JP2004508279A - 薬剤を異常脳領域及び／又は悪性腫瘍にデリバリーするためにカリウムチャンネル活性化を用いる方法 - Google Patents
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Abstract
ヒトを含む哺乳動物において異常脳領域及び／又は悪性腫瘍に薬剤を選択的にデリバリーする方法が開示される。薬剤は、カルシウム依存性カリウムチャンネル又はＡＴＰ依存性カリウムチャンネル［ＫＣａ又はＫＡＴＰ］活性化物質（ブラジキニン又はブラジキニン類似体以外）、例えば、直接カリウムチャンネルアゴニスト又は間接カリウムチャンネル活性化物質、例えば、可溶性グアニリルシクラーゼ（例えば、一酸化窒素又は一酸化窒素供与体）又はサイクリックＧＭＰ依存性プロテインキナーゼと同時に又は実質的に同時に投与され、よって薬剤が正常組織と比べて異常脳領域の細胞及び／又は腫瘍に選択的にデリバリーされる。従って、ヒトにおける悪性腫瘍を治療する方法が開示される。また、薬剤と共にカリウムチャンネル活性化物質と組合わせた医薬組成物、及び異常脳領域及び／又は悪性腫瘍への薬剤のデリバリーを高めるためのキットが開示される。
Description
【０００１】
発明の背景
本願明細書全体に種々の文献が括弧に引用されている。本発明が関係している技術水準を詳細に記載するために、これらの文献の開示内容は全体で本願明細書に含まれるものとする。
【０００２】
１． 発明の分野
本発明は、医療技術に関する。特に、異常な微小血管系を横切って治療を必要としている組織への薬剤のデリバリーを高める方法に関する。
【０００３】
２． 関連技術の説明
病的血管新生、即ち、新しい血管の増殖又は発生は、原発性、続発性又は転移性悪性腫瘍の成長と拡散に不可欠なものである。固形腫瘍において新生微小血管系を構成している新しい毛細血管と細動脈のある種の性質は正常な微小血管系と異なっている（Ｊ． Ｄｅｎｅｋａｍｐら， 血管系と微小周囲勾配： がん治療の新規な方法におけるミッシングリンク， Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ． ３８− ９９ ［１９９８］）。悪性腫瘍細胞からの血管形成によって誘導された新生微小血管系は、腫瘍形成性細胞によって誘導されなかった新生微小血管系に比べて一部の血管収縮剤に対して薬理学的反応性が変化することが報告された（Ｓ．Ｐ． Ａｎｄｒａｄｅ ＆ Ｗ．Ｔ． Ｂｅｒａｌｄｏ， 血管収縮剤に対する新生物又は非新生物関連新生血管系の薬理的反応性， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｐａｔｈｏｌ． ７９（６）：４２５−３２ ［１９９８］）。
多くのがん治療の提案は、新生微小血管系と正常微小血管系間の差異に基づくものであった。例えば、コンブレタスタチンＡ−４は、正常血管と比べて悪性腫瘍の血管に選択的に血管損傷及び閉塞を引き起こすことがわかった（Ｇ．Ｇ． Ｄａｒｋら， コンブレタスタチンＡ−４， 腫瘍血管系に対して強力で選択的な毒性を示す薬剤， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７（１０）：１８２９−３４ ［１９９７］； Ｄ．Ｊ． Ｃｈａｐｌｉｎ ｅｔ ａｌ， 固形腫瘍治療の抗血管アプローチ： コンブレタスタチンＡ４リン酸塩の評価， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９（ＩＡ）：１８９−９５ ［１９９９］）。
【０００４】
モノクローナル抗体は、新生血管系において血栓症を選択的に誘導するために、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）−Ｉ、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、糖タンパク質エンドシアリン、又は前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のような病的新生血管系の内皮細胞に特異的な抗原又は抗原の組合わせに向けられていた（Ｅ．ｇ．， Ｓ． Ｒａｎら， 腫瘍血管系の組織要素の抗体特定ターゲッティングによるマウスにおける固形ホジキン腫瘍の梗塞， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８（２０）：４６４６−５３ ［１９９８］； Ｉ． Ｏｈｉｚｕｍｉら， 腫瘍血管内皮細胞を標的にする抗体に基づく治療はラットにおける固形腫瘍成長を抑制する， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２３６（２）：４９３−９６ ［１９９７］； Ｓ．Ｓ． Ｃｈａｎｇら， ５種類の異なる抗前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）抗体は腫瘍関連新生血管系においてＰＳＡＭ発現を確認する， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９（１３）：３１９２−９８ ［１９９９］； Ｗ．Ｊ． Ｒｅｔｔｉｇら， ヒトがんにおける血管内皮細胞の細胞表面糖タンパク質、エンドシアリンの同定， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９（２２）：１０８３２−３６ ［１９９２］）。しかし、単独で用いられると、新生微小血管系を通る悪性腫瘍への血流を閉鎖することにより、必ずしも腫瘍成長が停止しないことがある。固形腫瘍の周辺の腫瘍形成性物細胞の活発に増殖する集団が正常微小血管系によって供給された血液に接近できるからである（Ｅ． ｇ．， Ｄ． Ｊ． Ｃｈａｐｌｉｎら ［１９９９］）。
【０００５】
その結果、他の従来の及び新規な治療様式が固形悪性腫瘍の治療に依然として価値がある。しかしながら、細胞障害性化学療法剤、モノクローナル抗体、サイトカイン、エフェクター細胞、又はウイルス粒子を含む新規な治療剤の効力は、適量で生体内の標的に到達する能力が制限されているため、この新規な治療剤の効果が限定されたものになっている（例えば、Ｒ．Ｋ Ｊａｉｎ， 腫瘍に治療剤をデリバリーするための血管間質関門， Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ． ９（３）：２５３−６６ ［１９９０］）。重要な制限要因は、腫瘍に供給される新生微小血管系の巨大分子やウイルス粒子に対する透過性が低いことである。
この微小血管透過性の問題は、中枢神経系の悪性腫瘍については特に深刻である。これらの悪性度は、神経外科的手法、化学療法及び放射線療法の領域における最近の進歩にもかかわらず、普通は致命的である。特に、脳、頭蓋、及び脊髄の悪性腫瘍をもつ患者の予後を実質的に変え得る標準治療様式はない。例えば、脳全体に浸潤の腫瘍細胞が特徴である、悪性髄芽腫、悪性髄膜腫、悪性神経線維肉腫及び悪性グリオーマと診断された患者に高死亡率が持続している。頭蓋内腫瘍塊は、手術で塊を除去し得るが、一時的な放射線療法や化学療法で治療した頭蓋内腫瘍、例えば、グリア芽細胞腫に伴う生存は、典型的には数ヶ月と測定されている。固形脳腫瘍に対する新しい治療様式の開発は、主に潜在的治療剤の経血管デリバリーに左右される。
【０００６】
化学療法剤やウイルス粒子の腫瘍細胞又は他の異常脳組織への経血管デリバリーは、血液脳関門、特に脳腫瘍に見られる血液腫瘍関門によって妨害される。血液脳関門は、正常脳組織と異常脳組織双方の脳毛細血管と細動脈の脳血管性内皮細胞によって形成された内皮間密着結合から生じると考えられる経血管透過性関門である。血液脳関門の維持は、おそらく内在性一酸化窒素の生産及びサイクリックＧＭＰ依存性機序が関与している（Ｌｉｕ， Ｓ．Ｍ． ＆ Ｓｕｎｄｑｖｉｓｔ， Ｔ．， 一酸化窒素やｃＧＭＰは過酸化水素処理内皮細胞において内皮透過性とＦ−アクチン分布を調節する， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ． Ｒｅｓ． ２３５（ｌ） ２３８−４４ ［１９９７］）。血液脳関門は、全身系血液供給の組成の変化（例えば、電解質として）又は血液から生じた巨大分子、例えば、免疫グロブリン又は他のポリぺプチドから脳を保護し、多くの外因性供給薬剤の脳組織への経血管デリバリーを妨げる。
脳組織異常、例えば、腫瘍の治療は、それ自体の毒性が著しい薬剤の使用がしばしば必要であり、その薬剤を異常組織又は悪性組織に優先的に向けることができることが非常に望ましい。一方、薬剤を脳に運搬することができる血液脳関門を開くことができる技術を開発することに多くの関心があった。これらの方法のいくつかは、無傷の正常脳組織において血液脳関門を残しつつ異常脳組織においてのみ血液脳関門を選択的に開くことができるものである。
【０００７】
例えば、Ｎｅｕｗｅｌｔらは、血液脳関門を浸透圧で破壊するために高張マンニトールの頚動脈内注射を用いた。頚動脈内大量注射により直後に投与された不活性化ＨＳＶ−１粒子の脳組織による吸収を高めたことが報告された（Ｅ．Ａ． Ｎｅｕｗｅｌｔら， 浸透圧修飾血液脳関門を横切る紫外線不活性化ヘルペスウイルスのデリバリー， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． ７４（３）：４７５−７９ ［１９９１］； また、Ｓ．Ｅ． Ｄｏｒａｎら， 血液脳関門破壊後の中枢神経系における組換えウイルスベクターからの遺伝子発現， Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ ３６（５）：９６５−７０ ［１９９５］； Ｇ． Ｎｉｌａｖｅｒら， 浸透圧血液脳関門破壊後のヌードマウス脳内腫瘍へのヘルペスウイルスやアデノウイルスのデリバリー， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２（２１）：９８２９−３３ ［１９９５］）。
ロイコトリエンＣ．ｓｕｂ．４ （ＬＴＣ．ｓｕｂ．４）を頚動脈内インフュージョンすると、正常脳毛細血管の透過性に影響せずに脳腫瘍毛細血管の透過性が選択的に高められる。しかしながら、脳腫瘍毛細血管に対するＬＴＣ．ｓｕｂ．４の作用は、小分子に限られ、正常脳組織に相対して異常脳組織における小分子の透過性をわずかしか高めることができない。従って、ＬＴＣ．ｓｕｂ．４は大きな水溶性分子の脳腫瘍又は他の異常へのデリバリーをほとんど増加させない。
【０００８】
血管作動性ナノぺプチドブラジキニンやそのアゴニスト又はその類似体（例えば、受容体仲介透過化処理剤［ＲＮＴｓ］）は、同時投与神経薬剤又は診断剤に対する血液脳関門透過性を高めるために静脈内に注射された（Ｂ． Ｍａｌｆｔｏｙ−Ｃａｍｉｎｅ， 血液脳関門透過性のブラジキニンアゴニストを投与することにより血液脳関門を高める方法， 米国特許第５，１１２，５９６号； Ｊ．Ｗ． Ｋｏｚａｒｉｃｈら， 透過化処理剤ぺプチドによる血液脳関門透過性を高める， 米国特許第５，２６８，１６４号）。ブラジキニンを頚動脈内インフュージョンすると、分子量が１００〜７０，０００ダルトンの範囲内にある分子に対して脳腫瘍及び虚血脳毛細血管の透過性が２〜１２倍選択的に高められる（Ｉｎａｍｕｒａ， Ｔ．ら， ブラジキニンは実験脳腫瘍において血液腫瘍関門を選択的に開放する， Ｊ． Ｃｅｒｅｂ． Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ． １４（５）：８６２−７０ ［１９９４］）。ブラジキニンは、非常に多量の投与の場合を除いて正常血液脳関門の透過性を高めない（Ｗｉｒｔｈ， Ｋ．ら， ＤｅｓＡｒｇ９−Ｄ−Ａｒｇ［Ｈｙｐ３，Ｔｈｉ５，Ｄ−Ｔｉｃ７，Ｏｉｃ８］ブラジキニン（ｄｅｓＡｒｇ ［Ｈｏｅ．１４０］）は強力なブラジキニンＢ１受容体アンタゴニストである， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０５ （２）： ２１７−１８［１９９１］）。ブラジキニンによる血液腫瘍関門の開放は、一時的なものであり、ｌ５〜２Ｏ分間続く（Ｉｎａｍｕｒａら ［１９９４］）。ブラジキニンで異常脳毛細血管を開けた後、それらの毛細血管は６０分間までブラジキニン作用に無反応性になる（Ｉｎａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ ［１９９４］）。
【０００９】
神経薬剤（例えば、５−フルオロウラシル、シスプラチン、メトトレキセート、又はモノクローナル抗体）又は診断剤（例えば、テクニシウム−９９グルコヘプトネート、ガリウム−ＥＤＴＡ、又は鉄（ＩＩ）磁気物質又はヨウ素化造影剤）を異常脳組織に選択的にデリバリーする方法は、ブラジキニン、又はブラジキニン類似体、例えば、ＲＭＰ−７の頚動脈内インフュージョンを用い、該ブラジキニン又はブラジキニン類似体は該薬剤とほぼ同時に投与された（Ｋ．Ｌ． Ｂｌａｃｋ， 異常脳組織毛細血管の選択的開放方法， 米国特許第５，５２７，７７８号及び同第５，４３４，１３７号）。ＨＳＶ由来ウイルス粒子のラットの脳における悪性腫瘍細胞への増強された経血管デリバリーは、血管脳関門をブラジキニン又はＲＭＰで破壊することにより達成された（Ｎ．Ｇ． Ｒａｉｎｏｖ， 実験脳新生物に動脈内デリバリーしたウイルス粒子又はモノクリスタリン粒子の選択的吸収， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ． Ｔｈｅｒ． ６（１２）：１５４３−５２ ［１９９５］； Ｎ．Ｇ． Ｒａｉｎｏｖら， 治療的単純ヘルペスウイルスベクターのブラジキニン増強動脈内デリバリーによるげっ歯類脳腫瘍モデルの長期生存， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５（３）：１５８−６２ ［１９９８］； Ｆ．Ｈ． Ｂａｒｎｅｔｔら， ＲＭＰ−７を用いた実験脳腫瘍へのヘルペスウイルスベクターの選択的デリバリー， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ６（ｌ）：１４−２０ ［１９９９］）。
【００１０】
カルシウム活性化カリウムチャンネル（ＫＣａ）は血管張力の重要な調整剤である （Ｎｅｌｓｏｎ ＭＴ， Ｑｕａｙｌｅ ＪＭ． 動脈平滑筋のカリウムチャンネルの生理的役割と性質， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２６８（４ Ｐｔ １）： Ｃ７９９−８２２［１９９５］； Ｂａｎｇ， Ｌ．ら， ニトログリセリン仲介血管弛緩は内皮カルシウム活性化カリウムチャンネルによりモジュレートされる， Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｒｅｓ． ４３（３）：７７２−７８ ［１９９９］）。ＫＣａチャンネルは、組織とサブユニットに遍在的に配分される。その活性は、脱分極が引き金になり、サイトゾルカルシウムジカチオン（Ｃａ２＋）の増加により高められる。Ｃａ２＋の局所的増加は、ＫＣａの非常に感受性のある脳サブユニットが感じ、細胞内の細胞質に対して向けられ、これらのチャンネルを通るかなりのカリウムカチオン流量を可能にする。細胞内サイクリック３’，５’アデノシン一リン酸濃度（ｃＡＭＰ）が血管内皮で上昇する条件 （例えば、低酸素）下で、ＡＴＰ感受性カリウムチャンネル（ＫＡＴＰ）は役割を果たすことができる（Ｊ．Ｅ． Ｂｒｉａｎら， 脳循環調節の最近の洞察， Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２３（６−７）： ４４９−５７ ［１９９６］）。ミノキシジル硫酸塩やクロマカリムは、ＫＡＴＰの活性化物質であることが報告されている（Ａ．Ｄ． Ｗｉｃｋｅｎｄｅｎら， 血管平滑筋に対するＫ（＋）−チャンネル開放物質クロマカリムとミノキシジル硫酸塩の作用の比較， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ， １０３（ｌ）： １１４８−５２ ［１９９１］）。
【００１１】
サイクリックＧＭＰ （ｃＧＭＰ）として一般に既知のグアノシン３’，５’−サイクリック一リン酸はカリウムチャンネルの調節と深く関係があり、重要なシグナル導入分子は３種類の主要なエフェクタータンパク質： （１） タンパク質リン酸化を仲介するｃＧＭＰ−依存性プロテインキナーゼ； （２） 形質膜を横切るカチオン流入を仲介するｃＧＭＰ−ゲートイオンチャンネルプロテインキナーゼ及び（３） サイクリックヌクレオチド異化作用を仲介するホスホジエステラーゼの調節を仲介する（Ｌｏｈｓｅ， ＭＪ．ら， ＮＯ：ｃＧＭＰシグナル導入の薬理学， Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ Ａｒｃｈ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３５８：１１１−１２ ［１９９８］； Ｓｍｏｌｅｎｓｋｉ， Ａ．ら， ＮＯ／ｃＧＭＰ作用の伝達物質としてのｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼＩ及びＨの機能分析， Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ Ａｒｃｈ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３５８：１３４−３９ ［１９９８］； Ｈｅ， Ｐ．ら， ｃＧＭＰは ［Ｃａ２＋］ｉの基礎的活性化微小血管透過性を独立してモジュレートする， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２７４（６ Ｐｔ ２）：ＨＩ８６５−７４ ［１９９８］； Ｈｏｌｓｃｈｅｒｍａｎｎ， Ｈ．ら， 大動脈内皮細胞の巨大分子のモジュレーションにおけるｃＧＭＰの２つの役割， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２７２（ｌ Ｐｔ ２）：Ｈ９１−９８ ［１９９７］）。
ｃＧＭＰのＧＴＰからの生産は、可溶性グアニリルシクラーゼ、一酸化窒素活性化酵素によって触媒される（Ｐａｔｅｌ， Ａ．Ｉ． ＆ Ｄｉａｍｏｎｄ， Ｊ．， ニトログリセリンやニトロプルシドナトリウムによるグアノシン３’，５’−サイクリック一リン酸（ｃＧＭＰ）依存性プロテインキナーゼの活性化， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２８３（２）：８８５−９３ ［１９９７］； Ｐａｔｅｌ， Ａ．Ｉ．ら， ラット精管や遠位結腸におけるグアノシン３’，５’−サイクリック一リン酸（ｃＧＭＰ）依存性プロテインキナーゼの活性化は収縮阻害を付随しない， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２８３（２）：８９４−９００ ［１９９７］）。
【００１２】
一酸化窒素が微小血管張力の調節に関与することも証明されている（Ｊｏｏ， Ｆ．ら， 脳微小血管における巨大分子輸送の調節： サイクリックＧＭＰの役割， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ２７８（１−２）：１６５−７４ １９８３］）。例えば、グリア腫瘍や虚血組織は正常脳に対してｎＮＯＳやｅＮＯＳに免疫陽性である（Ｃａｉ， Ｚ．ら ， 出生前低酸素虚血は若年ラット脳において一酸化窒素シンターゼの発現と活性を変化させ、学習欠損を引き起こす， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｂｕｌｌ． ４９（５）：３５９−６５ ［１９９９］； Ｎａｋａｎｏ， Ｓ．ら， 頚動脈内ブラジキニンインフュージョン後の高脳腫瘍微小血管透過性は一酸化窒素により仲介される， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５ ６：４０２７−４０３１ ［１９９６］； Ｆａｒａｃｉ， Ｆ．Ｍ．ら， 脳微小循環の拡張応答における可溶性グアニル酸シクラーゼの役割， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ８２１（２）：３６８−７３ ［１９９９］）。更に、グリオーマをもつラットをＮＯＳ阻害剤、Ｌ−ＮＡＭＥで前処理すると、ブラジキニン誘導透過性が著しく低下する（Ｍｏｎｃａｄａ， Ｓ．ら， 内在一酸化窒素： 生理的、病理的及び臨床的関連， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ２１（４）３６１−７４ ［１９９１］； Ｓｕｇｉｔａ， Ｍ．ら， 一酸化窒素やサイクリックＧＭＰはブラジキニンに対する腫瘍関門の感受性を減弱させる， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０： ５５９−５６３ ［１９９８］）。
【００１３】
ｃＧＭＰ（及びｃＡＭＰ）によって活性化される種類の酵素は、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＧ又はｃＧＫ）であり、酵素ＡＴＰ依存性リン酸化によって直接又は間接にカルシウム依存性カリウムチャンネルを活性化する（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， Ｂ．Ｅ．ら， ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼは脳動脈平滑筋細胞においてＣａ活性化Ｋチャンネルを活性化する， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２６５［Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ３４］： Ｃ２９９−Ｃ３０３ ［１９９３］； Ｆｕｋａｏ， Ｍ．ら， サイクリックＧＭＰ依存性プロテインキナーゼはセリン１０７２の直接リン酸化により哺乳動物細胞内で発現したクローン化ＢＫＣａチャンネルを活性化する， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４（１６）：１０９２７−３ ５ ［１９９９］； Ｂｅｃｋｅｒ， Ｅ．Ｍ．ら， 血管拡張剤刺激リンタンパク質（ＶＡＳＰ）： ヒト又はラット血小板におけるＹＣ−１及び一酸化窒素作用の標的， Ｊ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３５（３）：３９０−９７［２０００］）。一酸化窒素は、ｃＧＭＰ依存性機序とｃＧＭＰ非依存性機序双方によってＫＣａを活性化し得ることも証明されている（Ｃｈｅｎ， Ｃ．Ｈ．ら， 一酸化窒素は培養したウシ副腎クロマフィン細胞においてＣａ２＋ 活性化Ｋ＋ チャンネルを活性化する， Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｌｅｔｔ． ２４８（２）：１２７−２９ ［１９９８］； Ｖａａｌｉ， Ｋ．ら， 試験管内モルモット気管ＮＯ供与体の弛緩作用はカルシウム感受性カリウムチャンネルによって仲介される， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ， Ｔｈｅｒ． ２８６（ｌ）：１１０−１４ ［１９９８］； Ｓｏｂｅｙ， Ｃ．Ｇ． ＆ Ｆａｒａｃｉ， Ｆ．Ｍ．， 一酸化窒素に対する基底動脈の応答に対する４−アミノピリジンの阻害作用， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １２６（６）：１４３７−４３ ［１９９９］； Ｋｕｒｔｚ， Ａ．ら， 腎血管系に対する一酸化窒素作用機序， Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｓｃａｎｄ． １６８（ｌ）：４１−４５ ［２０００］）。
【００１４】
カリウムチャンネル活性化物質又はアゴニストの使用に対する治療は、高血圧、心臓虚血又は脳虚血、ニコチン嗜癖、気管支狭窄、又は神経変性疾患について教示しているが、特に悪性腫瘍の治療については教示していない（Ｅｒｈａｒｄｔら， カリウムチャンネル活性化物質／開放物質， 米国特許第５，４１６，０９７号； Ｓｃｈｏｈｅ−Ｌｏｏｐら， ４，４’−架橋ビス−２，４−ジアミノキナゾリン， 米国特許第５，７６０，２３０号； Ｓｉｔら， 鉄チャンネルモジュレーターとしての４−アリール−３−ヒドロキシキノリン−２−オン誘導体， 米国特許第５，９２２，７３５号； Ｇａｒｃｉａら， 生物活性化合物， 米国特許第５，３９９，５８７号； Ｃｈｅｒｋｓｅｙ， カリウムチャンネル活性化化合物とその使用方法， 米国特許第５，２３４，９４７号）。
【００１５】
ブラジキニンは［Ｃａ２＋］ｉを高めると考えられるので、ＫＣａチャンネルを活性化することができる。他の既知のＫＣａ活性化物質は、血管拡張剤、例えば、１，３−ジヒドロ−１−［２−ヒドロキシ−５−（トリフルオロメチル）フェニル］−５−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン（ＮＳ−１６１９； Ｍ． Ｈｏｌｌａｎｄら， ラット動脈平滑筋に対するＢＫＣａチャンネル活性化物質、ＮＳ１６１９の作用， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １１７（ｌ）：１１９−２９ ［１９９６］）として作用しないが、 ＫＣａがブラジキニン、一酸化窒素供与体、サイクリックグアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、又はグアニリルシクラーゼ活性化物質のような血管拡張剤によって仲介される血管拡張に重要な役割を果たすことができる証拠が蓄積している（Ｂｅｒｇ Ｔ．， Ｋｏｔｅｎｇ Ｏ．， 正常血圧ラットにおけるブラジキニン誘導又は一酸化窒素誘導低血圧のシグナリング経路； Ｋ＋ チャンネルの役割， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １２１（６）：１１１３−２０ ［１９９７］； Ｂｏｌｏｔｉｎａ， Ｖ．Ｍ．ら， 一酸化窒素は血管平滑筋においてカルシウム依存性カリウムチャンネルを直接活性化する， Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５０−３ ［１９９４］； Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， Ｂ．Ｅ．， ｅｔ ａｔ， ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼは脳動脈平滑菌細胞においてＣａ活性化Ｋチャンネルを活性化する， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２６５（ｌ Ｐｔ １）：Ｃ２９９−３０３ ［１９９３］； Ｓｏｂｅｙ， Ｃ．Ｇ．ら， ラットにおけるブラジキニン誘導脳血管拡張の機序． 反応性酸素化学種がＫ＋ チャンネルを活性化する証拠， Ｓｔｒｏｋｅ ２８（１１）：２２９０−４； ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ２２９５ ［１９９７］； Ｃ．Ｇ． Ｓｏｂｅｙ ＆ Ｆ．Ｍ． Ｆａｒａｃｉ， 基底動脈直径に対する一酸化窒素及びカリウムチャンネルアゴニスト及び阻害剤の影響， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２７２（ｌ Ｐｔ ２）：Ｈ２５６−６２ ［１９９７］； Ｈａｒｄｙ， Ｐ． ｅｔ ａｔ， 子ブタにおける一酸化窒素誘導眼血管弛緩におけるプロスタサイクリンの主な役割， Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ８３ （７）：７２１−２９ ［１９９８］； Ｂｙｃｈｋｏｖ Ｒ．ら， ヒト冠状動脈におけるカルシウム活性化カリウムチャンネルと硝酸塩誘導血管拡張， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２８５（ｌ）：２９３−９８ ［１９９８］； Ａｒｍｓｔｅａｄ， Ｗ．Ｍ．， 低酸素脳血管拡張に対するＫＣａチャンネル活性化の寄与はＮＯを必要としない， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ７９９（ｌ）：４４−４８ ［１９９８］）。
【００１６】
強力な血管拡張剤としてのブラジキニンの作用は、抗がん治療剤に対して血液脳関門を開くためにブラジキニンを用いる場合に不利である。ブラジキニン又はその類似体は逆に血圧を低くすることがあり、脳血流を減少させることもあり、一部の患者においては脳浮腫の原因となることがある（例えば、Ａ．Ｍ． Ｂｕｔｔ， 麻酔したラットの軟膜微小血管における血液脳関門を横切る電気抵抗に対する炎症性物質の作用， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ６９６（１−２）：１４５−５０［１９９５］）。更に、ブラジキニンは、平滑筋を収縮させ、疼痛受容体を刺激する。
その結果、中枢神経系、及び／又は他の異常脳領域を含む悪性腫瘍への選択的経血管デリバリー増強によって種々の治療剤の有効性を最大にすることがなお明らかに求められている。本発明のこれらの及び他の利点は、本明細書に記載される通りである。
【００１７】
発明の概要
本発明は、ヒトを含む哺乳動物において異常脳領域に薬剤をデリバリーする方法に関する。本方法は、該哺乳動物にカリウムチャンネル活性化物質（即ち、カルシウム依存性カリウムチャンネル又はＡＴＰ依存性カリウムチャンネル［ＫＣａ又はＫＡＴＰ］）を投与する段階を含んでいる。カリウムチャンネル活性化物質としては、直接アゴニスト（ブラジキニン又はブラジキニン類似体以外の）、例えば、ＮＳ−１６１９又はミノキシジルが含まれる。カリウムチャンネル活性化物質には、カリウムチャンネルを間接に活性化する化合物、例えば、一酸化窒素、一酸化窒素供与体、又はグアニリルシクラーゼの他の活性化物質も含まれる。カルシウム依存性カリウムチャンネルを活性化するサイクリックＧＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化物質も含まれる。カリウムチャンネル活性化物質は、哺乳動物における異常脳領域の細胞に血液を送る毛細血管又は細動脈の薬剤に対する透過性を高めるのに十分な条件と量で哺乳動物に投与される。カリウムチャンネル活性化物質と同時に又は実質的に同時に薬剤が投与され、異常脳領域を与える毛細血管や細動脈の透過性が増大する結果、薬剤は正常脳領域に比べて異常領域の細胞に選択的にデリバリーされる。本方法は、生存率が悪いことが周知の外傷、感染症、卒中、虚血、又は特に悪性脳腫瘍による物理的又は性化学的脳損傷の治療に特に有効である。
【００１８】
本発明は、本発明の脳又は身体のどこかの悪性腫瘍に薬剤をデリバリーする方法に関する。本方法は、ブラジキニン又はブラジキニン類似体以外のカリウムチャンネルアゴニストのようなカリウムチャンネル活性化物質を哺乳動物において悪性腫瘍の細胞に血液を送る毛細血管又は細動脈の薬剤に対する透過性を高めるのに十分な条件と量で哺乳動物に投与する段階を含んでいる。カリウムチャンネル活性化物質と同時に又は実質的に同時に薬剤を哺乳動物に投与し、カリウムチャンネル活性化物質によって非悪性腫瘍細胞と比べて悪性腫瘍細胞に選択的にデリバリーされる。本発明の方法は、新生物組織への薬剤デリバリーの選択性を高め、よって細胞障害性化学療法剤を含む薬剤から非悪性腫瘍組織に対する損傷をできるだけ少なくし、該薬剤の治療作用又は診断作用を集中させることによりあらゆる種類の悪性腫瘍を治療することに有効である。従って、ヒトにおいて悪性腫瘍を治療する方法に関する本発明は、がん患者に対する生存の見込みが高く、有害な副作用が少ない。本方法の選択性は、種々の薬剤、巨大分子、又はウイルス粒子に対する微小血管系の透過性を仲介する際のカルシウム依存性カリウム輸送体やＡＴＰ依存性カリウム輸送体（チャンネル）の役割と、正常微小血管経と比べて異常脳血管系又は腫瘍新生微小血管系に存在する多くのカルシウム依存性カリウムチャンネルやＡＴＰ依存性カリウムチャンネルとの組合わせに基づくものである。
【００１９】
本発明は、また、ヒトのような哺乳動物へ血管内インフュージョン又はボーラス注射によりデリバリーするための薬剤と共に薬学的に許容しうる溶液中に処方されたブラジキニン又はブラジキニン類似物以外のカリウムチャンネル活性化物質の組合わせを含む医薬組成物に関する。本医薬組成物は、本発明の方法を行うのに有効である。
本発明は、また、異常脳領域及び／又は悪性腫瘍への薬剤のデリバリーを高めるキットに関する
本発明のこれらの及び他の利点及び特徴は、下記の好適実施態様の詳細な説明において詳細に記載される。
【００２０】
好適実施態様の詳細な説明
本発明の方法は、哺乳動物において異常脳領域及び／又は悪性腫瘍に薬剤を選択的にデリバリーするのに有効である。本方法は、ブラジキニン又はブラジキニン類似体以外のカリウムチャンネル活性化物質を哺乳動物に、哺乳動物に存在する異常脳領域の細胞及び／又は悪性腫瘍の悪性腫瘍細胞へ血液を送る毛細血管又は細動脈の薬剤に対する透過性を高めるのに十分な条件と量で投与する段階を含んでいる。透過性の増強は、カリウムチャンネル活性化物質を投与しない対照に比べて少なくとも２〜６倍の範囲にある。透過性の相対的増強は、低分子量物質（例えば、約５０−２００ダルトン）より高分子量物質（例えば、約１０，０００−２５０，０００ダルトン）に対して著しい傾向がある。
【００２１】
異常脳領域には、物理的又は生化学的損傷、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、外傷、感染、卒中、脳虚血、又は脳内の新生物成長領域、例えば、良性又は悪性脳腫瘍組織により生理的に直接影響された脳組織領域が含まれる。
本発明は、また、脳における悪性腫瘍又は哺乳動物の身体のどこかの腫瘍に薬剤を選択的にデリバリーするのに有効である。本発明の技術は、グリオーマ、グリア芽細胞腫、希突起グリオーマ、星状細胞腫、上衣細胞腫、胎生神経外胚芽性腫瘍、非定型髄膜腫、悪性髄膜腫、神経芽細胞腫、肉腫、黒色腫、リンパ腫、又はがん腫を含む固形悪性腫瘍の全種類の治療に有効である。治療すべき腫瘍は、頭骨、脳、脊柱、胸郭、肺、腹膜、前立腺、卵巣、子宮、乳房、胃、肝、腸、結腸、直腸、骨、リンパ系、皮膚、又は哺乳動物の他の器官又は組織に含まれ得る。
【００２２】
本発明の方法は、ヒトを含む哺乳動物、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジの哺乳動物、又はマウス、ラット、ジャービル、ハムスター、又はウサギのような小哺乳動物を治療するのに有効である。
カリウムチャンネル活性化物質は、コンダクタンスが大きくても中間でも小さくてもあらゆるコンダクタンスレベルのカルシウム活性化カリウムチャンネル（ＫＣａ）か又はＡＴＰ感受性カリウムチャンネル（ＫＡＴＰ）の活性化物質である。ＫＣａの直接アゴニスト、例えば、１，３−ジヒドロ−ｌ−［２−ヒドロキシ−５−（トリフルオロメチル）フェニル］−５−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン（ＮＳ−１６１９）又は１−エチル−２−ベンズイミダゾリノン（１−ＥＢＩＯ）が含まれる。
【００２３】
また、有効なカリウムチャンネル活性化物質には、カリウムチャンネルを間接に活性化する化合物、例えば、一酸化窒素、一酸化窒素供与体、メタロポルフィリン（例えば、亜鉛プロトポルフィリン又はスズプロトポルフィリンＩＸ）、ＹＣ−１（ベンジルインダゾール誘導体）、又はグアニリルシクラーゼ活性化タンパク質（ＧＣＡＰ）のような可溶性グアニリル（即ち、グアニル酸）シクラーゼの活性化物質が含まれる（例えば、Ｋｏｅｓｌｉｎｇ， Ｄ．， 可溶性グアニリルシクラーゼモジュレーター， Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ Ａｒｃｈ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３５８：１２３−１２６ ［１９９８］を参照されたい。）。
ＫＡＴＰアゴニストである有効なカリウムチャンネル活性化物質の例としては、ミノキシジル（２，４−ジアミノ−６−ピペリジノピラミジン−３−オキシド； 水に不溶、エタノールに可溶 ２９ ｍｇ／ｍｌ）、ピナシジル（（＋／−）−Ｎ−シアノ−Ｎ’−４−ピリジニル−Ｎ”−（１，２，２−トリメチルプロピル）グアニジン； 水に不溶、エタノールに可溶 １４ ｍｇ／ｍｌ］）、（＋）−クロマカリム、（−）−クロマカリム又はレブクロマカリム、（＋／−）−クロマカリム、又はジアゾキシドが含まれる。
【００２４】
好ましいカリウムチャンネル活性化物質は一酸化窒素ガスであり、生体膜を横切って完全に透過できる。吸入可能な一酸化窒素ガスは、当該技術において既知である制御されたガス混合物のマスクにより哺乳動物に投与され得る（例えば、 Ｋｉｅｌｅｒ−Ｊｅｎｓｅｎ， Ｎ． ら， 肺血管抵抗性が上昇した心臓移植候補物質の評価における吸入一酸化窒素， Ｊ Ｈｅａｒｔ Ｌｕｎｇ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ． １３（３）：３６６−７５ ［１９９４］； Ｒａｊｅｋ， Ａ．ら， 吸入一酸化窒素は心臓移植中にプロスタグランジンＥ（１）より肺血管抵抗性を低下させる， Ａｎｅｓｔｈ Ａｎａｌｇ． ９０（３）：５２３−３０ ［２０００］； Ｓｏｌｉｎａ， Ａ．ら， 成人心臓手術患者において肺高血圧症を治療する吸入一酸化窒素とミルリノンの比較， Ｊ Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ Ｖａｓｃ． Ａｎｅｓｔｈ． １４（ｌ）：１２−１７ ［２０００］； Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ， Ｄ．Ａ．ら， 心臓手術後の吸入一酸化窒素による肺血管抵抗性の有効な制御， Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｓｕｒｇ １１１（４）：７５３−６２， ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ７６２−３ ［１９９６］）。一酸化窒素（ＮＯ）のガス混合物の濃度は、好ましくは約１〜１００ ｐｐｍ ＮＯ、更に好ましくは約４〜８０ ｐｐｍ ＮＯ、最も好ましくは約２０〜４０ ｐｐｍ ＮＯである。ガス混合物は、適切な濃度の酸素及び窒素及び／又は他の不活性ガス、例えば、二酸化炭素、ヘリウム又はアルゴンを含有する。任意により、全身麻酔が必要であるときのガス混合物には、亜酸化窒素（Ｎ２０）、キセノン、又はハロゲン化揮発性麻酔（ＨＶＡ）、例えば、ハロタン、セボフルラン、又はイソフルランのようなガス状麻酔が含まれる。全身麻酔は、例えば、カリウムチャンネル活性化物質（及び／又は薬剤又は化学療法剤）の投与が頚動脈内インフュージョンによる場合に必要であり、全身麻酔は、典型的には静脈内又は他のデリバリー経路を用いることを必要としない。当業者は、ＨＶＡが可溶性グアニリルシクラーゼ活性を阻害し得るという証拠を承知している（Ｍａｓａｋｉ， Ｅ．， ハロゲン化揮発性麻酔剤はラット脳において一酸化炭素刺激可溶性グアニリルシクラーゼ活性を阻害する， Ａｃｔａ Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｏｌ． Ｓｃａｎｄ． ４４（３）：３ ２１−２５ ［２０００］； Ｍａｓａｋｉ Ｅ． ＆ Ｋｏｎｄｏ Ｉ， メチレンブルー、可溶性グアニリルシクラーゼ阻害剤はラットにおいて、セボフルラン肺胞麻酔剤最低濃度を低下させ、脳サイクリックグアノシン一リン酸含有量を減少させる， Ａｎｅｓｔｈ． Ａｎａｌｇ． ８９（２）：４８４−８９ ［１９９９］）。その結果、ＨＶＡは本方法に従ってグアニリルシクラーゼ活性化物質と用いられる吸入麻酔の好ましい選択ではない。
【００２５】
一酸化窒素供与体は、生物系に適用した場合にＮＯ関連生理活性を与える化合物である。従って、ＮＯ供与体は、内在ＮＯ関連応答を模倣（ｍｉｍｉｃ）することができ、あるいは内在ＮＯ不足を置き換えることができる。当業者は、生物系において種々のＮＯ供与体によって遊離され得るＮＯの少なくとも３つの酸化還元状態があることを承知している（ＮＯ＋、ＮＯ０、又はＮＯ−）。これらはすべて本発明においては『一酸化窒素』又は『ＮＯ』という用語に含まれる。ＮＯの酸化還元状態は、他の生体分子、副生成物のプロファイル、及び生体応答に対してＮＯ供与体反応性がかなり相違する（Ｆｅｅｌｉｓｃｈ， Ｍ．， 薬理実験における一酸化窒素供与体の使用， Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ Ａｒｃｈ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，３５８：１１３−２２ ［１９９８］）。一部の種類のＮＯ供与体には酵素触媒が必要であるが、他の種類は非酵素的にＮＯを生じる。ＮＯを遊離するために、一部のＮＯ供与体には、例えば、チオールによる還元が必要であり、一部のＮＯ供与体には酸化が必要である。
【００２６】
一酸化窒素供与体の好ましい例は、１価又は多価アルコールの硝酸エステルである有機硝酸塩化合物を含んでいる。典型的には、これらは水に対する溶解度が低く、原液はエタノール又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で調製される。例は、三硝酸グリセリン（ＧＴＮ）又はニトログリセリン（ＮＴＧ）、ペンタエリスリチル四硝酸塩（ＰＥＴＮ）、イソソルビド二硝酸塩（ＩＳＤＮ）、又はイソソルビド５−一硝酸塩（ＩＳ−５−Ｎ）である。有機硝酸塩の投与は、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、又はＰＥＴＮ、ＩＳＤＮ、ＮＴＧ、又はＩＳ−５−Ｎの場合には経口で行われ得る。
【００２７】
他の好ましい例は、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ペニシラミン（ＳＮＡＰ）、Ｓ−ニトロソグルタチオン（ＳＮＯＧ）、Ｓ−ニトロソアルブミン、Ｓ−ニトロソシステインを含むＳ−ニトロソチオール化合物である。Ｓ−ニトロソチオールは、特に光感受性であるが、氷上と暗所で保持された原液は数時間安定であり、ＥＤＴＡのようなキレート化剤が安定性を高めるために添加され得る。投与は、好ましくは静脈内又は動脈内デリバリー経路による。
一酸化窒素供与体の他の好ましい例としては、モルシドミン（Ｎ−エトキシカルボニルモルホリノシドノンイミン）、リンシドミン（ＳＩＮ−１； ３−モルホリノシドノンイミン 又は３−モルホリニルシドノンイミン又は５−アミノ−３−モルホリニル−１，２，３−オキサジアゾリウム、例えば、塩化物塩）、又はピルシドミン（ＣＡＳ ９３６）のようなシドノンイミン化合物が含まれる。原液は、典型的にはＤＭＳＯ又はＤＭＦ中で調製され、光から保護される場合には４℃〜室温で安定である。リンシドミンは、易水溶性であり、まる１日約ｐＨ ５に調整された脱酸素蒸留水中の酸性溶液に安定である。生理的ｐＨにおいて、ＳＩＮ−１は開鎖形、ＳＩＮ−ＩＡ、好ましい一酸化窒素供与体に急速な非酵素加水分解され、これは暗所でｐＨ ７．４において安定である。投与は、好ましくは静脈内又は動脈内デリバリー経路による。
【００２８】
ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ； ペンタシアノニトロシル鉄酸（Ｉｌ）ナトリウム）のような鉄ニトロシル化合物も一酸化窒素供与体として有効である。水性原液は、好ましくは、使用前に脱酸素水中で新たに作られ、暗所で保持される。原液の安定性は、ｐＨ ３−５で高められる。グルタチオンのような生理的に適合するチオールがデリバリー緩衝液中に含まれると、ＮＯの遊離が増大され得る。ＳＮＰは静脈内インフュージョンで投与され、当業者はＮＯが遊離するにつれて５当量の毒性ＣＮ／モルＳＮＰの遊離により長期使用が阻まれることを承知している。
【００２９】
最も好ましい一酸化窒素供与体は、いわゆるＮＯＮＯａｔｅ化合物の中から選ばれる。 ＮＯＮＯａｔｅは、ＮＯと求核残基（Ｘ−）、例えば、アミン基又はスルファイト基との付加物であり、ＮＯ二量体は窒素原子を介して求核残基に結合して構造Ｘ［−Ｎ（Ｏ）ＮＯ］−の官能基を形成する。ＮＯＮＯａｔｅは、典型的には、生物学的反応成分によってほとんど影響されない予想できる割合でＮＯを遊離し、ＮＯの遊離はＸ− とＮＯの再生による酸触媒解離によるものであると考えられる。この性質は、薬剤を選択的にデリバリーする本発明の方法によれば特に有効である。異常脳領域と悪性腫瘍が、典型的には比較的低酸素であり、周囲ｐＨが比較的低く（例えば、ｐＨ ６．５−７．０）、異常脳領域又は悪性腫瘍の微小血管形では選択的にＮＯの遊離を集中させるからである。
【００３０】
ＮＯＮＯａｔｅとしては、最も好ましいジエチルアミン−ＮＯＮＯａｔｅ （ＤＥＡ／ＮＯ； Ｎ−エチルエタンアミン： １，１−ジエチルヒドロキシ−２−ニトロソヒドラジン（１：１）又は１−［Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ］ジアゼン−ｌ−イウム−１，２−ジオレート）が含まれる。他の好ましいＮＯＮＯａｔｅとしては、ジエチレントリアミン−ＮＯＮＯａｔｅ（ＤＥＴＡ／ＮＯ； ２，２’−ヒドロキシニトロソヒドラジノ］ビスエタンアミン）、スペルミン−ＮＯＮＯａｔｅ （ＳＰＥＲＩＮＯ； Ｎ−（４−［−１−（３−アミノプロピル）−２−ヒドロキシ−２−ニトロソヒドラジノ］ブチル）−１， ３−プロパンジアミン）、プロピルアミノプロピルアミン−ＮＯＮＯａｔｅ （ＰＡＰＡ／ＮＯ； ３−（２−ヒドロキシ−２−ニトロソ−１−プロピルヒドラジノ）−ｌ−プロパンアミン又は（Ｚ）−１−［Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ−（ｎ−プロピル）アミノ］ジアゼン−ｌ−イウム−１，２−ジオレート）、ＭＡＨＭＡ−ＮＯＮＯａｔｅ （ＭＡＨＭＡ／ＮＯ； ６−（２−ヒドロキシ−ｌ−メチル−２−ニトロソヒドラジノ）−Ｎ−メチル−ｌ−ヘキサンアミン）、ジプロピレントリアミン−ＮＯＮＯａｔｅ （ＤＰＴＡ／ＮＯ； ３，３’−（ヒドロキシニトロソヒドラジノ）ビス−ｌ−プロパンアミン）、ＰＩＰＥＲＡＺＩ／ＮＯ、プロリ−ＮＯＮＯａｔｅ （ＰＲＯＬＩ／ＮＯ； １−（［２−カルボキシラート］ピロリジン−１−イル）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート−メタノール、例えば、二ナトリウム塩）、ＳＵＬＦＯ−ＮＯＮＯａｔｅ（ＳＵＬＦＯ／ＮＯ、ヒドロキシジアゼンスルホン酸１−オキシド例えば、二ナトリウム塩）、亜硫酸ＮＯＮＯａｔｅ（ＳＬＴＬＦＩ／ＮＯ）、又はアンゲリス塩（ＯＸＩ／ＮＯ）が含まれる。
【００３１】
ほとんどすべてのＮＯＮＯａｔｅ化合物は、水に易溶性であり、水性原液は、使用直前に冷却脱酸素した１〜１０ ｍＭ ＮａＯＨ（好ましくは約ｐＨ １２）中で調製される。アルカリ性原液は、暗所で氷上に保持されるならば数時間安定である。ＮＯＮＯａｔｅの特徴的なＵＶ吸光度は水性溶液におけるＮＯＮＯａｔｅの分光学的定量化に使用し得る。ＮＯＮＯａｔｅは、好ましくは静脈内又は動脈内投与される。
一酸化窒素供与体は、種々の能力を有する（Ｆｅｒｒａｒｏ， Ｒ．ら， ウシクロマフィン細胞における細胞内サイクリックＧＭＰレベルに対する数種の一酸化炭素供与体の比較的作用： 一酸化窒素生産との相関， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １２７（３）：７７９−８７ ［１９９９］）。例えば、ＤＥＡ／ＮＯは半減期が約２〜４分間の最も強力な一酸化窒素供与体であり、ＰＡＰＡ／ＮＯ （ｔ１／２約１５分間）、ＳＰＥＲ／ＮＯ（ｔ１／２約３４−４０分間）は効力が劣り、ＤＥＴＡ／Ｎ０（ｔ１／２約２０時間）及びＳＮＡＰ（ｔ１／２約３３〜４１時間、グルタチオンのような生理的還元剤の存在下で短縮され得る）は更に効力が劣る。ＳＮＰは、また、強力なＮＯ供与体である（Ｆｅｒｒｅｒｏら ［１９９９］； Ｓａｌｏｍ， Ｊ．Ｂ．ら， ウサギ基底動脈におけるニトロプルシドナトリウムとＮＯＮＯａｔｅの弛緩作用， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５７（２）：７９−８７ ［１９９８］； Ｓａｌｏｍ， Ｊ．Ｂ．ら， ウサギ頚動脈におけるＮＯ供与体ニトロプルシドナトリウム、ＤＥＡＩＮＯとＳＰＥＲ／ＮＯの弛緩作用の比較， Ｇｅｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３２（ｌ）：７５−７９ ［１９９９］； Ｓａｌｏｍ， Ｊ． Ｂ．ら， ヤギ中脳動脈におけるニトロプルシドとＮＯＮＯａｔｅの弛緩作用： 全体的虚血−再潅流による遅延障害， Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ ３（ｌ）：８５−９３ ［１９９９］； Ｋｉｍｕｒａ， Ｍ．ら， 新規な一酸化窒素供与体に対するヒト基底動脈又は他の分離した動脈の応答， Ｊ． Ｃａｒｄｉｏｖａｃ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３２（５）：６９５−７０１ ［１９９８］）。その結果、ＮＯＮＯａｔｅ又は他のＮＯ供与体の有効濃度又は投与量は、本明細書に記載されるカリウムチャンネル活性化物質に好ましい投与量範囲にわたって変動するであろう。
【００３２】
ＮＯ供与体のストック溶液は、好ましくは、使用前に新たに調製され（各具体的なＮＯ供与体に適したｐＨで）、氷で冷却され、遮光（例えば、アルミニウムホイルに包まれた暗色ガラスバイアルの使用による）されるが、バイアルが適切に密閉される場合には有機硝酸塩は数ヵ月から数年まで貯蔵され得る。好ましくは、哺乳動物に投与する直前に、薬学的に許容しうる緩衝液中で最終希釈液が調製され、特に強酸性（例えば、塩酸塩）又はアルカリ性（例えば、ＮＯＮＯａｔｅ）ストック溶液が用いられるときにはＮＯ供与体含有緩衝液の最終ｐＨについて生理的適合性が調べられる。
主としてＮＯ暴露時間の生成物とＮＯ濃度は外因的に供給したＮＯに対する生体応答の質と程度を決定する。ＤＥＡ／Ｎ０のような短寿命のＮＯ供与体は、最も好ましくは、短時間の群発的ＮＯデリバリーを避けるためにボーラスインフュージョンよりむしろ連続インフュージョンで投与される。
カリウムチャンネル活性化物質には、カリウムチャンネルを直接に（例えば、ＫＣａを直接リン酸化することにより）又は間接に（例えば、ＫＣａ活性を直接モジュレートする他の調節タンパク質をリン酸化することにより）活性化する内在サイクリックＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＧ又はｃＧＫ）種の活性化物質である。ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼの他のイソ型の活性化物質が含まれる（例えば、Ｓｍｏｌｅｎｓｋｉ， Ａ．ら ［１９９８］）。ＰＫＧ活性化物質の有効な例としては、オクトブロモサイクリックＧＭＰ （８Ｂｒ−ｃＧＭＰ）又はジブチリルサイクリックＧＭＰが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３３】
有効なカリウムチャンネル活性化物質には本明細書に定義されるカリウムチャンネル活性化物質としての活性をなお有する薬学的に許容しうる分子結合体又は塩の形態が含まれる。例は、ミノキシジル硫酸塩であるが、他の薬学的に許容しうる塩は、塩化物、炭酸塩、重炭酸塩、硝酸塩等の硫酸塩以外のアニオンを含んでいる。薬学的に許容しうる塩の他の実施態様は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム等のカチオンを含んでいる。有効なカリウムチャンネル活性化物質の他の実施態様は、塩酸塩である。
しかしながら、本発明の方法に用いられるカリウムチャンネル活性化物質は、血管拡張因子ブラジキニン（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ）又はポリぺプチドブラジキニン類似体、例えば、受容体仲介透過化処理剤（ＲＭＰ）−７又はＡ７（例えば、Ｋｏｚａｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ， 米国特許第５，２６８，１６４号及びＰＣＴ国際出願第９２／１８５２９号）以外のものである。他のブラジキニン類似体としては、ブラジキニンと同じ性質を示すが修飾アミノ酸又はぺプチドの両末端のぺプチド伸長を有する関連ぺプチド構造が含まれる。ブラジキニン類似体の例としては、［ｐｈｅ．ｓｕｐ．８ （ＣＨ．ｓｕｂ．２ ＮＨ） Ａｒｇ．ｓｕｐ．９ ］ブラジキニン、Ｎ−アセチル［ｐｈｅ． ｓｕｐ． ８ （ＣＨ． ｓｕｂ． ２ −−ＮＨ−−Ａｒｇ． ｓｕｐ． ９ ］ブラジキニン又はｄｅｓＡｒｇ９ブラジキニンが挙げられる。
【００３４】
本発明の方法によれば、カリウムチャンネル活性化物質は、静脈内又は動脈内注射又はインフュージョンによって投与される。頭蓋内腫瘍のような異常脳領域を治療するために、カリウムチャンネル活性化物質は好ましくは頚動脈内インフュージョンにより投与される。特にことわらない限り、哺乳動物に投与すべきカリウムチャンネル活性化物質の量は、０．０７５〜１５００μｇ／ｋｇ体重の範囲にある。ヒトの場合、０．０７５〜１５０μｇ／ｋｇ体重の範囲が好ましい。当業者が承知しているように、具体的なカリウムチャンネル活性化物質に対する個々の患者の生理的応答は異なる。例えば、ヒトに対するＹＣ−１の有効量は一般的には約１５〜約４５μｇ／ｋｇ体重であり、 一酸化窒素供与体については一般的には約１５〜約４５μｇ／ｋｇ体重である。しかしながら、具体的なカリウムチャンネル活性化物質の各個体に最適な量は、デリバリー期間にわたる綿密な生理的監視を含む通常の手段によって求め得る。
投与量は、ボーラス注射で投与し得るが、好ましくは１〜３０分間、最も好ましくは１〜１５分間インフュージョンにより投与される。例えば、ラットにおいては、約０．７５〜１００μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１の投与速度が最も適している。約１００μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１より速い投与速度では、随伴する血圧の低下がしばしば観察される。ヒトにおいては、有効投与速度は、約０．０７５〜約１５μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１であり、血圧の注意深い監視が勧められる。当業者は、全インフュージョン量、液体インフュージョン速度、及びこれらに関連する生理的悪影響を避ける電解質平衡を調節するのにも注意深い。一部のカリウムチャンネル活性化物質、例えば、ＮＳ−１６１９、ミノキシジル、ミノキシジル硫酸塩、ピナシジル、又はジアゾキシドは、水に易溶性でなく、これらの物質を投与するために調製する際には、インフュージョン緩衝液で希釈する前にエタノールのような適切で薬学的に許容しうる溶媒がカリウムチャンネル活性化物質を溶解するために使用し得る。当業者は、溶媒関連毒性を避けるためにインフュージョン溶液中の溶媒の最終濃度を調節するのに慎重である。例えば、インフュージョン溶液中の５−１０％ （ｖ／ｖ）までの最終エタノール濃度がたいていの哺乳動物によって許容され、その毒性が無視できる。
【００３５】
本発明の方法は、薬剤に対する微小血管透過性増大が達成される具体的な機序に左右されないが、カリウムチャンネル活性化物質を投与すると異常脳領域及び／又は悪性腫瘍に血液を送る毛細血管や細動脈の内皮細胞膜においてカリウムチャンネルを通るカリウム流量が増加すると考えられる。これにより、微小血管上皮の密着結合のゆるみ及び／又は飲作用活性の増大が生じ、血管からの薬剤の吸収を増大する。本発明を行うに当たり、カリウムチャンネル活性（即ち、カリウムカチオン流量）を測定することは必要としない。しかし、当業者は、カリウム流量が、例えば、パッチ・クランプ又は微小電極デバイスを用いた４２Ｋ−又は２０１Ｔｌ＋の細胞吸収又はチャンネルコンダクタンスを測定することによる適切な方法で測定し得ることを承知している（例えば、Ｔ． Ｂｒｉｓｍａｒ ｅｌ ａｌ．， タリウム−２０１の吸収はヒトグリオーマ細胞において膜電位とカリウム透過性に関係する， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ５００（１−２）：３０−３６ ［１９８９］； Ｔ． Ｂｒｉｓｍａｒら， 培養したヒトグリオーマ細胞におけるＫ＋ 及びＴ１＋ 高吸収の機序， Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． １５（３）：３５１−６０ ［１９９５］； Ｓ． Ｃａｉら， ウシ大動脈内皮細胞における中間コンダクタンスのＫ（Ｃａ２＋）チャンネルの薬理学的性質， Ｊ． Ｍｅｍｂｒ． Ｂｉｏｌ． １６３（２）− ５８ ［１９９８］）。
【００３６】
薬剤は、カリウムチャンネル活性化物質と同時に又はほぼ同時に当業者され、薬剤は、正常脳組織又は非悪性腫瘍細胞に比べて選択的に異常脳領域及び／又は悪性腫瘍細胞に血流によって送られる。『同時に』は、薬剤がカリウムチャンネル活性化物質と同時期又は同時に投与されることを意味する。『実質的に同時に』は、薬剤がカリウムチャンネル活性化物質を最後に投与した後、約１時間以内に投与され、好ましくは約３０分以内に投与され、最も好ましくはカリウムチャンネル活性化物質と同時に投与されることを意味する。あるいは、『実質的に同時に』は、薬剤がカリウムチャンネル活性化物質を最初に投与される前、約３０分以内、好ましくは約１５分以内に投与されることを意味する。
哺乳動物において異常脳領域及び／又は悪性腫瘍に薬剤をデリバリーする方法は、異常脳領域及び／又は悪性腫瘍の微小血管を横切って薬剤を選択的にデリバリーするのに有効である。薬剤は、医薬品、即ち、化学療法剤である。化学療法剤の例としては、細胞障害性治療剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、アンホレリシン）、裸のＤＮＡ発現ベクター、治療タンパク質、治療オリゴヌクレオチド又はヌクレオチド類似体、インターフェロン、サイトカイン、サイトカインアゴニスト、サイトカインアンタゴニスト、アドレナリン作動性剤、抗痙攣剤、抗外傷剤、脳の損傷又は障害を治療又は予防するために用いられる神経医薬剤が挙げられる。化学療法剤としては、 Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体アンタゴニスト； 抗生物質のような抗菌剤； イムノトキシン、免疫抑制剤、ホウ素化合物、モノクローナル抗体又は特異抗原結合抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦ（ｖ）フラグメント）、又はインターフェロンのようなサイトカイン、インターロイキン（例えば、インターロイキン［ＩＬ］−２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、又はトランスフォーミング成長因子（例えば、ＴＧＦ−β）が含まれる。
【００３７】
薬剤には、抗がん化学療法剤も含まれる。典型的には、抗がん化学療法剤は、細胞障害性剤、例えば、５−フルオロウラシル、シスプラチン、カルボプラチン、メトトレキセート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ブンブラスチン、又は細胞障害性アルキル化剤、例えば、ブスルファン（１，４−ブタンジオールジメタンスルホネート； マイレラン、グラクソウェルカム（Ｍｙｌｅｒａｎ， Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ））、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、又はエチルエタンスルホン酸が挙げられるがこれらに限定されない。
抗がん化学療法剤は、脳又は身体の他の組織において悪性腫瘍に薬剤を選択的にデリバリーする方法を行うのに、又はヒトの悪性腫瘍を治療する方法に特に有効である。
薬剤としては、治療ウイルス粒子、例えば、生体内の細胞標的に遺伝物質をデリバリーするアデノウイルス由来又は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来ウイルスベクターも含まれる。薬剤としては、診断剤、例えば、画像診断剤又は造影剤、例えば、放射能標識物質（例えば、［９９Ｔｃ］−グルコヘプトネート）、ガリウム標識画像診断剤（例えば、ガリウム−ＥＤＴＡ）、又は鉄（ＩＩ）磁気物質、蛍光物質、発光物質、又はヨウ素化造影剤も含まれる。適切な場合には、抗がん活性を有する上記薬剤のいずれも、薬剤を悪性腫瘍に選択的にデリバリーする方法又はヒトにおいて悪性腫瘍を治療する方法を行うのに使用することができる。
【００３８】
従って、薬剤は、分子量が５０ダルトン〜約２５０ ｋＤの分子物質であり得る。又は直径が約５０〜２５０ナノメートルのウイルス粒子のような粒子であり得る。
これは、決して本発明の方法を行うのに使用し得る薬剤の種類の余すところのないリストであることを意図したものではない。薬剤は、そうでないことが好ましいが、高脂溶性で細胞膜を本質的に浸透し得る物質、例えば、ニトロソウレアであってもよい。
薬剤の使用量は、各薬剤の慣用の投与量範囲内であるが、本発明の方法を行うことにより、得られた高経血管透過性は投与量当たりの選択的治療効果を大きくすることができ、所望される場合には、例えば、具体的な哺乳動物において抗がん剤からの全身性毒性作用を少なくするために使用すべき有効投与量を少なくすることができる。
薬剤は、血流に送り得る適切な方法によって投与される。典型的には、これは、静脈内、筋肉内、又は動脈内（頚動脈内を含む）注射又はインフュージョンによる。しかしながら、一部の適用については、薬剤の投与量がカリウムチャンネル活性化物質とほぼ同時に血流に入る限り他の許容しうるデリバリー経路を使用することができる。例としては、摂取（例えば、粉末、懸濁液、溶液、エマルジョン、錠剤、カプセル又はカプレット）； 皮下注射； 定位注射； 又は接着貼付剤による経皮又は経粘膜デリバリー、舌下を含む口腔の皮膚、粘膜又は上皮、直腸、又は膣上皮を介してデリバリーする坐剤又はゲルが挙げられる。
【００３９】
あるいは、薬剤は、哺乳動物の医薬組成物においてカリウムチャンネル活性化物質と共に投与される。本発明の医薬組成物は、ヒトのような哺乳動物に静脈内インフュージョン又はボーラス注射によってデリバリーするための上記薬剤と共に薬学的に許容しうる溶液中に処方されたブラジキニン又はブラジキニン類似体以外の上記カリウムチャンネル活性化物質の組合わせを含んでいる。従って、該溶液は浸透圧（例えば、約０．１５ Ｍ生理食塩水）とｐＨ、典型的にはｐＨ ７．２〜７．５に関して適切に釣り合っている。該溶液は、更に、緩衝液、例えば、リン酸塩緩衝液（例えば、リン酸塩緩衝生理食塩水）を含んでいる。該溶液は、約０．０７５〜１５００μｇ／ｋｇ体重のカリウムチャンネル活性化物質投与速度を薬学的に許容しうる液量で最長約３０分間デリバリーするために処方される。ヒト患者については、該溶液は、好ましくは約０．０７５〜１５０μｇ／ｋｇ体重のカリウムチャンネル活性化物質の投与速度を薬学的に許容しうる液量で約３０分間までデリバリーするために処方される。
【００４０】
本発明は、また、薬剤の異常脳領域及び／又は悪性腫瘍へのデリバリーを高めるキットに関する。本キットは、ブラジキニン又はブラジキニン類似体以外の上記カリウムチャンネル活性化物質を含む物質又は成分の組み合わせである。更に、本キットは、一般の薬剤、又は特定の薬剤に対する新生微小血管系を含む異常微小血管の透過性を高めるためにカリウムチャンネル活性化物質の使用説明書を含んでいる。場合により、本キットは、薬学的に許容しうる製剤、又は特定の薬剤が含まれた又は含まれていないカリウムチャンネル活性化物質の薬学的に許容しうるインフュージョン製剤を含有し得る注射又はインフュージョン用備品一式、例えば、注射器、インフュージョンライン、クランプ、及び／又はインフュージョンバッグ／ビン中に特定の薬剤のような他の成分を含有している。キットに集合された物質又は成分は、作用可能性や効用を保存する便利で適切な方法で貯蔵される医師に供給され得る。例えば、成分は溶解した、脱水した、又は凍結乾燥した形であり得る。室温、冷蔵温度又は凍結温度で供給され得る。
本発明の方法及びキットの上記説明は、例示であり、網羅的なものではない。ここで、次の非限定的実施例について本発明を更に詳細に記載する。
【００４１】
実施例
実施例１： 方法
悪性腫瘍細胞系及び腫瘍移植 雌ウィスターラットにおいて実験脳腫瘍の移植にラットグリオーマ細胞株、ＲＧ２を用いた。組織培養におけるＲＧ２細胞増殖と維持の手法は記載されている（Ｓｕｇｉｔａ， Ｍ． ＆ Ｂｌａｃｋ， Ｋ．Ｌ．， サイクリックＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ阻害及び頚動脈内ブラジキニンインフュージョンは脳腫瘍への透過性を高める， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８（５）：９１４−２０ ［１９９８］； Ｉｎａｍｕｒａら ［１９９４］； Ｎａｋａｎｏ， Ｓ．ら， 頚動脈内ブラジキニンインフュージョン後の脳腫瘍微小血管透過性増強は一酸化窒素を仲介する， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６（１７）：４０２７−３１ ［１９９６］）。簡単に言えば、ラットグリオーマ由来のＲＧ２細胞は、使用まで凍結保持され、次に解凍され、ｌＯ％ 子ウシ血清を含むＦ１２培地の単層培養に維持される。一部の実験においては、Ｃ６グリオーマ細胞を用いた。
ウィスターラット（体重約１４０−１６０ ｇ）に腹腔内ケタミン（５０ ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、グリア細胞（１×１０５）を右半球に５μｌ Ｆ１２培地（１−２％ メチルセルロース）に懸濁した脳内注射によりハミルトン注射器で移植し、対側半球には移植しなかった。移植座標は、前頂に対して３ ｍｍ外側及び硬膜面に対して４．５ ｍｍの深さであった。
【００４２】
カリウムチャンネル活性化物質の頚動脈内インフュージョン ＲＧ２細胞の移植の７日後にラットを上記のように麻酔し、透過性実験の準備をした。ラットにＮＳ−１６１９ （選択的なコンダクタンスの大きいＣａ２＋活性化Ｋ＋チャンネル活性化物質； ＲＢＩ、ナティック、マサチューセッツ州）か又はミノキシジル硫酸塩（ＫＡＴＰチャンネル活性化物質）を右頚動脈に５．３μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１ （５３．３μｌ／ｍｉｎで）の投与速度で１５分間、ＰＢＳ、ｐＨ ７．４； ５％ （ｖ／ｖ）エタノールのインフュージョンビヒクル中でインフュージョンした。ＰＢＳで希釈する前にカリウムチャンネル活性化物質を溶解するためにエタノール（２５％ ［ｖ／ｖ］）を用いた。血液量実験については、カリウムチャンネル活性化物質化合物の頚動脈内インフュージョン開始の５分後と１４分後に［１４Ｃ］デキストラン（１００μＣｉ／ｋｇ； デュポンニューイングランドヌクレア社、ボストン、マサチューセッツ州）を静脈内ボーラスとして注射し、１分間と１０分間維持して２つの異なる時点を得た。領域透過性実験については、血管作用化合物の頚動脈内インフュージョン開始の５分後に１００μＣｉ／ｋｇの［１４Ｃ］α−アミノイソ酪酸（デュポンニューイングランドヌクレア社、ボストン、マサチューセッツ州）を右大腿静脈に静脈内ボーラスとして注射した。血清放射能を求めるためにトレーサーの注射直後にペリスタ吸引ポンプを用いて０．０８３ ｍｌ／ｍｉｎの一定速度で大腿動脈血を抜いた。頚動脈インフュージョンの１５分後に、ラットを断頭し、脳を迅速に取り出し、定量的オートラジオグラフィのために凍結した。
【００４３】
一酸化窒素（ＮＯ）供与体の透過性実験においては、ＮＯ供与体の頚動脈内インフュージョンを上記のように２．６６μｇ ｍｉｎ−１ ｋｇ−１の投与速度で１５分間行った。一酸化窒素供与体には、ナトリウム２−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼノテートオキシド（ＤＥＡ／ＮＯ）、半減期が２．１分の一酸化窒素供与体又はＰＡＰＡ／ＮＯ （［Ｚ］−Ｉ−［Ｎ−［３−アミノプロピオ］−Ｎ−［Ｎ−プロピオアミノ］ジアゼン−ｌ−イウム−１，２−ジオレート（アレクシス社（Ａｌｅｘｉｓ Ｃｏｒｐ．））、半減期が１５分の一酸化窒素供与体を含めた。ＤＥＡ／ＮＯ又は ＰＡＰＡ／ＮＯをＰＢＳに溶解し、ＲＧ２グリオーマをもつラットに投与して生理的パラメーターに影響することなく［１４Ｃ］−ＡＩＢの透過性（Ｋｉ）を求めた。［１４Ｃ］−ＡＩＢをボーラスとして静脈内に投与し、Ｋｉを求めた。実験中、生理的パラメーターを監視した。
【００４４】
一方向輸送定数 （Ｋ ｉ ） 正常組織と腫瘍組織において血液腫瘍関門及び血液脳関門を横切る透過性の指標として［１４Ｃ］α−アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）の一方向移動定数Ｋｉを測定した。定量的オートラジオグラフィを用いてＫｉ値（μｌ ｇ−１ ｍｉｎ−１）を得た。血液から脳への移動の初速度を以前に記載された式を用いて計算した（Ｏｈｎｏ， Ｋ，ら， 意識のあるラットにおいて非電解質に対する脳血管透過性の下限， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２３５（３）：Ｈ２９９−３０７， ［１９７８］； Ｉｎａｍｕｒａ， Ｔ．，ら， ブラジキニンは実験脳腫瘍において血液腫瘍関門を選択的に開放する， Ｊ． Ｃｅｒｅｂ． Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ． １４（５）：８６２−７０ ［１９９４］）。定量的データを２群ｔ検定を用いて分析し、同じ割合又は同じ手段（同じ数）の２群フィッシャーズ精密検定には統計的有意性を得るために各群に最低６匹の動物を必要とする。多数の処理グループをＡＮＯＶＡによる対照グループと比較し、Ｐ値をこの後のボンフェローニ検定により求めた。
【００４５】
用量依存性実験 ＮＳ−１６１９を２５％ エタノールに溶解し、ＰＢＳで希釈して種々のインフュージョン用濃度を得た。ＮＳ−１６１９を頚動脈内インフュージョン（投与速度： ０、１３、２６．５、５３、８０、１００及び１１０μｌ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１； すべて５３．３μｌ／ｍｉｎで）によりＲＧ２グリオーマをもつラットに投与して静脈内に投与される［１４Ｃ］−ＡＩＢの高透過性（Ｋｉ）を生じる投与量を求めた。Ｋｉを上記のように求めた。実験中、生理的パラメーターを監視した。
【００４６】
阻害実験 ＮＳ−１６１９が透過性を高めたので、その作用の特異性を特異的ＫＣａチャンネルインヒビター、イベリオトキシン（ＲＢＩ、ナティック、マサチューセッツ州； （［ＩＥＢＴＸ］を最終原液濃度１００μｇ／ｍｌまで生理食塩水に希釈した）。ＩＢＴＸ （２．３μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１）をＮＳ−１６１９ （２６．５μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１）と同時インフュージョンしてＲＧ２グリオーマラットモデルにおける異常毛細血管のＫＣａチャンネル誘導透過性を遮断した。１７匹のラットをこれらの実験に用いた（３匹はビヒクルのみの対照［即ち、ＰＢＳ ＋ ５％ （ｖ／ｖ） エタノール］； ３匹はＩＢＴＸ； ８匹はＮＳ−１６１９； ３匹はＮＳ−１６１９ ＋ ＩＢＴＸ）。
他の実験においては、ＩＢＴＸ （０．２μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１ １５分間）を一酸化窒素供与体ＤＥＡ／Ｎ０ （２．６６μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１ １５分間）と同時インフュージョンしてＲＧ２グリオーマラットモデルにおける異常毛細血管のＫＣａチャンネル誘導透過性を遮断した。１３匹のラットをこれらの実験に用いた（４匹はビイクルのみの対照； ３匹はＤＥＡ／ＮＯ、３匹はＰＡＰＡ／ＮＯ、及び３匹はＤＥＡ／ＮＯ＋ＩＢＴＸ）。
頭蓋内ＲＧ２腫瘍をもつウィスターラットを用いた他の生体内透過性実験においては、上記のように、腫瘍中央部と腫瘍周囲組織に対する［１４Ｃ］−ＡＩＢの一方向輸送定数（Ｋｉ）を、ブラジキニン（１０μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１ １５分間）又はミノキシジル硫酸塩（２６．６μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１ １５分間）の頚動脈内インフュージョン又はブラジキニンとミノキシジル硫酸塩を１５分間同時インフュージョン後に求めた。実験中、生理的パラメーターを監視した。選択的ＫＡＴＰ阻害剤、グリベンクラミド（１３．３μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１ １５分間）を用いて ＫＡＴＰチャンネルの阻害が血液腫瘍関門透過性のブラジキン誘導増強又はミノキシジル硫酸塩誘導増強を阻害するかを求めた。
【００４７】
他の実験においては、ＲＧ２グリオーマ細胞を上記ラット脳の右半球に移植した。移植の７日後に、オクトブロモサイクリックＧＭＰ （８Ｂｒ−ｃＧＭＰ、１６．７μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１）、サイクリックＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＧ）の活性化物質の頚動脈内インフュージョンによりＰＫＧ阻害剤（ＫＴ５８２３、６．７７μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１； 又はＲｐ−ｐＣＰＴ−ｃＧＭＰ、６０μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１）を含まずに又は含めて行った。対照グループにおいては、生理食塩水又は２％ ＤＭＳＯをラットにインフュージョンした。実験の終了時に、ラットを麻酔下で犠牲にし、［１４Ｃ］−ＡＩＢ （μｌ ｇ−１ ｍｉｎ−１）のＫｉを測定するために脳を取り出した。正常脳と腫瘍組織においてＰＫＧ発現を比較するためにウェスタンブロット分析を用いた。
定量的オートラジオグラフィと［１４Ｃ］−ＡＩＢ （μｌ ｇ−１ ｍｉｎ−１）のＫｉの計算をＯｈｎｏ ｅｔ ａｌ （１９７８）に従って上記のように行った。
【００４８】
Ｋ Ｃａ チャンネルと Ｋ ＡＴＰ チャンネルの免疫組織化学分析 透過性実験から得られた脳切片（厚さ１２μｍ）を、１：１００希釈液のアフィニティー精製ＫＣａチャンネル抗体（アロモンラボス（Ａｌｏｎｉｏｎｅ Ｌａｂｓ）、エルサレム、イスラエル）と１時間、ビオチニル化ウマ抗マウスイムノグロビン（ベクターラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、バーリンガム、カリフォルニア州）と３０分間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ部位をアビジン：ビオチニル化酵素複合体（ＡＢＣ）キット（ＫＣａ）を用いて可視化した。ＫＡＴＰの免疫局在化については、上記組織切片をウサギ抗マウスＫｉｒ ６．２抗血清（１：２００希釈液； 抗血清はＤｒ． Ｓｕｓｕｍｕ Ｓｅｉｎｏから恵与された）と４℃で一晩インキュベートした。その抗血清は、ヒトＫｉｒ ６．２と交差反応性であり、以前に記載されたように調製した（Ｓｕｚｕｋｉ， Ｍ．ら， ラット膵臓におけるスルホニルウレア受容体Ｉの結合局在性決定， Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４２（１０）： １２０４−１１ ［１９９９］）。Ｋｉｒ ６．２は、哺乳動物ＫＡＴＰのカリウム内向き調整（Ｋｉｒ）タンパク質成分である。結合ウサギ抗マウスＫｉｒ ６．２抗体の可視化は、 製造業者が指示したようにＰＢＳで３回洗浄し二次抗体（ローダミン標識抗ウサギＩｇＧ ［１：２００希釈液］； サンタクルーズバイオテクノロジー社（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．）、サンタクルーズ、カリフォルニア州）と結合させ、共焦点蛍光顕微鏡で調べた後に行った。
【００４９】
透過電子顕微鏡 （ＴＥＭ） ラット脳組織を次の手順によってＴＥＭ分析のために準備した。カリウムチャンネル活性化物質、阻害剤、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＢＲＰ）、及び／又はビヒクル対照緩衝液の頚動脈内インフュージョンを含む実験後、 ラットをまずＰＢＳ （５０−１００ ｍｌ）、次に１．０％ グルタルアルデヒド（２５０ ｍＬ）で心臓からのインフュージョン固定をした。脳組織を冠状に切断して腫瘍領域を露出させ、問題の領域を選択し、約１ｍｍの厚さの小切片にし、１．０％ グルタルアルデヒドに４℃で２時間浸漬固定した。試料を５％ スクロース／０．１ Ｍ ＰＢＳで４℃で一晩連続振盪し溶液を変えながらすすいだ。次に、試料を１％ ＯｓＯ４で４℃において２時間連続振盪しながら浸漬固定した。次に、試料を増加濃度（５０−１００％）のエタノールで４℃において１５分間絶えず振盪ししばしば溶液を変えながら脱水した。試料をプロピレンオキシド、次にエポンで室温において振盪しながら浸潤させた。包埋を６０℃で４８時間行った。ダイヤモンドエッジブレードを備えたミクロトームで半薄切片（約３０−５０μｍ厚）をつくった。最後に、超薄切片（約１−１０ ｎｍ厚）をミクロトームでつくり、酢酸ウラニルで４５−６０分間、クエン酸鉛で１５分間染色し、ＴＥＭ分析のために処理した。各処理グループにおいて１０本の毛細血管を選び、低倍率の写真を撮った（合計９０本の毛細血管）。毛細血管の基本的な形態を、毛細血管の基本的プロファイル： 分離管腔周囲、管腔周囲、毛細血管の全領域（核と空胞を除く）、及び毛細血管の平均厚さを表すパラメーターを測定及び計算することによって調べた。
【００５０】
別の実験においては、小胞の密度について、各ラット（各治療グループは５−６匹のラットを有する）から選ばれた３本の血管を高倍率のテストゾーンとして４枚の電子顕微鏡写真を撮ることにより求めた。テストゾーンは、ＥＭスクリーン上の３、６、９、及び１２時のようにランダムに選んだ。テストゾーンの領域を測定し、小胞の数を顕微鏡写真の背景を知らない人間によって計数させた。小胞密度は、細胞質のμｍ２当たりの小胞の数として示した。全小胞領域と細胞質領域の割合は、同じ顕微鏡写真を用いても求められる。全小胞領域を測定し、小胞に含まれる細胞質に対する割合を計算し、％として示した。小胞の平均直径も計算された。
処理から生じる形態学的変化を、各ラットから６つの密着結合（ｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を選ぶことにより調べた（５匹のラットが各処理グループであり、密着結合は合計２７０であった）。密着結合を高倍率で写真を撮った。密着結合の分析は、各密着結合について『裂指数（ｃｌｅｆｔ ｉｎｄｅｘ）』や『裂領域指数（ｃｌｅｆｔ ａｒｅａ ｉｎｄｅｘ）』を比べることによった。裂指数は、次式： （融合していないセグメントの長さ）÷（結合の長さ）によって表される（Ｓｔｅｗａｒｔ， １９８７）。裂領域指数は、式： （融合していないセグメントの領域）−（結合の長さ）によって示した。
【００５１】
一時的中脳動脈 （ＭＣＡ） 閉鎖 わずかに変更したＬｉｕ， Ｙ．ら， 中脳動脈閉鎖−再潅流モデルを用いたラット脳虚血におけるグルコース代謝の時間経過とＭＫ−８０の作用， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８ （６）： ５０５−５０８ （１９９６）に記載されているようにＭＣＡ閉鎖を行った。 概要としては、同側の共通の頚動脈と外部頚動脈を結紮した後に頚動脈内の分岐から挿入したシリコーンゴムシリンダーで右ＭＣＡを一時的に閉鎖した。シリンダーは硬化剤と混合したシリコーンで被覆された４−０ナイロンの１７ ｍｍ長の手術用糸からつくられており、末端の直径が５ ｍｍから０．２５−０．３０ ｍｍまで類別されている。糸を分岐近くの外部頚動脈を通って頚動脈内動脈に挿入し、挿入点で結紮した。シリコーンゴムシリンダーは、前脳動脈の隣接部分に達した。右ＭＣＡと後交通動脈の原点を糸で閉鎖した。手術後、動物をゆるく適合したパスツールキャストによって固定した。虚血組織の血液による再潅流を可能にするために虚血の約１時間又は２時間後に頚動脈内動脈から糸を抜いた。１５分間再潅流した４５分後に頚動脈インフュージョンによりカリウムチャンネル活性化物質及び／又は阻害剤を注射した。
一部の実験においては、再潅流の５０分後に（カリウムチャンネル活性化物質及び／又は阻害剤の投与を開始した５分後に）静脈内にエバンスブルー染料を注射した。エバンスブルー染料の注射の１０分後、脳微小血管から過剰のエバンスブルー染料を流し出すために心臓を通って２００ ｍｌのＰＢＳをラットに潅流した。
【００５２】
実施例２： 結果
カリウムチャンネル活性化物質は血液腫瘍関門を横切る輸送を選択的に増加させる
移植したグリオーマ細胞をもつウィスターラットにＮＳ−１６１９か又はミノキシジル硫酸塩を７．５μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１で１５分間インフュージョンしたとき、血液腫瘍関門を形成する新生血管系を横切る輸送についてＮＳ−１６１９やミノキシジル硫酸塩により［１４Ｃ］α−アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）の一方向輸送定数Ｋｉが著しく増大したが、正常脳微小血管系を横切る輸送については増大しなかった（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。これらの結果から、カリウムカルシウムチャンネルの活性化が正常脳組織を与える毛細血管に比べて固形悪性腫瘍の毛細血管を横切る分子の透過性を選択的に高めることが証明された。
ＮＳ−１６１９の投与量を増加することにより、ＲＧ２グリオーマ毛細血管における［１４Ｃ］α−アミノイソ酪酸の一方向移動定数Ｋｉが用量依存方式で増大した（図１３）。多量の投与量では（１００μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ及び１１０μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）、ラットの動脈血圧の著しい降下が観察された。各グループに用いられるラットの数は、図１３の括弧に示されている。
【００５３】
［１４Ｃ］α−アミノイソ酪酸の一方向移動定数Ｋｉを増大させるＮＳ−１６１９の能力がＫＣａチャンネル特異的阻害剤イベリオトキシン（ＩＢＴＸ； 図１４）により阻害されたことから、この作用の特異性が証明された。ＲＧ２腫瘍をもつラットにおいてＩＢＴＸ （２．３μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１； ｎ＝３）を含む又は含まないＮＳ−１６１９ （２６．５μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１）と共に［１４Ｃ］−ＡＩＢを１５分間用いてＫｉを求めた。ＮＳ−１６１９インフュージョンに対する応答のＫｉの増大（ｎ＝８； ＊ ＊ Ｐ＜０．００１ ５％ エタノールを含む又は含まないＰＢＳと比較）は、ＩＢＴＸ同時処理により減弱した。調べた投与量のＩＢＴＸ単独は、異常毛細血管の脳腫瘍関門透過性に影響しなかった。しかしながら、ＩＢＴＸは、ＮＳ−１６１９−誘導透過性（Ｋｉ）の増強を著しく下げ（ｎ＝３， ＊ ＊ Ｐ＜Ｏ． ００１ ＮＳ処理グループと比較）、カリウムチャンネル特異的作用を示した。ＰＢＳ＋５％ エタノールを投与した対照は、ＰＢＳ−エタノールを投与した対照と区別できなかった。
可溶性グアニリルシクラーゼ活性化物質 ＹＣ−１を投与した場合に血液腫瘍関門透過性の匹敵しうる増強が得られた（図１）。ＩＢＴＸ及び可溶性グアニリルシクラーゼの選択的阻害剤、１Ｈ−［１，２，４］オキサジアゾロ［４，３−ａ］キノザリン−ｌ−オン（ＯＤＱ）は、ＹＣ−１によるＫｉの増大を減弱させ、ＫＣａ仲介であることを示した。
【００５４】
ミノキシジル硫酸塩をインフュージョンすると、ビヒクル対照グループに比べてＫｉの著しい増大が得られた（２８．３±６．０μｌ／ｇ／ｍｉｎ； Ｐ＜０．００１） （図７）。血液腫瘍透過性のこの増強は、ミノキシジル硫酸塩の作用を著しく減弱させる（Ｋｉ ＝ １２．７±２．０μｌ／ｇ／ｍｉｎ）、ＫＡＴＰチャンネルインヒビターグリベンクラミドによって減弱した。従って、ミノキシジル硫酸塩によるＫｉ増大は、血液腫瘍関門透過性を選択的に高めるＫＡＴＰチャンネルの活性化によるものであった。ミノキシジル硫酸塩による処理から得られた透過性の増大は、ＫＣａ活性化物質ブラジキニン（Ｋｉ ＝ ３４±８．０μｌ／ｇ／ｍｉｎ）によるものと匹敵し、個々の処理グループと比べて透過性に対する著しい付加作用（Ｋｉ ＝ ４２±６μｌ／ｇ／ｍｉｎ； Ｐ＜０．０５）がブラジキニンとミノキシジル硫酸塩による組合わせ処理で得られた（図７）。
グリベンクラミドの同時インフュージョンがブラジキニン誘導Ｋｉ増大（図８）を阻害できなかったことは、ブラジキニンがＫＡＴＰチャンネルを調節しないことを示す他の研究と一致している。しかしながら、ＫＣａチャンネルアンタゴニスト、ＩＢＴＸはブラジキニン作用を著しく減弱させ（Ｋｉ ＝ １７．７±６μｌ／ｇ／ｍｉｎ； Ｐ＜Ｏ．０１）、Ｋｉ増大がＫＣａの活性化によるものであり、ブラジキニンによるＫＡＴＰチャンネルでないことが示された（図８）。
【００５５】
ミノキシジル硫酸塩による作用は、グリベンクラミド（Ｋｉ ＝ １２．７±２μｌ／ｇ／ｍｉｎ； Ｐ＜Ｏ．００１； 図９）によって著しく減弱した。しかしながら、この作用は、ＩＢＴＸにより阻害されず、ＫＡＴＰチャンネルがミノキシジル硫酸塩による透過性を仲介することが示された。これらの結果は、血液腫瘍関門透過性に関する独立した経路を意味し、脳腫瘍の微小毛細血管において一方はＫＣａによって調節され、もう一方はＫＡＴＰチャンネルによって調節されることを示唆する。
一酸化窒素供与体も血液腫瘍関門の透過性を高めた。図２から、ＲＧ２グリオーマ組織がＰＢＳ処理対照（図２Ａ）と比べてＤＥＡ／ＮＯ処理ウィスターラット（図２Ｂ）がエバンスブルー染色（ＭＷ ９６０．８２）により生体内染色されることがわかる。これらの結果は、ＮＳ−１６１９又はＹＣ−１を用いてエバンスブルーにより生体内染色により得られる結果に匹敵した（データは示されていない）。
図３から、対照（生理食塩水）と比べてＤＥＡ／ＮＯやＰＡＰＡ／ＮＯ（それぞれＫｉ ＝ ３２±９．０μｌ ｇ−１ ｍｉｎ−１及び３２±９．０μｌ ｇ−１ ｍｉｎ−１）に対して応答してＫｉが著しく増大したことがわかる。しかしながら、ＩＢＴＸで同時処理すると、ＤＥＡＮＯ（Ｋｉ ＝ １５．３±２．３μｌ ｇ−１ ｍｉｎ−１； Ｐ＜０．００１）又はＰＡＰＡ／ＮＯ（Ｋｉ ＝ １５．３±１．７μｌ ｇ−１ ｍｉｎ−１； Ｐ＜０．００１）のインフュージョンの効果が減弱し、効果がＫＣａ媒介性であったことがわかる。調べた投与量でのＩＢＴＸ単独は、異常毛細血管の脳腫瘍関門透過性を影響しなかった。
ウェスタンブロットから、正常脳も腫瘍脳も共にＰＫＧ発現がわかった。ＰＫＧ活性化物質８Ｂｒ−ｃＧＭＰは、ビヒクルのみの対照と比べてＫｉ値を増大させた（Ｋｉ ＝ ２２．１±６．６μｌ ｇ−１ ｍｉｎ−１と１４．２±５．１μｌ ｇ−１ ｍｉｎ−１； Ｐ＜０．０５）。これらの結果は、ＰＫＧを活性化するｃＧＭＰの内在生産が、おそらくＫＣａのＰＫＧ仲介活性化により血液腫瘍関門透過性を選択的に高めることを意味している。
【００５６】
免疫組織化学分析によりカリウムチャンネルが正常組織に比べて新生血管系や悪性腫瘍細胞に多く存在することがわかる
ＫＣａチャンネルタンパク質を上記のように特異抗体を用いて免疫的に局在決定した。免疫組織化学分析から、ＫＣａチャンネルが正常対側組織の切片と比べて、ＲＧ２をもつラット脳切片の腫瘍組織や腫瘍毛細血管においてＫＣａチャンネルが選択的に増加したことがわかった（図１５）。同様に、ＫＡＴＰ特異抗体を用いたＫＡＴＰの免疫局在化から、ＫＡＴＰチャンネルがＲＧ２腫瘍をもつラット脳切片やＣ６腫瘍をもつラット脳ウイルス切片の腫瘍組織や腫瘍毛細血管において選択的に増加したことがわかった（図１６）。これらの免疫組織化学結果は、ＫＣａチャンネルのＮＳ−１６１９による活性化、又はＫＡＴＰのミノキシジルによる活性化が血管腫瘍関門を選択的に開放した透過性データと一致している。
まとめると、透過性及び免疫組織化学データから、カリウムチャンネルを活性化する化合物が抗腫瘍化合物の悪性腫瘍組織へのデリバリーを選択的に高めるために使用し得ることが証明される。
【００５７】
透過型電子顕微鏡実験 透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）実験から、ＰＢＳ対照と比べて、ＫＣａ活性化物質ＮＳ−１６１９とブラジキニンの頚動脈内インフュージョン後、毛細血管内皮、及び腫瘍細胞の管腔−分離管腔軸に沿った飲作用胞の形成及び移動促進がわかった。（図４）。定量的分析から、ブラジキニンとＮＳ−１６１９が共にＰＢＳ対照と比べて核を含まない細胞質の単位表面積当たりの小胞数を著しく増加させることがわかった。 飲作用胞の平均直径は７５−８０ ｍｍであった。 腫瘍毛細血管内皮細胞の管腔膜の陥入は、飲作用胞の配列を生じ、内皮細胞質（Ｅ）の管腔−分離管腔軸に沿って移動する。これらの小胞は、基底膜とドッキング及び融合し、内皮細胞膜の分離管腔側面に内容物を遊離させる。処理グループからの細胞は、無傷基底膜（ＢＭ）と内皮密着結合を有すると思われる。輸送飲作用胞（ＰＶ）は、管腔（Ｌ）と分離管腔（Ａｂ）領域近くに存在する（図４）。ブラジキニン又はＮＳ−１６１９のインフュージョン後のグリオーマからの細胞は、無傷基底膜と内皮密着結合（ＴＪ）を有する（例えば、図５）。追加のＴＥＭ実験から、脳腫瘍毛細血管の内皮細胞の飲作用胞の配列内に電子密度の高いホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ； 分子量が約４０，０００のタンパク質マーカー）の存在がわかり、ＫＣａ活性化物質ブラジキニンをＲＧ２腫瘍をもつラットにＨＲＰと同時インフュージョンした後にＨＲＰが内皮の管腔−分離管腔領域から腫瘍細胞に輸送されていることがわかった（図５及び図６）。このＨＲＰを装荷した輸送小胞の証拠は、経内皮小胞輸送が腫瘍細胞への薬剤デリバリーの重要な細胞機序であることを意味する。
【００５８】
カリウムチャンネル活性化物質ブラジキニンをインフュージョンした腫瘍をもつラット、及びトレーサーホースラディシュ（ＨＲＰ）を静脈注射した腫瘍をもつラットによる追加のＴＥＭ実験から、脳腫瘍毛細血管の内皮細胞の飲作用胞の配列内に電子密度の高いＨＲＰが存在することがわかった（図５； Ｐ ＝ 形質膜）。ブラジキニンインフュージョン後、ＨＲＰを積んだ小胞の数が増加し（ＰＢＳ処理腫瘍細胞と比べて腫瘍細胞に認められた図６； 矢印）、薬剤分子が毛細血管内皮を脳腫瘍塊へ向かって通過したならば、小胞輸送が腫瘍細胞への薬剤デリバリーの主要な細胞機序であることを意味している。
ビヒクル対照とブラジキニン（ＢＫ）インフュージョングループ間の調べた形態学的パラメーターのいずれにもほとんど差が見られなかったが、種々の種類の調べた組織と比較するとこれらのパタメーターに著しい差があった。分離管腔と管腔周囲、毛細血管の面積、及びＲＧ２腫瘍とＣ６腫瘍の毛細血管の平均厚さは、正常脳基底核より著しく大きかった。しかしながら、基底核における小胞領域の密度と割合の著しい増加は、未処理ラットと比べた場合、ＲＧ２及びＣ６腫瘍領域におけるブラジキニン処理ラットに認められた（表１）。
【００５９】
【表１】
表１ 内皮細胞質の小胞の密度と面積の割合
ａ ＢＧ ＝ 基底核
ａａ ＰＢＳ ＝ リン酸塩緩衝生理食塩水ビヒクル対照； ＢＫ ＰＢＳ ＋ ブラジキニン
ｂ 数値は平均 ＳＤ； ｎ＝ラットの数
ｃ 数値は平均 ＳＤ； ｎ＝毛細血管の数
ｄ 生理食塩水対照グループとの有意差、ｐ ＜ ０．０１
【００６０】
カリウムチャンネル活性化物質は虚血脳領域の異常脳毛細血管の透過性を高める
予備的ＭＣＡ閉鎖／再潅流実験においては、ＫＣａ活性化物質ブラジキニンが一過性虚血後の梗塞組織の透過性を高めることがわかった。ＮＯＳ活性は、一過性虚血再潅流ラットモデルにおいて著しく上昇し（データは示されていない）、このことは虚血毛細血管の透過性を高めるブラジキニンの能力と一致する（図１０Ｂ）。図１０Ｂに示されるように、虚血脳領域の微小血管経の透過性により、正常脳微小血管系（即ち、対側組織）と比べて、ＭＣＡ閉鎖の２時間後のカリウムチャンネル活性化物質に対する応答性が高められた。対照的に、図１０Ａは、脳微小血管系の透過性は、ＭＣＡ閉鎖のわずか１時間後にもカリウムチャンネル活性化物質に対して応答しなかったことを示している。これは、組織が次第に異常になるので長時間の虚血により微小血管系の性質が変化することを意味している。
虚血−再潅流ラットモデルを用いて、虚血脳領域におけるカリウムチャンネルによりエバンスブルー染料に対する高透過性が調節されたことが直接観察された。図１１においては、冠状脳切片が腫瘍組織内のエバンスブルー（ＥＢ）を示している。エバンスブルー染料の吸収は、血液脳関門／血液腫瘍関門透過性の既知の定性的尺度である。２時間のＭＣＡ閉鎖後に１時間の再潅流に供したラットは、ＰＢＳビヒクルインフュージョン後の虚血領域において透過性の増強を示さなかった（図１１）。対照的に、同様の虚血状態に続いてＫＣａチャンネルの活性化物質、例えば、ブラジキニン又はＮＳ−１６１９（図１１）又は一酸化窒素供与体（データは示されていない）の動脈内インフュージョン に供したラットは染料に対する透過性を高めた。カリウムチャンネル活性化物質によって生じた染料に対する高透過性は、ＫＣａ特異的阻害剤ＩＢＴＸとの同時インフュージョンにより低下し、ＫＣａの特異的関係を意味している（図１１）。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ウィスターラットの悪性腫瘍ＲＧ２グリオーマ組織において［１４Ｃ］α−アミノイソ酪酸の一方向移動定数Ｋｉでの可溶性グアニリルシクラーゼ活性化物質ＹＣ−１（２．６６μｇ ｍｉｎ−１ ｋｇ−１； ｎ ＝ ６）に対する応答を、ＤＭＳＯ ＋ 生理食塩水対照（ｎ ＝ ６）、ＹＣ−１ ＋ イベリオトキシン（ＩＢＴＸ； ０．２μｇ ＩＢＴＸ ｍｉｎ−１ ｋｇ−１； ｎ ＝ ３）、又はＹＣ−１ ＋ 可溶性グアニリルシクラーゼの選択的阻害剤、１Ｈ−［１，２，４］オキサジアゾロ［４，３−ａ］キノザリン−１−オン（ＯＤＱ）（２．６６μｇ ｍｉｎ−１ ｋｇ−１； ｎ ＝ ４）の各１５分間処理との比較を示すグラフである。腫瘍コア（灰色の棒）、腫瘍コアから約３ ｍｍの腫瘍隣接組織（白色の棒）、及び正常対側脳組織（黒色の棒）のＫｉ（μｌ／ｇ／ｍｉｎ）が示されている。
【図２】
ウィスターラットの悪性腫瘍ＲＧ２グリオーマ組織におけるエバンスブルー染色の血液腫瘍関門透過性に対する一酸化窒素供与体ジエチルアミン−ＮＯＮＯａｔｅ （ＤＥＡ／ＮＯ）の増強作用を示す写真である。図２Ａはリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳのみの対照）で処理したラットからの脳切片を示す写真である。図２ＢはＤＥＡ／ＮＯ処理ラットからの脳切片を示す写真である。
【図３】
ウィスターラットの悪性腫瘍ＲＧ２グリオーマ組織において［１４Ｃ］α−アミノイソ酪酸の一方向移動定数ＫｉでのＤＥＡ／ＮＯ（２．６６μｇ ｍｉｎ−１ ｋｇ−１； ｎ ＝ ３）に対する応答を、ＰＢＳ対照、ＤＥＡ／ＮＯ ＋ イベリオトキシン（ＩＢＴＸ； ０．２μｇ ＩＢＴＸ ｍｉｎ−１ ｋｇ−１； ｎ ＝ ３）、又はＰＡＰＡ／ＮＯ（２．６６μｇ ｍｉｎ−１ ｋｇ−１； ｎ ＝ ３）の各１５分間処理との比較を示すグラフである。腫瘍中央部（黒色の棒）、腫瘍コアから約３ ｍｍの腫瘍隣接組織（白色の棒）、及び正常対側脳組織（網状の棒）のＫｉ（μｌ／ｇ／ｍｉｎ）が示されている。
【図４】
ＲＧ２腫瘍毛細血管における経内皮小胞輸送を示す写真である。ウィスターラットからのＲＧ２腫瘍をもつ脳切片を、ＰＢＳ （０．８ ｍｌ）（図４Ａ； ５４，０００×倍率）； ブラジキニン（１０μｇ ｍｉｎ−１ ｋｇ−１）（図４Ｂ； ８７，０００×倍率）； 又はＮＳ−１６１９ （５．３μｇ ｍｉｎ−１ ｋｇ−１； 図４Ｃ； ８７，０００×倍率）で１５分間頚動脈内にインフュージョンした後に作製した。腫瘍中央部の切片のＴＥＭ分析により、ＫＣａ活性化物質ブラジキニンとＮＳ−１６１９が内皮細胞質の輸送飲作用胞を増加させることが示される。
【図５】
カリウムチャンネル活性化物質（ブラジキニン）が、内皮飲作用胞によって腫瘍毛細血管内腔からのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＢＲＰ）の輸送を増加させることを示す写真である。図５Ａ （８，７００×倍率）及び図５Ｂ （２１，０００×倍率）は、 ＰＢＳ対照グループのラットからの血管組織と腫瘍組織を示す写真である。図５Ｃ （８，７００×倍率）及び図５Ｄ （２１，０００×倍率）はカリウムチャンネル活性化物質ブラジキニンで処理したラットからの血管組織と腫瘍組織を示す写真である。
【図６】
カリウムチャンネル活性化物質（ブラジキニン）が、ＲＧ２腫瘍細胞においてＢＲＰの小胞輸送を誘導することを示す写真である。図６Ａ （８，７００×倍率）は、ＰＢＳ対照のラットからの腫瘍組織を示す写真であり、図６Ｂ （１０，８００×倍率）及び図６Ｃ （２１，０００×倍率）はブラジキニン処理ラットからの腫瘍組織を示す写真である。
【図７】
ＫＡＴＰ活性化物質ミノキシジル硫酸塩及びＫＣａ活性化物質ブラジキニンによる一方向輸送定数の増大を示すグラフである。
【図８】
ブラジキニンによるＫｉの増大はグリベンクラミドにより減弱されず、ＩＢＴＸがブラジキニンによる作用を著しく減弱したことを示すグラフである。
【図９】
ミノキシジル硫酸塩によるＫｉの増大はグリベンクラミドにより減弱されず、ＩＢＴＸが作用を阻止しなかったことを示すグラフである。
【図１０】
カリウムチャンネル活性化物質による処理の結果として虚血脳領域の微小透過性増大を示すグラフである。Ｋｉは、ブラジキニン処理動物（黒色の棒）及び対象動物（灰色の棒）について対の柱状図表で示され、組織は（左から右へ）、尾状被殻； 皮質； 尾状被殻対側； 及び皮質対側を試験した。図１０Ａから、虚血の１時間後の血液脳関門透過性がビヒクル処理グループと比べてブラジキニン処理によって影響されなかった（１時間のＭＣＡ閉鎖に続いて１時間の再潅流； 挿入図： オートラジオグラフ）ことが示される。図１０Ｂから、ブラジキニンが２時間のＭＣＡ閉鎖に続いて１時間の再潅流後に虚血性梗塞周辺部（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｉｎｆａｒｃｔ ｐｅｎｕｍｂｒａ）において透過性を著しく増大したことが示される（挿入図： オートラジオグラフ）。
【図１１】
カリウム活性化物質が虚血脳組織において微小血管系の透過性を高めることを示す写真である。梗塞脳組織（エバンスブルーの吸収が著しく少ない）の血液脳関門透過性の変化は、一過性虚血にかかったラットには観察されなかった（２時間のＭＣＡ閉鎖及び１時間の再潅流； 上と下の左側パネル）。ＰＢＳビヒクル処理（上と下の左側パネル）と比べてブラジキニン処理（１０μｇ ｍｉｎ−ｌ ｋｇ−１ １５分間； 上中央パネル）又はＮＳ処理（１．５μｇ ｍｉｎ−１ ｋｇ−１ １５分間、下の中央パネル）ラットの虚血脳組織にエバンスブルー吸収のかなりの増大が見られた。しかしながら、ＩＢＴＸ （０．２μｇ ｍｉｎ−１ ｋｇ−１ １５分間）との同時インフュージョンにより、ブラジキニン（上右側パネル）又はＮＳ−１６１９（下右側パネル）によって誘導されたエバンスブルーの吸収増大を減弱した。
【図１２Ａ】
ウィスターラットの悪性腫瘍ＲＧ２グリオーマ組織の正常脳組織の隣接部（中央部）と対側（右側）の血液脳関門透過性に対する作用と［１４Ｃ］−アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）トレーサー（左）の血液腫瘍関門透過性に対するＮＳ−１６１９の増強作用との比較を示すグラフである。
【図１２Ｂ】
ウィスターラットの悪性腫瘍ＲＧ２グリオーマ組織の正常脳組織の隣接部（中央部）と対側（右側）の血液脳関門透過性に対する作用と［１４Ｃ］ＡＩＢトレーサー（左）の血液腫瘍関門透過性に対するミノキシジル硫酸塩の増強作用との比較を示すグラフである。
【図１３】
ウィスターラットの悪性腫瘍ＲＧ２グリオーマ組織における［１４Ｃ］−アミノイソ酪酸の一方向移動定数ＫｉでのＮＳ−１６１９に対する用量応答を示すグラフである。Ｋｉ ＝ ｌ／ｇ／ｍｉｎ。
【図１４】
ＮＳ−１６１９（２６．５μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１）の透過性増強作用のイベリオトキシン（ＩＢＴＸ； ２．３μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１）よる特異的阻害を示すグラフである。Ｋｉは、ＲＧ２腫瘍をもつウィスターラットにおいて１５分間、［１４Ｃ］ＡＩＢとＩＩＢＴＸ （２．３μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１）を含む又は含まないＮＳ−１６１９（２６．５μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１）とを用いて求めた。結果が ５％ エタノールを含む又は含まないＰＢＳ、ｐＨ ７．４と比較されている。
【図１５】
グリオーマ組織（図１５Ｂ）の抗ＫＣａ免疫学的染色によって示されるＫＣａの強い過剰発現と、正常対側脳組織（図１５Ａ）との比較を示す写真である。倍率は１００×である。
【図１６】
腫瘍中央部からのＲＧ２（図１６Ｃ）又はＣ６（図１６Ｄ）グリオーマ組織の抗ＫＣａ免疫学的染色によって示されるＫＣａの強い過剰発現と、正常対側脳組織（図１６Ａ）及びＲＧ２腫瘍周辺（図１６Ｂ）との比較を示す写真である。倍率は１００×である。
発明の背景
本願明細書全体に種々の文献が括弧に引用されている。本発明が関係している技術水準を詳細に記載するために、これらの文献の開示内容は全体で本願明細書に含まれるものとする。
【０００２】
１． 発明の分野
本発明は、医療技術に関する。特に、異常な微小血管系を横切って治療を必要としている組織への薬剤のデリバリーを高める方法に関する。
【０００３】
２． 関連技術の説明
病的血管新生、即ち、新しい血管の増殖又は発生は、原発性、続発性又は転移性悪性腫瘍の成長と拡散に不可欠なものである。固形腫瘍において新生微小血管系を構成している新しい毛細血管と細動脈のある種の性質は正常な微小血管系と異なっている（Ｊ． Ｄｅｎｅｋａｍｐら， 血管系と微小周囲勾配： がん治療の新規な方法におけるミッシングリンク， Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ． ３８− ９９ ［１９９８］）。悪性腫瘍細胞からの血管形成によって誘導された新生微小血管系は、腫瘍形成性細胞によって誘導されなかった新生微小血管系に比べて一部の血管収縮剤に対して薬理学的反応性が変化することが報告された（Ｓ．Ｐ． Ａｎｄｒａｄｅ ＆ Ｗ．Ｔ． Ｂｅｒａｌｄｏ， 血管収縮剤に対する新生物又は非新生物関連新生血管系の薬理的反応性， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｐａｔｈｏｌ． ７９（６）：４２５−３２ ［１９９８］）。
多くのがん治療の提案は、新生微小血管系と正常微小血管系間の差異に基づくものであった。例えば、コンブレタスタチンＡ−４は、正常血管と比べて悪性腫瘍の血管に選択的に血管損傷及び閉塞を引き起こすことがわかった（Ｇ．Ｇ． Ｄａｒｋら， コンブレタスタチンＡ−４， 腫瘍血管系に対して強力で選択的な毒性を示す薬剤， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７（１０）：１８２９−３４ ［１９９７］； Ｄ．Ｊ． Ｃｈａｐｌｉｎ ｅｔ ａｌ， 固形腫瘍治療の抗血管アプローチ： コンブレタスタチンＡ４リン酸塩の評価， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９（ＩＡ）：１８９−９５ ［１９９９］）。
【０００４】
モノクローナル抗体は、新生血管系において血栓症を選択的に誘導するために、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）−Ｉ、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、糖タンパク質エンドシアリン、又は前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のような病的新生血管系の内皮細胞に特異的な抗原又は抗原の組合わせに向けられていた（Ｅ．ｇ．， Ｓ． Ｒａｎら， 腫瘍血管系の組織要素の抗体特定ターゲッティングによるマウスにおける固形ホジキン腫瘍の梗塞， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８（２０）：４６４６−５３ ［１９９８］； Ｉ． Ｏｈｉｚｕｍｉら， 腫瘍血管内皮細胞を標的にする抗体に基づく治療はラットにおける固形腫瘍成長を抑制する， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２３６（２）：４９３−９６ ［１９９７］； Ｓ．Ｓ． Ｃｈａｎｇら， ５種類の異なる抗前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）抗体は腫瘍関連新生血管系においてＰＳＡＭ発現を確認する， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９（１３）：３１９２−９８ ［１９９９］； Ｗ．Ｊ． Ｒｅｔｔｉｇら， ヒトがんにおける血管内皮細胞の細胞表面糖タンパク質、エンドシアリンの同定， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９（２２）：１０８３２−３６ ［１９９２］）。しかし、単独で用いられると、新生微小血管系を通る悪性腫瘍への血流を閉鎖することにより、必ずしも腫瘍成長が停止しないことがある。固形腫瘍の周辺の腫瘍形成性物細胞の活発に増殖する集団が正常微小血管系によって供給された血液に接近できるからである（Ｅ． ｇ．， Ｄ． Ｊ． Ｃｈａｐｌｉｎら ［１９９９］）。
【０００５】
その結果、他の従来の及び新規な治療様式が固形悪性腫瘍の治療に依然として価値がある。しかしながら、細胞障害性化学療法剤、モノクローナル抗体、サイトカイン、エフェクター細胞、又はウイルス粒子を含む新規な治療剤の効力は、適量で生体内の標的に到達する能力が制限されているため、この新規な治療剤の効果が限定されたものになっている（例えば、Ｒ．Ｋ Ｊａｉｎ， 腫瘍に治療剤をデリバリーするための血管間質関門， Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ． ９（３）：２５３−６６ ［１９９０］）。重要な制限要因は、腫瘍に供給される新生微小血管系の巨大分子やウイルス粒子に対する透過性が低いことである。
この微小血管透過性の問題は、中枢神経系の悪性腫瘍については特に深刻である。これらの悪性度は、神経外科的手法、化学療法及び放射線療法の領域における最近の進歩にもかかわらず、普通は致命的である。特に、脳、頭蓋、及び脊髄の悪性腫瘍をもつ患者の予後を実質的に変え得る標準治療様式はない。例えば、脳全体に浸潤の腫瘍細胞が特徴である、悪性髄芽腫、悪性髄膜腫、悪性神経線維肉腫及び悪性グリオーマと診断された患者に高死亡率が持続している。頭蓋内腫瘍塊は、手術で塊を除去し得るが、一時的な放射線療法や化学療法で治療した頭蓋内腫瘍、例えば、グリア芽細胞腫に伴う生存は、典型的には数ヶ月と測定されている。固形脳腫瘍に対する新しい治療様式の開発は、主に潜在的治療剤の経血管デリバリーに左右される。
【０００６】
化学療法剤やウイルス粒子の腫瘍細胞又は他の異常脳組織への経血管デリバリーは、血液脳関門、特に脳腫瘍に見られる血液腫瘍関門によって妨害される。血液脳関門は、正常脳組織と異常脳組織双方の脳毛細血管と細動脈の脳血管性内皮細胞によって形成された内皮間密着結合から生じると考えられる経血管透過性関門である。血液脳関門の維持は、おそらく内在性一酸化窒素の生産及びサイクリックＧＭＰ依存性機序が関与している（Ｌｉｕ， Ｓ．Ｍ． ＆ Ｓｕｎｄｑｖｉｓｔ， Ｔ．， 一酸化窒素やｃＧＭＰは過酸化水素処理内皮細胞において内皮透過性とＦ−アクチン分布を調節する， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ． Ｒｅｓ． ２３５（ｌ） ２３８−４４ ［１９９７］）。血液脳関門は、全身系血液供給の組成の変化（例えば、電解質として）又は血液から生じた巨大分子、例えば、免疫グロブリン又は他のポリぺプチドから脳を保護し、多くの外因性供給薬剤の脳組織への経血管デリバリーを妨げる。
脳組織異常、例えば、腫瘍の治療は、それ自体の毒性が著しい薬剤の使用がしばしば必要であり、その薬剤を異常組織又は悪性組織に優先的に向けることができることが非常に望ましい。一方、薬剤を脳に運搬することができる血液脳関門を開くことができる技術を開発することに多くの関心があった。これらの方法のいくつかは、無傷の正常脳組織において血液脳関門を残しつつ異常脳組織においてのみ血液脳関門を選択的に開くことができるものである。
【０００７】
例えば、Ｎｅｕｗｅｌｔらは、血液脳関門を浸透圧で破壊するために高張マンニトールの頚動脈内注射を用いた。頚動脈内大量注射により直後に投与された不活性化ＨＳＶ−１粒子の脳組織による吸収を高めたことが報告された（Ｅ．Ａ． Ｎｅｕｗｅｌｔら， 浸透圧修飾血液脳関門を横切る紫外線不活性化ヘルペスウイルスのデリバリー， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． ７４（３）：４７５−７９ ［１９９１］； また、Ｓ．Ｅ． Ｄｏｒａｎら， 血液脳関門破壊後の中枢神経系における組換えウイルスベクターからの遺伝子発現， Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ ３６（５）：９６５−７０ ［１９９５］； Ｇ． Ｎｉｌａｖｅｒら， 浸透圧血液脳関門破壊後のヌードマウス脳内腫瘍へのヘルペスウイルスやアデノウイルスのデリバリー， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２（２１）：９８２９−３３ ［１９９５］）。
ロイコトリエンＣ．ｓｕｂ．４ （ＬＴＣ．ｓｕｂ．４）を頚動脈内インフュージョンすると、正常脳毛細血管の透過性に影響せずに脳腫瘍毛細血管の透過性が選択的に高められる。しかしながら、脳腫瘍毛細血管に対するＬＴＣ．ｓｕｂ．４の作用は、小分子に限られ、正常脳組織に相対して異常脳組織における小分子の透過性をわずかしか高めることができない。従って、ＬＴＣ．ｓｕｂ．４は大きな水溶性分子の脳腫瘍又は他の異常へのデリバリーをほとんど増加させない。
【０００８】
血管作動性ナノぺプチドブラジキニンやそのアゴニスト又はその類似体（例えば、受容体仲介透過化処理剤［ＲＮＴｓ］）は、同時投与神経薬剤又は診断剤に対する血液脳関門透過性を高めるために静脈内に注射された（Ｂ． Ｍａｌｆｔｏｙ−Ｃａｍｉｎｅ， 血液脳関門透過性のブラジキニンアゴニストを投与することにより血液脳関門を高める方法， 米国特許第５，１１２，５９６号； Ｊ．Ｗ． Ｋｏｚａｒｉｃｈら， 透過化処理剤ぺプチドによる血液脳関門透過性を高める， 米国特許第５，２６８，１６４号）。ブラジキニンを頚動脈内インフュージョンすると、分子量が１００〜７０，０００ダルトンの範囲内にある分子に対して脳腫瘍及び虚血脳毛細血管の透過性が２〜１２倍選択的に高められる（Ｉｎａｍｕｒａ， Ｔ．ら， ブラジキニンは実験脳腫瘍において血液腫瘍関門を選択的に開放する， Ｊ． Ｃｅｒｅｂ． Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ． １４（５）：８６２−７０ ［１９９４］）。ブラジキニンは、非常に多量の投与の場合を除いて正常血液脳関門の透過性を高めない（Ｗｉｒｔｈ， Ｋ．ら， ＤｅｓＡｒｇ９−Ｄ−Ａｒｇ［Ｈｙｐ３，Ｔｈｉ５，Ｄ−Ｔｉｃ７，Ｏｉｃ８］ブラジキニン（ｄｅｓＡｒｇ ［Ｈｏｅ．１４０］）は強力なブラジキニンＢ１受容体アンタゴニストである， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０５ （２）： ２１７−１８［１９９１］）。ブラジキニンによる血液腫瘍関門の開放は、一時的なものであり、ｌ５〜２Ｏ分間続く（Ｉｎａｍｕｒａら ［１９９４］）。ブラジキニンで異常脳毛細血管を開けた後、それらの毛細血管は６０分間までブラジキニン作用に無反応性になる（Ｉｎａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ ［１９９４］）。
【０００９】
神経薬剤（例えば、５−フルオロウラシル、シスプラチン、メトトレキセート、又はモノクローナル抗体）又は診断剤（例えば、テクニシウム−９９グルコヘプトネート、ガリウム−ＥＤＴＡ、又は鉄（ＩＩ）磁気物質又はヨウ素化造影剤）を異常脳組織に選択的にデリバリーする方法は、ブラジキニン、又はブラジキニン類似体、例えば、ＲＭＰ−７の頚動脈内インフュージョンを用い、該ブラジキニン又はブラジキニン類似体は該薬剤とほぼ同時に投与された（Ｋ．Ｌ． Ｂｌａｃｋ， 異常脳組織毛細血管の選択的開放方法， 米国特許第５，５２７，７７８号及び同第５，４３４，１３７号）。ＨＳＶ由来ウイルス粒子のラットの脳における悪性腫瘍細胞への増強された経血管デリバリーは、血管脳関門をブラジキニン又はＲＭＰで破壊することにより達成された（Ｎ．Ｇ． Ｒａｉｎｏｖ， 実験脳新生物に動脈内デリバリーしたウイルス粒子又はモノクリスタリン粒子の選択的吸収， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ． Ｔｈｅｒ． ６（１２）：１５４３−５２ ［１９９５］； Ｎ．Ｇ． Ｒａｉｎｏｖら， 治療的単純ヘルペスウイルスベクターのブラジキニン増強動脈内デリバリーによるげっ歯類脳腫瘍モデルの長期生存， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５（３）：１５８−６２ ［１９９８］； Ｆ．Ｈ． Ｂａｒｎｅｔｔら， ＲＭＰ−７を用いた実験脳腫瘍へのヘルペスウイルスベクターの選択的デリバリー， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ６（ｌ）：１４−２０ ［１９９９］）。
【００１０】
カルシウム活性化カリウムチャンネル（ＫＣａ）は血管張力の重要な調整剤である （Ｎｅｌｓｏｎ ＭＴ， Ｑｕａｙｌｅ ＪＭ． 動脈平滑筋のカリウムチャンネルの生理的役割と性質， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２６８（４ Ｐｔ １）： Ｃ７９９−８２２［１９９５］； Ｂａｎｇ， Ｌ．ら， ニトログリセリン仲介血管弛緩は内皮カルシウム活性化カリウムチャンネルによりモジュレートされる， Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｒｅｓ． ４３（３）：７７２−７８ ［１９９９］）。ＫＣａチャンネルは、組織とサブユニットに遍在的に配分される。その活性は、脱分極が引き金になり、サイトゾルカルシウムジカチオン（Ｃａ２＋）の増加により高められる。Ｃａ２＋の局所的増加は、ＫＣａの非常に感受性のある脳サブユニットが感じ、細胞内の細胞質に対して向けられ、これらのチャンネルを通るかなりのカリウムカチオン流量を可能にする。細胞内サイクリック３’，５’アデノシン一リン酸濃度（ｃＡＭＰ）が血管内皮で上昇する条件 （例えば、低酸素）下で、ＡＴＰ感受性カリウムチャンネル（ＫＡＴＰ）は役割を果たすことができる（Ｊ．Ｅ． Ｂｒｉａｎら， 脳循環調節の最近の洞察， Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２３（６−７）： ４４９−５７ ［１９９６］）。ミノキシジル硫酸塩やクロマカリムは、ＫＡＴＰの活性化物質であることが報告されている（Ａ．Ｄ． Ｗｉｃｋｅｎｄｅｎら， 血管平滑筋に対するＫ（＋）−チャンネル開放物質クロマカリムとミノキシジル硫酸塩の作用の比較， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ， １０３（ｌ）： １１４８−５２ ［１９９１］）。
【００１１】
サイクリックＧＭＰ （ｃＧＭＰ）として一般に既知のグアノシン３’，５’−サイクリック一リン酸はカリウムチャンネルの調節と深く関係があり、重要なシグナル導入分子は３種類の主要なエフェクタータンパク質： （１） タンパク質リン酸化を仲介するｃＧＭＰ−依存性プロテインキナーゼ； （２） 形質膜を横切るカチオン流入を仲介するｃＧＭＰ−ゲートイオンチャンネルプロテインキナーゼ及び（３） サイクリックヌクレオチド異化作用を仲介するホスホジエステラーゼの調節を仲介する（Ｌｏｈｓｅ， ＭＪ．ら， ＮＯ：ｃＧＭＰシグナル導入の薬理学， Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ Ａｒｃｈ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３５８：１１１−１２ ［１９９８］； Ｓｍｏｌｅｎｓｋｉ， Ａ．ら， ＮＯ／ｃＧＭＰ作用の伝達物質としてのｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼＩ及びＨの機能分析， Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ Ａｒｃｈ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３５８：１３４−３９ ［１９９８］； Ｈｅ， Ｐ．ら， ｃＧＭＰは ［Ｃａ２＋］ｉの基礎的活性化微小血管透過性を独立してモジュレートする， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２７４（６ Ｐｔ ２）：ＨＩ８６５−７４ ［１９９８］； Ｈｏｌｓｃｈｅｒｍａｎｎ， Ｈ．ら， 大動脈内皮細胞の巨大分子のモジュレーションにおけるｃＧＭＰの２つの役割， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２７２（ｌ Ｐｔ ２）：Ｈ９１−９８ ［１９９７］）。
ｃＧＭＰのＧＴＰからの生産は、可溶性グアニリルシクラーゼ、一酸化窒素活性化酵素によって触媒される（Ｐａｔｅｌ， Ａ．Ｉ． ＆ Ｄｉａｍｏｎｄ， Ｊ．， ニトログリセリンやニトロプルシドナトリウムによるグアノシン３’，５’−サイクリック一リン酸（ｃＧＭＰ）依存性プロテインキナーゼの活性化， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２８３（２）：８８５−９３ ［１９９７］； Ｐａｔｅｌ， Ａ．Ｉ．ら， ラット精管や遠位結腸におけるグアノシン３’，５’−サイクリック一リン酸（ｃＧＭＰ）依存性プロテインキナーゼの活性化は収縮阻害を付随しない， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２８３（２）：８９４−９００ ［１９９７］）。
【００１２】
一酸化窒素が微小血管張力の調節に関与することも証明されている（Ｊｏｏ， Ｆ．ら， 脳微小血管における巨大分子輸送の調節： サイクリックＧＭＰの役割， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ２７８（１−２）：１６５−７４ １９８３］）。例えば、グリア腫瘍や虚血組織は正常脳に対してｎＮＯＳやｅＮＯＳに免疫陽性である（Ｃａｉ， Ｚ．ら ， 出生前低酸素虚血は若年ラット脳において一酸化窒素シンターゼの発現と活性を変化させ、学習欠損を引き起こす， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｂｕｌｌ． ４９（５）：３５９−６５ ［１９９９］； Ｎａｋａｎｏ， Ｓ．ら， 頚動脈内ブラジキニンインフュージョン後の高脳腫瘍微小血管透過性は一酸化窒素により仲介される， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５ ６：４０２７−４０３１ ［１９９６］； Ｆａｒａｃｉ， Ｆ．Ｍ．ら， 脳微小循環の拡張応答における可溶性グアニル酸シクラーゼの役割， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ８２１（２）：３６８−７３ ［１９９９］）。更に、グリオーマをもつラットをＮＯＳ阻害剤、Ｌ−ＮＡＭＥで前処理すると、ブラジキニン誘導透過性が著しく低下する（Ｍｏｎｃａｄａ， Ｓ．ら， 内在一酸化窒素： 生理的、病理的及び臨床的関連， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ２１（４）３６１−７４ ［１９９１］； Ｓｕｇｉｔａ， Ｍ．ら， 一酸化窒素やサイクリックＧＭＰはブラジキニンに対する腫瘍関門の感受性を減弱させる， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０： ５５９−５６３ ［１９９８］）。
【００１３】
ｃＧＭＰ（及びｃＡＭＰ）によって活性化される種類の酵素は、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＧ又はｃＧＫ）であり、酵素ＡＴＰ依存性リン酸化によって直接又は間接にカルシウム依存性カリウムチャンネルを活性化する（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， Ｂ．Ｅ．ら， ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼは脳動脈平滑筋細胞においてＣａ活性化Ｋチャンネルを活性化する， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２６５［Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ３４］： Ｃ２９９−Ｃ３０３ ［１９９３］； Ｆｕｋａｏ， Ｍ．ら， サイクリックＧＭＰ依存性プロテインキナーゼはセリン１０７２の直接リン酸化により哺乳動物細胞内で発現したクローン化ＢＫＣａチャンネルを活性化する， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４（１６）：１０９２７−３ ５ ［１９９９］； Ｂｅｃｋｅｒ， Ｅ．Ｍ．ら， 血管拡張剤刺激リンタンパク質（ＶＡＳＰ）： ヒト又はラット血小板におけるＹＣ−１及び一酸化窒素作用の標的， Ｊ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３５（３）：３９０−９７［２０００］）。一酸化窒素は、ｃＧＭＰ依存性機序とｃＧＭＰ非依存性機序双方によってＫＣａを活性化し得ることも証明されている（Ｃｈｅｎ， Ｃ．Ｈ．ら， 一酸化窒素は培養したウシ副腎クロマフィン細胞においてＣａ２＋ 活性化Ｋ＋ チャンネルを活性化する， Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｌｅｔｔ． ２４８（２）：１２７−２９ ［１９９８］； Ｖａａｌｉ， Ｋ．ら， 試験管内モルモット気管ＮＯ供与体の弛緩作用はカルシウム感受性カリウムチャンネルによって仲介される， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ， Ｔｈｅｒ． ２８６（ｌ）：１１０−１４ ［１９９８］； Ｓｏｂｅｙ， Ｃ．Ｇ． ＆ Ｆａｒａｃｉ， Ｆ．Ｍ．， 一酸化窒素に対する基底動脈の応答に対する４−アミノピリジンの阻害作用， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １２６（６）：１４３７−４３ ［１９９９］； Ｋｕｒｔｚ， Ａ．ら， 腎血管系に対する一酸化窒素作用機序， Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｓｃａｎｄ． １６８（ｌ）：４１−４５ ［２０００］）。
【００１４】
カリウムチャンネル活性化物質又はアゴニストの使用に対する治療は、高血圧、心臓虚血又は脳虚血、ニコチン嗜癖、気管支狭窄、又は神経変性疾患について教示しているが、特に悪性腫瘍の治療については教示していない（Ｅｒｈａｒｄｔら， カリウムチャンネル活性化物質／開放物質， 米国特許第５，４１６，０９７号； Ｓｃｈｏｈｅ−Ｌｏｏｐら， ４，４’−架橋ビス−２，４−ジアミノキナゾリン， 米国特許第５，７６０，２３０号； Ｓｉｔら， 鉄チャンネルモジュレーターとしての４−アリール−３−ヒドロキシキノリン−２−オン誘導体， 米国特許第５，９２２，７３５号； Ｇａｒｃｉａら， 生物活性化合物， 米国特許第５，３９９，５８７号； Ｃｈｅｒｋｓｅｙ， カリウムチャンネル活性化化合物とその使用方法， 米国特許第５，２３４，９４７号）。
【００１５】
ブラジキニンは［Ｃａ２＋］ｉを高めると考えられるので、ＫＣａチャンネルを活性化することができる。他の既知のＫＣａ活性化物質は、血管拡張剤、例えば、１，３−ジヒドロ−１−［２−ヒドロキシ−５−（トリフルオロメチル）フェニル］−５−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン（ＮＳ−１６１９； Ｍ． Ｈｏｌｌａｎｄら， ラット動脈平滑筋に対するＢＫＣａチャンネル活性化物質、ＮＳ１６１９の作用， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １１７（ｌ）：１１９−２９ ［１９９６］）として作用しないが、 ＫＣａがブラジキニン、一酸化窒素供与体、サイクリックグアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、又はグアニリルシクラーゼ活性化物質のような血管拡張剤によって仲介される血管拡張に重要な役割を果たすことができる証拠が蓄積している（Ｂｅｒｇ Ｔ．， Ｋｏｔｅｎｇ Ｏ．， 正常血圧ラットにおけるブラジキニン誘導又は一酸化窒素誘導低血圧のシグナリング経路； Ｋ＋ チャンネルの役割， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １２１（６）：１１１３−２０ ［１９９７］； Ｂｏｌｏｔｉｎａ， Ｖ．Ｍ．ら， 一酸化窒素は血管平滑筋においてカルシウム依存性カリウムチャンネルを直接活性化する， Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５０−３ ［１９９４］； Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， Ｂ．Ｅ．， ｅｔ ａｔ， ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼは脳動脈平滑菌細胞においてＣａ活性化Ｋチャンネルを活性化する， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２６５（ｌ Ｐｔ １）：Ｃ２９９−３０３ ［１９９３］； Ｓｏｂｅｙ， Ｃ．Ｇ．ら， ラットにおけるブラジキニン誘導脳血管拡張の機序． 反応性酸素化学種がＫ＋ チャンネルを活性化する証拠， Ｓｔｒｏｋｅ ２８（１１）：２２９０−４； ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ２２９５ ［１９９７］； Ｃ．Ｇ． Ｓｏｂｅｙ ＆ Ｆ．Ｍ． Ｆａｒａｃｉ， 基底動脈直径に対する一酸化窒素及びカリウムチャンネルアゴニスト及び阻害剤の影響， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２７２（ｌ Ｐｔ ２）：Ｈ２５６−６２ ［１９９７］； Ｈａｒｄｙ， Ｐ． ｅｔ ａｔ， 子ブタにおける一酸化窒素誘導眼血管弛緩におけるプロスタサイクリンの主な役割， Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ８３ （７）：７２１−２９ ［１９９８］； Ｂｙｃｈｋｏｖ Ｒ．ら， ヒト冠状動脈におけるカルシウム活性化カリウムチャンネルと硝酸塩誘導血管拡張， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２８５（ｌ）：２９３−９８ ［１９９８］； Ａｒｍｓｔｅａｄ， Ｗ．Ｍ．， 低酸素脳血管拡張に対するＫＣａチャンネル活性化の寄与はＮＯを必要としない， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ７９９（ｌ）：４４−４８ ［１９９８］）。
【００１６】
強力な血管拡張剤としてのブラジキニンの作用は、抗がん治療剤に対して血液脳関門を開くためにブラジキニンを用いる場合に不利である。ブラジキニン又はその類似体は逆に血圧を低くすることがあり、脳血流を減少させることもあり、一部の患者においては脳浮腫の原因となることがある（例えば、Ａ．Ｍ． Ｂｕｔｔ， 麻酔したラットの軟膜微小血管における血液脳関門を横切る電気抵抗に対する炎症性物質の作用， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ６９６（１−２）：１４５−５０［１９９５］）。更に、ブラジキニンは、平滑筋を収縮させ、疼痛受容体を刺激する。
その結果、中枢神経系、及び／又は他の異常脳領域を含む悪性腫瘍への選択的経血管デリバリー増強によって種々の治療剤の有効性を最大にすることがなお明らかに求められている。本発明のこれらの及び他の利点は、本明細書に記載される通りである。
【００１７】
発明の概要
本発明は、ヒトを含む哺乳動物において異常脳領域に薬剤をデリバリーする方法に関する。本方法は、該哺乳動物にカリウムチャンネル活性化物質（即ち、カルシウム依存性カリウムチャンネル又はＡＴＰ依存性カリウムチャンネル［ＫＣａ又はＫＡＴＰ］）を投与する段階を含んでいる。カリウムチャンネル活性化物質としては、直接アゴニスト（ブラジキニン又はブラジキニン類似体以外の）、例えば、ＮＳ−１６１９又はミノキシジルが含まれる。カリウムチャンネル活性化物質には、カリウムチャンネルを間接に活性化する化合物、例えば、一酸化窒素、一酸化窒素供与体、又はグアニリルシクラーゼの他の活性化物質も含まれる。カルシウム依存性カリウムチャンネルを活性化するサイクリックＧＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化物質も含まれる。カリウムチャンネル活性化物質は、哺乳動物における異常脳領域の細胞に血液を送る毛細血管又は細動脈の薬剤に対する透過性を高めるのに十分な条件と量で哺乳動物に投与される。カリウムチャンネル活性化物質と同時に又は実質的に同時に薬剤が投与され、異常脳領域を与える毛細血管や細動脈の透過性が増大する結果、薬剤は正常脳領域に比べて異常領域の細胞に選択的にデリバリーされる。本方法は、生存率が悪いことが周知の外傷、感染症、卒中、虚血、又は特に悪性脳腫瘍による物理的又は性化学的脳損傷の治療に特に有効である。
【００１８】
本発明は、本発明の脳又は身体のどこかの悪性腫瘍に薬剤をデリバリーする方法に関する。本方法は、ブラジキニン又はブラジキニン類似体以外のカリウムチャンネルアゴニストのようなカリウムチャンネル活性化物質を哺乳動物において悪性腫瘍の細胞に血液を送る毛細血管又は細動脈の薬剤に対する透過性を高めるのに十分な条件と量で哺乳動物に投与する段階を含んでいる。カリウムチャンネル活性化物質と同時に又は実質的に同時に薬剤を哺乳動物に投与し、カリウムチャンネル活性化物質によって非悪性腫瘍細胞と比べて悪性腫瘍細胞に選択的にデリバリーされる。本発明の方法は、新生物組織への薬剤デリバリーの選択性を高め、よって細胞障害性化学療法剤を含む薬剤から非悪性腫瘍組織に対する損傷をできるだけ少なくし、該薬剤の治療作用又は診断作用を集中させることによりあらゆる種類の悪性腫瘍を治療することに有効である。従って、ヒトにおいて悪性腫瘍を治療する方法に関する本発明は、がん患者に対する生存の見込みが高く、有害な副作用が少ない。本方法の選択性は、種々の薬剤、巨大分子、又はウイルス粒子に対する微小血管系の透過性を仲介する際のカルシウム依存性カリウム輸送体やＡＴＰ依存性カリウム輸送体（チャンネル）の役割と、正常微小血管経と比べて異常脳血管系又は腫瘍新生微小血管系に存在する多くのカルシウム依存性カリウムチャンネルやＡＴＰ依存性カリウムチャンネルとの組合わせに基づくものである。
【００１９】
本発明は、また、ヒトのような哺乳動物へ血管内インフュージョン又はボーラス注射によりデリバリーするための薬剤と共に薬学的に許容しうる溶液中に処方されたブラジキニン又はブラジキニン類似物以外のカリウムチャンネル活性化物質の組合わせを含む医薬組成物に関する。本医薬組成物は、本発明の方法を行うのに有効である。
本発明は、また、異常脳領域及び／又は悪性腫瘍への薬剤のデリバリーを高めるキットに関する
本発明のこれらの及び他の利点及び特徴は、下記の好適実施態様の詳細な説明において詳細に記載される。
【００２０】
好適実施態様の詳細な説明
本発明の方法は、哺乳動物において異常脳領域及び／又は悪性腫瘍に薬剤を選択的にデリバリーするのに有効である。本方法は、ブラジキニン又はブラジキニン類似体以外のカリウムチャンネル活性化物質を哺乳動物に、哺乳動物に存在する異常脳領域の細胞及び／又は悪性腫瘍の悪性腫瘍細胞へ血液を送る毛細血管又は細動脈の薬剤に対する透過性を高めるのに十分な条件と量で投与する段階を含んでいる。透過性の増強は、カリウムチャンネル活性化物質を投与しない対照に比べて少なくとも２〜６倍の範囲にある。透過性の相対的増強は、低分子量物質（例えば、約５０−２００ダルトン）より高分子量物質（例えば、約１０，０００−２５０，０００ダルトン）に対して著しい傾向がある。
【００２１】
異常脳領域には、物理的又は生化学的損傷、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、外傷、感染、卒中、脳虚血、又は脳内の新生物成長領域、例えば、良性又は悪性脳腫瘍組織により生理的に直接影響された脳組織領域が含まれる。
本発明は、また、脳における悪性腫瘍又は哺乳動物の身体のどこかの腫瘍に薬剤を選択的にデリバリーするのに有効である。本発明の技術は、グリオーマ、グリア芽細胞腫、希突起グリオーマ、星状細胞腫、上衣細胞腫、胎生神経外胚芽性腫瘍、非定型髄膜腫、悪性髄膜腫、神経芽細胞腫、肉腫、黒色腫、リンパ腫、又はがん腫を含む固形悪性腫瘍の全種類の治療に有効である。治療すべき腫瘍は、頭骨、脳、脊柱、胸郭、肺、腹膜、前立腺、卵巣、子宮、乳房、胃、肝、腸、結腸、直腸、骨、リンパ系、皮膚、又は哺乳動物の他の器官又は組織に含まれ得る。
【００２２】
本発明の方法は、ヒトを含む哺乳動物、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジの哺乳動物、又はマウス、ラット、ジャービル、ハムスター、又はウサギのような小哺乳動物を治療するのに有効である。
カリウムチャンネル活性化物質は、コンダクタンスが大きくても中間でも小さくてもあらゆるコンダクタンスレベルのカルシウム活性化カリウムチャンネル（ＫＣａ）か又はＡＴＰ感受性カリウムチャンネル（ＫＡＴＰ）の活性化物質である。ＫＣａの直接アゴニスト、例えば、１，３−ジヒドロ−ｌ−［２−ヒドロキシ−５−（トリフルオロメチル）フェニル］−５−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン（ＮＳ−１６１９）又は１−エチル−２−ベンズイミダゾリノン（１−ＥＢＩＯ）が含まれる。
【００２３】
また、有効なカリウムチャンネル活性化物質には、カリウムチャンネルを間接に活性化する化合物、例えば、一酸化窒素、一酸化窒素供与体、メタロポルフィリン（例えば、亜鉛プロトポルフィリン又はスズプロトポルフィリンＩＸ）、ＹＣ−１（ベンジルインダゾール誘導体）、又はグアニリルシクラーゼ活性化タンパク質（ＧＣＡＰ）のような可溶性グアニリル（即ち、グアニル酸）シクラーゼの活性化物質が含まれる（例えば、Ｋｏｅｓｌｉｎｇ， Ｄ．， 可溶性グアニリルシクラーゼモジュレーター， Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ Ａｒｃｈ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３５８：１２３−１２６ ［１９９８］を参照されたい。）。
ＫＡＴＰアゴニストである有効なカリウムチャンネル活性化物質の例としては、ミノキシジル（２，４−ジアミノ−６−ピペリジノピラミジン−３−オキシド； 水に不溶、エタノールに可溶 ２９ ｍｇ／ｍｌ）、ピナシジル（（＋／−）−Ｎ−シアノ−Ｎ’−４−ピリジニル−Ｎ”−（１，２，２−トリメチルプロピル）グアニジン； 水に不溶、エタノールに可溶 １４ ｍｇ／ｍｌ］）、（＋）−クロマカリム、（−）−クロマカリム又はレブクロマカリム、（＋／−）−クロマカリム、又はジアゾキシドが含まれる。
【００２４】
好ましいカリウムチャンネル活性化物質は一酸化窒素ガスであり、生体膜を横切って完全に透過できる。吸入可能な一酸化窒素ガスは、当該技術において既知である制御されたガス混合物のマスクにより哺乳動物に投与され得る（例えば、 Ｋｉｅｌｅｒ−Ｊｅｎｓｅｎ， Ｎ． ら， 肺血管抵抗性が上昇した心臓移植候補物質の評価における吸入一酸化窒素， Ｊ Ｈｅａｒｔ Ｌｕｎｇ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ． １３（３）：３６６−７５ ［１９９４］； Ｒａｊｅｋ， Ａ．ら， 吸入一酸化窒素は心臓移植中にプロスタグランジンＥ（１）より肺血管抵抗性を低下させる， Ａｎｅｓｔｈ Ａｎａｌｇ． ９０（３）：５２３−３０ ［２０００］； Ｓｏｌｉｎａ， Ａ．ら， 成人心臓手術患者において肺高血圧症を治療する吸入一酸化窒素とミルリノンの比較， Ｊ Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ Ｖａｓｃ． Ａｎｅｓｔｈ． １４（ｌ）：１２−１７ ［２０００］； Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ， Ｄ．Ａ．ら， 心臓手術後の吸入一酸化窒素による肺血管抵抗性の有効な制御， Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｓｕｒｇ １１１（４）：７５３−６２， ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ７６２−３ ［１９９６］）。一酸化窒素（ＮＯ）のガス混合物の濃度は、好ましくは約１〜１００ ｐｐｍ ＮＯ、更に好ましくは約４〜８０ ｐｐｍ ＮＯ、最も好ましくは約２０〜４０ ｐｐｍ ＮＯである。ガス混合物は、適切な濃度の酸素及び窒素及び／又は他の不活性ガス、例えば、二酸化炭素、ヘリウム又はアルゴンを含有する。任意により、全身麻酔が必要であるときのガス混合物には、亜酸化窒素（Ｎ２０）、キセノン、又はハロゲン化揮発性麻酔（ＨＶＡ）、例えば、ハロタン、セボフルラン、又はイソフルランのようなガス状麻酔が含まれる。全身麻酔は、例えば、カリウムチャンネル活性化物質（及び／又は薬剤又は化学療法剤）の投与が頚動脈内インフュージョンによる場合に必要であり、全身麻酔は、典型的には静脈内又は他のデリバリー経路を用いることを必要としない。当業者は、ＨＶＡが可溶性グアニリルシクラーゼ活性を阻害し得るという証拠を承知している（Ｍａｓａｋｉ， Ｅ．， ハロゲン化揮発性麻酔剤はラット脳において一酸化炭素刺激可溶性グアニリルシクラーゼ活性を阻害する， Ａｃｔａ Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｏｌ． Ｓｃａｎｄ． ４４（３）：３ ２１−２５ ［２０００］； Ｍａｓａｋｉ Ｅ． ＆ Ｋｏｎｄｏ Ｉ， メチレンブルー、可溶性グアニリルシクラーゼ阻害剤はラットにおいて、セボフルラン肺胞麻酔剤最低濃度を低下させ、脳サイクリックグアノシン一リン酸含有量を減少させる， Ａｎｅｓｔｈ． Ａｎａｌｇ． ８９（２）：４８４−８９ ［１９９９］）。その結果、ＨＶＡは本方法に従ってグアニリルシクラーゼ活性化物質と用いられる吸入麻酔の好ましい選択ではない。
【００２５】
一酸化窒素供与体は、生物系に適用した場合にＮＯ関連生理活性を与える化合物である。従って、ＮＯ供与体は、内在ＮＯ関連応答を模倣（ｍｉｍｉｃ）することができ、あるいは内在ＮＯ不足を置き換えることができる。当業者は、生物系において種々のＮＯ供与体によって遊離され得るＮＯの少なくとも３つの酸化還元状態があることを承知している（ＮＯ＋、ＮＯ０、又はＮＯ−）。これらはすべて本発明においては『一酸化窒素』又は『ＮＯ』という用語に含まれる。ＮＯの酸化還元状態は、他の生体分子、副生成物のプロファイル、及び生体応答に対してＮＯ供与体反応性がかなり相違する（Ｆｅｅｌｉｓｃｈ， Ｍ．， 薬理実験における一酸化窒素供与体の使用， Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ Ａｒｃｈ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，３５８：１１３−２２ ［１９９８］）。一部の種類のＮＯ供与体には酵素触媒が必要であるが、他の種類は非酵素的にＮＯを生じる。ＮＯを遊離するために、一部のＮＯ供与体には、例えば、チオールによる還元が必要であり、一部のＮＯ供与体には酸化が必要である。
【００２６】
一酸化窒素供与体の好ましい例は、１価又は多価アルコールの硝酸エステルである有機硝酸塩化合物を含んでいる。典型的には、これらは水に対する溶解度が低く、原液はエタノール又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で調製される。例は、三硝酸グリセリン（ＧＴＮ）又はニトログリセリン（ＮＴＧ）、ペンタエリスリチル四硝酸塩（ＰＥＴＮ）、イソソルビド二硝酸塩（ＩＳＤＮ）、又はイソソルビド５−一硝酸塩（ＩＳ−５−Ｎ）である。有機硝酸塩の投与は、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、又はＰＥＴＮ、ＩＳＤＮ、ＮＴＧ、又はＩＳ−５−Ｎの場合には経口で行われ得る。
【００２７】
他の好ましい例は、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ペニシラミン（ＳＮＡＰ）、Ｓ−ニトロソグルタチオン（ＳＮＯＧ）、Ｓ−ニトロソアルブミン、Ｓ−ニトロソシステインを含むＳ−ニトロソチオール化合物である。Ｓ−ニトロソチオールは、特に光感受性であるが、氷上と暗所で保持された原液は数時間安定であり、ＥＤＴＡのようなキレート化剤が安定性を高めるために添加され得る。投与は、好ましくは静脈内又は動脈内デリバリー経路による。
一酸化窒素供与体の他の好ましい例としては、モルシドミン（Ｎ−エトキシカルボニルモルホリノシドノンイミン）、リンシドミン（ＳＩＮ−１； ３−モルホリノシドノンイミン 又は３−モルホリニルシドノンイミン又は５−アミノ−３−モルホリニル−１，２，３−オキサジアゾリウム、例えば、塩化物塩）、又はピルシドミン（ＣＡＳ ９３６）のようなシドノンイミン化合物が含まれる。原液は、典型的にはＤＭＳＯ又はＤＭＦ中で調製され、光から保護される場合には４℃〜室温で安定である。リンシドミンは、易水溶性であり、まる１日約ｐＨ ５に調整された脱酸素蒸留水中の酸性溶液に安定である。生理的ｐＨにおいて、ＳＩＮ−１は開鎖形、ＳＩＮ−ＩＡ、好ましい一酸化窒素供与体に急速な非酵素加水分解され、これは暗所でｐＨ ７．４において安定である。投与は、好ましくは静脈内又は動脈内デリバリー経路による。
【００２８】
ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ； ペンタシアノニトロシル鉄酸（Ｉｌ）ナトリウム）のような鉄ニトロシル化合物も一酸化窒素供与体として有効である。水性原液は、好ましくは、使用前に脱酸素水中で新たに作られ、暗所で保持される。原液の安定性は、ｐＨ ３−５で高められる。グルタチオンのような生理的に適合するチオールがデリバリー緩衝液中に含まれると、ＮＯの遊離が増大され得る。ＳＮＰは静脈内インフュージョンで投与され、当業者はＮＯが遊離するにつれて５当量の毒性ＣＮ／モルＳＮＰの遊離により長期使用が阻まれることを承知している。
【００２９】
最も好ましい一酸化窒素供与体は、いわゆるＮＯＮＯａｔｅ化合物の中から選ばれる。 ＮＯＮＯａｔｅは、ＮＯと求核残基（Ｘ−）、例えば、アミン基又はスルファイト基との付加物であり、ＮＯ二量体は窒素原子を介して求核残基に結合して構造Ｘ［−Ｎ（Ｏ）ＮＯ］−の官能基を形成する。ＮＯＮＯａｔｅは、典型的には、生物学的反応成分によってほとんど影響されない予想できる割合でＮＯを遊離し、ＮＯの遊離はＸ− とＮＯの再生による酸触媒解離によるものであると考えられる。この性質は、薬剤を選択的にデリバリーする本発明の方法によれば特に有効である。異常脳領域と悪性腫瘍が、典型的には比較的低酸素であり、周囲ｐＨが比較的低く（例えば、ｐＨ ６．５−７．０）、異常脳領域又は悪性腫瘍の微小血管形では選択的にＮＯの遊離を集中させるからである。
【００３０】
ＮＯＮＯａｔｅとしては、最も好ましいジエチルアミン−ＮＯＮＯａｔｅ （ＤＥＡ／ＮＯ； Ｎ−エチルエタンアミン： １，１−ジエチルヒドロキシ−２−ニトロソヒドラジン（１：１）又は１−［Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ］ジアゼン−ｌ−イウム−１，２−ジオレート）が含まれる。他の好ましいＮＯＮＯａｔｅとしては、ジエチレントリアミン−ＮＯＮＯａｔｅ（ＤＥＴＡ／ＮＯ； ２，２’−ヒドロキシニトロソヒドラジノ］ビスエタンアミン）、スペルミン−ＮＯＮＯａｔｅ （ＳＰＥＲＩＮＯ； Ｎ−（４−［−１−（３−アミノプロピル）−２−ヒドロキシ−２−ニトロソヒドラジノ］ブチル）−１， ３−プロパンジアミン）、プロピルアミノプロピルアミン−ＮＯＮＯａｔｅ （ＰＡＰＡ／ＮＯ； ３−（２−ヒドロキシ−２−ニトロソ−１−プロピルヒドラジノ）−ｌ−プロパンアミン又は（Ｚ）−１−［Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ−（ｎ−プロピル）アミノ］ジアゼン−ｌ−イウム−１，２−ジオレート）、ＭＡＨＭＡ−ＮＯＮＯａｔｅ （ＭＡＨＭＡ／ＮＯ； ６−（２−ヒドロキシ−ｌ−メチル−２−ニトロソヒドラジノ）−Ｎ−メチル−ｌ−ヘキサンアミン）、ジプロピレントリアミン−ＮＯＮＯａｔｅ （ＤＰＴＡ／ＮＯ； ３，３’−（ヒドロキシニトロソヒドラジノ）ビス−ｌ−プロパンアミン）、ＰＩＰＥＲＡＺＩ／ＮＯ、プロリ−ＮＯＮＯａｔｅ （ＰＲＯＬＩ／ＮＯ； １−（［２−カルボキシラート］ピロリジン−１−イル）ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート−メタノール、例えば、二ナトリウム塩）、ＳＵＬＦＯ−ＮＯＮＯａｔｅ（ＳＵＬＦＯ／ＮＯ、ヒドロキシジアゼンスルホン酸１−オキシド例えば、二ナトリウム塩）、亜硫酸ＮＯＮＯａｔｅ（ＳＬＴＬＦＩ／ＮＯ）、又はアンゲリス塩（ＯＸＩ／ＮＯ）が含まれる。
【００３１】
ほとんどすべてのＮＯＮＯａｔｅ化合物は、水に易溶性であり、水性原液は、使用直前に冷却脱酸素した１〜１０ ｍＭ ＮａＯＨ（好ましくは約ｐＨ １２）中で調製される。アルカリ性原液は、暗所で氷上に保持されるならば数時間安定である。ＮＯＮＯａｔｅの特徴的なＵＶ吸光度は水性溶液におけるＮＯＮＯａｔｅの分光学的定量化に使用し得る。ＮＯＮＯａｔｅは、好ましくは静脈内又は動脈内投与される。
一酸化窒素供与体は、種々の能力を有する（Ｆｅｒｒａｒｏ， Ｒ．ら， ウシクロマフィン細胞における細胞内サイクリックＧＭＰレベルに対する数種の一酸化炭素供与体の比較的作用： 一酸化窒素生産との相関， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １２７（３）：７７９−８７ ［１９９９］）。例えば、ＤＥＡ／ＮＯは半減期が約２〜４分間の最も強力な一酸化窒素供与体であり、ＰＡＰＡ／ＮＯ （ｔ１／２約１５分間）、ＳＰＥＲ／ＮＯ（ｔ１／２約３４−４０分間）は効力が劣り、ＤＥＴＡ／Ｎ０（ｔ１／２約２０時間）及びＳＮＡＰ（ｔ１／２約３３〜４１時間、グルタチオンのような生理的還元剤の存在下で短縮され得る）は更に効力が劣る。ＳＮＰは、また、強力なＮＯ供与体である（Ｆｅｒｒｅｒｏら ［１９９９］； Ｓａｌｏｍ， Ｊ．Ｂ．ら， ウサギ基底動脈におけるニトロプルシドナトリウムとＮＯＮＯａｔｅの弛緩作用， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５７（２）：７９−８７ ［１９９８］； Ｓａｌｏｍ， Ｊ．Ｂ．ら， ウサギ頚動脈におけるＮＯ供与体ニトロプルシドナトリウム、ＤＥＡＩＮＯとＳＰＥＲ／ＮＯの弛緩作用の比較， Ｇｅｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３２（ｌ）：７５−７９ ［１９９９］； Ｓａｌｏｍ， Ｊ． Ｂ．ら， ヤギ中脳動脈におけるニトロプルシドとＮＯＮＯａｔｅの弛緩作用： 全体的虚血−再潅流による遅延障害， Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ ３（ｌ）：８５−９３ ［１９９９］； Ｋｉｍｕｒａ， Ｍ．ら， 新規な一酸化窒素供与体に対するヒト基底動脈又は他の分離した動脈の応答， Ｊ． Ｃａｒｄｉｏｖａｃ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３２（５）：６９５−７０１ ［１９９８］）。その結果、ＮＯＮＯａｔｅ又は他のＮＯ供与体の有効濃度又は投与量は、本明細書に記載されるカリウムチャンネル活性化物質に好ましい投与量範囲にわたって変動するであろう。
【００３２】
ＮＯ供与体のストック溶液は、好ましくは、使用前に新たに調製され（各具体的なＮＯ供与体に適したｐＨで）、氷で冷却され、遮光（例えば、アルミニウムホイルに包まれた暗色ガラスバイアルの使用による）されるが、バイアルが適切に密閉される場合には有機硝酸塩は数ヵ月から数年まで貯蔵され得る。好ましくは、哺乳動物に投与する直前に、薬学的に許容しうる緩衝液中で最終希釈液が調製され、特に強酸性（例えば、塩酸塩）又はアルカリ性（例えば、ＮＯＮＯａｔｅ）ストック溶液が用いられるときにはＮＯ供与体含有緩衝液の最終ｐＨについて生理的適合性が調べられる。
主としてＮＯ暴露時間の生成物とＮＯ濃度は外因的に供給したＮＯに対する生体応答の質と程度を決定する。ＤＥＡ／Ｎ０のような短寿命のＮＯ供与体は、最も好ましくは、短時間の群発的ＮＯデリバリーを避けるためにボーラスインフュージョンよりむしろ連続インフュージョンで投与される。
カリウムチャンネル活性化物質には、カリウムチャンネルを直接に（例えば、ＫＣａを直接リン酸化することにより）又は間接に（例えば、ＫＣａ活性を直接モジュレートする他の調節タンパク質をリン酸化することにより）活性化する内在サイクリックＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＧ又はｃＧＫ）種の活性化物質である。ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼの他のイソ型の活性化物質が含まれる（例えば、Ｓｍｏｌｅｎｓｋｉ， Ａ．ら ［１９９８］）。ＰＫＧ活性化物質の有効な例としては、オクトブロモサイクリックＧＭＰ （８Ｂｒ−ｃＧＭＰ）又はジブチリルサイクリックＧＭＰが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３３】
有効なカリウムチャンネル活性化物質には本明細書に定義されるカリウムチャンネル活性化物質としての活性をなお有する薬学的に許容しうる分子結合体又は塩の形態が含まれる。例は、ミノキシジル硫酸塩であるが、他の薬学的に許容しうる塩は、塩化物、炭酸塩、重炭酸塩、硝酸塩等の硫酸塩以外のアニオンを含んでいる。薬学的に許容しうる塩の他の実施態様は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム等のカチオンを含んでいる。有効なカリウムチャンネル活性化物質の他の実施態様は、塩酸塩である。
しかしながら、本発明の方法に用いられるカリウムチャンネル活性化物質は、血管拡張因子ブラジキニン（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ）又はポリぺプチドブラジキニン類似体、例えば、受容体仲介透過化処理剤（ＲＭＰ）−７又はＡ７（例えば、Ｋｏｚａｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ， 米国特許第５，２６８，１６４号及びＰＣＴ国際出願第９２／１８５２９号）以外のものである。他のブラジキニン類似体としては、ブラジキニンと同じ性質を示すが修飾アミノ酸又はぺプチドの両末端のぺプチド伸長を有する関連ぺプチド構造が含まれる。ブラジキニン類似体の例としては、［ｐｈｅ．ｓｕｐ．８ （ＣＨ．ｓｕｂ．２ ＮＨ） Ａｒｇ．ｓｕｐ．９ ］ブラジキニン、Ｎ−アセチル［ｐｈｅ． ｓｕｐ． ８ （ＣＨ． ｓｕｂ． ２ −−ＮＨ−−Ａｒｇ． ｓｕｐ． ９ ］ブラジキニン又はｄｅｓＡｒｇ９ブラジキニンが挙げられる。
【００３４】
本発明の方法によれば、カリウムチャンネル活性化物質は、静脈内又は動脈内注射又はインフュージョンによって投与される。頭蓋内腫瘍のような異常脳領域を治療するために、カリウムチャンネル活性化物質は好ましくは頚動脈内インフュージョンにより投与される。特にことわらない限り、哺乳動物に投与すべきカリウムチャンネル活性化物質の量は、０．０７５〜１５００μｇ／ｋｇ体重の範囲にある。ヒトの場合、０．０７５〜１５０μｇ／ｋｇ体重の範囲が好ましい。当業者が承知しているように、具体的なカリウムチャンネル活性化物質に対する個々の患者の生理的応答は異なる。例えば、ヒトに対するＹＣ−１の有効量は一般的には約１５〜約４５μｇ／ｋｇ体重であり、 一酸化窒素供与体については一般的には約１５〜約４５μｇ／ｋｇ体重である。しかしながら、具体的なカリウムチャンネル活性化物質の各個体に最適な量は、デリバリー期間にわたる綿密な生理的監視を含む通常の手段によって求め得る。
投与量は、ボーラス注射で投与し得るが、好ましくは１〜３０分間、最も好ましくは１〜１５分間インフュージョンにより投与される。例えば、ラットにおいては、約０．７５〜１００μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１の投与速度が最も適している。約１００μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１より速い投与速度では、随伴する血圧の低下がしばしば観察される。ヒトにおいては、有効投与速度は、約０．０７５〜約１５μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１であり、血圧の注意深い監視が勧められる。当業者は、全インフュージョン量、液体インフュージョン速度、及びこれらに関連する生理的悪影響を避ける電解質平衡を調節するのにも注意深い。一部のカリウムチャンネル活性化物質、例えば、ＮＳ−１６１９、ミノキシジル、ミノキシジル硫酸塩、ピナシジル、又はジアゾキシドは、水に易溶性でなく、これらの物質を投与するために調製する際には、インフュージョン緩衝液で希釈する前にエタノールのような適切で薬学的に許容しうる溶媒がカリウムチャンネル活性化物質を溶解するために使用し得る。当業者は、溶媒関連毒性を避けるためにインフュージョン溶液中の溶媒の最終濃度を調節するのに慎重である。例えば、インフュージョン溶液中の５−１０％ （ｖ／ｖ）までの最終エタノール濃度がたいていの哺乳動物によって許容され、その毒性が無視できる。
【００３５】
本発明の方法は、薬剤に対する微小血管透過性増大が達成される具体的な機序に左右されないが、カリウムチャンネル活性化物質を投与すると異常脳領域及び／又は悪性腫瘍に血液を送る毛細血管や細動脈の内皮細胞膜においてカリウムチャンネルを通るカリウム流量が増加すると考えられる。これにより、微小血管上皮の密着結合のゆるみ及び／又は飲作用活性の増大が生じ、血管からの薬剤の吸収を増大する。本発明を行うに当たり、カリウムチャンネル活性（即ち、カリウムカチオン流量）を測定することは必要としない。しかし、当業者は、カリウム流量が、例えば、パッチ・クランプ又は微小電極デバイスを用いた４２Ｋ−又は２０１Ｔｌ＋の細胞吸収又はチャンネルコンダクタンスを測定することによる適切な方法で測定し得ることを承知している（例えば、Ｔ． Ｂｒｉｓｍａｒ ｅｌ ａｌ．， タリウム−２０１の吸収はヒトグリオーマ細胞において膜電位とカリウム透過性に関係する， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ５００（１−２）：３０−３６ ［１９８９］； Ｔ． Ｂｒｉｓｍａｒら， 培養したヒトグリオーマ細胞におけるＫ＋ 及びＴ１＋ 高吸収の機序， Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． １５（３）：３５１−６０ ［１９９５］； Ｓ． Ｃａｉら， ウシ大動脈内皮細胞における中間コンダクタンスのＫ（Ｃａ２＋）チャンネルの薬理学的性質， Ｊ． Ｍｅｍｂｒ． Ｂｉｏｌ． １６３（２）− ５８ ［１９９８］）。
【００３６】
薬剤は、カリウムチャンネル活性化物質と同時に又はほぼ同時に当業者され、薬剤は、正常脳組織又は非悪性腫瘍細胞に比べて選択的に異常脳領域及び／又は悪性腫瘍細胞に血流によって送られる。『同時に』は、薬剤がカリウムチャンネル活性化物質と同時期又は同時に投与されることを意味する。『実質的に同時に』は、薬剤がカリウムチャンネル活性化物質を最後に投与した後、約１時間以内に投与され、好ましくは約３０分以内に投与され、最も好ましくはカリウムチャンネル活性化物質と同時に投与されることを意味する。あるいは、『実質的に同時に』は、薬剤がカリウムチャンネル活性化物質を最初に投与される前、約３０分以内、好ましくは約１５分以内に投与されることを意味する。
哺乳動物において異常脳領域及び／又は悪性腫瘍に薬剤をデリバリーする方法は、異常脳領域及び／又は悪性腫瘍の微小血管を横切って薬剤を選択的にデリバリーするのに有効である。薬剤は、医薬品、即ち、化学療法剤である。化学療法剤の例としては、細胞障害性治療剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、アンホレリシン）、裸のＤＮＡ発現ベクター、治療タンパク質、治療オリゴヌクレオチド又はヌクレオチド類似体、インターフェロン、サイトカイン、サイトカインアゴニスト、サイトカインアンタゴニスト、アドレナリン作動性剤、抗痙攣剤、抗外傷剤、脳の損傷又は障害を治療又は予防するために用いられる神経医薬剤が挙げられる。化学療法剤としては、 Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体アンタゴニスト； 抗生物質のような抗菌剤； イムノトキシン、免疫抑制剤、ホウ素化合物、モノクローナル抗体又は特異抗原結合抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦ（ｖ）フラグメント）、又はインターフェロンのようなサイトカイン、インターロイキン（例えば、インターロイキン［ＩＬ］−２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、又はトランスフォーミング成長因子（例えば、ＴＧＦ−β）が含まれる。
【００３７】
薬剤には、抗がん化学療法剤も含まれる。典型的には、抗がん化学療法剤は、細胞障害性剤、例えば、５−フルオロウラシル、シスプラチン、カルボプラチン、メトトレキセート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ブンブラスチン、又は細胞障害性アルキル化剤、例えば、ブスルファン（１，４−ブタンジオールジメタンスルホネート； マイレラン、グラクソウェルカム（Ｍｙｌｅｒａｎ， Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ））、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、又はエチルエタンスルホン酸が挙げられるがこれらに限定されない。
抗がん化学療法剤は、脳又は身体の他の組織において悪性腫瘍に薬剤を選択的にデリバリーする方法を行うのに、又はヒトの悪性腫瘍を治療する方法に特に有効である。
薬剤としては、治療ウイルス粒子、例えば、生体内の細胞標的に遺伝物質をデリバリーするアデノウイルス由来又は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来ウイルスベクターも含まれる。薬剤としては、診断剤、例えば、画像診断剤又は造影剤、例えば、放射能標識物質（例えば、［９９Ｔｃ］−グルコヘプトネート）、ガリウム標識画像診断剤（例えば、ガリウム−ＥＤＴＡ）、又は鉄（ＩＩ）磁気物質、蛍光物質、発光物質、又はヨウ素化造影剤も含まれる。適切な場合には、抗がん活性を有する上記薬剤のいずれも、薬剤を悪性腫瘍に選択的にデリバリーする方法又はヒトにおいて悪性腫瘍を治療する方法を行うのに使用することができる。
【００３８】
従って、薬剤は、分子量が５０ダルトン〜約２５０ ｋＤの分子物質であり得る。又は直径が約５０〜２５０ナノメートルのウイルス粒子のような粒子であり得る。
これは、決して本発明の方法を行うのに使用し得る薬剤の種類の余すところのないリストであることを意図したものではない。薬剤は、そうでないことが好ましいが、高脂溶性で細胞膜を本質的に浸透し得る物質、例えば、ニトロソウレアであってもよい。
薬剤の使用量は、各薬剤の慣用の投与量範囲内であるが、本発明の方法を行うことにより、得られた高経血管透過性は投与量当たりの選択的治療効果を大きくすることができ、所望される場合には、例えば、具体的な哺乳動物において抗がん剤からの全身性毒性作用を少なくするために使用すべき有効投与量を少なくすることができる。
薬剤は、血流に送り得る適切な方法によって投与される。典型的には、これは、静脈内、筋肉内、又は動脈内（頚動脈内を含む）注射又はインフュージョンによる。しかしながら、一部の適用については、薬剤の投与量がカリウムチャンネル活性化物質とほぼ同時に血流に入る限り他の許容しうるデリバリー経路を使用することができる。例としては、摂取（例えば、粉末、懸濁液、溶液、エマルジョン、錠剤、カプセル又はカプレット）； 皮下注射； 定位注射； 又は接着貼付剤による経皮又は経粘膜デリバリー、舌下を含む口腔の皮膚、粘膜又は上皮、直腸、又は膣上皮を介してデリバリーする坐剤又はゲルが挙げられる。
【００３９】
あるいは、薬剤は、哺乳動物の医薬組成物においてカリウムチャンネル活性化物質と共に投与される。本発明の医薬組成物は、ヒトのような哺乳動物に静脈内インフュージョン又はボーラス注射によってデリバリーするための上記薬剤と共に薬学的に許容しうる溶液中に処方されたブラジキニン又はブラジキニン類似体以外の上記カリウムチャンネル活性化物質の組合わせを含んでいる。従って、該溶液は浸透圧（例えば、約０．１５ Ｍ生理食塩水）とｐＨ、典型的にはｐＨ ７．２〜７．５に関して適切に釣り合っている。該溶液は、更に、緩衝液、例えば、リン酸塩緩衝液（例えば、リン酸塩緩衝生理食塩水）を含んでいる。該溶液は、約０．０７５〜１５００μｇ／ｋｇ体重のカリウムチャンネル活性化物質投与速度を薬学的に許容しうる液量で最長約３０分間デリバリーするために処方される。ヒト患者については、該溶液は、好ましくは約０．０７５〜１５０μｇ／ｋｇ体重のカリウムチャンネル活性化物質の投与速度を薬学的に許容しうる液量で約３０分間までデリバリーするために処方される。
【００４０】
本発明は、また、薬剤の異常脳領域及び／又は悪性腫瘍へのデリバリーを高めるキットに関する。本キットは、ブラジキニン又はブラジキニン類似体以外の上記カリウムチャンネル活性化物質を含む物質又は成分の組み合わせである。更に、本キットは、一般の薬剤、又は特定の薬剤に対する新生微小血管系を含む異常微小血管の透過性を高めるためにカリウムチャンネル活性化物質の使用説明書を含んでいる。場合により、本キットは、薬学的に許容しうる製剤、又は特定の薬剤が含まれた又は含まれていないカリウムチャンネル活性化物質の薬学的に許容しうるインフュージョン製剤を含有し得る注射又はインフュージョン用備品一式、例えば、注射器、インフュージョンライン、クランプ、及び／又はインフュージョンバッグ／ビン中に特定の薬剤のような他の成分を含有している。キットに集合された物質又は成分は、作用可能性や効用を保存する便利で適切な方法で貯蔵される医師に供給され得る。例えば、成分は溶解した、脱水した、又は凍結乾燥した形であり得る。室温、冷蔵温度又は凍結温度で供給され得る。
本発明の方法及びキットの上記説明は、例示であり、網羅的なものではない。ここで、次の非限定的実施例について本発明を更に詳細に記載する。
【００４１】
実施例
実施例１： 方法
悪性腫瘍細胞系及び腫瘍移植 雌ウィスターラットにおいて実験脳腫瘍の移植にラットグリオーマ細胞株、ＲＧ２を用いた。組織培養におけるＲＧ２細胞増殖と維持の手法は記載されている（Ｓｕｇｉｔａ， Ｍ． ＆ Ｂｌａｃｋ， Ｋ．Ｌ．， サイクリックＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ阻害及び頚動脈内ブラジキニンインフュージョンは脳腫瘍への透過性を高める， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８（５）：９１４−２０ ［１９９８］； Ｉｎａｍｕｒａら ［１９９４］； Ｎａｋａｎｏ， Ｓ．ら， 頚動脈内ブラジキニンインフュージョン後の脳腫瘍微小血管透過性増強は一酸化窒素を仲介する， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６（１７）：４０２７−３１ ［１９９６］）。簡単に言えば、ラットグリオーマ由来のＲＧ２細胞は、使用まで凍結保持され、次に解凍され、ｌＯ％ 子ウシ血清を含むＦ１２培地の単層培養に維持される。一部の実験においては、Ｃ６グリオーマ細胞を用いた。
ウィスターラット（体重約１４０−１６０ ｇ）に腹腔内ケタミン（５０ ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、グリア細胞（１×１０５）を右半球に５μｌ Ｆ１２培地（１−２％ メチルセルロース）に懸濁した脳内注射によりハミルトン注射器で移植し、対側半球には移植しなかった。移植座標は、前頂に対して３ ｍｍ外側及び硬膜面に対して４．５ ｍｍの深さであった。
【００４２】
カリウムチャンネル活性化物質の頚動脈内インフュージョン ＲＧ２細胞の移植の７日後にラットを上記のように麻酔し、透過性実験の準備をした。ラットにＮＳ−１６１９ （選択的なコンダクタンスの大きいＣａ２＋活性化Ｋ＋チャンネル活性化物質； ＲＢＩ、ナティック、マサチューセッツ州）か又はミノキシジル硫酸塩（ＫＡＴＰチャンネル活性化物質）を右頚動脈に５．３μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１ （５３．３μｌ／ｍｉｎで）の投与速度で１５分間、ＰＢＳ、ｐＨ ７．４； ５％ （ｖ／ｖ）エタノールのインフュージョンビヒクル中でインフュージョンした。ＰＢＳで希釈する前にカリウムチャンネル活性化物質を溶解するためにエタノール（２５％ ［ｖ／ｖ］）を用いた。血液量実験については、カリウムチャンネル活性化物質化合物の頚動脈内インフュージョン開始の５分後と１４分後に［１４Ｃ］デキストラン（１００μＣｉ／ｋｇ； デュポンニューイングランドヌクレア社、ボストン、マサチューセッツ州）を静脈内ボーラスとして注射し、１分間と１０分間維持して２つの異なる時点を得た。領域透過性実験については、血管作用化合物の頚動脈内インフュージョン開始の５分後に１００μＣｉ／ｋｇの［１４Ｃ］α−アミノイソ酪酸（デュポンニューイングランドヌクレア社、ボストン、マサチューセッツ州）を右大腿静脈に静脈内ボーラスとして注射した。血清放射能を求めるためにトレーサーの注射直後にペリスタ吸引ポンプを用いて０．０８３ ｍｌ／ｍｉｎの一定速度で大腿動脈血を抜いた。頚動脈インフュージョンの１５分後に、ラットを断頭し、脳を迅速に取り出し、定量的オートラジオグラフィのために凍結した。
【００４３】
一酸化窒素（ＮＯ）供与体の透過性実験においては、ＮＯ供与体の頚動脈内インフュージョンを上記のように２．６６μｇ ｍｉｎ−１ ｋｇ−１の投与速度で１５分間行った。一酸化窒素供与体には、ナトリウム２−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ジアゼノテートオキシド（ＤＥＡ／ＮＯ）、半減期が２．１分の一酸化窒素供与体又はＰＡＰＡ／ＮＯ （［Ｚ］−Ｉ−［Ｎ−［３−アミノプロピオ］−Ｎ−［Ｎ−プロピオアミノ］ジアゼン−ｌ−イウム−１，２−ジオレート（アレクシス社（Ａｌｅｘｉｓ Ｃｏｒｐ．））、半減期が１５分の一酸化窒素供与体を含めた。ＤＥＡ／ＮＯ又は ＰＡＰＡ／ＮＯをＰＢＳに溶解し、ＲＧ２グリオーマをもつラットに投与して生理的パラメーターに影響することなく［１４Ｃ］−ＡＩＢの透過性（Ｋｉ）を求めた。［１４Ｃ］−ＡＩＢをボーラスとして静脈内に投与し、Ｋｉを求めた。実験中、生理的パラメーターを監視した。
【００４４】
一方向輸送定数 （Ｋ ｉ ） 正常組織と腫瘍組織において血液腫瘍関門及び血液脳関門を横切る透過性の指標として［１４Ｃ］α−アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）の一方向移動定数Ｋｉを測定した。定量的オートラジオグラフィを用いてＫｉ値（μｌ ｇ−１ ｍｉｎ−１）を得た。血液から脳への移動の初速度を以前に記載された式を用いて計算した（Ｏｈｎｏ， Ｋ，ら， 意識のあるラットにおいて非電解質に対する脳血管透過性の下限， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２３５（３）：Ｈ２９９−３０７， ［１９７８］； Ｉｎａｍｕｒａ， Ｔ．，ら， ブラジキニンは実験脳腫瘍において血液腫瘍関門を選択的に開放する， Ｊ． Ｃｅｒｅｂ． Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ． １４（５）：８６２−７０ ［１９９４］）。定量的データを２群ｔ検定を用いて分析し、同じ割合又は同じ手段（同じ数）の２群フィッシャーズ精密検定には統計的有意性を得るために各群に最低６匹の動物を必要とする。多数の処理グループをＡＮＯＶＡによる対照グループと比較し、Ｐ値をこの後のボンフェローニ検定により求めた。
【００４５】
用量依存性実験 ＮＳ−１６１９を２５％ エタノールに溶解し、ＰＢＳで希釈して種々のインフュージョン用濃度を得た。ＮＳ−１６１９を頚動脈内インフュージョン（投与速度： ０、１３、２６．５、５３、８０、１００及び１１０μｌ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１； すべて５３．３μｌ／ｍｉｎで）によりＲＧ２グリオーマをもつラットに投与して静脈内に投与される［１４Ｃ］−ＡＩＢの高透過性（Ｋｉ）を生じる投与量を求めた。Ｋｉを上記のように求めた。実験中、生理的パラメーターを監視した。
【００４６】
阻害実験 ＮＳ−１６１９が透過性を高めたので、その作用の特異性を特異的ＫＣａチャンネルインヒビター、イベリオトキシン（ＲＢＩ、ナティック、マサチューセッツ州； （［ＩＥＢＴＸ］を最終原液濃度１００μｇ／ｍｌまで生理食塩水に希釈した）。ＩＢＴＸ （２．３μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１）をＮＳ−１６１９ （２６．５μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１）と同時インフュージョンしてＲＧ２グリオーマラットモデルにおける異常毛細血管のＫＣａチャンネル誘導透過性を遮断した。１７匹のラットをこれらの実験に用いた（３匹はビヒクルのみの対照［即ち、ＰＢＳ ＋ ５％ （ｖ／ｖ） エタノール］； ３匹はＩＢＴＸ； ８匹はＮＳ−１６１９； ３匹はＮＳ−１６１９ ＋ ＩＢＴＸ）。
他の実験においては、ＩＢＴＸ （０．２μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１ １５分間）を一酸化窒素供与体ＤＥＡ／Ｎ０ （２．６６μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１ １５分間）と同時インフュージョンしてＲＧ２グリオーマラットモデルにおける異常毛細血管のＫＣａチャンネル誘導透過性を遮断した。１３匹のラットをこれらの実験に用いた（４匹はビイクルのみの対照； ３匹はＤＥＡ／ＮＯ、３匹はＰＡＰＡ／ＮＯ、及び３匹はＤＥＡ／ＮＯ＋ＩＢＴＸ）。
頭蓋内ＲＧ２腫瘍をもつウィスターラットを用いた他の生体内透過性実験においては、上記のように、腫瘍中央部と腫瘍周囲組織に対する［１４Ｃ］−ＡＩＢの一方向輸送定数（Ｋｉ）を、ブラジキニン（１０μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１ １５分間）又はミノキシジル硫酸塩（２６．６μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１ １５分間）の頚動脈内インフュージョン又はブラジキニンとミノキシジル硫酸塩を１５分間同時インフュージョン後に求めた。実験中、生理的パラメーターを監視した。選択的ＫＡＴＰ阻害剤、グリベンクラミド（１３．３μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１ １５分間）を用いて ＫＡＴＰチャンネルの阻害が血液腫瘍関門透過性のブラジキン誘導増強又はミノキシジル硫酸塩誘導増強を阻害するかを求めた。
【００４７】
他の実験においては、ＲＧ２グリオーマ細胞を上記ラット脳の右半球に移植した。移植の７日後に、オクトブロモサイクリックＧＭＰ （８Ｂｒ−ｃＧＭＰ、１６．７μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１）、サイクリックＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＧ）の活性化物質の頚動脈内インフュージョンによりＰＫＧ阻害剤（ＫＴ５８２３、６．７７μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１； 又はＲｐ−ｐＣＰＴ−ｃＧＭＰ、６０μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１）を含まずに又は含めて行った。対照グループにおいては、生理食塩水又は２％ ＤＭＳＯをラットにインフュージョンした。実験の終了時に、ラットを麻酔下で犠牲にし、［１４Ｃ］−ＡＩＢ （μｌ ｇ−１ ｍｉｎ−１）のＫｉを測定するために脳を取り出した。正常脳と腫瘍組織においてＰＫＧ発現を比較するためにウェスタンブロット分析を用いた。
定量的オートラジオグラフィと［１４Ｃ］−ＡＩＢ （μｌ ｇ−１ ｍｉｎ−１）のＫｉの計算をＯｈｎｏ ｅｔ ａｌ （１９７８）に従って上記のように行った。
【００４８】
Ｋ Ｃａ チャンネルと Ｋ ＡＴＰ チャンネルの免疫組織化学分析 透過性実験から得られた脳切片（厚さ１２μｍ）を、１：１００希釈液のアフィニティー精製ＫＣａチャンネル抗体（アロモンラボス（Ａｌｏｎｉｏｎｅ Ｌａｂｓ）、エルサレム、イスラエル）と１時間、ビオチニル化ウマ抗マウスイムノグロビン（ベクターラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、バーリンガム、カリフォルニア州）と３０分間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ部位をアビジン：ビオチニル化酵素複合体（ＡＢＣ）キット（ＫＣａ）を用いて可視化した。ＫＡＴＰの免疫局在化については、上記組織切片をウサギ抗マウスＫｉｒ ６．２抗血清（１：２００希釈液； 抗血清はＤｒ． Ｓｕｓｕｍｕ Ｓｅｉｎｏから恵与された）と４℃で一晩インキュベートした。その抗血清は、ヒトＫｉｒ ６．２と交差反応性であり、以前に記載されたように調製した（Ｓｕｚｕｋｉ， Ｍ．ら， ラット膵臓におけるスルホニルウレア受容体Ｉの結合局在性決定， Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４２（１０）： １２０４−１１ ［１９９９］）。Ｋｉｒ ６．２は、哺乳動物ＫＡＴＰのカリウム内向き調整（Ｋｉｒ）タンパク質成分である。結合ウサギ抗マウスＫｉｒ ６．２抗体の可視化は、 製造業者が指示したようにＰＢＳで３回洗浄し二次抗体（ローダミン標識抗ウサギＩｇＧ ［１：２００希釈液］； サンタクルーズバイオテクノロジー社（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．）、サンタクルーズ、カリフォルニア州）と結合させ、共焦点蛍光顕微鏡で調べた後に行った。
【００４９】
透過電子顕微鏡 （ＴＥＭ） ラット脳組織を次の手順によってＴＥＭ分析のために準備した。カリウムチャンネル活性化物質、阻害剤、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＢＲＰ）、及び／又はビヒクル対照緩衝液の頚動脈内インフュージョンを含む実験後、 ラットをまずＰＢＳ （５０−１００ ｍｌ）、次に１．０％ グルタルアルデヒド（２５０ ｍＬ）で心臓からのインフュージョン固定をした。脳組織を冠状に切断して腫瘍領域を露出させ、問題の領域を選択し、約１ｍｍの厚さの小切片にし、１．０％ グルタルアルデヒドに４℃で２時間浸漬固定した。試料を５％ スクロース／０．１ Ｍ ＰＢＳで４℃で一晩連続振盪し溶液を変えながらすすいだ。次に、試料を１％ ＯｓＯ４で４℃において２時間連続振盪しながら浸漬固定した。次に、試料を増加濃度（５０−１００％）のエタノールで４℃において１５分間絶えず振盪ししばしば溶液を変えながら脱水した。試料をプロピレンオキシド、次にエポンで室温において振盪しながら浸潤させた。包埋を６０℃で４８時間行った。ダイヤモンドエッジブレードを備えたミクロトームで半薄切片（約３０−５０μｍ厚）をつくった。最後に、超薄切片（約１−１０ ｎｍ厚）をミクロトームでつくり、酢酸ウラニルで４５−６０分間、クエン酸鉛で１５分間染色し、ＴＥＭ分析のために処理した。各処理グループにおいて１０本の毛細血管を選び、低倍率の写真を撮った（合計９０本の毛細血管）。毛細血管の基本的な形態を、毛細血管の基本的プロファイル： 分離管腔周囲、管腔周囲、毛細血管の全領域（核と空胞を除く）、及び毛細血管の平均厚さを表すパラメーターを測定及び計算することによって調べた。
【００５０】
別の実験においては、小胞の密度について、各ラット（各治療グループは５−６匹のラットを有する）から選ばれた３本の血管を高倍率のテストゾーンとして４枚の電子顕微鏡写真を撮ることにより求めた。テストゾーンは、ＥＭスクリーン上の３、６、９、及び１２時のようにランダムに選んだ。テストゾーンの領域を測定し、小胞の数を顕微鏡写真の背景を知らない人間によって計数させた。小胞密度は、細胞質のμｍ２当たりの小胞の数として示した。全小胞領域と細胞質領域の割合は、同じ顕微鏡写真を用いても求められる。全小胞領域を測定し、小胞に含まれる細胞質に対する割合を計算し、％として示した。小胞の平均直径も計算された。
処理から生じる形態学的変化を、各ラットから６つの密着結合（ｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を選ぶことにより調べた（５匹のラットが各処理グループであり、密着結合は合計２７０であった）。密着結合を高倍率で写真を撮った。密着結合の分析は、各密着結合について『裂指数（ｃｌｅｆｔ ｉｎｄｅｘ）』や『裂領域指数（ｃｌｅｆｔ ａｒｅａ ｉｎｄｅｘ）』を比べることによった。裂指数は、次式： （融合していないセグメントの長さ）÷（結合の長さ）によって表される（Ｓｔｅｗａｒｔ， １９８７）。裂領域指数は、式： （融合していないセグメントの領域）−（結合の長さ）によって示した。
【００５１】
一時的中脳動脈 （ＭＣＡ） 閉鎖 わずかに変更したＬｉｕ， Ｙ．ら， 中脳動脈閉鎖−再潅流モデルを用いたラット脳虚血におけるグルコース代謝の時間経過とＭＫ−８０の作用， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８ （６）： ５０５−５０８ （１９９６）に記載されているようにＭＣＡ閉鎖を行った。 概要としては、同側の共通の頚動脈と外部頚動脈を結紮した後に頚動脈内の分岐から挿入したシリコーンゴムシリンダーで右ＭＣＡを一時的に閉鎖した。シリンダーは硬化剤と混合したシリコーンで被覆された４−０ナイロンの１７ ｍｍ長の手術用糸からつくられており、末端の直径が５ ｍｍから０．２５−０．３０ ｍｍまで類別されている。糸を分岐近くの外部頚動脈を通って頚動脈内動脈に挿入し、挿入点で結紮した。シリコーンゴムシリンダーは、前脳動脈の隣接部分に達した。右ＭＣＡと後交通動脈の原点を糸で閉鎖した。手術後、動物をゆるく適合したパスツールキャストによって固定した。虚血組織の血液による再潅流を可能にするために虚血の約１時間又は２時間後に頚動脈内動脈から糸を抜いた。１５分間再潅流した４５分後に頚動脈インフュージョンによりカリウムチャンネル活性化物質及び／又は阻害剤を注射した。
一部の実験においては、再潅流の５０分後に（カリウムチャンネル活性化物質及び／又は阻害剤の投与を開始した５分後に）静脈内にエバンスブルー染料を注射した。エバンスブルー染料の注射の１０分後、脳微小血管から過剰のエバンスブルー染料を流し出すために心臓を通って２００ ｍｌのＰＢＳをラットに潅流した。
【００５２】
実施例２： 結果
カリウムチャンネル活性化物質は血液腫瘍関門を横切る輸送を選択的に増加させる
移植したグリオーマ細胞をもつウィスターラットにＮＳ−１６１９か又はミノキシジル硫酸塩を７．５μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１で１５分間インフュージョンしたとき、血液腫瘍関門を形成する新生血管系を横切る輸送についてＮＳ−１６１９やミノキシジル硫酸塩により［１４Ｃ］α−アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）の一方向輸送定数Ｋｉが著しく増大したが、正常脳微小血管系を横切る輸送については増大しなかった（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。これらの結果から、カリウムカルシウムチャンネルの活性化が正常脳組織を与える毛細血管に比べて固形悪性腫瘍の毛細血管を横切る分子の透過性を選択的に高めることが証明された。
ＮＳ−１６１９の投与量を増加することにより、ＲＧ２グリオーマ毛細血管における［１４Ｃ］α−アミノイソ酪酸の一方向移動定数Ｋｉが用量依存方式で増大した（図１３）。多量の投与量では（１００μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ及び１１０μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）、ラットの動脈血圧の著しい降下が観察された。各グループに用いられるラットの数は、図１３の括弧に示されている。
【００５３】
［１４Ｃ］α−アミノイソ酪酸の一方向移動定数Ｋｉを増大させるＮＳ−１６１９の能力がＫＣａチャンネル特異的阻害剤イベリオトキシン（ＩＢＴＸ； 図１４）により阻害されたことから、この作用の特異性が証明された。ＲＧ２腫瘍をもつラットにおいてＩＢＴＸ （２．３μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１； ｎ＝３）を含む又は含まないＮＳ−１６１９ （２６．５μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１）と共に［１４Ｃ］−ＡＩＢを１５分間用いてＫｉを求めた。ＮＳ−１６１９インフュージョンに対する応答のＫｉの増大（ｎ＝８； ＊ ＊ Ｐ＜０．００１ ５％ エタノールを含む又は含まないＰＢＳと比較）は、ＩＢＴＸ同時処理により減弱した。調べた投与量のＩＢＴＸ単独は、異常毛細血管の脳腫瘍関門透過性に影響しなかった。しかしながら、ＩＢＴＸは、ＮＳ−１６１９−誘導透過性（Ｋｉ）の増強を著しく下げ（ｎ＝３， ＊ ＊ Ｐ＜Ｏ． ００１ ＮＳ処理グループと比較）、カリウムチャンネル特異的作用を示した。ＰＢＳ＋５％ エタノールを投与した対照は、ＰＢＳ−エタノールを投与した対照と区別できなかった。
可溶性グアニリルシクラーゼ活性化物質 ＹＣ−１を投与した場合に血液腫瘍関門透過性の匹敵しうる増強が得られた（図１）。ＩＢＴＸ及び可溶性グアニリルシクラーゼの選択的阻害剤、１Ｈ−［１，２，４］オキサジアゾロ［４，３−ａ］キノザリン−ｌ−オン（ＯＤＱ）は、ＹＣ−１によるＫｉの増大を減弱させ、ＫＣａ仲介であることを示した。
【００５４】
ミノキシジル硫酸塩をインフュージョンすると、ビヒクル対照グループに比べてＫｉの著しい増大が得られた（２８．３±６．０μｌ／ｇ／ｍｉｎ； Ｐ＜０．００１） （図７）。血液腫瘍透過性のこの増強は、ミノキシジル硫酸塩の作用を著しく減弱させる（Ｋｉ ＝ １２．７±２．０μｌ／ｇ／ｍｉｎ）、ＫＡＴＰチャンネルインヒビターグリベンクラミドによって減弱した。従って、ミノキシジル硫酸塩によるＫｉ増大は、血液腫瘍関門透過性を選択的に高めるＫＡＴＰチャンネルの活性化によるものであった。ミノキシジル硫酸塩による処理から得られた透過性の増大は、ＫＣａ活性化物質ブラジキニン（Ｋｉ ＝ ３４±８．０μｌ／ｇ／ｍｉｎ）によるものと匹敵し、個々の処理グループと比べて透過性に対する著しい付加作用（Ｋｉ ＝ ４２±６μｌ／ｇ／ｍｉｎ； Ｐ＜０．０５）がブラジキニンとミノキシジル硫酸塩による組合わせ処理で得られた（図７）。
グリベンクラミドの同時インフュージョンがブラジキニン誘導Ｋｉ増大（図８）を阻害できなかったことは、ブラジキニンがＫＡＴＰチャンネルを調節しないことを示す他の研究と一致している。しかしながら、ＫＣａチャンネルアンタゴニスト、ＩＢＴＸはブラジキニン作用を著しく減弱させ（Ｋｉ ＝ １７．７±６μｌ／ｇ／ｍｉｎ； Ｐ＜Ｏ．０１）、Ｋｉ増大がＫＣａの活性化によるものであり、ブラジキニンによるＫＡＴＰチャンネルでないことが示された（図８）。
【００５５】
ミノキシジル硫酸塩による作用は、グリベンクラミド（Ｋｉ ＝ １２．７±２μｌ／ｇ／ｍｉｎ； Ｐ＜Ｏ．００１； 図９）によって著しく減弱した。しかしながら、この作用は、ＩＢＴＸにより阻害されず、ＫＡＴＰチャンネルがミノキシジル硫酸塩による透過性を仲介することが示された。これらの結果は、血液腫瘍関門透過性に関する独立した経路を意味し、脳腫瘍の微小毛細血管において一方はＫＣａによって調節され、もう一方はＫＡＴＰチャンネルによって調節されることを示唆する。
一酸化窒素供与体も血液腫瘍関門の透過性を高めた。図２から、ＲＧ２グリオーマ組織がＰＢＳ処理対照（図２Ａ）と比べてＤＥＡ／ＮＯ処理ウィスターラット（図２Ｂ）がエバンスブルー染色（ＭＷ ９６０．８２）により生体内染色されることがわかる。これらの結果は、ＮＳ−１６１９又はＹＣ−１を用いてエバンスブルーにより生体内染色により得られる結果に匹敵した（データは示されていない）。
図３から、対照（生理食塩水）と比べてＤＥＡ／ＮＯやＰＡＰＡ／ＮＯ（それぞれＫｉ ＝ ３２±９．０μｌ ｇ−１ ｍｉｎ−１及び３２±９．０μｌ ｇ−１ ｍｉｎ−１）に対して応答してＫｉが著しく増大したことがわかる。しかしながら、ＩＢＴＸで同時処理すると、ＤＥＡＮＯ（Ｋｉ ＝ １５．３±２．３μｌ ｇ−１ ｍｉｎ−１； Ｐ＜０．００１）又はＰＡＰＡ／ＮＯ（Ｋｉ ＝ １５．３±１．７μｌ ｇ−１ ｍｉｎ−１； Ｐ＜０．００１）のインフュージョンの効果が減弱し、効果がＫＣａ媒介性であったことがわかる。調べた投与量でのＩＢＴＸ単独は、異常毛細血管の脳腫瘍関門透過性を影響しなかった。
ウェスタンブロットから、正常脳も腫瘍脳も共にＰＫＧ発現がわかった。ＰＫＧ活性化物質８Ｂｒ−ｃＧＭＰは、ビヒクルのみの対照と比べてＫｉ値を増大させた（Ｋｉ ＝ ２２．１±６．６μｌ ｇ−１ ｍｉｎ−１と１４．２±５．１μｌ ｇ−１ ｍｉｎ−１； Ｐ＜０．０５）。これらの結果は、ＰＫＧを活性化するｃＧＭＰの内在生産が、おそらくＫＣａのＰＫＧ仲介活性化により血液腫瘍関門透過性を選択的に高めることを意味している。
【００５６】
免疫組織化学分析によりカリウムチャンネルが正常組織に比べて新生血管系や悪性腫瘍細胞に多く存在することがわかる
ＫＣａチャンネルタンパク質を上記のように特異抗体を用いて免疫的に局在決定した。免疫組織化学分析から、ＫＣａチャンネルが正常対側組織の切片と比べて、ＲＧ２をもつラット脳切片の腫瘍組織や腫瘍毛細血管においてＫＣａチャンネルが選択的に増加したことがわかった（図１５）。同様に、ＫＡＴＰ特異抗体を用いたＫＡＴＰの免疫局在化から、ＫＡＴＰチャンネルがＲＧ２腫瘍をもつラット脳切片やＣ６腫瘍をもつラット脳ウイルス切片の腫瘍組織や腫瘍毛細血管において選択的に増加したことがわかった（図１６）。これらの免疫組織化学結果は、ＫＣａチャンネルのＮＳ−１６１９による活性化、又はＫＡＴＰのミノキシジルによる活性化が血管腫瘍関門を選択的に開放した透過性データと一致している。
まとめると、透過性及び免疫組織化学データから、カリウムチャンネルを活性化する化合物が抗腫瘍化合物の悪性腫瘍組織へのデリバリーを選択的に高めるために使用し得ることが証明される。
【００５７】
透過型電子顕微鏡実験 透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）実験から、ＰＢＳ対照と比べて、ＫＣａ活性化物質ＮＳ−１６１９とブラジキニンの頚動脈内インフュージョン後、毛細血管内皮、及び腫瘍細胞の管腔−分離管腔軸に沿った飲作用胞の形成及び移動促進がわかった。（図４）。定量的分析から、ブラジキニンとＮＳ−１６１９が共にＰＢＳ対照と比べて核を含まない細胞質の単位表面積当たりの小胞数を著しく増加させることがわかった。 飲作用胞の平均直径は７５−８０ ｍｍであった。 腫瘍毛細血管内皮細胞の管腔膜の陥入は、飲作用胞の配列を生じ、内皮細胞質（Ｅ）の管腔−分離管腔軸に沿って移動する。これらの小胞は、基底膜とドッキング及び融合し、内皮細胞膜の分離管腔側面に内容物を遊離させる。処理グループからの細胞は、無傷基底膜（ＢＭ）と内皮密着結合を有すると思われる。輸送飲作用胞（ＰＶ）は、管腔（Ｌ）と分離管腔（Ａｂ）領域近くに存在する（図４）。ブラジキニン又はＮＳ−１６１９のインフュージョン後のグリオーマからの細胞は、無傷基底膜と内皮密着結合（ＴＪ）を有する（例えば、図５）。追加のＴＥＭ実験から、脳腫瘍毛細血管の内皮細胞の飲作用胞の配列内に電子密度の高いホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ； 分子量が約４０，０００のタンパク質マーカー）の存在がわかり、ＫＣａ活性化物質ブラジキニンをＲＧ２腫瘍をもつラットにＨＲＰと同時インフュージョンした後にＨＲＰが内皮の管腔−分離管腔領域から腫瘍細胞に輸送されていることがわかった（図５及び図６）。このＨＲＰを装荷した輸送小胞の証拠は、経内皮小胞輸送が腫瘍細胞への薬剤デリバリーの重要な細胞機序であることを意味する。
【００５８】
カリウムチャンネル活性化物質ブラジキニンをインフュージョンした腫瘍をもつラット、及びトレーサーホースラディシュ（ＨＲＰ）を静脈注射した腫瘍をもつラットによる追加のＴＥＭ実験から、脳腫瘍毛細血管の内皮細胞の飲作用胞の配列内に電子密度の高いＨＲＰが存在することがわかった（図５； Ｐ ＝ 形質膜）。ブラジキニンインフュージョン後、ＨＲＰを積んだ小胞の数が増加し（ＰＢＳ処理腫瘍細胞と比べて腫瘍細胞に認められた図６； 矢印）、薬剤分子が毛細血管内皮を脳腫瘍塊へ向かって通過したならば、小胞輸送が腫瘍細胞への薬剤デリバリーの主要な細胞機序であることを意味している。
ビヒクル対照とブラジキニン（ＢＫ）インフュージョングループ間の調べた形態学的パラメーターのいずれにもほとんど差が見られなかったが、種々の種類の調べた組織と比較するとこれらのパタメーターに著しい差があった。分離管腔と管腔周囲、毛細血管の面積、及びＲＧ２腫瘍とＣ６腫瘍の毛細血管の平均厚さは、正常脳基底核より著しく大きかった。しかしながら、基底核における小胞領域の密度と割合の著しい増加は、未処理ラットと比べた場合、ＲＧ２及びＣ６腫瘍領域におけるブラジキニン処理ラットに認められた（表１）。
【００５９】
【表１】
表１ 内皮細胞質の小胞の密度と面積の割合
ａａ ＰＢＳ ＝ リン酸塩緩衝生理食塩水ビヒクル対照； ＢＫ ＰＢＳ ＋ ブラジキニン
ｂ 数値は平均 ＳＤ； ｎ＝ラットの数
ｃ 数値は平均 ＳＤ； ｎ＝毛細血管の数
ｄ 生理食塩水対照グループとの有意差、ｐ ＜ ０．０１
【００６０】
カリウムチャンネル活性化物質は虚血脳領域の異常脳毛細血管の透過性を高める
予備的ＭＣＡ閉鎖／再潅流実験においては、ＫＣａ活性化物質ブラジキニンが一過性虚血後の梗塞組織の透過性を高めることがわかった。ＮＯＳ活性は、一過性虚血再潅流ラットモデルにおいて著しく上昇し（データは示されていない）、このことは虚血毛細血管の透過性を高めるブラジキニンの能力と一致する（図１０Ｂ）。図１０Ｂに示されるように、虚血脳領域の微小血管経の透過性により、正常脳微小血管系（即ち、対側組織）と比べて、ＭＣＡ閉鎖の２時間後のカリウムチャンネル活性化物質に対する応答性が高められた。対照的に、図１０Ａは、脳微小血管系の透過性は、ＭＣＡ閉鎖のわずか１時間後にもカリウムチャンネル活性化物質に対して応答しなかったことを示している。これは、組織が次第に異常になるので長時間の虚血により微小血管系の性質が変化することを意味している。
虚血−再潅流ラットモデルを用いて、虚血脳領域におけるカリウムチャンネルによりエバンスブルー染料に対する高透過性が調節されたことが直接観察された。図１１においては、冠状脳切片が腫瘍組織内のエバンスブルー（ＥＢ）を示している。エバンスブルー染料の吸収は、血液脳関門／血液腫瘍関門透過性の既知の定性的尺度である。２時間のＭＣＡ閉鎖後に１時間の再潅流に供したラットは、ＰＢＳビヒクルインフュージョン後の虚血領域において透過性の増強を示さなかった（図１１）。対照的に、同様の虚血状態に続いてＫＣａチャンネルの活性化物質、例えば、ブラジキニン又はＮＳ−１６１９（図１１）又は一酸化窒素供与体（データは示されていない）の動脈内インフュージョン に供したラットは染料に対する透過性を高めた。カリウムチャンネル活性化物質によって生じた染料に対する高透過性は、ＫＣａ特異的阻害剤ＩＢＴＸとの同時インフュージョンにより低下し、ＫＣａの特異的関係を意味している（図１１）。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ウィスターラットの悪性腫瘍ＲＧ２グリオーマ組織において［１４Ｃ］α−アミノイソ酪酸の一方向移動定数Ｋｉでの可溶性グアニリルシクラーゼ活性化物質ＹＣ−１（２．６６μｇ ｍｉｎ−１ ｋｇ−１； ｎ ＝ ６）に対する応答を、ＤＭＳＯ ＋ 生理食塩水対照（ｎ ＝ ６）、ＹＣ−１ ＋ イベリオトキシン（ＩＢＴＸ； ０．２μｇ ＩＢＴＸ ｍｉｎ−１ ｋｇ−１； ｎ ＝ ３）、又はＹＣ−１ ＋ 可溶性グアニリルシクラーゼの選択的阻害剤、１Ｈ−［１，２，４］オキサジアゾロ［４，３−ａ］キノザリン−１−オン（ＯＤＱ）（２．６６μｇ ｍｉｎ−１ ｋｇ−１； ｎ ＝ ４）の各１５分間処理との比較を示すグラフである。腫瘍コア（灰色の棒）、腫瘍コアから約３ ｍｍの腫瘍隣接組織（白色の棒）、及び正常対側脳組織（黒色の棒）のＫｉ（μｌ／ｇ／ｍｉｎ）が示されている。
【図２】
ウィスターラットの悪性腫瘍ＲＧ２グリオーマ組織におけるエバンスブルー染色の血液腫瘍関門透過性に対する一酸化窒素供与体ジエチルアミン−ＮＯＮＯａｔｅ （ＤＥＡ／ＮＯ）の増強作用を示す写真である。図２Ａはリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳのみの対照）で処理したラットからの脳切片を示す写真である。図２ＢはＤＥＡ／ＮＯ処理ラットからの脳切片を示す写真である。
【図３】
ウィスターラットの悪性腫瘍ＲＧ２グリオーマ組織において［１４Ｃ］α−アミノイソ酪酸の一方向移動定数ＫｉでのＤＥＡ／ＮＯ（２．６６μｇ ｍｉｎ−１ ｋｇ−１； ｎ ＝ ３）に対する応答を、ＰＢＳ対照、ＤＥＡ／ＮＯ ＋ イベリオトキシン（ＩＢＴＸ； ０．２μｇ ＩＢＴＸ ｍｉｎ−１ ｋｇ−１； ｎ ＝ ３）、又はＰＡＰＡ／ＮＯ（２．６６μｇ ｍｉｎ−１ ｋｇ−１； ｎ ＝ ３）の各１５分間処理との比較を示すグラフである。腫瘍中央部（黒色の棒）、腫瘍コアから約３ ｍｍの腫瘍隣接組織（白色の棒）、及び正常対側脳組織（網状の棒）のＫｉ（μｌ／ｇ／ｍｉｎ）が示されている。
【図４】
ＲＧ２腫瘍毛細血管における経内皮小胞輸送を示す写真である。ウィスターラットからのＲＧ２腫瘍をもつ脳切片を、ＰＢＳ （０．８ ｍｌ）（図４Ａ； ５４，０００×倍率）； ブラジキニン（１０μｇ ｍｉｎ−１ ｋｇ−１）（図４Ｂ； ８７，０００×倍率）； 又はＮＳ−１６１９ （５．３μｇ ｍｉｎ−１ ｋｇ−１； 図４Ｃ； ８７，０００×倍率）で１５分間頚動脈内にインフュージョンした後に作製した。腫瘍中央部の切片のＴＥＭ分析により、ＫＣａ活性化物質ブラジキニンとＮＳ−１６１９が内皮細胞質の輸送飲作用胞を増加させることが示される。
【図５】
カリウムチャンネル活性化物質（ブラジキニン）が、内皮飲作用胞によって腫瘍毛細血管内腔からのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＢＲＰ）の輸送を増加させることを示す写真である。図５Ａ （８，７００×倍率）及び図５Ｂ （２１，０００×倍率）は、 ＰＢＳ対照グループのラットからの血管組織と腫瘍組織を示す写真である。図５Ｃ （８，７００×倍率）及び図５Ｄ （２１，０００×倍率）はカリウムチャンネル活性化物質ブラジキニンで処理したラットからの血管組織と腫瘍組織を示す写真である。
【図６】
カリウムチャンネル活性化物質（ブラジキニン）が、ＲＧ２腫瘍細胞においてＢＲＰの小胞輸送を誘導することを示す写真である。図６Ａ （８，７００×倍率）は、ＰＢＳ対照のラットからの腫瘍組織を示す写真であり、図６Ｂ （１０，８００×倍率）及び図６Ｃ （２１，０００×倍率）はブラジキニン処理ラットからの腫瘍組織を示す写真である。
【図７】
ＫＡＴＰ活性化物質ミノキシジル硫酸塩及びＫＣａ活性化物質ブラジキニンによる一方向輸送定数の増大を示すグラフである。
【図８】
ブラジキニンによるＫｉの増大はグリベンクラミドにより減弱されず、ＩＢＴＸがブラジキニンによる作用を著しく減弱したことを示すグラフである。
【図９】
ミノキシジル硫酸塩によるＫｉの増大はグリベンクラミドにより減弱されず、ＩＢＴＸが作用を阻止しなかったことを示すグラフである。
【図１０】
カリウムチャンネル活性化物質による処理の結果として虚血脳領域の微小透過性増大を示すグラフである。Ｋｉは、ブラジキニン処理動物（黒色の棒）及び対象動物（灰色の棒）について対の柱状図表で示され、組織は（左から右へ）、尾状被殻； 皮質； 尾状被殻対側； 及び皮質対側を試験した。図１０Ａから、虚血の１時間後の血液脳関門透過性がビヒクル処理グループと比べてブラジキニン処理によって影響されなかった（１時間のＭＣＡ閉鎖に続いて１時間の再潅流； 挿入図： オートラジオグラフ）ことが示される。図１０Ｂから、ブラジキニンが２時間のＭＣＡ閉鎖に続いて１時間の再潅流後に虚血性梗塞周辺部（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｉｎｆａｒｃｔ ｐｅｎｕｍｂｒａ）において透過性を著しく増大したことが示される（挿入図： オートラジオグラフ）。
【図１１】
カリウム活性化物質が虚血脳組織において微小血管系の透過性を高めることを示す写真である。梗塞脳組織（エバンスブルーの吸収が著しく少ない）の血液脳関門透過性の変化は、一過性虚血にかかったラットには観察されなかった（２時間のＭＣＡ閉鎖及び１時間の再潅流； 上と下の左側パネル）。ＰＢＳビヒクル処理（上と下の左側パネル）と比べてブラジキニン処理（１０μｇ ｍｉｎ−ｌ ｋｇ−１ １５分間； 上中央パネル）又はＮＳ処理（１．５μｇ ｍｉｎ−１ ｋｇ−１ １５分間、下の中央パネル）ラットの虚血脳組織にエバンスブルー吸収のかなりの増大が見られた。しかしながら、ＩＢＴＸ （０．２μｇ ｍｉｎ−１ ｋｇ−１ １５分間）との同時インフュージョンにより、ブラジキニン（上右側パネル）又はＮＳ−１６１９（下右側パネル）によって誘導されたエバンスブルーの吸収増大を減弱した。
【図１２Ａ】
ウィスターラットの悪性腫瘍ＲＧ２グリオーマ組織の正常脳組織の隣接部（中央部）と対側（右側）の血液脳関門透過性に対する作用と［１４Ｃ］−アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）トレーサー（左）の血液腫瘍関門透過性に対するＮＳ−１６１９の増強作用との比較を示すグラフである。
【図１２Ｂ】
ウィスターラットの悪性腫瘍ＲＧ２グリオーマ組織の正常脳組織の隣接部（中央部）と対側（右側）の血液脳関門透過性に対する作用と［１４Ｃ］ＡＩＢトレーサー（左）の血液腫瘍関門透過性に対するミノキシジル硫酸塩の増強作用との比較を示すグラフである。
【図１３】
ウィスターラットの悪性腫瘍ＲＧ２グリオーマ組織における［１４Ｃ］−アミノイソ酪酸の一方向移動定数ＫｉでのＮＳ−１６１９に対する用量応答を示すグラフである。Ｋｉ ＝ ｌ／ｇ／ｍｉｎ。
【図１４】
ＮＳ−１６１９（２６．５μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１）の透過性増強作用のイベリオトキシン（ＩＢＴＸ； ２．３μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１）よる特異的阻害を示すグラフである。Ｋｉは、ＲＧ２腫瘍をもつウィスターラットにおいて１５分間、［１４Ｃ］ＡＩＢとＩＩＢＴＸ （２．３μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１）を含む又は含まないＮＳ−１６１９（２６．５μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１）とを用いて求めた。結果が ５％ エタノールを含む又は含まないＰＢＳ、ｐＨ ７．４と比較されている。
【図１５】
グリオーマ組織（図１５Ｂ）の抗ＫＣａ免疫学的染色によって示されるＫＣａの強い過剰発現と、正常対側脳組織（図１５Ａ）との比較を示す写真である。倍率は１００×である。
【図１６】
腫瘍中央部からのＲＧ２（図１６Ｃ）又はＣ６（図１６Ｄ）グリオーマ組織の抗ＫＣａ免疫学的染色によって示されるＫＣａの強い過剰発現と、正常対側脳組織（図１６Ａ）及びＲＧ２腫瘍周辺（図１６Ｂ）との比較を示す写真である。倍率は１００×である。
Claims (161)
- 哺乳動物において異常脳領域に薬剤をデリバリーする方法であって、
異常脳領域をもつ哺乳動物に
（Ａ） 可溶性グアニリルシクラーゼ活性化物質； 及び
（Ｂ） サイクリックＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ活性化物質
からなる群より選ばれたカリウムチャンネル活性化物質を、該異常脳領域の細胞に血液を送る毛細血管又は細動脈の該薬剤に対する透過性を高めるのに十分な条件と量で投与すること； 及び
該薬剤を該カリウムチャンネル活性化物質と同時に又は実質的に同時に該哺乳動物に投与することであって、その結果該薬剤が正常脳と比べて該異常脳領域の該細胞に選択的にデリバリーされること、
を含む、前記方法。 - 該異常脳領域が創傷、外傷、感染、卒中、又は虚血によって生理的に影響された脳組織領域である、請求項１記載の方法。
- 該異常脳が良性腫瘍組織又は悪性腫瘍組織である、請求項１記載の方法。
- 該グアニリルシクラーゼ活性化物質が一酸化窒素又は一酸化窒素供与体である、請求項１記載の方法。
- 該一酸化窒素供与体が有機硝酸塩化合物、鉄ニトロシル化合物、Ｓ−ニトロソチオール化合物、シドノンイミン化合物、及びＮＯＮＯａｔｅ化合物からなる群より選ばれる、請求項４記載の方法。
- 該有機硝酸塩化合物が三硝酸グリセリン、ニトログリセリン、四硝酸ペンタエリスリトール、硝酸イソソルビド、又は５−硝酸イソソルビドである、請求項５記載の方法。
- 該鉄ニトロシル化合物がニトロプルシドナトリウムである、請求項５記載の方法。
- 該シドノンイミン化合物がモルシドミン、リンシドミン、又はピルシドミンである、請求項５記載の方法。
- 該Ｓ−ニトロソチオール化合物がＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ペニシラミン、Ｓ−ニトロソグルタチオン、Ｓ−ニトロソアルブミン、又はＳ−ニトロソシステインである、請求項５記載の方法。
- 該ＮＯＮＯａｔｅ化合物がジエチルアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、ジエチレントリアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、ジプロピレントリアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、スペルミン−ＮＯＮＯａｔｅ、プロピルアミノプロピルアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、ＭＡＨＭＡ−ＮＯＮＯａｔｅ、ピペラジ−ＮＯＮＯａｔｅ、プロリ−ＮＯＮＯａｔｅ、スルホ−ＮＯＮＯａｔｅ、アンゲリス塩、又は亜硝酸塩ＮＯＮＯａｔｅである、請求項５記載の方法。
- 該サイクリックＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ活性化物質がオクトブロモサイクリックＧＭＰ及びジブチリルサイクリックＧＭＰからなる群より選ばれる、請求項１記載の方法。
- 前記哺乳動物がヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、マウス、ラット、ジャービル、ハムスター、又はウサギである、請求項１記載の方法。
- 該薬剤が細胞障害性治療剤、ＤＮＡ発現ベクター、ウイルスベクター、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、抗菌剤、インターフェロン、サイトカイン、サイトカインアゴニスト、サイトカインアンタゴニスト、イムノトキシン、免疫抑制剤、ホウ素化合物、モノクローナル抗体、アドレナリン生産剤、抗痙攣剤、虚血保護剤、抗外傷剤、抗がん化学療法剤、又は診断剤である、請求項１記載の方法。
- 該診断剤が画像診断剤又は造影剤である、請求項１３記載の方法。
- 該診断剤が放射能標識物質、ガリウム標識物質、又は鉄（ＩＩ）磁気物質、蛍光物質、発光物質、及びヨウ素化造影剤からなる群より選ばれた造影剤である、請求項１３記載の方法。
- 該薬剤がＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体アンタゴニスト、抗生物質、インターロイキン−２； 又はトランスフォーミング成長因子−β、シスプラチン、カルボプラチン、腫瘍壊死因子−α、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、アンホテリシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ブスルファン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、又はエチルエタンスルホン酸である、請求項１記載の方法。
- 該ウイルスベクターがアデノウイルス由来ベクター又は単純ヘルペスウイルス由来ベクターである、請求項１３記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質を投与する段階が静脈内又は動脈内インフュージョン又は静脈内又は動脈内注射による段階である、請求項１記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質を投与する段階が頚動脈内インフュージョン又は頚動脈内注射による段階である、請求項１記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質がボーラス注射によって該哺乳動物に投与される、請求項１記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質が約０．０７５〜１５００μｇ／ｋｇ体重の量で該哺乳動物に投与される、請求項１記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質が約０．０７５〜１５０μｇ／ｋｇ体重の量で該哺乳動物に投与される、請求項２１記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質が約０． ０７５〜約１００μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１の投与速度で約３０分間まで該哺乳動物に投与される、請求項１記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質が約０． ０７５〜約１５μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１の投与速度で約３０分間まで該哺乳動物に投与される、請求項２３記載の方法。
- 哺乳動物において薬剤を異常脳領域に選択的にデリバリーする方法であって、
異常脳領域をもつ哺乳動物に実質的に一酸化窒素、一酸化窒素供与体及びサイクリックＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ活性化物質からなる群より選ばれたカリウムチャンネル活性化物質を、該異常脳領域の細胞に血液を送る毛細血管又は細動脈の内皮細胞膜におけるカルシウム活性化カリウムチャンネル又はＡＴＰ感受性カリウムチャンネルと通るカリウム流量を増加させるのに十分な条件と量で投与し、よって該毛細血管又は細動脈が該薬剤に対してより透過性にすること； 及び、
該薬剤を該カリウムチャンネル活性化物質と同時に又は実質的に同時に該哺乳動物に投与し、該薬剤を正常脳と比べて該異常脳領域の該細胞に選択的にデリバリーすること、
を含む、前記方法。 - 該異常脳領域が創傷、外傷、感染、卒中、又は虚血によって生理的に影響された脳組織領域である、請求項２５記載の方法。
- 該異常脳が良性腫瘍組織又は悪性腫瘍組織である、請求項２５記載の方法。
- 該一酸化窒素供与体が有機硝酸塩化合物、鉄ニトロシル化合物、Ｓ−ニトロソチオール化合物、シドノンイミン化合物、及びＮＯＮＯａｔｅ化合物からなる群より選ばれる、請求項２５記載の方法。
- 該有機硝酸塩化合物が三硝酸グリセリン、ニトログリセリン、四硝酸ペンタエリスリトール、硝酸イソソルビド、又は５−硝酸イソソルビドである、請求項２８記載の方法。
- 該鉄ニトロシル化合物がニトロプルシドナトリウムである、請求項２８記載の方法。
- 該シドノンイミン化合物がモルシドミン、リンシドミン、又はピルシドミンである、請求項２８記載の方法。
- 該Ｓ−ニトロソチオール化合物がＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ペニシラミン、Ｓ−ニトロソグルタチオン、Ｓ−ニトロソアルブミン、又はＳ−ニトロソシステインである、請求項２８記載の方法。
- 該ＮＯＮＯａｔｅ化合物がジエチルアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、ジエチレントリアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、ジプロピレントリアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、スペルミン−ＮＯＮＯａｔｅ、プロピルアミノプロピルアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、ＭＡＨＭＡ−ＮＯＮＯａｔｅ、ピペラジ−ＮＯＮＯａｔｅ、プロリ−ＮＯＮＯａｔｅ、スルホ−ＮＯＮＯａｔｅ、アンゲリス塩、又は亜硝酸塩ＮＯＮＯａｔｅである、請求項２８記載の方法。
- 該サイクリックＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ活性化物質がオクトブロモサイクリックＧＭＰ及びジブチリルサイクリックＧＭＰからなる群より選ばれる、請求項２５記載の方法。
- 前記哺乳動物がヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、マウス、ラット、ジャービル、ハムスター、又はウサギである、請求項２５記載の方法。
- 該薬剤が細胞障害性治療剤、ＤＮＡ発現ベクター、ウイルスベクター、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、抗菌剤、インターフェロン、サイトカイン、サイトカインアゴニスト、サイトカインアンタゴニスト、イムノトキシン、免疫抑制剤、ホウ素化合物、モノクローナル抗体、アドレナリン生産剤、抗痙攣剤、虚血保護剤、抗外傷剤、抗がん化学療法剤、又は診断剤である、請求項２５記載の方法。
- 該診断剤が画像診断剤又は造影剤である、請求項３６記載の方法。
- 該診断剤が放射能標識物質、ガリウム標識物質、又は鉄（ＩＩ）磁気物質、蛍光物質、発光物質、及びヨウ素化造影剤からなる群より選ばれた造影剤である、請求項３６記載の方法。
- 該薬剤がＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体アンタゴニスト、抗生物質、インターロイキン−２； 又はトランスフォーミング成長因子−β、シスプラチン、カルボプラチン、腫瘍壊死因子−α、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、アンホテリシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ブスルファン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、又はエチルエタンスルホン酸である、請求項２５記載の方法。
- 該ウイルスベクターがアデノウイルス由来ベクター又は単純ヘルペスウイルス由来ベクターである、請求項３６記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質を投与する段階が静脈内又は動脈内インフュージョン又は静脈内又は動脈内注射による段階である、請求項２５記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質を投与する段階が頚動脈内インフュージョン又は頚動脈内注射による段階である、請求項２５記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質がボーラス注射によって該哺乳動物に投与される、請求項２５記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質が約０．０７５〜１５００μｇ／ｋｇ体重の量で該哺乳動物に投与される、請求項２５記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質が約０．０７５〜１５０μｇ／ｋｇ体重の量で該哺乳動物に投与される、請求項４４記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質が約０． ０７５〜約１００μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１の投与速度で約３０分間まで該哺乳動物に投与される、請求項２５記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質が約０． ０７５〜約１５μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１の投与速度で約３０分間まで該哺乳動物に投与される、請求項４６記載の方法。
- 哺乳動物において薬剤を悪性腫瘍にデリバリーする方法であって、
悪性腫瘍をもつ哺乳動物に
（Ａ） 可溶性グアニリルシクラーゼ活性化物質； 及び
（Ｂ） サイクリックＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ活性化物質
からなる群より選ばれたカリウムチャンネル活性化物質を該悪性腫瘍の細胞に血液を送る毛細血管又は細動脈の該薬剤に対する透過性を高めるのに十分な条件と量で投与すること； 及び
該薬剤を該カリウムチャンネル活性化物質と同時に又は実質的に同時に該哺乳動物に投与することであって、その結果該薬剤が非悪性腫瘍細胞と比べて該悪性腫瘍細胞に選択的にデリバリーされること、
を含む、前記方法。 - 該可溶性グアニリルシクラーゼ活性化物質が一酸化窒素又は一酸化窒素供与体である、請求項４８記載の方法。
- 該一酸化窒素供与体が有機硝酸塩化合物、鉄ニトロシル化合物、Ｓ−ニトロソチオール化合物、シドノンイミン化合物、及びＮＯＮＯａｔｅ化合物からなる群より選ばれる、請求項４９記載の方法。
- 該有機硝酸塩化合物が三硝酸グリセリン、ニトログリセリン、四硝酸ペンタエリスリトール、硝酸イソソルビド、又は５−硝酸イソソルビドである、請求項５０記載の方法。
- 該鉄ニトロシル化合物がニトロプルシドナトリウムである、請求項５０記載の方法。
- 該シドノンイミン化合物がモルシドミン、リンシドミン、又はピルシドミンである、請求項５０記載の方法。
- 該Ｓ−ニトロソチオール化合物がＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ペニシラミン、Ｓ−ニトロソグルタチオン、Ｓ−ニトロソアルブミン、又はＳ−ニトロソシステインである、請求項５０記載の方法。
- 該ＮＯＮＯａｔｅ化合物がジエチルアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、ジエチレントリアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、ジプロピレントリアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、スペルミン−ＮＯＮＯａｔｅ、プロピルアミノプロピルアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、ＭＡＨＭＡ−ＮＯＮＯａｔｅ、ピペラジ−ＮＯＮＯａｔｅ、プロリ−ＮＯＮＯａｔｅ、スルホ−ＮＯＮＯａｔｅ、アンゲリス塩、又は亜硝酸塩ＮＯＮＯａｔｅである、請求項５０記載の方法。
- 該サイクリックＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ活性化物質がオクトブロモサイクリックＧＭＰ及びジブチリルサイクリックＧＭＰからなる群より選ばれる、請求項４８記載の方法。
- 該悪性腫瘍がグリオーマ、グリア芽細胞腫、希突起グリオーマ、星状細胞腫、上衣細胞腫、胎生神経外胚芽性腫瘍、非定型髄膜腫、悪性髄膜腫、神経芽細胞腫、肉腫、黒色腫、リンパ腫、又はがん腫である、請求項４８記載の方法。
- 該悪性腫瘍が、前記哺乳動物の頭骨、脳、脊柱、胸郭、肺、腹膜、前立腺、卵巣、子宮、乳房、胃、肝、腸、結腸、直腸、骨、リンパ系、又は皮膚に含まれている、請求項４８記載の方法。
- 前記哺乳動物がヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、マウス、ラット、ジャービル、ハムスター、又はウサギである、請求項４８記載の方法。
- 該薬剤が細胞障害性治療剤、ＤＮＡ発現ベクター、ウイルスベクター、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、抗菌剤、インターフェロン、サイトカイン、サイトカインアゴニスト、サイトカインアンタゴニスト、イムノトキシン、免疫抑制剤、ホウ素化合物、モノクローナル抗体、アドレナリン生産剤、抗痙攣剤、虚血保護剤、抗外傷剤、抗がん化学療法剤、又は診断剤である、請求項４８記載の方法。
- 該診断剤が画像診断剤又は造影剤である、請求項６０記載の方法。
- 該診断剤が放射能標識物質、ガリウム標識物質、又は鉄（ＩＩ）磁気物質、蛍光物質、発光物質、及びヨウ素化造影剤からなる群より選ばれた造影剤である、請求項６０記載の方法。
- 該薬剤がＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体アンタゴニスト、抗生物質、インターロイキン−２； 又はトランスフォーミング成長因子−β、シスプラチン、カルボプラチン、腫瘍壊死因子−α、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、アンホテリシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ブスルファン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、又はエチルエタンスルホン酸である、請求項４８記載の方法。
- 該ウイルスベクターがアデノウイルス由来ベクター又は単純ヘルペスウイルス由来ベクターである、請求項６０記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質を投与する段階が静脈内又は動脈内インフュージョン又は静脈内又は動脈内注射による段階である、請求項４８記載の方法。
- 該腫瘍が頭蓋内腫瘍であり、該カリウムチャンネル活性化物質が頚動脈内インフュージョン又は頚動脈内注射により投与される、請求項４８記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質がボーラス注射によって該哺乳動物に投与される、請求項４８記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質が約０．０７５〜１５００μｇ／ｋｇ体重の量で該哺乳動物に投与される、請求項４８記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質が約０．０７５〜１５０μｇ／ｋｇ体重の量で該哺乳動物に投与される、請求項６８記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質が約０． ０７５〜約１００μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１の投与速度で約３０分間まで該哺乳動物に投与される、請求項４８記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質が約０． ０７５〜約１５μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１の投与速度で該哺乳動物に投与される、請求項７０記載の方法。
- 哺乳動物において薬剤を悪性腫瘍にデリバリーする方法であって、
悪性腫瘍をもつ哺乳動物に実質的に一酸化窒素供与体及びサイクリックＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ活性化物質からなる群より選ばれたカリウムチャンネル活性化物質を該悪性腫瘍の細胞に血液を送る毛細血管又は細動脈においてカルシウム活性化カリウムチャンネル又はＡＴＰ感受性カリウムチャンネルを通るカリウム流量を増加させるのに十分な条件と量で投与し、よって該毛細血管又は細動脈が薬剤に対してより透過性にすること； 及び
該薬剤を該カリウムチャンネル活性化物質と同時に又は実質的に同時に該哺乳動物に投与し、該薬剤が非悪性腫瘍細胞と比べて該悪性腫瘍細胞に選択的にデリバリーすること、
を含む、前記方法。 - 該一酸化窒素供与体が有機硝酸塩化合物、鉄ニトロシル化合物、Ｓ−ニトロソチオール化合物、シドノンイミン化合物、及びＮＯＮＯａｔｅ化合物からなる群より選ばれる、請求項７２記載の方法。
- 該有機硝酸塩化合物が三硝酸グリセリン、ニトログリセリン、四硝酸ペンタエリスリトール、硝酸イソソルビド、又は５−硝酸イソソルビドである、請求項７３記載の方法。
- 該鉄ニトロシル化合物がニトロプルシドナトリウムである、請求項７３記載の方法。
- 該シドノンイミン化合物がモルシドミン、リンシドミン、又はピルシドミンである、請求項７３記載の方法。
- 該Ｓ−ニトロソチオール化合物がＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ペニシラミン、Ｓ−ニトロソグルタチオン、Ｓ−ニトロソアルブミン、又はＳ−ニトロソシステインである、請求項７３記載の方法。
- 該ＮＯＮＯａｔｅ化合物がジエチルアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、ジエチレントリアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、ジプロピレントリアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、スペルミン−ＮＯＮＯａｔｅ、プロピルアミノプロピルアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、ＭＡＨＭＡ−ＮＯＮＯａｔｅ、ピペラジ−ＮＯＮＯａｔｅ、プロリ−ＮＯＮＯａｔｅ、スルホ−ＮＯＮＯａｔｅ、アンゲリス塩、又は亜硝酸塩ＮＯＮＯａｔｅである、請求項７２記載の方法。
- 該サイクリックＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ活性化物質がオクトブロモサイクリックＧＭＰ及びジブチリルサイクリックＧＭＰからなる群より選ばれる、請求項７２記載の方法。
- 該悪性腫瘍がグリオーマ、グリア芽細胞腫、希突起グリオーマ、星状細胞腫、上衣細胞腫、胎生神経外胚芽性腫瘍、非定型髄膜腫、悪性髄膜腫、神経芽細胞腫、肉腫、黒色腫、リンパ腫、又はがん腫である、請求項７２記載の方法。
- 該悪性腫瘍が、前記哺乳動物の頭骨、脳、脊柱、胸郭、肺、腹膜、前立腺、卵巣、子宮、乳房、胃、肝、腸、結腸、直腸、骨、リンパ系、又は皮膚に含まれている、請求項７２記載の方法。
- 前記哺乳動物がヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、マウス、ラット、ジャービル、ハムスター、又はウサギである、請求項７２記載の方法。
- 該薬剤が細胞障害性治療剤、ＤＮＡ発現ベクター、ウイルスベクター、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、抗菌剤、インターフェロン、サイトカイン、サイトカインアゴニスト、サイトカインアンタゴニスト、イムノトキシン、免疫抑制剤、ホウ素化合物、モノクローナル抗体、アドレナリン生産剤、抗痙攣剤、虚血保護剤、抗外傷剤、抗がん化学療法剤、又は診断剤である、請求項７２記載の方法。
- 該診断剤が画像診断剤又は造影剤である、請求項８３記載の方法。
- 該診断剤が放射能標識物質、ガリウム標識物質、又は鉄（ＩＩ）磁気物質、蛍光物質、発光物質、及びヨウ素化造影剤からなる群より選ばれた造影剤である、請求項８３記載の方法。
- 該薬剤がＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体アンタゴニスト、抗生物質、インターロイキン−２； 又はトランスフォーミング成長因子−β、シスプラチン、カルボプラチン、腫瘍壊死因子−α、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、アンホテリシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ブスルファン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、又はエチルエタンスルホン酸である、請求項７２記載の方法。
- 該ウイルスベクターがアデノウイルス由来ベクター又は単純ヘルペスウイルス由来ベクターである、請求項８３記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質を投与する段階が静脈内又は動脈内インフュージョン又は静脈内又は動脈内注射による段階である、請求項７２記載の方法。
- 該腫瘍が頭蓋内腫瘍であり、該カリウムチャンネル活性化物質が頚動脈内インフュージョン又は頚動脈内注射により投与される、請求項７２記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質がボーラス注射によって該哺乳動物に投与される、請求項７２記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質が約０．０７５〜１５００μｇ／ｋｇ体重の量で該哺乳動物に投与される、請求項７２記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質が約０．０７５〜１５０μｇ／ｋｇ体重の量で該哺乳動物に投与される、請求項９１記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質が約０． ０７５〜約１００μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１の投与速度で約３０分間まで該哺乳動物に投与される、請求項７２記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質が約０． ０７５〜約１５μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１の投与速度で該哺乳動物に投与される、請求項９３記載の方法。
- ヒトにおいて悪性腫瘍を治療する方法であって、
悪性腫瘍をもつヒトに実質的に一酸化窒素、一酸化窒素供与体及びサイクリックＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ活性化物質からなる群より選ばれたカリウムチャンネル活性化物質を該悪性腫瘍の細胞に血液を送る毛細血管又は細動脈の薬剤に対する透過性を高めるのに十分な条件と量で投与すること； 及び
該ヒトに該カリウムチャンネル活性化物質と同時に又は実質的に同時に該薬剤を投与し、それにより該薬剤を非悪性腫瘍細胞と比べて該悪性腫瘍細胞に選択的にデリバリーすること、
を含む、前記方法。 - 該一酸化窒素供与体が有機硝酸塩化合物、鉄ニトロシル化合物、Ｓ−ニトロソチオール化合物、シドノンイミン化合物、及びＮＯＮＯａｔｅ化合物からなる群より選ばれる、請求項９５記載の方法。
- 該有機硝酸塩化合物が硝酸グリセリン、ニトログリセリン、四硝酸ペンタエリスリトール、硝酸イソソルビド、又は５−硝酸イソソルビドである、請求項９６記載の方法。
- 該鉄ニトロシル化合物がニトロプルシドナトリウムである、請求項９６記載の方法。
- 該シドノンイミン化合物がモルシドミン、リンシドミン、又はピルシドミンである、請求項７３記載の方法。
- 該Ｓ−ニトロソチオール化合物がＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ペニシラミン、Ｓ−ニトロソグルタチオン、Ｓ−ニトロソアルブミン、又はＳ−ニトロソシステインである、請求項９６記載の方法。
- 該ＮＯＮＯａｔｅ化合物がジエチルアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、ジエチレントリアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、ジプロピレントリアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、スペルミン−ＮＯＮＯａｔｅ、プロピルアミノプロピルアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、ＭＡＨＭＡ−ＮＯＮＯａｔｅ、ピペラジ−ＮＯＮＯａｔｅ、プロリ−ＮＯＮＯａｔｅ、スルホ−ＮＯＮＯａｔｅ、アンゲリス塩、又は亜硝酸塩ＮＯＮＯａｔｅである、請求項９６記載の方法。
- 該サイクリックＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ活性化物質がオクトブロモサイクリックＧＭＰ及びジブチリルサイクリックＧＭＰからなる群より選ばれる、請求項９５記載の方法。
- 該悪性腫瘍がグリオーマ、グリア芽細胞腫、希突起グリオーマ、星状細胞腫、上衣細胞腫、胎生神経外胚芽性腫瘍、非定型髄膜腫、悪性髄膜腫、神経芽細胞腫、肉腫、黒色腫、リンパ腫、又はがん腫である、請求項９５記載の方法。
- 該悪性腫瘍が、前記ヒトの頭骨、脳、脊柱、胸郭、肺、腹膜、前立腺、卵巣、子宮、乳房、胃、肝、腸、結腸、直腸、骨、リンパ系、又は皮膚に含まれている、請求項９５記載の方法。
- 該薬剤が細胞障害性治療剤、ＤＮＡ発現ベクター、ウイルスベクター、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、抗菌剤、インターフェロン、サイトカイン、サイトカインアゴニスト、サイトカインアンタゴニスト、イムノトキシン、免疫抑制剤、ホウ素化合物、モノクローナル抗体、アドレナリン生産剤、抗痙攣剤、虚血保護剤、抗外傷剤、抗がん化学療法剤、又は診断剤である、請求項９５記載の方法。
- 該診断剤が画像診断剤又は造影剤である、請求項１０５記載の方法。
- 該診断剤が放射能標識物質、ガリウム標識物質、又は鉄（ＩＩ）磁気物質、蛍光物質、発光物質、及びヨウ素化造影剤からなる群より選ばれた造影剤である、請求項１０５記載の方法。
- 該薬剤がＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体アンタゴニスト、抗生物質、インターロイキン−２； 又はトランスフォーミング成長因子−β、シスプラチン、カルボプラチン、腫瘍壊死因子−α、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、アンホテリシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ブスルファン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、又はエチルエタンスルホン酸である、請求項９５記載の方法。
- 該ウイルスベクターがアデノウイルス由来ベクター又は単純ヘルペスウイルス由来ベクターである、請求項１０５記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質を投与する段階が静脈内又は動脈内インフュージョン又は静脈内又は動脈内注射による段階である、請求項９５記載の方法。
- 該腫瘍が頭蓋内腫瘍であり、該カリウムチャンネル活性化物質が頚動脈内インフュージョンにより投与される、請求項９５記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質がボーラス注射によって該ヒトに投与される、請求項９５記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質が約０．０７５〜１５０μｇ／ｋｇ体重の量で該ヒトに投与される、請求項９５記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質が約０．０７５〜１５μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１の投与速度で該ヒトに投与される、請求項９５記載の方法。
- ヒトにおいて悪性腫瘍を治療する方法であって、
悪性腫瘍をもつヒトに実質的に一酸化窒素、一酸化窒素供与体及びサイクリックＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ活性化物質からなる群より選ばれたカリウムチャンネル活性化物質を該悪性腫瘍の細胞に血液を送る毛細血管又は細動脈の内皮細胞膜においてカルシウム活性化カリウムチャンネル又はＡＴＰ感受性カリウムチャンネルを通るカリウム流量を増加させるのに十分な条件と量で投与し、よって該毛細血管又は細動脈が薬剤に対してより透過性にすること； 及び
該薬剤を該カリウムチャンネル活性化物質と同時に又は実質的に同時に該ヒトに投与し、該薬剤を非悪性腫瘍細胞と比べて該悪性腫瘍細胞に選択的にデリバリーすること、
を含む、前記方法。 - 該一酸化窒素供与体が有機硝酸塩化合物、鉄ニトロシル化合物、Ｓ−ニトロソチオール化合物、シドノンイミン化合物、及びＮＯＮＯａｔｅ化合物からなる群より選ばれる、請求項１１５記載の方法。
- 該有機硝酸塩化合物が三硝酸グリセリン、ニトログリセリン、四硝酸ペンタエリスリトール、硝酸イソソルビド、又は５−硝酸イソソルビドである、請求項１１６記載の方法。
- 該鉄ニトロシル化合物がニトロプルシドナトリウムである、請求項１１６記載の方法。
- 該シドノンイミン化合物がモルシドミン、リンシドミン、又はピルシドミンである、請求項１１６記載の方法。
- 該Ｓ−ニトロソチオール化合物がＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ペニシラミン、Ｓ−ニトロソグルタチオン、Ｓ−ニトロソアルブミン、又はＳ−ニトロソシステインである、請求項１１６記載の方法。
- 該ＮＯＮＯａｔｅ化合物がジエチルアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、ジエチレントリアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、ジプロピレントリアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、スペルミン−ＮＯＮＯａｔｅ、プロピルアミノプロピルアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、ＭＡＨＭＡ−ＮＯＮＯａｔｅ、ピペラジ−ＮＯＮＯａｔｅ、プロリ−ＮＯＮＯａｔｅ、スルホ−ＮＯＮＯａｔｅ、アンゲリス塩、又は亜硝酸塩ＮＯＮＯａｔｅである、請求項１１６記載の方法。
- 該サイクリックＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ活性化物質がオクトブロモサイクリックＧＭＰ及びジブチリルサイクリックＧＭＰからなる群より選ばれる、請求項１１５記載の方法。
- 該悪性腫瘍がグリオーマ、グリア芽細胞腫、希突起グリオーマ、星状細胞腫、上衣細胞腫、胎生神経外胚芽性腫瘍、非定型髄膜腫、悪性髄膜腫、神経芽細胞腫、肉腫、黒色腫、リンパ腫、又はがん腫である、請求項１１５記載の方法。
- 該悪性腫瘍が、前記ヒトの頭骨、脳、脊柱、胸郭、肺、腹膜、前立腺、卵巣、子宮、乳房、胃、肝、腸、結腸、直腸、骨、リンパ系、又は皮膚に含まれている、請求項１１５記載の方法。
- 該薬剤が細胞障害性治療剤、ＤＮＡ発現ベクター、ウイルスベクター、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、抗菌剤、インターフェロン、サイトカイン、サイトカインアゴニスト、サイトカインアンタゴニスト、イムノトキシン、免疫抑制剤、ホウ素化合物、モノクローナル抗体、アドレナリン生産剤、抗痙攣剤、虚血保護剤、抗外傷剤、抗がん化学療法剤、又は診断剤である、請求項１１５記載の方法。
- 該診断剤が画像診断剤又は造影剤である、請求項１２５記載の方法。
- 該診断剤が放射能標識物質、ガリウム標識物質、又は鉄（ＩＩ）磁気物質、蛍光物質、発光物質、及びヨウ素化造影剤からなる群より選ばれた造影剤である、請求項１２５記載の方法。
- 該薬剤がＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体アンタゴニスト、抗生物質、インターロイキン−２； 又はトランスフォーミング成長因子−β、シスプラチン、カルボプラチン、腫瘍壊死因子−α、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、アンホテリシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ブスルファン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、又はエチルエタンスルホン酸である、請求項１１５記載の方法。
- 該ウイルスベクターがアデノウイルス誘導ベクター又は単純ヘルペスウイルス誘導ベクターである、請求項１２５記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質を投与する段階が静脈内又は動脈内注射による段階である、請求項１１５記載の方法。
- 該腫瘍が頭蓋内腫瘍であり、該カリウムチャンネル活性化物質が頚動脈内インフュージョンにより投与される、請求項１１５記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質がボーラス注射によって該ヒトに投与される、請求項１１５記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質が約０．０７５〜１５０μｇ／ｋｇ体重の量で該ヒトに投与される、請求項１１５記載の方法。
- 該カリウムチャンネル活性化物質が約０．０７５〜１５μｇ ｋｇ−１ ｍｉｎ−１の投与速度で該ヒトに投与される、請求項１１５記載の方法。
- 血管内インフュージョン又は血管内注射により哺乳動物にデリバリーするための薬剤と共に薬学的に許容しうる溶液中に処方された可溶性グアニリルシクラーゼ活性化物質及びサイクリックＧＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化物質からなる群より選ばれたカリウムチャンネル活性化物質の組合わせを含む医薬組成物。
- 該溶液が薬学的に許容しうる液量中約０．０７５〜１５００μｇ／ｋｇ体重の該カリウムチャンネル活性化物質の投与速度を最大３０分間でデリバリーするために処方されている、請求項１３５記載の医薬組成物。
- 該溶液が薬学的に許容しうる液量中約０．０７５〜１５０μｇ／ｋｇ体重の該カリウムチャンネル活性化物質の投与速度を最大３０分間でデリバリーするために処方されている、請求項１３５記載の医薬組成物。
- 該可溶性グアニリルシクラーゼ活性化物質が一酸化窒素又は一酸化窒素供与体である、請求項１３５記載の医薬組成物。
- 該一酸化窒素供与体が有機硝酸塩化合物、鉄ニトロシル化合物、Ｓ−ニトロソチオール化合物、シドノンイミン化合物、及びＮＯＮＯａｔｅ化合物からなる群より選ばれる、請求項１３５記載の医薬組成物。
- 該有機硝酸塩化合物が三硝酸グリセリン、ニトログリセリン、四硝酸ペンタエリスリトール、硝酸イソソルビド、又は５−硝酸イソソルビドである、請求項１３９記載の医薬組成物。
- 該鉄ニトロシル化合物がニトロプルシドナトリウムである、請求項１３９記載の医薬組成物。
- 該シドノンイミン化合物がモルシドミン、リンシドミン、又はピルシドミンである、請求項１３９記載の医薬組成物。
- 該Ｓ−ニトロソチオール化合物がＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ペニシラミン、Ｓ−ニトロソグルタチオン、Ｓ−ニトロソアルブミン、又はＳ−ニトロソシステインである、請求項１３９記載の医薬組成物。
- 該ＮＯＮＯａｔｅ化合物がジエチルアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、ジエチレントリアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、ジプロピレントリアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、スペルミン−ＮＯＮＯａｔｅ、プロピルアミノプロピルアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、ＭＡＨＭＡ−ＮＯＮＯａｔｅ、ピペラジ−ＮＯＮＯａｔｅ、プロリ−ＮＯＮＯａｔｅ、スルホ−ＮＯＮＯａｔｅ、アンゲリス塩、又は亜硝酸塩ＮＯＮＯａｔｅである、請求項１３９記載の医薬組成物。
- 該サイクリックＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ活性化物質がオクトブロモサイクリックＧＭＰ及びジブチリルサイクリックＧＭＰからなる群より選ばれる、請求項１３５記載の医薬組成物。
- 該薬剤が細胞障害性治療剤、ＤＮＡ発現ベクター、ウイルスベクター、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、抗菌剤、インターフェロン、サイトカイン、サイトカインアゴニスト、サイトカインアンタゴニスト、イムノトキシン、免疫抑制剤、ホウ素化合物、モノクローナル抗体、アドレナリン生産剤、抗痙攣剤、虚血保護剤、抗外傷剤、抗がん化学療法剤、又は診断剤である、請求項１３５記載の医薬組成物。
- 該診断剤が画像診断剤又は造影剤である、請求項１４６記載の医薬組成物。
- 該診断剤が放射能標識物質、ガリウム標識物質、又は鉄（ＩＩ）磁気物質、蛍光物質、発光物質、及びヨウ素化造影剤からなる群より選ばれた造影剤である、請求項１４６記載の医薬組成物。
- 該薬剤がＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体アンタゴニスト、抗生物質、インターロイキン−２； 又はトランスフォーミング成長因子−β、シスプラチン、カルボプラチン、腫瘍壊死因子−α、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、アンホテリシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ブスルファン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、又はエチルエタンスルホン酸である、請求項１３５記載の医薬組成物。
- 該ウイルスベクターがアデノウイルス由来ベクター又は単純ヘルペスウイルス由来ベクターである、請求項１４６記載の医薬組成物。
- 哺乳動物に血管内インフュージョンするために薬学的に許容しうる緩衝液を更に含んでいる、請求項１３５記載の医薬組成物。
- 該緩衝液がリン酸塩緩衝生理食塩水である、請求項１５２記載の医薬組成物。
- 異常脳領域及び／又は悪性腫瘍への薬剤のデリバリーを高めるためのキットであって、
可溶性グアニリルシクラーゼ活性化物質及びサイクリックＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ活性化物質からなる群より選ばれたカリウムチャンネル活性化物質； 及び
異常脳領域又は悪性腫瘍への薬剤のデリバリーを高める該カリウムチャンネル活性化物質を用いるための説明書
を含む、前記キット。 - 該可溶性グアニリルシクラーゼ活性化物質が一酸化窒素又は一酸化窒素供与体である、請求項１５３記載のキット。
- 該一酸化窒素供与体が有機硝酸塩化合物、鉄ニトロシル化合物、Ｓ−ニトロソチオール化合物、シドノンイミン化合物、及びＮＯＮＯａｔｅ化合物からなる群より選ばれる、請求項１５４記載のキット。
- 該有機硝酸塩化合物が硝酸グリセリン、ニトログリセリン、四硝酸ペンタエリスリトール、硝酸イソソルビド、又は５−硝酸イソソルビドである、請求項１５５記載のキット。
- 該鉄ニトロシル化合物がニトロプルシドナトリウムである、請求項１５５記載のキット。
- 該シドノンイミン化合物がモルシドミン、リンシドミン、又はピルシドミンである、請求項１５５記載のキット。
- 該Ｓ−ニトロソチオール化合物がＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ペニシラミン、Ｓ−ニトロソグルタチオン、Ｓ−ニトロソアルブミン、又はＳ−ニトロソシステインである、請求項１５５記載のキット。
- 該ＮＯＮＯａｔｅ化合物がジエチルアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、ジエチレントリアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、ジプロピレントリアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、スペルミン−ＮＯＮＯａｔｅ、プロピルアミノプロピルアミン−ＮＯＮＯａｔｅ、ＭＡＨＭＡ−ＮＯＮＯａｔｅ、ピペラジ−ＮＯＮＯａｔｅ、プロリ−ＮＯＮＯａｔｅ、スルホ−ＮＯＮＯａｔｅ、アンゲリス塩、又は亜硝酸塩ＮＯＮＯａｔｅである、請求項１５５記載のキット。
- 該サイクリックＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ活性化物質がオクトブロモサイクリックＧＭＰ及びジブチリルサイクリックＧＭＰからなる群より選ばれる、請求項１５３記載のキット。
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