより得た。ＰＣＲはＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実施した。各５０μｌ反応物は２．５Ｕ 酵素、０．２μＭ 各プライマー、０．２ｍＭ 各ｄＮＴＰ、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ トリス−Ｃｌ（ｐＨ８．７５）、２０ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ トリトンＸ−１００、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び２％ ＤＭＳＯを含んでいた。反応物を、９４℃×２０秒間の変性ステップ、６０℃×１分間のアニーリングステップ及び７２℃×３分間の合成ステップのサイクルに３５回かけた。ＰＣＲ産物を一般的な方法を用いてＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、配列決定した。
５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の急速増幅）産物はＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ及び上記と同じ反応緩衝液を用いて得た。ＰＣＲ増幅は、鋳型としてマウスの心脳Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（遺伝子特異的プライマーＣＡＴＴＣＴＧＧＴＴＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣ（配列番号３７））を用い、９４℃×２０秒間の変性ステップ、６８℃×３分間のアニーリング及び合成ステップのサイクルに３２回かけて実施した。その後、プライマー（ＡＣＣＴＧＡＧＣＣＡＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＧＣ（配列番号３８））を用いる入れ子ＰＣＲ反応を２５増幅サイクルで実施した。ＰＣＲ産物を一般的な方法を用いてＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、配列決定した。
３’ＲＡＣＥ産物はＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＭＳＯを除く以外は同一の反応緩衝液を用いて得た。ＰＣＲ増幅は、鋳型としてマウスの心脳Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（遺伝子特異的ＣＴＧＣＴＧＡＡＧＴＴＧＧＡＧＡＡＡＡＧＴＧＣＧ（配列番号３９））を用い、９４℃×２０秒間の変性ステップ、６８℃×３分間のアニーリング及び合成ステップのサイクルに３２回かけて実施した。その後、プライマーＧＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＡＡＧ（配列番号４０）またはＧＡＧＣＴＣＣＡＧＡＣＧＧＴＧＡＡＧＧＡＡＡＣ（配列番号４１）を用いる入れ子ＰＣＲ反応を２５サイクル実施した。ＰＣＲ産物を一般的な方法を用いてＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、配列決定した。
（ゲノム構造）
３’マウスＤｉｓｃ１ ｃＤＮＡ配列（ヌクレオチド２３７６〜２４９０）をプローブとして用いてＢＡＣ（細菌人工染色体）マウスライブラリー（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）をスクリーニングした。製造業者が推奨しているようにハイブリダイゼーションのために一般的手順を用いた。二本鎖プローブをレディプライマーＩＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＢｉｏｔｅｃｈレディプライマーＩＩランダムプライム標識システム）を用いて［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識し、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｃｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐカラムを用いて精製した。
３’マウスＤｉｓｃ１ ｃＤＮＡ配列（ヌクレオチド２３７６〜２４９０）をプローブとして用いてＢＡＣ（細菌人工染色体）マウスライブラリー（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）をスクリーニングした。製造業者が推奨しているようにハイブリダイゼーションのために一般的手順を用いた。二本鎖プローブをレディプライマーＩＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＢｉｏｔｅｃｈレディプライマーＩＩランダムプライム標識システム）を用いて［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識し、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｃｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐカラムを用いて精製した。
ポジティブＢＡＣクローンをＰＣＲ（プライマー組１ ＧＧＡＴＴＣＴＣＡＣＡＴＣＧＴＴＴＣＴＧＣ（配列番号４２）及びＧＡＧＡＧＣＴＴＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧ（配列番号４３）；プライマー組２ ＧＡＡＡＴＧＧＣＣＡＣＴＡＴＡＣＣＴＧＣ（配列番号４４）及びＣＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＡ（配列番号４５））により確認した。ＰＣＲはＡｍｐｌｉＴａｑゴールトＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。各５０μｌ反応物は１．２５Ｕ 酵素、０．２μＭ 各プライマー、０．２ｍＭ 各ｄＮＴＰ、１０ｍＭ トリス−Ｃｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ
ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２及び０．００１％（ｗ／ｖ） ゼラチンを含んでいた。９４℃で９分間インキュベート後、反応物を９４℃×２０秒間の変性ステップ、６０℃×３０秒間のアニーリングステップ及び７２℃×１分間の合成ステップのサイクルに３２回かけた。
ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２及び０．００１％（ｗ／ｖ） ゼラチンを含んでいた。９４℃で９分間インキュベート後、反応物を９４℃×２０秒間の変性ステップ、６０℃×３０秒間のアニーリングステップ及び７２℃×１分間の合成ステップのサイクルに３２回かけた。
ＴＲＡＸ遺伝子はヒト染色体ｌｑ４２上のＤＩＳＣ１から上流に位置している。ＰＣＲ結果は、３’マウスＴＲＡＸに対してポジティブなマウスＢＡＣクローンの１つはＰＣＲにより５’マウスＤｉｓｃ１に対してもポジティブであることを示した。Ｔｓｎａｘに対してプライマーＣＣＡＣＡＴＧＣＴＴＴＣＡＡＣＧＡＧＴＴ（配列番号４６）及びＡＧＡＧＣＡＧＧＴＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＡＣ（配列番号４７）を用いた。２つのＤｉｓｃ１プライマー組を用いた（組１ ＴＴＣＡＴＣＣＡＡＣＴＣＴＣＣＣＴＴＧＧ（配列番号４８）及びＧＧＧＣＣＴＧＴＣＴＧＡＧＣＴＡＧＡＴＧ（配列番号４９）；組２ ＡＧＡＣＴＴＧＧＣＴＣＡＧＧＴＧＡＣＧＡ（配列番号５０）及びＧＣＧＧＴＴＧＣＴＣＡＧＴＡＧＧＴＡＧ（配列番号５１））。ＰＣＲ条件は上記と同じであった。
（ノーザンブロット分析）
Ｃｌｏｎｔｅｃｈマウス多組織をＤｉｓｃ１（ヌクレオチド２３７６〜２４９０）を用いてプローブした。プローブは、マウス心Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型として用いるＰＣＲにより得た。Ｄｉｓｃ１は心臓、脳、腎臓及び精巣中に〜７ｋｂ及び〜４．４ｋｂの転写物として弱く存在している。
Ｃｌｏｎｔｅｃｈマウス多組織をＤｉｓｃ１（ヌクレオチド２３７６〜２４９０）を用いてプローブした。プローブは、マウス心Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型として用いるＰＣＲにより得た。Ｄｉｓｃ１は心臓、脳、腎臓及び精巣中に〜７ｋｂ及び〜４．４ｋｂの転写物として弱く存在している。
Ｃｌｏｎｔｅｃｈラット多組織ノーザンブロットに対して６０℃で低緊縮ハイブリダイゼーションを実施した。Ｄｉｓｃ１心ｃＤＮＡクローンの１つをＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩを用いて切除することによりＤｉｓｃ１のヌクレオチド１１３８〜２４９７に相当するプローブを得た。〜７ｋｂ転写物は心臓及び骨格筋で認められ、別の〜１．３５ｋｂ転写物は心臓、肝臓、腎臓及び脳で認められた。発現レベルは骨格筋及び脳よりも心臓及び肝臓で高かった。
（生命情報科学分析）
マウスＴＲＡＸ ｃＤＮＡ配列をデーターベースｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ．（Ｚｈａｏら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１１（１０）：１７３６−１７４５（２００１））にかけることによりＴＩＧＲ ＢＡＣ末端配列決定プロジェクトから同定した。
マウスＴＲＡＸ ｃＤＮＡ配列をデーターベースｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ．（Ｚｈａｏら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１１（１０）：１７３６−１７４５（２００１））にかけることによりＴＩＧＲ ＢＡＣ末端配列決定プロジェクトから同定した。
ヒトＤＩＳＣ１及びマウスＤｉｓｃ１ ＤＮＡ及びタンパク質配列をＣｌｕｓｔａｌ Ｗプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２（２２）：４６７３−８０（１９９４））を用いてアラインした。ヒト及びマウス配列はＰＲＯＳＩＴＥを用いてサブ配列について特徴づけられた（Ｂａｉｒｏｃｈ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９（補遺）：２２４１−２２４５（１９９９１）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９（２３）：６５６５−６５７２（１９９１））。ヒト及びマウスＤＩＳＣ１配列はいずれもロイシンジッパーモチーフに対してポジティプであった。マウスまたはヒト配列をＩｎｔｅｒＰｒｏプログラム（Ａｐｗｅｉｌｅｒら，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１６（１２）：１１４５−１１５０（２０００））を用いて検索することによりＤＵＦ２３２、トロポミオシン及び２極性核移行シグナルに対するホモロジーが認められた。
（ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）
Ｃ５７ＢＬ６雄マウス（２０〜２５ｇ，ニューヨーク州ジャーマンタウンに所在のＴａｃｏｎｉｃ）を１２時間ずつの明暗の光周期で動物ケア施設（ＡＡＡＬＡＣ証明）に収容に、水道水及びげっ歯類飼料は自由に摂取させた。順化（５〜１０日）後、動物を過剰量のＣＯ２で安楽死させ、脳を凍結させ、２０μｍの冠状クリオスタット切片をゲラセン被覆スライド上で集めた。
Ｃ５７ＢＬ６雄マウス（２０〜２５ｇ，ニューヨーク州ジャーマンタウンに所在のＴａｃｏｎｉｃ）を１２時間ずつの明暗の光周期で動物ケア施設（ＡＡＡＬＡＣ証明）に収容に、水道水及びげっ歯類飼料は自由に摂取させた。順化（５〜１０日）後、動物を過剰量のＣＯ２で安楽死させ、脳を凍結させ、２０μｍの冠状クリオスタット切片をゲラセン被覆スライド上で集めた。
マウスＤｉｓｃ１の断片（塩基１１３８−２４９７）を心ｃＤＮＡクローンからＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩを用いて切除し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（カリフォルニア州ラホヤに所在のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローン化した。次いで、プラスミドを用いて、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の３５Ｓ−ＵＴＰ標識ｃＲＮＡプローブを作成した。
簡単に説明すると、切片を載せたスライドを４％ パラホルムアルデヒドで後固定し、無水酢酸で処理し、クロロホルム及び水を用いて脱脂、脱水した。次いで、スライドを５０％ ホルムアルデヒドハイブリダイゼーション混合物中Ｄｉｓｃ１ ｍＲＡＮに対するアンチセンスまたはセンス（コントロール）リボプローブ２００μｌ（６×１０６ＤＰＭ／スライド）とハイブリダイズし、カバーガラスを被せることなく湿潤スライドチャンバにおいて５５℃で一晩インキュベートした。翌朝、スライドを２×ＳＳＣ／１０ｍＭ ＤＴＴで洗浄し、ＲＮａｓｅ Ａ（２０μｇ／ｍｌ）で処理し、６０℃において０．１×ＳＳＣで洗浄して、非特異的標識を除去した。脱水後、スライドをＢｉｏＭａｘ（ＢＭＲ−１；コダック）Ｘ線フィルムに３日間対置し、ＮＴＢ２核エマルション中に浸した。スライドを４〜６週間曝し、写真技術により処理し、クレシルバイオレットで染色し、カバーガラスを被せた。
Ｄｉｓｃ１のクローニング
ＤＩＳＣ１タンパク質配列を公開マウスゲノムデーターベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｓｅｑ／ＭｍＨｏｍｅ．ｈｔｍｌ）に基づいて検索することによりＤＩＳＣ１配列に相当する４つのマウスゲノムＤＮＡ配列が同定された（表２）。これらの配列はヒトＤＩＳＣ１ゲノム配列のエキソン２、６、１２及び１３に相当した（Ｍｉｌｌａｒら，Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｒｔｙ，６（２）：１７３−１７８（２００１））。全脳及び心ｃＤＮＡライブラリーからＤｉｓｃ１の中心部分をＰＣＲ増幅するためにマウスゲノム断片１及び４に対するプライマーを用いた。次いで、５’及び３’ＲＡＣＥを用いて、オルソロガスＤｉｓｃ１配列の残りを得た。
ＤＩＳＣ１タンパク質配列を公開マウスゲノムデーターベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｓｅｑ／ＭｍＨｏｍｅ．ｈｔｍｌ）に基づいて検索することによりＤＩＳＣ１配列に相当する４つのマウスゲノムＤＮＡ配列が同定された（表２）。これらの配列はヒトＤＩＳＣ１ゲノム配列のエキソン２、６、１２及び１３に相当した（Ｍｉｌｌａｒら，Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｒｔｙ，６（２）：１７３−１７８（２００１））。全脳及び心ｃＤＮＡライブラリーからＤｉｓｃ１の中心部分をＰＣＲ増幅するためにマウスゲノム断片１及び４に対するプライマーを用いた。次いで、５’及び３’ＲＡＣＥを用いて、オルソロガスＤｉｓｃ１配列の残りを得た。
Ｄｉｓｃ１ ｃＤＮＡは３１９０ｂｐの長さであり、タンパク質８５１アミノ酸長に相当する２５５３ｂｐのオープンリーディングフレームを有している。インフレームスプライス変異体も同定された（配列番号３及び４）。
スプライス変異体は３００１ｂｐの長さであり、完全長マウスｃＤＮＡに比較して１８９塩基対が欠失していた。この変異体では、ＡＴＧからヌクレオチド＋１として、ヌクレオチド＋１８４３〜＋２０３１がスプライスされている。タンパク質７８８アミノ酸長に相当する２３６４ｂｐのオープンリーディングフレームを有している。
ヒトＤＩＳＣ１のスプライス変異体はすでに同定されていた（Ｍｉｌｌａｒら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，９（９）：１４１５−２３（２０００））。しかしながら、Ｄｉｓｃ１スプライス変異体とは遺伝子の位置が異なっている。完全長Ｄｉｓｃ１配列及びスプライス変異体配列の両方を脳及び心ｃＤＮＡライブラリーで増幅させた。
Ｄｉｓｃ１のクローニング中多くの一塩基多型（ＳＮＰ）も同定された（表３）。
生命情報科学分析
ヒト及びマウスＤＮＡ配列のＣｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２（２２）：４６７３−４６８０（１９９４））アラインメントは、これらの配列間の６０％の同一性を示した。ヒト及びマウスタンパク質配列間のタンパク質アラインメント（図１）は、これらのタンパク質配列間の５６％同一性及び１４％類似性（同一のアミノ酸を除く）を示した。これは、マウス及びヒトオルソログ間で通常見られるよりも低度のホモロジーである（Ｍａｋａｌｏｗｓｋｉら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，６（９）：８４６−８５７（１９９６））。
ヒト及びマウスＤＮＡ配列のＣｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２（２２）：４６７３−４６８０（１９９４））アラインメントは、これらの配列間の６０％の同一性を示した。ヒト及びマウスタンパク質配列間のタンパク質アラインメント（図１）は、これらのタンパク質配列間の５６％同一性及び１４％類似性（同一のアミノ酸を除く）を示した。これは、マウス及びヒトオルソログ間で通常見られるよりも低度のホモロジーである（Ｍａｋａｌｏｗｓｋｉら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，６（９）：８４６−８５７（１９９６））。
ＰＲＯＳＩＴＥを用いる生命情報科学分析は、ヒトＤＩＳＣ１配列中に存在する３つのロイシンジッパーモチーフがマウス中に保存されていることを示した。生命情報科学分析法はＬａｎｄｓｃｈｕｌｚら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０（４８６０）：１７５９−１７６４（１９８８）；Ｂａｉｒｏｃｈ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９（補遺）：２２４１−２２４５（１９９１）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９（２３）：６５６５−６５７２（１９９１））に記載されている。ロイシンジッパーモチーフは、Ｄｉｓｃ１中のアミノ酸４５４−４７５、アミノ酸４６１−４８２及びアミノ酸６０３−６２４に、ＤＩＳＣ１中のアミノ酸４５８−４７９、アミノ酸４６５−４８６及びアミノ酸６０７−６２８に位置していた。
すでに記載されている（Ｍｉｌｌａｒら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，９（９）：１４１５−１４２３（２０００））ヒトＤＩＳＣ１タンパク質のＣ末端の多重コイルドメインはマウスタンパク質中にも保存されている。加えて、マウス配列のＩｎｔｅｒｐｒｏＳｃａｎデーターベース（Ａｐｗｅｉｌｅｒら，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ，１６（１２）：１１４５−１１５０（２０００））検索は、推定プレホールディグシャペロンＤＵＦ２３に対して低いホモロジーを示した（Ｍｏｒｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３（４５）：２９７９４−２９８００（１９９８））。対照的に、ヒトＤＩＳＣ１中に存在する二極性核移行シグナル（Ｄｉｎｇｗａｌｌら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２：３６７−３９０（１９８６））もトロポミオシンに対する弱いホモロジー（ｍａｃＬｅｏｄ，６（５）：２０８−２１２（１９８７））もＤｉｓｃ１中には見られなかった。
Ｄｉｓｃ１染色体局在化
マウスＤｉｓｃ１とヒトＤＩＳＣ１間のホモロジーレベルが低いために、クローン化Ｄｉｓｃ１遺伝子配列がマウスゲノム中のヒト染色体１ｑ４２に対応する合成領域に由来していたことを示すことによりマウスゲノム配列がＤＩＳＣ１の真のオルソログであることを証明すべくマウスゲノム配列を試験した。ＴＲＡＸ（トランスリン関連因子Ｘ；Ｔｓｎａｘ，ＮＭ＿０１６９０９）は、染色体１上のヒトＤＩＳＣ１配列に近位の３５ｋｂ（キロベース）であることが判明した（Ｍｉｌｌａｒら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，６７（１）：６９−７７（２０００））。
マウスＤｉｓｃ１とヒトＤＩＳＣ１間のホモロジーレベルが低いために、クローン化Ｄｉｓｃ１遺伝子配列がマウスゲノム中のヒト染色体１ｑ４２に対応する合成領域に由来していたことを示すことによりマウスゲノム配列がＤＩＳＣ１の真のオルソログであることを証明すべくマウスゲノム配列を試験した。ＴＲＡＸ（トランスリン関連因子Ｘ；Ｔｓｎａｘ，ＮＭ＿０１６９０９）は、染色体１上のヒトＤＩＳＣ１配列に近位の３５ｋｂ（キロベース）であることが判明した（Ｍｉｌｌａｒら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，６７（１）：６９−７７（２０００））。
ＴＩＧＲマウスＢＡＣ末端配列決定データーベースをマウスＴＲＡＸ（Ｔｓｎａｘ，ＮＭ＿０１６９０９）配列（ｗｗｗ．ｔｉｇ．ｏｒｇ）を用いて検索することによりマウスＢＡＣを同定した（Ｚｈａｏら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１１（１０）：１７３６−１４７５（２００１））。
Ｔｓｎａｘ配列を含む２つのＢＡＣが同定された。ＢＡＣ ４１８Ｌ１１はＴｓｎａｘのヌクレオチド９６４〜１４４６を含んでおり、ＢＡＣ ２３６Ｆ１９はＴｓｎａｘのヌクレオチド１５００〜２４１０を含んでいた（図５）。Ｄｉｓｃ１配列２５９Ｅ１２を含むＢＡＣは、ＥＳ ＢＡＣライブラリーに対してＤｉｓｃ１プローブをハイブリダイズすることによっても同定した。
ＴｓｎａｘがマウスゲノムのＤｉｓｃ１の近くに位置していることを確認するために、Ｔｓｎａｘ及びＤｉｓｃ１由来のプライマーを用いるＰＣＲ増幅を同定したＢＡＣの各々に対して実施した。４１８Ｌ１１はアミノ酸（ａａ）７３３〜９８３でＴｓｎａｘ ＤＮＡに対してポジティブであり、ａａ １５２４〜１６６０でＴｓｎａｘ ＤＮＡプライマーを用いてＴｓｎａｘ配列３’に対してネガティブであった。２３６Ｆ１９は４１８Ｌ１１の遠位にゲノムマウス配列を含んでいる。ＰＣＲ結果は、２３６Ｆ１９はａａ １５２４〜１６６０でＴｓｎａｘ配列に対してネガティブであるが、ａａ ２０３６〜２２５８でＴｓｎａｘ配列に対してポジティブであったことを示した。加えて、２３６Ｆ１９はａａ ６４０〜７７１及びａａ ８２８〜１０３５に対するプライマーを用いてＤｉｓｃ１配列に対してポジティブであった。この結果は、Ｄｉｓｃ１がヒト染色体１ｑ４２に相当するマウス合成領域にあったのでＤＩＳＣ１の真のオルソログであったことを示した。
ノーザン分析
Ｄｉｓｃ１プローブをＣｌｏｎｔｅｃｈマウス多組織ノーザンブロットに対してハイブリダイズした。低緊縮洗浄条件で、Ｄｉｓｃ１転写物が心臓、脳、腎臓及び精巣で同定された。心臓は７．０及び４．４ｋｂの転写物を有し、精巣は１０及び４．４ｋｂの転写物を有し、腎臓は４．４ｋｂの１つの転写物を有していた。かすかな転写物が７．０ｋｂで脳中でも同定された。Ｄｉｓｃ１プローブをＣｌｏｎｔｅｃｈラット多組織ノーザンブロットに対してハイブリダイズした。低緊縮洗浄条件で、Ｄｉｓｃ１転写物が心臓、脳、肝臓、骨格筋、腎臓及び精巣において同定された。より高い緊縮洗浄条件では、７．０ｋｂの１つの心臓転写物のみが同定された。
Ｄｉｓｃ１プローブをＣｌｏｎｔｅｃｈマウス多組織ノーザンブロットに対してハイブリダイズした。低緊縮洗浄条件で、Ｄｉｓｃ１転写物が心臓、脳、腎臓及び精巣で同定された。心臓は７．０及び４．４ｋｂの転写物を有し、精巣は１０及び４．４ｋｂの転写物を有し、腎臓は４．４ｋｂの１つの転写物を有していた。かすかな転写物が７．０ｋｂで脳中でも同定された。Ｄｉｓｃ１プローブをＣｌｏｎｔｅｃｈラット多組織ノーザンブロットに対してハイブリダイズした。低緊縮洗浄条件で、Ｄｉｓｃ１転写物が心臓、脳、肝臓、骨格筋、腎臓及び精巣において同定された。より高い緊縮洗浄条件では、７．０ｋｂの１つの心臓転写物のみが同定された。
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
Ｃ５７ＢＬ６マウス脳切片でＤｉｓｃ１リボプローブを用いて成熟マウス脳に対してｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析を実施した。海馬の歯状回では高レベルの発現が見られ、嗅球、小脳、並びに海馬のＣＡ１、ＣＡ２及びＣＡ３野では低レベルの発現が見られた。
Ｃ５７ＢＬ６マウス脳切片でＤｉｓｃ１リボプローブを用いて成熟マウス脳に対してｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析を実施した。海馬の歯状回では高レベルの発現が見られ、嗅球、小脳、並びに海馬のＣＡ１、ＣＡ２及びＣＡ３野では低レベルの発現が見られた。
他の実施態様も本発明の請求の範囲内である。幾つかの実施態様を示し、説明してきたが、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく各種修飾を加えることができる。
【配列表】
Claims (19)
- 配列番号１の少なくとも１８連続アミノ酸を含む精製ポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが配列番号１の少なくとも５０連続アミノ酸を含む請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドがエキソン１−エキソン２、エキソン２−エキソン３、エキソン３−エキソン４、エキソン４−エキソン５、エキソン５−エキソン６、エキソン６−エキソン７、エキソン７−エキソン８、エキソン８−エキソン９、エキソン９−エキソン１０、エキソン１０−エキソン１１、エキソン１１−エキソン１２及びエキソン１２−エキソン１３からなる群から選択される２つ以上の連続エキソンコード化領域の少なくとも９連続アミノ酸を含む請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが配列番号１、配列番号３、または修飾配列番号１のアミノ酸配列を含み、修飾配列番号１はアミノ酸４６：Ａ→Ｖ、アミノ酸５８：Ｇ→Ｄ、アミノ酸１１１：Ｅ→Ｄ、アミノ酸２１４：Ｆ→Ｌ及びアミノ酸２３１：Ｃ→Ｒからなる群から選択される１つ以上の修飾を含む、請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが配列番号１、配列番号３、または修飾配列番号１のアミノ酸配列からなり、修飾配列番号１はアミノ酸４６：Ａ→Ｖ、アミノ酸５８：Ｇ→Ｄ、アミノ酸１１１：Ｅ→Ｄ、アミノ酸２１４：Ｆ→Ｌ及びアミノ酸２３１：Ｃ→Ｒからなる群から選択される１つ以上の修飾を含む、請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列からなる請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。
- ａ）請求の範囲第１項から第６項のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードし、外因性プロモーターに転写的に連結されている；ｂ）配列番号２またはその相補体中に存在する少なくとも３０連続塩基であり、固体支持体に結合している；ｃ）配列番号２である；ｄ）ヌクレオチド１３７：Ｃ→Ｔ、ヌクレオチド１７３：Ｇ→Ａ、ヌクレオチド３３３：Ｇ→Ｔ、ヌクレオチド６０６：Ｃ→Ｔ、ヌクレオチド６４０：Ｔ→Ｃ、ヌクレオチド６９１：Ｔ→Ｃ及びヌクレオチド１１９１：Ｇ→Ａからなる群から選択される１つ以上の修飾を含む修飾配列番号２である；またはｅ）配列番号４である；のいずれかであるヌクレオチド配列を含む組換え核酸。
- 前記ヌクレオチド配列が配列番号２、配列番号４、または修飾配列番号２のいずれかであり、修飾配列番号２はヌクレオチド１３７：Ｃ→Ｔ、ヌクレオチド１７３：Ｇ→Ａ、ヌクレオチド３３３：Ｇ→Ｔ、ヌクレオチド６０６：Ｃ→Ｔ、ヌクレオチド６４０：Ｔ→Ｃ、ヌクレオチド６９１：Ｔ→Ｃ及びヌクレオチド１１９１：Ｇ→Ａからなる群から選択される１つ以上の修飾を含み、前記ヌクレンチド配列が外因性プロモーターに転写的に連結されている請求の範囲第７項に記載の組換え核酸。
- 前記組換え核酸が発現ベクターである請求の範囲第８項に記載の組換え核酸。
- 前記細胞がプロモーターにより認識されるＲＮＡポリメラーゼを含む請求の範囲第９項に記載の組換え核酸を含む組換え細胞。
- マウス細胞ゲノムに配列番号１の少なくとも２０連続塩基をコードする組換え核酸を導入するステップを含む方法により作成される組換え細胞。
- ヒト精神分裂病における欠損１（ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ−ｉｎ−ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ１）ポリペプチド全体わたり、配列番号１のポリペプチドに選択的に結合する抗体を含む精製抗体調製物。
- 配列番号１の少なくとも２０連続アミノ酸を含む精神分裂病における欠損１（Ｄｉｓｃ１）ポリペプチドをコードする対立遺伝子の改変を含み、前記改変により対立遺伝子からの前記ポリペプチドの完全長発現が実質的に減少または増加している組換えマウス。
- Ｄｉｓｃ１ポリペプチドが配列番号１、配列番号３、または修飾配列番号１からなり、修飾配列番号１はアミノ酸４６：Ａ→Ｖ、アミノ酸５８：Ｇ→Ｄ、アミノ酸１１１：Ｅ→Ｄ、アミノ酸２１４：Ｆ→Ｌ及びアミノ酸２３１：Ｃ→Ｒからなる群から選択される１つ以上の修飾を含む、請求の範囲第１３項に記載の組換えマウス。
- 前記改変が前記ポリペプチドの発現を実質的に除去する請求の範囲第１３項に記載の組換えマウス。
- 前記改変により短小化ポリペプチドが生ずる請求の範囲第１３項に記載の組換えマウス。
- 前記マウスが両Ｄｉｓｃ１対立遺伝子の改変を含み、前記改変により前記対立遺伝子からのポリペプチドの完全長発現が実質的に低下している請求の範囲第１３項に記載の組換えマウス。
- （ａ）配列番号１の少なくとも約２０連続アミノ酸を含む化合物をＤｉｓｃ１ポリペプチドと接触させるステップ、及び（ｂ）Ｄｉｓｃ１ポリペプチドに結合する化合物の能力を調べるステップを含むＤｉｓｃ１ポリペプチドに結合し得る化合物のスクリーニング方法。
- ポリペプチドが配列番号１、配列番号３、または修飾配列番号１からなり、修飾配列番号１はアミノ酸４６：Ａ→Ｖ、アミノ酸５８：Ｇ→Ｄ、アミノ酸１１１：Ｅ→Ｄ、アミノ酸２１４：Ｆ→Ｌ及びアミノ酸２３１：Ｃ→Ｒからなる群から選択される１つ以上の修飾を含む、請求の範囲第１８項に記載の方法。
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