JP2004506427A - 植物の安定した形質転換の方法 - Google Patents
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Abstract
植物組織（例えば、人工培地上の茎頂や腋芽）から多芽構造体を誘導し、多芽培養物を産生する。次いで、これらの多芽培養物を既知の形質転換法で形質転換する。引き続き、この形質転換細胞から植物を再生する。本発明の方法により効率的に形質転換され得る作物には、サトウダイコン、ヒマワリ、ダイズ、ワタ、タバコ、トマト、ラッカセイ、メロン、スイカ、カボチャ、アブラナ属、及びコショウのような、通常は形質転換へ抵抗する植物が含まれる。
Description
【０００１】
本発明は、植物の形質転換と形質転換植物の再生に関する。特に、本発明は、通常は形質転換へ抵抗する植物の形質転換に関する。
【０００２】
遺伝的形質転換による植物変種の改良は、現代の植物育種にとってますます重要になっている。病気抵抗性、昆虫抵抗性、又は改善された品質といった形質を植物へ与える遺伝子のような、潜在的な商業上の関心がある遺伝子は、様々な遺伝子導入技術により作物品種へ取込まれる可能性がある。
【０００３】
効率的な形質転換系の開発は、植物における遺伝子発現の分析に必要である。そのような系の必要条件には、効率的な植物再生を可能にする適切な標的植物組織、外来ＤＮＡを標的植物細胞へ効率的にデリバリーする遺伝子デリバリー運搬体、及び、形質転換細胞を選択するための効率的な方法が含まれる。双子葉品種の遺伝的形質転換では、例えば、細菌のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ；根頭がん腫菌）を利用する形質転換系が遺伝子デリバリーの運搬体として頻繁に使用されてきた。アグロバクテリウム仲介性形質転換に好ましい標的組織には、今のところ、子葉、葉組織、及び胚軸が含まれる。高速微小発射体ボンバードメント法は、植物への遺伝子デリバリーのための代替え方法を提供する。
【０００４】
遺伝的形質転換と後続の再生は、今日多くの植物種にとってほとんど定常的な事柄になっているが、サトウダイコン、カボチャ、ヒマワリ、ダイズ、及びワタのような商業的に重要ないくつかの作物は、利用可能である数多くの方法のほとんどによる形質転換へ依然抵抗している。
【０００５】
Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ（これには、サトウダイコン、飼料ダイコン、食用ダイコン、及びフダンソウが含まれる）は、ある細胞では一過性の発現があり、特定の遺伝子型では時折成功するものの、トランスジェニック植物の産生への簡単で定常的な方法が利用可能でない１つの例である。サトウダイコンのプロトプラストの形質転換に対する忌避性（ｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｃｅ）は、十分に文書化されている。例えば、国際特許出願ＷＯ９１／１３１５９号と Ｋ． Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １０ ３０９−３１４ （１９９２） を参照のこと。アグロバクテリウム仲介性の遺伝子導入に関して言えば、「サトウダイコンの忌避性は有名であり」、「トランスジェニックサトウダイコン植物の産生について報告された技術のほとんどで、それを開発した研究室の熟練技術が必要とされ、他者により容易には再現されないことが証明され（てき）た」。Ｆ． Ａ． Ｋｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． １１６， ９７−１０６ （１９９６）， Ｍ． Ｃ． Ｅｌｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ『植物におけるサイトカイニンの生理学及び生化学（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃｙｔｏｋｉｎｉｎｓ ｉｎ Ｐｌａｍｔｓ）』３２９−３３４頁（ＳＰＢ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｔｈｅ Ｈａｇｕｅ， １９９２）を引用；Ｋ． Ｌｉｎｄｓｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｂｏｔ． ４１， ５２９−５３６ （１９９０） ； 及び Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ ｅｔ ａｌ．， 同上。Ｋｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， の論文は、さらに、「第一選択の方法は・・・子葉を外植片系として使用するものであるが、これは表面的にしか説明されていない」と述べている。Ｋｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， 同上、Ｊ． Ｅ． Ｆｒｙ ｅｔ ａｌ．，『国際植物分子生物学会の第３回国際会議、抄録番号３８４』（Ｒ． Ｂ． Ｈａｌｌｉｃｋ 編、Ｔｕｓｃｏｎ，アリゾナ、アメリカ、１９９１）を引用。しかしながら。この方法でさえさして効率的ではなく、１例として、ある研究者は、１５，０００個の接種外植片から、いくつかのキメラを含む２１個のトランスジェニック苗条しか得られないと報告した。Ｕ． Ｓａｎｄｅｒ，『Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌ． からの形質転換』（学位論文、ハノーバー大学、ドイツ、１９９４）。Ｋｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， の論文そのものも、子葉節とカナマイシン選択技術を使用したサトウダイコンの形質転換頻度を０．９％と報告している。Ｋｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， 同上、１０３頁。
【０００６】
文献には、サトウダイコンの表皮細胞からのカルス産生に関して簡略な記述があり（Ｋｏｔｏｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｕｌｌ． ｏｆ ｔｈｅ Ｐｏｌｉｓｈ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ３２， １１−１２ （１９８４）； Ｋｏｔｏｗｓｋａ， Ｂｅｉｔｒ． Ｂｉｏｌ． Ｐｆｌａｎｚ． ６７， ２０９−２２３ （１９９２） を参照のこと）、いくつかの報告がサトウダイコン葉柄の表皮上での不定芽形成について記載している。例えば、Ｈａｒｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ２， ９３−１０２ （１９８３）； Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｆｌａｎｚ． １８２， ４８５−４９０ （１９８７） を参照のこと。しかしながら、これらの報告は、上記の方法を使用して形質転換されたサトウダイコン植物が再生され得ることの証拠を提示しない。
【０００７】
サトウダイコンのプロトプラストを（気孔の孔辺細胞を介して）使用するサトウダイコンの形質転換が報告されている。例えば、Ｒ． Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， １１３３−１１３８ （１９９６）； Ｒ． Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０７， １３７９−１３８６ （１９９５）； Ｒ． Ｓｅｖｅｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６， ８４３−８４６ （１９９８）； 及びヨーロッパ特許ＥＰ０７２３３９３Ｂ１を参照のこと。しかしながら、サトウダイコンの葉から単離されるプロトプラストは大きさと形態がまばらであり、供給源の組織内に生理学と細胞遺伝学の両レベルで高度の細胞不均質性が存在することを反映している。従って、プロトプラストを利用する形質転換技術には、特定の方法を開発した研究室の熟練技術が必要とされ、その結果はたやすく再現可能になるわけではない。
【０００８】
サトウダイコンのこれまでの形質転換技術は、どう見ても、外植片の供給源、植物の遺伝子型、及び、使用する選択条件にあまりに依存してきたので、高い効率の形質転換は、達成することがきわめて困難であった。例えば、Ｋ． Ｌｉｎｄｓｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ ４１， ５２９−５３６ （１９９０）； Ｋ． Ｌｉｎｄｓｅｙ ｅｔ ａｌ，「サトウダイコン（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌ．）の形質転換」、『農林業のバイオテクノロジー、２３巻、植物プロトプラストと遺伝子工学ＩＶ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． ２３， Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）』（Ｙ． Ｐ． Ｓ． Ｂａｊａｊ 編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， ベルリン、１９９３）を参照のこと。サトウダイコンは、温帯地方の重要な作物である。世界の糖消費量の３０％はサトウダイコンに由来する。従って、これまで形質転換へ抵抗してきたダイコンと他の植物へ適用され得る、簡単で高効率の形質転換法への継続的なニーズが存在する。
【０００９】
簡単で高効率の形質転換法が求められる、形質転換へ抵抗する他の植物には、様々な品種のカボチャが含まれる。ある研究では、種子から切除した子葉を使用する体細胞胚形成により、夏（栽培）カボチャの栽培変異植物が再生された。Ｃ． Ｇｏｎｓａｌｖｅｓ， ＨｏｒｔＳｃｉｅｎｃｅ ３０， １２９５−１２９７ （１９９５）。しかしながら、この方法の再生効率は、最初の外植片につき０．３の小植物体と計算された。同上。他の報告でも、トランスジェニックカボチャの産生が報告されているが、再生植物を得るために使用された形質転換法は、記載されていないか、又は一般的に利用可能ではない。例えば、Ｄ． Ｔｒｉｃｏｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３， １４５８−１４６５， １４６４ （１９９５） を参照のこと。
【００１０】
苗木の（非切除）茎頂又は切除した茎頂を使用する形質転換法が記載されている。Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ． への米国特許第５，１６４，３１０号（そのまま参照により本明細書に組み込まれる）；Ｐ． Ｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９１， １２１２−１２１８ （１９８９）； Ｆ． Ｊ． Ｌ． Ａｒａｇａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． １５８， １５７−１６３ （１９９７）； 及び Ｐ． Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ． ８， ２７５−２８１ （１９９２） を参照のこと。これらの方法では、茎頂は、形質転換の時点で苗木又は発芽種子へ付いたままであったか、苗木から切除された。後者の場合、最終的には、切除された茎頂につき１つの苗条だけが産生された。
【００１１】
茎頂から誘導される分裂組織培養物を使用する形質転換法も記載されている。例えば、Ｈ． Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ． への米国特許第５，７６７，３６８号（参照により本明細書に組み込まれる）；Ｈ． Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １１０， １０９７−１１０７ （１９９６）；及び Ｓ． Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １８， ９５９−９６６ （１９９９） を参照のこと。しかしながら、これらの方法は、ごくひと握りの単子葉植物（即ち、トウモロコシ、オオムギ、及びオート麦）でのみ有効であると示されていて、これらの方法を使用した形質転換の試みの後で成功裡に再生された形質転換双子葉植物はない。さらに、茎頂から誘導された分裂組織培養物を使用する単子葉植物の形質転換は、上記の文献に記載されるように、概して微小発射体ボンバードメントにより達成された（即ち、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ により仲介されるものではない）。
【００１２】
本発明者は、植物組織（例えば、人工培地上の茎頂や腋芽）から多苗条構造体（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｈｏｏｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を誘導し、多芽培養物（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｈｏｏｔ ｃｕｌｔｕｒｅ）を産生する方法を発見した。次いで、これらの多芽（マルチシュート）培養物を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ、ＤＮＡ被覆微小発射体を用いた高速ボンバードメント、又は他の既知の形質転換法で形質転換する。形質転換の後で、この多芽培養物を選択培地へ移し、形質転換細胞と非形質転換細胞へ分化させ得る。引き続き、再生培地、及び／又は根付け（ｒｏｏｔｉｎｇ）培地へ移すと、形質転換細胞から植物が再生される。本発明は、サトウダイコン、ヒマワリ、ダイズ、ワタ、ラッカセイ、メロン、スイカ、カボチャ、アブラナ属、タバコ、トマト、及びコショウを含む商業作物へ適用され得る。本発明は、通常は形質転換へ抵抗する植物を高い効率で形質転換するために使用され得るので、既存の方法に優るある利点を提供する。本発明はまた、植物、特に双子葉植物のプラスチドゲノムを形質転換するために使用される。
【００１３】
本発明は：
（ａ）形質転換へ抵抗する双子葉植物の組織を培養基で培養し、この組織から多芽培養物を産生する工程；（ｂ）この多芽培養物の細胞へ核酸を導入し、それによりこの核酸を含んでなる形質転換細胞を産生する工程；及び（ｃ）この形質転換細胞から形質転換植物を再生させる工程を含んでなる、形質転換された双子葉植物を産生する方法を提供する。組織は、好ましくは分裂組織であり、好ましくは、茎頂、腋芽、又は花の分裂組織から切除されるか、又は組織はカルス組織である。好ましい態様では、植物が、ウリ科か又はアカザ科のメンバーである。もう１つの好ましい態様では、植物が、サトウダイコン、ヒマワリ、ダイズ、ワタ、メロン、スイカ、及びカボチャからなる群から選択される。好ましくは、植物は、サトウダイコン、カボチャ、メロン、又はスイカである。もう１つの好ましい態様では、組織が植物の苗木の茎頂から切除される。もう１つの好ましい態様では、培養基が少なくとも１つの植物生長調節剤、好ましくはサイトカイニンを含む。もう１つの好ましい態様では、生長調節剤が、６−フルフリルアミノプリン（カイネチン）、６−ベンジル−アミノプリン（６−ＢＡＰ）、６−ジメチルアリルアミノ−プリン（２ｉｐ）、トランス−６−（４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エニル）アミノ−尿素（ゼアチン）、ＴＤＺ、ジベレリン酸（ＧＡ）、ＩＡＡ、ＮＡＡ、ジカンバ、２，３，５−Ｔ、及び２，４−Ｄからなる群から選択される。培養基中の生長調節剤の濃度は、好ましくは約０．０１ｍｇ／Ｌ〜約２５ｍｇ／Ｌの間、より好ましくは約０．０１ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌの間、より好ましくは約０．０１ｍｇ／Ｌ〜約５ｍｇ／Ｌの間、より好ましくは約０．０５ｍｇ／Ｌ〜約８ｍｇ／Ｌの間にある。もう１つの好ましい態様では、微粒子ボンバードメント、電気泳動、又はエレクトロポレーションによるか、又はアグロバクテリウム属に属する細菌を使用して、核酸が細胞へ導入される。もう１つの好ましい態様では、該核酸が、双子葉植物にとって異種である核酸を含む。好ましくは、該核酸は、ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコード化する遺伝子、ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）活性を有するポリペプチドをコード化する遺伝子、キシロースイソメラーゼ（ｘｙｌＡ）活性を有するポリペプチドをコード化する遺伝子、又はＧＵＳ活性を有するポリペプチドをコード化する遺伝子を含む。好ましくは、該核酸は、植物への異種遺伝子を含む核酸を含んでなるベクターである。
【００１４】
なおもう１つの好ましい態様では、本方法の工程（ｃ）が、形質転換細胞を含んでなる多芽培養物を選択する工程；この多芽培養物を苗条の伸長を促進する条件下で生長させ、少なくとも１つの形質転換苗条を産生する工程；及び、次いで、この少なくとも１つの形質転換苗条を成熟した形質転換植物へ生長させる工程を含む。好ましくは、この少なくとも１つの形質転換苗条は、根形成を促進する培地でこの少なくとも１つの形質転換苗条を生長させた後で、成熟した形質転換植物へ生長する。
【００１５】
なおもう１つの好ましい態様では、本方法の工程（ｃ）が、形質転換細胞を含んでなる多芽培養物を選択する工程；この多芽培養物を苗条の伸長を促進する条件下で生長させ、少なくとも１つの形質転換苗条を産生する工程；この少なくとも１つの形質転換苗条をクローン化する工程；及び、このクローン苗条（ｃｌｏｎｅｄ ｓｈｏｏｔ）を形質転換植物へ成熟させる工程を含む。好ましくは、このクローン苗条は、根形成を促進する培地でこのクローン苗条を生長させた後で、成熟した形質転換植物へ生長する。
【００１６】
さらに本発明は：
上記の方法のいずれでも産生される形質転換植物細胞、
上記の方法のいずれでも産生される多芽培養物、
上記の方法のいずれでも産生される形質転換植物を提供する。好ましい態様では、形質転換植物は、ＰＭＩ活性を有するポリペプチドを発現するカボチャ植物、メロン植物、又はスイカ植物である。もう１つの好ましい態様では、形質転換植物は、ＰＰＯ活性を有するポリペプチドを発現するサトウダイコン植物である。
【００１７】
さらに本発明は：
上記の形質転換植物により産生される種子（この種子は、多芽培養物へ形質転換される核酸を含む）と、その種子から生長される植物を提供する。
【００１８】
さらに本発明は：
（ａ）植物の組織を培養基で培養し、この組織から多芽培養物を産生する工程；
（ｂ）この多芽培養物の細胞のプラスチドゲノムへ核酸を導入し、それによりこの核酸を含んでなる前記細胞の形質転換プラスチドゲノムを産生する工程；及び
（ｃ）この形質転換細胞から形質転換植物を再生させる工程を含んでなる、形質転換プラスチドゲノムを含んでなる植物を産生する方法を提供する。好ましい態様では、組織が分裂組織であり、好ましくは、茎頂、腋芽、花の分裂組織、又は葉組織から切除されるか、又は、組織がカルス組織である。好ましい態様では、形質転換細胞が形質転換プラスチドゲノムについてホモプラスミー（ｈｏｍｏｐｌａｓｍｉｃ）である。もう１つの好ましい態様では、植物が形質転換プラスチドゲノムについてホモプラスミーである。もう１つの好ましい態様では、植物が双子葉植物である。好ましくは、植物は、ウリ科か又はアカザ科のメンバーである。もう１つの好ましい態様では、植物が、サトウダイコン、ヒマワリ、ダイズ、ワタ、ラッカセイ、メロン、スイカ、タバコ、トマト、カボチャ、アブラナ属、及びコショウからなる群から選択される。好ましくは、植物は、サトウダイコン、タバコ、及びトマトである。もう１つの好ましい態様では、組織が植物の苗木の茎頂から切除されるか、又はそれから導かれる。もう１つの好ましい態様では、培養基が少なくとも１つの植物生長調節剤、好ましくはサイトカイニンを含む。もう１つの好ましい態様では、生長調節剤が、６−フルフリルアミノプリン（カイネチン）、６−ベンジル−アミノプリン（６−ＢＡＰ）、６−ジメチルアリルアミノ−プリン（２ｉｐ）、トランス−６−（４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エニル）アミノ−尿素（ゼアチン）、ＴＤＺ、ジベレリン酸（ＧＡ）、ＩＡＡ、ＮＡＡ、ジカンバ、２，３，５−Ｔ、及び２，４−Ｄからなる群から選択される。好ましくは、培養基中の生長調節剤の濃度は、約０．０１ｍｇ／Ｌ〜約２５ｍｇ／Ｌの間、より好ましくは約０．０１ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌの間、より好ましくは約０．０１ｍｇ／Ｌ〜約５ｍｇ／Ｌの間、より好ましくは約０．０５ｍｇ／Ｌ〜約８ｍｇ／Ｌの間にある。核酸は、好ましくは、微粒子ボンバードメント、電気泳動、又はエレクトロポレーションにより細胞へ導入される。好ましくは、該核酸は、双子葉植物にとって異種である遺伝子を含む核酸を含んでなるベクターである。もう１つの好ましい態様では、本方法の工程（ｃ）が、形質転換細胞を含んでなる多芽培養物を選択する工程；この多芽培養物を苗条の伸長を促進する条件下で生長させ、少なくとも１つの形質転換苗条を産生する工程；及び、次いで、この少なくとも１つの形質転換苗条を成熟した形質転換植物へ生長させる工程を含む。好ましい態様では、この少なくとも１つの形質転換苗条が、根形成を促進する培地でこの少なくとも１つの形質転換苗条を生長させた後で、成熟した形質転換植物へ生長する。
【００１９】
もう１つの好ましい態様では、本方法の工程（ｃ）が、形質転換細胞を含んでなる多芽培養物を選択する工程；この多芽培養物を苗条の伸長を促進する条件下で生長させ、少なくとも１つの形質転換苗条を産生する工程；この少なくとも１つの形質転換苗条をクローン化する工程；及び、このクローン苗条を形質転換植物へ成熟させる工程を含む。好ましくは、このクローン苗条は、根形成を促進する培地でこのクローン苗条を生長させた後で、成熟した形質転換植物へ生長する。
【００２０】
さらに本発明は：
上記の方法のいずれでも産生される形質転換プラスチドゲノム、
上記の方法のいずれでも産生される形質転換プラスチドゲノムを含んでなるプラスチド、
上記の方法のいずれでも産生される形質転換植物細胞（好ましくは、この植物細胞は、形質転換プラスチドゲノムについてホモプラスミーである）、
上記の方法のいずれでも産生される多芽培養物、
上記の方法のいずれでも産生される形質転換植物（好ましくは、この植物は、形質転換プラスチドゲノムについてホモプラスミーである）を提供する。
【００２１】
さらに本発明は：
上記の形質転換植物により産生される種子（この種子は、多芽培養物へ形質転換される核酸を含む）と、その種子から生長される植物を提供する。
【００２２】
本発明の先述の側面と他の側面を以下に示す明細書で詳しく説明する。
以下に本発明を、本発明の好ましい態様が記載される、付帯の明細書に関連してより詳しく説明する。しかしながら、本発明は様々な形態で具体化され得るので、本発明を本明細書に示される態様に制限されるものと解釈してはならない。むしろ、これらの態様は、この開示が詳細で完全であるために提供され、当業者に対して本発明の範囲を十分に伝えるものである。本発明の記載において本明細書で使用される用語は、特定の態様を記載するためだけのものであって、本発明を制限するものではない。本発明の記載と付帯の特許請求項において使用されるように、単数形の不定冠詞（ａ，ａｎ）と定冠詞（ｔｈｅ）は、文脈が明瞭に他のことを明示しない場合は、複数形も含むものとする。
【００２３】
他に定義されなければ、本明細書で使用されるすべての技術及び科学の用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及される公表物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、いずれもそのまま参照により本明細書に組み込まれる。
【００２４】
他に示されなければ、クローン遺伝子、発現カセット、ベクター（例、プラスミド）、タンパク質、及びタンパク質フラグメント、並びに本発明により形質転換される細胞及び植物の産生には、標準的な方法が使用され得る。他に示されなければ、クローン遺伝子、発現カセット、ベクター（例、プラスミド）、タンパク質、及びタンパク質フラグメントの本発明による産生には、標準的な方法が使用され得る。そのような技術は当業者に知られている。例えば、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，『分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）第２版』（コールドスプリングハーバー・ラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、１９８９）と Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，『分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）』（ジェネラル・パブリッシング・アソシエーツ社、及びウィリー・インターサイエンス、ニューヨーク、１９９１）；Ｊ． Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，編『植物の遺伝的形質転換と遺伝子発現：実験マニュアル（Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）』（ブラックウェル・サイエンティフィック・パブリケーションズ、１９８８）；及び、Ｓ． Ｂ． Ｇｅｌｖｉｎ ＆ Ｒ． Ａ． Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ 編『植物における遺伝子の導入、発現、及び遺伝子産物の分析（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）』を参照のこと。
【００２５】
本発明の方法は、形質転換植物を産生するのに有用である。本発明の形質転換植物は、先ず植物組織を培養基で培養し、この組織から多芽培養物を産生することによって産生される。次いで、この多芽培養物の細胞へ核酸を導入し、それによりこの核酸を含んでなる形質転換細胞を産生する。最後に、この形質転換細胞から形質転換植物を再生させる。
【００２６】
本発明の好ましい態様では、形質転換される植物細胞が通常は形質転換へ抵抗する。特に好ましい態様では、形質転換される植物細胞が双子葉植物細胞であり、最も好ましくは、本明細書に定義されるような形質転換へ抵抗する双子葉植物細胞である。本明細書で使用される「植物細胞」若しくは「植物」には、植物全体、植物細胞、又は植物組織中の細胞下植物オルガネラ（即ち、プラスチド）、又は培養中の植物組織、植物細胞、植物細胞懸濁液、細胞下植物オルガネラ、及びプロトプラストが含まれる。植物組織には、植物の分化又は未分化の組織が含まれ、それには、限定されないが、根、苗条、葉、花粉、種子、腫瘍組織、配偶体、胞子体、小胞子、及び、単細胞、プロトプラスト、胚、及びカルス組織のような、培養中の様々な形態の細胞が含まれる。植物組織は、植物中にあるか、又は、器官、組織、又は細胞培養物の中にあり得る。
【００２７】
一般に、双子葉植物は開花植物であって、２つの子葉のある胚、網目状の葉脈のある葉、中心髄を囲む環にある幹の維管束を有する。上記に述べたように、本発明により形質転換され得る双子葉植物は、好ましくは、形質転換へ抵抗する双子葉植物である。一般に、形質転換へ抵抗する植物は、その細胞が今日知られている形質転換の方法（即ち、微小発射体ボンバードメント若しくは生物的（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）形質転換、アグロバクテリウム仲介性形質転換、エレクトロポレーション、電気泳動、等）により形質転換され得ないか、又はそのような方法により低い形質転換効率（即ち、１．０％未満、又は０．５％未満、さらには、０．１％未満）で形質転換されるものである。形質転換へ抵抗する植物はまた、その細胞、組織、プロトプラスト、又はカルスが既知の方法により形質転換され得ても、その形質転換された細胞、組織、プロトプラスト、又はカルスが成熟したトランスジェニック植物を再生し得ない植物である。
【００２８】
本発明の好ましい態様では、双子葉植物がウリ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）科のメンバーである。本発明のもう１つの好ましい態様では、双子葉植物がアカザ（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａ）科のメンバーである。より好ましい態様では、双子葉植物が Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ（即ち、サトウダイコン、飼料ダイコン、食用ダイコン、及びフダンソウ）、ヒマワリ、ダイズ、ワタ、ラッカセイ、メロン、スイカ、カボチャ、タバコ、トマト、アブラナ属、及びコショウからなる群から選択される。最も好ましい態様では、双子葉植物がサトウダイコン又はカボチャである。
【００２９】
本発明では、植物が、その植物由来の組織から多芽培養物をはじめに産生させることによって形質転換される。本明細書で使用されるように、「多芽培養物」という用語は、相互交換可能的に「外植片」を意味する場合もある。本発明で利用され得る組織には、限定されないが、分裂組織、根頂組織、茎頂組織（葉原基、頂部領域、腋領域、胚軸、及び子葉を含む）、苗木茎頂（分裂組織、葉身、葉柄、又は葉身−柄遷移帯組織を含み得る）、及びカルス組織が含まれる。好ましい態様では、多芽培養物を分裂組織から産生する組織が、茎頂、腋芽、又は花の分裂組織から切除される。
【００３０】
本発明の１つの態様では、はじめに、種子発芽培地で、好ましくは無菌培養下で種子を発芽させることによって、多芽培養物が入手され得る。種子発芽技術は当業者に知られている。本発明の好ましい態様では、種子発芽培地（ＧＭ）は、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ 及び Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）塩（シグマケミカルズ、セントルイス、Ｍｏ．から市販されている）を含む。ＧＭは、さらに、スクロースのような炭水化物源を含む場合があり、これは好ましい。この炭水化物源は、約２０〜４０ｇ／Ｌ（約２〜４（ｗ／ｖ）％）、好ましくは約３０ｇ／Ｌ（約３（ｗ／ｖ）％）の量で存在し得る。場合により、そして好ましくは、ＧＭは、Ｂ５ビタミン類、ミオイノシトール（１００ｍｇ）、パントテン酸、及びＰＨＹＴＡＧＥＬ（登録商標）（やはりシグマケミカルから入手可能）のような植物組織培養ゲル化剤を含み得る。サイトカイニン様機能（以下に記載される）のある植物生長調節剤もまた、（しかも好ましくは）この種子発芽培地へ加えてよい。サイトカイニン様機能のある好適な植物生長調節剤には、限定されないが、６−ベンジル−アミノプリン（６−ＢＡＰ若しくはＢＡ）、６−フルフリルアミノプリン（カイネチン）、６−ジメチルアリルアミノ−プリン（２ｉｐ）、トランス−６−（４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エニル）アミノ−尿素（ゼアチン）、等が含まれる。ＧＭでは、植物生長調節剤を、約０．５ｍｇ／Ｌ若しくは約０．１ｍｇ／Ｌ、又は約０．０５ｍｇ／Ｌほどに低いか、又はさらに低い濃度で加え得るか；他のやり方では、植物生長調節剤を、約１．０ｍｇ／Ｌ若しくは約２．０ｍｇ／Ｌ、又は約５ｍｇ／Ｌほどに高いか，又はさらに高い濃度で加え得る。カゼイン加水分解物、プロリン、及び／又はグルタミンの追加も有益であり得る。サトウダイコンのような双子葉作物では、２，３，５−トリヨード安息香酸（ＴＩＢＡ）のようなオーキシン阻害剤のＧＭへの追加が有益であり得る。
【００３１】
約７〜１４日で種子がＧＭ上で発芽した（即ち、苗木になった）後で、この苗木の茎頂を切除し、本明細書で苗条増殖培地（ｓｈｏｏｔ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ： ＳＭＭ）と呼ばれる培養基で培養（即ち、プレート培養）する。好ましくは、茎頂は、頂及び腋の分裂領域、葉原基、３〜４ｍｍの胚軸、及び子葉を含み、短く摘み取ってさらなる伸長を抑制し得る。当然ながら、多芽培養物を産生するために本発明で使用される他の植物組織もＳＭＭでプレート培養され得る。本発明の好ましい態様では、ＳＭＭが、ＭＳ塩、炭水化物源（好ましくはスクロース）、Ｂ５ビタミン類、及びＰＨＹＴＡＧＥＬ（登録商標）のようなゲル化剤を含む。さらに、ＳＭＭは、ＢＡ、カイネチン、２ｉｐ、ゼアチン、等のような少なくとも１つのサイトカイニン様生長調節剤を含有する。ＢＡは、サトウダイコンや他の双子葉品種の頂若しくは腋の分裂組織から、スクロース含有培地で苗条分裂組織培養物を誘導するのに好ましい生長調節剤である。サイトカイニン様生長調節剤は、約２．０ｍｇ／Ｌ、又は約１．０ｍｇ／Ｌ、又は約０．０５ｍｇ／Ｌ、又は約０．０１ｍｇ／Ｌほどに低いか、又はさらに低い濃度でＳＭＭに存在し得るか；他のやり方では、サイトカイニン様生長調節剤は、約５．０ｍｇ／Ｌ、又は約８．０ｍｇ／Ｌ、又は１０ｍｇ／Ｌ、又は約２５ｍｇ／Ｌ、又は約１００ｍｇ／Ｌほどに高いか、又はさらに高い濃度で存在し得る。１つの態様では、サイトカイニン様生長調節剤は、約０．０５ｍｇ／Ｌ〜約２５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇ／Ｌ、そして最も好ましくは約０．５ｍｇ／Ｌ〜約８ｍｇ／ＬでＳＭＭに存在する。苗条分裂組織培養物を誘導するために、追加の生長調節剤をＳＭＭへ加えてよい。そのような生長調節剤には、ジベレリン酸（ＧＡ）と、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）、α−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、チジアツロン（ＴＤＺ）、３，６−ジクロロ−ｏ−アニシン酸（ＤＩＣＡＭＢＡ）、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸（２，４，５−Ｔ）、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）のようなオーキシン様機能のある調節剤、及び、当業者に知られた他の生長調節剤が含まれる。
【００３２】
ＳＭＭで生長する多芽培養物を、１５〜３５℃の温度の明／暗条件下で培養し、好ましくは、約２０℃の温度、約１２〜１６時間の日長で、低い光度（約１０〜約３０μアインシュタイン）下に培養する。約４〜６週後、多芽培養物は密集ロゼットに似たものとなり、形質転換への準備ができている。
【００３３】
多芽培養物は、多くの形質転換法のいずれでも形質転換され得る。本明細書で使用されるように、「形質転換」という用語は、核酸セグメント、一般的には、異種の核酸配列若しくは遺伝子を、それまではその遺伝子を含有していなかった植物、植物組織、植物オルガネラ（即ち、プラスチド、又は葉緑体）、又は植物細胞へ安定的に導入することを意味する。好ましくは、形質転換は、その核酸配列の、植物のゲノムへの安定した組込みをもたらす。本明細書で使用されるように、「ゲノム」という用語には、核ゲノム、プラスチドゲノム、及びミトコンドリアゲノムが含まれる。
【００３４】
本発明の発明者はまた、多芽培養物の細胞に多量のプラスチドが存在していることを発見した。従って、そのような培養物は、プラスチド形質転換のための興味深い標的組織を提供する。従って、他の好ましい態様では、本発明の方法が、植物細胞のプラスチドゲノムを形質転換するために使用される。好ましくは、双子葉植物細胞のプラスチドゲノムが本発明の方法を使用して形質転換される。もう１つの好ましい態様では、通常は形質転換へ抵抗する双子葉植物細胞のプラスチドゲノムが本発明の方法を使用して形質転換される。
【００３５】
プラスチド形質転換の主たる利点は、一般に、プラスチドが実質的な修飾のない細菌遺伝子を発現し得ること、そして、プラスチドが単一のプロモーターの制御下で多数のオープンリーディングフレームを発現し得ることである。プラスチド形質転換の技術は、米国特許第５，４５１，５１３号；５，５４５，８１７号；及び５，５４５，８１８号；ＰＣＴ出願ＷＯ９５／１６７８３号；及び、ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１， ７３０１−７３０５ （１９９４） に記載されている。葉緑体の形質転換の基本技術は、例えば、生物的（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）形質転換や、塩化カルシウム若しくはＰＥＧ仲介性形質転換のような他のプロトプラスト形質転換法を使用して、選択マーカーに隣接するクローン化プラスチドＤＮＡの領域を注目の遺伝子と一緒に好適な標的組織へ導入することを伴う。標的指向配列と呼ばれる、１〜１．５ｋｂの隣接領域によりプラスチドゲノムとの相同的組換えが促進され、これによりプラストムの特定領域の置換若しくは修飾が可能になる。はじめは、スペクチノマイシン及び／又はストレプトマイシンへの抵抗性を与える葉緑体の１６Ｓ ｒＲＮＡ及びｒｐｓ１２の遺伝子における点突然変異が、形質転換の選択マーカーとして利用された。Ｚ． Ｓｖａｂ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７， ８５２６−８５３０ （１９９０） 及び Ｊ． Ｍ． Ｓｔａｕｂ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４， ３９−４５ （１９９２） を参照のこと。これらマーカー間にクローニング部位が存在することで、外来遺伝子の導入のためのプラスチド標的指向ベクターの創出が可能になった。Ｊ． Ｍ． Ｓｔａｕｂ， ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １２， ６０１−６０６ （１９９３） を参照のこと。劣性ｒＲＮＡ若しくはｒ−タンパク質の抗生物質耐性遺伝子を、優性選択マーカーであるスペクチノマイシン解毒酵素のアミノグリコシド−３’−アデニルトランスフェラーゼをコード化する細菌ａａｄＡ遺伝子で置き換えることにより、形質転換効率の実質的な増加が得られる。Ｚ． Ｓｖａｂ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０， ９１３−９１７ （１９９３） を参照のこと。このマーカーは、かつて緑藻 Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ のプラスチドゲノムの高頻度形質転換に成功裡に使用された。Ｍ． Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ−Ｃｌｅｒｍｏｎｔ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９， ４０８３−４０８９ （１９９１）。プラスチド形質転換に有用な他の選択マーカーが当技術分野で知られている。プラスチドの発現では、それぞれの植物細胞に存在する環状プラスチドゲノムの数千コピーへ遺伝子が相同的組換えにより挿入されるので、これは核発現遺伝子よりずっとコピー数が多いという利点があり、可溶性の全植物タンパク質の１０％を容易に超え得る発現レベルが可能になる。本発明の好ましい態様では、注目のヌクレオチド配列がプラスチドの標的指向ベクターへ挿入され、所望される植物宿主のプラスチドゲノムへ形質転換される。好ましくは、注目のヌクレオチド配列を含有するプラスチドゲノムについてホモプラスミーな植物が得られ、そのヌクレオチド配列の高発現が選好的に可能になる。
【００３６】
「異種」という用語は、本明細書では、現下の宿主に関して異なる天然の起源（即ち、異なる種に由来するか、又は同種に由来するが、染色体の位置、配向、又はコピー数が異なる）を有する核酸配列（例、遺伝子）又はタンパク質を明示するために使用される。「異種」はまた、あるタンパク質に存在する１つ以上のドメインが、存在する他のドメインに関して、その天然起源において異なることを明示するためにも使用される。本明細書で使用される「核酸」という用語は、一緒に共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は概してホスホジエステル結合を含有するが、ある場合には、他の骨格を有し得る核酸類似体が含まれる。さらに、天然に存在する核酸及び類似体と非天然に存在する核酸及び類似体の混合物が使用され得る。核酸は、特定されるように、一本鎖又は二本鎖であり得るか、又は二本鎖若しくは一本鎖の配列の両方の部分を含有し得る。核酸は、ＤＮＡ（ゲノム及びｃＤＮＡ）、ＲＮＡ、又はハイブリッドであり得て、ここで核酸はデオキシリボ−及びリボ−ヌクレオチドの任意の組合せと、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン、等を含む、塩基の任意の組合せを含有する。
【００３７】
ある一定の植物種、又は特定タイプの植物組織について使用される形質転換法は、既知の方法に基づいて当業者により決定されるような最も適正な方法に依存する。外来遺伝子を植物細胞へ安定的に挿入し、修飾された細胞を操作するための新規な手段が開発されているので、当業者は、既知の方法から選択し、所望される結果を達成することができる。本発明の実施に有用な既知の形質転換技術には、限定されないが、微粒子ボンバードメント（Ｓａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ． への米国特許第４，９４５，０５０号、及び ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６， ９２３−９２６）；直接ＤＮＡ取込み（Ｊ． Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ３， ２７１７ （１９８４））；エレクトロポレーション（Ｍ． Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２， ５８２４ （１９８５））；マイクロインジェクション（Ａ． Ｃｒｏｓｓｗａｙ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２０２， １７９ （１９８６））；及び、アグロバクテリウム仲介性の植物組織への遺伝子導入が含まれる。本発明では、微粒子ボンバードメントとアグロバクテリウム仲介性形質転換の技術が好ましく、アグロバクテリウム仲介性遺伝子導入が最も好ましい。
【００３８】
アグロバクテリウム仲介性遺伝子導入では、ＤＮＡを植物染色体へ導入する、細菌 Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 及び Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ の天然の能力が巧みに利用される。アグロバクテリウムは植物病原体であり、Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 及び Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ のそれぞれＴｉ及びＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡと呼ばれる領域でコード化される一組の遺伝子を植物細胞へ導入する。Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ を使用する形質転換は、Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ のそれに類似して開発された。Ｒｙａｌｓ ｅｔ ａｌ． への米国特許第５，７７７，２００号を参照のこと（この開示内容はそのまま参照により本明細書に組み込まれる）。Ｔｉプラスミドの導入の典型的な結果は、Ｔ−ＤＮＡが宿主染色体へ安定的に組込まれている、クラウンガールと呼ばれる腫瘍性の増殖である。Ｒｉプラスミドの宿主染色体ＤＮＡへの組込みは、「毛根（ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔ）病」として知られる状態をもたらす。宿主植物に疾患を引き起こす能力は、ＤＮＡの導入及び組込みを失うことなく、Ｔ−ＤＮＡ中の該遺伝子を欠失させることにより除去され得る。形質転換の目的のために植物細胞へデリバリーされるべき核酸（即ち、異種遺伝子）は、組込まれるＴ−ＤＮＡの終点を規定するボーダー配列へ付けられる。
【００３９】
植物を形質転換するのに適した任意のアグロバクテリウムのベクター若しくはベクター系を、本発明に従って利用され得る。多様なアグロバクテリウム株が当技術分野で知られていて、本発明の方法に使用され得る。代表的なアグロバクテリウムベクター系は、Ｇ． Ａｎ， ｅｔ ａｌ． ＥＭＢＯ Ｊ． ４， ２７７ （１９８５）； Ｌ． Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３０３， ２０９ （１９８３）； Ｌ． Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ２， ９８７ （１９８３）； Ｌ． Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，『植物の遺伝子工学（Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）』（ケンブリッジ・ユニバーシティ・プレス、ニューヨーク、６３頁（１９８５）； Ｈｏｏｙｋａａｓ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １３， ３２７ （１９８９）； Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５， ３０２ （１９９５）； Ｃｈｉｌｔｏｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０， ３１１９ （１９９３）； Ｍｏｌｌｏｎｙ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． ＮＹ １９， １４８ （１９９３）； Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４， ７４５ （１９９６）； 及び Ｋｏｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １０， １６５ （１９９６） に記載されていて、これらの開示内容はそのまま参照により本明細書に組み込まれる。
【００４０】
アグロバクテリウムのＴ−領域だけでなく、Ｔｉ（又はＲｉ）プラスミドはｖｉｒ領域を含有する。ｖｉｒ領域は効率的な形質転換にとって重要であり、種特異的であるらしい。例えば、異種ＤＮＡとｖｉｒ機能を担う操作されたアームのない（ｄｉｓａｒｍｅｄ）Ｔ−ＤＮＡが分離したプラスミドに存在する、バイナリーベクター系が開発されている。換言すると、注目の異種核酸配列（即ち、遺伝子若しくは遺伝子群）と隣接Ｔ−ＤＮＡを、ｖｉｒ領域が欠落したバイナリーウイルスにより運ぶことができる。次いで、このｖｉｒ領域が、アームのないＴｉ−プラスミド上か、又は第二のバイナリープラスミド上に提供される。このやり方では、異種ＤＮＡを含んでなる修飾されたＴ−ＤＮＡ領域が小さなプラスミド中に構築され、これが大腸菌中で複製する。このプラスミドを、三親（ｔｒｉ−ｐａｒｅｎｔａｌ）交配かエレクトロポレーションにより、毒性（ビルレンス）遺伝子配列のある適合プラスミドを含有する Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ へ共役的に導入する。ｖｉｒ機能がトランスで供給され、Ｔ−ＤＮＡが植物ゲノムへ導入される。もう１つの代替法では、異種核酸配列とＴ−ＤＮＡボーダー配列が、二重組換え事象を介してＴｉ−プラスミドのＴ−ＤＮＡ部位へ入れられ、それにより本来のＴｉ−プラスミドＴ−ＤＮＡが新たなＴ−ＤＮＡに置き換えられる。ｖｉｒ領域は、Ｔｉ−プラスミドによるか、又はバイナリープラスミド上に提供され得る。さらなる代替法では、異種核酸配列と隣接Ｔ−ＤＮＡが、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ ｅｔ ａｌ． への米国特許第４，９４０，８３８号に記載されるように細菌染色体へ組込まれてから、ｖｉｒ領域がＴｉ−プラスミド又はバイナリープラスミド上に供給され得る。本明細書で記載されるバイナリーベクターが本発明の実施において使用され得て、好ましい。
【００４１】
他のやり方では、本発明の他の態様では、スーパーバイナリー又は「スーパービルレント（超毒性）」アグロバクテリウムベクターがアグロバクテリウム溶液中で利用される。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５９１，６１５号及びＥＰ０６０４６６２号を参照のこと。きわめて高い形質転換効率を示すスーパービルレント Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ａ２８１に含まれる、ＴｉプラスミドｐＴｉＢｏ５４２（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６９， ４４１７ （１９８７））のハイパービルレンス領域から由来するＤＮＡ領域を含有する、そのようなスーパーバイナリーベクターが構築された（Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２， ７０２ （１９８４）； Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６８， １２８３ （１９８６）； Ｋｏｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６６， ８８ （１９８６）； Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６９， ４４１７ （１９８７）； Ｋｏｍａｒｉ， Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６０， ２２３ （１９８７）； ＡＴＣＣ受入れ番号：３７３９４）。
【００４２】
当業者に知られている代表的なスーパーバイナリーベクターには、ｐＴＯＫ１６２（参照により本明細書に組み込まれる、日本特許出願（公開）４−２２２５２７号、ヨーロッパ特許出願ＥＰ５０４，８６９及びＥＰ６０４、６６２、及び米国特許第５，５９１，６１６号を参照のこと）とｐＴＯＫ２３３（Ｋｏｍａｒｉ， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９， ３０３ （１９９０）， 及び Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， ７４５ （１９９６）； 参照により本明細書に組み込まれる）が含まれる。上記の参考文献に説明される方法により他のスーパーバイナリーベクターを構築し得る。スーパーバイナリーベクターのｐＴＯＫ１６２は、大腸菌と Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ の両方で複製が可能である。さらに、このベクターは、ｐＴｉＢｏ５４２のビルレンス領域に由来するｖｉｒＢ、ｖｉｒＣ、及びｖｉｒＧ遺伝子を含有する。このプラスミドはまた、抗生物質耐性遺伝子、選択マーカー遺伝子、及び、所望されるならば、植物へ形質転換される注目の核酸を含有する。ｐＴＯＫ１６２について上記に記載される特徴を有する、本発明のスーパーバイナリーベクターを構築し得る。本発明で使用されるスーパーバイナリーベクターと他のベクターのＴ−領域は、例えば、植物へデリバリーされる異種遺伝子の挿入のための制限部位を有するように構築され得る。他のやり方では、形質転換される異種核酸が、ｉｎ ｖｉｖｏ 相同的組換えを利用することによってベクターのＴ−ＤＮＡ領域に挿入され得る。Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｅｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ２， ９８７ （１９８３）； Ｈｏｒｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３， ４９６ （１９８４） を参照のこと。そのような相同的組換えは、スーパーバイナリーベクターがｐＢＲ３２２又は他の類似プラスミドの領域と相同の領域を有するという事実に依拠する。従って、２つのプラスミドが一緒になると、相同領域を介した遺伝的組換えによりスーパーバイナリーベクターの中へ所望される遺伝子が挿入される。
【００４３】
好ましくは、本発明の方法で利用されるアグロバクテリウムベクター及びベクター系は、組換え核酸技術により、形質転換細胞で発現される異種核酸（例えば、注目の遺伝子若しくは遺伝子群）を含有するように修飾される。
【００４４】
「発現」は、構造異種核酸が転写及び翻訳されてコード化タンパク質を産生することを意味する。発現はまた、例えばアンチセンス構築体の場合のように、転写だけを意味する場合もある。発現される異種核酸は、好ましくはＴ−領域へ組込まれ、アグロバクテリウムベクターのＴ−ＤＮＡボーダー配列がそれに隣接する。
【００４５】
コーディング配列だけでなく、本発明のベクターはまた、場合により、異種核酸の転写及び翻訳に有用であるか又は必要な調節配列を含む場合がある。そのような調節配列の例には、限定されないが、（プロモーターを含む）転写開始領域、エンハンサー、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’及び３’非コーディング領域（即ち、５’リーダー配列）、ターミネーター配列、及び、当業者に知られた他の調節要素が含まれる。本発明に使用される修飾ベクターを創製するために使用され得る一般的な分子生物学の技術は、当業者によく知られている。
【００４６】
形質転換後に発現される核酸は、好ましくは、好適なプロモーター配列の制御下に置かれる。「プロモーター」という用語は、転写の開始を指令する、構造遺伝子若しくはコーディング配列の５’末端にあるヌクレオチド配列を意味する。本明細書で使用されるように、「機能的に連結している」という用語は、ＤＮＡコーディング領域の転写がプロモーターにより制御及び調節されるようなやり方で、そのプロモーターがＤＮＡコーディング領域へ連結していることを意味する。プロモーターをコーディング領域へ機能的に連結させる手段は当技術分野でよく知られている。
【００４７】
植物における発現では、宿主細胞に適したプロモーターが選択されなければならないが、プロモーターの選択は、当業者の技量の範囲内にある。本発明の実施に有用なプロモーターには、限定されないが、構成的、誘導的、一時調節的、発生調節的、化学調節的、組織選好的、及び組織特異的なプロモーターが含まれる。
【００４８】
数多くのプロモーターについて、植物細胞でのＲＮＡの転写を促進することが知られているか又は見出されていて、本発明のＤＮＡ構築体において使用され得る。好適なプロモーターの例には、ノパリン（ｎｏｐａｌｉｎｅ）シンターゼ（ＮＯＳ）及びオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）のプロモーター、リブロースビスリン酸カルボキシラーゼプロモーターの小サブユニット由来の光誘導プロモーター、ＣａＭＶ ３５Ｓ及び１９Ｓプロモーター、Ｆｉｇｗｏｒｔモザイクウイルス由来の完全長転写物プロモーター、ヒストンプロモーター、チューブリンプロモーター、又はマンノピンシンターゼプロモーター（ＭＡＳ）が含まれる。プロモーターはまた、葉、幹、根、又は分裂組織のような特定の組織において選好的な発現を引き起こすものでもあるか、又はプロモーターは、光、熱ストレス、水分ストレス、又は植物による化学品の適用若しくは産生により誘導され得る。代表的な葉緑組織特異的なプロモーターには、トウモロコシのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）プロモーター、小サブユニットリブロースビス−カルボキシラーゼプロモーター（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）、及び葉緑素ａ／ｂ結合タンパク質のプロモーターが含まれる。
【００４９】
本発明に有用なさらなるプロモーターには、限定されないが、ほとんどの細胞型で発現されることが知られている、いくつかのアクチン遺伝子（例えば、イネ（ｒｉｃｅ）アクチン）の１つが含まれる。本発明の実施に有用なさらにもう１つの構成プロモーターは、多くの細胞型で蓄積することが知られているもう１つの遺伝子産物である、ユビキノンから導かれる。このユビキノンプロモーターは、トランスジェニック植物での使用のためにいくつかの種からクローン化された（例えば、ヒマワリ（Ｂｉｎｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ７９： ８７−９４ （１９９１）；及びトウモロコシ（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． １２， ６１９−６３２））。他の有用なプロモーターは、トウモロコシ由来のＵ２及びＵ５ ｓｎＲＮＡプロモーター（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７， ８９９１ （１９８９））とアルコールデヒドロゲナーゼ由来のプロモーター（Ｄｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２， ３９８３ （１９８４））である。本発明に有用な、植物の組織特異的若しくは組織選好的プロモーターは、根、髄、葉、又は花粉における発現を指令するものである。そのようなプロモーターが、（そのまま参照により本明細書に組み込まれる）米国特許第５，６２５，１３６号に開示されている。また有用であるのは、Ｓｃｈｅｒｎｔｈａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ７： １２４９ （１９８８） により開示されるような、種子特異的な発現をもたらすプロモーター；葯特異的プロモーターのａｎｔ３２及びａｎｔ４３Ｄ；葯（タペート組織）特異的プロモーターのＢ６（Ｈｕｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １７Ｂ， 抄録＃Ｄ２０９ （１９９３））；及び、修飾されたＳ１３プロモーターのような雌しべ特異的プロモーター（Ｄｚｅｌｋａｌｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ５， ８５５ （１９９３））である。
【００５０】
他の植物プロモーターが、好ましくは植物又は植物ウイルスから入手され得て、選択されるプロモーターが植物において十分な発現を引き起こし、所望されるタンパク質の有効量の産生をもたらす限りにおいて利用され得る。本発明の好ましい態様では、プロモーターがイネアクチン−１プロモーターである。
【００５１】
植物で発現されることが所望される任意の異種遺伝子若しくは核酸が本発明での形質転換に適していて、本発明の方法に使用され得る。本発明の植物において形質転換されて発現される異種遺伝子には、限定されないが、病気への耐性をコード化する遺伝子、昆虫への耐性をコード化する遺伝子、栄養価を与える遺伝子、抗真菌、抗菌、又は抗ウイルス活性を与える遺伝子、除草剤への耐性を与える遺伝子、改善された植物若しくは栄養の形質を与える遺伝子、等が含まれる。他のやり方では、治療用（例えば、獣医学若しくは医療上の使用）若しくは免疫原性（例えば、予防接種用）ペプチド及びタンパク質が本発明の方法により形質転換される植物で発現され得る。
【００５２】
構造遺伝子の発現が好ましい。本明細書で使用されるように、「構造遺伝子」は、タンパク質、ポリペプチド、又はそれらの一部をコード化するＤＮＡセグメントを含んでなり、転写の開始を推進する５’配列を含まない遺伝子の部分である。構造遺伝子は、細胞に通常見出されるものであるか、又はそれが導入される細胞の場所には通常見出されない（即ち、異種遺伝子である）ものであり得る。異種遺伝子は，細菌のゲノム若しくはエピソーム、真核、核、又はプラスミドのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡを含む、当技術分野で知られた任意の供給源から全体的若しくは部分的に誘導され得る。構造遺伝子は、コーディング領域又は非翻訳領域のいずれかに１つ以上の修飾を含有する場合があり、それにより発現産物の生物学的活性若しくは化学構造、発現の速度、又は発現制御のやり方が影響され得る。そのような修飾には、限定されないが、１つ以上のヌクレオチドの突然変異、挿入、欠失、及び置換が含まれる。構造遺伝子は、中断されないコーディング配列を構成し得るか、又は、適正なスプライス連結部により連結される１つ以上のイントロンを包含する場合がある。構造遺伝子は、天然に存在するか又は合成のいずれか、又は両方である複数の供給源から誘導されるセグメントの複合体であり得る。宿主細胞における改善された発現のために遺伝子を合成する場合、遺伝子のコドン使用の頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用の頻度に近似するように遺伝子を設計することが望ましい。
【００５３】
同様に、本発明の方法は、植物において遺伝子発現を制御する核酸を導入するために使用され得る。例えば、導入される核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコード化し得る。他のやり方では、本発明の植物が、化学合成や他の産業目的のために酵素経路を再生させる１つ以上の遺伝子で形質転換され得る。本発明に有用な異種核酸は、天然に存在し得て、原核生物若しくは真核生物（例、細菌、真菌、酵母、ウイルス、植物、昆虫、及び哺乳動物）から得られる場合があるか、又はこの核酸は、全体的若しくは部分的に合成され得る。
【００５４】
本発明の好ましい態様では、双子葉多芽培養物へデリバリーされるか又は形質転換される異種核酸若しくは遺伝子が、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）活性を有するポリペプチドをコード化する。例えば、米国特許第５，７６７，３７３号；５，９３９，６０２号；６，０２３，０１２号；及び６，０８４，１５５号を参照のこと（この開示内容はそのまま参照により本明細書に組み込まれる）。もう１つの好ましい態様では、双子葉多芽培養物へデリバリーされるか又は形質転換される核酸若しくは遺伝子が、ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）活性を有するポリペプチドをコード化する。例えば、米国特許第５，７６７，３７８号及び５，９９４，６２９号を参照のこと（この開示内容はそのまま参照により本明細書に組み込まれる）。さらにもう１つの好ましい態様では、双子葉多芽培養物へデリバリーされるか又は形質転換される核酸若しくは遺伝子が、キシロースイソメラーゼ（ｘｙｌＡ）活性を有するポリペプチドをコード化する。なおもう１つの好ましい態様では、双子葉多芽培養物へデリバリーされるか又は形質転換される核酸若しくは遺伝子が、ＧＵＳ活性を有するポリペプチドをコード化する。
【００５５】
上記に列挙した方法のいずれかによる、レシピエントの細胞、プラスチド、及び／又は植物への異種核酸のデリバリーをした後で、さらなる培養と植物再生のために、異種遺伝子の成功又は亢進した発現を示す細胞及び植物を、概して１つ以上のスクリーニング方法により同定する。
【００５６】
一般に、「スクリーニング」は、植物へ形質転換された異種遺伝子の発現を示す細胞及び／又は植物を同定することを意味する。通常、スクリーニングは、さらなる培養と植物再生のために（即ち、トランスジェニック植物の産生のために）、成功裡に形質転換された種子（即ち、トランスジェニック種子）を選択するために行われる。形質転換体を同定する能力を高めるために、通常、選択可能若しくはスクリーン可能なマーカー遺伝子が注目の異種遺伝子と一緒に植物へ形質転換される。そのような場合、細胞、種子、植物、又は苗木を選択薬剤（群）へ曝露することによって、潜在的に形質転換された細胞、種子、又は植物がアッセイされる。例えば、マンノース又は抗生物質（例、ハイグロマイシン、カナマイシン、又はパラモマイシン）のような選択剤を含有する培地で種子若しくは苗木を生長させることのような選択条件の下で、トランスジェニック細胞、種子、又は植物が候補選択（スクリーン）され得て、成功裡に形質転換された植物は、そのような選択剤への耐性をコード化する遺伝子で形質転換されている。他のやり方では、他の方法（例、除草剤耐性遺伝子で形質転換した植物をＰＰＯ阻害剤（上記参照）又はＢＡＳＴＡ（登録商標）のような除草剤へ曝露すること）が、細胞、種子、植物、又は植物の組織を所望されるマーカー遺伝子について候補選択するために使用される。他のやり方では、例えばホスホマンノース（ＰＭＩ）活性を有するポリペプチドをコード化する核酸を用いたポジティブ選択法が使用される。本発明の好ましい態様では、形質転換された多芽培養物を、抗生物質及び／又はマンノースを含んでなる植物生育培地で生長させることによって、形質転換細胞を選択する。
【００５７】
形質転換体を同定する能力を高めるために、発現される注目の核酸配列としてか、又はそれに加えて選択可能若しくはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を利用することが望まれる場合がある。「マーカー遺伝子」は、そのマーカー遺伝子を発現する細胞へ独自の表現型を与える遺伝子であり、そのような形質転換細胞がそのマーカーを有さない細胞から識別されることを可能にする。そのような遺伝子は、化学的手段により、即ち、選択剤（例、除草剤、抗生物質、等）の使用により「選択」し得る形質をそのマーカーが与えるかどうか、又は、それが観察若しくは検査により、即ち、「スクリーニング」により同定され得る形質（例、Ｒ−遺伝子座の形質）そのものであるかどうかに依存して、選択可能マーカーかスクリーニング可能マーカーのいずれか一方をコード化し得る。好適なマーカー遺伝子の多くの例が当技術分野で知られていて、本発明の実施に利用され得る。選択マーカー遺伝子は、形質転換細胞により発現される唯一の異種遺伝子であり得るか、又は形質転換細胞へ形質転換されて発現される別の異種遺伝子とともに発現され得る。選択マーカー遺伝子は、形質転換された細胞若しくは組織の同定及び選択に利用される。選択マーカー遺伝子には、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコード化するような、抗生物質耐性をコード化する遺伝子、並びに除草性化合物への耐性を与える遺伝子が含まれる。除草剤耐性遺伝子は、概して、除草剤へ反応しない修飾された標的タンパク質か、又は除草剤が作用し得る前にそれを植物中で分解するか又は解毒する酵素をコードする。ＤｅＢｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ６， ２５１３ （１９８７）； ＤｅＢｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９１， ６９１ （１９８９）； Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８， ８３３ （１９９０）； Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２， ６０３ （１９９０） を参照のこと。例えば、グリリン酸（ｇｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）若しくはスルホニル尿素除草剤への耐性は、突然変異体の標的酵素である５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）及びアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）をコード化する遺伝子を使用して得られた。グルホシン酸アンモニウム、ボロモキシニル、及び２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）への耐性は、それぞれの除草剤を解毒する、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ、ニトリラーゼ、又は２，４−ジクロロフェノキシ酢酸モノオキシゲナーゼをコード化する細菌遺伝子を使用して得られた。選択マーカー遺伝子には、限定されないが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， ＣＲＣ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４， １ （１９８６））；シアナミドヒドラターゼ（Ｍａｉｅｒ−Ｇｒｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８， ４２５０ （１９９１））；アスパラギン酸キナーゼ；ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（Ｐｅｒｌ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１， ７１５ （１９９３））；ｂａｒ遺伝子（Ｔｏｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １００， １５０３ （１９９２）； Ｍｅａｇｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｏｐ． Ｓｃｉ． ３６， １３６７ （１９９６））；トリプトファンデカルボキシラーゼ（Ｇｏｄｄｉｊｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２， ９０７ （１９９３））；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＥＯ； Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎ． １， ３２７ （１９８２））；ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ又はＨＹＧ；Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ６， １０７４ （１９８６））；ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）；ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＤｅＢｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ６， ２５１３ （１９８７））；２，２−ジクロロプロピオン酸デハロゲナーゼ（Ｂｕｃｈａｎａｎ−Ｗｏｌｌａｔｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３Ｄ， ３３０ （１９８９））；アセトヒドロキシ酸シンターゼ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ． への米国特許第４，７６１，３７３号；Ｈａｕｇｈｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２２１， ２６６ （１９８８））；５−エノールピルビルシキミ酸−リン酸シンターゼ（ａｒｏＡ；Ｃｏｍａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１７， ７４１ （１９８５））；ハロアリールニトリラーゼ（Ｓｔａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ． へのＷＯ８７／０４１８１）；アセチル−補酵素Ａカルボキシラーゼ（Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９２， １２２０ （１９９０））；ジヒドロプテリン酸シンターゼ（ｓｕｌＩ；Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５， １２７ （１９９０））；及び３２ｋＤａフォトシステムＩＩポリペプチド（ｐｓｂＡ；Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２， １３４６ （１９８３））をコード化する遺伝子が含まれる。
【００５８】
さらに含まれるのは、クロラムフェニコール（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ２， ９８７ （１９８３））；メトトレキセート（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３０３， ２０９ （１９８３）； Ｍｅｉｊｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １６， ８０７ （１９９１））；ハイグロマイシン（Ｗａｌｄｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５， １０３ （１９８５）； Ｚｈｉｊｉａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １０８， ２１９ （１９８５）； Ｍｅｉｊｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １６， ８０７ （１９９１））；ストレプトマイシン（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２１０， ８６ （１９８７））；スペクチノマイシン（Ｂｒｅｔａｇｎｅ−Ｓａｇｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ． ５， １３１ （１９９６））；ブレオマイシン（Ｈｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ７， １７１ （１９８６））；スルホンアミド（Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． １５， １２７ （１９９０））；ブロモキシニル（Ｓｔａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２， ４１９ （１９８８））；２，４−Ｄ（Ｓｔｒｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７， ８１１ （１９８９））；ホスフィノトリシン（ＤｅＢｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ６， ２５１３ （１９８７））；スペクチノマイシン（Ｂｒｅｔａｇｎｅ−Ｓｇｎａｒｄ ａｎｄ Ｃｈｕｐｅａｕ， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５， １３１ （１９９６））への耐性をコード化する遺伝子である。
【００５９】
選択マーカー遺伝子の上記リストは限定するものではない。本発明では任意の選択マーカー遺伝子が使用され得る。
形質転換植物の種子か又はその種子から産生される再生植物における異種核酸若しくは「トランス遺伝子」の存在をさらに確かめるには、多様なアッセイが実施され得る。そのようなアッセイには、例えば、サザン及びノーザンブロッティングとＰＣＲのような分子生物学アッセイ；免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット）や酵素機能により、タンパク産物の存在を検出するような生化学アッセイ；及び、葉若しくは根のアッセイのような植物部分のアッセイが含まれる。サザンブロッティングとＰＣＲは、問題となっている遺伝子を検出するために使用され得るが、それらはその遺伝子が発現されているかどうかについての情報を提供しない。異種遺伝子の発現は、導入された遺伝子のタンパク産物を特異的に同定すること、又はその発現により引き起こされる表現型の変化を評価することによって評価され得る。特定タンパク質の産生及び同定のアッセイには、そのタンパク質の物理化学、構造、機能、又は他の特質が利用され得る。特有の物理化学若しくは構造上の特性により、そのタンパク質を、ネイティブ若しくは変性ゲル電気泳動や等電点電気泳動のような電気泳動法によるか、又はイオン交換若しくはゲル排除クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー技術により分離して同定することが可能になる。個々のタンパク質に特有な構造は、その存在をＥＬＩＳＡアッセイのようなフォーマットで検出するために特異抗体を使用するための機会を提供する。種々のアプローチを組合せれば、抗体を使用して電気泳動技術により分離された個々の遺伝子産物を定位するウェスタンブロットのように、より高い特異性で利用され得る。精製後のアミノ酸配列決定による評価のように追加の技術を利用して、注目の産物の同一性を完全に確定し得る。これらの技術は最もよく利用されるものであるが、他の技術も当技術分野で知られていて、追加的に使用され得る。
【００６０】
本発明の１つの特別の利点は、シングルシュート培養物ではなく、多芽（マルチシュート）培養物若しくは外植片を形質転換に使用することで、他のやり方では形質転換へ抵抗する植物の形質転換の効率が高まることにある。効率とは、異種核酸で成功裡に形質転換されなかった植物若しくは植物細胞の比率と比較した、所望される異種核酸で成功裡に形質転換された植物若しくは植物細胞の比率を意味する。本発明の好ましい態様では、本発明の方法の形質転換効率が約１％より高く、より好ましくは４％より高く、さらにより好ましくは１０％より高く、そして最も好ましくは約３０％より高い。形質転換効率は、トランスジェニック植物をもたらす外植片の数と標的外植片の数の比として定義される。本発明の異種核酸を含んでなる（例えば、本発明の異種核酸、又は本発明の形質転換細胞を含んでなる）トランスジェニック植物も、トランスジェニック植物により産生される種子及び子孫と同様に、本発明の側面である。形質転換細胞を有用な栽培変種へ培養するための方法は、当業者に知られている。植物組織の ｉｎ ｖｉｔｒｏ 培養、しかも多くの事例では、植物全体への再生についての技術が知られている。本発明のさらなる側面は、上記の核酸を含有する、トランスジェニック植物組織、植物、又は種子である。好ましい態様では、本発明を使用して産生される形質転換外植片はキメラでないか、又はごくわずかな割合の形質転換外植片がキメラである。このことは、好ましくは、高サイトカイニン処理の時間を延ばすことか、又はマンノース選択のストリンジェンシーを高めること、あるいはその両方により達成される（以下の実施例５を参照のこと）。
【００６１】
このように、本発明の形質転換細胞は、本明細書に提供されるように、選択若しくはスクリーニングにより同定されて、再生を維持する適正な培地で培養されてから、植物へ成熟化され得る。植物は、好ましくは、生育室か又は温室で成熟化される。植物は、最初の組織に依存して、形質転換体が同定されてから約６週〜１０ヶ月で再生される。再生の間、細胞は、組織培養容器の固形培地で生長され得る。そのような容器の例示的な態様は、ペトリ皿とＰｌａｎｔ Ｃｏｎ（登録商標）である。再生植物は、苗条及び根の生育の段階に達した後で、さらなる生長と検査のために温室へ移してよい。上記に提供されるように、再生植物の種子及び子孫植物は本発明の側面である。従って、「種子」という用語には、形質転換植物の種子、並びに形質転換植物の子孫から産生される種子が含まれるわけである。本発明の植物には、形質転換されて再生される植物だけでなく、本発明により産生される形質転換されて再生された植物の子孫も含まれる。
【００６２】
１つの態様では、本発明の再生トランスジェニック植物が、形質転換された多芽培養物をはじめに選択培地で生長させ、形質転換された培養物が成熟するにつれて、非形質転換組織をすべて除去することによってつくられる。選択が完了してから、形質転換培養物により産生された苗条を、好ましくは苗条伸長培地を含有する容器へ移す；そのような培地は当技術分野で知られていて、以下に記載する。所望されるならば、形質転換された苗条は、ＭＳベースのクローニング培地（例えば、さらにマンノースを含んでなる、上記に記載されるような生育培地）でクローン化され得る。他のやり方では、単苗条若しくはクローンが、以下に記載されるか、又は当業者により決定され得るような適正な根付け培地へ移すことによって成功裡に根付けされ得る。
【００６３】
本発明の方法により産生される植物は、上記の標準法により、成功した形質転換について候補選択され得る。本発明の再生植物の種子及び子孫植物は、本発明のもう１つの側面である、改良された植物及び種子の株を開発するために、トランスジェニックで組込まれた核酸配列の継続した存在について継続的に候補選択されて選択され得る。このようにして、望ましいトランスジェニック核酸配列を、ある種の選良株、又は商業的に貴重な株若しくは変種のような、他の遺伝系統へ移す（即ち、遺伝子移入するか又は交配させる）ことが可能である。望ましい核酸配列を植物の遺伝系統へ遺伝子導入する方法は、古典的な交配、プロトプラスト融合、核導入、及び染色体導入を含む、当技術分野で知られている多種多様な技術により行い得る。交配のアプローチ及び技術は当技術分野で知られていて、例えば、Ｊ． Ｒ． Ｗｅｌｓｈ，『植物の遺伝学及び交配の基礎（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ）』（ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、ニューヨーク （１９８１））；『作物の交配（Ｃｒｏｐ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ）』（Ｄ． Ｒ． Ｗｏｏｄ 編、アメリカ作物栽培学会、マジソン、ウィスコンシン （１９８３））；Ｏ． Ｍａｙｏ，『植物交配の理論（Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ）第２版』（クラレンドン・プレス、オックスフォード、イギリス （１９８７））；及び、Ｗｒｉｃｋｅ ａｎｄ Ｗｅｂｅｒ， 『定量遺伝学と選択植物交配（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ）』（Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ ａｎｄ Ｃｏ． ベルリン （１９８６））に示される。これらの技術と当技術分野の他の技術を使用して、本発明に従って得られるトランスジェニック植物及び交配株が、商業的に貴重な雑種の植物及び作物（例えば、雑種のカボチャ及びサトウダイコン）を産生するために使用され得て、この雑種も本発明の側面である。
【００６４】
以下の実施例は本発明を詳しく説明するために提供されるものであり、それを制限するものと解釈してはならない。
【００６５】
【実施例】
実施例１：カボチャの形質転換
種子の滅菌及び発芽
カボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｐｅｐｏ． Ｌ．）の成熟胚を一対のプライヤーを使用して乾燥種子から慎重に除去する。次いで、それを５０ｍｌの使い捨て遠心管へ入れ、１５％（Ｖ／Ｖ）Ｃｌｏｒｏｘ（登録商標）溶液中で１５分間表面を滅菌する。滅菌の間、この管を回転機にかけ、２００ｒｐｍでかき混ぜる。滅菌水で３回濯いでから、この胚を滅菌水にさらに２０分漬す。管を時々手で振り混ぜ、胚を囲む膜を除去する。滅菌の後で、成熟胚を４．０ｍｇ／Ｌ−ＢＡ補充ＭＳベース培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ， １９６２）で発芽させ、培養室の２３〜２６℃の暗所で生長させる。
【００６６】
外植片の調製
子葉柄．発芽から３日後、胚軸と子葉の２／３を発芽中の苗木から除去する。次いで、子葉節、茎頂、及び子葉の残り部分を含む子葉柄の外植片を苗条増殖（ＳＭ）培地へ移し、照明下に２５℃で生長させる。ＳＭ培地は、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン類、２〜４ｍｇ／ＬのＢＡを含有し、約４ｇ／Ｌ（又は約０．４％（ｗ／ｖ））のＰｈｙｔａｇｅｌ（登録商標）で固まらせる。
【００６７】
ＳＭ培地での培養の３〜１０日後に、伸長した胚軸及び子葉の余分な組織を注意深く除去し、形質転換に使用する子葉柄を茎頂領域から分離する。子葉柄はまた、形質転換に使用の前にさらに３〜１４日間ＳＭ培地で培養し得る。
【００６８】
茎頂．苗条原基、葉原基、若葉、及び胚軸の一部を含有する頂若しくは腋の分裂組織を発芽中の苗木若しくは小植物体から切除する。それをＳＭ培地で維持し、２５℃の照明下で生長させ、隔週で継代培養する。茎頂外植片は、初回継代培養後には形質転換への準備ができている。それらはまた、数回の継代培養後も形質転換の外植片として使用され得る。
【００６９】
アグロバクテリウム株とプラスミド
ＥＨＡ１０１、ＬＢＡ４４０４、ＧＶ３１０１、及びＫ６（ＡＴＣＣ＃５５９６４）のような Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 株が、好ましい株として、ＥＨＡ１０１（Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ， １９８６， Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １６８： １２９１−１３０１）を用いた遺伝子デリバリーに使用される。形質転換に使用されるプラスミド、ｐＮＯＶ２１０５は、修飾されたＳｍａｓ遺伝子プロモーター（Ｎｉ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ７： ６６１−６７６）により発動される、ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）のコーディング配列を含有する。Ｓｍａｓ（マンノピンシンターゼ）プロモーターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ から導かれ、ｏｃｓエンハンサー領域を増やすことによって亢進される。この遺伝子は、ｎｏｓ３’領域で終結する。それはまた、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ，Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ （１９８６） ＰＲＯＣ． ＮＡＴＬ． ＡＣＡＤ． ＳＣＩ． ＵＳＡ ８３： ８４４７−８４５１）をコード化する大腸菌のｕｉｄＡ遺伝子を含有する。ｇｕｓイントロン（Ｖａｎｃａｎｎｅｙｔ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ ２２０ （２）： ２４５−２５０）は、ＧＵＳコーディング配列の内側に配置された。この遺伝子は、Ｓｍａｓプロモーターにより発動され、ｎｏｓ３’領域で終結する。形質転換に使用されるアグロバクテリウムを、適正な抗生物質（カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ、スペクチノマイシン１００ｍｇ／Ｌ、及びカルベニシリン１００ｍｇ／Ｌ）を含有する、Ｂａｃｔｏ寒天で固めたＹＰ培地（酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、及びＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）で維持する。この細菌を２８℃に保つ。
【００７０】
接種と共存培養
アグロバクテリウムを外植片へ接種するのに３つの方法を採用する。
方法１．２〜３日齢の Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ コロニーを、接種ループを用いて、Ｂａｃｔｏ（登録商標）寒天で固めた細菌プレートから採取する。アグロバクテリウムを外植片へ接種する直前か、又はその間に、子葉柄の分裂領域又は頂及び腋の茎頂の分裂組織培養物を、外科用ブレード又は針のいずれかにより、繰り返し表面を傷つける。創傷に先立って標的領域の表面にアグロバクテリウムを塗布することにより細菌の接種を行うか、又は創傷処理に先立って、アグロバクテリウムをブレード若しくは針へ「塗りつける」。創傷の後で、液体のアグロバクテリウム誘導培地（例えば、ＳＭ培地とアセトシリンゴン２００〜６００ｍｇ／Ｌを含むオール培地、外植片の大きさに依存して１μｌ〜６μｌ）を、外植片の大きさに依存して約１〜約６μＬの量で、創傷領域へ直ちに塗布する。創傷組織の表面上の過剰なアグロバクテリウムとオール培地を無菌濾紙により除去する。短い時間の間空気乾燥させた後で、感染させた外植片を共存培養培地（例えば、オール培地に加えて約２０ｇ／Ｌのスクロースと３０ｇ／Ｌのグルコースを含むＡＣＣ培地）へ移し、２２℃の暗所で２〜４日間インキュベートする。
【００７１】
方法２．２〜３日齢の Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 凝集物をＹＰプレートから採取し、２５〜５０μｌのオール培地と混合する。接種前３０分の間、細菌を室温で放置する。少量の誘導化 Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 混合物を、創傷に先立って、子葉柄の分裂領域又は頂及び腋の茎頂からの分裂組織培養物へ塗布することによって、細菌感染を行う。他のやり方では、アグロバクテリウム凝集物でコートしたブレード若しくは針を用いて標的領域を傷つけることにより細菌感染を行う。短い時間の間空気乾燥させた後で、感染させた外植片をＡＣＣ共存培養培地へ移す。
【００７２】
方法３．２〜３日齢の細菌凝集物を感染当日にオール培地に懸濁させることか、又は、細菌をＹＰ液体培地で一晩増殖させてから感染に先立ってその細菌をオール培地に再懸濁させることのいずれかにより、感染に使用する Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 懸濁液を調製する。前者の場合は、懸濁液を、使用前０．５〜３時間の間、スローモーションシェーカーでかき混ぜるか、又は手で穏やかに振り混ぜる。Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ の最終濃度を０．２〜２．０ｘ１０９ｃｆｕ（コロニー形成単位）へ調整する。感染のために、外植片を Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 懸濁液に浸し、標的領域をブレード又は針のいずれかで傷つける。感染後、外植片上の過剰な液体を濾紙で拭き取り、表面の液体が見えなくなるまで、外植片を３０〜６０分間空気乾燥させる。次いで、感染された外植片を共存培養のためにＡＣＣ培地へ移す。
【００７３】
苗条の増殖及び選択
ＡＣＣ培地で２〜４日間共存培養した後で、感染した外植片を苗条増殖／選択培地（ＭＳＳ）へ移し、２５℃の照明下で２週間生長させる。後続の継代培養及び選択を２週間の間隔で行う。それぞれの継代培養で、マンノース耐性の緑色の苗条塊を選択し、小片へ切断し、新鮮なＭＳＳ培地へ移す。ＭＳＳ培地は、ＳＭ培地と抗生物質を含み、マンノースを含むか又は含まない。ＭＳＳ培地中のマンノースの濃度は、後続の選択を通して０ｇ／Ｌから２ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、及び４ｇ／Ｌへと徐々に高め、スクロースの濃度は３０ｇ／Ｌから２５ｇ／Ｌへ、次いで２０ｇ／Ｌへと減少させる。
【００７４】
植物の再生
マンノースで生長する苗条塊を維持し、２〜４ｇ／Ｌのマンノースと０．５〜４ｍｇ／Ｌの６−ベンジル−アミノプリン（ＢＡ若しくは６−ＢＡＰ）を含有するＭＳＳ培地で新たなクローンをつくる。苗条の伸長を促進するために、ＢＡ ０．５ｍｇ／Ｌを含むか又は含まないＭＳＳ培地で苗条塊を生長させる。ＢＡのないＭＳＳ培地か、又は１ｍｇ／Ｌのインドール−３−酪酸（ＩＢＡ）を含有するＭＳＳ培地で苗条を根付かせる。根付いた苗条を土壌へ移し、温室で成熟するまで生長させる。トランスジェニック植物を自家受粉させる、及び／又は非トランスジェニック植物と他家受粉させて、Ｔ１子孫を産生する。Ｔ１トランスジェニック子孫は、分析のために採取され、Ｔ２トランスジェニック子孫を産生するために使用される。
【００７５】
植物の分析
ＧＵＳ組織化学アッセイ．トランスジェニック植物及び非トランスジェニック対照植物からの組織若しくは器官を、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ （Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． Ｒｅｐ． ５， ３８７−４０５ （１９８７）） の方法に従って、３７℃で一晩、ＧＵＳ基質中でインキュベートする。葉組織におけるＧＵＳ発現の視覚化を助長するには、必要ならば、７０％エタノールを使用して組織から葉緑素を抽出する。子孫の根及び未熟胚についてＧＵＳ組織化学アッセイを実施することによって、ｇｕｓ遺伝子を含有するトランスジェニック子孫を候補選択する。子孫中のトランス遺伝子の分離分析を、カイ二乗検定を使用して実施する。
【００７６】
ＥＬＩＳＡアッセイ．トランスジェニック及び非トランスジェニック植物から葉サンプルを採取し、ＥＬＩＳＡ＋（プラス）／−（マイナス）アッセイを実施して、ＰＭＩ酵素の存在を確かめる。
【００７７】
トランス遺伝子の組込み．トランスジェニック及び非トランスジェニック対照の植物から全ＤＮＡを単離する。植物ゲノムにおけるトランス遺伝子の組込みをサザンブロット分析により確かめる。ＥＨＡ１０１（ｐＮＯＶ２１０５）を用いた形質転換からの結果を表１に要約する。
【００７８】
【表１】
【００７９】
本発明に記載の多苗条形質転換アプローチを使用するカボチャの形質転換効率は、１％〜１０．５％に及んだ。トランスジェニックカボチャ植物の葉、葉柄、根、幹、苗条、葯、花冠、蕚（がく）、花糸、花蜜、花粉粒、柱頭、花柱、胚珠、子房の表皮、及び未熟胚に強いＧＵＳ活性が観察された。サザンブロット分析により、トランスジェニック植物のゲノムにおけるｐｍｉ遺伝子の組込みを確かめた。カイ二乗検定を実施して、子孫中のトランス遺伝子（ＧＵＳ）の分離をチェックした。この結果は、ＧＵＳ遺伝子が、自家受粉した子孫（Ｔ１）では３：１の比で、非トランスジェニック植物と他家受粉した子孫では１：１の比で分離することを示した。１つの自家受粉Ｔ１植物に由来する６つのＴ２子孫をさらなる分析のために選択した。この６つのＴ２植物から全部で１３６の胚を採取し、ＧＵＳ及びＰＭＩ遺伝子の存在について分析した。この結果はいずれも陽性であり、ホモ接合発現物（ｅｖｅｎｔ）の回復を確認した。
【００８０】
実施例２：スイカの形質転換
スイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ （Ｔｈｕｍｂ．） Ｍａｎｓｆ．）の成熟種子を発芽させ、実施例１に記載されるように多芽培養物を調製する。アグロバクテリウム感染、共存培養、選択植物の再生を含む、スイカの形質転換に使用する形質転換の工程及び培地は、実施例１に記載のように実施する。ｐＮＯＶ２１０５を収容する Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＥＨＡ１０１を用いた形質転換の結果を表２に示す。実施例１の記載と同じように、栄養及び生殖の器官及び組織のほとんどで強いＧＵＳ活性が観察された。ＧＵＳ活性の発現はまた、自家受粉したトランスジェニックスイカ植物の子孫でも観察された。
【００８１】
【表２】
【００８２】
実施例３：メロンの形質転換
メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ Ｌ．）種子の種皮を一つのピンセットを使用して除去し、種子を、７０％エタノール、１分間に次いで、１％塩酸、１０分間で滅菌する。この種子を滅菌水で３〜４回濯ぎ、半濃度のホルモンフリーＭＳ培地に、プレートあたり１０個の種子で播く。２２〜２４℃、３０００〜４０００ルクスで１６時間と暗所８時間で種子を発芽させる。７日後、苗木から子葉と葉柄を分離し、それらをＭＳ３０培地（ＭＳ塩、スクロース３０ｇ／Ｌ）へ移す。形質転換の１日前に、５０μｌのストック溶液を５ｍｌの抗生物質含有ＭＳ培地へ移すことによって、ユニバーサル管において Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ の培養を開始する。この培養物を２８℃、１５０ｒｐｍで、少なくとも１７時間インキュベートする。形質転換の当日、１．２〜１．５ｍｌの一晩増殖させたアグロバクテリウム培養物を、子葉を含有するプレートへ加える（最終アグロバクテリウム濃度：２ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌ）。子葉柄の分裂組織部位に小さな切込み（創傷）をつける。アグロバクテリウム＋外植片の入ったプレートを真空乾燥機中に移す。真空ポンプにより１分間真空をかける。真空を１５分間維持する。１５分後、真空をゆっくり解除する。アグロバクテリウムの懸濁液をプレートから吸い取る。ＭＳ３０をプレートへ加えることにより、外植片を液体ＭＳ３０で洗浄する。ＭＳ３０をプレートから吸い取り、滅菌濾紙上でこの外植片を乾かす。１プレートあたり２０〜３０個の外植片で、ＢＭ４．５＋ＢＡＰ ０．５ｍｇ／ｌ（ＢＭ４．５Ｂ）に外植片をのせる。このプレートを、２１〜２３℃、１５００〜２０００ルクスで１６時間、次いで暗所の８時間で５日間インキュベートする。５日間の共存培養の後、１プレートあたり１０個の外植片で、マンノース、ＢＡ ０．５ｍｇ／Ｌ、アンシミドール ０．１２５ｍｇ／Ｌ、及びＡｇＮＯ３ １．５ｍｇ／Ｌを含有する選択培地へこの外植片を移す。このプレートを、２４℃、２０００〜２５００ルクスで１６時間置いてから、次いで暗所に８時間置き、２〜２．５週ごとに新鮮な培地へ移す。０．５ｍｍ以上の大きさの苗条を、ＭＳ塩、ＮＡＡ ０．１ｍｇ／ｌ、ＡｇＮＯ３ ３ｍｇ／Ｌとセフォタキシム ２００ｍｇ／ｌ及びバンコマイシン １００ｍｇ／ｌを含有するＢＭＭ−ｃ培地へ移す。この苗条を２〜３週ごとに新鮮な培地へ移す。
【００８３】
実施例４：ヒマワリの形質転換
ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ Ｌ．）の種子を実施例１に記載のように発芽させる。実施例１に記載の培地を使用して、元の茎頂か又は未熟花部から多芽培養物を調製する。未熟花部は、温室で育てた若い植物か、又は ｉｎ ｖｉｔｒｏ 培養した茎頂から採取する。この多芽培養物を、ｐＮＯＶ２１０５を収容する Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＥＨＡ１０１で形質転換する。感染から４週後の多芽培養物に強いＧＵＳ活性が観察される。実施例１に記載のような選択及び苗条増殖の工程に従って、トランスジェニック植物を回収する。この結果を表３に要約する。
【００８４】
【表３】
【００８５】
実施例５：サトウダイコンの形質転換
種子の滅菌及び発芽
サトウダイコン（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌ．）の種子を、濃硫酸を１０分間使用して種皮処理する。この種子を徹底的に濯いで残余の硫酸を除いた後で、種子を水に一晩浸ける。翌日、２０％ Ｃｌｏｒｏｘ（登録商標）（市販されている）を１５分間振り混ぜながら使用して、表面の滅菌を実施する。その後、種子を滅菌水で５回濯いでから６時間空気乾燥させた後で、無菌培養下の種子発芽培地（ＧＭ）へプレートする。１つの例では、ＧＭには、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ 及び Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）塩（シグマケミカルズ、セントルイス、Ｍｏ．）が約３０ｇ／Ｌのスクロースとともに含まれた。Ｂ５ビタミン類（やはりシグマケミカルズから入手）、ミオイノシトール（１００ｍｇ／Ｌ）、パントテン酸（１ｍｇ／Ｌ）、及びＰｈｙｔａｇｅｌ（登録商標）３．６ｇ／Ｌも、サイトカイニン様機能を有する植物生長調節剤と同様に、ＧＭに含まれた。サイトカイニンレベルは、概して０．５ｍｇ／Ｌ〜５ｍｇ／Ｌの典型的な範囲内にあり、通常は１．０〜２．０ｍｇ／Ｌの間である。サトウダイコンの種子では、オーキシン阻害剤のＴＩＢＡも加えられる。
【００８６】
苗条分裂組織培養物の切除と培養の開始
７〜１４日齢の苗木の茎頂を切除し、苗条増殖培地（ＳＭＭ）へプレートする。この場合には、ＳＭＭに、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ 及び Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）塩、スクロース ３０ｇ／Ｌ、Ｂ５ビタミン類、Ｐｈｙｔａｇｅｌ ８ｇ／Ｌが含まれた。さらに、ＳＭＭは、一般的には約１〜１０ｍｇ／Ｌの濃度範囲に、通常は２〜６ｍｇ／Ｌの濃度範囲に、ＢＡ、カイネチン、２−ｉｐ、又はゼアチンのような、少なくとも１つのサイトカイニン生長調節剤を含有した。ＧＡのような追加の生長調節剤と、ＩＡＡ、ＮＡＡ、及び２，４−Ｄのようなオーキシン様機能を有する生長調節剤も加えた。
【００８７】
茎頂は、頂及び腋の苗条分裂領域、葉原基、３〜４ｍｍの胚軸、及び子葉を含み、短く摘み取ってさらなる伸長を抑制する。プレート培養から７〜１０日ごとに、新たに伸長した葉の素材を除去してから、標的外植片を新鮮なＳＭＭへ継代培養した。典型的には、多苗条標的外植片を、２０℃、１２〜１６時間の日長で、低い光度（１０〜３０μアインシュタイン）下に培養する。４〜６週後、多芽培養物は密集ロゼットに似たものとなり、形質転換への準備ができている。
【００８８】
多芽培養物の接種及びインキュベーション
この多芽培養物の形質転換には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 仲介性形質転換を利用する。プラスミドｐＡＤ１２８９及びｐＮＯＶ２１０５（ＰＭＩ選択マーカー遺伝子とＧＵＳ評価可能マーカー遺伝子を含有する）を有する Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 株のＥＨＡ１０１を、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、及びＢａｃｔｏａｇａｒ（登録商標） １５ｇ／Ｌからなる固形培養基において、２８℃で２〜３日間増殖させる。プラスミドｐＮＯＶ１５０８は、修飾されたＳＭａｓプロモーターにより発動され、ｎｏｓ３’領域で終結する、ｐｍｉ遺伝子を含有する。それはまた、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＵＢＱ３（イントロン）プロモーター（Ｎｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２１， ８９５−９０６ （１９９３） を参照のこと）により発動され、３５Ｓ ３’領域で終結する、二重突然変異 Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＰＰＯ遺伝子（米国特許第６，０８４，１５５号を参照のこと）を含有する。形質転換に先立つ１日前に、残存する伸長した葉の素材を除去することにより、多芽培養物の接種を準備する。
【００８９】
接種を始めるには、滅菌ループを使用して、Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ の単一コロニーを元のＹＰ培養プレートと一緒に採取する。それぞれの標的外植片の実際の接種では、採取した Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ のコロニー中へ無菌の外科用ブレードを浸し、これを使用して各標的の頂及び腋の分裂領域に刻みを入れる。いくつかの実験では、この接種工程の直後に、約４〜６μｌのＭＳＭＧ誘導培地（ＭＳ塩、グルコース ２ｇ／Ｌ、ＭＥＳ、及びアセトシリンゴン ２００μＭ）を各標的の創傷表面へ塗布する。苗条分裂組織産生細胞への遺伝子デリバリーを指令するには、可能な限り多くの分裂ゾーンの中央を通して切断する努力がなされる。典型的には１０〜２０の標的培養物を連続して処理してから、層流フードの無菌条件下で１０分間空気乾燥させる。空気乾燥処理の後で、処理された標的外植片をＭＳＣＣ共存培養培地（ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン類、ＢＡ ２ｍｇ／Ｌ、スクロース３０ｇ／Ｌ、アセトシリンゴン ２００μＭ）へ移す。次いで、処理された外植片を、連続的に暗所で培養しながら、２２℃で２〜３日間、ＭＳＣＣ培地でインキュベートする。
【００９０】
標的の培養及び選択
接種と共存培養の後で、多苗条外植片を、２ｍｇ／ＬのＢＡと適正な抗生物質を含む新鮮なＳＭＭ培地へ少なくとも２日間移してから、マンノース選択圧力をかける。形質転換された組織を、形質転換後の徐々に増加する量のマンノース（２ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌ）と減少する量のスクロース（２６ｇ／Ｌ〜０ｇ／Ｌ）で選択する。マンノース選択レベルは、段階的なやり方で、マンノース２ｇ／Ｌ＋スクロース２６ｇ／Ｌからマンノース３ｇ／Ｌ＋スクロース２４ｇ／Ｌへ、次いでマンノース４ｇ／Ｌ＋スクロース２２ｇ／Ｌ、これに後続して、マンノース５ｇ／Ｌ＋スクロース２０ｇ／Ｌ、及びマンノース６ｇ／Ｌ＋スクロース１８ｇ／Ｌへと増加させる。多芽培養物は大きさが生長し続けるので、それぞれの共存培養時に、十分な選択圧力を助長するように注意深く分割する。ＢＡレベルを典型的には形質転換後１６〜２０週の間２ｍｇ／Ｌに維持し、選択下での苗条分裂組織の増殖を継続させる。この時期の後で、ＢＡレベルを４〜６週の間０．２５ｍｇ／Ｌへ低下させてから消失させ、苗条の伸長を促進する。生存している形質転換組織の領域を元の標的外植片の死んだ非形質転換部分から継続的に取り出し、生存している部分を再び注意深く分割して、ストリンジェントな選択を促進する。選択と苗条再生は、典型的には１０〜約３０週の期間にわたり進行する。若い苗条が出現したときに、それらを分離させ、形質転換苗条の最も効率的な選択の選択下で単離する。
【００９１】
形質転換苗条の伸長
若い苗条がほぼ０．５〜１．５ｃｍに達したならば、上記のようなマンノース選択をかけるか又はかけずに、苗条伸長培地（生育苗条の伸長はサイトカイニンレベルの低下により高められる）を含有するＧＡ７へそれらを移す。苗条伸長培地は、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン類、３０％スクロース、及びＰｈｙｔａｇｅｌ（登録商標）（７．５ｇ／ｌ）を含有する。伸長培地には、低レベルのサイトカイニンが、０．１〜１．０ｍｇ／ｌの典型的な範囲内で取込まれる。サトウダイコンに最適なサイトカイニンの適用は、カイネチン０．５ｍｇ／Ｌである。
【００９２】
形質転換植物の再生
形質転換苗条を、ＭＳベースのクローニング培地＋マンノース ５〜２０ｇ／Ｌでクローン化する。最初の１つのトランスジェニック苗条に由来する多苗条が望ましい場合があるので、この理由のために、基本ＭＳ培地中にサイトカイニンとオーキシンを組み合わせて使用して、クローニングを誘導した。両方の生長調節剤の低レベルは、典型的には０．１ｍｇ／Ｌ〜０．５ｍｇ／Ｌに及ぶ。サトウダイコンでは、ＭＳ塩とスクロース３０ｇ／Ｌを、カイネチン０．２ｍｇ／Ｌ、ＮＡＡ ０．１ｍｇ／Ｌ、及びＰｈｙｔａｇｅｌ（登録商標） ７ｇ／Ｌとともに使用する。
【００９３】
ＩＢＡ若しくはＮＡＡのような１又は２つのオーキシンを０．５ｍｇ／Ｌ〜５ｍｇ／Ｌで補充した、ＭＳ基本培地を含有する根付け培地へ移し、シングルシュート若しくはクローンを成功裡に根付かせる。１つの例では、根付け培地は、ＩＢＡ ５ｍｇ／Ｌ、ＮＡＡ ０．５ｍｇ／Ｌ、及び約５〜２０ｇ／Ｌのマンノースを含有する。Ｐｈｙｔａｇｅｌ（登録商標）は、５ｇ／Ｌで、根の生育を支えるのに適正なゲル化剤であることがわかった。
【００９４】
形質転換の結果
サトウダイコンでは、多芽培養物を外植片として使用すると、高い効率の形質転換が達成された。
【００９５】
ｐＮＯＶ２１０５を含有する Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ で形質転換したサトウダイコンの多芽培養物からの結果を表４に示す。形質転換されたサトウダイコン植物からのＧＵＳ発現が、組織化学アッセイを使用して検出された。ＰＭＩ遺伝子の発現は、ＰＭＩ ＥＬＩＳＡ＋／−アッセイを使用して決定した。
【００９６】
【表４】
【００９７】
サトウダイコンの多芽培養物を、ｐＮＯＶ１５０８（ＰＭＩ選択マーカー遺伝子と突然変異した Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＰＰＯ遺伝子を含有するプラスミド）を含有する Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ で形質転換した１つの実験では、３４の外植片のうち１８がＰＭＩ＋の植物を産生した。このＰＭＩ＋トランスジェニックサトウダイコン植物のノーザン分析によるさらなる分析は、そのうちの７つが突然変異した Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＰＰＯ遺伝子を発現することも示した。このＰＰＯ発現植物にＰＰＯ阻害剤の除草剤を野外適用可能レベルで噴霧すると、そのうちのいくつかがその除草剤に対して劇的に高い耐性を示した。２つのトランスジェニックＰＰＯ発現物をＴ１種子産生のために選択した。ＰＭＩ遺伝子についてのＰＭＩ ＥＬＩＳＡ及びサザン分析により、これらの発現物がトランスジェニックであることを確かめた。それぞれはＰＭＩ遺伝子のコピーの組込みを多数含有することが示された。根付いたＴ０植物を土壌へ移し、２１℃、湿度６０％、日長１６時間／夜間８時間の温室条件で５〜６週間生長させた。正常な表現型の植物の生育を観察してから、Ｔ０植物を１６週間春化処理の条件（４℃、昼１６時間／夜８時間）へ移してから、１４℃へ２週間順化させた。順化の後で、このトランスジェニック体を温室条件へ戻し、正常な花の生育を観察した。このトランスジェニック体を種子の産生のために自家受粉させ、非トランスジェニック植物と他家受粉させた。Ｔ１種子が成功裡に産生されたので、採取し、発芽のために土壌に播いた。ＰＭＩ ＥＬＩＳＡ分析により、Ｔ１の苗木がＰＭＩ遺伝子を含有することが証明された。それぞれの発現物につき５つのＴ１植物のサザン分析により、ＰＭＩ及びＰＰＯのトランス遺伝子の同時組込みを確かめた。
【００９８】
キメラの排除
キメラである（一部トランスジェニックである）形質転換植物を産生する可能性を減らすには、追加の工程を行う。１つの工程は、高サイトカイニン処理（２ｍｇ／Ｌ）の期間を８週から１６週へ延長し、苗条分裂増殖培養物を選択圧力下で刺激し続けることである。もう１つの工程は、マンノース選択のストリンジェンシーを高める（例えば、マンノースを選択の間に５ｇ／Ｌから１０ｇ／Ｌへ段階的に高める）ことである。サトウダイコンの多芽培養物をｐＮＯＶ２１０５含有ＥＨＡ１０１で形質転換した１つの実験では、ＧＵＳ発現について分析した３６の外植片のうち３５（９７％）が完全にトランスジェニックな苗条を産生した（以下の表５を参照のこと）。
【００９９】
【表５】
【０１００】
実施例６：茎頂、葉、又は他の植物組織から導かれる分裂組織培養物を使用するプラスチドの形質転換
サトウダイコンプラスチド形質転換ベクターの構築
Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ プラスチドゲノムのｔｒｎＶ及びｒｐｓ１２／７遺伝子間領域を増幅し、キメラ遺伝子の挿入のために修飾する。サトウダイコンのプラスチドゲノムからの１５５９ｂｐ領域（１〜１５６０位、ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号ＡＢ０３２４２６）をＰＣＲ増幅し、Ｐｓｔ１部位を５２５位に挿入する。第一の５３６ｂｐのＰＣＲ増幅を、以下のプライマー対を用いて Ｂ． ｖｕｌｇａｒｉｓ の全ＤＮＡから実施する：天然のＭｌｕＩ制限部位（下線）を有するＢｖ１６−ＭｌｕＩ（５’ＴＴＣ ＴＴＡ ＣＧＣ ＧＴＴ ＡＣＴ ＣＡＣ ＣＣＧ ３’，配列番号１）、及びＰｓｔＩ部位（下線）を導入するＢｖ１６Ｓ−ＰｓｔＩ（５’ＡＡＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＴＣ ＣＣＧ ＧＣＴ ＣＣＡ ＡＧＴ ３’，配列番号２）。第二の１０４９ｂｐのＰＣＲ増幅を、以下のプライマー対を用いて実施した：ＢａｍＨＩ制限部位（下線）を導入するＢｖｒｐｓ１２−ＢＨＩ（５’ＡＡＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＡＡ ＴＴＧ ＡＣＧ ＧＧＴ ＴＡＧ ＴＧＴ Ｇ３’，配列番号３）、及びＰｓｔＩ部位（下線）を導入するＢｖｒｐｓ１２−ＰｓｔＩ（５’ＡＡＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ＴＣＧ ＣＡＣ ＴＡＴ ＴＡＣ ＧＧＡ ＴＡＣ ＧＡＡ ３’，配列番号４）。いずれのＰＣＲ反応も、以下のような製造業者（パーキンエルマー／ロッシュ、ブランクブルグ、ＮＪ）の推奨法に従って、パーキンエルマーサーマルサイクラー４８０において、Ｐｆｕ熱安定ＤＮＡポリメラーゼを用いて行う：９５℃、５分に次いで、９５℃、１分／５０℃、１分／７２℃、１分の３５サイクル、次いで７２℃で１０分。５３６ｂｐ増幅産物をＭｌｕＩ及びＰｓｔＩで消化すると、サトウダイコンプラスチドのｔｒｎＶ隣接配列を表す５２５ｂｐのＭｌｕＩ／ＰｓｔＩフラグメントを生じる。１０４９ｂｐ増幅産物をＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩで消化すると、サトウダイコンのｒｐｓ１２／７隣接配列を表す１０３４ｂｐのＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩフラグメントを生じる。
【０１０１】
タバコプラスチドの形質転換ベクターであるｐＡＴ２３８（ＰＣＴ ＷＯ００／２０６１２、ノバルティス、国際公開日０４／１３／００）をＭｌｕＩ及びＢａｍＨＩで切断し、３．３ｋｂのＭｕｌＩ／ＰｓｔＩベクターフラグメントを単離した。このフラグメントを、５２５ｂｐのＭｌｕＩ／ＰｓｔＩフラグメントと１０３４ｂｐのＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩフラグメントとの三者間反応で連結させると、サトウダイコンの形質転換ベクターであるｐＥＢｃｐＳＢｅｅｔの骨格を生じる。生じたプラスミドは、キメラのタバコ：：サトウダイコン：：タバコプラスチドｔｒｎＶ及びｒｐｓ１２／７の遺伝子間座を含み、１５５９ｂｐのサトウダイコン配列には、ｔｒｎＶの側で４１４ｂｐのタバコプラスチド配列が、ｒｐｓ１２／７の側で３９ｂｐが隣接している。タバコのｐｓｂＡプロモーターにより発動され、スペクチノマイシンへの耐性を与えるキメラａａｄＡ遺伝子を、サトウダイコンの配列中にすでに創出されたＰｓｔＩ部位へ挿入する。ｒｐｓ１２／７隣接領域の方へ配向しているａａｄＡカセットを有するプラスミドのクローン（ｐＥＢＳＢ１）を後続のサトウダイコン多芽体の形質転換に使用する。
【０１０２】
サトウダイコンプラスチドの形質転換
サトウダイコンの多芽培養物を実施例５に記載されるように茎頂から導く。ボンバードメントの前日、標的外植片を４つの断片へ切る（外植片の頂部から底部へ切る）か、又はインタクトな標的外植物として保つ。
【０１０３】
ボンバードメントの当日、サトウダイコンの標的外植片（全体又は切断片）を、１２％スクロースを有するＳＭＭ培地へ移す。遺伝子デリバリーを最大化するために、外植片を標的プレートの中央に置く。切断した外植片は、切断面が上向きになるように配向させ、外植片の内部細胞への遺伝子デリバリーを最大化する。すでに記載したサトウダイコンプラスチドの形質転換ベクターであるｐＥＢＳＢ１で無菌粒子を被覆する。このＤＮＡ−粒子の調製及びボンバードメントの方法は、製造業者により記載されるプロトコールに類似している。
【０１０４】
ボンバードメントの後で、サトウダイコンの外植片をＳＭＭ培地に２日間戻す。次いで、このサトウダイコンを、２５０ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンを有する選択用のＳＭＭ培地へ移す。２週間後、この組織を、継続した選択のために、５００ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンを含有するＳＭＭ培地へ移す。１〜２ヶ月の選択の後で、緑色のスペクチノマイシン耐性苗条が白色の組織上に出現し、これを分析する。
【０１０５】
タバコプラスチドの形質転換
約０．５〜５ｍｇ／Ｌ、好ましくは１〜２ｍｇ／Ｌの濃度範囲でＢＡＰのような少なくとも１つのサイトカイニン生長調節剤を含有する培地で、タバコの葉組織から分裂組織培養物を導く。分裂組織培養物はまた、タバコ植物の他の部分からも導かれる。ＮＡＡのような追加の生長調節剤も含まれる。この培地は、植物調節剤に加えて、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン類、スクロース３０ｇ／Ｌ、及び寒天３ｇ／Ｌを含有し、ｐＨは約５．８である。
【０１０６】
ボンバードメントの当日、分裂組織培養物を新鮮な培地へ移し、遺伝子デリバリーを最大化するために、標的プレートの中央に置く。タバコプラスチドの形質転換ベクターであるｐＡｔ２３８（国際特許出願ＰＣＴ ＷＯ００／２０６１２を参照のこと）で無菌粒子を被覆する。このＤＮＡ−粒子の調製及びボンバードメントの方法は、製造業者により記載されるプロトコールに類似している。
【０１０７】
ボンバードメントから２日後に、５００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを含有する選択培地へ培養物を移す。約４週間の選択の後で、耐性のある緑色の苗条が白色の組織から出現する。この一次耐性苗条組織を、５００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを含有する新鮮培地へ定期的に継代培養する。
【０１０８】
選択から３ヵ月後、２回の実験からの１７の独立した発現物について、ａａｄＡ遺伝子とそのプラスチドへの組込みをＰＣＲにより分析する。１４の発現物で、ａａｄＡを含有し、該プラスミドがそのプラスチドへ組込まれていることを確かめた。
【０１０９】
トマトプラスチドの形質転換
（子葉、葉、茎頂、等のような）トマト組織由来の様々な外植片を、（ゼアチン、ＢＡＰのような）少なくとも１つのサイトカイニン生長調節剤を含有する培地で培養する。サイトカイニン濃度は、約０．５〜５ｍｇ／Ｌ、好ましくは１〜２ｍｇ／Ｌに及ぶ。ＩＡＡ、ＮＡＡのような追加の生長調節剤も含める。この培地は、植物調節剤に加えて、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン類、スクロース３０ｇ／Ｌ、及びＰｈｙｔａｇａｒ ７．５ｇ／Ｌを含有し、ｐＨ５．８である。
【０１１０】
ボンバードメントの当日、分裂組織培養物を新鮮な培地へ移し、遺伝子デリバリーを最大化するために、標的プレートの中央に置く。選択マーカー遺伝子（及び、注目の遺伝子）に隣接するトマト若しくはタバコの相同配列を含有するプラスチドＤＮＡで無菌粒子を被覆する。このＤＮＡ−粒子の調製及びボンバードメントの方法は、製造業者により記載されるプロトコールに類似している。
【０１１１】
ボンバードメントから２日後に、５００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを含有する選択培地へ培養物を移す。数週間の選択の後で、耐性のある緑色の苗条が白色の組織から出現する。得られた苗条は、スペクチノマイシン選択培地で生長し続け、形質転換プラスチドを含有する。
【０１１２】
上記は本発明の例示であって、それを制限するものと解釈されてはならない。本発明は以下の特許請求項により明確化され、特許請求項の同等物もそこに含まれる。
本発明は、植物の形質転換と形質転換植物の再生に関する。特に、本発明は、通常は形質転換へ抵抗する植物の形質転換に関する。
【０００２】
遺伝的形質転換による植物変種の改良は、現代の植物育種にとってますます重要になっている。病気抵抗性、昆虫抵抗性、又は改善された品質といった形質を植物へ与える遺伝子のような、潜在的な商業上の関心がある遺伝子は、様々な遺伝子導入技術により作物品種へ取込まれる可能性がある。
【０００３】
効率的な形質転換系の開発は、植物における遺伝子発現の分析に必要である。そのような系の必要条件には、効率的な植物再生を可能にする適切な標的植物組織、外来ＤＮＡを標的植物細胞へ効率的にデリバリーする遺伝子デリバリー運搬体、及び、形質転換細胞を選択するための効率的な方法が含まれる。双子葉品種の遺伝的形質転換では、例えば、細菌のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ；根頭がん腫菌）を利用する形質転換系が遺伝子デリバリーの運搬体として頻繁に使用されてきた。アグロバクテリウム仲介性形質転換に好ましい標的組織には、今のところ、子葉、葉組織、及び胚軸が含まれる。高速微小発射体ボンバードメント法は、植物への遺伝子デリバリーのための代替え方法を提供する。
【０００４】
遺伝的形質転換と後続の再生は、今日多くの植物種にとってほとんど定常的な事柄になっているが、サトウダイコン、カボチャ、ヒマワリ、ダイズ、及びワタのような商業的に重要ないくつかの作物は、利用可能である数多くの方法のほとんどによる形質転換へ依然抵抗している。
【０００５】
Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ（これには、サトウダイコン、飼料ダイコン、食用ダイコン、及びフダンソウが含まれる）は、ある細胞では一過性の発現があり、特定の遺伝子型では時折成功するものの、トランスジェニック植物の産生への簡単で定常的な方法が利用可能でない１つの例である。サトウダイコンのプロトプラストの形質転換に対する忌避性（ｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｃｅ）は、十分に文書化されている。例えば、国際特許出願ＷＯ９１／１３１５９号と Ｋ． Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １０ ３０９−３１４ （１９９２） を参照のこと。アグロバクテリウム仲介性の遺伝子導入に関して言えば、「サトウダイコンの忌避性は有名であり」、「トランスジェニックサトウダイコン植物の産生について報告された技術のほとんどで、それを開発した研究室の熟練技術が必要とされ、他者により容易には再現されないことが証明され（てき）た」。Ｆ． Ａ． Ｋｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． １１６， ９７−１０６ （１９９６）， Ｍ． Ｃ． Ｅｌｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ『植物におけるサイトカイニンの生理学及び生化学（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃｙｔｏｋｉｎｉｎｓ ｉｎ Ｐｌａｍｔｓ）』３２９−３３４頁（ＳＰＢ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｔｈｅ Ｈａｇｕｅ， １９９２）を引用；Ｋ． Ｌｉｎｄｓｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｂｏｔ． ４１， ５２９−５３６ （１９９０） ； 及び Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ ｅｔ ａｌ．， 同上。Ｋｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， の論文は、さらに、「第一選択の方法は・・・子葉を外植片系として使用するものであるが、これは表面的にしか説明されていない」と述べている。Ｋｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， 同上、Ｊ． Ｅ． Ｆｒｙ ｅｔ ａｌ．，『国際植物分子生物学会の第３回国際会議、抄録番号３８４』（Ｒ． Ｂ． Ｈａｌｌｉｃｋ 編、Ｔｕｓｃｏｎ，アリゾナ、アメリカ、１９９１）を引用。しかしながら。この方法でさえさして効率的ではなく、１例として、ある研究者は、１５，０００個の接種外植片から、いくつかのキメラを含む２１個のトランスジェニック苗条しか得られないと報告した。Ｕ． Ｓａｎｄｅｒ，『Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌ． からの形質転換』（学位論文、ハノーバー大学、ドイツ、１９９４）。Ｋｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， の論文そのものも、子葉節とカナマイシン選択技術を使用したサトウダイコンの形質転換頻度を０．９％と報告している。Ｋｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， 同上、１０３頁。
【０００６】
文献には、サトウダイコンの表皮細胞からのカルス産生に関して簡略な記述があり（Ｋｏｔｏｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｕｌｌ． ｏｆ ｔｈｅ Ｐｏｌｉｓｈ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ３２， １１−１２ （１９８４）； Ｋｏｔｏｗｓｋａ， Ｂｅｉｔｒ． Ｂｉｏｌ． Ｐｆｌａｎｚ． ６７， ２０９−２２３ （１９９２） を参照のこと）、いくつかの報告がサトウダイコン葉柄の表皮上での不定芽形成について記載している。例えば、Ｈａｒｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ２， ９３−１０２ （１９８３）； Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｆｌａｎｚ． １８２， ４８５−４９０ （１９８７） を参照のこと。しかしながら、これらの報告は、上記の方法を使用して形質転換されたサトウダイコン植物が再生され得ることの証拠を提示しない。
【０００７】
サトウダイコンのプロトプラストを（気孔の孔辺細胞を介して）使用するサトウダイコンの形質転換が報告されている。例えば、Ｒ． Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， １１３３−１１３８ （１９９６）； Ｒ． Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０７， １３７９−１３８６ （１９９５）； Ｒ． Ｓｅｖｅｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６， ８４３−８４６ （１９９８）； 及びヨーロッパ特許ＥＰ０７２３３９３Ｂ１を参照のこと。しかしながら、サトウダイコンの葉から単離されるプロトプラストは大きさと形態がまばらであり、供給源の組織内に生理学と細胞遺伝学の両レベルで高度の細胞不均質性が存在することを反映している。従って、プロトプラストを利用する形質転換技術には、特定の方法を開発した研究室の熟練技術が必要とされ、その結果はたやすく再現可能になるわけではない。
【０００８】
サトウダイコンのこれまでの形質転換技術は、どう見ても、外植片の供給源、植物の遺伝子型、及び、使用する選択条件にあまりに依存してきたので、高い効率の形質転換は、達成することがきわめて困難であった。例えば、Ｋ． Ｌｉｎｄｓｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ ４１， ５２９−５３６ （１９９０）； Ｋ． Ｌｉｎｄｓｅｙ ｅｔ ａｌ，「サトウダイコン（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌ．）の形質転換」、『農林業のバイオテクノロジー、２３巻、植物プロトプラストと遺伝子工学ＩＶ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． ２３， Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）』（Ｙ． Ｐ． Ｓ． Ｂａｊａｊ 編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， ベルリン、１９９３）を参照のこと。サトウダイコンは、温帯地方の重要な作物である。世界の糖消費量の３０％はサトウダイコンに由来する。従って、これまで形質転換へ抵抗してきたダイコンと他の植物へ適用され得る、簡単で高効率の形質転換法への継続的なニーズが存在する。
【０００９】
簡単で高効率の形質転換法が求められる、形質転換へ抵抗する他の植物には、様々な品種のカボチャが含まれる。ある研究では、種子から切除した子葉を使用する体細胞胚形成により、夏（栽培）カボチャの栽培変異植物が再生された。Ｃ． Ｇｏｎｓａｌｖｅｓ， ＨｏｒｔＳｃｉｅｎｃｅ ３０， １２９５−１２９７ （１９９５）。しかしながら、この方法の再生効率は、最初の外植片につき０．３の小植物体と計算された。同上。他の報告でも、トランスジェニックカボチャの産生が報告されているが、再生植物を得るために使用された形質転換法は、記載されていないか、又は一般的に利用可能ではない。例えば、Ｄ． Ｔｒｉｃｏｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３， １４５８−１４６５， １４６４ （１９９５） を参照のこと。
【００１０】
苗木の（非切除）茎頂又は切除した茎頂を使用する形質転換法が記載されている。Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ． への米国特許第５，１６４，３１０号（そのまま参照により本明細書に組み込まれる）；Ｐ． Ｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９１， １２１２−１２１８ （１９８９）； Ｆ． Ｊ． Ｌ． Ａｒａｇａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． １５８， １５７−１６３ （１９９７）； 及び Ｐ． Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ． ８， ２７５−２８１ （１９９２） を参照のこと。これらの方法では、茎頂は、形質転換の時点で苗木又は発芽種子へ付いたままであったか、苗木から切除された。後者の場合、最終的には、切除された茎頂につき１つの苗条だけが産生された。
【００１１】
茎頂から誘導される分裂組織培養物を使用する形質転換法も記載されている。例えば、Ｈ． Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ． への米国特許第５，７６７，３６８号（参照により本明細書に組み込まれる）；Ｈ． Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １１０， １０９７−１１０７ （１９９６）；及び Ｓ． Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １８， ９５９−９６６ （１９９９） を参照のこと。しかしながら、これらの方法は、ごくひと握りの単子葉植物（即ち、トウモロコシ、オオムギ、及びオート麦）でのみ有効であると示されていて、これらの方法を使用した形質転換の試みの後で成功裡に再生された形質転換双子葉植物はない。さらに、茎頂から誘導された分裂組織培養物を使用する単子葉植物の形質転換は、上記の文献に記載されるように、概して微小発射体ボンバードメントにより達成された（即ち、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ により仲介されるものではない）。
【００１２】
本発明者は、植物組織（例えば、人工培地上の茎頂や腋芽）から多苗条構造体（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｈｏｏｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を誘導し、多芽培養物（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｈｏｏｔ ｃｕｌｔｕｒｅ）を産生する方法を発見した。次いで、これらの多芽（マルチシュート）培養物を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ、ＤＮＡ被覆微小発射体を用いた高速ボンバードメント、又は他の既知の形質転換法で形質転換する。形質転換の後で、この多芽培養物を選択培地へ移し、形質転換細胞と非形質転換細胞へ分化させ得る。引き続き、再生培地、及び／又は根付け（ｒｏｏｔｉｎｇ）培地へ移すと、形質転換細胞から植物が再生される。本発明は、サトウダイコン、ヒマワリ、ダイズ、ワタ、ラッカセイ、メロン、スイカ、カボチャ、アブラナ属、タバコ、トマト、及びコショウを含む商業作物へ適用され得る。本発明は、通常は形質転換へ抵抗する植物を高い効率で形質転換するために使用され得るので、既存の方法に優るある利点を提供する。本発明はまた、植物、特に双子葉植物のプラスチドゲノムを形質転換するために使用される。
【００１３】
本発明は：
（ａ）形質転換へ抵抗する双子葉植物の組織を培養基で培養し、この組織から多芽培養物を産生する工程；（ｂ）この多芽培養物の細胞へ核酸を導入し、それによりこの核酸を含んでなる形質転換細胞を産生する工程；及び（ｃ）この形質転換細胞から形質転換植物を再生させる工程を含んでなる、形質転換された双子葉植物を産生する方法を提供する。組織は、好ましくは分裂組織であり、好ましくは、茎頂、腋芽、又は花の分裂組織から切除されるか、又は組織はカルス組織である。好ましい態様では、植物が、ウリ科か又はアカザ科のメンバーである。もう１つの好ましい態様では、植物が、サトウダイコン、ヒマワリ、ダイズ、ワタ、メロン、スイカ、及びカボチャからなる群から選択される。好ましくは、植物は、サトウダイコン、カボチャ、メロン、又はスイカである。もう１つの好ましい態様では、組織が植物の苗木の茎頂から切除される。もう１つの好ましい態様では、培養基が少なくとも１つの植物生長調節剤、好ましくはサイトカイニンを含む。もう１つの好ましい態様では、生長調節剤が、６−フルフリルアミノプリン（カイネチン）、６−ベンジル−アミノプリン（６−ＢＡＰ）、６−ジメチルアリルアミノ−プリン（２ｉｐ）、トランス−６−（４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エニル）アミノ−尿素（ゼアチン）、ＴＤＺ、ジベレリン酸（ＧＡ）、ＩＡＡ、ＮＡＡ、ジカンバ、２，３，５−Ｔ、及び２，４−Ｄからなる群から選択される。培養基中の生長調節剤の濃度は、好ましくは約０．０１ｍｇ／Ｌ〜約２５ｍｇ／Ｌの間、より好ましくは約０．０１ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌの間、より好ましくは約０．０１ｍｇ／Ｌ〜約５ｍｇ／Ｌの間、より好ましくは約０．０５ｍｇ／Ｌ〜約８ｍｇ／Ｌの間にある。もう１つの好ましい態様では、微粒子ボンバードメント、電気泳動、又はエレクトロポレーションによるか、又はアグロバクテリウム属に属する細菌を使用して、核酸が細胞へ導入される。もう１つの好ましい態様では、該核酸が、双子葉植物にとって異種である核酸を含む。好ましくは、該核酸は、ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコード化する遺伝子、ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）活性を有するポリペプチドをコード化する遺伝子、キシロースイソメラーゼ（ｘｙｌＡ）活性を有するポリペプチドをコード化する遺伝子、又はＧＵＳ活性を有するポリペプチドをコード化する遺伝子を含む。好ましくは、該核酸は、植物への異種遺伝子を含む核酸を含んでなるベクターである。
【００１４】
なおもう１つの好ましい態様では、本方法の工程（ｃ）が、形質転換細胞を含んでなる多芽培養物を選択する工程；この多芽培養物を苗条の伸長を促進する条件下で生長させ、少なくとも１つの形質転換苗条を産生する工程；及び、次いで、この少なくとも１つの形質転換苗条を成熟した形質転換植物へ生長させる工程を含む。好ましくは、この少なくとも１つの形質転換苗条は、根形成を促進する培地でこの少なくとも１つの形質転換苗条を生長させた後で、成熟した形質転換植物へ生長する。
【００１５】
なおもう１つの好ましい態様では、本方法の工程（ｃ）が、形質転換細胞を含んでなる多芽培養物を選択する工程；この多芽培養物を苗条の伸長を促進する条件下で生長させ、少なくとも１つの形質転換苗条を産生する工程；この少なくとも１つの形質転換苗条をクローン化する工程；及び、このクローン苗条（ｃｌｏｎｅｄ ｓｈｏｏｔ）を形質転換植物へ成熟させる工程を含む。好ましくは、このクローン苗条は、根形成を促進する培地でこのクローン苗条を生長させた後で、成熟した形質転換植物へ生長する。
【００１６】
さらに本発明は：
上記の方法のいずれでも産生される形質転換植物細胞、
上記の方法のいずれでも産生される多芽培養物、
上記の方法のいずれでも産生される形質転換植物を提供する。好ましい態様では、形質転換植物は、ＰＭＩ活性を有するポリペプチドを発現するカボチャ植物、メロン植物、又はスイカ植物である。もう１つの好ましい態様では、形質転換植物は、ＰＰＯ活性を有するポリペプチドを発現するサトウダイコン植物である。
【００１７】
さらに本発明は：
上記の形質転換植物により産生される種子（この種子は、多芽培養物へ形質転換される核酸を含む）と、その種子から生長される植物を提供する。
【００１８】
さらに本発明は：
（ａ）植物の組織を培養基で培養し、この組織から多芽培養物を産生する工程；
（ｂ）この多芽培養物の細胞のプラスチドゲノムへ核酸を導入し、それによりこの核酸を含んでなる前記細胞の形質転換プラスチドゲノムを産生する工程；及び
（ｃ）この形質転換細胞から形質転換植物を再生させる工程を含んでなる、形質転換プラスチドゲノムを含んでなる植物を産生する方法を提供する。好ましい態様では、組織が分裂組織であり、好ましくは、茎頂、腋芽、花の分裂組織、又は葉組織から切除されるか、又は、組織がカルス組織である。好ましい態様では、形質転換細胞が形質転換プラスチドゲノムについてホモプラスミー（ｈｏｍｏｐｌａｓｍｉｃ）である。もう１つの好ましい態様では、植物が形質転換プラスチドゲノムについてホモプラスミーである。もう１つの好ましい態様では、植物が双子葉植物である。好ましくは、植物は、ウリ科か又はアカザ科のメンバーである。もう１つの好ましい態様では、植物が、サトウダイコン、ヒマワリ、ダイズ、ワタ、ラッカセイ、メロン、スイカ、タバコ、トマト、カボチャ、アブラナ属、及びコショウからなる群から選択される。好ましくは、植物は、サトウダイコン、タバコ、及びトマトである。もう１つの好ましい態様では、組織が植物の苗木の茎頂から切除されるか、又はそれから導かれる。もう１つの好ましい態様では、培養基が少なくとも１つの植物生長調節剤、好ましくはサイトカイニンを含む。もう１つの好ましい態様では、生長調節剤が、６−フルフリルアミノプリン（カイネチン）、６−ベンジル−アミノプリン（６−ＢＡＰ）、６−ジメチルアリルアミノ−プリン（２ｉｐ）、トランス−６−（４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エニル）アミノ−尿素（ゼアチン）、ＴＤＺ、ジベレリン酸（ＧＡ）、ＩＡＡ、ＮＡＡ、ジカンバ、２，３，５−Ｔ、及び２，４−Ｄからなる群から選択される。好ましくは、培養基中の生長調節剤の濃度は、約０．０１ｍｇ／Ｌ〜約２５ｍｇ／Ｌの間、より好ましくは約０．０１ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌの間、より好ましくは約０．０１ｍｇ／Ｌ〜約５ｍｇ／Ｌの間、より好ましくは約０．０５ｍｇ／Ｌ〜約８ｍｇ／Ｌの間にある。核酸は、好ましくは、微粒子ボンバードメント、電気泳動、又はエレクトロポレーションにより細胞へ導入される。好ましくは、該核酸は、双子葉植物にとって異種である遺伝子を含む核酸を含んでなるベクターである。もう１つの好ましい態様では、本方法の工程（ｃ）が、形質転換細胞を含んでなる多芽培養物を選択する工程；この多芽培養物を苗条の伸長を促進する条件下で生長させ、少なくとも１つの形質転換苗条を産生する工程；及び、次いで、この少なくとも１つの形質転換苗条を成熟した形質転換植物へ生長させる工程を含む。好ましい態様では、この少なくとも１つの形質転換苗条が、根形成を促進する培地でこの少なくとも１つの形質転換苗条を生長させた後で、成熟した形質転換植物へ生長する。
【００１９】
もう１つの好ましい態様では、本方法の工程（ｃ）が、形質転換細胞を含んでなる多芽培養物を選択する工程；この多芽培養物を苗条の伸長を促進する条件下で生長させ、少なくとも１つの形質転換苗条を産生する工程；この少なくとも１つの形質転換苗条をクローン化する工程；及び、このクローン苗条を形質転換植物へ成熟させる工程を含む。好ましくは、このクローン苗条は、根形成を促進する培地でこのクローン苗条を生長させた後で、成熟した形質転換植物へ生長する。
【００２０】
さらに本発明は：
上記の方法のいずれでも産生される形質転換プラスチドゲノム、
上記の方法のいずれでも産生される形質転換プラスチドゲノムを含んでなるプラスチド、
上記の方法のいずれでも産生される形質転換植物細胞（好ましくは、この植物細胞は、形質転換プラスチドゲノムについてホモプラスミーである）、
上記の方法のいずれでも産生される多芽培養物、
上記の方法のいずれでも産生される形質転換植物（好ましくは、この植物は、形質転換プラスチドゲノムについてホモプラスミーである）を提供する。
【００２１】
さらに本発明は：
上記の形質転換植物により産生される種子（この種子は、多芽培養物へ形質転換される核酸を含む）と、その種子から生長される植物を提供する。
【００２２】
本発明の先述の側面と他の側面を以下に示す明細書で詳しく説明する。
以下に本発明を、本発明の好ましい態様が記載される、付帯の明細書に関連してより詳しく説明する。しかしながら、本発明は様々な形態で具体化され得るので、本発明を本明細書に示される態様に制限されるものと解釈してはならない。むしろ、これらの態様は、この開示が詳細で完全であるために提供され、当業者に対して本発明の範囲を十分に伝えるものである。本発明の記載において本明細書で使用される用語は、特定の態様を記載するためだけのものであって、本発明を制限するものではない。本発明の記載と付帯の特許請求項において使用されるように、単数形の不定冠詞（ａ，ａｎ）と定冠詞（ｔｈｅ）は、文脈が明瞭に他のことを明示しない場合は、複数形も含むものとする。
【００２３】
他に定義されなければ、本明細書で使用されるすべての技術及び科学の用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及される公表物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、いずれもそのまま参照により本明細書に組み込まれる。
【００２４】
他に示されなければ、クローン遺伝子、発現カセット、ベクター（例、プラスミド）、タンパク質、及びタンパク質フラグメント、並びに本発明により形質転換される細胞及び植物の産生には、標準的な方法が使用され得る。他に示されなければ、クローン遺伝子、発現カセット、ベクター（例、プラスミド）、タンパク質、及びタンパク質フラグメントの本発明による産生には、標準的な方法が使用され得る。そのような技術は当業者に知られている。例えば、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，『分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）第２版』（コールドスプリングハーバー・ラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、１９８９）と Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，『分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）』（ジェネラル・パブリッシング・アソシエーツ社、及びウィリー・インターサイエンス、ニューヨーク、１９９１）；Ｊ． Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，編『植物の遺伝的形質転換と遺伝子発現：実験マニュアル（Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）』（ブラックウェル・サイエンティフィック・パブリケーションズ、１９８８）；及び、Ｓ． Ｂ． Ｇｅｌｖｉｎ ＆ Ｒ． Ａ． Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ 編『植物における遺伝子の導入、発現、及び遺伝子産物の分析（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）』を参照のこと。
【００２５】
本発明の方法は、形質転換植物を産生するのに有用である。本発明の形質転換植物は、先ず植物組織を培養基で培養し、この組織から多芽培養物を産生することによって産生される。次いで、この多芽培養物の細胞へ核酸を導入し、それによりこの核酸を含んでなる形質転換細胞を産生する。最後に、この形質転換細胞から形質転換植物を再生させる。
【００２６】
本発明の好ましい態様では、形質転換される植物細胞が通常は形質転換へ抵抗する。特に好ましい態様では、形質転換される植物細胞が双子葉植物細胞であり、最も好ましくは、本明細書に定義されるような形質転換へ抵抗する双子葉植物細胞である。本明細書で使用される「植物細胞」若しくは「植物」には、植物全体、植物細胞、又は植物組織中の細胞下植物オルガネラ（即ち、プラスチド）、又は培養中の植物組織、植物細胞、植物細胞懸濁液、細胞下植物オルガネラ、及びプロトプラストが含まれる。植物組織には、植物の分化又は未分化の組織が含まれ、それには、限定されないが、根、苗条、葉、花粉、種子、腫瘍組織、配偶体、胞子体、小胞子、及び、単細胞、プロトプラスト、胚、及びカルス組織のような、培養中の様々な形態の細胞が含まれる。植物組織は、植物中にあるか、又は、器官、組織、又は細胞培養物の中にあり得る。
【００２７】
一般に、双子葉植物は開花植物であって、２つの子葉のある胚、網目状の葉脈のある葉、中心髄を囲む環にある幹の維管束を有する。上記に述べたように、本発明により形質転換され得る双子葉植物は、好ましくは、形質転換へ抵抗する双子葉植物である。一般に、形質転換へ抵抗する植物は、その細胞が今日知られている形質転換の方法（即ち、微小発射体ボンバードメント若しくは生物的（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）形質転換、アグロバクテリウム仲介性形質転換、エレクトロポレーション、電気泳動、等）により形質転換され得ないか、又はそのような方法により低い形質転換効率（即ち、１．０％未満、又は０．５％未満、さらには、０．１％未満）で形質転換されるものである。形質転換へ抵抗する植物はまた、その細胞、組織、プロトプラスト、又はカルスが既知の方法により形質転換され得ても、その形質転換された細胞、組織、プロトプラスト、又はカルスが成熟したトランスジェニック植物を再生し得ない植物である。
【００２８】
本発明の好ましい態様では、双子葉植物がウリ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）科のメンバーである。本発明のもう１つの好ましい態様では、双子葉植物がアカザ（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａ）科のメンバーである。より好ましい態様では、双子葉植物が Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ（即ち、サトウダイコン、飼料ダイコン、食用ダイコン、及びフダンソウ）、ヒマワリ、ダイズ、ワタ、ラッカセイ、メロン、スイカ、カボチャ、タバコ、トマト、アブラナ属、及びコショウからなる群から選択される。最も好ましい態様では、双子葉植物がサトウダイコン又はカボチャである。
【００２９】
本発明では、植物が、その植物由来の組織から多芽培養物をはじめに産生させることによって形質転換される。本明細書で使用されるように、「多芽培養物」という用語は、相互交換可能的に「外植片」を意味する場合もある。本発明で利用され得る組織には、限定されないが、分裂組織、根頂組織、茎頂組織（葉原基、頂部領域、腋領域、胚軸、及び子葉を含む）、苗木茎頂（分裂組織、葉身、葉柄、又は葉身−柄遷移帯組織を含み得る）、及びカルス組織が含まれる。好ましい態様では、多芽培養物を分裂組織から産生する組織が、茎頂、腋芽、又は花の分裂組織から切除される。
【００３０】
本発明の１つの態様では、はじめに、種子発芽培地で、好ましくは無菌培養下で種子を発芽させることによって、多芽培養物が入手され得る。種子発芽技術は当業者に知られている。本発明の好ましい態様では、種子発芽培地（ＧＭ）は、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ 及び Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）塩（シグマケミカルズ、セントルイス、Ｍｏ．から市販されている）を含む。ＧＭは、さらに、スクロースのような炭水化物源を含む場合があり、これは好ましい。この炭水化物源は、約２０〜４０ｇ／Ｌ（約２〜４（ｗ／ｖ）％）、好ましくは約３０ｇ／Ｌ（約３（ｗ／ｖ）％）の量で存在し得る。場合により、そして好ましくは、ＧＭは、Ｂ５ビタミン類、ミオイノシトール（１００ｍｇ）、パントテン酸、及びＰＨＹＴＡＧＥＬ（登録商標）（やはりシグマケミカルから入手可能）のような植物組織培養ゲル化剤を含み得る。サイトカイニン様機能（以下に記載される）のある植物生長調節剤もまた、（しかも好ましくは）この種子発芽培地へ加えてよい。サイトカイニン様機能のある好適な植物生長調節剤には、限定されないが、６−ベンジル−アミノプリン（６−ＢＡＰ若しくはＢＡ）、６−フルフリルアミノプリン（カイネチン）、６−ジメチルアリルアミノ−プリン（２ｉｐ）、トランス−６−（４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エニル）アミノ−尿素（ゼアチン）、等が含まれる。ＧＭでは、植物生長調節剤を、約０．５ｍｇ／Ｌ若しくは約０．１ｍｇ／Ｌ、又は約０．０５ｍｇ／Ｌほどに低いか、又はさらに低い濃度で加え得るか；他のやり方では、植物生長調節剤を、約１．０ｍｇ／Ｌ若しくは約２．０ｍｇ／Ｌ、又は約５ｍｇ／Ｌほどに高いか，又はさらに高い濃度で加え得る。カゼイン加水分解物、プロリン、及び／又はグルタミンの追加も有益であり得る。サトウダイコンのような双子葉作物では、２，３，５−トリヨード安息香酸（ＴＩＢＡ）のようなオーキシン阻害剤のＧＭへの追加が有益であり得る。
【００３１】
約７〜１４日で種子がＧＭ上で発芽した（即ち、苗木になった）後で、この苗木の茎頂を切除し、本明細書で苗条増殖培地（ｓｈｏｏｔ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ： ＳＭＭ）と呼ばれる培養基で培養（即ち、プレート培養）する。好ましくは、茎頂は、頂及び腋の分裂領域、葉原基、３〜４ｍｍの胚軸、及び子葉を含み、短く摘み取ってさらなる伸長を抑制し得る。当然ながら、多芽培養物を産生するために本発明で使用される他の植物組織もＳＭＭでプレート培養され得る。本発明の好ましい態様では、ＳＭＭが、ＭＳ塩、炭水化物源（好ましくはスクロース）、Ｂ５ビタミン類、及びＰＨＹＴＡＧＥＬ（登録商標）のようなゲル化剤を含む。さらに、ＳＭＭは、ＢＡ、カイネチン、２ｉｐ、ゼアチン、等のような少なくとも１つのサイトカイニン様生長調節剤を含有する。ＢＡは、サトウダイコンや他の双子葉品種の頂若しくは腋の分裂組織から、スクロース含有培地で苗条分裂組織培養物を誘導するのに好ましい生長調節剤である。サイトカイニン様生長調節剤は、約２．０ｍｇ／Ｌ、又は約１．０ｍｇ／Ｌ、又は約０．０５ｍｇ／Ｌ、又は約０．０１ｍｇ／Ｌほどに低いか、又はさらに低い濃度でＳＭＭに存在し得るか；他のやり方では、サイトカイニン様生長調節剤は、約５．０ｍｇ／Ｌ、又は約８．０ｍｇ／Ｌ、又は１０ｍｇ／Ｌ、又は約２５ｍｇ／Ｌ、又は約１００ｍｇ／Ｌほどに高いか、又はさらに高い濃度で存在し得る。１つの態様では、サイトカイニン様生長調節剤は、約０．０５ｍｇ／Ｌ〜約２５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇ／Ｌ、そして最も好ましくは約０．５ｍｇ／Ｌ〜約８ｍｇ／ＬでＳＭＭに存在する。苗条分裂組織培養物を誘導するために、追加の生長調節剤をＳＭＭへ加えてよい。そのような生長調節剤には、ジベレリン酸（ＧＡ）と、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）、α−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、チジアツロン（ＴＤＺ）、３，６−ジクロロ−ｏ−アニシン酸（ＤＩＣＡＭＢＡ）、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸（２，４，５−Ｔ）、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）のようなオーキシン様機能のある調節剤、及び、当業者に知られた他の生長調節剤が含まれる。
【００３２】
ＳＭＭで生長する多芽培養物を、１５〜３５℃の温度の明／暗条件下で培養し、好ましくは、約２０℃の温度、約１２〜１６時間の日長で、低い光度（約１０〜約３０μアインシュタイン）下に培養する。約４〜６週後、多芽培養物は密集ロゼットに似たものとなり、形質転換への準備ができている。
【００３３】
多芽培養物は、多くの形質転換法のいずれでも形質転換され得る。本明細書で使用されるように、「形質転換」という用語は、核酸セグメント、一般的には、異種の核酸配列若しくは遺伝子を、それまではその遺伝子を含有していなかった植物、植物組織、植物オルガネラ（即ち、プラスチド、又は葉緑体）、又は植物細胞へ安定的に導入することを意味する。好ましくは、形質転換は、その核酸配列の、植物のゲノムへの安定した組込みをもたらす。本明細書で使用されるように、「ゲノム」という用語には、核ゲノム、プラスチドゲノム、及びミトコンドリアゲノムが含まれる。
【００３４】
本発明の発明者はまた、多芽培養物の細胞に多量のプラスチドが存在していることを発見した。従って、そのような培養物は、プラスチド形質転換のための興味深い標的組織を提供する。従って、他の好ましい態様では、本発明の方法が、植物細胞のプラスチドゲノムを形質転換するために使用される。好ましくは、双子葉植物細胞のプラスチドゲノムが本発明の方法を使用して形質転換される。もう１つの好ましい態様では、通常は形質転換へ抵抗する双子葉植物細胞のプラスチドゲノムが本発明の方法を使用して形質転換される。
【００３５】
プラスチド形質転換の主たる利点は、一般に、プラスチドが実質的な修飾のない細菌遺伝子を発現し得ること、そして、プラスチドが単一のプロモーターの制御下で多数のオープンリーディングフレームを発現し得ることである。プラスチド形質転換の技術は、米国特許第５，４５１，５１３号；５，５４５，８１７号；及び５，５４５，８１８号；ＰＣＴ出願ＷＯ９５／１６７８３号；及び、ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１， ７３０１−７３０５ （１９９４） に記載されている。葉緑体の形質転換の基本技術は、例えば、生物的（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）形質転換や、塩化カルシウム若しくはＰＥＧ仲介性形質転換のような他のプロトプラスト形質転換法を使用して、選択マーカーに隣接するクローン化プラスチドＤＮＡの領域を注目の遺伝子と一緒に好適な標的組織へ導入することを伴う。標的指向配列と呼ばれる、１〜１．５ｋｂの隣接領域によりプラスチドゲノムとの相同的組換えが促進され、これによりプラストムの特定領域の置換若しくは修飾が可能になる。はじめは、スペクチノマイシン及び／又はストレプトマイシンへの抵抗性を与える葉緑体の１６Ｓ ｒＲＮＡ及びｒｐｓ１２の遺伝子における点突然変異が、形質転換の選択マーカーとして利用された。Ｚ． Ｓｖａｂ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７， ８５２６−８５３０ （１９９０） 及び Ｊ． Ｍ． Ｓｔａｕｂ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４， ３９−４５ （１９９２） を参照のこと。これらマーカー間にクローニング部位が存在することで、外来遺伝子の導入のためのプラスチド標的指向ベクターの創出が可能になった。Ｊ． Ｍ． Ｓｔａｕｂ， ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １２， ６０１−６０６ （１９９３） を参照のこと。劣性ｒＲＮＡ若しくはｒ−タンパク質の抗生物質耐性遺伝子を、優性選択マーカーであるスペクチノマイシン解毒酵素のアミノグリコシド−３’−アデニルトランスフェラーゼをコード化する細菌ａａｄＡ遺伝子で置き換えることにより、形質転換効率の実質的な増加が得られる。Ｚ． Ｓｖａｂ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０， ９１３−９１７ （１９９３） を参照のこと。このマーカーは、かつて緑藻 Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ のプラスチドゲノムの高頻度形質転換に成功裡に使用された。Ｍ． Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ−Ｃｌｅｒｍｏｎｔ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９， ４０８３−４０８９ （１９９１）。プラスチド形質転換に有用な他の選択マーカーが当技術分野で知られている。プラスチドの発現では、それぞれの植物細胞に存在する環状プラスチドゲノムの数千コピーへ遺伝子が相同的組換えにより挿入されるので、これは核発現遺伝子よりずっとコピー数が多いという利点があり、可溶性の全植物タンパク質の１０％を容易に超え得る発現レベルが可能になる。本発明の好ましい態様では、注目のヌクレオチド配列がプラスチドの標的指向ベクターへ挿入され、所望される植物宿主のプラスチドゲノムへ形質転換される。好ましくは、注目のヌクレオチド配列を含有するプラスチドゲノムについてホモプラスミーな植物が得られ、そのヌクレオチド配列の高発現が選好的に可能になる。
【００３６】
「異種」という用語は、本明細書では、現下の宿主に関して異なる天然の起源（即ち、異なる種に由来するか、又は同種に由来するが、染色体の位置、配向、又はコピー数が異なる）を有する核酸配列（例、遺伝子）又はタンパク質を明示するために使用される。「異種」はまた、あるタンパク質に存在する１つ以上のドメインが、存在する他のドメインに関して、その天然起源において異なることを明示するためにも使用される。本明細書で使用される「核酸」という用語は、一緒に共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は概してホスホジエステル結合を含有するが、ある場合には、他の骨格を有し得る核酸類似体が含まれる。さらに、天然に存在する核酸及び類似体と非天然に存在する核酸及び類似体の混合物が使用され得る。核酸は、特定されるように、一本鎖又は二本鎖であり得るか、又は二本鎖若しくは一本鎖の配列の両方の部分を含有し得る。核酸は、ＤＮＡ（ゲノム及びｃＤＮＡ）、ＲＮＡ、又はハイブリッドであり得て、ここで核酸はデオキシリボ−及びリボ−ヌクレオチドの任意の組合せと、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン、等を含む、塩基の任意の組合せを含有する。
【００３７】
ある一定の植物種、又は特定タイプの植物組織について使用される形質転換法は、既知の方法に基づいて当業者により決定されるような最も適正な方法に依存する。外来遺伝子を植物細胞へ安定的に挿入し、修飾された細胞を操作するための新規な手段が開発されているので、当業者は、既知の方法から選択し、所望される結果を達成することができる。本発明の実施に有用な既知の形質転換技術には、限定されないが、微粒子ボンバードメント（Ｓａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ． への米国特許第４，９４５，０５０号、及び ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６， ９２３−９２６）；直接ＤＮＡ取込み（Ｊ． Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ３， ２７１７ （１９８４））；エレクトロポレーション（Ｍ． Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２， ５８２４ （１９８５））；マイクロインジェクション（Ａ． Ｃｒｏｓｓｗａｙ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２０２， １７９ （１９８６））；及び、アグロバクテリウム仲介性の植物組織への遺伝子導入が含まれる。本発明では、微粒子ボンバードメントとアグロバクテリウム仲介性形質転換の技術が好ましく、アグロバクテリウム仲介性遺伝子導入が最も好ましい。
【００３８】
アグロバクテリウム仲介性遺伝子導入では、ＤＮＡを植物染色体へ導入する、細菌 Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 及び Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ の天然の能力が巧みに利用される。アグロバクテリウムは植物病原体であり、Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 及び Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ のそれぞれＴｉ及びＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡと呼ばれる領域でコード化される一組の遺伝子を植物細胞へ導入する。Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ を使用する形質転換は、Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ のそれに類似して開発された。Ｒｙａｌｓ ｅｔ ａｌ． への米国特許第５，７７７，２００号を参照のこと（この開示内容はそのまま参照により本明細書に組み込まれる）。Ｔｉプラスミドの導入の典型的な結果は、Ｔ−ＤＮＡが宿主染色体へ安定的に組込まれている、クラウンガールと呼ばれる腫瘍性の増殖である。Ｒｉプラスミドの宿主染色体ＤＮＡへの組込みは、「毛根（ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔ）病」として知られる状態をもたらす。宿主植物に疾患を引き起こす能力は、ＤＮＡの導入及び組込みを失うことなく、Ｔ−ＤＮＡ中の該遺伝子を欠失させることにより除去され得る。形質転換の目的のために植物細胞へデリバリーされるべき核酸（即ち、異種遺伝子）は、組込まれるＴ−ＤＮＡの終点を規定するボーダー配列へ付けられる。
【００３９】
植物を形質転換するのに適した任意のアグロバクテリウムのベクター若しくはベクター系を、本発明に従って利用され得る。多様なアグロバクテリウム株が当技術分野で知られていて、本発明の方法に使用され得る。代表的なアグロバクテリウムベクター系は、Ｇ． Ａｎ， ｅｔ ａｌ． ＥＭＢＯ Ｊ． ４， ２７７ （１９８５）； Ｌ． Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３０３， ２０９ （１９８３）； Ｌ． Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ２， ９８７ （１９８３）； Ｌ． Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，『植物の遺伝子工学（Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）』（ケンブリッジ・ユニバーシティ・プレス、ニューヨーク、６３頁（１９８５）； Ｈｏｏｙｋａａｓ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １３， ３２７ （１９８９）； Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５， ３０２ （１９９５）； Ｃｈｉｌｔｏｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０， ３１１９ （１９９３）； Ｍｏｌｌｏｎｙ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． ＮＹ １９， １４８ （１９９３）； Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４， ７４５ （１９９６）； 及び Ｋｏｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １０， １６５ （１９９６） に記載されていて、これらの開示内容はそのまま参照により本明細書に組み込まれる。
【００４０】
アグロバクテリウムのＴ−領域だけでなく、Ｔｉ（又はＲｉ）プラスミドはｖｉｒ領域を含有する。ｖｉｒ領域は効率的な形質転換にとって重要であり、種特異的であるらしい。例えば、異種ＤＮＡとｖｉｒ機能を担う操作されたアームのない（ｄｉｓａｒｍｅｄ）Ｔ−ＤＮＡが分離したプラスミドに存在する、バイナリーベクター系が開発されている。換言すると、注目の異種核酸配列（即ち、遺伝子若しくは遺伝子群）と隣接Ｔ−ＤＮＡを、ｖｉｒ領域が欠落したバイナリーウイルスにより運ぶことができる。次いで、このｖｉｒ領域が、アームのないＴｉ−プラスミド上か、又は第二のバイナリープラスミド上に提供される。このやり方では、異種ＤＮＡを含んでなる修飾されたＴ−ＤＮＡ領域が小さなプラスミド中に構築され、これが大腸菌中で複製する。このプラスミドを、三親（ｔｒｉ−ｐａｒｅｎｔａｌ）交配かエレクトロポレーションにより、毒性（ビルレンス）遺伝子配列のある適合プラスミドを含有する Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ へ共役的に導入する。ｖｉｒ機能がトランスで供給され、Ｔ−ＤＮＡが植物ゲノムへ導入される。もう１つの代替法では、異種核酸配列とＴ−ＤＮＡボーダー配列が、二重組換え事象を介してＴｉ−プラスミドのＴ−ＤＮＡ部位へ入れられ、それにより本来のＴｉ−プラスミドＴ−ＤＮＡが新たなＴ−ＤＮＡに置き換えられる。ｖｉｒ領域は、Ｔｉ−プラスミドによるか、又はバイナリープラスミド上に提供され得る。さらなる代替法では、異種核酸配列と隣接Ｔ−ＤＮＡが、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ ｅｔ ａｌ． への米国特許第４，９４０，８３８号に記載されるように細菌染色体へ組込まれてから、ｖｉｒ領域がＴｉ−プラスミド又はバイナリープラスミド上に供給され得る。本明細書で記載されるバイナリーベクターが本発明の実施において使用され得て、好ましい。
【００４１】
他のやり方では、本発明の他の態様では、スーパーバイナリー又は「スーパービルレント（超毒性）」アグロバクテリウムベクターがアグロバクテリウム溶液中で利用される。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５９１，６１５号及びＥＰ０６０４６６２号を参照のこと。きわめて高い形質転換効率を示すスーパービルレント Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ａ２８１に含まれる、ＴｉプラスミドｐＴｉＢｏ５４２（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６９， ４４１７ （１９８７））のハイパービルレンス領域から由来するＤＮＡ領域を含有する、そのようなスーパーバイナリーベクターが構築された（Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２， ７０２ （１９８４）； Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６８， １２８３ （１９８６）； Ｋｏｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６６， ８８ （１９８６）； Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６９， ４４１７ （１９８７）； Ｋｏｍａｒｉ， Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６０， ２２３ （１９８７）； ＡＴＣＣ受入れ番号：３７３９４）。
【００４２】
当業者に知られている代表的なスーパーバイナリーベクターには、ｐＴＯＫ１６２（参照により本明細書に組み込まれる、日本特許出願（公開）４−２２２５２７号、ヨーロッパ特許出願ＥＰ５０４，８６９及びＥＰ６０４、６６２、及び米国特許第５，５９１，６１６号を参照のこと）とｐＴＯＫ２３３（Ｋｏｍａｒｉ， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９， ３０３ （１９９０）， 及び Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， ７４５ （１９９６）； 参照により本明細書に組み込まれる）が含まれる。上記の参考文献に説明される方法により他のスーパーバイナリーベクターを構築し得る。スーパーバイナリーベクターのｐＴＯＫ１６２は、大腸菌と Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ の両方で複製が可能である。さらに、このベクターは、ｐＴｉＢｏ５４２のビルレンス領域に由来するｖｉｒＢ、ｖｉｒＣ、及びｖｉｒＧ遺伝子を含有する。このプラスミドはまた、抗生物質耐性遺伝子、選択マーカー遺伝子、及び、所望されるならば、植物へ形質転換される注目の核酸を含有する。ｐＴＯＫ１６２について上記に記載される特徴を有する、本発明のスーパーバイナリーベクターを構築し得る。本発明で使用されるスーパーバイナリーベクターと他のベクターのＴ−領域は、例えば、植物へデリバリーされる異種遺伝子の挿入のための制限部位を有するように構築され得る。他のやり方では、形質転換される異種核酸が、ｉｎ ｖｉｖｏ 相同的組換えを利用することによってベクターのＴ−ＤＮＡ領域に挿入され得る。Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｅｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ２， ９８７ （１９８３）； Ｈｏｒｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３， ４９６ （１９８４） を参照のこと。そのような相同的組換えは、スーパーバイナリーベクターがｐＢＲ３２２又は他の類似プラスミドの領域と相同の領域を有するという事実に依拠する。従って、２つのプラスミドが一緒になると、相同領域を介した遺伝的組換えによりスーパーバイナリーベクターの中へ所望される遺伝子が挿入される。
【００４３】
好ましくは、本発明の方法で利用されるアグロバクテリウムベクター及びベクター系は、組換え核酸技術により、形質転換細胞で発現される異種核酸（例えば、注目の遺伝子若しくは遺伝子群）を含有するように修飾される。
【００４４】
「発現」は、構造異種核酸が転写及び翻訳されてコード化タンパク質を産生することを意味する。発現はまた、例えばアンチセンス構築体の場合のように、転写だけを意味する場合もある。発現される異種核酸は、好ましくはＴ−領域へ組込まれ、アグロバクテリウムベクターのＴ−ＤＮＡボーダー配列がそれに隣接する。
【００４５】
コーディング配列だけでなく、本発明のベクターはまた、場合により、異種核酸の転写及び翻訳に有用であるか又は必要な調節配列を含む場合がある。そのような調節配列の例には、限定されないが、（プロモーターを含む）転写開始領域、エンハンサー、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’及び３’非コーディング領域（即ち、５’リーダー配列）、ターミネーター配列、及び、当業者に知られた他の調節要素が含まれる。本発明に使用される修飾ベクターを創製するために使用され得る一般的な分子生物学の技術は、当業者によく知られている。
【００４６】
形質転換後に発現される核酸は、好ましくは、好適なプロモーター配列の制御下に置かれる。「プロモーター」という用語は、転写の開始を指令する、構造遺伝子若しくはコーディング配列の５’末端にあるヌクレオチド配列を意味する。本明細書で使用されるように、「機能的に連結している」という用語は、ＤＮＡコーディング領域の転写がプロモーターにより制御及び調節されるようなやり方で、そのプロモーターがＤＮＡコーディング領域へ連結していることを意味する。プロモーターをコーディング領域へ機能的に連結させる手段は当技術分野でよく知られている。
【００４７】
植物における発現では、宿主細胞に適したプロモーターが選択されなければならないが、プロモーターの選択は、当業者の技量の範囲内にある。本発明の実施に有用なプロモーターには、限定されないが、構成的、誘導的、一時調節的、発生調節的、化学調節的、組織選好的、及び組織特異的なプロモーターが含まれる。
【００４８】
数多くのプロモーターについて、植物細胞でのＲＮＡの転写を促進することが知られているか又は見出されていて、本発明のＤＮＡ構築体において使用され得る。好適なプロモーターの例には、ノパリン（ｎｏｐａｌｉｎｅ）シンターゼ（ＮＯＳ）及びオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）のプロモーター、リブロースビスリン酸カルボキシラーゼプロモーターの小サブユニット由来の光誘導プロモーター、ＣａＭＶ ３５Ｓ及び１９Ｓプロモーター、Ｆｉｇｗｏｒｔモザイクウイルス由来の完全長転写物プロモーター、ヒストンプロモーター、チューブリンプロモーター、又はマンノピンシンターゼプロモーター（ＭＡＳ）が含まれる。プロモーターはまた、葉、幹、根、又は分裂組織のような特定の組織において選好的な発現を引き起こすものでもあるか、又はプロモーターは、光、熱ストレス、水分ストレス、又は植物による化学品の適用若しくは産生により誘導され得る。代表的な葉緑組織特異的なプロモーターには、トウモロコシのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）プロモーター、小サブユニットリブロースビス−カルボキシラーゼプロモーター（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）、及び葉緑素ａ／ｂ結合タンパク質のプロモーターが含まれる。
【００４９】
本発明に有用なさらなるプロモーターには、限定されないが、ほとんどの細胞型で発現されることが知られている、いくつかのアクチン遺伝子（例えば、イネ（ｒｉｃｅ）アクチン）の１つが含まれる。本発明の実施に有用なさらにもう１つの構成プロモーターは、多くの細胞型で蓄積することが知られているもう１つの遺伝子産物である、ユビキノンから導かれる。このユビキノンプロモーターは、トランスジェニック植物での使用のためにいくつかの種からクローン化された（例えば、ヒマワリ（Ｂｉｎｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ７９： ８７−９４ （１９９１）；及びトウモロコシ（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． １２， ６１９−６３２））。他の有用なプロモーターは、トウモロコシ由来のＵ２及びＵ５ ｓｎＲＮＡプロモーター（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７， ８９９１ （１９８９））とアルコールデヒドロゲナーゼ由来のプロモーター（Ｄｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２， ３９８３ （１９８４））である。本発明に有用な、植物の組織特異的若しくは組織選好的プロモーターは、根、髄、葉、又は花粉における発現を指令するものである。そのようなプロモーターが、（そのまま参照により本明細書に組み込まれる）米国特許第５，６２５，１３６号に開示されている。また有用であるのは、Ｓｃｈｅｒｎｔｈａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ７： １２４９ （１９８８） により開示されるような、種子特異的な発現をもたらすプロモーター；葯特異的プロモーターのａｎｔ３２及びａｎｔ４３Ｄ；葯（タペート組織）特異的プロモーターのＢ６（Ｈｕｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １７Ｂ， 抄録＃Ｄ２０９ （１９９３））；及び、修飾されたＳ１３プロモーターのような雌しべ特異的プロモーター（Ｄｚｅｌｋａｌｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ５， ８５５ （１９９３））である。
【００５０】
他の植物プロモーターが、好ましくは植物又は植物ウイルスから入手され得て、選択されるプロモーターが植物において十分な発現を引き起こし、所望されるタンパク質の有効量の産生をもたらす限りにおいて利用され得る。本発明の好ましい態様では、プロモーターがイネアクチン−１プロモーターである。
【００５１】
植物で発現されることが所望される任意の異種遺伝子若しくは核酸が本発明での形質転換に適していて、本発明の方法に使用され得る。本発明の植物において形質転換されて発現される異種遺伝子には、限定されないが、病気への耐性をコード化する遺伝子、昆虫への耐性をコード化する遺伝子、栄養価を与える遺伝子、抗真菌、抗菌、又は抗ウイルス活性を与える遺伝子、除草剤への耐性を与える遺伝子、改善された植物若しくは栄養の形質を与える遺伝子、等が含まれる。他のやり方では、治療用（例えば、獣医学若しくは医療上の使用）若しくは免疫原性（例えば、予防接種用）ペプチド及びタンパク質が本発明の方法により形質転換される植物で発現され得る。
【００５２】
構造遺伝子の発現が好ましい。本明細書で使用されるように、「構造遺伝子」は、タンパク質、ポリペプチド、又はそれらの一部をコード化するＤＮＡセグメントを含んでなり、転写の開始を推進する５’配列を含まない遺伝子の部分である。構造遺伝子は、細胞に通常見出されるものであるか、又はそれが導入される細胞の場所には通常見出されない（即ち、異種遺伝子である）ものであり得る。異種遺伝子は，細菌のゲノム若しくはエピソーム、真核、核、又はプラスミドのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡを含む、当技術分野で知られた任意の供給源から全体的若しくは部分的に誘導され得る。構造遺伝子は、コーディング領域又は非翻訳領域のいずれかに１つ以上の修飾を含有する場合があり、それにより発現産物の生物学的活性若しくは化学構造、発現の速度、又は発現制御のやり方が影響され得る。そのような修飾には、限定されないが、１つ以上のヌクレオチドの突然変異、挿入、欠失、及び置換が含まれる。構造遺伝子は、中断されないコーディング配列を構成し得るか、又は、適正なスプライス連結部により連結される１つ以上のイントロンを包含する場合がある。構造遺伝子は、天然に存在するか又は合成のいずれか、又は両方である複数の供給源から誘導されるセグメントの複合体であり得る。宿主細胞における改善された発現のために遺伝子を合成する場合、遺伝子のコドン使用の頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用の頻度に近似するように遺伝子を設計することが望ましい。
【００５３】
同様に、本発明の方法は、植物において遺伝子発現を制御する核酸を導入するために使用され得る。例えば、導入される核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコード化し得る。他のやり方では、本発明の植物が、化学合成や他の産業目的のために酵素経路を再生させる１つ以上の遺伝子で形質転換され得る。本発明に有用な異種核酸は、天然に存在し得て、原核生物若しくは真核生物（例、細菌、真菌、酵母、ウイルス、植物、昆虫、及び哺乳動物）から得られる場合があるか、又はこの核酸は、全体的若しくは部分的に合成され得る。
【００５４】
本発明の好ましい態様では、双子葉多芽培養物へデリバリーされるか又は形質転換される異種核酸若しくは遺伝子が、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）活性を有するポリペプチドをコード化する。例えば、米国特許第５，７６７，３７３号；５，９３９，６０２号；６，０２３，０１２号；及び６，０８４，１５５号を参照のこと（この開示内容はそのまま参照により本明細書に組み込まれる）。もう１つの好ましい態様では、双子葉多芽培養物へデリバリーされるか又は形質転換される核酸若しくは遺伝子が、ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）活性を有するポリペプチドをコード化する。例えば、米国特許第５，７６７，３７８号及び５，９９４，６２９号を参照のこと（この開示内容はそのまま参照により本明細書に組み込まれる）。さらにもう１つの好ましい態様では、双子葉多芽培養物へデリバリーされるか又は形質転換される核酸若しくは遺伝子が、キシロースイソメラーゼ（ｘｙｌＡ）活性を有するポリペプチドをコード化する。なおもう１つの好ましい態様では、双子葉多芽培養物へデリバリーされるか又は形質転換される核酸若しくは遺伝子が、ＧＵＳ活性を有するポリペプチドをコード化する。
【００５５】
上記に列挙した方法のいずれかによる、レシピエントの細胞、プラスチド、及び／又は植物への異種核酸のデリバリーをした後で、さらなる培養と植物再生のために、異種遺伝子の成功又は亢進した発現を示す細胞及び植物を、概して１つ以上のスクリーニング方法により同定する。
【００５６】
一般に、「スクリーニング」は、植物へ形質転換された異種遺伝子の発現を示す細胞及び／又は植物を同定することを意味する。通常、スクリーニングは、さらなる培養と植物再生のために（即ち、トランスジェニック植物の産生のために）、成功裡に形質転換された種子（即ち、トランスジェニック種子）を選択するために行われる。形質転換体を同定する能力を高めるために、通常、選択可能若しくはスクリーン可能なマーカー遺伝子が注目の異種遺伝子と一緒に植物へ形質転換される。そのような場合、細胞、種子、植物、又は苗木を選択薬剤（群）へ曝露することによって、潜在的に形質転換された細胞、種子、又は植物がアッセイされる。例えば、マンノース又は抗生物質（例、ハイグロマイシン、カナマイシン、又はパラモマイシン）のような選択剤を含有する培地で種子若しくは苗木を生長させることのような選択条件の下で、トランスジェニック細胞、種子、又は植物が候補選択（スクリーン）され得て、成功裡に形質転換された植物は、そのような選択剤への耐性をコード化する遺伝子で形質転換されている。他のやり方では、他の方法（例、除草剤耐性遺伝子で形質転換した植物をＰＰＯ阻害剤（上記参照）又はＢＡＳＴＡ（登録商標）のような除草剤へ曝露すること）が、細胞、種子、植物、又は植物の組織を所望されるマーカー遺伝子について候補選択するために使用される。他のやり方では、例えばホスホマンノース（ＰＭＩ）活性を有するポリペプチドをコード化する核酸を用いたポジティブ選択法が使用される。本発明の好ましい態様では、形質転換された多芽培養物を、抗生物質及び／又はマンノースを含んでなる植物生育培地で生長させることによって、形質転換細胞を選択する。
【００５７】
形質転換体を同定する能力を高めるために、発現される注目の核酸配列としてか、又はそれに加えて選択可能若しくはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を利用することが望まれる場合がある。「マーカー遺伝子」は、そのマーカー遺伝子を発現する細胞へ独自の表現型を与える遺伝子であり、そのような形質転換細胞がそのマーカーを有さない細胞から識別されることを可能にする。そのような遺伝子は、化学的手段により、即ち、選択剤（例、除草剤、抗生物質、等）の使用により「選択」し得る形質をそのマーカーが与えるかどうか、又は、それが観察若しくは検査により、即ち、「スクリーニング」により同定され得る形質（例、Ｒ−遺伝子座の形質）そのものであるかどうかに依存して、選択可能マーカーかスクリーニング可能マーカーのいずれか一方をコード化し得る。好適なマーカー遺伝子の多くの例が当技術分野で知られていて、本発明の実施に利用され得る。選択マーカー遺伝子は、形質転換細胞により発現される唯一の異種遺伝子であり得るか、又は形質転換細胞へ形質転換されて発現される別の異種遺伝子とともに発現され得る。選択マーカー遺伝子は、形質転換された細胞若しくは組織の同定及び選択に利用される。選択マーカー遺伝子には、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコード化するような、抗生物質耐性をコード化する遺伝子、並びに除草性化合物への耐性を与える遺伝子が含まれる。除草剤耐性遺伝子は、概して、除草剤へ反応しない修飾された標的タンパク質か、又は除草剤が作用し得る前にそれを植物中で分解するか又は解毒する酵素をコードする。ＤｅＢｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ６， ２５１３ （１９８７）； ＤｅＢｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９１， ６９１ （１９８９）； Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８， ８３３ （１９９０）； Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２， ６０３ （１９９０） を参照のこと。例えば、グリリン酸（ｇｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）若しくはスルホニル尿素除草剤への耐性は、突然変異体の標的酵素である５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）及びアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）をコード化する遺伝子を使用して得られた。グルホシン酸アンモニウム、ボロモキシニル、及び２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）への耐性は、それぞれの除草剤を解毒する、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ、ニトリラーゼ、又は２，４−ジクロロフェノキシ酢酸モノオキシゲナーゼをコード化する細菌遺伝子を使用して得られた。選択マーカー遺伝子には、限定されないが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， ＣＲＣ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４， １ （１９８６））；シアナミドヒドラターゼ（Ｍａｉｅｒ−Ｇｒｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８， ４２５０ （１９９１））；アスパラギン酸キナーゼ；ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（Ｐｅｒｌ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１， ７１５ （１９９３））；ｂａｒ遺伝子（Ｔｏｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １００， １５０３ （１９９２）； Ｍｅａｇｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｏｐ． Ｓｃｉ． ３６， １３６７ （１９９６））；トリプトファンデカルボキシラーゼ（Ｇｏｄｄｉｊｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２， ９０７ （１９９３））；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＥＯ； Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎ． １， ３２７ （１９８２））；ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ又はＨＹＧ；Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ６， １０７４ （１９８６））；ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）；ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＤｅＢｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ６， ２５１３ （１９８７））；２，２−ジクロロプロピオン酸デハロゲナーゼ（Ｂｕｃｈａｎａｎ−Ｗｏｌｌａｔｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３Ｄ， ３３０ （１９８９））；アセトヒドロキシ酸シンターゼ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ． への米国特許第４，７６１，３７３号；Ｈａｕｇｈｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２２１， ２６６ （１９８８））；５−エノールピルビルシキミ酸−リン酸シンターゼ（ａｒｏＡ；Ｃｏｍａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１７， ７４１ （１９８５））；ハロアリールニトリラーゼ（Ｓｔａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ． へのＷＯ８７／０４１８１）；アセチル−補酵素Ａカルボキシラーゼ（Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９２， １２２０ （１９９０））；ジヒドロプテリン酸シンターゼ（ｓｕｌＩ；Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５， １２７ （１９９０））；及び３２ｋＤａフォトシステムＩＩポリペプチド（ｐｓｂＡ；Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２， １３４６ （１９８３））をコード化する遺伝子が含まれる。
【００５８】
さらに含まれるのは、クロラムフェニコール（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ２， ９８７ （１９８３））；メトトレキセート（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３０３， ２０９ （１９８３）； Ｍｅｉｊｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １６， ８０７ （１９９１））；ハイグロマイシン（Ｗａｌｄｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５， １０３ （１９８５）； Ｚｈｉｊｉａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １０８， ２１９ （１９８５）； Ｍｅｉｊｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １６， ８０７ （１９９１））；ストレプトマイシン（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２１０， ８６ （１９８７））；スペクチノマイシン（Ｂｒｅｔａｇｎｅ−Ｓａｇｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ． ５， １３１ （１９９６））；ブレオマイシン（Ｈｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ７， １７１ （１９８６））；スルホンアミド（Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． １５， １２７ （１９９０））；ブロモキシニル（Ｓｔａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２， ４１９ （１９８８））；２，４−Ｄ（Ｓｔｒｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７， ８１１ （１９８９））；ホスフィノトリシン（ＤｅＢｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ６， ２５１３ （１９８７））；スペクチノマイシン（Ｂｒｅｔａｇｎｅ−Ｓｇｎａｒｄ ａｎｄ Ｃｈｕｐｅａｕ， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５， １３１ （１９９６））への耐性をコード化する遺伝子である。
【００５９】
選択マーカー遺伝子の上記リストは限定するものではない。本発明では任意の選択マーカー遺伝子が使用され得る。
形質転換植物の種子か又はその種子から産生される再生植物における異種核酸若しくは「トランス遺伝子」の存在をさらに確かめるには、多様なアッセイが実施され得る。そのようなアッセイには、例えば、サザン及びノーザンブロッティングとＰＣＲのような分子生物学アッセイ；免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット）や酵素機能により、タンパク産物の存在を検出するような生化学アッセイ；及び、葉若しくは根のアッセイのような植物部分のアッセイが含まれる。サザンブロッティングとＰＣＲは、問題となっている遺伝子を検出するために使用され得るが、それらはその遺伝子が発現されているかどうかについての情報を提供しない。異種遺伝子の発現は、導入された遺伝子のタンパク産物を特異的に同定すること、又はその発現により引き起こされる表現型の変化を評価することによって評価され得る。特定タンパク質の産生及び同定のアッセイには、そのタンパク質の物理化学、構造、機能、又は他の特質が利用され得る。特有の物理化学若しくは構造上の特性により、そのタンパク質を、ネイティブ若しくは変性ゲル電気泳動や等電点電気泳動のような電気泳動法によるか、又はイオン交換若しくはゲル排除クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー技術により分離して同定することが可能になる。個々のタンパク質に特有な構造は、その存在をＥＬＩＳＡアッセイのようなフォーマットで検出するために特異抗体を使用するための機会を提供する。種々のアプローチを組合せれば、抗体を使用して電気泳動技術により分離された個々の遺伝子産物を定位するウェスタンブロットのように、より高い特異性で利用され得る。精製後のアミノ酸配列決定による評価のように追加の技術を利用して、注目の産物の同一性を完全に確定し得る。これらの技術は最もよく利用されるものであるが、他の技術も当技術分野で知られていて、追加的に使用され得る。
【００６０】
本発明の１つの特別の利点は、シングルシュート培養物ではなく、多芽（マルチシュート）培養物若しくは外植片を形質転換に使用することで、他のやり方では形質転換へ抵抗する植物の形質転換の効率が高まることにある。効率とは、異種核酸で成功裡に形質転換されなかった植物若しくは植物細胞の比率と比較した、所望される異種核酸で成功裡に形質転換された植物若しくは植物細胞の比率を意味する。本発明の好ましい態様では、本発明の方法の形質転換効率が約１％より高く、より好ましくは４％より高く、さらにより好ましくは１０％より高く、そして最も好ましくは約３０％より高い。形質転換効率は、トランスジェニック植物をもたらす外植片の数と標的外植片の数の比として定義される。本発明の異種核酸を含んでなる（例えば、本発明の異種核酸、又は本発明の形質転換細胞を含んでなる）トランスジェニック植物も、トランスジェニック植物により産生される種子及び子孫と同様に、本発明の側面である。形質転換細胞を有用な栽培変種へ培養するための方法は、当業者に知られている。植物組織の ｉｎ ｖｉｔｒｏ 培養、しかも多くの事例では、植物全体への再生についての技術が知られている。本発明のさらなる側面は、上記の核酸を含有する、トランスジェニック植物組織、植物、又は種子である。好ましい態様では、本発明を使用して産生される形質転換外植片はキメラでないか、又はごくわずかな割合の形質転換外植片がキメラである。このことは、好ましくは、高サイトカイニン処理の時間を延ばすことか、又はマンノース選択のストリンジェンシーを高めること、あるいはその両方により達成される（以下の実施例５を参照のこと）。
【００６１】
このように、本発明の形質転換細胞は、本明細書に提供されるように、選択若しくはスクリーニングにより同定されて、再生を維持する適正な培地で培養されてから、植物へ成熟化され得る。植物は、好ましくは、生育室か又は温室で成熟化される。植物は、最初の組織に依存して、形質転換体が同定されてから約６週〜１０ヶ月で再生される。再生の間、細胞は、組織培養容器の固形培地で生長され得る。そのような容器の例示的な態様は、ペトリ皿とＰｌａｎｔ Ｃｏｎ（登録商標）である。再生植物は、苗条及び根の生育の段階に達した後で、さらなる生長と検査のために温室へ移してよい。上記に提供されるように、再生植物の種子及び子孫植物は本発明の側面である。従って、「種子」という用語には、形質転換植物の種子、並びに形質転換植物の子孫から産生される種子が含まれるわけである。本発明の植物には、形質転換されて再生される植物だけでなく、本発明により産生される形質転換されて再生された植物の子孫も含まれる。
【００６２】
１つの態様では、本発明の再生トランスジェニック植物が、形質転換された多芽培養物をはじめに選択培地で生長させ、形質転換された培養物が成熟するにつれて、非形質転換組織をすべて除去することによってつくられる。選択が完了してから、形質転換培養物により産生された苗条を、好ましくは苗条伸長培地を含有する容器へ移す；そのような培地は当技術分野で知られていて、以下に記載する。所望されるならば、形質転換された苗条は、ＭＳベースのクローニング培地（例えば、さらにマンノースを含んでなる、上記に記載されるような生育培地）でクローン化され得る。他のやり方では、単苗条若しくはクローンが、以下に記載されるか、又は当業者により決定され得るような適正な根付け培地へ移すことによって成功裡に根付けされ得る。
【００６３】
本発明の方法により産生される植物は、上記の標準法により、成功した形質転換について候補選択され得る。本発明の再生植物の種子及び子孫植物は、本発明のもう１つの側面である、改良された植物及び種子の株を開発するために、トランスジェニックで組込まれた核酸配列の継続した存在について継続的に候補選択されて選択され得る。このようにして、望ましいトランスジェニック核酸配列を、ある種の選良株、又は商業的に貴重な株若しくは変種のような、他の遺伝系統へ移す（即ち、遺伝子移入するか又は交配させる）ことが可能である。望ましい核酸配列を植物の遺伝系統へ遺伝子導入する方法は、古典的な交配、プロトプラスト融合、核導入、及び染色体導入を含む、当技術分野で知られている多種多様な技術により行い得る。交配のアプローチ及び技術は当技術分野で知られていて、例えば、Ｊ． Ｒ． Ｗｅｌｓｈ，『植物の遺伝学及び交配の基礎（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ）』（ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、ニューヨーク （１９８１））；『作物の交配（Ｃｒｏｐ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ）』（Ｄ． Ｒ． Ｗｏｏｄ 編、アメリカ作物栽培学会、マジソン、ウィスコンシン （１９８３））；Ｏ． Ｍａｙｏ，『植物交配の理論（Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ）第２版』（クラレンドン・プレス、オックスフォード、イギリス （１９８７））；及び、Ｗｒｉｃｋｅ ａｎｄ Ｗｅｂｅｒ， 『定量遺伝学と選択植物交配（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ）』（Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ ａｎｄ Ｃｏ． ベルリン （１９８６））に示される。これらの技術と当技術分野の他の技術を使用して、本発明に従って得られるトランスジェニック植物及び交配株が、商業的に貴重な雑種の植物及び作物（例えば、雑種のカボチャ及びサトウダイコン）を産生するために使用され得て、この雑種も本発明の側面である。
【００６４】
以下の実施例は本発明を詳しく説明するために提供されるものであり、それを制限するものと解釈してはならない。
【００６５】
【実施例】
実施例１：カボチャの形質転換
種子の滅菌及び発芽
カボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｐｅｐｏ． Ｌ．）の成熟胚を一対のプライヤーを使用して乾燥種子から慎重に除去する。次いで、それを５０ｍｌの使い捨て遠心管へ入れ、１５％（Ｖ／Ｖ）Ｃｌｏｒｏｘ（登録商標）溶液中で１５分間表面を滅菌する。滅菌の間、この管を回転機にかけ、２００ｒｐｍでかき混ぜる。滅菌水で３回濯いでから、この胚を滅菌水にさらに２０分漬す。管を時々手で振り混ぜ、胚を囲む膜を除去する。滅菌の後で、成熟胚を４．０ｍｇ／Ｌ−ＢＡ補充ＭＳベース培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ， １９６２）で発芽させ、培養室の２３〜２６℃の暗所で生長させる。
【００６６】
外植片の調製
子葉柄．発芽から３日後、胚軸と子葉の２／３を発芽中の苗木から除去する。次いで、子葉節、茎頂、及び子葉の残り部分を含む子葉柄の外植片を苗条増殖（ＳＭ）培地へ移し、照明下に２５℃で生長させる。ＳＭ培地は、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン類、２〜４ｍｇ／ＬのＢＡを含有し、約４ｇ／Ｌ（又は約０．４％（ｗ／ｖ））のＰｈｙｔａｇｅｌ（登録商標）で固まらせる。
【００６７】
ＳＭ培地での培養の３〜１０日後に、伸長した胚軸及び子葉の余分な組織を注意深く除去し、形質転換に使用する子葉柄を茎頂領域から分離する。子葉柄はまた、形質転換に使用の前にさらに３〜１４日間ＳＭ培地で培養し得る。
【００６８】
茎頂．苗条原基、葉原基、若葉、及び胚軸の一部を含有する頂若しくは腋の分裂組織を発芽中の苗木若しくは小植物体から切除する。それをＳＭ培地で維持し、２５℃の照明下で生長させ、隔週で継代培養する。茎頂外植片は、初回継代培養後には形質転換への準備ができている。それらはまた、数回の継代培養後も形質転換の外植片として使用され得る。
【００６９】
アグロバクテリウム株とプラスミド
ＥＨＡ１０１、ＬＢＡ４４０４、ＧＶ３１０１、及びＫ６（ＡＴＣＣ＃５５９６４）のような Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 株が、好ましい株として、ＥＨＡ１０１（Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ， １９８６， Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １６８： １２９１−１３０１）を用いた遺伝子デリバリーに使用される。形質転換に使用されるプラスミド、ｐＮＯＶ２１０５は、修飾されたＳｍａｓ遺伝子プロモーター（Ｎｉ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ７： ６６１−６７６）により発動される、ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）のコーディング配列を含有する。Ｓｍａｓ（マンノピンシンターゼ）プロモーターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ から導かれ、ｏｃｓエンハンサー領域を増やすことによって亢進される。この遺伝子は、ｎｏｓ３’領域で終結する。それはまた、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ，Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ （１９８６） ＰＲＯＣ． ＮＡＴＬ． ＡＣＡＤ． ＳＣＩ． ＵＳＡ ８３： ８４４７−８４５１）をコード化する大腸菌のｕｉｄＡ遺伝子を含有する。ｇｕｓイントロン（Ｖａｎｃａｎｎｅｙｔ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ ２２０ （２）： ２４５−２５０）は、ＧＵＳコーディング配列の内側に配置された。この遺伝子は、Ｓｍａｓプロモーターにより発動され、ｎｏｓ３’領域で終結する。形質転換に使用されるアグロバクテリウムを、適正な抗生物質（カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ、スペクチノマイシン１００ｍｇ／Ｌ、及びカルベニシリン１００ｍｇ／Ｌ）を含有する、Ｂａｃｔｏ寒天で固めたＹＰ培地（酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、及びＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）で維持する。この細菌を２８℃に保つ。
【００７０】
接種と共存培養
アグロバクテリウムを外植片へ接種するのに３つの方法を採用する。
方法１．２〜３日齢の Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ コロニーを、接種ループを用いて、Ｂａｃｔｏ（登録商標）寒天で固めた細菌プレートから採取する。アグロバクテリウムを外植片へ接種する直前か、又はその間に、子葉柄の分裂領域又は頂及び腋の茎頂の分裂組織培養物を、外科用ブレード又は針のいずれかにより、繰り返し表面を傷つける。創傷に先立って標的領域の表面にアグロバクテリウムを塗布することにより細菌の接種を行うか、又は創傷処理に先立って、アグロバクテリウムをブレード若しくは針へ「塗りつける」。創傷の後で、液体のアグロバクテリウム誘導培地（例えば、ＳＭ培地とアセトシリンゴン２００〜６００ｍｇ／Ｌを含むオール培地、外植片の大きさに依存して１μｌ〜６μｌ）を、外植片の大きさに依存して約１〜約６μＬの量で、創傷領域へ直ちに塗布する。創傷組織の表面上の過剰なアグロバクテリウムとオール培地を無菌濾紙により除去する。短い時間の間空気乾燥させた後で、感染させた外植片を共存培養培地（例えば、オール培地に加えて約２０ｇ／Ｌのスクロースと３０ｇ／Ｌのグルコースを含むＡＣＣ培地）へ移し、２２℃の暗所で２〜４日間インキュベートする。
【００７１】
方法２．２〜３日齢の Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 凝集物をＹＰプレートから採取し、２５〜５０μｌのオール培地と混合する。接種前３０分の間、細菌を室温で放置する。少量の誘導化 Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 混合物を、創傷に先立って、子葉柄の分裂領域又は頂及び腋の茎頂からの分裂組織培養物へ塗布することによって、細菌感染を行う。他のやり方では、アグロバクテリウム凝集物でコートしたブレード若しくは針を用いて標的領域を傷つけることにより細菌感染を行う。短い時間の間空気乾燥させた後で、感染させた外植片をＡＣＣ共存培養培地へ移す。
【００７２】
方法３．２〜３日齢の細菌凝集物を感染当日にオール培地に懸濁させることか、又は、細菌をＹＰ液体培地で一晩増殖させてから感染に先立ってその細菌をオール培地に再懸濁させることのいずれかにより、感染に使用する Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 懸濁液を調製する。前者の場合は、懸濁液を、使用前０．５〜３時間の間、スローモーションシェーカーでかき混ぜるか、又は手で穏やかに振り混ぜる。Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ の最終濃度を０．２〜２．０ｘ１０９ｃｆｕ（コロニー形成単位）へ調整する。感染のために、外植片を Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 懸濁液に浸し、標的領域をブレード又は針のいずれかで傷つける。感染後、外植片上の過剰な液体を濾紙で拭き取り、表面の液体が見えなくなるまで、外植片を３０〜６０分間空気乾燥させる。次いで、感染された外植片を共存培養のためにＡＣＣ培地へ移す。
【００７３】
苗条の増殖及び選択
ＡＣＣ培地で２〜４日間共存培養した後で、感染した外植片を苗条増殖／選択培地（ＭＳＳ）へ移し、２５℃の照明下で２週間生長させる。後続の継代培養及び選択を２週間の間隔で行う。それぞれの継代培養で、マンノース耐性の緑色の苗条塊を選択し、小片へ切断し、新鮮なＭＳＳ培地へ移す。ＭＳＳ培地は、ＳＭ培地と抗生物質を含み、マンノースを含むか又は含まない。ＭＳＳ培地中のマンノースの濃度は、後続の選択を通して０ｇ／Ｌから２ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、及び４ｇ／Ｌへと徐々に高め、スクロースの濃度は３０ｇ／Ｌから２５ｇ／Ｌへ、次いで２０ｇ／Ｌへと減少させる。
【００７４】
植物の再生
マンノースで生長する苗条塊を維持し、２〜４ｇ／Ｌのマンノースと０．５〜４ｍｇ／Ｌの６−ベンジル−アミノプリン（ＢＡ若しくは６−ＢＡＰ）を含有するＭＳＳ培地で新たなクローンをつくる。苗条の伸長を促進するために、ＢＡ ０．５ｍｇ／Ｌを含むか又は含まないＭＳＳ培地で苗条塊を生長させる。ＢＡのないＭＳＳ培地か、又は１ｍｇ／Ｌのインドール−３−酪酸（ＩＢＡ）を含有するＭＳＳ培地で苗条を根付かせる。根付いた苗条を土壌へ移し、温室で成熟するまで生長させる。トランスジェニック植物を自家受粉させる、及び／又は非トランスジェニック植物と他家受粉させて、Ｔ１子孫を産生する。Ｔ１トランスジェニック子孫は、分析のために採取され、Ｔ２トランスジェニック子孫を産生するために使用される。
【００７５】
植物の分析
ＧＵＳ組織化学アッセイ．トランスジェニック植物及び非トランスジェニック対照植物からの組織若しくは器官を、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ （Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． Ｒｅｐ． ５， ３８７−４０５ （１９８７）） の方法に従って、３７℃で一晩、ＧＵＳ基質中でインキュベートする。葉組織におけるＧＵＳ発現の視覚化を助長するには、必要ならば、７０％エタノールを使用して組織から葉緑素を抽出する。子孫の根及び未熟胚についてＧＵＳ組織化学アッセイを実施することによって、ｇｕｓ遺伝子を含有するトランスジェニック子孫を候補選択する。子孫中のトランス遺伝子の分離分析を、カイ二乗検定を使用して実施する。
【００７６】
ＥＬＩＳＡアッセイ．トランスジェニック及び非トランスジェニック植物から葉サンプルを採取し、ＥＬＩＳＡ＋（プラス）／−（マイナス）アッセイを実施して、ＰＭＩ酵素の存在を確かめる。
【００７７】
トランス遺伝子の組込み．トランスジェニック及び非トランスジェニック対照の植物から全ＤＮＡを単離する。植物ゲノムにおけるトランス遺伝子の組込みをサザンブロット分析により確かめる。ＥＨＡ１０１（ｐＮＯＶ２１０５）を用いた形質転換からの結果を表１に要約する。
【００７８】
【表１】
本発明に記載の多苗条形質転換アプローチを使用するカボチャの形質転換効率は、１％〜１０．５％に及んだ。トランスジェニックカボチャ植物の葉、葉柄、根、幹、苗条、葯、花冠、蕚（がく）、花糸、花蜜、花粉粒、柱頭、花柱、胚珠、子房の表皮、及び未熟胚に強いＧＵＳ活性が観察された。サザンブロット分析により、トランスジェニック植物のゲノムにおけるｐｍｉ遺伝子の組込みを確かめた。カイ二乗検定を実施して、子孫中のトランス遺伝子（ＧＵＳ）の分離をチェックした。この結果は、ＧＵＳ遺伝子が、自家受粉した子孫（Ｔ１）では３：１の比で、非トランスジェニック植物と他家受粉した子孫では１：１の比で分離することを示した。１つの自家受粉Ｔ１植物に由来する６つのＴ２子孫をさらなる分析のために選択した。この６つのＴ２植物から全部で１３６の胚を採取し、ＧＵＳ及びＰＭＩ遺伝子の存在について分析した。この結果はいずれも陽性であり、ホモ接合発現物（ｅｖｅｎｔ）の回復を確認した。
【００８０】
実施例２：スイカの形質転換
スイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ （Ｔｈｕｍｂ．） Ｍａｎｓｆ．）の成熟種子を発芽させ、実施例１に記載されるように多芽培養物を調製する。アグロバクテリウム感染、共存培養、選択植物の再生を含む、スイカの形質転換に使用する形質転換の工程及び培地は、実施例１に記載のように実施する。ｐＮＯＶ２１０５を収容する Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＥＨＡ１０１を用いた形質転換の結果を表２に示す。実施例１の記載と同じように、栄養及び生殖の器官及び組織のほとんどで強いＧＵＳ活性が観察された。ＧＵＳ活性の発現はまた、自家受粉したトランスジェニックスイカ植物の子孫でも観察された。
【００８１】
【表２】
実施例３：メロンの形質転換
メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ Ｌ．）種子の種皮を一つのピンセットを使用して除去し、種子を、７０％エタノール、１分間に次いで、１％塩酸、１０分間で滅菌する。この種子を滅菌水で３〜４回濯ぎ、半濃度のホルモンフリーＭＳ培地に、プレートあたり１０個の種子で播く。２２〜２４℃、３０００〜４０００ルクスで１６時間と暗所８時間で種子を発芽させる。７日後、苗木から子葉と葉柄を分離し、それらをＭＳ３０培地（ＭＳ塩、スクロース３０ｇ／Ｌ）へ移す。形質転換の１日前に、５０μｌのストック溶液を５ｍｌの抗生物質含有ＭＳ培地へ移すことによって、ユニバーサル管において Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ の培養を開始する。この培養物を２８℃、１５０ｒｐｍで、少なくとも１７時間インキュベートする。形質転換の当日、１．２〜１．５ｍｌの一晩増殖させたアグロバクテリウム培養物を、子葉を含有するプレートへ加える（最終アグロバクテリウム濃度：２ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌ）。子葉柄の分裂組織部位に小さな切込み（創傷）をつける。アグロバクテリウム＋外植片の入ったプレートを真空乾燥機中に移す。真空ポンプにより１分間真空をかける。真空を１５分間維持する。１５分後、真空をゆっくり解除する。アグロバクテリウムの懸濁液をプレートから吸い取る。ＭＳ３０をプレートへ加えることにより、外植片を液体ＭＳ３０で洗浄する。ＭＳ３０をプレートから吸い取り、滅菌濾紙上でこの外植片を乾かす。１プレートあたり２０〜３０個の外植片で、ＢＭ４．５＋ＢＡＰ ０．５ｍｇ／ｌ（ＢＭ４．５Ｂ）に外植片をのせる。このプレートを、２１〜２３℃、１５００〜２０００ルクスで１６時間、次いで暗所の８時間で５日間インキュベートする。５日間の共存培養の後、１プレートあたり１０個の外植片で、マンノース、ＢＡ ０．５ｍｇ／Ｌ、アンシミドール ０．１２５ｍｇ／Ｌ、及びＡｇＮＯ３ １．５ｍｇ／Ｌを含有する選択培地へこの外植片を移す。このプレートを、２４℃、２０００〜２５００ルクスで１６時間置いてから、次いで暗所に８時間置き、２〜２．５週ごとに新鮮な培地へ移す。０．５ｍｍ以上の大きさの苗条を、ＭＳ塩、ＮＡＡ ０．１ｍｇ／ｌ、ＡｇＮＯ３ ３ｍｇ／Ｌとセフォタキシム ２００ｍｇ／ｌ及びバンコマイシン １００ｍｇ／ｌを含有するＢＭＭ−ｃ培地へ移す。この苗条を２〜３週ごとに新鮮な培地へ移す。
【００８３】
実施例４：ヒマワリの形質転換
ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ Ｌ．）の種子を実施例１に記載のように発芽させる。実施例１に記載の培地を使用して、元の茎頂か又は未熟花部から多芽培養物を調製する。未熟花部は、温室で育てた若い植物か、又は ｉｎ ｖｉｔｒｏ 培養した茎頂から採取する。この多芽培養物を、ｐＮＯＶ２１０５を収容する Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＥＨＡ１０１で形質転換する。感染から４週後の多芽培養物に強いＧＵＳ活性が観察される。実施例１に記載のような選択及び苗条増殖の工程に従って、トランスジェニック植物を回収する。この結果を表３に要約する。
【００８４】
【表３】
実施例５：サトウダイコンの形質転換
種子の滅菌及び発芽
サトウダイコン（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌ．）の種子を、濃硫酸を１０分間使用して種皮処理する。この種子を徹底的に濯いで残余の硫酸を除いた後で、種子を水に一晩浸ける。翌日、２０％ Ｃｌｏｒｏｘ（登録商標）（市販されている）を１５分間振り混ぜながら使用して、表面の滅菌を実施する。その後、種子を滅菌水で５回濯いでから６時間空気乾燥させた後で、無菌培養下の種子発芽培地（ＧＭ）へプレートする。１つの例では、ＧＭには、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ 及び Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）塩（シグマケミカルズ、セントルイス、Ｍｏ．）が約３０ｇ／Ｌのスクロースとともに含まれた。Ｂ５ビタミン類（やはりシグマケミカルズから入手）、ミオイノシトール（１００ｍｇ／Ｌ）、パントテン酸（１ｍｇ／Ｌ）、及びＰｈｙｔａｇｅｌ（登録商標）３．６ｇ／Ｌも、サイトカイニン様機能を有する植物生長調節剤と同様に、ＧＭに含まれた。サイトカイニンレベルは、概して０．５ｍｇ／Ｌ〜５ｍｇ／Ｌの典型的な範囲内にあり、通常は１．０〜２．０ｍｇ／Ｌの間である。サトウダイコンの種子では、オーキシン阻害剤のＴＩＢＡも加えられる。
【００８６】
苗条分裂組織培養物の切除と培養の開始
７〜１４日齢の苗木の茎頂を切除し、苗条増殖培地（ＳＭＭ）へプレートする。この場合には、ＳＭＭに、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ 及び Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）塩、スクロース ３０ｇ／Ｌ、Ｂ５ビタミン類、Ｐｈｙｔａｇｅｌ ８ｇ／Ｌが含まれた。さらに、ＳＭＭは、一般的には約１〜１０ｍｇ／Ｌの濃度範囲に、通常は２〜６ｍｇ／Ｌの濃度範囲に、ＢＡ、カイネチン、２−ｉｐ、又はゼアチンのような、少なくとも１つのサイトカイニン生長調節剤を含有した。ＧＡのような追加の生長調節剤と、ＩＡＡ、ＮＡＡ、及び２，４−Ｄのようなオーキシン様機能を有する生長調節剤も加えた。
【００８７】
茎頂は、頂及び腋の苗条分裂領域、葉原基、３〜４ｍｍの胚軸、及び子葉を含み、短く摘み取ってさらなる伸長を抑制する。プレート培養から７〜１０日ごとに、新たに伸長した葉の素材を除去してから、標的外植片を新鮮なＳＭＭへ継代培養した。典型的には、多苗条標的外植片を、２０℃、１２〜１６時間の日長で、低い光度（１０〜３０μアインシュタイン）下に培養する。４〜６週後、多芽培養物は密集ロゼットに似たものとなり、形質転換への準備ができている。
【００８８】
多芽培養物の接種及びインキュベーション
この多芽培養物の形質転換には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 仲介性形質転換を利用する。プラスミドｐＡＤ１２８９及びｐＮＯＶ２１０５（ＰＭＩ選択マーカー遺伝子とＧＵＳ評価可能マーカー遺伝子を含有する）を有する Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 株のＥＨＡ１０１を、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、及びＢａｃｔｏａｇａｒ（登録商標） １５ｇ／Ｌからなる固形培養基において、２８℃で２〜３日間増殖させる。プラスミドｐＮＯＶ１５０８は、修飾されたＳＭａｓプロモーターにより発動され、ｎｏｓ３’領域で終結する、ｐｍｉ遺伝子を含有する。それはまた、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＵＢＱ３（イントロン）プロモーター（Ｎｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２１， ８９５−９０６ （１９９３） を参照のこと）により発動され、３５Ｓ ３’領域で終結する、二重突然変異 Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＰＰＯ遺伝子（米国特許第６，０８４，１５５号を参照のこと）を含有する。形質転換に先立つ１日前に、残存する伸長した葉の素材を除去することにより、多芽培養物の接種を準備する。
【００８９】
接種を始めるには、滅菌ループを使用して、Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ の単一コロニーを元のＹＰ培養プレートと一緒に採取する。それぞれの標的外植片の実際の接種では、採取した Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ のコロニー中へ無菌の外科用ブレードを浸し、これを使用して各標的の頂及び腋の分裂領域に刻みを入れる。いくつかの実験では、この接種工程の直後に、約４〜６μｌのＭＳＭＧ誘導培地（ＭＳ塩、グルコース ２ｇ／Ｌ、ＭＥＳ、及びアセトシリンゴン ２００μＭ）を各標的の創傷表面へ塗布する。苗条分裂組織産生細胞への遺伝子デリバリーを指令するには、可能な限り多くの分裂ゾーンの中央を通して切断する努力がなされる。典型的には１０〜２０の標的培養物を連続して処理してから、層流フードの無菌条件下で１０分間空気乾燥させる。空気乾燥処理の後で、処理された標的外植片をＭＳＣＣ共存培養培地（ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン類、ＢＡ ２ｍｇ／Ｌ、スクロース３０ｇ／Ｌ、アセトシリンゴン ２００μＭ）へ移す。次いで、処理された外植片を、連続的に暗所で培養しながら、２２℃で２〜３日間、ＭＳＣＣ培地でインキュベートする。
【００９０】
標的の培養及び選択
接種と共存培養の後で、多苗条外植片を、２ｍｇ／ＬのＢＡと適正な抗生物質を含む新鮮なＳＭＭ培地へ少なくとも２日間移してから、マンノース選択圧力をかける。形質転換された組織を、形質転換後の徐々に増加する量のマンノース（２ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌ）と減少する量のスクロース（２６ｇ／Ｌ〜０ｇ／Ｌ）で選択する。マンノース選択レベルは、段階的なやり方で、マンノース２ｇ／Ｌ＋スクロース２６ｇ／Ｌからマンノース３ｇ／Ｌ＋スクロース２４ｇ／Ｌへ、次いでマンノース４ｇ／Ｌ＋スクロース２２ｇ／Ｌ、これに後続して、マンノース５ｇ／Ｌ＋スクロース２０ｇ／Ｌ、及びマンノース６ｇ／Ｌ＋スクロース１８ｇ／Ｌへと増加させる。多芽培養物は大きさが生長し続けるので、それぞれの共存培養時に、十分な選択圧力を助長するように注意深く分割する。ＢＡレベルを典型的には形質転換後１６〜２０週の間２ｍｇ／Ｌに維持し、選択下での苗条分裂組織の増殖を継続させる。この時期の後で、ＢＡレベルを４〜６週の間０．２５ｍｇ／Ｌへ低下させてから消失させ、苗条の伸長を促進する。生存している形質転換組織の領域を元の標的外植片の死んだ非形質転換部分から継続的に取り出し、生存している部分を再び注意深く分割して、ストリンジェントな選択を促進する。選択と苗条再生は、典型的には１０〜約３０週の期間にわたり進行する。若い苗条が出現したときに、それらを分離させ、形質転換苗条の最も効率的な選択の選択下で単離する。
【００９１】
形質転換苗条の伸長
若い苗条がほぼ０．５〜１．５ｃｍに達したならば、上記のようなマンノース選択をかけるか又はかけずに、苗条伸長培地（生育苗条の伸長はサイトカイニンレベルの低下により高められる）を含有するＧＡ７へそれらを移す。苗条伸長培地は、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン類、３０％スクロース、及びＰｈｙｔａｇｅｌ（登録商標）（７．５ｇ／ｌ）を含有する。伸長培地には、低レベルのサイトカイニンが、０．１〜１．０ｍｇ／ｌの典型的な範囲内で取込まれる。サトウダイコンに最適なサイトカイニンの適用は、カイネチン０．５ｍｇ／Ｌである。
【００９２】
形質転換植物の再生
形質転換苗条を、ＭＳベースのクローニング培地＋マンノース ５〜２０ｇ／Ｌでクローン化する。最初の１つのトランスジェニック苗条に由来する多苗条が望ましい場合があるので、この理由のために、基本ＭＳ培地中にサイトカイニンとオーキシンを組み合わせて使用して、クローニングを誘導した。両方の生長調節剤の低レベルは、典型的には０．１ｍｇ／Ｌ〜０．５ｍｇ／Ｌに及ぶ。サトウダイコンでは、ＭＳ塩とスクロース３０ｇ／Ｌを、カイネチン０．２ｍｇ／Ｌ、ＮＡＡ ０．１ｍｇ／Ｌ、及びＰｈｙｔａｇｅｌ（登録商標） ７ｇ／Ｌとともに使用する。
【００９３】
ＩＢＡ若しくはＮＡＡのような１又は２つのオーキシンを０．５ｍｇ／Ｌ〜５ｍｇ／Ｌで補充した、ＭＳ基本培地を含有する根付け培地へ移し、シングルシュート若しくはクローンを成功裡に根付かせる。１つの例では、根付け培地は、ＩＢＡ ５ｍｇ／Ｌ、ＮＡＡ ０．５ｍｇ／Ｌ、及び約５〜２０ｇ／Ｌのマンノースを含有する。Ｐｈｙｔａｇｅｌ（登録商標）は、５ｇ／Ｌで、根の生育を支えるのに適正なゲル化剤であることがわかった。
【００９４】
形質転換の結果
サトウダイコンでは、多芽培養物を外植片として使用すると、高い効率の形質転換が達成された。
【００９５】
ｐＮＯＶ２１０５を含有する Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ で形質転換したサトウダイコンの多芽培養物からの結果を表４に示す。形質転換されたサトウダイコン植物からのＧＵＳ発現が、組織化学アッセイを使用して検出された。ＰＭＩ遺伝子の発現は、ＰＭＩ ＥＬＩＳＡ＋／−アッセイを使用して決定した。
【００９６】
【表４】
サトウダイコンの多芽培養物を、ｐＮＯＶ１５０８（ＰＭＩ選択マーカー遺伝子と突然変異した Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＰＰＯ遺伝子を含有するプラスミド）を含有する Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ で形質転換した１つの実験では、３４の外植片のうち１８がＰＭＩ＋の植物を産生した。このＰＭＩ＋トランスジェニックサトウダイコン植物のノーザン分析によるさらなる分析は、そのうちの７つが突然変異した Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＰＰＯ遺伝子を発現することも示した。このＰＰＯ発現植物にＰＰＯ阻害剤の除草剤を野外適用可能レベルで噴霧すると、そのうちのいくつかがその除草剤に対して劇的に高い耐性を示した。２つのトランスジェニックＰＰＯ発現物をＴ１種子産生のために選択した。ＰＭＩ遺伝子についてのＰＭＩ ＥＬＩＳＡ及びサザン分析により、これらの発現物がトランスジェニックであることを確かめた。それぞれはＰＭＩ遺伝子のコピーの組込みを多数含有することが示された。根付いたＴ０植物を土壌へ移し、２１℃、湿度６０％、日長１６時間／夜間８時間の温室条件で５〜６週間生長させた。正常な表現型の植物の生育を観察してから、Ｔ０植物を１６週間春化処理の条件（４℃、昼１６時間／夜８時間）へ移してから、１４℃へ２週間順化させた。順化の後で、このトランスジェニック体を温室条件へ戻し、正常な花の生育を観察した。このトランスジェニック体を種子の産生のために自家受粉させ、非トランスジェニック植物と他家受粉させた。Ｔ１種子が成功裡に産生されたので、採取し、発芽のために土壌に播いた。ＰＭＩ ＥＬＩＳＡ分析により、Ｔ１の苗木がＰＭＩ遺伝子を含有することが証明された。それぞれの発現物につき５つのＴ１植物のサザン分析により、ＰＭＩ及びＰＰＯのトランス遺伝子の同時組込みを確かめた。
【００９８】
キメラの排除
キメラである（一部トランスジェニックである）形質転換植物を産生する可能性を減らすには、追加の工程を行う。１つの工程は、高サイトカイニン処理（２ｍｇ／Ｌ）の期間を８週から１６週へ延長し、苗条分裂増殖培養物を選択圧力下で刺激し続けることである。もう１つの工程は、マンノース選択のストリンジェンシーを高める（例えば、マンノースを選択の間に５ｇ／Ｌから１０ｇ／Ｌへ段階的に高める）ことである。サトウダイコンの多芽培養物をｐＮＯＶ２１０５含有ＥＨＡ１０１で形質転換した１つの実験では、ＧＵＳ発現について分析した３６の外植片のうち３５（９７％）が完全にトランスジェニックな苗条を産生した（以下の表５を参照のこと）。
【００９９】
【表５】
実施例６：茎頂、葉、又は他の植物組織から導かれる分裂組織培養物を使用するプラスチドの形質転換
サトウダイコンプラスチド形質転換ベクターの構築
Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ プラスチドゲノムのｔｒｎＶ及びｒｐｓ１２／７遺伝子間領域を増幅し、キメラ遺伝子の挿入のために修飾する。サトウダイコンのプラスチドゲノムからの１５５９ｂｐ領域（１〜１５６０位、ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号ＡＢ０３２４２６）をＰＣＲ増幅し、Ｐｓｔ１部位を５２５位に挿入する。第一の５３６ｂｐのＰＣＲ増幅を、以下のプライマー対を用いて Ｂ． ｖｕｌｇａｒｉｓ の全ＤＮＡから実施する：天然のＭｌｕＩ制限部位（下線）を有するＢｖ１６−ＭｌｕＩ（５’ＴＴＣ ＴＴＡ ＣＧＣ ＧＴＴ ＡＣＴ ＣＡＣ ＣＣＧ ３’，配列番号１）、及びＰｓｔＩ部位（下線）を導入するＢｖ１６Ｓ−ＰｓｔＩ（５’ＡＡＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＴＣ ＣＣＧ ＧＣＴ ＣＣＡ ＡＧＴ ３’，配列番号２）。第二の１０４９ｂｐのＰＣＲ増幅を、以下のプライマー対を用いて実施した：ＢａｍＨＩ制限部位（下線）を導入するＢｖｒｐｓ１２−ＢＨＩ（５’ＡＡＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＡＡ ＴＴＧ ＡＣＧ ＧＧＴ ＴＡＧ ＴＧＴ Ｇ３’，配列番号３）、及びＰｓｔＩ部位（下線）を導入するＢｖｒｐｓ１２−ＰｓｔＩ（５’ＡＡＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ＴＣＧ ＣＡＣ ＴＡＴ ＴＡＣ ＧＧＡ ＴＡＣ ＧＡＡ ３’，配列番号４）。いずれのＰＣＲ反応も、以下のような製造業者（パーキンエルマー／ロッシュ、ブランクブルグ、ＮＪ）の推奨法に従って、パーキンエルマーサーマルサイクラー４８０において、Ｐｆｕ熱安定ＤＮＡポリメラーゼを用いて行う：９５℃、５分に次いで、９５℃、１分／５０℃、１分／７２℃、１分の３５サイクル、次いで７２℃で１０分。５３６ｂｐ増幅産物をＭｌｕＩ及びＰｓｔＩで消化すると、サトウダイコンプラスチドのｔｒｎＶ隣接配列を表す５２５ｂｐのＭｌｕＩ／ＰｓｔＩフラグメントを生じる。１０４９ｂｐ増幅産物をＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩで消化すると、サトウダイコンのｒｐｓ１２／７隣接配列を表す１０３４ｂｐのＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩフラグメントを生じる。
【０１０１】
タバコプラスチドの形質転換ベクターであるｐＡＴ２３８（ＰＣＴ ＷＯ００／２０６１２、ノバルティス、国際公開日０４／１３／００）をＭｌｕＩ及びＢａｍＨＩで切断し、３．３ｋｂのＭｕｌＩ／ＰｓｔＩベクターフラグメントを単離した。このフラグメントを、５２５ｂｐのＭｌｕＩ／ＰｓｔＩフラグメントと１０３４ｂｐのＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩフラグメントとの三者間反応で連結させると、サトウダイコンの形質転換ベクターであるｐＥＢｃｐＳＢｅｅｔの骨格を生じる。生じたプラスミドは、キメラのタバコ：：サトウダイコン：：タバコプラスチドｔｒｎＶ及びｒｐｓ１２／７の遺伝子間座を含み、１５５９ｂｐのサトウダイコン配列には、ｔｒｎＶの側で４１４ｂｐのタバコプラスチド配列が、ｒｐｓ１２／７の側で３９ｂｐが隣接している。タバコのｐｓｂＡプロモーターにより発動され、スペクチノマイシンへの耐性を与えるキメラａａｄＡ遺伝子を、サトウダイコンの配列中にすでに創出されたＰｓｔＩ部位へ挿入する。ｒｐｓ１２／７隣接領域の方へ配向しているａａｄＡカセットを有するプラスミドのクローン（ｐＥＢＳＢ１）を後続のサトウダイコン多芽体の形質転換に使用する。
【０１０２】
サトウダイコンプラスチドの形質転換
サトウダイコンの多芽培養物を実施例５に記載されるように茎頂から導く。ボンバードメントの前日、標的外植片を４つの断片へ切る（外植片の頂部から底部へ切る）か、又はインタクトな標的外植物として保つ。
【０１０３】
ボンバードメントの当日、サトウダイコンの標的外植片（全体又は切断片）を、１２％スクロースを有するＳＭＭ培地へ移す。遺伝子デリバリーを最大化するために、外植片を標的プレートの中央に置く。切断した外植片は、切断面が上向きになるように配向させ、外植片の内部細胞への遺伝子デリバリーを最大化する。すでに記載したサトウダイコンプラスチドの形質転換ベクターであるｐＥＢＳＢ１で無菌粒子を被覆する。このＤＮＡ−粒子の調製及びボンバードメントの方法は、製造業者により記載されるプロトコールに類似している。
【０１０４】
ボンバードメントの後で、サトウダイコンの外植片をＳＭＭ培地に２日間戻す。次いで、このサトウダイコンを、２５０ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンを有する選択用のＳＭＭ培地へ移す。２週間後、この組織を、継続した選択のために、５００ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンを含有するＳＭＭ培地へ移す。１〜２ヶ月の選択の後で、緑色のスペクチノマイシン耐性苗条が白色の組織上に出現し、これを分析する。
【０１０５】
タバコプラスチドの形質転換
約０．５〜５ｍｇ／Ｌ、好ましくは１〜２ｍｇ／Ｌの濃度範囲でＢＡＰのような少なくとも１つのサイトカイニン生長調節剤を含有する培地で、タバコの葉組織から分裂組織培養物を導く。分裂組織培養物はまた、タバコ植物の他の部分からも導かれる。ＮＡＡのような追加の生長調節剤も含まれる。この培地は、植物調節剤に加えて、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン類、スクロース３０ｇ／Ｌ、及び寒天３ｇ／Ｌを含有し、ｐＨは約５．８である。
【０１０６】
ボンバードメントの当日、分裂組織培養物を新鮮な培地へ移し、遺伝子デリバリーを最大化するために、標的プレートの中央に置く。タバコプラスチドの形質転換ベクターであるｐＡｔ２３８（国際特許出願ＰＣＴ ＷＯ００／２０６１２を参照のこと）で無菌粒子を被覆する。このＤＮＡ−粒子の調製及びボンバードメントの方法は、製造業者により記載されるプロトコールに類似している。
【０１０７】
ボンバードメントから２日後に、５００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを含有する選択培地へ培養物を移す。約４週間の選択の後で、耐性のある緑色の苗条が白色の組織から出現する。この一次耐性苗条組織を、５００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを含有する新鮮培地へ定期的に継代培養する。
【０１０８】
選択から３ヵ月後、２回の実験からの１７の独立した発現物について、ａａｄＡ遺伝子とそのプラスチドへの組込みをＰＣＲにより分析する。１４の発現物で、ａａｄＡを含有し、該プラスミドがそのプラスチドへ組込まれていることを確かめた。
【０１０９】
トマトプラスチドの形質転換
（子葉、葉、茎頂、等のような）トマト組織由来の様々な外植片を、（ゼアチン、ＢＡＰのような）少なくとも１つのサイトカイニン生長調節剤を含有する培地で培養する。サイトカイニン濃度は、約０．５〜５ｍｇ／Ｌ、好ましくは１〜２ｍｇ／Ｌに及ぶ。ＩＡＡ、ＮＡＡのような追加の生長調節剤も含める。この培地は、植物調節剤に加えて、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン類、スクロース３０ｇ／Ｌ、及びＰｈｙｔａｇａｒ ７．５ｇ／Ｌを含有し、ｐＨ５．８である。
【０１１０】
ボンバードメントの当日、分裂組織培養物を新鮮な培地へ移し、遺伝子デリバリーを最大化するために、標的プレートの中央に置く。選択マーカー遺伝子（及び、注目の遺伝子）に隣接するトマト若しくはタバコの相同配列を含有するプラスチドＤＮＡで無菌粒子を被覆する。このＤＮＡ−粒子の調製及びボンバードメントの方法は、製造業者により記載されるプロトコールに類似している。
【０１１１】
ボンバードメントから２日後に、５００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを含有する選択培地へ培養物を移す。数週間の選択の後で、耐性のある緑色の苗条が白色の組織から出現する。得られた苗条は、スペクチノマイシン選択培地で生長し続け、形質転換プラスチドを含有する。
【０１１２】
上記は本発明の例示であって、それを制限するものと解釈されてはならない。本発明は以下の特許請求項により明確化され、特許請求項の同等物もそこに含まれる。
Claims (50)
- 形質転換された双子葉植物を産生する方法であって：
（ａ）形質転換へ抵抗する双子葉植物の組織を培養基で培養し、この組織から多芽培養物を産生する工程；
（ｂ）この多芽培養物の細胞へ核酸を導入し、それによりこの核酸を含む形質転換細胞を産生する工程；及び、
（ｃ）この形質転換細胞から形質転換植物を再生させる工程を含んでなる、前記方法。 - 組織が分裂組織である、請求項１に記載の方法。
- 分裂組織が、茎頂、腋芽、又は花の分裂組織から切除される、請求項２に記載の方法。
- 組織がカルス組織である、請求項１に記載の方法。
- 植物がウリ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）科か又はアカザ（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａ）科のメンバーである、請求項１に記載の方法。
- 植物が、サトウダイコン、ヒマワリ、ダイズ、ワタ、メロン、スイカ、カボチャ、アブラナ属、及びコショウからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
- 植物が、サトウダイコン、カボチャ、メロン、又はスイカである、請求項１に記載の方法。
- 組織が植物の苗木の茎頂から切除される、請求項１に記載の方法。
- 培養基が少なくとも１つの植物生長調節剤を含む、請求項１に記載の方法。
- 少なくとも１つの植物生長調節剤がサイトカイニンである、請求項９に記載の方法。
- 培養基中の生長調節剤の濃度が約０．０１ｍｇ／Ｌ〜約２５ｍｇ／Ｌの間にある、請求項９に記載の方法。
- 核酸が、微粒子ボンバードメントによるか、又はアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌を使用して細胞へ導入される、請求項１に記載の方法。
- 該核酸が双子葉植物に対して異種である核酸を含む、請求項１に記載の方法。
- 核酸がＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコード化する遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
- 核酸がホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）活性を有するポリペプチドをコード化する遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
- 核酸がキシロースイソメラーゼ（ｘｙｌＡ）活性を有するポリペプチドをコード化する遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
- 核酸がＧＵＳ活性を有するポリペプチドをコード化する遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
- 工程（ｃ）が：
形質転換細胞を含む多芽培養物を選択する工程；
この多芽培養物を苗条の伸長を促進する条件下で生長させ、少なくとも１つの形質転換苗条を産生する工程；及び、次いで、
この少なくとも１つの形質転換苗条を成熟した形質転換植物へ生長させる工程を含む、請求項１に記載の方法。 - 少なくとも１つの形質転換苗条が、根形成を促進する培地でこの少なくとも１つの形質転換苗条を生長させた後で、成熟した形質転換植物へ生長する、請求項１９に記載の方法。
- 工程（ｃ）が：
形質転換細胞を含む多芽培養物を選択する工程；
この多芽培養物を苗条の伸長を促進する条件下で生長させ、少なくとも１つの形質転換苗条を産生する工程；
この少なくとも１つの形質転換苗条をクローン化する工程；及び、
クローン苗条を形質転換植物へ成熟させる工程を含む、請求項１に記載の方法。 - クローン苗条が、根形成を促進する培地でこのクローン苗条を生長させた後で、成熟した形質転換植物へ生長する、請求項２０に記載の方法。
- 請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法により産生される形質転換植物細胞。
- 請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法により産生される多芽培養物。
- 請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法により産生される形質転換植物。
- 植物が、ＰＭＩ活性を有するポリペプチドを発現するカボチャ植物である、請求項２４に記載の形質転換植物。
- 植物が、ＰＭＩ活性を有するポリペプチドを発現するメロン植物である、請求項２４に記載の形質転換植物。
- 植物が、ＰＭＩ活性を有するポリペプチドを発現するスイカ植物である、請求項２４に記載の形質転換植物。
- 植物が、ＰＰＯ活性を有するポリペプチドを発現するサトウダイコン植物である、請求項２４に記載の形質転換植物。
- 請求項２４に記載の形質転換植物により産生される種子であって、多芽培養物へ形質転換された核酸を含む、前記種子。
- 形質転換プラスチドゲノムを含む植物を産生する方法であって：
（ａ）植物の組織を培養基で培養し、この組織から多芽培養物を産生する工程；
（ｂ）この多芽培養物の細胞のプラスチドゲノムへ核酸を導入し、それによりこの核酸を含む前記細胞の形質転換プラスチドゲノムを産生する工程；及び、
（ｃ）この形質転換細胞から形質転換植物を再生させる工程を含んでなる、前記方法。 - 組織が分裂組織である、請求項３０に記載の方法。
- 分裂組織が、茎頂、腋芽、又は花の分裂組織、又は葉組織から切除される、請求項３０に記載の方法。
- 組織がカルス組織である、請求項３０に記載の方法。
- 植物が双子葉植物である、請求項３０に記載の方法。
- 双子葉植物が、サトウダイコン、タバコ、又はトマトである、請求項３０に記載の方法。
- 組織が植物の苗木の茎頂から切除される、請求項３０に記載の方法。
- 培養基が少なくとも１つの植物生長調節剤を含む、請求項３０に記載の方法。
- 少なくとも１つの植物生長調節剤がサイトカイニンである、請求項３７に記載の方法。
- 培養基中の生長調節剤の濃度が約０．０１ｍｇ／Ｌ〜約２５ｍｇ／Ｌの間にある、請求項３７に記載の方法。
- 核酸が微粒子ボンバードメントにより細胞へ導入される、請求項３０に記載の方法。
- 該核酸が双子葉植物に対して異種である核酸を含む、請求項３０に記載の方法。
- 工程（ｃ）が：
形質転換細胞を含んでなる多芽培養物を選択する工程；
この多芽培養物を苗条の伸長を促進する条件下で生長させ、少なくとも１つの形質転換苗条を産生する工程；及び、次いで、
この少なくとも１つの形質転換苗条を成熟した形質転換植物へ生長させる工程を含む、請求項３０に記載の方法。 - 少なくとも１つの形質転換苗条が、根形成を促進する培地でこの少なくとも１つの形質転換苗条を生長させた後で、成熟した形質転換植物へ生長する、請求項４２に記載の方法。
- 工程（ｃ）が：
形質転換細胞を含んでなる多芽培養物を選択する工程；
この多芽培養物を苗条の伸長を促進する条件下で生長させ、少なくとも１つの形質転換苗条を産生する工程；
この少なくとも１つの形質転換苗条をクローン化する工程；及び、
クローン苗条を形質転換植物へ成熟させる工程を含む、請求項３０に記載の方法。 - クローン苗条が、根形成を促進する培地でこのクローン苗条を生長させた後で、成熟した形質転換植物へ生長する、請求項４４に記載の方法。
- 請求項３０〜４５のいずれか１項に記載の方法により産生される形質転換プラスチドゲノム。
- 請求項４６に記載の形質転換プラスチドゲノムを含むプラスチド。
- 請求項４６に記載のプラスチドゲノムを含む形質転換植物細胞。
- 請求項４８に記載の植物細胞を含む形質転換植物。
- 請求項４９に記載の形質転換植物により産生される種子であって、多芽培養物へ形質転換された核酸を含む、前記種子。
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