JP2004505997A - シクロフィリン受容体アンタゴニストを用いるhiv−1感染および炎症性疾患の治療 - Google Patents
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Abstract
本発明の実施例および具体例は、とりわけ、CD147としても知られる以前に知られた細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導蛋白質(EMMPRIN)がシクロフィリン(CyP)のシグナル変換細胞受容体であることを教示および開示する。したがって、新規な治療的介入標的としてCyP/EMMPRIN相互作用を用いる、HIV感染、AIDS、AIDS関連障害、慢性関節リウマチ(RA)、結合組織障害、癌あるいは局所的または全身性のCyP放出、合成または結合によって特徴付けられるいずれかの症状の治療法が開示される。さらに、抗−EMMPRIN抗体、ならびにCyP/EMMPRIN相互作用を阻害することによって作用する可溶性EMMPRIN蛋白質およびペプチドを含む医薬組成物が開示される。本発明は、さらに、CyP/EMMPRIN相互作用を阻害する化合物の同定のためのスクリーニングアッセイを提供する。
Description
【0001】
(技術分野)
本発明は、シクロフィリン(CyP)およびヒト細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導蛋白質(EMMPRIN)間のリガンド/受容体関係のアンタゴニストを利用するHIV感染、後天性免疫不全症候群(AIDS)、慢性関節リウマチ(RA)、結合組織障害および癌の治療法を提供する。本発明は、さらに、CyP/EMMPRIN結合相互作用を修飾することによって治療活性を提供する抗−EMMPRIN抗体およびEMMPRINまたはEMMPRINペプチドの可溶性形態を提供する。本発明は、さらに、CyP/EMMPRIN結合相互作用を修飾する化合物の同定のためのスクリーニングアッセイを提供する。
【0002】
(背景技術)
本発明は、シクロフィリン、シクロフィリンの細胞受容体とのその同種相互作用およびシクロフィリン関連障害の治療に関する。例えば、シクロフィリンAは、とりわけ、(1)HIV感染由来の後天性免疫不全症候群(AIDS)に関連する症状および(2)炎症性疾患(例えば、慢性関節リウマチ)の病因に関与する。
【0003】
(1)後天性免疫不全症候群(AIDS)
ヒト免疫不全ウイルス(HIV)は、レトロウイルスのレンチウイルスファミリーのメンバーである(Teichら、RNA Tumor Viruses, Weissら、eds. CSH−Press, pp. 949−956, 1984)。HIVは、後天性免疫不全症候群(AIDS)と呼ばれる遅変性免疫系疾患の主要な原因として関係している(Barre−Sinoussiら、Science 220: 868−870, 1983; Galloら、Science 224: 500−503, 1984)。ヒトにおいて、HIV複製は、CD4+Tリンパ球およびマクロファージ集団において顕著に起こり、HIV感染はT細胞の涸渇を導き、結局、免疫不全、日和見感染、神経機能不全、新生物成長および最終的には死を導く。
HIVウイルス粒子のコアは、キャプシド抗原(CA)蛋白質をウイルスRNAゲノムおよび初期複製事象に必要な酵素と一緒に含む。ミリスチル化マトリックス抗原(MA)蛋白質は、ウイルスコアと感染された細胞膜由来の脂質膜外被との間の空間を埋める。HIV外被表面糖蛋白質は、ウイルス出芽の間に細胞性プロテアーゼによって2つの糖蛋白質、gp41およびgp120に切断される1つの160Kd前駆体蛋白質として合成される。ウイルス性gp41は膜貫通型糖タンパク質であり、gp120は、おそらく3量体または多量体形態において、gp41と非共有結合したままの細胞外糖蛋白質である(Hammarskjold & Redosh, Biochem. Biophys Acta 989: 269−280, 1989)。
【0004】
CD4はHIV−1ウイルスの細胞受容体として作用するので、HIVはCD4+宿主細胞を標的とする(Dalgleshら、Nature 312: 763−767, 1984; Klatzmannら、Nature 312: 767−768, 1984; Maddonら、Cell 47: 333−348, 1986)。細胞中へのウイルス侵入は、gp120が細胞のCD4受容体分子に結合することに依存し(McDougalら、Science 231: 382−385, 1986; Maddonら、Cell 47: 333−348, 1986)、gp120はHIVのCD4+細胞に対する親和性を明らかにし、一方、gp41はウイルス膜中の外被糖蛋白質複合体を固定する。これらのウイルス:細胞相互作用は感染に必要であるが、付加的なウイルス:細胞相互作用もまた必要とされるという証拠がある。
HIV感染は世界的に流行しており、HIV関連疾患は主要な世界的な健康問題の代表である。不運にも、HIV感染および/またはAIDSに対する最終的に病気に効く抗レトロウイルス薬またはワクチンは存在しない。かかる薬剤およびワクチンを開発する試みは、HIV生活環の種々の段階に対応する分子を標的としてきた(例えば、逆転写酵素、後期ウイルス性プロテアーゼ、およびワクチンの場合、gp160、gp120およびgp41)。また、HIV感染の最も初期の段階である細胞中へのウイルスの侵入を阻害できる薬剤を開発するための試みもなされている。この点で、治療的介入の焦点がHIVの認識された細胞表面受容体であるCD4およびCCR5に向けられた。例えば、組換え型可溶性CD4は、いくつかのHIV−1株によるCD4+T細胞の感染を阻害することが示された(Smithら、Sicience 238: 1704−1707, 1987)。しかしながら、ある種の初代HIV−1単離株は、組換え型CD4による阻害に対し比較的感受性ではない(Daarら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6574−6579, 1990)。さらに、組換え型可溶性CD4の臨床試験は結論に達しない結果をもたらした(Schooleyら、Ann. Int. Med. 112:247−253, 1990; Kahnら、Ann. Int. Med. 112:254−261, 1990; Yarchoanら、Proc. Vth Int. Conf. on AIDS, p.564, MCP 137, 1989)。
したがって、たとえ、かなりの努力が抗レトロウイルス薬およびワクチンの設計および試験に向けられていても、効果的で非毒性の治療に対する当該分野における要望がある。
【0005】
AIDSに対する新規な治療的介入の標的;シクロフィリンA
シクロフィリンA(本明細書では以後、「CyPA」という)は、幅広い種類の細胞において発現される19KD蛋白質である。CyPAは免疫抑制剤シクロスポリンA(以後、「CsA」という)に結合し(Etzkornら、Current Biology 3; 929−933, 1993; Liu, Immunol. Today. 14: 290−295, 1993(Immunol. Today 14(8):399, 1993に正誤表が発表された)、ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼ(PPIase)活性および蛋白質折りたたみまたは「シャペロン」活性を有する(Galat, Eur. J. Biochem. 216:689−707, 1993; Kofronら、Biochemistry. 30:6127−6134, 1991 (Bichemistry 30(44):10818, 1991において正誤表が発表された)。CyPAは、免疫の調節に関与する関連細胞因子の1群である「イムノフィリンファミリー」のメンバーである(Galat, Eur. J. Biochem. 216−689−707, 1993; Frumanら、FASEB. J. 8:391−400, 1994)。少なくとも4つの型の哺乳類シクロフィリンがクローン化されている(CyPA、CyPB、CyPCおよびhCyP3)(Friedmanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6815−6819, 1993)。
【0006】
CyPAは、移植片拒絶の予防において幅広く使用される強力な免疫抑制剤であるCsAに対する宿主細胞受容体の1つであると認識される。CsAは、強力な免疫抑制、抗寄生虫、殺真菌および慢性抗炎症特性を示す疎水性環状ウンデカペプチドのファミリーのメンバーである。CsAは、T細胞活性化における初期段階を阻害することによってその免疫抑制効果を発揮すると考えられる。CsAは、T細胞増殖因子インターロイキン2(IL−2)のRNA転写を阻害し、前駆体細胞融解性Tリンパ球によるIL−2受容体の発現を阻害することが見出された(Palacios, J. Immunol. 128: 337, 1982)。CyPAは、免疫抑制を顕在化するのに必要なレベルと一致した値である10−8モル/Lの範囲の解離定数でCsAに結合する(Handschumacherら、Science 226:544, 1984)。
【0007】
CyPAとHIVビリオンのGag蛋白質、詳細にはそのキャプシド抗原部分との機能的結合が同定された(lubanら、Cell, 1993)。CyPAは特異的にHIV−1ビリオン中に組み込まれ、Gag−シクロフィリン相互作用の崩壊がCyPAのビリオン中への組み込みおよびHIV−1複製の両方を妨げることが報告された(Frankeら、Nature 372:359−362, 1995; Thaliら、Nature 372:363−365, 1994)。これらのデータは、GagとCyPAとの相互作用が感染性HIV−1ビリオンの形成に必要であるというモデル(Braatenら、J.Virol. 70: 3551−3561, 1996)と一致する。
【0008】
CsAは、イン・ビトロでGag−シクロフィリン相互作用を干渉し、シクロフィリンのビリオン中への組み込みを阻害し、細胞培養におけるHIV−1の複製を阻害することが示された(Frankeら、上掲;Thaliら、上掲;Billichら、J.Virol. 69:2451−2461, 1995)。CsAがHIV−1ウイルスと直接相互作用することは示されていない。CsAおよびその類似体がHIV生活環における2つの段階にて干渉すると仮定される。第1に、感染の確立の間にCyPAと相互作用することによる。ここに、CsA処理は、環状HIV DNAの形成およびプロウイルスDNAの宿主ゲノム中への組み込みによって測定した場合、感染細胞のゲノム中への組み込みの前にHIV感染を阻害する(Sherryら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 1758−1763, 1998)。第2に、ウイルス複製の後期にてCyPAと相互作用し、HIV−1粒子中へのCyPA組み込みを妨げることによって、ウイルスを非感受性にすることによる(Billichら、上掲)。したがって、研究活動は、抗HIV剤を開発するための試みにおいて、ウイルス性Gag蛋白質と細胞性CyPA蛋白質との間の相互作用を崩壊させることに集中している。
【0009】
上述の観察にもかかわらず、患者におけるHIV感染の治療としてのCsAの有用性は厳格に制限されている。第1に、CsAは強力な免疫抑制剤である。したがって、免疫系が損なわれるであろうHIV感染患者におけるその使用は禁忌である。さらに、CsAおよびその類似体のHIV阻害効果は、CsAを用いて免疫抑制を実現するのに必要な量よりも10〜100倍高い薬物濃度を必要とする。やや逆説的には、シクロスポリンの一般的に全身性免疫系を抑制する能力は、HIV感染の治療として提案されている(米国特許第4814323号参照)。しかしながら、激しく免疫抑制された状態のHIV感染患者では、該治療法はひどい不利益を有する。
【0010】
したがって、当該分野において、新規なCyPA関連性介入標的および結合剤を同定し、特徴付けること、およびHIV感染の治療および予防のための新規な化合物および方法を同定するためのそれらの使用に対する要望がある。当該分野において、CyPAが特異的に細胞と相互作用してHIV感染の媒介となる手段を同定および機構的に理解すること、およびかかるメカニズムの治療上の使用方法または新規な治療剤を見出すこと、または新規かつ有用な診断的および予後的アッセイを提供することに対する要望がある。
【0011】
(2)慢性関節リウマチ
慢性関節リウマチ(以後、RAという)は、関節の慢性炎症性疾患である。RAは、相当な罹病率、機能的無能力および高い死亡率を伴う(Harris, N. Engl. J. Med. 322:1277−1289, 1990 (N. Engl. J. Med. 323:996, 1990に正誤表が発表された;コメント参照))。米国において概算で2−4百万ケースのRAがあり、そのピークの発病率は35歳〜45歳である(Brooks, 上掲)。RAの病因は知られていない。
【0012】
T細胞依存性メカニズムによって開始すると考えられる持続性炎症性滑膜炎は、代表的なRAの1つであり、通常、対称性多発関節炎として周囲の関節に影響を及ぼす(Brooks,上掲)。該炎症性滑膜炎は、(a)酸素ラジカルおよび蛋白質分解酵素を放出する好中球を浸潤させ、(b)好中球プロテアーゼによって自体活性化されるマトリックスメタロプロテイナーゼのプロ酵素形態を放出し、次いで軟骨崩壊を引き起こす内在性繊維芽細胞様滑膜細胞によって、悪化すると考えられている。したがって、滑膜炎症は軟骨崩壊および骨腐食、次いで関節変形をもたらす(Zvaifler & Firestein, Arthritis Rheum. 37: 783−789, 1994; Sewell & Trentham, Lancet 341: 283−286, 1993)。
【0013】
T細胞関与
RAの開始および永久化におけるT細胞の役割について強力な証拠が蓄積しているが、他の細胞型(例えば、樹状細胞、繊維芽細胞様滑膜細胞、および初代B細胞)は特徴的な進行性の関節崩壊に寄与している(Thomasら、J. Leukoc. Biol. 66: 286−292, 1999; McCachren, Arthritis Rheum. 34: 1085−1093, 1991; Zvaifler & Firestein, 上掲)。相当な証拠が好中球および好中球生産物が関節崩壊に関与することを示す(Edwards & Hallett, Immunol. Today 18:320−324, 1997; Harris, 上掲;Kakimotoら、Cell Immunol. 165: 26−32, 1995; Janusz & Durham, Inflamm. Res. 46:503−508, 1997; Griffithsら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:517−521, 1995)。
【0014】
したがって、慢性関節リウマチは、複数の細胞型が関与する複雑な進行性の疾患である。RA患者における治療的介入戦略は、第1に、該疾患の発病および進行を阻害することに向けられており、第2に、関節の損傷および傷害の媒介となる局所的な関節炎症を阻害することに向けられている(Harris, N. Engl. J. Med. 322: 1277−1289, 1990 (N. Engl. J. Med. 323:996, 1990に正誤表が発表された;コメント参照),Brooks, Lancet 341:286−290, 1993)。
【0015】
RAにおける滑液の過形成に対する刺激は、古典的には、免疫媒介性炎症過程として記載されてきた(Zvaifler & Firestein, Arthritis Rheum. 37: 783−7899, 1994)。かかる炎症は、RA滑膜の内膜下浸潤物中における有力な細胞である活性化したCD4+細胞によって生成される因子に対する応答であると考えられる(Zvaifler & Firestein, Arthritis Rheum. 37: 783−7899, 1994; McCachren, Arthritis Rheum. 34: 1085−1093, 1991)。さらに、特異的クラスII MHC多形がRAに対する危険性を与えるという観察は、T細胞がRAの発達において中枢的な役割を果たすことを強く示唆する(Gregersenら、Am. J. Med. 85: 17−19. 1988; Winchesterら、Rheum. Dis. Clin. North Am. 18:761−783, 1992)。
【0016】
T細胞がRAの病因の肝要な役割を果たすという事実は、RA患者における治療薬としてのシクロフィリンA(以後、「CsA」という)の使用をもたらした(Yocum, Semin. Arthritis Rheum. 29: 27−35, 1999; Brooks, Lancet 341: 286−290, 1993; de Wynterら、Stem. Cells 16: 349−356, 1998)。CsAは、シクロフィリンの細胞内貯蔵への結合を介して作用すると推定される強力な免疫抑制剤である(Erlanger, Immunol. Today. 13: 487−490, 1992; Liu, Immunol. Today 14: 290−295, 1993 (Immunol. Today 14(8):399, 1993に正誤表が発表された(コメント参照))。
【0017】
RAにおける非T細胞因子;好中球およびマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMPs)
2つの主張が、RA関連病理において、T細胞のほかに他の因子の決定的な関与を示す。第1に、T細胞産物がRA滑液または抽出物中で明らかにされなかった(Edwards & Hallett, Immunol. Today 18:320−324, 1997)。第2に、T細胞媒介性免疫応答の修飾に基づく現行の戦略は効き目がなく、深刻な毒性を伴う可能性がある。さらに、特に、該疾患がいったん確立されたならば(すなわち、およそ1年目以降に)、かかるT細胞に基づく戦略が骨および軟骨破壊の進行を制限できるという証拠がない(Zvaifler & Firestein, Arthritis Rheum. 37: 783−789, 1994; Yocum, Semin. Arthritis Rheum. 29:27−35, 1999)。
【0018】
好中球
RAは、滑液中の大量の好中球の蓄積によって特徴付けられる。C5a、ロイコトリエンB4、血小板活性化因子(PAF)およびIL−8のような化学誘引物質(Harris, N. Engl. J. Med. 322: 1277−1289, 1990 (N. Engl. J. Med. 323: 996, 1990に正誤表が発表された;コメント参照); Edwards & Hallett, Immunol. Today 18: 320−324, 1997; Premack & Schall, Nature Med. 2: 1174−1178, 1996)は、特徴的な好中球流入の顕在化において役割を果たすと考えられる。好中球は、おそらく細胞破壊物および免疫複合体の食作用によって、滑液内で活性化し、その結果、脱顆粒およびプロテイナーゼおよび反応性オキシダントの放出をもたらす(Harris, N. Engl. J. Med. 322: 1277−1289, 1990 (N.Engl. J. Med. 323: 996, 1990に正誤表が発表された;コメント参照))。さらに、活性化された好中球は、RA滑液中で検出可能なサイトカインの多く:IL−1β、IL−8、IL−12、TNF−α、TGF−およびGRO−αを分泌する(Edwards & Hallett, Immunol. Today 18: 320−324, 1997)。好中球はまた、おそらく、破壊する関節中に酵素(例えば、エラスターゼ)を放出するので、組織破壊において中心的な役割を果たす(Swell & Trentham, Lancet 341: 283−286, 1993; Edwards & Hallett, Immunol. Today 18: 320−324, 1997)。したがって、特異的な阻害剤(例えば、MDL101、146およびONO−5046)を用いて好中球エラスターゼを阻害することは、関節炎動物モデルにおいて軟骨破壊の減少をもたらす(Janusz & Durham, Inflamm. Res. 46:503−508, 1997; Kakimotoら、Cell Immunol. 165: 26−32, 1995)。
【0019】
マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMPs)
マトリックスメタロプロテイナーゼ(以後、「MMPs」という)は、細胞外マトリックス成分を破壊することのできる構造的に関連する亜鉛メタロエンドペプチダーゼの群を含む(Nagaseら、Matrix Suppl. 1:237−244, 1992; Giambernardiら、Matrix Biol. 16: 483−496, 1998)。MMPsは、MMP活性が種々の細胞型において正確に調節される正常組織リモデリング過程において重要な有益な役割を果たす。MMP活性は、前駆体活性化(プロMMPからMMPへ)または内在性阻害剤、例えば、α2−マクログロブリンおよびメタロプロテイナーゼの組織阻害剤(TIMPs)による活性化された種の阻害のいずれかによって、細胞性遺伝子発現レベルにて調節されるだけでなく、蛋白質レベルでも調節される(Nagaseら、Matrix Suppl. 1:237−244, 1992; Ogataら、J. Biol. Chem. 270:18506−18511, 1995; Zuckerら、J. Biol. Chem. 273: 1216−1222, 1998)。
しかしながら、MMPsの脱調節作用は、関節炎、歯周炎、組織潰瘍、ならびに癌細胞侵入および転移などの多くの結合組織疾患における細胞外マトリックスの病理学的破壊に寄与する(Kahariら、Exp. Dermatol. 6: 199−213, 1997; Keyszerら、J. Rheumatol. 26: 251−258, 1999; Benbowら、J. Biol. Chem. 274: 25371−25378, 1999; Keyszerら、Z. Rheumatology 57: 392−398, 1998)。
【0020】
RAの新規な治療的介入標的:シクロフィリン
RAにおける病理学的プロセスの正確な原因はまだ論争中である。典型的には、RAの治療は、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)および遅効性抗リューマチ薬(SAARD)の組み合わせを用いる多くの専門分野にわたるアプローチを含んでいた。かかる組み合わせ療法は、しばしば効果的であるが、重大な副作用をもたらす。例えば、NSAIDは関節炎症の重大な症状の軽減を提供するが、腎臓および胃に蓄積して、胃腸の不快感、腎臓損傷および皮膚反応を包含する有害な反応をもたらす可能性がある(Yocum, Semin. Arthritis Rheum. 29: 27−35, 1999; Brooks, Lancet 341: 286−290, 1993)。
したがって、RAの新規な治療法の設計を可能にするであろう新規な治療標的を同定することに対し、当該分野において要望がある。RAにおける治療的介入のための3つの幅広い病理学的プロセス領域は:異常なT細胞活性化応答;滑液細胞の異常増殖ならびに滑液細胞による過剰なサイトカインおよびMMP生産;および末梢血から管外部位への白血球の移動である。
【0021】
シクロフィリンA
上記の3つプロセス領域の全てに関連する1の特異的治療標的は、CsAの遍在的に分布した宿主細胞受容体であるシクロフィリンA(以後、「CyPA」という)である。CyPAは、完全に細胞内蛋白質ではないが、また、炎症刺激に応答して細胞により分泌される(Sherryら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3511−3515, 1992)。細胞外CyPAは、イン・ビトロでの強力な好中性および好酸性化学誘引物質であり、イン・ビボで注射されたとき、好中球の迅速な流入によって特徴付けられる炎症応答を顕在化する(Sherryら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3511−3515, 1992; Xuら、J. Biol. Chem. 267: 11968−11971, 1992; Leiva & Lyttle, Biochem. Biophys. Res. Commun. 186: 1178−11836, 1992)。CyPAの白血球誘引活性はCsAの存在下で阻害されるが、CsAの非免疫抑制類似体であるシクロフィリンGによって阻害されない(Sherryら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3511−3515, 1992; Xuら、J. Biol. Chem. 267: 11968−11971, 1992)。
【0022】
RA患者の関節中の滑液は、高レベルのCyPAを含有しており、かかるCyPAレベルは滑液中の好中球の数および疾患の重篤度の両方と相関する(Billichら、J. Exp. Med. 185: 975−980, 1997)。滑液中に放出されたCyPAが好中球を誘引しており、それが到達すると活性化し、次いで、蛋白質分解性酵素およびオキシダントを放出し、軟骨破壊を促進し、疾患を悪化させると仮定するのが論理的である。したがって、RAを軽減することにおけるCsAの有効性は2つの方法において明らかにされうる。第1に、そのT細胞活性化干渉能を介して作用することができ、よって疾患プロセスの開始を干渉しうる。第2に、CsAは、活性な疾患の期間中、関節において放出されるCyPAに結合することによって作用することができ、それにより、CyPAの好中性化学誘引活性を阻害しうる。
しかしながら、CsA処理は本質的に毒性であり、その結果、肝臓破壊、免疫抑制をもたらし、また、日和見感染に感染しやすくなる。これらの毒性影響は、CsAが膜浸透性であり、全ての細胞中に容易に侵入するという事実の結果である。
【0023】
したがって、当該分野において、RA病因および進行、HIV感染およびこれらのプロセスのメカニズムの悪化の基本的病態生理学のさらなる理解を得る必要がある。したがって、当該分野において、新規なシクロフィリン関連介入標的を同定し、特徴付ける必要があり、また、炎症疾患を治療するための、およびHIV感染を予防するための新規な化合物および方法を同定するためにかかる標的を使用する必要がある。当該分野において、シクロフィリンが特異的に細胞と相互作用してシグナル変換およびHIV感染の媒介となる手段を同定し、そのメカニズムを理解する必要がある。最後に、当該分野において、いったん同定されたならば、かかるメカニズムがどのように治療上使用できるかを理解するか、または新規な治療剤を見出すか、またはこれらの症状の新規かつ有用な診断的および予後的アッセイを提供する必要がある。
【0024】
(発明の開示)
本発明は、以前に知られた細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導蛋白質(”EMMPRIN”)(配列番号2)(CD147としても知られる)がシクロフィリン(”CyP”)の新規な細胞表面受容体であるという驚くべき知見に基づいている。したがって、本発明の実施例および具体例は、HIV−1感染、後天性免疫不全症候群(”AIDS”)、炎症性および自己免疫疾患(例えば、慢性関節リウマチ(”RA”)、EAE、ARDSおよび歯周炎)、結合組織障害、腫瘍成長または移転、あるいは治療の必要な患者における局所的または全身性のCyP放出、合成または結合によって特徴付けられるいずれかの症状などの徴候のための治療法、医薬組成物およびかかる徴候に対する治療活性を有する試験化合物のスクリーニングアッセイを提供する。
【0025】
治療法
本発明は、炎症性疾患、自己免疫疾患、組織潰瘍、腫瘍成長または転移、あるいは治療の必要な患者における局所的または全身性のCyP放出、合成または結合によって特徴付けられるいずれかの症状を治療または予防するための方法であって、治療上有効量のCyP/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストを患者に投与することを特徴とする方法を提供する。好ましくは、CyP/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストは、抗−EMMPRIN抗体、可溶性EMMPRIN蛋白質またはポリペプチド、CyP蛋白質またはポリペプチドおよびその組み合わせである。好ましくは、炎症性または自己免疫疾患は、関節炎、EAE、ARDSまたは歯周炎である。好ましくは、CyP/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストは、抗−EMMPRIN抗体である。好ましくは、抗−EMMPRIN抗体はEMMPRINの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインに結合する。好ましくは、抗−EMMPRIN抗体はモノクローナル抗体である。好ましくは、抗−EMMPRINモノクローナル抗体は、1本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはFabフラグメントである。最も好ましくは、抗−EMMPRIN抗体は、UM−8D6抗−CD147モノクローナル抗体によって認識されるエピトープに結合する。好ましくは、CyP/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストは、EMMPRIN膜貫通ドメインに対応する配列番号2のおよその残基206からおよその残基229までにわたる配列から取り出した約5〜14個のアミノ酸のアミノ酸配列を含むEMMPRNポリペプチドである。
【0026】
本発明は、さらに、炎症性疾患、自己免疫疾患、組織潰瘍、腫瘍成長または転移あるいは治療の必要な患者における局所的または全身性のCyP放出、合成または結合によって特徴付けられるいずれかの症状を治療または予防する方法であって、治療上有効量の式I:
I R1−R2−R3−R4−R5−R6−Pro−R7−R8−R9
[式中、R1−は、His−、SerHis−、ArgSerHis−、Lys−、LysLys−、Arg−であるか、または存在せず;R2、R3およびR4は独立して、Leu、Ile、Ala、Metであるか、または存在せず;R5およびR8は独立して、Leu、Ile、AlaまたはMetであり;R6およびR7は独立して、Phe、TrpまたはTyrであり;−R9は、−Gly、−GlyIle、−GlyIleValであるか、または存在しない]
で示される化合物を患者に投与することを特徴とする方法を提供する。好ましくは、R1−がHis−、SerHis−、ArgSerHis−、Lys−、LysLys−、Arg−であるか、または存在せず;R2−がLeuであり;R3がAlaであり;R4がAlaであり;R5がLeuであり;R6がTrpであり;R7がPheであり;R8がLeuであり;−R9が存在しない式Iである。好ましくは、R1−が存在せず;R2がLeuであり;R3がAlaであり;R4がAlaであり;R5がLeuであり;R6がTrpであり;R7がPheであり;R8がLeuであり;−R9が存在しない式Iである。
【0027】
本発明は、さらに、細胞が機能的EMMPRIN受容体を発現し、レトロウイルスがウイルス感染の組み込み前工程において該EMMPRIN受容体を利用するレトロウイルス感染に対する細胞の感受性を減少させる方法であって、レトロウイルス感染の組み込み前工程を阻害するのに十分な量のCyP/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストと該細胞とを接触させることを特徴とする方法を提供する。好ましくは、CyP/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストは、抗−EMMPRIN抗体、可溶性EMMPRIN蛋白質またはペプチド、CyP誘導体またはペプチド、およびその組み合わせである。好ましくは、CyP/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストは、抗−EMMPRIN抗体である。好ましくは、抗−EMMPRIN抗体はEMMPRINの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインに結合する。好ましくは、抗−EMMPRIN抗体はモノクローナル抗体である。好ましくは、抗−EMMPRINモノクローナル抗体は、1本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはFabフラグメントである。最も好ましくは、抗−EMMPRIN抗体は、UM−8D6抗−CD147モノクローナル抗体によって認識されるエピトープに結合する。好ましくは、CyP/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストは、EMMPRIN膜貫通ドメインに対応する配列番号2のおよその残基206からおよその残基229までにわたる配列から取り出した約5〜14個のアミノ酸のアミノ酸配列を含むEMMPRNポリペプチドである。
【0028】
本発明は、さらに、細胞が機能的EMMPRIN受容体を発現し、レトロウイルスがウイルス感染の組み込み前工程においてEMMPRIN受容体を利用するレトロウイルス感染に対する細胞の感受性を減少させる方法であって、該細胞をレトロウイルス感染の組み込み前工程を阻害するのに十分な量の式I:
I R1−R2−R3−R4−R5−R6−Pro−R7−R8−R9
[式中、R1−は、His−、SerHis−、ArgSerHis−、Lys−、LysLys−、Arg−であるか、または存在せず;R2、R3およびR4は独立して、Leu、Ile、Ala、Metであるか、または存在せず;R5およびR8は独立して、Leu、Ile、AlaまたはMetであり;R6およびR7は独立して、Phe、TrpまたはTyrであり;−R9は、−Gly、−GlyIle、−GlyIleValであるか、または存在しない]
で示される化合物と接触させることを特徴とする方法を提供する。好ましくは、R1−がHis−、SerHis−、ArgSerHis−、Lys−、LysLys−、Arg−であるか、または存在せず;R2がLeuであり;R3がAlaであり;R4がAlaであり;R5がLeuであり;R6がTrpであり;R7がPheであり;R8がLeuであり;−R9が存在しない式Iである。好ましくは、R1−が存在せず;R2がLeuであり;R3がAlaであり;R4がAlaであり;R5がLeuであり;R6がTrpであり;R7がPheであり;R8がLeuであり;−R9が存在しない式Iである。
【0029】
本発明は、さらに、HIV感染、AIDSまたはAIDS関連障害をその治療が必要な患者において治療または予防する方法であって、治療上有効量のCyPA/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストを患者に投与することを特徴とする方法を提供する。好ましくは、CyP/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストは、抗−EMMPRIN抗体、可溶性EMMPRIN蛋白質またはペプチド、CyPA誘導体またはペプチドおよびその組み合わせである。好ましくは、CyP/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストは抗−EMMPRIN抗体である。好ましくは、抗−EMMPRIN抗体は、EMMPRINの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインに結合する。好ましくは、抗−EMMPRIN抗体はモノクローナル抗体である。好ましくは、抗−EMMPRINモノクローナル抗体は、1本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはFabフラグメントである。最も好ましくは、抗−EMMPRIN抗体はUM−8D6抗−CD147モノクローナル抗体によって認識されるエピトープに結合する。
【0030】
本発明は、さらに、HIV感染、AIDSまたはAIDS関連障害をその治療が必要な患者において治療または予防する方法であって、治療上有効量の式I:
I R1−R2−R3−R4−R5−R6−Pro−R7−R8−R9
[式中、R1−は、His−、SerHis−、ArgSerHis−、Lys−、LysLys−、Arg−であるか、または存在せず;R2、R3およびR4は独立して、Leu、Ile、Ala、Metであるか、または存在せず;R5およびR8は独立して、Leu、Ile、AlaまたはMetであり;R6およびR7は独立して、Phe、TrpまたはTyrであり;−R9は、−Gly、−GlyIle、−GlyIleValであるか、または存在しない]
で示される化合物を患者に投与することを特徴とする方法を提供する。好ましくは、R1−がHis−、SerHis−、ArgSerHis−、Lys−、LysLys−、Arg−であるか、または存在せず;R2がLeuであり;R3がAlaであり;R4がAlaであり;R5がLeuであり;R6がTrpであり;R7がPheであり;R8がLeuであり;−R9が存在しない式Iである。好ましくは、R1−が存在せず;R2がLeuであり;R3がAlaであり;R4がAlaであり;R5がLeuであり;R6がTrpであり;R7がPheであり;R8がLeuであり;−R9が存在しない式Iである。
【0031】
スクリーニングアッセイ
本発明はさらに、HIV感染、AIDSまたはAIDS関連障害、炎症性疾患、自己免疫疾患、腫瘍成長または転移あるいは治療が必要な患者における局所的または全身性のCyP放出、合成または結合によって特徴付けられるいずれかの症状に対して治療活性を有する試験化合物を同定する方法であって:(a)試験化合物を機能的CyP蛋白質および機能的EMMPRIN蛋白質と接触させ、ここに、該蛋白質の少なくとも1つが検出可能なラベルを有し;(b)いずれかの得られるEMMPRIN/CyP複合体を該ラベルの存在に関してアッセイし;次いで(c)試験化合物がCyP蛋白質のEMMPRIN蛋白質への結合を阻害したかどうかを決定し、それにより、CyP蛋白質のEMMPRIN蛋白質への結合を阻害する試験化合物が治療化合物として同定されることを特徴とする方法を提供する。好ましくは、機能的EMMPRIN蛋白質または機能的CyP蛋白質のいずれかを固相上に固定する。好ましくは、CyP蛋白質またはEMMPRIN蛋白質を放射能ラベル、蛍光レポーターまたはクエンチャー部分、比色または蛍光変化を触媒する酵素ラベルまたはその組み合わせで標識する。好ましくは、炎症性または自己免疫疾患は関節炎、EAE、ARDSまたは歯周炎である。
【0032】
本発明は、さらに、HIV感染、AIDSまたはAIDS関連障害、炎症性疾患、自己免疫疾患、腫瘍成長または転移あるいは治療の必要に患者における局所的または全身性のCyP放出、合成または結合によって特徴付けられるいずれかの症状に対する治療活性を有する試験化合物を同定する方法であって:(a)試験化合物を機能的CyP蛋白質の存在下、機能的EMMPRIN蛋白質を発現している細胞と接触させ;次いで(b)試験化合物がCyP蛋白質のEMMPRIN蛋白質への結合を阻害するかどうかを決定し、それにより、CyP蛋白質のEMMPRIN蛋白質への結合を阻害する試験化合物が治療化合物として同定されることを特徴とする方法を提供する。好ましくは、炎症性または自己免疫疾患は関節炎、EAE、ARDSまたは歯周炎である。好ましくは、細胞は組換えEMMPRIN、CD4、CXCR4またはその組み合わせを発現する。好ましくは、CyP蛋白質のEMMPRIN蛋白質への結合の阻害の決定は、CyP/EMMPRINアンタゴニストアッセイ、受容体感作または脱感作アッセイ、受容体アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションアッセイ、EMMPRIN媒介性シグナル変換アッセイ、Ca2+動員アッセイ、マトリックスメタロプロテイナーゼ発現または活性アッセイ、細胞成長率アッセイ、HIV−1感染アッセイ、および細胞サイクルまたは細胞分化の特異的マーカーの検出に基づくアッセイよりなる群から選択されるアッセイを基礎とする。好ましくは、EMMPRIN媒介性シグナル変換アッセイは、細胞内蛋白質のリン酸化または活性化状態の決定に基づき、ここに、細胞内蛋白質は、Ras、PKA、RAP1、B−Raf、MekおよびMAPKよりなる群から選択され、それにより、該細胞内蛋白質のリン酸化または活性化状態を対照細胞におけるそのリン酸化または活性化状態と比べて変化させる試験化合物が治療化合物として同定される。好ましくは、細胞周期または細胞分化の特異的マーカーは、細胞周期調節蛋白質サイクリンD1、サイクリンEおよびp21/Waf1よりなる群から選択され、それにより、該細胞周期マーカーを対照細胞におけるその状態と比べて変化させる試験化合物が癌治療化合物として同定される。好ましくは、マトリックスメタロプロテイナーゼ発現アッセイは、プロMMP−1、プロMMP−3、プロMMP−9、MMP−1、MMP−3またはMMP−9の発現または活性を測定する。好ましくは、HIV−1感染アッセイは、ウイルス性逆転写酵素活性またはウイルスに指示されるルシフェラーゼ発現を測定する。
【0033】
医薬組成物
本発明はさらに、式Iの化合物またはその医薬上許容される塩および医薬上許容される担体を含んでなる医薬組成物を提供し、ここに、式Iは
I R1−R2−R3−R4−R5−R6−Pro−R7−R8−R9
[式中、R1−は、His−、SerHis−、ArgSerHis−、Lys−、LysLys−、Arg−であるか、または存在せず;R2、R3およびR4は独立して、Leu、Ile、Ala、Metであるか、または存在せず;R5およびR8は独立して、Leu、Ile、AlaまたはMetであり;R6およびR7は独立して、Phe、TrpまたはTyrであり;−R9は、−Gly、−GlyIle、−GlyIleValであるか、または存在しない]
である。好ましくは、R1−がHis−、SerHis−、ArgSerHis−、Lys−、LysLys−、Arg−であるか、または存在せず;R2がLeuであり;R3がAlaであり;R4がAlaであり;R5がLeuであり;R6がTrpであり;R7がPheであり;R8がLeuであり;−R9が存在しない式Iである。好ましくは、R1−が存在せず;R2−がLeuであり;R3がAlaであり;R4がAlaであり;R5がLeuであり;R6がTrpであり;R7がPheであり;R8がLeuであり;−R9が存在しない式Iである。
【0034】
図面の簡単な記載
図1(左側のパネル)は、本発明によって単離されたcDNAクローン(配列番号1)によってコードされるヒトEMMPRIN蛋白質の概略図を示す。269アミノ酸EMMPRIN蛋白質は、シグナルペプチド(sp)、細胞外ドメイン(ecd)、膜貫通ドメイン(tm)および細胞内ドメイン(icd)を包含する数個の機能的ドメインに分けられる。結合研究に用いられたEMM.C1およびEMM.C2構築物の両方がシグナルペプチドを欠き、一方(EMM.C1)は細胞外ドメインのみを有していた。図1の右側のパネルは、[35S]−標識したEMMPRINがCyPAセファロースアフィニティー樹脂によって特異的に保持されたことを示す。アフィニティーに結合されたEMMPRINを溶出し、電気泳動およびオートラジオグラフィーによって分析した。EMMPRINはCyPAを欠く対照樹脂によって保持されなかった。
図2は、空のベクターで安定にトランスフェクトされたCHO細胞(CHO)またはEMMPRIN発現CHO細胞系統(CHO−EMM)におけるEMMPRIN発現のFACS分析を示す。EMMPRIN発現は、抗−CD147(M6FT)、市販の抗−EMMPRIN抗体(Research Diagnostics, Inc.; Flanders, NJ)を用いてFACSによって分析された。CHO細胞は安定にトランスフェクトされて高レベルのEMMPRINを発現することができる。
【0035】
図3は、CHO(EMMPRIN発現なし)またはCHO−EMM細胞(安定な構造的EMMPRIN発現)におけるCa2+動員が外来的に加えられたCyPA(10μg/ml)によって誘導されたことを示す(左側のパネル)。CHO−EMM細胞におけるCyPAに誘導されたシグナリングは、抗−CD147mAb(M6FT)抗体(すなわち、抗−EMPRINmAB)によって阻害されたが、イソ型対照抗体によって阻害されなかった(右側のパネル)。
図4は、ゲニステイン(チロシンキナーゼ阻害剤)がCHO−EMM細胞においてCyPAにより誘導されるEMMPRIN媒介性Ca2+動員を完全に排除したことを示す。CyPAにより誘導されるCa2+動員は、細胞内シグナルの変換に関与することが知られている種々のキナーゼの種々の阻害剤を用いて前処理されたCHO−EMM細胞において測定された。曲線は、上方から下方へ、阻害剤なし、百日咳毒(PTX)B−オリゴマー(ケモカイン受容体の交差脱感作を誘導する)、PTX(Gi−GoおよびGt−蛋白質ファミリーのメンバーによって媒介されるシグナリング経路を不活性化する)、PD98059(MAPK阻害剤)、ビシンドリルマレイミドI(PKC阻害剤)およびゲニステインでの前処理を示す。ゲニステインは、CHO−EMM細胞においてCyPAにより誘導されるCa2+動員を完全に排除した。
【0036】
図5は、WI−38ヒト初代肺繊維芽細胞におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)発現に対するCyPA処理の影響のウェスタンイムノブロット分析を示す。ヒトWI−38繊維芽細胞をCyPAまたは培地のみで処理し、次いで、上清を収集し、ろ過し、マウスモノクローナル抗体(Cal Biochem, La Jolla, CA)を用いて、MMP−1、MMP−3およびMMP−9反応性についてウェスタンイムノブロットによって分析した。CyPA−処理は、プロMMP−1の発現および放出を活性化し、プロMMP−3のそれを増加させた。
【0037】
図6は、ルシフェラーゼ(左側および中央パネル)およびHIV−1逆転写酵素活性(右側パネル)の分析を示し、細胞表面EMMPRIN発現がCHO−EMMPRIN(CHO−EMM)細胞のMuLV−およびHIV−1LAV−偽型HIV−1(Luc−HIV−1)感染をCHO(対照)細胞と比べて増加させること、その増加効果が抗−CD147mAb(UM−8D6)によって大いに減少されること、およびその増加効果がプロウイルスDNAの組み込みの前の段階で明らかにされることを示す。
左側のパネルは、ルシフェラーゼを発現しているMuLV−偽型HIV−1で感染させたCHO(対照)またはCHO−EMM(EMMPRINを構造発現している)細胞におけるルシフェラーゼ発現(感染後4日目に測定され、対照に相対的なパーセンテージとして表した)を示す。細胞表面EMMPRINの存在はルシフェラーゼ発現を5〜6倍に増加させた。さらに、この増加は、感染中に抗−CD147mAb(UM−8D6)を加えた場合、大いに減少された。
中央パネルは、CD4−およびCXCR−発現ベクターで一過性トランスフェクトし、次いで、侵入に関してCD4およびCXCR4に依存するHIV−1LAV由来のEnvを有する偽型であるLuc−HIV−1で感染させたCHOまたはCHO−EMM細胞の3連培養におけるルシフェラーゼ発現を示す。ルシフェラーゼ発現は、対照(CHO/CD4/CXCR4細胞;100%とする)に相対的な発現のパーセンテージとして表わす。ルシフェラーゼ発現における3〜4倍の増加がEMMPRINを発現している細胞において観察された。
右側のパネルは、CD4−およびCXCR4−発現ベクターで一過性トランスフェクトし、次いで、抗−CD147mAb(UM−8D6)またはイソ型に合致する不適切な抗体の存在下、EnvMuLV−またはEnvLA1−偽型luc−HIV−1で感染させたCHOおよびCHO−EMM細胞における逆転写酵素活性を示す。ウイルス性DNAは、PCRによって、初期逆転写産物に特異的なプライマーLTR R/U5を用いて、感染の2時間後に分析された。結果は、ダイレクトイメージャー(Packard)において定量化され、対照(イソ型で処理したCHO/CD4/CXCR4細胞;100とする)に相対的なLTR/gag−特異的シグナルに関連する放射能として表わす。EnvMuLVおよびEnvLAV−偽型ウイルスでの感染後のLTR R/U5逆転写産物の量は、CHO/CD4/CXCR4細胞と比べてCHO−EMM/CD4/CXCR4細胞において3〜4倍に増加した。さらに、抗−CD147mAbはEMMPRINの増加効果を減少させた。
【0038】
図7Aは、抗−CD147mAbがヒト初代PBMCにおけるHIV−1複製を阻害したことを示す。PHA活性化PBMCの3連培養物をT−リンパ親和性X4株HIV−1LAVまたはマクロファージ親和性R5HIV−1ADA(左側のパネル)、あるいはLAVまたはADA株由来の外被を有するルシフェラーゼを発現している組換えHIV−1偽型(右側のパネル)のいずれかで感染させた。抗−CD147mAb(UM−8D6)またはイソ型に合致した対照mAbを感染の30分前に加え、実験の間中存在させた。ウイルス複製は、21日目の培養上清におけるRT活性(左側のパネル)または感染後4日目のルシフェラーゼ活性(右側のパネル)によって評価した。結果は、対照(イソ型に合致した不適切なmAbで処理した細胞;100%とする)に相対的なRTまたはルシフェラーゼ活性として表わす。結果は、EMMPRINがHIV−1感染に関与したことを示す。
【0039】
図7Bは、抗−CD147mAbがヒトPBMCへのHIV付着を阻害しなかったことを示す。3連PBMC培養物を37℃にて、抗−CD147mAb(UM−8D6;50μg/ml)、抗−CD4mAb(5μg/ml)またはヘパリナーゼIII(3x10−4IU/ml)で前処理し、次いで洗浄し、HIV−1LAV(p24の10ng/ml)と一緒に4℃で1時間インキュベートした。細胞に結合したウイルス性p24の量をELISAによってアッセイした。示される結果は、異なるドナー由来のPBMCを用いて行った3つの実験のうち1つの代表実験についてのものである。抗−CD147mAb(UM−8D6)は、ヒトPBMCへのHIV−1LAV付着を阻害しなかったが、抗−CD4mAbは付着を有意に減少させた。
【0040】
図7Cは、抗−CD147mAbが、PBMCとHIV−1 ADAおよびLAV外被を発現しているHeLa細胞との間のHIV Env媒介性融合を阻害せず、また、ウイルス性p24の細胞インターナリゼーションを減少させなかったことを示す。左側のパネル:PBMCとHIV−1Env(X4 LAVまたはR5 Ba−L)を発現しているHeLa細胞との間の融合は、抗−CD147(UM−8D6;50μg/ml)または抗−CD4(5μg/ml)mAbの存在下、β−Gal発現によって評価された(「方法」実施例6を参照のこと)。結果は、正の対照(非処理細胞;100%とする)に相対的なβ−Gal活性として表わし、同じドナー由来の細胞を用いる3つの独立した測定値の平均±SDとして示す。右側のパネル:ウイルス−細胞融合の分析の場合、PBMCをHIV−1LAVと一緒にインキュベートした(「方法」、実施例6を参照のこと)。次いで、細胞をトリプシン(0.025%、30分間、37℃)で処理し、溶解し、ウイルス性p24をELISAにより溶解物中において測定した。これらのデータは、抗−CD147mAb(UM−8D6)のHIV−1感染に対する阻害効果が融合後メカニズムによって媒介されたことを示す。
【0041】
図7Dは、抗−CD147mAbがHIV−1逆転写量を減少させたことを示す。左上および右側のパネル:PHA−活性化ヒトPBMCを抗−CD147mAb(UM−8D6;50μg/ml)または抗−CD4mAb(2μg/ml)、または対応するイソ型に合致した対照mAb(50μg/ml)のいずれかで、HIV−1感染の2時間前に処理した。HIV−1逆転写の分析は、HIV−1LAVでのPBMCの感染の2時間後に、「ストロング−ストップ」初期逆転写産物に特異的なLTR R/U5プライマーを用いて行った。PCR結果は、ダイレクトイメージャー(Packard)において定量化され、抗体−非処理対照(100%とする)に相対的な処理細胞におけるカウントパーセンテージとして示す。抗−CD147mAb(UM−8D6)は、逆転写産物の量をおよそ2倍減少させた。予測どおり(実施例6参照)、抗−CD4mAbはLTR R/U5増幅フラグメントの量をより一層減少させた。左下のパネル:細胞あたり1つのHIV−1ゲノムを含有する8E5/LAI細胞の希釈物をPCR標準物として用いた。
【0042】
図7Eは、HIV−1蛋白質の細胞レベル以下の分布に対する抗−CD147mAbの影響を示す。50μg/mlの抗−CD147mAb(Ancell)またはイソ型に合致した対照mAbの存在下、MT−4細胞に4℃にてHIV−1LAIを接種した。アリコート(1x106細胞)を蛋白質分析のために30分後に回収し(すなわち、0時間p.i.時点試料)(上方のパネル)、一方、接種した培養物を37℃に移し、1.5時間インキュベートした(下方のパネル)。細胞分画を行い(「方法」、実施例6参照)、サイトソル(C)、膜(M)および細胞骨格(CS)画分中の蛋白質を、アクチン、CAおよびMAに対するモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロットおよびECLによって分析した。ウイルス性MA蛋白質およびCAは、抗−CD147mAbの不在下、感染の1.5時間後に膜(M)から各々、細胞骨格(CS)およびサイトソル画分へ輸送された(イソ型パネル、各々、レーン「CS」および「C」)。しかしながら、MAおよびCAの両方が抗−CD147mAb(UM−8D6)で処理されたMT−4細胞における細胞膜画分に結合したままであり(α−CD147パネル、レーン「M」)、それは、EMMPRINがHIV−1脱外被の調節に関与したことを示す。
【0043】
図8は、CsA耐性HIVウイルス株の複製が抗−CD147mAbによって阻害されなかったことを示す。293T細胞をシクロスポリンA(1μM)の不在下(”C”)または存在下(”CsA”)、HIV−1NL4−3(”WT”)(左のパネル)または変異体(”A224E”)(右のパネル)ウイルスの分子クローンでトランスフェクトした。ウイルス生産性のトランスフェクト細胞を洗浄し、4連でさらに4日間、CD8+T細胞涸渇PBMCおよび抗−CD147mAb(UM−8D6;100μg/ml)を添加して(”293T+CD4+T細胞”)または添加しないで(”293T”)培養した。ウイルス複製は、培養上清中のRT活性を測定することによってアッセイした。結果は平均±SEとして示す。抗−CD147mAb(UM−8D6)は、CsA耐性A224Eウイルスの複製を阻害しなかったが、野生型ウイルスの複製を有意に減少させた。
【0044】
図9は、EMMPRIN膜貫通領域のアミノ末端由来の8アミノ酸ポリペプチド(配列番号3)がEnvMuLV偽型ルシフェラーゼ発現性HIV−1によるCHO−EMM細胞の感染を阻害したことを示す。左側のパネルは、CD147の概略構造(”sp”=シグナルペプチド、”e”=細胞外ドメイン、”t”=膜貫通ドメインおよび”c”=細胞質ドメイン)およびその膜貫通ドメイン由来の2つのペプチド(”ペプチド1”および”ペプチド2”)を示す。右側のパネルは、所定濃度のペプチド1、2および”スクランブルペプチド1”の存在下、組換えEnvMuLV−偽型ルシフェラーゼ発現性HIV−1で感染させたCHOおよびCHO−EMM細胞の感染後4日目のルシフェラーゼ発現データを示す。ペプチド1(LAALWPFL)は、EMMPRIN膜貫通ドメインのアミノ酸206−213に対応する8アミノ酸配列(配列番号3)である。ペプチド2(GIVAEVLVL)は、EMMPRIN膜貫通ドメインのアミノ酸214−222に対応する9アミノ酸ポリペプチド配列(配列番号4)である。ランダム化した配列対照であるスクランブルペプチド1(FAWPLLLA)は、ペプチド1のアミノ酸残基のランダム化配列にしたがって作成された。
【0045】
発明の詳細な記載
定義
CyPは蛋白質シクロフィリンを示し、その少なくとも4つの型、CyPA(シクロスポリンAの宿主細胞受容体)、CyPB、CyPCおよびhCyP3、シクロフィリンのいずれかの誘導体、またはシクロフィリンに対応するアミノ酸配列を有するいずれかのフラグメントまたはペプチドが知られている。CyPのポリペプチドまたはペプチドフラグメントは、CyPポリペプチドまたはCyPペプチドと呼ばれ、CyP、CyPポリペプチドまたはペプチドフラグメントの誘導体、およびCyP、CyPポリペプチドまたはペプチドフラグメントの無関係な蛋白質への融合(本明細書において、各々、CyP誘導体およびCyP融合蛋白質という)を包含する。機能的CyPとは、その同種のCyP結合蛋白質またはリガンドにイン・ビボまたはイン・ビトロで結合する蛋白質をいう。例えば、機能的CyPAは、EMMPRIN、CsA、HIV−gag蛋白質(特に、そのキャプシド抗原部分と)またはその組み合わせに結合するCyPA蛋白質、ペプチド、ポリペプチドまたは融合蛋白質である。
【0046】
CyP結合蛋白質は、シクロフィリン特異的結合活性を有するいずれかの細胞結合蛋白質、細胞表面結合蛋白質または受容体、細胞外受容体、可溶性受容体または細胞内結合蛋白質を意味する。例えば、本明細書に開示されるように、EMMPRINは細胞表面CyP結合蛋白質(すなわち、CyPの細胞表面受容体)である。
CsAはシクロスポリンA、シクロスポリンAのいずれかの誘導体、またはシクロスポリンAに対応するアミノ酸配列を有するいずれかのフラグメントまたはペプチドである。
【0047】
EMMPRIN(配列番号2)は、ヒト細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導蛋白質であり、細胞表面CyPAまたはCyPB受容体である。EMMPRINは別名で、当該分野において、CD147、バシジンおよびM6−抗原と呼ばれる。EMMPRINのポリペプチドまたはペプチドフラグメントは、EMMPRINポリペプチドまたはEMMPRINペプチドと呼ばれ、EMMPRIN、EMMPRINポリペプチドまたはペプチドフラグメントの誘導体、およびEMMPRIN、EMMPRINポリペプチドまたはペプチドフラグメントの無関係な蛋白質への融合(本明細書において、各々、EMMPRIN誘導体およびEMMPRIN融合蛋白質という)を包含する。機能的EMMPRIN蛋白質、ペプチド、ポリペプチドまたは融合蛋白質は、CyP蛋白質、ペプチドまたはその誘導体に結合するか、あるいはレトロウイルス関連CyPA蛋白質またはペプチドにイン・ビボまたはイン・ビトロで結合するEMMPRIN蛋白質、ペプチド、ポリペプチド、融合蛋白質、細胞受容体、可溶性受容体または細胞内結合蛋白質をいう。
【0048】
CD147はEMMPRIN(配列番号2)を意味する。
抗−EMMPRIN抗体は抗−CD147抗体を意味する。
抗−CD147または抗−EMMPRIN抗体は、EMMPRINまたはEMMPRINの保存的変種またはEMMPRINのペプチドフラグメントの1以上のエピトープを特異的に認識する抗体を意味し、限定するものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb)、ヒト化またはキメラ抗体、1本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fab発現ライブラリーによって生産されるフラグメント、抗−イディオタイプ(抗−Id)抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを包含する。
【0049】
抗−CD147mAb(UM−8D6)またはUM−8D6抗−CD147モノクローナル抗体は詳細には、Ancell Immunology Research Products (Bayport, MN)から市販されているネズミIgG1抗−CD147モノクローナル抗体をいう。該抗体を下記の実施例5−7に使用した。
抗−CD147mAB(M6F)は詳細には、Research Diagnostic, Inc. (”RDI”, Flanders, NJ)から市販されている抗−CD147モノクローナル抗体RDI−CD147−M6FTをいう。該抗体を下記の実施例2に使用した。
【0050】
MMPsは、マトリックスメタロプロテイナーゼを意味する。プロMMPは、蛋白質分解性切断によって活性化できる対応するMMPの不活性チモーゲン(プロ酵素)形態を意味する。例えば、MMP−1はプロMMP−1の蛋白質分解性切断によって生産される。
PICはHIV−1組み込み前複合体を意味する。
MAはHIV−1マトリックス抗原蛋白質を意味する。
CAはHIV−1キャプシド抗原蛋白質を意味する。
PHAはフィトヘマグルチニン抗原を意味する。
293T細胞は、当該分野で認識されたHIV−1感受性胚性腎細胞系統をいう。
【0051】
CHO細胞は、当該分野で認識されたチャイニーズハムスター卵巣細胞系統をいう。
CHO−EMM細胞は、高レベルのEMMPRINを構造発現する安定にトランスフェクトされたCHO細胞系統をいう。
MT−4細胞は当該分野で認識されたヒトT細胞系統をいう。
PBMCは初代ヒト末梢血単核細胞をいう。
A224Eは、当該分野で認識されたCsA耐性HIV−1 CA変異株をいう。
【0052】
概観
本発明は、シクロフィリン(”CyP”)と細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導因子(”EMMPRIN”)との間のリガンド/受容体関係という出願人の驚くべき知見に基づく。さらに、EMMPRINの細胞外ドメインに結合する抗−CD147(すなわち、抗−EMMPRIN)モノクローナル抗体がCyPのEMMPRINへの結合(実施例1)、CyP/EMMPRIN媒介性シグナル変換(実施例2)およびCyPA−関連HIV−1感染/複製を阻害した。したがって、CyP/EMMPRIN相互作用を修飾する薬剤はCyP−およびEMMPRIN−の両方に関連する治療的有用性を有する。
【0053】
治療およびスクリーニング方法
本発明は、CyP/EMMPRIN相互作用を修飾し、それにより、HIV−1感染、後天性免疫不全症候群(”AIDS”)、炎症性および自己免疫疾患(例えば、慢性関節リウマチ(”RA”)、EAE、ARDS、歯周炎)、腫瘍成長または転移あるいは治療の必要な患者における局所的または全身性のCyPA放出、合成または結合によって特徴付けられるいずれかの症状などの徴候に対する治療法において治療的有用性を有する試験化合物を同定するためのスクリーニング法(例えば、アッセイ)を提供する。本発明の方法によって達成される化合物は、小型分子、大型分子(例えば、EMMPRINまたはCyP蛋白質、そのペプチド)および抗体を包含する。
【0054】
EMMPRIN、および/またはCyPと相互作用して、これらの分子間の結合を模倣、変調または拮抗するか、および/またはEMMPRIN、CyPまたはEMMPRIN:CyP複合体の活性を変調する化合物を同定するために、細胞性および非細胞性アッセイを用いることができる。細胞ベースのアッセイは、例えば、EMMPRIN、CyPまたはEMMPRIN:CyP複合体の活性、移動または細胞コンパートメント化、あるいは他の蛋白質(例えば、HIV−1 MAおよびCA蛋白質)のEMMPRIN媒介性細胞コンパートメント化に影響を及ぼす化合物または組成物を同定するために用いることができる。該アッセイは、他のパラメーターのなかでも、EMMPRIN、CyP、またはEMMPRIN:CyP複合体への直接の結合を測定できるか、または下流のシグナル変換経路に関与する細胞内因子に対する間接的な影響または該細胞内因子による間接的な影響を測定できる。かかる細胞ベースのアッセイは、EMMPRINおよび/またはCyP蛋白質またはペプチドあるいは無関係の蛋白質またはペプチドとのその融合を発現する細胞、細胞系統、または操作された細胞もしくは細胞系統を利用する。該細胞は、さらに、EMMPRIN媒介性シグナリング活性を変調する化合物の同定を援助するために、EMMPRIN、CyP、またはEMMPRIN:CyP複合体によって変換されるシグナルに連結されたレポーター分子を組み込むように操作することができる。
【0055】
EMMPRINおよびCyP蛋白質、ポリペプチドおよび融合蛋白質は、抗体を生産するための、ならびに診断および治療のための、EMMPRIN、CyP、またはEMMPRIN:CyP複合体と相互作用する、および/またはEMMPRIN、CyP、またはEMMPRIN:CyP複合体の活性を変調する化合物をスクリーニングするための細胞および非細胞ベースのアッセイにおいて使用される。
【0056】
EMMPRINまたはCyP蛋白質産物は、EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストとして治療上使用される。かかるEMMPRINまたはCyP蛋白質産物は、限定するものではないが、1以上のEMMPRINまたはCyPドメイン(例えば、CyPのEMMPRIN相互作用ドメイン)に対応するペプチドまたはポリペプチド、1以上のEMMPRINまたはCyPドメイン(例えば、EMMPRINの場合、細胞外および/または膜貫通ドメインなど)を欠く末端切断型EMMPRINまたはCyPポリペプチド、EMMPRINまたはCyP融合蛋白質産物(例えば、EGFPおよびFLAG融合を包含するGST融合、またはエピトープタグ付加融合)、およびEMMPRINまたはCyP蛋白質もしくはペプチド誘導体または複合体を包含する。
【0057】
例えば、有効量の適当な可溶性EMMPRIN蛋白質またはペプチド、またはEMMPRIN融合蛋白質(例えば、EMMPRINHA)を患者に投与し、それにより、それが内在性CyPと相互作用し、あるいは、内在性CyPを「活性化」、「中和」または「排除」して、EMMPRIN、CyP、またはEMMPRIN:CyP複合体の活性を変調する。また別の具体例において、かかるEMMPRIN産物をコードしているヌクレオチド構築物を用いて、かかるEMMPRIN産物をイン・ビボで発現するように宿主細胞を遺伝子操作する。これらの遺伝子操作された細胞は、体内で「バイオリアクター」として機能し、別法で内在性CyPを「活性化」、「中和」または「排除」するであろう適当な可溶性EMMPRIN産物の連続的な供給をデリバリーする。
【0058】
別法では、EMMPRINに対する抗体、あるいはEMMPRINアゴニストもしくはアンタゴニストであり、および/またはEMMPRIN媒介性シグナル変換を変調し、およびEMMPRIN媒介性シグナル変換経路における下流の標的に対して作用する他の薬剤を治療剤として用いる。
【0059】
CyP/EMMPRIN結合相互作用は、慢性関節リウマチ(RA)のような局所的または全身性のCyP放出、合成または結合によって特徴付けられる症状のための新規な治療的介入標的である
CyP/EMMPRIN結合相互作用は、RAのようなCyPA−関連治療的徴候のための新規な介入標的である。なぜならば、(1)EMMPRINはCyP結合蛋白質であり;(2)EMMPRINはCyPのシグナリング受容体であり、チロシンキナーゼ依存性シグナル変換の媒介となり;および(3)CyP処理はWI−38初代ヒト繊維芽細胞におけるプロMMP−1およびプロMMP−3の発現および放出を活性化および増強するからである。
【0060】
(1)EMMPRINはCyPA結合蛋白質として同定された。
詳細には、EMMPRIN cDNAクローン(配列番号1)が単離され、始めに標準的な酵母2−ハイブリッドプロトコールによってCyPA相互作用蛋白質として同定された(実施例1および図1)。次いで、CyPA/EMMPRIN結合相互作用を、[35S]−標識化EMMPRINのCyPAセファロースアフィニティー樹脂へ特異的結合を明らかにすることによって確認した(実施例1、図1、右側のパネル)。
【0061】
(2)EMMPRINはCyPのシグナリング受容体として同定され、チロシンキナーゼ依存性シグナル変換の媒介となった。
詳細には、CyPAまたはCyPBはCHO−EMM細胞(EMMPRIN発現ベクターで安定にトランスフェクトされており、EMMPRINを構造的に発現している)においてCa2+動員を誘導したが、対照CHO細胞(EMMPRINを発現しない)において誘導しなかった(実施例2および図3、左側のパネル)。さらに、イソ型対照抗体ではなく、抗−CD147mAb(M6FT)(すなわち、抗−EMMPRIN mAb)がCHO−EMM細胞におけるCyPA媒介性Ca2+動員を阻害した(図3、右側のパネル)。さらに、チロシンキナーゼ阻害剤ゲニステインは、CHO−EMM細胞におけるCyPAにより誘導されるシグナリングの阻害において有効であった(図4)。したがって、EMMPRINはCyPAおよびCyPBの細胞受容体として同定され、チロシンキナーゼ依存性経路を介する細胞内シグナル変換の媒介をした。
【0062】
(3)CyPA処理は、WI−38初代ヒト繊維芽細胞においてプロMMP−1の発現を活性化し、プロMMP−3の放出を増強した。
WI−38初代ヒト繊維芽細胞のCyPAでの処理は、メタロプロテイナーゼチモーゲンプロMMP−1の発現および放出を活性化し、プロMMP−3の放出を増強した(実施例4および図5)。メタロプロテイナーゼMMP−1およびMMP−3は、RA患者の滑液中において上昇されることが知られており、RA疾患関連病理に寄与すると考えられる。活性型MMP−1およびMMP−3種は、通常、周囲の組織によって放出される蛋白質分解酵素(例えば、RA患者の滑液中の蛋白質分解酵素)によって、対応する分泌された不活性型チモーゲン、プロMMP−1およびプロMMP−3から生じる。
【0063】
したがって、EMMPRINがMMP生産を刺激するメカニズムは、EMMPRINを細胞−細胞相互作用に関与する付着型分子として狭く特徴付ける初期の文献によって示されたものより複雑である。EMMPRINはまた、(本明細書に開示されるように)、その可溶性リガンドであるCyPAを介してシグナルを受けることによってMMP生産を刺激したシグナル変換受容体として同定された。
【0064】
したがって、本発明は、活性なRA疾患の間、炎症した関節中に放出されたCyPが、好中球表面のEMMPRINへのCyP結合を介して関節に好中球を誘引するモデルを支持する。これらの好中球は次いで、CyP依存性およびCyP非依存性メカニズムを介して関節中で活性化されて、RA疾患を悪化させる酵素(例えば、好中球エラスターゼ)を放出する。したがって、抗−EMMPRIN抗体またはEMMPRINアゴニストもしくはアンタゴニストとして作用する他の薬剤は、RAあるいは局所的または全身性のCyP放出、合成または結合によって特徴付けられる他の症状(すなわち、CyP−関連治療的徴候)の治療または予防のための治療的有用性を有する。
【0065】
CyP/EMMPRIN結合相互作用は、HIV−1感染および/またはAIDSもしくはAIDS関連障害の治療または予防などの局所的または全身性のCyP放出、合成または結合によって特徴付けられる症状のための新規な治療的介入標的である。
CyPA/EMMPRIN結合相互作用は、HIV感染および/またはAIDSもしくはAIDS関連障害のための新規な介入標的である。なぜならば、(1)細胞表面EMMPRINは、MuLV−、およびHIV−1コアを担持するHIV−1偽型レトロウイルスによるCHO細胞の細胞性感染の組み込み前工程に対して実質的な増強効果を有し、(2)細胞表面EMMPRINは、初代ヒト細胞(末梢血単核細胞;PBMC)のHIV感染の組み込み前工程に対して実質的な増強効果を有し;および(3)抗−CD147mAb(UM−8D6)の阻害効果に対するウイルス耐性はCsAに対する耐性に相関するからである。
【0066】
(1)細胞表面EMMPRINは、MuLV−、およびHIV−1コアを担持するHIV−1−偽型レトロウイルスによるCHO細胞の細胞性感染の組み込み前工程に対して実質的な増強効果を有した。
CHO細胞の細胞表面上のEMMPRIN蛋白質の存在は、MuLV偽型HIVによる感染を増強した(実施例5および図6、左側のパネル)。さらに、この増強は、抗−CD147mAb(UM−8D6)によって大いに減少され(実施例5および図6、左側のパネル)、かかる感染はEMMPRIN膜貫通ドメインペプチド1(配列番号3)によって阻害された(実施例8および図9)。
【0067】
さらに、EMMPRINは、HIV−1偽型HIVによるCHO/CD4/CXCR4細胞(CD4−およびCXCR4−発現ベクターでトランスフェクトされたCHO細胞)感染を増強した(実施例5および図6、中央のパネル)。さらに、EnvADA−偽型luc−HIV−1によるPHA−活性化ヒトPBMCの感染はペプチド1(配列番号3)によって阻害された(実施例8)。
【0068】
最後に、EMMPRINは、ウイルス組み込み前段階にてHIV感染を増強した。詳細には、HIV−特異的逆転写は、EMMPRINの存在下で(すなわち、CHO−EMM/CD4/CXCR4において、CHO/CD4/CXCR4細胞と比べて)3〜4倍増加した。有意には、抗−CD147mAbはこの増強効果を減少させ(図6、右側のパネル)、それはEMMPRINがウイルス組み込み前段階で作用することを示す。
【0069】
(2)細胞表面EMMPRINは、PBMCのHIV感染の融合後の組み込み前工程に対して実質的な増強効果を有した。
抗−EMMPRIN mAb(UM−8D6)は、ヒト初代PBMC中でのHIV−1株の複製を阻害した(実施例6および図7A)。詳細には、イソ型に合致した対照mAbではなく、抗−CD147mAb(UM−8D6)が初代PBMC中でのマクロファージ−親和性(ADA)およびT細胞系統−適応性(LAV)HIV−1株の複製を阻害した(実施例6および図7A、左側および右側のパネル)。
【0070】
有意には、抗−CD4mAbとは対照的に、抗−CD147mAb(UM−8D6)は、ヒトPBMCをHIV−1と一緒に4℃でインキュベーション後に細胞結合型ウイルス性p24の量を測定することによって決定した場合、ヒトPBMCに対するHIV結合を阻害しなかった(実施例6および図7B)。したがって、抗−CD147mAb(UM−8D6)は、ウイルス結合と組み込みとの間の工程にてHIV−1感染を阻害したのである。
【0071】
さらに、抗−CD4mAbとは対照的に、抗−CD147mAb(UM−8D6)は、PBMCとHIV−1 ADAおよびLAV外被を発現しているHeLa細胞との間のHIV Env媒介性融合を阻害せず(実施例6および図7C、左側のパネル)、また、ウイルス性p24の細胞性インターナリゼーションも減少させなかった(実施例6および図7C、左のパネル)。したがって、本発明によると、EMMPRINはHIV−1感染における融合後工程で作用する。
【0072】
したがって、抗CD147mAb(UM−8D6)は、HIV−1感染の間、初期および後期の両方のHIV−1逆転写量を減少させた(実施例6および図7D)。HIV−1逆転写は、組み込み前の複合体(”PIC”)の進行性成熟を示す融合後過程である。したがって、抗−CD147mAb(UM−8D6)は、ウイルス−細胞融合と逆転写の開始との間のHIV−1感染における工程を干渉した。
【0073】
さらに、抗−CD147mAb(UM−8D6)は、新たな感染後初期のHIV−1マトリックス(MA)およびキャプシド(CA)蛋白質の正常な移動を阻害した。詳細には、抗−CD147mAb(UM−8D6)の存在下、ウイルスは細胞膜に保持され、それは、EMMPRINがHIV−1脱外被において役割を果たすことを示す(実施例6および図7E)。
【0074】
(3)抗−CD147mAbの阻害効果に対するウイルス耐性は、CsAに対する耐性と相関した。
ヒトPBMCにおけるA224E(CsA−耐性、CA変異体HIV株)の複製は、抗−CD147mAb(UM−8D6)での処理に対し耐性であった(実施例7および図8)。
したがって、抗−CD147mAbは、ウイルス−細胞融合と逆転写の開始との間のHIV−1感染におけるCyPA依存性工程(すなわち、融合後の組み込み前工程)を干渉した。したがって、EMMPRINは、HIV−1感染における融合後の組み込み前工程(例えば、ウイルス脱外被)の媒介となった。
【0075】
したがって、理論に拘束されることなく、CyPAがHIV−1感染の媒介となるメカニズムは、ビリオン中のHIV−gag蛋白質および細胞表面ヘパラン(本発明以前には、「独占的なCyPA受容体」でると断言されていた、Saphireら、EMBO J. 18:6771−6785, 1999)と相互作用する蛋白質としてCyPAを狭く特徴付けている先行技術によって示されるよりも複雑である。驚くべきことに、本明細書に開示されるように、EMMPRINはHIV−1感染におけるCyPA依存性工程の媒介となった。よって、CyPAは、HIV−1感染の間のHIV−gag、ヘパランおよびEMMPRINとの複数の相互作用に関与した。さらに、EMMPRINは、新たな感染後初期のHIV−1 MAおよびCA蛋白質の正常な移動の媒介となった。抗−CD147mAb(UM−8D6)が新規なCyPA/EMMPRIN結合相互作用(およびそれにより媒介されるシグナル変換)を拮抗したという証明は、さらに、HIV−1感染および/またはAIDS、および/または局所的または全身性のCyPA放出もしくは合成によって特徴付けられる他の症状(すなわち、CyPA−関連治療的徴候)の治療または予防のための方法において有用な該相互作用を修飾する他の薬剤の使用を可能にする。
【0076】
CyP/EMMPRIN結合相互作用は、癌のような局所的または全身性のCyP放出、合成もしくは結合によって特徴付けられる症状のための新規な治療的介入標的である。
CyPA/EMMPRIN結合相互作用は、癌のための新規な介入標的である。なぜならば、(1)EMMPRIN発現腫瘍細胞は、それと共培養された繊維芽細胞中のMMPsの発現をアップレギュレートすることが知られており(Biswasら、Cancer Res. 55: 434−439, 1995);(2)本明細書中で開示されるように、CyPはヒト繊維芽細胞中のMMP生産を活性化および/または増強し;および(3)MMPsの脱調節された作用は、例えば、関節炎、歯周炎、組織潰瘍を包含する多くの結合組織疾患における、および癌細胞侵入および転移における細胞外マトリックスの病理学的破壊に寄与するからである(Kahariら、Exp. Dermatol. 6:199−213, 1997; Keyszerら、J. Rheumatol. 26: 251−258, 1999; Benbowら、J. Biol. Chem. 274: 25371−25378, 1999; Keyszerら、Z. Rheumatology 57: 392−398, 1998)。
【0077】
EMMPRIN蛋白質、ポリペプチドおよび抗体
EMMPRINまたはCyP蛋白質およびポリペプチド、および変異形態、末端切断形態または欠失形態のEMMPRINまたはCyPおよび/またはEMMPRINまたはCyP融合蛋白質は、限定するものではないが、抗体の生産、診断アッセイの試薬として、例えば、HIV−1感染、AIDS、RAおよび癌の治療および予防に使用できる治療化合物のためのスクリーニングアッセイの試薬として、および例えば、HIV−1感染、AIDSおよびAIDS関連障害、RAおよび癌の治療に有用な医薬的試薬としての使用を包含する種々の使用のために調製することができる。
【0078】
EMMPRINおよびCyP蛋白質およびポリペプチドの生産
EMMPRINをコードしているcDNA配列を、対応する推定アミノ酸配列(配列番号2)と共に配列番号1に示す。図1は、EMMPRINのシグナルペプチド、細胞外(ecd)、膜貫通(tm)および細胞内(icd)ドメインを概略的に示す。EMMPRINまたはCyPの1以上のドメイン(例えば、EMMPRINecdまたはtmドメイン)に対応するペプチド、末端切断型または欠失型EMMPRINまたはCyP(例えば、1以上の領域またはドメインが欠失しているEMMPRINまたはCyP)ならびに全長EMMPRINまたはCyP、EMMPRINまたはCyPペプチドあるいは末端切断型EMMPRINまたはCyPが無関係の蛋白質に融合している融合蛋白質(例えば、GST、FLAGおよびEGFP融合)もまた、本発明の範囲内である。例えば、かかる可溶性EMMPRIN蛋白質、ペプチドまたは融合蛋白質、または循環性CyPに結合して「活性化」、「中和」または「排除」する抗体(抗−イディオタイプ抗体を包含する)を本明細書に記載のように用いて、例えば、HIV−1感染、AIDS、RAおよび癌を治療または予防することができる。この目的のために、EMMPRINの個々のドメインに対応するペプチド、EMMPRINの可溶性欠失変異体、またはEMMPRIN蛋白質全体を別のポリペプチド(例えば、IgFcポリペプチド、またはエピトープタグ)に融合することができる。別法では、EMMPRIN受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するCyP蛋白質、ペプチドまたは融合蛋白質を本明細書に記載のように用いて、例えば、HIV−1感染、AIDSおよびAIDS関連障害、RAおよび癌を治療または予防することができる。
【0079】
かかるペプチド、ポリペプチド、および融合蛋白質は、組換えDNA技術によって調製できる。例えば、1以上のEMMPRIN領域またはドメインをコードしているヌクレオチド配列を合成またはクローン化し、可溶性受容体または可溶性結合蛋白質またはペプチドのような可溶性EMMPRIN蛋白質をコードするように一緒に連結する(例えば、配列番号3、配列番号4、配列番号5)。1以上のEMMPRIN領域またはドメインをコードしているDNA配列を直接またはペプチドスペーサーをコードするリンカーオリゴヌクレオチドを介して一緒に連結することができる。かかるリンカーは、フレキシブルなグリシンに富むアミノ酸配列をコードすることができ、それにより、一緒に繋ぎ合わされたドメインにEMMPRINリガンド(例えば、CyPAまたはCyPB)に結合できるコンホメーションをとらせる。別法では、個々の領域またはドメインをコードしているヌクレオチド配列を用いてEMMPRINペプチドを発現することができる。1以上のCyP領域またはドメインをコードしているヌクレオチド配列を用いて、同様の構造を調製することができる。
【0080】
EMMPRINまたはCyPの適当な領域をコードしているヌクレオチド配列を発現させてかかるポリペプチドを生産するために、種々の宿主発現ベクター系を用いてもよい。得られるペプチドまたはポリペプチドが可溶性誘導体である場合、該ペプチド、ポリペプチドを培養培地から回収することができる。ポリペプチドまたは蛋白質が分泌されない場合、EMMPRINまたはCyP産物を宿主細胞自体から回収することができる。
【0081】
宿主発現ベクター系はまた、EMMPRINまたはCyPまたは機能的等価物を発現する操作された宿主細胞を包含する。かかる発現系からのEMMPRINまたはCyP蛋白質、ペプチドおよび融合蛋白質の精製または濃縮は、当業者によく知られた適当な方法を用いて達成できる。しかしながら、かかる操作された宿主細胞自体は、EMMPRINまたはCyP蛋白質、ペプチドおよび融合蛋白質の構造的および機能的特徴を保持することだけでなく、例えば、薬物スクリーニングアッセイにおいて、生物学的活性を評価することも重要である状況において使用されうる。
【0082】
本発明の目的に使用されうる宿主発現ベクター系は、限定するものではないが、EMMPRINまたはCyPヌクレオチド配列を含有する組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌(例えば、イー・コリ(E. coli)、ビー・ズブチリス(B. subtilis))などの微生物;EMMPRINまたはCyPヌクレオチド配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母(例えば、サッカロマイセス(Saccharomyces)、ピチア(Pichia));EMMPRINまたはCyP配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)で感染させた昆虫細胞系;EMMPRINまたはCyPヌクレオチド配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)で感染させた、またはEMMPRINまたはCyPヌクレオチド配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換された植物細胞系;または哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター、またはワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含有する組換え発現構築物を収容している哺乳動物細胞系(例えば、COS、CHO、BHK、293、3T3、MCF−7、Hs578T)を包含する。
【0083】
細菌系において、EMMPRINまたはCyP遺伝子産物の発現が意図される使用に依存して、いくつかの発現ベクターが有利に選択されうる。例えば、大量のかかる蛋白質を生産しようとする場合、EMMPRINまたはCyP蛋白質、ペプチドおよび融合蛋白質の医薬組成物の生産のために、またはEMMPRINまたはCyP蛋白質に対する抗体を生産するために、容易に精製される融合蛋白質産物の高レベルの発現を指示するベクターが望ましい。かかるベクターは、限定するものではないが、融合蛋白質が生産されるようにEMMPRINまたはCyPAコーディング配列がベクター中にフレーム内においてlacZコーディング領域と個々に連結されうるイー・コリ発現ベクターpUR278(Rutherら、EMBO J. 2:1791, 1983);pINベクター(Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13: 3101−3109, 1985; Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264: 5503−5509, 1989)などを包含する。また、PGEXベクターを使用して、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)との融合蛋白質として外来性ポリペプチドを発現させてもよい。一般に、かかる融合蛋白質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着、次いで、遊離のグルタチオンの存在下での溶離によって溶解細胞から容易に精製することができる。クローン化された標的遺伝子産物をGST部分からはずすことができるように、PGEXベクターは、トロンビンまたは因子Xaプロテアーゼ切断部位を包含するように設計される。
【0084】
別法では、発現されている融合蛋白質に特異的な抗体または他のアフィニティー相互作用の利用がいずれかの融合蛋白質の精製を容易にできるようにする。例えば、ワクシニア発現/アフィニティー精製系は、ヒト細胞系統において発現された非変性融合蛋白質の容易な発現および精製を可能にする(Janknechtら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972−8976, 1991)。該系において、目的の遺伝子のオープンリーディングフレームが翻訳的に6個のヒスチジン残基よりなるアミノ末端タグに融合するように、目的の遺伝子をワクシニア組換えプラスミド中にサブクローン化する。組換えワクシニアウイルスで感染させた細胞由来の抽出物をNi2+:ニトリロ酢酸−アガロースカラム上に負荷し、イミダゾール含有バッファーを用いてヒスチジンタグ付加された蛋白質を選択的に溶出させる。
【0085】
昆虫系
昆虫系において外来遺伝子を発現させるために、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)多角体病ウイルス(AcNPV)をベクターとして用いることができる。該ウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞中で増殖する。EMMPRIN−またはCyP−コーディング配列は、ウイルスの非必須領域(例えば、ポリヒドリン遺伝子)中に個々にクローン化し、AcNPVプロモーター(例えば、ポリヒドリンプロモーター)の調節下に置いてもよい。EMMPRIN−またはCyP−コーディング配列の成功した挿入は、ポリヒドリン遺伝子の不活性化および非閉塞性組換えウイルス(すなわち、ポリヒドリン遺伝子によってコードされるタンパク質性外被を欠くウイルス)の生産をもたらすであろう。次いで、組換えウイルスを用いて細胞を感染させ、ここに、挿入遺伝子を発現させる(Smithら、J. Virol. 46: 584, 1983; Smith, 米国特許第4,215,051号)。
【0086】
哺乳動物宿主細胞において、いくつかのウイルスに基づく発現系を用いてもよい。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、目的のEMMPRINまたはCyPヌクレオチド配列をアデノウイルス転写/翻訳調節複合体、例えば、後期プロモーターおよびトリパータイト(tripartite)リーダー配列に連結してもよい。次いで、該キメラ遺伝子をアデノウイルスゲノム中にイン・ビトロまたはイン・ビボ組換えによって挿入してもよい。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、領域E1またはE3)における挿入は、生存能力があり、かつ、感染宿主においてEMMPRINまたはCyP遺伝子産物を発現できる組換えウイルスをもたらすであろう(Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655−3659, 1984)。特異的開始シグナルもまた、挿入されたEMMPRINまたはCyPヌクレオチド配列の効率のよい翻訳に必要とされうる。これらのシグナルは、ATG開始コドンおよび隣接配列を包含する。それ自体の開始コドンおよび隣接配列を包含する全EMMPRINまたはCyP遺伝子またはcDNAが適当な発現ベクター中に挿入される場合、付加的な翻訳調節シグナルは必要とされないこともある。しかしながら、EMMPRIN−またはCyP−コーディング配列の部分のみが挿入される場合、おそらくATG開始コドンを包含する外来性翻訳調節シグナルが提供されなければならない。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために、所望のコーディング配列のリーディングフレームと共に「フレーム内」になければならない。これらの外来性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の種々の起源であることができる。発現効率は、適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含むことによって増加しうる(Bittnerら、Methods Enzymol. 153: 516−544, 1987)。
【0087】
さらに、挿入配列の発現を変調するか、または所望される特異的様式で遺伝子産物を修飾および加工処理する宿主細胞株を選択してもよい。蛋白質産物のかかる修飾(例えば、グリコシル化)およびプロセッシング(例えば、切断)は、蛋白質の機能にとって重要である。異なる宿主細胞は、蛋白質および遺伝子産物の翻訳後プロセッシングおよび修飾のための特徴的および特異的メカニズムを有する。発現された外来性蛋白質の正確な修飾およびプロセッシングを確実にするために適当な細胞系統または宿主系を選択することができる。したがって、一次転写産物の正しいプロセッシング、グリコシル化、および遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞を用いてもよい。かかる哺乳動物宿主細胞は、限定するものではないが、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、MCF−7、Hs578TおよびWI38細胞系統を包含する。
【0088】
組換え蛋白質の長期間の高収率の生産のために、安定な発現が好ましい。例えば、EMMPRINまたはCyP配列を安定に発現する細胞系統を操作してもよい。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを用いるよりもむしろ、適当な発現調節エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)によって調節されるDNAおよび選択マーカーを用いて宿主細胞を形質転換することができる。外来性DNAの導入後、操作した細胞を栄養培地中で1−2日間増殖させてもよく、次いで、選択培地に移す。組換えプラスミド中の選択マーカーは該選択に対する耐性を与え、細胞の染色体中にプラスミドを安定に組み込ませ、増殖させて、次いで、細胞系統中にクローン化し、膨張することができる細胞増殖巣を形成させる。該方法は、有利なことに、EMMPRINまたはCyP遺伝子産物を発現する安定な細胞系統(例えば、下記実施例2において論じられるCHO−EMM細胞系統)を操作するために使用されうる。かかる操作された細胞系統は、特に、EMMPRIN遺伝子産物の内在活性に影響を及ぼす化合物のスクリーニングおよび評価において有用でありうる。
【0089】
限定するものではないが、各々、tk−、hgprt−またはaprt−細胞において用いることのできるヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ(Wiglerら、Cell 11:223, 1977)、ヒポキサチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. USA 48: 2026, 1962)、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowら、Cell 22: 817, 1980)遺伝子を包含するいくつかの選択系を用いてもよい。また、抗−代謝産物耐性を下記の遺伝子:メソトレキセートに対する耐性を与えるdhfr(Wiglerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567, 1980; O’Hareら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527, 1981);マイコフェノール酸に対する耐性を与えるgpt(Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072, 1981);アミノグリコシドG−418に対する耐性を与えるneo(Colberre−Garapinら、J. Mol. Biol. 150:1, 1981)およびヒグロマイシンに対する耐性を与えるhygro(Santerreら、Gene 30: 147, 1984)の選択の基礎として用いることができる。
【0090】
EMMPRINまたはCyPAポリペプチドに対する抗体
EMMPRINまたはCyPの1以上のエピトープあるいはEMMPRINまたはCyPの保存的変種のエピトープあるいはEMMPRINまたはCyPのペプチドフラグメントを特異的に認識する抗体もまた、本発明に包含される。かかる抗体は、限定するものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb)、ヒト化またはキメラ抗体、1本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fab発現ライブラリーによって生産されるフラグメント、抗−イディオタイプ(抗−Id)抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを包含する。
【0091】
かかる抗体は、正常または異常なEMMPRIN活性の変調のための方法として用いられ(実施例2、5、6および7参照)、したがって、例えば、HIV−1感染、AIDS、RAおよび癌の治療および/または予防のための方法の一部として有用である。
さらに、本発明の抗体は、例えば、生物学的試料中のEMMPRINの検出において用いられるので、EMMPRINの異常量について患者または組織試料を試験しうるところの診断的または予後的技術の一部として有用である。かかる抗体は、また、例えば、EMMPRIN遺伝子産物の発現および/または活性に対する試験化合物の影響を評価するための化合物スクリーニングスキームと一緒に使用される。さらに、かかる抗体は、下記される遺伝子療法技術と一緒に使用して、例えば、正常および/または操作されたEMMPRIN−またはCyP−発現細胞を患者へのその導入前に評価することができる。
【0092】
抗体産生
抗体の産生のために、種々の宿主動物をEMMPRINまたはCyP、EMMPRINまたはCyPペプチド(例えば、膜貫通型、細胞外またはCyP−相互作用ドメインなどのEMMPRINまたはCyPの機能的ドメインに対応するもの)、末端切断型EMMPRINまたはCyPポリペプチド(1以上のドメイン、例えば、膜貫通型またはCyP−相互作用ドメインが欠失しているEMMPRINまたはCyP)、EMMPRINまたはCyPの機能的等価物あるいはEMMPRINまたはCyPの変異体を用いる注射によって免疫化する。かかる宿主動物は、限定するものではないが、ウサギ、マウス、ハムスターおよびラットを包含する。宿主種に依存する種々のアジュバンドを用いて、免疫学的応答を増加させてもよく、該アジュバンドは、限定するものではないが、フロイントの(完全および不完全)アジュバンド、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの表面活性物質、プルロニック(pluronic)ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、スカシガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバンド、例えば、BCG(bacille Calmette−Guerin)およびコリネバクテリウム・パルバム(Corynebacterium parvum)を包含する。
【0093】
ポリクローナル抗体は、免疫化された動物の血清由来の抗体分子の異種集団である。特定の抗原に対する抗体の同種集団であるモノクローナル抗体は、培養中の継続的細胞系統による抗体分子の生産を提供するいずれかの技術によって得られる。これらは、限定するものではないが、KohlerおよびMilstein(Nature 256: 495−497, 1975;および米国特許第4,376,110号)のハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kosborら、Immunology Today 4:72, 1983; Coleら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026−2030, 1983)およびEBV−ハイブリドーマ技術(Coleら、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77−96, 1985)を包含する。かかる抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDおよびそのいずれかのサブクラスを包含するいずれかの免疫グロブリンクラスのものであってもよい。本発明のmAbを生産するハイブリドーマは、イン・ビトロまたはイン・ビボで培養してもよい。イン・ビボでの高力価のmAbの生産により、これは現在の好ましい生産方法とされる。
【0094】
さらに、適当な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を適当な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒にスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の生産のために開発された技術(Morrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851−6855, 1984; Neubergerら、Nature, 312: 604−608, 1984; Takedaら、Nature, 314: 452−454, 1985)を用いることができる。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子、例えば、ネズミmAb由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域(ヒト化)を有する分子である。
【0095】
別法では、1本鎖抗体の生産のために記載された技術(米国特許第4,946,778号;Bird, Science 242:423−426, 1988; Hustonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879−5883, 1988;およびWardら、Nature 334: 544−546, 1989)を、EMMPRINまたはCyP遺伝子産物に対する1本鎖抗体を生産するように適応させる。1本鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してFv領域のH鎖およびL鎖フラグメントを連結することによって形成され、その結果、1本鎖ポリペプチドを生じる。
【0096】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは既知の技術によって生産される。例えば、かかるフラグメントは、限定するものではないが、抗体分子のペプシン消化によって生産されるF(ab’)2フラグメント;およびF(ab’)2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生じるFabフラグメントを包含する。別法では、Fab発現ライブラリーを構築して(Huseら、Science, 246: 1275−1281, 1981)、所望の特異性を用いるモノクローナルFabフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にする。
【0097】
次いで、EMMPRINまたはCyPに対する抗体を利用して、当業者によく知られた技術を用い、EMMPRINまたはCyPを「模倣」する抗−イディオタイプ抗体を生産する(Greenspan & Bona, FASEB J. 7:437−444, 1993; およびNissinoff, J. Immunol. 147: 2429−2438, 1991)。例えば、CyPに結合し、EMMPRINの結合を拮抗的に阻害するEMMPRINまたはCyPに対する抗体を用いて、EMMPRINまたはCyPを「模倣」し、それによって、EMMPRINを結合および中和する抗−イディオタイプを生じる。かかる中和性抗−イディオタイプまたはかかる抗−イディオタイプのFabフラグメントは、EMMPRINを中和するための治療計画において用いられる。
【0098】
別法では、EMMPRIN活性のアンタゴニストとして作用する、すなわち、EMMPRINによる活性化またはシグナリングを阻害するEMMPRINに対する抗体を生産する(下記の実施例2において示される)。かかる抗体は、例えば、HIV−1感染、AIDSおよびAIDS関連障害、RAまたは癌を治療するために、治療上使用される。同様に、EMMPRINのアゴニストとして作用する抗体を生産する。かかる抗体はEMMPRINに結合し、そのシグナル変換活性を活性化する。
【0099】
例えば、HIV−1感染、AIDSおよびAIDS関連障害、RA、癌および局所的または全身性のCyP放出、合成または結合によって特徴付けられる症状の治療において有用な薬物のスクリーニングアッセイ
EMMPRIN活性またはEMMPRIN遺伝子発現を変調し、それいよって、例えば、HIV−1感染、AIDS、RAまたは癌を変調する化合物または組成物を同定するために、多くの異なるアッセイ系(例えば、均一、不均一、細胞ベースおよび非細胞ベース)を設計し、使用できる。下記の系はキット中に処方されてもよい。この目的のために、試薬(例えば、EMMPRINまたはCyP蛋白質あるいはEMMPRINまたはCyP蛋白質を発現している細胞)を種々の容器、例えば、バイアル、チューブ、ミクロタイターウェルプレート、ボトルなどの中にパックする。他の試薬、例えば、正の対照試料、負の対照試料、EMMPRINまたはCyP蛋白質、ペプチド、バッファー、細胞培養培地、抗体などを分離した容器中に入れ、キットを提供することができる。
【0100】
スクリーニングアッセイの基本的な設計および原理
本明細書中で論じられる特定の具体例に限らず、他の当該分野で認識された可能性のなかでも、EMMPRIN、CyPまたはCyP:EMMPRIN複合体に結合するか;CyPとEMMPRINとの間の相互作用を干渉するか;あるいは蛋白質(例えば、HIV−1 MAおよびCA蛋白質)のEMMPRIN−媒介性シグナル変換またはEMMPRIN−媒介性細胞コンパートメント化をもたらす化合物または組成物を同定するために、下記のアッセイが設計される。CyP/EMMPRIN相互作用のアンタゴニストまたはアゴニストとして、あるいはEMMPRIN−媒介性シグナル変換または他のEMMPRIN−媒介性活性の修飾剤として同定された化合物は、例えば、HIV−1感染、AIDSおよびAIDS関連障害、RAまたは癌の治療および予防に対する治療的有用性を有する。
【0101】
CyP/EMMPRIN相互作用を阻害する化合物を同定するためのアッセイの原理は、試験化合物、機能的CyPおよびEMMPRIN蛋白質(または一部、EMMPRIN蛋白質を含む細胞調製物)を含有する反応混合物を調製し、成分が相互作用し、結合する(すなわち、除去および/または検出できる複合体が形成される)のに十分な時間、該反応混合物をインキュベートすることを含む。例えば、アンタゴニスト活性について化合物を試験するために、反応混合物を試験化合物の存在下および不在下で調製する。試験化合物は、最初に反応混合物中に含有されてもよく、またはCyPおよびEMMPRIN蛋白質の添加後に加えられてもよい。対照反応混合物は、試験化合物を用いずにインキュベートするか、または対照薬剤と共にインキュベートする。次いで、いずれかのCyP:EMMPRIN複合体の形成を検出する。対照反応中で複合体が形成するが、試験化合物を含有する反応混合物中では形成しないことは、該化合物がCyP/EMMPRIN相互作用を拮抗することを示す。さらに、試験化合物ならびに正常なCyPおよびEMMPRIN蛋白質を含有する反応混合物内での複合体形成をまた、試験化合物および誘導体化または変異体CyPまたはEMMPRIN蛋白質を含有する反応混合物内での複合体形成と比較してもよい。
【0102】
均一および不均一アッセイフォーマット
CyP/EMMPRIN相互作用のアンタゴニストおよびアゴニストのためのスクリーニングアッセイは、均一または不均一フォーマットのいずれかにおいて行われる。均一アッセイは、細胞ベースまたは非細胞ベースのいずれかであり、ここに、全反応が液相中で行われる。不均一アッセイは、一般に(常にではない;例えば、細胞表面EMMPRINを展示している固定化細胞)非細胞ベースであり、リガンドまたは受容体のいずれかを固相上に固定し、反応の最後に固相上に固定された複合体を検出することを含む。
【0103】
いずれかのアプローチにおいて、反応物の添加順序を変えて、試験されている化合物について異なる情報を得る。例えば、拮抗によって、リガンド/受容体相互作用を干渉する試験化合物は、試験物質の存在下で反応を行うことによって;すなわち、リガンドおよび相互作用する細胞性または細胞外受容体より前または同時に、試験物質を反応混合物に加えることによって同定される。別法では、予め形成された複合体を崩壊させる試験化合物、例えば、該複合体由来の成分の1つを置き換えるより高い結合定数を有する化合物を、リガンド/受容体複合体が形成した後に反応混合物に試験化合物を加えることによって試験する。種々のフォーマットを簡単に下記する。
【0104】
不均一の細胞ベースおよび非細胞ベースアッセイ
不均一アッセイ系において、リガンドあるいは相互作用する細胞または細胞外受容体のいずれかを固体表面上に固定する一方で、非固定種を直接的または間接的に標識する。実際には、ミクロタイタープレートを利用する。固定される種は、非共有または共有結合によって固定される。非共有結合は、固体表面をリガンド、受容体蛋白質または受容体を発現している細胞の溶液で被覆し、所望により乾燥させることによって達成される。別法では、固定されるべき種に特異的な固定化抗体を用いて、固体表面に該種を固定する。該表面は予め調製していてもよい。
【0105】
アッセイは、試験化合物を用いて、または用いないで、被覆された表面に固定された種の結合パートナーを曝露することによって行われる。反応完了後に非反応成分は除去され(例えば、洗浄によって)、形成されたいずれの複合体も固体表面上に固定されたままであろう。
【0106】
固定された複合体の検出は、下記に限定されないいくつかの方法において達成される。第1に、非固定種が予め標識されている場合、固定された標識の検出は複合体が形成されたことを示す。第2に、非固定種が予め標識されていない場合、間接的な標識を用いて固定された複合体を検出する;例えば、最初に固定されない種に特異的な標識抗体を用いる(次いで、抗体は、直接的に標識されるか、または標識された抗−Ig抗体で間接的に標識されてもよい)。反応成分の添加順序に依存して、複合体形成を阻害するか、または予め形成された複合体を崩壊させる試験化合物が検出される。
【0107】
別法では、反応は、試験化合物の存在下または不在下で液相中で行うことができ、反応産物を非反応成分から分離し、次いで、複合体を例えば、溶液中で形成されたいずれかの複合体を固定するための結合成分の1つに特異的な固定化抗体を用い、他の結合パートナーに特異的な別の標識化抗体を用いてかかる固定された複合体を検出することによって、不均一に検出する。複合体形成を阻害するか、または予め形成された複合体を崩壊させる試験化合物は、最初の均一液相中における反応物添加の順序に依存して同定される。
【0108】
例えば、不均一アッセイにおいて、まず、固定化のために、リガンドまたは受容体蛋白質を慣例の組換えDNA技術を用いて調製する。例えば、pGEX−5X−1のような融合ベクターを用いて、得られる融合蛋白質中でその結合活性が維持されるような方法で、リガンド遺伝子コーディング領域をグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)遺伝子に融合する。相互作用する受容体を精製し、放射性異性体125Iで標識できるモノクローナル抗体を生産するために用いる。GST−リガンド融合蛋白質をグルタチオン−アガロースビーズに固定する。次いで、試験化合物の存在下または不在下で、相互作用および結合を起こさせる方法で、相互作用する受容体を加える。反応期間の最後に非結合材料を洗い去り、標識したモノクローナル抗体を該系に加え、複合体化した成分に結合させる。リガンド/受容体相互作用は、グルタチオン−アガロースビーズに結合したままの放射能量を測定することによって検出される。試験化合物による相互作用の阻害の成功は、測定される放射能の減少をもたらす。
【0109】
別法では、GST−リガンド融合蛋白質および相互作用受容体を、固体グルタチオン−アガロースビーズの不在下、液体中で一緒に混合する。該種を相互作用させる間または相互作用させた後に、試験化合物を加える。次いで、該混合物をグルタチオン−アガロースビーズに加え、非結合材料を洗い去る。リガンド/受容体相互作用の阻害の程度を、標識抗体を添加し、ビーズと結合した放射能を測定することによって検出する。
【0110】
したがって、本発明は、細胞ベースおよび非細胞ベースの不均一アッセイを提供し、ここに、組換え発現されたEMMPRIN蛋白質、ポリペプチドまたは融合蛋白質、またはCyP:EMMPRIN複合体、またはEMMPRIN受容体を発現している細胞は固体基質(例えば、試験管、ミクロタイターウェル、またはカラム)に結合している。次いで、試験化合物を、固定化EMMPRIN蛋白質、ポリペプチドまたは融合蛋白質、またはCyP:EMMPRIN複合体のいずれかに結合できるその能力について、またはCyP蛋白質、ポリペプチドまたは融合蛋白質の固定化EMMPRIN蛋白質、ポリペプチドまたは融合蛋白質への結合を拮抗または促進できるその能力についてアッセイする。
【0111】
したがって、EMMPRINとEMMPRINリガンド、例えば、CyPAまたはCyPBとの間の相互作用を模倣する化合物を同定するためのスクリーンが設計される。かかるスクリーンにおいて、試験化合物を標識し、固定化EMMPRIN蛋白質、ポリペプチドまたは融合蛋白質に結合できるその能力についてアッセイする。本発明の別の態様において、EMMPRINとEMMPRINリガンド、例えば、CyPAまたはCyPBとの間の相互作用を拮抗する化合物を同定するためのスクリーンが設計される。かかるスクリーンにおいて、EMMPRINリガンドを標識し、試験化合物を、標識リガンドのEMMPRINへの結合を拮抗できるその能力についいてアッセイする。
【0112】
均一の細胞ベースおよび非細胞ベースアッセイ
均一アッセイは、細胞ベースまたは非細胞ベースのいずれかであり、ここに、全反応を液相中で行う。
細胞ベースアッセイ
均一の細胞ベースアッセイ系を用いて、例えば、HIV−1感染、AIDS、RAまたは癌の治療のための化合物を同定するために、EMMPRINの活性を変調する化合物についてスクリーンする。この目的のために、EMMPRINまたはCyPを内在性発現する細胞を化合物のスクリーンに用いる。別法では、293細胞、COS細胞、CHO細胞、MCF−7細胞、Hs578T細胞、繊維芽細胞などの細胞系統を遺伝子操作してEMMPRINまたはCyPを発現させて、スクリーニング目的に用いる。好ましくは、CyPまたはCyPペプチドまたは融合蛋白質による活性化に応答する機能的EMMPRIN蛋白質を発現するように遺伝子操作された宿主細胞をアッセイの終了点として用いる。かかる終了点は、例えば、化学的、生理学的、生物学的、または表現型特性における当該分野で認識された変化、例えば、宿主細胞遺伝子またはレポーター遺伝子(例えば、MMPs)の誘導、cAMPレベル、アデニリルシクラーゼ活性、カルシウム動員、宿主細胞G−蛋白質活性、宿主細胞キナーゼ活性、シグナル変換経路の活性化、細胞外酸性化率、増殖、分化、ウイルス感染に対する感受性、受容体改変(例えば、感作、脱感作、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション)などの測定によって提供される。
【0113】
スクリーニングアッセイにおいて有用であるためには、機能的EMMPRINまたはCyP蛋白質を発現している宿主細胞は、有意なEMMPRINに基づく終了点応答、好ましくはバックグラウンドより5倍大きい誘導を提供すべきである。EMMPRINに基づく誘導応答を最大化するために、宿主細胞は、好ましくは、その読出しに依存していくつかの特徴を有する。例えば、CREレポーター遺伝子の誘導を検出するために、(a)低い天然レベルのcAMP、(b)高レベルのアデニリルシクラーゼ、(c)高レベルの蛋白質キナーゼA、(d)低レベルのホスホジエステラーゼおよび(e)高レベルのcAMP応答エレメント結合蛋白質を含む1組のアッセイ条件が有益である。さらに、CRE受容体の誘導のための別の経路を排除して基底レベルを減少させる。EMMPRINに基づく応答を増加させるために、より大量の好ましい因子(例えば、EMMPRINアンタゴニストとして作用する化合物についてスクリーニングする場合、増強されたまたは構造的EMMPRINおよび/またはCyP発現)またはより少量の好ましくない因子(例えば、EMMPRINアゴニストについてスクリーニングする場合、増強されたCyP発現)を発現するように宿主細胞を操作する。
【0114】
かかる細胞系の使用において、EMMPRINまたはCyP蛋白質を発現している細胞を試験化合物または対照に曝露する。曝露後、細胞をアッセイしてEMMPRINシグナル変換経路の成分の発現および/または活性を測定する。別法では、シグナル変換経路自体の活性をアッセイする。例えば、曝露後、細胞溶解物をカルシウム動員(実施例3参照)、cAMPの誘導、または蛋白質チロシンキナーゼ(PTK)(実施例3)、セリン/スレオニンキナーゼ、g−蛋白質、Ras、PKA、RAP1、B−Raf、Mek、またはMAPK活性またはリン酸化の変調についてアッセイする。特定のシグナル変換経路および上流のアクチベーターの活性化または不活化は多くの転写因子の活性化または不活化を導くことができ、それは、次いで、特に細胞増殖、分化、休止または死の媒介となることができる。これは、小型GTP−結合蛋白質、Rap1上の活性部位のPKAのリン酸化ならびにその後のセリン/スレオニンキナーゼ、B−RafおよびMAPKの活性化を導くMAPKキナーゼ、Mekの活性化によるPC12細胞の神経細胞分化において例示される。この同じ経路は、特定の前立腺癌細胞系統、例えばLNCaPおよびPC−3MのNE分化に関係している。
【0115】
EMMPRINのアゴニストとして作用しうる化合物についてのスクリーニングにおいて、CyPをほとんど発現しないか、または発現しない細胞系統を用いて、対照と比較した試験化合物によるシグナル変換の活性化について試験することが有利である。EMMPRINのアンタゴニストとして作用する化合物についてのスクリーニングにおいて、CyPを過剰発現させるか、または外来性CyPを提供して、対照と比較した試験化合物によるシグナル変換の阻害について試験することが有利である。
【0116】
EMMPRINは、新たな感染後初期にHIV−1マトリックス(MA)およびキャプシド(CA)蛋白質の正常な細胞内移動の媒介となることが本明細書中に示された(実施例6および実施例7E)。よって、別の具体例において、試験化合物は、ウイルス感染後のHIV−1マトリックス(MA)およびキャプシド(CA)蛋白質の細胞内移動を調節するその能力に基づいて選択される。
【0117】
非細胞ベースアッセイ
均一な細胞ベースアッセイのほかに、均一な非細胞ベースアッセイ系を用いて、EMMPRIN、CyPまたはCyP:EMMPRIN複合体と相互作用する、例えば、それらに結合する化合物を同定する。かかる化合物は、EMMPRIN活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し、例えば、HIV−1感染、AIDS、RAまたは癌の治療において使用される。組換えEMMPRIN蛋白質、ポリペプチド、融合蛋白質または可溶性EMMPRIN蛋白質を発現させ、非細胞ベースアッセイにおいて利用して(CyP蛋白質、ポリペプチドまたは融合蛋白質を用いて、または用いずに)、EMMPRIN、CyPまたはCyP:EMMPRIN複合体に結合する化合物を同定する。別法では、1以上のEMMPRINまたはCyPドメインに対応するポリペプチド、または1以上のEMMPRINまたはCyPドメインを含有する融合蛋白質を非細胞ベースアッセイ系において用いて、EMMPRIN、CyPまたはCyP:EMMPRIN複合体に結合する化合物を同定する。同定された化合物は、EMMPRIN媒介性活性、例えば、シグナル変換を変調するのに治療上有用である。
【0118】
例えば、蛍光レポーター部分に基づくアッセイが均一の非細胞ベースアッセイの例である。かかるアッセイは、例えば、蛍光「レポーター部分」および「クエンチャー部分」を含み、その各々がリンカー部分(例えば、フォスフォルアミダイト、または当該分野で使用可能な他の適当なリンカー)に共有結合し、それにより、各々が相互作用蛋白質対の1メンバーに互いに結合する(例えば、レポーター部分はリガンドに結合し、クエンチャー部分は相互作用受容体に結合した)。適当なレポーターおよびクエンチャー分子の例は、5’蛍光レポーター色素6FAM(「FAM」;2,7−ジメトキシ−4,5−ジクロロ−6−カルボキシ−フルオレセイン)、TET(6−カルボキシ−4,7,2’,7’−テトラクロロフルオレセイン)および3’クエンチャー色素TAMRA(6−カルボキシテトラメチルローダミン)(Livakら、PCR Methods Appl. 4: 357−362, 1995; Gibsonら、Genome Res. 6: 995−1001;およびHeidら、Genome Res. 6:986−994, 1996)。
【0119】
レポーターおよびクエンチャー部分が極めて接近している場合、レポーター部分発光はクエンチング部分へ効率よく移動し、蛍光−発光スペクトル(例えば、518nm)はクエンチされるかまたは遮蔽される。しかしながら、分離すると、レポーター部分発光はもはやクエンチング部分へ効率よく移動せず、その結果、レポーター部分蛍光−発光スペクトルの増加をもたらす。典型的には、反応の間、クエンチング部分(例えば、TAMRA)の蛍光強度があまり変化しないような蛍光色素が選択される。マグネシウムおよび塩濃度、反応条件(時間および温度)、蛋白質配列、大きさおよび組成を包含するいくつかの因子は、かかる蛍光に基づくアッセイの効率に影響を及ぼす。所定のゲノム座について最適な蛍光強度を生じるためのこれらの因子の最適化は、当業者に明らかである。
【0120】
したがって、本発明に包含される1の具体例において、予め形成されたCyP:EMMPRIN複合体を調製し、ここに、CyPまたはEMMPRINのいずれか(または両方)は適当な蛍光タグで標識されており、複合体形成のために標識またはタグにより生じるシグナルはクエンチされる(例えば、米国特許第4,109,496号参照)。予め形成された複合体由来の種の1つと競合し、それを置換する試験物質の添加は、バックグラウンドより大きいシグナルの生成をもたらす。このように、CyP:EMMPRIN相互作用を拮抗する試験物質が同定される。
【0121】
スクリーニング化合物
上記のアッセイを用いて、EMMPRINまたはCyP:EMMPRIN複合体活性に影響を及ぼす化合物を同定する。例えば、EMMPRINまたはCyP:EMMPRIN複合体活性に影響を及ぼす化合物は、限定するものではないが、EMMPRINに結合して天然リガンド(CyP)の結合を阻害するかまたは阻害せず、シグナル変換を活性化する(アゴニスト)かまたは活性化を阻害する(アンタゴニスト)化合物、およびCyP(例えば、可溶性EMMPRIN蛋白質またはペプチド、またはCsA誘導体)に結合し、それにより、CyP−媒介性EMMPRIN活性を拮抗または増強する化合物を包含する。
【0122】
EMMPRINシグナル変換を変調する化合物(例えば、下流のシグナリング事象、カルシウム動員(実施例3参照)、cAMPの誘導、蛋白質チロシンキナーゼ(PTK)(実施例3)またはセリン/スレオニンキナーゼ、G蛋白質、Ras、PKA、RAP1、B−Raf、MekまたはMAPK活性またはリン酸化の変調(それは、CyPがEMMPRINに結合することによって活性化されるシグナルの変換に関係しうる)に影響を及ぼす化合物)もまた、本発明のアッセイ法によって同定される。本発明は、EMMPRINの下流のシグナリング事象に影響を及ぼし、よって、CyPおよびEMMPRINのHIV感染、AIDS、RAおよび癌に対する影響を変調するような化合物の同定および使用を提供する。
【0123】
しかしながら、EMMPRIN遺伝子活性に影響を及ぼす化合物(EMMPRIN遺伝子発現に影響を及ぼすことによって、転写に影響を及ぼすかまたはスプライス事象を干渉し、その結果、全長または末端切断型のEMMPRINの発現を変調できる分子、例えば、蛋白質または小型有機分子を包含する)もまた、本発明のアッセイ法によって同定される。
【0124】
本発明にしたがってスクリーンされる化合物は、限定するものではないが、EMMPRINまたはCyP:EMMPRIN複合体に結合し、CyPによって引き起こされる活性を模倣する(すなわち、アゴニスト)かまたはCyPによって引き起こされる活性を阻害する(すなわち、アンタゴニスト)ペプチド、抗体およびそのフラグメント、および他の有機化合物(例えば、ペプチド模倣物);ならびにCyPに結合し、それにより、CyP−媒介性EMMPRIN活性を「活性化」または「中和」するペプチド、抗体またはそのフラグメント、および他の有機化合物(変異体または末端切断型EMMPRIN分子(またはその一部)を包含する)を包含する。化合物は、限定するものではないが、ランダムペプチドライブラリー;(Lamら、Nature 354: 82−84, 1991; Houghtenら、Nature 354: 84−86, 1991)、およびD−および/またはL−配置アミノ酸、ホスホペプチド(限定するものではないが、ランダムまたは部分変性した特異的(directed)ホスホペプチドライブラリーを包含する;例えば、Songyangら、Cell 72: 67−778, 1993)、抗体(限定するものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗−イディオタイプ、キメラまたは1本鎖抗体、およびFAb、F(ab’)2およびFAb発現ライブラリーフラグメント、およびそのエピトープ結合フラグメントを包含する)および小型有機または無機分子より作成されるコンビナトリアル化学に由来する分子ライブラリーのメンバーを包含するがそれに限定されるものではないペプチド、例えば可溶性ペプチドを包含する。本発明にしたがってスクリーンされる他の化合物は、限定するものではないが、血脳関門を横切り、適当な細胞中へ侵入し、(例えば、遺伝子発現に関与する調節領域または転写因子と相互作用することにより)EMMPRIN遺伝子またはEMMPRINシグナル変換経路に関与するいくつかの他の遺伝子の発現に影響を及ぼすことのできる小型有機分子;またはEMMPRINの活性またはEMMPRINシグナル変換経路に関与するいくつかの他の細胞内因子の活性(例えば、カルシウム動員、cAMPの誘導、蛋白質チロシンキナーゼ(PTK)、セリン/スレオニンキナーゼ、G蛋白質、Ras、PKA、RAP1、B−Raf、MekまたはMAPK活性またはリン酸化の変調)に影響を及ぼすような化合物を包含する。
【0125】
また、CyP/EMMPRIN相互作用の同定により、当該分野で認められたコンピューターモデリング(例えば、X線結晶学、NMRに基づいた活性部位モデリングなど)およびデータベース検索技術を応用して、EMMPRIN発現または活性を変調できる化合物の同定、またはすでに同定された該化合物の改善が可能となる。
【0126】
医薬処方および癌の治療法
CyP−媒介性EMMPRIN活性、例えば、EMMPRIN−媒介性シグナル変換を減少または増強する本発明のアッセイにおいて同定された化合物を用いて、例えば、HIV−1感染、AIDSおよびAIDS関連障害、RAまたは癌を治療することができる。特定の方法、処方および投与様式は、治療上の徴候、および化合物の物理化学的特性、および標的器官または組織に依存するであろう。異なるアプローチが議論される。
【0127】
本発明によると、治療上関連のあるEMMPRIN発現細胞のイン・ビトロでの抗−CD147mAbを用いる処理は、HIV−1による感染を阻害しただけでなく、CyP−媒介性EMMPRINシグナル変換をも阻害した(実施例2、3、5、6および7参照)。したがって、適当な患者におけるイン・ビボでのCyP−媒介性EMMPRIN活性の拮抗(例えば、抗−EMMPRIN抗体の投与による、または下流のシグナリング事象を標的とすることによって)は、例えば、HIV−1感染、AIDSおよびAIDS関連障害、RAまたは癌の治療において有用であろう。別法では、CyP−媒介性EMMPRIN活性のアゴニストは、例えば、正常な組織リモデリング過程を増強するのに有用である。
【0128】
治療化合物のCyP/EMMPRIN相互作用に対する絶対的な特異性が明らかである必要はない。例えば、EMMPRINおよび他の未知のCyP相互作用分子の両方を作動する化合物を使用することができた。かかる化合物は、例えばHIV−1感染、AIDS、RAまたは癌治療を達成するように、関節、血液、胸部組織、前立腺またはその他へのデリバリーが最も効果的になるように、および潜在的な副作用が最小限になるように、投与することができた。CyP/EMMPRIN相互作用に対する特異性が明らかではない化合物は、他の分子(例えば、他のCyP相互作用蛋白質)の変調に起因しうる副作用を制御するための別の療法または薬剤と共に投与することができるが、CyP/EMMPRIN相互作用に対する優先性または選択性が明らかな化合物が好ましい。
【0129】
投与量決定
かかる化合物の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物において、例えば、LD50(集団の50%までの致死量)およびED50(集団の50%における治療上有効な投与量)を決定するための標準的な医薬および毒物学的手法によって決定される。毒性および治療的効果の間の投与量比は治療的指標であり、それは、LD50/ED50比として表すことができる。大きい治療的指標を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を用いてもよいが、非感染細胞への損傷の可能性を最小限にし、それにより副作用を減少させるために、かかる化合物が冒された組織の部位を標的とするデリバリーシステムを設計するよう取り計らうべきである。
【0130】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量範囲を計画するのに使用される。かかる化合物の投与量は、好ましくは、毒性をほとんど伴わないか、または毒性を伴わないED50を包含する循環濃度の範囲内にある。該投与量は、使用される投薬形態および利用される投与経路に依存して該範囲内で変化してもよい。本発明の方法で使用されるいずれかの化合物の場合、治療上有効な投与量は典型的に、細胞培養アッセイから最初に見積もられる。投与量は、細胞培養において決定されるIC50(すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度)を包含する循環血漿濃度範囲に達するように、動物モデルにおいて処方されてもよい。かかる情報を用いて、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定する。例えば、高速液体クロマトグラフィーによって、血漿中レベルを測定する。治療上有効な投与量はさらに、HIV感染を阻害するのに十分な化合物の量をいう。治療上有効な投与量は、単独で、またはHIV感染もしくは関連疾患のための他の治療と組み合わせて補助療法として投与されてもよい。
【0131】
治療上有効な投与量はさらに、HIV感染を阻害する、またはAIDS−、RA−もしくは癌−関連過程の進行を阻害するのに十分な化合物の量をいう。治療上有効な投与量は、単独で、またはHIV感染もしくは関連疾患のための他の治療と組み合わせて補助療法として投与されてもよい。
【0132】
処方および使用
本発明の化合物の処方および投与のための技術は、例えば、”Remington’s Pharmaceutical Sciences” Mack Publishing Co., Easton, PA, 最新版において見出される。本発明にしたがう使用のための医薬組成物は、1以上の生理学上許容される担体または賦形剤を用いて常法において処方される。
したがって、該化合物およびその生理学上許容される塩および溶媒和物は、例えば、吸入または吹き入れ(口または鼻を介する)、経口、バッカル、直腸、経粘膜、または腸内投与、粘膜内、皮下、骨髄内注射ならびにくも膜下、直接的脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射を包含する非経口デリバリーを包含する適当な経路を介する投与のために処方され、デポーまたは徐放性製剤に処方されてもよい。さらに、本発明の薬剤を標的とされるドラッグデリバリーシステムにおいて、例えば、抗−CD4抗体で被覆したリポソームにおいて投与してもよい。かかるリポソームは、CD4を発現している細胞を標的とし、該細胞によって選択的に拾い上げられる。
【0133】
経口投与の場合、医薬組成物は、医薬錠許容される賦形剤、例えば:結合剤(例えば、糊化トウモロコシ澱粉、コムギ澱粉、コメ澱粉、ジャガイモ澱粉、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および/またはポリビニルピロリドン(PVP);充填剤(例えば、ラクトース、シュークロース、マンニトール、またはソルビトール、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム);滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ);崩壊剤(例えば、ジャガイモ澱粉、澱粉グリコール酸ナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩、例えば、アルギン酸ナトリウム);または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)を用いて常法によって調製される、例えば、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などの形態をとる。錠剤は、当該分野でよく知られた方法によって被覆される。経口投与用の液体調製物は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液であり、またはそれらは、使用前に水または他の適当なビヒクルで復元するための乾燥産物として提供されてもよい。かかる液体調製物は、医薬上許容される添加物、例えば、懸濁化剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素添加食用脂肪);乳化剤(例えば、レシチンまたはアラビアゴム);非水性ビヒクル(例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分別植物油);および保存料(例えば、メチルまたはプロピル−p−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸)を用いて常法によって調製される。該調製物はまた、緩衝塩、フレーバー、着色料および甘味料を適宜含有していてもよい。経口投与用調製物は、活性化合物の制御された放出を与えるように適当に処方されうる。バッカル投与の場合、組成物は、常法において処方される錠剤またはロゼンジの形態をとっていてもよい。
【0134】
吸入による投与の場合、本発明による使用のための化合物は、通常、適当なプロペラント、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガスを用いて、加圧パックまたはネブライザーから与えられるエーロゾルスプレーの形態でデリバリーされる。加圧エーロゾルの場合、投薬単位は、計量した量をデリバリーするためのバルブを提供することによって決定されうる。吸入器または吹き入れ器中において使用するための化合物と適当な粉末基剤、例えば、ラクトースまたは澱粉の粉末混合物を含有しているゼラチンのカプセルおよびカートリッジを処方してもよい。
【0135】
注射の場合、本発明の薬剤を水性溶液、好ましくは生理学上相溶性のバッファー、例えば、ハンク溶液、リンガー溶液または生理学的セーラインバッファー中で処方してもよい。
化合物は、ボーラス注射による注射または連続的注入による非経口投与用に処方されてもよい。注射用処方は、保存料を添加したアンプルまたは複数回投与量用の容器中における単位投与量形態において提供されうる。非経口投与用の医薬処方は、水溶性形態における活性化合物の水溶液を包含する。さらに、活性化合物の懸濁液は、適当な油性注射懸濁液として調製されうる。適当な脂肪親和性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを包含する。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘性を増加する物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含有しうる。所望により、懸濁液はまた、高濃度溶液の調製可能とするために、適当な安定化剤または化合物の可溶性を増加させる薬剤を含有してもよい。
【0136】
経粘膜投与の場合、浸透されるべき障壁に適当な浸透剤を処方に用いる。
さらに、化合物はまた、デポー製剤として処方されうる。かかる長期作用性処方は、植え込みによって(例えば、皮下または筋内に)または筋内注射によって投与されうる。したがって、例えば、化合物は、適当な高分子または疎水性材料(例えば、許容できる油中のエマルジョンとして)またはイオン交換樹脂と共に、または可溶性の乏しい誘導体として、例えば、可溶性の乏しい塩として処方されうる。
【0137】
CyP/EMMPRIN相互作用のモジュレーターとして同定された本発明の化合物の多くは、医薬上適合性のカウンターイオンとの塩として提供されうる。医薬上適合性の塩は、限定するものではないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを包含する多くの酸または塩基と共に形成されうる。塩は、対応する遊離の塩基形態である水性または他のプロトン性溶媒中でより可溶性である傾向がある。医薬上許容される塩、担体または賦形剤の例は、当業者によく知られており、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A.R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990において見出すことができる。かかる塩は、限定するものではないが、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、塩化水素、臭化水素、ヨウ化水素、酢酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩などを包含する。
【0138】
所望により、化合物を、活性成分を含有する1以上の単位投与形態を含有しうるパックまたはディスペンサー装置中に提供してもよい。パックは、例えば、金属またはプラスチック箔、例えばブリスターパックを含みうる。パックまたはディスペンサー装置には、投与説明書が付随しうる。
【0139】
EMMPRIN活性を制御し、HIV−1感染、AIDSおよびAIDS関連障害、RA、癌または局所的もしくは全身性のCyP放出、合成もしくは結合によって特徴付けられる他の症状を治療または予防することに対する細胞ベースの遺伝子療法アプローチ
患者におけるEMMPRIN遺伝子発現および/またはEMMPRIN活性の全レベルを変調するために利用されうる付加的な方法は、可溶性EMMPRINまたはCyPドメイン、その融合蛋白質(例えば、EMMPRINまたはCyPの融合Ig分子)、またはシクロフィリン(CyPを包含する)変異体、例えばCyP/EMMPRIN相互作用を干渉することによって、HIV感染またはEMMPRIN媒介性シグナル変換を阻害するEMMPRINまたはCyPの分子デコイまたは他の模倣物を発現する適当な組換え(遺伝子操作された)または非組換え細胞の導入を包含する。かかる細胞、好ましくは自己細胞は、適当な解剖学上の部位に(例えば、RA関節に)、またはそれらが可溶性分子の供給をデリバリーする「バイオリアクター」として機能しうる体内の異なる部位に配置される組織移植片の一部として、イン・ビボで投与される。かかる可溶性EMMPRINまたはCyPポリペプチドおよび融合蛋白質は、適当な濃度で発現される場合、内在性EMMPRIN活性を拮抗または作動することにおいて、あるいは場合により、EMMPRINの天然リガンド(すなわち、CyP)を中和、「排除」または「活性化」することにおいて有用であり、かくして、例えば、HIV−1感染、AIDSおよびAIDS関連障害、RAおよび癌の治療のために、EMMPRIN活性のモジュレーターとして作用する。かかる細胞ベースの遺伝子療法技術は、当業者によく知られている(Andersonら、米国特許第5,399,349号;Mulligan & Wilson, 米国特許第5,460,959号)。例えば、これらの方法は、近年、ヒト糖尿病の治療への応用が成功し、それにより、糖尿病患者は、インスリン分泌性膵臓小島細胞の移植(生着)によって毎日のインスリン注射から開放された(Shapiroら、N. Engl. J. Med. 343: 230−238, 2000)。
【0140】
実施例1
EMMPRINはCyP相互作用蛋白質である。
該実施例は、CyPAを「餌(bait)」として(すなわち、相互作用標的として)用いる酵母2−ハイブリッドプロトコール(Clontech Laboratories, Inc.; Palo Alto, CA)を用いるイン・ビトロ実験を提供して、Bリンパ球から調製されたcDNA「捕獲(prey)」ライブラリーをスクリーニングすることによってCyPA−相互作用蛋白質を同定する。特に、以前に知られた膜貫通蛋白質EMMPRINは、本発明の該具体例においてCyPA−相互作用蛋白質として同定された。
【0141】
方法 酵母2−ハイブリッドスクリーニング
簡単に言うと、ヒトCyPAとして同定された「発現された配列タグ」をATCC(ATCC#78809D)から得た。イン・ビトロでの翻訳および配列決定は、該配列が全長CyPA cDNA(本質的にGenBank#Y00052と相同性)を示すことを確認した。配列をベクターpAS2−1(ClonTech)中にクローン化して、CyPA−GAL4 DNA結合ドメイン(BD)融合蛋白質をコードしているプラスミドpAS2−1−CyPAを作成した。該プラスミドを「餌」として用いて、GAL4活性化ドメイン(AD)をコードしているpSE1107中に構築されたヒトB−細胞cDNAライブラリー(すなわち、「捕獲」ライブラリー)(Dr. S. Fields, SUNY, Stony Brook由来)(ライブラリー複雑度≒108)をスクリーンした。
【0142】
スクリーニングは、MATCHMAKERTM(登録商標)2−ハイブリッドシステム2(Clontech Laboratories, Inc.; Palo Alto,CA)を用いて本質的に製造者による示唆通りに行った。対照実験において、pAS2−1−CypAは、酵母レポーター宿主株(Y187またはY190)中に単独で導入された場合、または「空の」GAL4活性化ドメイン(AD)ベクター(pACT2,Clontench)と同時形質転換した場合、GAL4プロモーター由来の転写を活性化しなかった(ベータ−ガラクトシダーゼ活性として測定された)(負の対照)。pAS2−1−CypAがpGAD424−GAG構築物(全長HIV−1gag蛋白質とGAL4 ADとの間の融合を発現している;Luban ら、Cell 73: 1067−1078, 1993)と同時形質転換された場合に、強力な正のシグナルが検出された(正の対照)。実際のスクリーニングは、pAS2−1−CypAをpSE1107−細胞ライブラリーと一緒にY190酵母レポーター宿主株中へ同時形質転換することによって行われた。相互作用性同時形質転換体についての選択は、3連のドロップ−アウトプレート(SD/−His/−Trp/−Leu)上に培養物を播種し、次いで、標準的なフィルターアッセイプロトコールによりlacZレポーター遺伝子の発現についてコロニーを試験することによって行った。全ての青色コロニーをさらに、ClonTechプロトコールにたがってシクロヘキシイミドカウンター−選択によってスクリーンして、偽陽性を同定した。最後に、真の陽性コロニー由来のプラスミドを単離し、配列決定した。
【0143】
単離したEMPRINクローン
約106個のcDNAクローンをスクリーンした。数ラウンドのスクリーニングの後、10個のクローンを真の陽性として選択し(上記の「方法」を参照)、配列決定した。該スクリーンにおいて比較的強く相互作用したクローンのうち1つは、その配列決定された5’側の186個のヌクレオチドにおいてヒト細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導因子(EMMPRIN)cDNA(DeCastroら、J. Invest. Dermatol. 106: 1260−1265, 1996)と97%同一であるインサートを有した。EMMPRINは、CyPA相互作用性クローンのなかで唯一の膜貫通蛋白質であり、それによりCyPA受容体という役目の良好な候補物質とされたので、さらなる分析のために選択された(図1)。EMMPRIN(ヒト)のDNAおよび蛋白質配列を各々、配列番号1および配列番号2に示す。
【0144】
EMMPRINは、50−60kDaの分子量および特徴的なシグナルペプチド(sp)、細胞外(ecd)、膜貫通(tm)および細胞内(icd)ドメインを有する269−アミノ酸の高度にグリコシル化された細胞表面蛋白質である(図1、左パネル)。構造的に、EMMPRINは免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリーに属する(Miyauchiら、J. Biochem. (Tokyo) 107: 316−323, 1990; Kasinrerkら、J. Immunol. 149: 847−854, 1992)。別法では、EMMPRINは、ヒトにおいてCD147、バシジン(basigin)およびM6−抗原(Miyauchiら、J. Biochem. (Tokyo) 107: 316−323, 1990; Kasinrerkら、J. Immunol. 149: 847−854, 1992)、ニワトリにおいてニューロセリンおよびHT7(Albrechtら、Brain Res. 535: 49−61, 1990)、マウス胚においてバシジンおよびgp42蛋白質(Altrudaら、Gene 85: 445−451, 1989; Igakuraら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 224: 33−36, 1996)およびラットにおいてOX−47(Fossumら、Eur. J. Immunol. 21: 671−679, 1991)細胞ともいう。これらの分子の全てに関するアミノ酸配列および予測第三構造は、高いホモロジーおよび決定的なアミノ酸の保存を共有する。
【0145】
EMMPRINは、いくつかの腫瘍細胞の細胞表面上に発現され、それにより、培養中、非常に高レベルのコラゲナーゼ活性を生じるように繊維芽細胞を刺激する(Biswasら、Cancer Res. 55: 434−439, 1995)。コラゲナーゼおよび他のメタロプロテイナーゼの分泌は、基底膜の細胞外マトリックス成分の分解、腫瘍細胞侵入および転移における決定的な工程を導き、慢性関節リウマチにおける軟骨崩壊に寄与する(McCachren, Arthritis Rheum. 34: 1085−1093, 1991; Firestein, Arthritis Rheum. 39: 1781−1790, 1996)。
【0146】
EMMPRINはまた、幅広い正常細胞において発現される。例えば、EMMPRINは、網膜発達におけるニューロン−グリア細胞相互作用(Fadool & Linser, Dev. Dyn. 196: 252−262, 1993)および免疫応答および細胞−細胞認識の調節(Berditchevskiら、J. Biol. Chem. 272: 29174−29180, 1997)に関与することが知られている。バシジン欠失マウスは、両性の生殖不能症を示し、短期間の記憶および学習における欠陥を示す(Igakuraら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 224: 33−3649, 1996)。EMMPRINの発現は、PHAによるT細胞活性化においてアップレギュレートされる。該アップレギュレーションは、該表面におけるEMMPRINの二量体化を導き、それにより、容易に抗体認識可能になる(Edwards & Hallett, Immunol. Today 18: 320−324, 1997)。
【0147】
EMMPRINがCyPA結合蛋白質である確認
本発明の別の具体例において、固定化CyPAおよびイン・ビトロで転写および翻訳された[35S]−標識化EMMPRINを用いてアフィニティー樹脂結合分析を行って、酵母2−ハイブリッド実験において観察されたEMMPRIN−CyPA相互作用を確認した。図1は、[35S]−標識化EMMPRINが特にCyPA−誘導体化セファロースビーズによって保持されたことを示す(図1、右側のパネル)。
【0148】
方法 [35S]−標識化EMMPRINの調製
EMM.C1(ecd、tmおよびicdドメインを含有する)およびEMM.C2(tmおよびicdドメインを欠く)フラグメントをpT7Blueベクター中にクローン化し、標準的なPromegaプロトコールにしたがって、TnT−結合型網状赤血球ライゼートシステム(Promega)を用いる結合型イン・ビトロ転写−翻訳反応に付した。
【0149】
CyPAアフィニティービーズの調製および結合反応条件
CyPAアフィニティー樹脂は、製造者の指示書にしたがって、組換え体ヒトCyPAをセファロースに結合させることによって調製した。簡単に言うと、1gの凍結乾燥したCNBr−活性化セファロース4B(Pharmacia; Piscataway, NJ)を1mM HCl中で再水和し、焼結ガラス漏斗上、1mM HCl(200ml/g凍結乾燥粉末)で15分間洗浄した。洗浄した樹脂を、3.3mlの0.1M NaHCO3/0.5M NaClバッファー(pH8)中に溶解した6mgの組換え体ヒトCyPAと混合した。混合物を室温で2時間振盪し、そのとき、0.15mlの1Mエタノールアミン−HCl(pH9.0)を加え、混合物をさらに2時間振盪させて過剰の反応性基をクエンチし、次いで、樹脂を三サイクルの別のpHで広範囲に洗浄した。対照樹脂は、最初のカップリング工程の間にCyPAが加えられなかったことをのぞき、同様に処理された。結合反応は、結合バッファー(20mM HEPES,pH6.8;150mM KOAc;2mM Mg(OAc)2;2mM DTT;0.1%Tween20;0.1mM PMSF,1μg/mlアプロチニン,1μg/mlペプスタチン)中、室温で90分間行った。
【0150】
EMMPRINは、CyPA−被覆セファロースビーズによって特異的に保持された。
[35S]−標識化EMMPRINのアリコートをCyPAアフィニティー樹脂または対照樹脂と一緒にインキュベートした。結合した蛋白質を標準Laemmliバッファーで溶出し、電気泳動およびオートラジオグラフィーによって明らかにした(図1、右側のパネル)。[35S]−標識化EMMPRINは、CyPAセファロースビーズによって特異的に保持されたが、CyPAを欠く対照ビーズには保持されなかった。
【0151】
該特異的なイン・ビトロ結合相互作用は、全長EMMPRIN構築物EMM.C2(ecd、tmおよびicdドメインを含有する)でのみ観察され、tmおよびicdドメインを欠くEMM.C1 EMMPRIN構築物では観察されなかった。さらに、CyPAは、無傷細胞上の細胞表面EMMPRINに結合し、細胞内シグナリングを誘導する(下記参照)。これらの結果は、おそらく、セファロースビーズ上のCyPAに対するecd CyP−結合部位の適当な提示のためにEMMPRIN膜貫通および/または細胞内ドメインが必要であること、またはCyPAが直接tmドメインと、ecdまたはtmドメインのいずれかと、または両方のドメインと相互作用するメカニズムを反映する。
【0152】
実施例2
EMMPRINはCyPAに対するシグナリング受容体である。
該実施例は、EMMPRIN−トランスフェクトCHO細胞が高レベルのEMMPRINを細胞表面上に発現したこと、CyPAおよびCyPBがかかるCHO−EMMPRIN細胞においてCa2+動員を誘導したこと、およびかかるCHO−EMMPRIN細胞におけるCyPにより誘導されるCa2+動員が抗−EMMPRIN抗体の添加によって阻害されたことを明らかにし、EMMPRINがCyPのシグナリング受容体であることを示すイン・ビトロ実験およびアッセイを提供する。
【0153】
実施例1の具体例に示される結果(図1)は、イン・ビトロで発現されたEMMPRINがセファロースアフィニティー樹脂上に固定されたCyPAに結合することを明らかにする。CyPが細胞表面に発現されたEMMPRINに結合するかどうか、該相互作用が細胞内シグナリングカスケードを引き起こすかどうかを評価するために、さらに実験が行われた。
【0154】
CHO細胞系統はEMMPRIN−陰性であるが、高レベルのEMMPRINを発現するようにトランスフェクトされた。
試験された全てのヒトおよびほとんどのマウス細胞系統は、すでにEMMPRINを発現していた。したがって、CyP−EMMPRIN相互作用の分子メカニズムを分析するために、検出可能なEMMPRINを有さないCHO細胞が選択された。ヒトEMMPRIN発現ベクターですでに一過性トランスフェクトされているCHO細胞の不均一集団をブライアン・トゥール(Brian Toole)博士(Trufts University; Boston, MA)から得た。高レベルのEMMPRINを安定に発現した個々のクローンを、市販の抗−ヒトEMMPRINモノクローナル抗体(抗−CD147、Research Diagnostics, Inc.; Flanders, NJ)を用いるFACSソーティングによって該不均一集団から単離した。図2は、最も高レベルのEMMPRINをその表面に発現しているCHOクローン(CHO−EMM)のFACS分析を示す。CHO−EMMクローンを増殖させ、さらなる実験の全てに使用した。
【0155】
外来的に加えられたCyPAまたはCyPBは、CHO−EMMPRIN細胞においてCa2+動員を誘導した。
EMMPRIN−トランスフェクト(CHO−EMM)および対照(ベクター−トランスフェクト)CHO細胞におけるカルシウムの細胞内貯蓄の相対的動員を分析して、CyP−EMMPRIN相互作用が細胞内シグナル変換を導くかどうかを決定した。
【0156】
方法 Ca2+動員
Ca2+動員アッセイは、本質的にSherryら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 1758−1763, 1998に記載のとおりに行った。簡単に言うと、3x106個のFura−2−AM−負荷CHOまたはCHO−EMM細胞(5x106細胞/ml)を1試料あたり10μgのヒトCyPAで刺激し、340および380nmの蛍光発光をPerkin−ElmerルミネセンススペクトロメーターLS50B上で測定した。
CyPAは、CHO−EMMにおいて特徴的なCa2+動員を誘導したが、対照CHO細胞において誘導しなかった(図3、左側のパネル)。付加的な実験が10μg/ml CyPA濃度でのシグナリング応答の飽和を示したので、図3に示される結果は該濃度を用いて得られた。これらの結果は、EMMPRINがCyPAのシグナル変換受容体であることを明らかにする。同様の結果が、CHO−EMM Ca2+動員アッセイにおいてCyPBを用いて得られた。
【0157】
CHO−EMMPRIN細胞におけるCyPにより誘導されるCa2+動員は、抗−EMMPRIN抗体の添加によって阻害された。
観察されたカルシウム動員が特異的にEMMPRIN媒介性であったという付加的な証拠を得るために、抗−EMMPRIN抗体またはイソ型対照抗体の存在下でのカルシウム動員実験を行った(図3、右側のパネル)。
【0158】
方法 Ca2+動員
Ca2+動員アッセイは、抗−CD147mAb(M6FT)(Research Diagnostic, Inc)およびイソ型対照抗体(33814X, Pharmingen)をFura−2−AM負荷工程の間に500ng/ml濃度で加えたことを除き、本明細書に上記されたとおりに行った。
【0159】
抗−CD147mAb(M6FT)の存在下、CyPAはCHO−EMM細胞においてCa2+シグナリングを誘導せず(図3、右側パネル)、細胞表面EMMPRINに結合する抗−CD147抗体およびCyPAが相互に排他的であることを確立した。付加的な対照実験は、抗−CD147mAb(M6FT)自体が、CHOまたはCHO−EMM細胞においてCa2+シグナリングを誘導しなかったことを示した。合わせて考慮し、使用された抗体の文書で証明された特異性を考慮すると、これらのデータはEMMPRINがCyPAのシグナリング受容体であることを証明する。
【0160】
実施例3
CHO−EMMPRIN細胞におけるCyPAにより誘導されるCa2+動員はゲニステインによって阻害された。
該実施例は、CyPに誘導されるEMMPRIN媒介性Ca2+動員が既知の細胞内シグナル変換経路を介して起きることを明らかにするイン・ビトロ実験およびアッセイを提供する。CyPAにより誘導されるCa2+動員は、細胞内シグナルの変換に関与することが知られている種々のキナーゼの阻害剤で前処理された細胞において測定された。特に、チロシンキナーゼ阻害剤、ゲニステインは、EMMPRINを安定に発現したCHO−EMM細胞においてCyPAにより誘導されるCa2+動員を完全に排除した(図4)。
【0161】
方法 Ca2+動員の阻害分析
CHO−EMMPRIN細胞は、まず、細胞のFura−2負荷の間、下記の薬剤:ビス−インドリルマレイミド(10nM)、PKC阻害剤;PD98059(100μM)、MAPK阻害剤およびゲニステイン(67μM)、チロシンキナーゼ阻害剤で45分間前処理した。次いで、該細胞を10μg/mlのCyPAで刺激し、上記のようにCa2+動員分析に付した。別法では、Gi−GoおよびGt−蛋白質ファミリーのメンバーによって媒介されるシグナリング経路を不活化するボルデテラ・パルツシス(Bordetella pertussis)毒素(PTX;100ng/ml)、または近年、ケモカイン受容体の交差−脱感作を誘導することが示された(Alfanoら、J. Exp. Med. 190: 597−606, 1999)PTX B−オリゴマー(100ng/ml)を10μg/ml CyPAでの刺激およびCa2+動員分析の12時間前に加えた。
【0162】
ゲニステインは、CHO−EMM細胞においてCyPAに誘導されるEMMPRIN−媒介性Ca2+動員を完全に排除した。
図4は、ビス−インドリルマレイミドI(PKC阻害剤)およびPD98059(MAPK阻害剤)が、CHO−EMM細胞におけるCyPAにより誘導されるCa2+動員に対して影響を及ぼさなかったことを示す。同様に、百日咳毒(PTX)またはPTX B−オリゴマーでの細胞の処理は、CHO−EMM細胞におけるCyPAにより誘導されるCa2+シグナリングを阻害しなかった。対照的に、チロシンキナーゼの阻害剤であるゲニステインは、CyPAに刺激されたCHO−EMMPRIN細胞においてCa2+動員を完全に排除した(図4、下方の曲線)。これらのデータは、CyPAに誘導されるEMMPRIN−媒介性シグナル変換がチロシンキナーゼ依存性経路を介して起こることを示す。
【0163】
実施例4
CyPA−処理は、培養された繊維芽細胞によるプロMMP発現および放出をアップレギュレートした。
該実施例は、CyP−処理が初代肺繊維芽細胞におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ(以後、「MMP」という)発現をアップレギュレートするかどうかを決定するためのイン・ビトロ実験およびアッセイを提供する。本発明の具体例は、CyPA−処理がWI−38培養ヒト初代肺繊維芽細胞によるMMP−1の発現および放出を活性化し、MMP−3のそれを増強したことを明らかにする(図5)。
【0164】
方法 初代ヒト肺繊維芽細胞のCyP−処理;ウェスタンイムノ−ブロット分析
まず、初代WI−38ヒト肺繊維芽細胞(高レベルのEMMPRINを発現している)を80%集密度まで増殖させ、一晩、血清欠乏にし、次いで、単独または100ng/ml CyPAの存在下で5時間インキュベートした。次いで、細胞上清および膜を収集し、特異的マウス抗体を用いるウェスタンイムノ−ブロット分析によってMMP発現について分析した(Cal Biochem; La Jolla, CA)。
【0165】
CyPA処理は、WI−38繊維芽細胞によるプロMMP−1の発現および放出を活性化し、プロMMP−3の発現および放出を増強した。
MMP−1、MMP−3およびMMP−9は、慢性関節リウマチ患者の滑液中で上昇することが報告されており、疾患関連病理に寄与すると考えられるので(Sorsaら、Semin. Arthritis Rheum. 22: 44−53, 1992; Keyszerら、J. Rheumatol. 26: 251−258, 1999; Soら、Rheumatology (Oxford). 38: 407−410, 1999; McCachren, Arthritis Rheum. 34: 1085−1093, 1991)、CyPAがMMP−1、MMP−3およびMMP−9の発現を誘導するかという疑問を調べた。
図5は、非処理繊維芽細胞ではなく、CyPAで処理されたWI−38繊維芽細胞がMMP−1を培養流体中に発現および放出したことを示す。さらに、CyPAは、MMP−3の発現および放出を増強し、さもなければ、それはこれらの細胞によって構造的に分泌された。MMP−9は、非処理またはCyPA−処理細胞の上清流体中で観察されなかった。
【0166】
さらに、SDS−PAGE分析によって評価される分子量に基づき、プロ酵素形態のMMP−1およびMMP−3がCyPAに応答して放出されたことが決定された。チモグラフィーを用いて活性なMMPを分析する平行実験では、各々、成熟した活性なMMP−1およびMMP−3に相当するであろう45kDaおよび33kDaのバンドが現れなかった。MMP発現は本発明の具体例にしたがって、培養中の休止繊維芽細胞の精製された集団において調べられていたので、これは驚くべきことではなかった。MMPファミリーの全メンバーは、周囲の細胞および組織によって放出される蛋白質分解性酵素によって細胞外でその後に活性化される不活性なチモーゲン(例えば、プロMMP−1およびプロMMP−3)として分泌されることが知られている(Woessner, FASEB J. 5:2145−2154, 1991)。正常な関節と比べて炎症を起こしたRA関節では、プロMMP−1およびプロMMP−3をその活性形態へ最終的に切断する酵素の供給源であると考えられる好中球の数が著しく増加している。次いで、活性化したMMPsは、軟骨を分解するように作用して関節崩壊を導く(Edwards & Hallett, Immunol. Today 18: 320−324, 1997)。
【0167】
これらのデータは、イン・ビボでのマトリックスメタロプロテイナーゼ活性のEMMPRIN−媒介性刺激のための二元的メカニズムであって、それにより、EMMPRINが細胞外CyPリガンドを介するシグナルを受け(すなわち、シグナル変換細胞受容体として)、別の細胞上のカウンター受容体との細胞−細胞付着−型相互作用を介してシグナルを与える(すなわち、固定された細胞表面「リガンド」として)メカニズムを支持する。
【0168】
実施例5
細胞表面EMMPRINは、HIV−1コアを担持するMuLV−偽型レトロウイルスによるCHO細胞の細胞感染の組み込み前工程に対する実質的な増強効果を有した。
該実施例は、CHO細胞において、EMMPRINがHIV感染に関与することを示すイン・ビトロ実験およびアッセイを提供する。特に、本発明の具体例によると、細胞表面EMMPRINの存在は、HIV−1コアを有するMuLV−偽型レトロウイルスによる細胞感染の組み込み前工程に対して実質的な増強効果を有した(図6)。
【0169】
方法 CHO細胞系統
HIV−1感染におけるEMMPRINの役割を調べるためのDNAトランスフェクション実験において、EMMPRINを発現しないCHO細胞が最初に使用された。これは、試験された全ての潜在的にHIV−1感受性のヒト細胞(初代T細胞およびマクロファージ、Tリンパ球および単核細胞HOS、293TおよびHeLa細胞系統)がすでに比較的高レベルのEMMPRINを発現していたからである。いくつかのCHO−EMMクローンが、ブライアン・トゥール博士(Tufts University, Boston, MA)によって提供され、高レベルのEMMPRINを発現していたEMMPRIN−トランスフェクトCHO細胞から選択された(実施例2参照)。対照(pcDNA−トランスフェクト)CHO細胞においてEMMPRINは検出されなかった。
【0170】
CHO細胞のトランスフェクション
75ccフラスコ中80%集密度まで増殖させたCHO細胞を、Fugene(Boehringer Mannheim)を用い、製造者によって提供されたプロトコールにしたがって、10μgのCD4またはCXCR4発現ベクター(各々、pBABE−T4およびpBABE−CXCR4)でトランスフェクトした。トランスフェクション効率は、フローサイトメトリック分析によって明らかにしたところ、典型的に15−20%であった。
【0171】
抗体
抗−CD147mAb(UM−8D6)は、Ancell Immunology Research Products(Bayport, MN)から得、イソ型に合致した(IgG1κ)対照mAbはBD PharMingen (San Diego, CA) から得た。抗−CD4mAbは、Beckton Dickinson (Parsippany, NJ) から得た。
【0172】
ルシフェラーゼを発現している偽型HIV−1変種での感染
Env−偽型ルシフェラーゼ発現HIV−1組換え体を用いる単一サイクルアッセイを本質的に以前の記載(Connorら、J. Exp. Med. 185: 621−628, 1997; Dragicら、Nature 381: 667−673, 1996)どおりに行った。簡単に言うと、偽型ルシフェラーゼレポーターウイルスを、外被欠損NL4−3構築物を発現しているプラスミドおよびX4株HxB2または両栄養性ネズミ白血病ウイルス(MuLV)のいずれか由来のウイルス性外被を発現しているプラスミドでの293T細胞の同時トランスフェクションによって生産した。培養4日後に、偽型ウイルスで感染された細胞(106細胞あたり5ngのp24)をレポーター溶解バッファー(Promega)を用いて溶解し、Dynex MLXミクロプレートルミノメーターを用いて、相対光単位においてルシフェラーゼ活性を測定した。
【0173】
EMMPRINは、MuLV偽型HIVによるCHO細胞感染を増強した。
EMMPRINがHIV感染を増強するかどうかを決定するために、ネズミ白血病ウイルス(MuLV)の両栄養性外被を有する偽型の組換えルシフェラーゼ発現性HIV−1でのCHO−EMMまたは対照CHO細胞の感染のルシフェラーゼ活性分析を行った。
CHO−EMMまたは対照(pcDNA−トランスフェクト)CHO細胞の三連培養を50μg/mlの抗−CD147(すなわち、抗−EMMPRIN)mAbまたはイソ型に合致した対照mAbの存在または不在下、MuLV由来のEnvを有する偽型のルシフェラーゼ発現性HIV−1(Luc−HIV−1)で感染させた。37℃で1時間感染させる前に、ヘパリナーゼIII(3x10−4IU/ml)を細胞に加えた。ルシフェラーゼ発現を感染の4日後に測定し、100%とされる対照(CHO−pcDNA細胞)に相対的な発現のパーセンテージとして表す。
細胞表面EMMPRINは、CHO細胞においてルシフェラーゼ発現を5−ないし6−倍増加した(図6、左側のパネル)。さらに、該増加は、抗−CD147mAbが感染の間に加えられた場合、大きく減少した(図6、左側のパネル、第三の垂直バー)。
【0174】
EMMPRINはHIV−1偽型HIVによるCHO細胞感染を増強した。
EMMPRINがHIV−1外被を有する偽型のウイルスの複製を増強するかどうかを決定するために、CHO−EMMまたは対照CHO細胞をCD4−およびCXCR4−発現ベクターで一過性トランスフェクトし、次いで、LAV外被を有する偽型のルシフェラーゼ発現性HIV−1構築物で感染させた。
CHOまたはCHO−EMM細胞の三連培養をCD−4発現性pBABE−T4およびCXCR4−発現性pBABE−CXCR4で一過性トランスフェクトし、侵入のためにCD4およびCXCR4に依存するHIV−1LAV由来のEnvを有する偽型のLuc−HIV−1で感染させた。ルシフェラーゼ発現を上記のように検出し、100%とされる対照細胞(CHO/CD4/CXCR4)に相対的な発現のパーセンテージとして表す。
MuLV外被を用いる上記の結果と同様に、ルシフェラーゼ発現における3−ないし4−倍の増加が、EMMPRINを発現している細胞において観察された(図6、中央のパネル)。
【0175】
EMMPRINはウイルス組み込み前段階でHIV感染を増強した。
EMMPRINのHIV感染に対する増強効果がプロウイルスDNAの組み込み前の段階で発現するかどうかを決定するために、感染CHO細胞中、抗−CD147mAbの存在下または不在下でHIV−1逆転写量を測定した。
CHOおよびCHO−EMM細胞の2連培養をCD4−およびCXCR4−発現ベクターで一過性トランスフェクトし、次いで、抗−CD147mAb(UM−8D6)またはイソ型に合致した対照抗体の存在下、EnvMuLVまたはEnvLAVのいずれかを有する偽型のluc−HIV−1で感染させた。感染の2時間後、LTR R/U5プライマー(配列番号2)(配列番号3)、および初期逆転写産物に特異的なプローブ(配列番号4)(Schmidtmayerovaら、J. Virol. 72: 4633−4642, 1998)を用いて、ウイルスDNAをPCRによって分析した。結果をダイレクトイメージャー(Direct Imager)(Packard)で定量化し、100%とされる対照細胞(イソ型処理したCHO/CD4/CXCR4)に相対的なLTR/gag−特異的シグナルに関連する放射能として表した。
【0176】
EnvMuLV−およびEnvLAV−偽型ウイルスでの感染後のLTR R/U5逆転写産物の量は、CHO/CD4/CXCR4細胞と比べたCHO−EMM/CD4/CXCR4細胞において3−ないし4−倍に増加した(図6、右側パネル)。さらに、ルシフェラーゼ発現に対する上記の抗−CD147mAb(UM−8D6)効果と一致して、抗−CD147mAb(UM−8D6)は、CD147の該増強効果を減少させた(図6、右側のパネル、各シリーズにおける最後の垂直バー)。抗−CD147mAb(UM−8D6)によるCD147活性の不完全な抑制の理由は、おそらく、CHO−EMM細胞における高レベルのEMMPRIN発現および/またはウイルス付随CyPAと比べた該抗体によって認識されるEMMPRINエピトープにおける差に起因した。
【0177】
したがって、EMMPRINは、HIV−1コアを有するレトロウイルスによる細胞感染の組み込み前工程に対する増強効果を有した。有意には、該効果は、偽型化に使用されたEnvの同一性に依存しなかった。したがって、HIV−1感染の増強におけるEMMPRINの活性は、侵入に用いられる受容体の性質に依存しないようである。かかる受容体独立性作用様式は、CyPAの活性に似ており、それは、ヘパランとの相互作用を介して偽型HIV−1コア含有ウイルスの付着の媒介となることが報告されている(Saphireら、EMBO J. 18:6771−6785, 1999)。しかしながら、ヘパランは、ルシフェラーゼ発現EnvMuLV−偽型HIV−1の複製に対するEMMPRINの増強効果に必要とされない。HIV−1付着を有意に減少させたCHO−EMM細胞のヘパリナーゼIIIでの処理(図7B)は、EMMPRIN−媒介性ルシフェラーゼ活性を減少させなかった(図6、左側パネル)。
したがって、本発明のデータは、ヘパラン(潜在的にgp120−媒介性付着に関与する(Mondorら、J. Virol. 72: 3623−3634, 1998))がウイルス組み込み前のHIV−1感染工程に対するEMMPRIN−媒介性増強効果に寄与しないメカニズムと一致する。
【0178】
実施例6
細胞表面EMMPRINは、初代ヒトPBMCのHIV−1感染の融合後の組み込み前工程に対する実質的な増強効果を有した。
該実施例は、EMMPRINがヒト初代末梢血単核細胞(PBMC)のHIV感染に関与することを示すイン・ビトロ実験およびアッセイを提供する。特に、PBMC上の細胞表面EMMPRINの存在は、T細胞適応性またはマクロファージ栄養性HIV−1株による、またはHIV−1コアを有する偽型レトロウイルスによる細胞感染の融合後の組み込み前工程に対する実質的な増強効果を有した(図7A−E)。
【0179】
方法 末梢血単核細胞(PBMC)の調製および感染
ヒト初代末梢血単核細胞(PBMC)は、標準的なFicoll−Hypaque勾配遠心分離法を用いて、全血から得られた。PHA(5μg/ml)を用いて2日間、細胞を活性化し、次いで、種々の濃度の抗−CD147mAb(UM−8D6)またはイソ型に合致した対照mAbの存在下、HIV−1LAVまたはHIV−1ADA(1x106細胞あたり5x103cpmのRT活性)で感染させた。ウイルス複製は、培養上清中のRT活性を測定することによってアッセイされた。
【0180】
ルシフェラーゼ発現性偽型HIV−1変種での感染
偽型Luc−HIV−1株の調製およびその感染は、外被がLAVまたはADA株のいずれか由来であることを除き、上記実施例5に記載のとおりに行った。
【0181】
ウイルス付着アッセイ
PHA−活性化PBMCを37℃で2時間、抗−CD147mAb(UM−8D6;50μg/ml)、抗−CD4mAb(5μg/ml)またはヘパリナーゼIII(3x10−4IU/ml)と一緒にインキュベートし、次いで、洗浄し、HIV−1LAV(10ng/mlのp24)と一緒に4℃で1時間インキュベートした。4℃でHIV−1LAVを用いる1時間のインキュベーション期間に、ヘパリナーゼではなく抗体が存在した。細胞の広範囲な洗浄後、細胞結合したウイルス性p24の量をELISAによってアッセイした。
【0182】
融合アッセイ 細胞−細胞融合
HIV−1 Env−媒介性細胞融合は、比色融合技術(Alkhatibら、J. Virol. 70: 5487−5494, 1996)を用いてアッセイした。簡単に言うと、初代PHA−活性化PBMCをT7 RNAポリメラーゼを発現しているワクシニアウイルス(vTF7−3,Fuerstら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 8122−8126, 1986)で感染させ、抗−CD147mAb(UM−8D6)またはイソ型に合致した対照mAbの存在下で2.5時間、HIV−1Env(X4 EnvLAVを発現するためのvCB−41、およびR5 EnvBa−Lを発現するためのvCB−43;Broder & Berger, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 9004−9008, 1995)およびT7プロモーターに連結されたイー・コリlacZ遺伝子(vCB−21R−lacZ,Alkhatibら、J. Virol. 70: 5487−5494, 1996)を発現しているワクシニアウイルスに同時感染させたHeLa細胞を5:1の比率で用いて同時インキュベートして細胞融合させた。細胞融合を評価するために、β−Gal活性を測定する標準的な比色アッセイを洗剤性細胞溶解液と共に用いた。得られた結果は、正の対照(非抗体処理、100%とする)に相対的なβ−Gal活性として表し、同じドナー由来の細胞を用いる3つの独立した測定値の平均±SDとして下記に示した。
【0183】
ウイルス−細胞融合
ウイルス−細胞融合の分析のために、PHA−活性化PBMCをHIV−1LAVと一緒に37℃で2時間、所定の抗体の存在下または不在下(すなわち、「対照」)でインキュベートした。細胞をトリプシン(0.025%、37℃で30分)で処理し、溶解し、溶解液中、ELISAによって細胞内に取り込まれたウイルス性p24を測定した。細胞を4℃にて抗体を用いずにウイルスと一緒にインキュベートし、次いで、トリプシンの存在下37℃に移すことによって、該アッセイのバックグラウンド(すなわち、4℃「対照」)を決定した。該値は、トリプシンの存在下でどうにか細胞に侵入することのできるウイルスの量を反映する。
【0184】
PCRによるHIV−1特異的DNAの検出(逆転写酵素アッセイ)
PHA−活性化ヒトPBMCを、HIV−1感染の2時間前に、抗−CD147mAb(UM−8D6;50μg/ml)、抗−CD4mAb(2μg/ml)または対応するイソ型に合致した対照mAb(50μg/ml)で処理した。次いで、PBMCのHIV−1LAVでの感染の2時間後に所定のプライマーを用い、本質的にSchmidtmayerovaら、J. Virol. 72: 4633−4642, 1998に記載の通りに、HIV−1逆転写の分析を行った。
【0185】
簡単に言うと、細胞をプロテイナーゼKを含有する標準PCRバッファー中に溶解した。プロテイナーゼKは熱不活性化され、25μlアリコートを、0.2μMオリゴヌクレオチドプライマー、200μMの各デオキシヌクレオチド、50mM KCl、10mM Tris(pH8.3)、2mM MgCl2および1.25UのTaqポリメラーゼ(Perkin−Elmer)を含有する全量50μlの35サイクルのPCRに付した。各サイクルは、94℃の変性工程30秒、アニーリング工程(プライマーの各ペアにつきTm−5℃)30秒および72℃の伸長工程1分より構成された。アガロースゲル電気泳動後、増幅されたDNAを、[32P]−標識プローブを用いるサザンブロットハイブリダイゼーションによって分析した。次いで、インスタント・イメージャー(Packard)を用いて正しいサイズの増幅フラグメントを定量し、抗体非処理対照(100%とする)と比較した抗体処理におけるカウントのパーセンテージとして表した。下記のプライマーおよびプローブを用いた:LTR R/U5、センスプライマー(5’−GGCTAACTAGGGAACCCACTG−3’)[配列番号6]、アンチセンスプライマー(5’−CTGCTAGAGATTTTCCACACTGAC−3’)[配列番号7]、およびプローブ(5’−TGTGTGCCCGTCTGTTGTGTG−3’)[配列番号8];LTR/gagプライマー、センスプライマー(5’−CAGATATCCACTGACCTTTGG−3’)[配列番号9]、アンチセンスプライマー(5’−GCTTAATACTGACGCTCTCGCA−3’)[配列番号10]、およびプローブ(5’−GAGGCTTAAGCAGTGGGTTC−3’)[配列番号11](Schmidtmayerovaら、上掲参照)。
【0186】
細胞分画およびウェスタンブロット分析
いくつかの修飾を伴う以前に公表されたプロトコール(Bukrinskayaら、J. Exp. Med. 188: 2113−2125, 1998)を用いて、HIV−1LAIに感染させたMT−4細胞の細胞画分を調製した。簡単に言うと、細胞をペレット化し、低張性バッファー(10mM HEPES、pH6.9、10mM KCl、0.1mM PMSFおよび1μg/mlアプロチニン)中、氷上で15分間インキュベートした。次いで、細胞をDounceホモジェネーションによって崩壊させ、核を1,500xgで5分間ペレット化し、捨てた。上清画分を除去し、18,000xgで45分間遠心分離した。この第2の遠心分離由来の上清を保存し、本明細書においてこれを「サイトソル」画分という。細胞骨格および膜画分を含有する第2遠心分離由来のペレットを、1%n−オクチル−β−D−グリコピラノシドを補足したNTENTバッファー(150mM NaCl、10mM Tris−HCl、pH7.2、1mM EDTA、1%Triton X−100、0.1mM PMSFおよび1μg/mlアプロチニン)中に再懸濁し、18,000xgで30分間遠心分離した。この第3の遠心分離由来の上清を保存し、本明細書においてこれを「膜」画分といい、一方、対応するペレットは「細胞骨格」画分を示す。2x106細胞/レーンの等価物由来の細胞画分を12%SDS−PAGE上で分画し、MA、CA(どちらもABI由来)およびアクチン(Sigma)に対するモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロットアッセイによって分析した。
【0187】
抗−EMMPRIN mAbは、ヒト初代PBMCにおけるHIV−1株の複製を阻害した。
抗−CD147(すなわち、抗−EMMPRIN)mAb(UM−8D6)を用いて、初代ヒトPBMCにおけるEMMPRIN活性のメカニズムをさらに研究した(図7A)。
PHA−活性化PBMCの三連培養にT細胞系統−適応性X4 HIV−1LAV株またはマクロファージ−栄養性R5HIV−1ADA株のいずれか(図7A、左パネル)、またはLAVまたはADA株のいずれか由来の外被を有する偽型のルシフェラーゼ−発現性組換えHIV−1(図7A、右パネル)を感染させた。所定量の抗−CD147mAb(UM−8D6)(右パネルにおける実験に50μg/mlが使用された)またはイソ型に合致した対照mAb(全対照試料において50μg/ml)を感染の30分前に加え、実験期間中存在した。ウイルス複製は、21日目の培養上清中のRT活性によって(図7A、左パネル)、または感染後4日目のルシフェラーゼ活性によって(右パネル)評価された。結果は、対照(イソ型に合致した無関係のmAbで処理された細胞;100%とする)に相対的なRTのパーセンテージ(LTR R/U5プライマー(配列番号6)および(配列番号7)、およびプローブ(配列番号8)を用いる)またはルシフェラーゼ活性として示される。
イソ型に合致した対照mAbではなく、抗−CD147mAb(UM−8D6)が、初代PBMCにおいてマクロファージ−栄養性(ADA)およびT細胞系統−適応性(LAV)HIV−1株の複製を阻害した(図7A、左パネル)。同様の結果が、ADAまたはLAV外被を有する偽型の組換えルシフェラーゼ−発現ウイルスを用いて観察された(図7A、右パネル)。
【0188】
抗−CD147mAb(UM−8D6)は、ヒトPBMCへのHIV付着を阻害しなかった。
HIV−1複製の異なる初期工程(例えば、ウイルス付着、融合、脱外被など)に対する抗−CD147mAb(UM−8D6)の効果を分析して、HIV感染に対するその阻害活性のメカニズムを定義付けた(図7B)。
【0189】
ウイルス付着工程は、ウイルス粒子を細胞と一緒に4℃でインキュベートし、次いで、細胞に結合したウイルス性p24の量を測定することによって分析された。詳細には、上記の該実施例の「方法」に記載のように、三連PBMC培養を37℃で抗−CD147mAb(UM−8D6;50μg/ml)、抗−CD4(5μg/ml)mAbまたはヘパリナーゼIII(3x10−4IU/ml)で前処理し、次いで洗浄し、HIV−1LAV(10ng/mlのp24)と一緒に4℃で1時間インキュベートした。細胞に結合したp24の量をELISAによってアッセイし、結果を異なるドナー由来の細胞を用いて行った三つの実験のうち1つの代表的実験について示す。
【0190】
有意には、抗−CD147mAb(UM−8D6)は、ヒトPBMCへのHIV−1LAV付着を阻害しなかったが、抗−CD4mAbはそれを有意に減少した(図7B)。予測どおり、HIV−1LAV付着はまた、HIV−1付着におけるヘパランの仮定された役割と一致して(Saphireら、EMBO J. 18:6771−6785, 1999(宿主CyPAは、ヘパランを介して標的細胞へのHIV−1付着の媒介となる);Mondorら、J. Virol. 72: 3623−3634, 1998(HeLa CD4+細胞へのHIV−1付着はCD4−独立性のgp120依存性であり、細胞表面ヘパランを必要とする)、ヘパリナーゼIIIでの細胞の前処理によって減少した。したがって、これらのデータは、抗−CD147mAb(UM−8D6)がウイルス付着と組み込みとの間のどこかの工程でHIV感染を阻害したことを示す。
【0191】
抗−CD147mAb(UM−8D6)は、PBMCとHIV−1 ADAおよびLAV外被を発現しているHeLa細胞との間のHIV Env−媒介性融合を阻害せず、また、ウイルス性p24の細胞インタナリゼーションも減少しなかった。
PBMCとHIV−1 ADAおよびLAV外被を発現しているHeLa細胞との間のHIV−1 Env−媒介性融合に対する抗−CD147mAb(UM−8D6)の効果を分析して、EMMPRINが複製のウイルス細胞融合工程に関与するかどうかを決定した(図7C、左パネル)。さらに、HIV−1感染に関連して、融合に対する抗−CD147mAb(UM−8D6)の効果を、トリプシン処理後のHIV−1LAV−接種したPBMCに結合したままであるウイルス性p24の量(すなわち、細胞内に取り込まれたp24に相当する)を測定することによって分析した(図7C、右パネル)。
【0192】
細胞−細胞融合
PBMCとHIV−1 Env(X4 LAVまたはR5 Ba−L)を発現しているHeLa細胞との間の融合を抗−CD147(UM−8D6;50μg/ml)または抗−CD4(5μg/ml)mAbの存在下、該実施例の「方法」において本明細書に上記されるようにβ−Gal発現によって評価した。T7 RNAポリメラーゼ発現性PBMCとT7プロモーターに連結されたイー・コリLacZ遺伝子のみを発現しているHeLa細胞との共培養において検出されたバックグラウンド活性を全ての値から引いた。抗−CD147mAb(UM−8D6)は、HIV−1 env−媒介性細胞−細胞融合を阻害しなかったが、予想通り、抗−CD4mAbは有意に細胞融合を減少させた(図7C、左パネル)。
【0193】
ウイルス−細胞融合
ウイルス−細胞融合の分析のために、上記の該実施例の「方法」に記載されるようにPBMCをHIV−1LAVと一緒にインキュベートした。抗−CD147mAb(UM−8D6)は、ウイルス性p24インターナリゼーションを阻害しなかったが、予想通り、抗−CD4mAbは細胞内に取り込まれたp24の量をバックグラウンドレベルまで減少させた(図7C、右パネル)。したがって、抗−CD147抗体は、ウイルス−細胞融合の結果としてトリプシン消化に対して耐性になったウイルス性蛋白質の量を減少しなかった。
したがって、図7C(両方のパネル)の合わせた結果は、HIV−1感染に対する抗−CD147mAbの阻害効果が融合後メカニズムによって媒介されることを示す。
【0194】
抗CD147mAb(UM−8D6)は初期および後期の両方のHIV−1逆転写の量を減少させた。
半定量的なPCR法を用いて、組み込み前の複合体(PIC)の進行性成熟を代表する融合後工程であるHIV−1特異的逆転写の量を分析した(図7D)。
PHA−活性化ヒトPBMCをHIV−1感染の2時間前に、抗−CD147mAb(UM−8D6;50μg/ml)または抗−CD4mAb(2μg/ml)、または対応するイソ型に合致した対照mAb(50μg/ml)のいずれかで処理した。次いで、「方法」に上記されるようなHIV−1LAVでのPBMCの感染の2時間後に、プライマーLTR R/U5(配列番号6)および(配列番号7)、および「ストロング−ストップ(strong−stop)」初期逆転写産物意特異的なプローブ(配列番号8)を用いて、HIV−1逆転写の分析を行った(Schmidtmayerovaら、J. Virol. 72: 4633−4642, 1998)。PCR結果をダイレクトイメージャー(Packard)上で定量化し、抗体非処理対照(100%とする)に相対的な処理試料中のカウントのパーセンテージとして示す。細胞あたり1個のHIV−1ゲノムを含有する8E5/LAI細胞の希釈(Folksら、J. Exp.Med. 164: 280−290, 1986)をPCR標準として用いた(図7D、左下パネル)。データは、2連で行った3つの独立した実験を示す。
【0195】
抗−CD147mAb(UM−8D6)は、「ストロング−ストップ」逆転写産物の量を約2倍減少させた(図7D、左上および右側のパネル)。この短いDNAフラグメントは、ウイルス侵入後すぐに生産され、その量は逆転写の開始を反映する(Zackら、Cell 61: 213−222, 1990)。予想通り、抗−CD4mAbは、ウイルス付着およびウイルス−細胞融合に対する該mAbの本明細書に記載した効果に一致して(図7Bおよび7C)、より一層LTR R/U5−増幅フラグメントの量を減少させた(図7D、左上および右側のパネル)。抗−CD147mAb(UM−8D6)の同様の効果が、後期逆転写産物を各々、増幅および検出するLTR/gagプライマー(配列番号9)および(配列番号10)ならびにプローブ(配列番号11)を用いて検出されたPCRフラグメントの量において観察された(Schmidtmayerovaら、J. Virol. 72: 4633−4642, 1998)。
【0196】
したがって、該具体例の結果は、図7A、7Bおよび7Cにおいて本明細書中に提示されるデータと共に、抗−CD147mAb(UM−8D6)がウイルス−細胞融合と逆転写の開始との間の工程を干渉したことを示す。かかる活性の1つの有望なメカニズムは、いずれかの特定の理論に限定されるものではなく、組み込み前の複合体(PIC)形成の阻害であり、それにより、CD147はHIV−1脱外被において役割を果たす。
【0197】
抗CD147mAb(UM−8D6)は、新たな感染後初期にHIV−1マトリックス(MA)およびキャプシド(CA)蛋白質の正常な移動を阻害し、それは、EMMPRINがHIV−1脱外被に関与したことを示す。
ウイルス「脱外被」はHIV感染後すぐに起こり、ウイルスマトリックス蛋白質(MA)および核蛋白質複合体からのウイルス性キャプシド蛋白質(CA)の解離を含む(Bukrinskyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6125−6129, 1993; Millerら、J. Virol. 71: 5382−5390, 1997)。詳細には、MAは膜から細胞骨格へ移動するが、CAはサイトソル中に保持される(Boukrinskayaら、J. Exp. Med. 188: 2113−2125, 1998)。蛋白質再配置の該パターンは、HIV−1逆転写複合体と細胞骨格の結合に相関し、PIC形成の初期工程における細胞骨格の関与を示唆する(Bukrinskayaら、j. Exp. Med. 188: 2113−2125, 1998)。
【0198】
新たな感染後初期のHIV−1マトリックス(MA)およびキャプシド(CA)蛋白質の細胞内分布は、EMMPRINが感染の間のHIV−1「脱外被」工程に関与したかどうかを決定するために研究された(図7E)。
MT−4細胞に4℃にて、抗−CD147mAb(UM−8D6;50μg/ml)またはイソ型に合致した対照mAbの存在下でHIV−1LAVを接種した。アリコート(1x106細胞)を蛋白質分析のために30分後に回収し(すなわち、0時間p.i.時点試料)(図7E、上方パネル)、一方、接種した培養物を37℃に移し、1.5時間インキュベートした(図7E、下方パネル)。細胞分画を該実施例の「方法」に上記したように行い、サイトソル(C)、膜(M)および細胞骨格(CS)画分中の蛋白質をアクチン、CAおよびMAに特異的なモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロッティングおよびECLによって分析した。
【0199】
得られたウイルスMAおよびCA蛋白質の細胞内分布は、抗−CD147mAbの不在下、本明細書に上記した先行文献におけるものと一致した。すなわち、感染の1.5時間後、ウイルスMAおよびCA蛋白質は、各々、膜(M)から細胞骨格(CS)およびサイトソル画分中へ特徴的な移動を行った(図7E、イソ型パネル、各々、レーン「CS」および「C」)。
しかしながら、かかる蛋白質移動は抗−CD147mAb(UM−8D6)で処理したMT−4細胞において観察されず、ここに、MAおよびCAの両方は細胞膜画分と結合したままであった(図7E、α−CD147パネル、レーン「MT」)。したがって、抗−CD147mAb(UM−8D6)の存在下、ウイルスは細胞膜に保持され、それは、EMMPRINが感染の間のHIV−1脱外被工程の調節に関与することを示す。
【0200】
実施例7
抗−CD147mAbの阻害効果に対するウイルス耐性はCsAに対する耐性と相関した。
該実施例は、抗−CD147mAbの阻害効果に対するHIV耐性がCsAに対する耐性に相関したことを示し、該抗体がウイルス感染におけるCyPA−依存性工程を干渉したことを示すイン・ビトロ実験およびアッセイを提供する。詳細には、ヒトPBMCにおけるA224E(CsA−耐性、CA変異HIV株)の複製は抗−CD147mAb(UM−8D6)での処理に対して耐性であった(図8)。
【0201】
方法 新たなHIV感染のための共培養プロトコール
293T細胞を同系野生型またはA224E CA変異体ウイルスの分子クローンでトランスフェクトし、CsA(1μM)の存在下または不在下で3日間培養した。トランスフェクション後3日目に細胞を洗浄し、CsAを用いずにさらに4日間培養するか、または抗−CD147mAb(UM−8D6;100μg/ml)の存在下または不在下でCsAを添加せずに(両方のウイルスの複製に影響を及ぼしたT細胞に対する該薬剤のウイルスに無関係な免疫抑制効果を回避するために)、PHA−活性化CD8+T細胞−欠乏PBMC(1個の293T細胞につき20個の血液単核細胞)との共培養に用いた。共培養の4日後、ウイルス複製を、実施例6の「方法」に上記したように、LTR U/5プライマー(配列番号6)および(配列番号7)ならびにプローブ(配列番号8)を用いて培養上清中の逆転写酵素(RT)活性によってアッセイした。
【0202】
ヒトPBMC中におけるA224E(CsA−耐性、CA変異HIV株)の複製は、抗−CD147mAbでの処理に対して耐性であった。
CsAはCyPAと相互作用し、それにより、イン・ビトロでGag(CA抗原部分)−CyPA相互作用を干渉し、シクロフィリンのビリオン中への組み込みを阻害し、細胞培養においてHIV−1の複製を阻害することが示された。上記した本明細書中の「背景」におけるまとめを参照のこと。これらのデータは、GagとCyPAの相互作用が感染性HIV−1ビリオンの形成に必要であるというモデルと一致する(Sherryら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 1758−1763, 1998)。したがって、CsA−耐性HIV株(例えば、CsA耐性、CyPA−依存特性を与えるCA変異を有する株)による感染は、CyPAに依存しないか、またはCyPA受容体アンタゴニストによって特異に影響を及ぼされていることが無理なく予測され得る。
【0203】
したがって、抗−CD147mAbの阻害効果がCsAに対する耐性と相関するかどうかを決定するために、CsA耐性を与えるCA変異を有するA224Eウイルス株による感染が分析された。かかる相関は、CD147抗体がウイルス感染におけるCyPA−依存工程を干渉する付加的な証拠であろう。
該実施例の「方法」において本明細書に上記したように、293T細胞をシクロスポリンA(1μM)の不在下(”C”)または存在下(”CsA”)、HIV−1NL4−3(WT)(図8、左パネル)または変異体A224E(図8、右パネル)ウイルスの分子クローンでトランスフェクトした。ウイルス生産性トランスフェクト細胞を洗浄し、CD8+T細胞欠損PBMCおよび抗−CD147mAb(UM−8D6;100μg/ml)を添加して(”293T+CD4+T細胞”)または添加せずに(”293T”)さらに4日間、4連で培養した。ウイルス複製は、「方法」において上記したように、培養上清中のRT活性を測定することによってアッセイした。結果を平均±SEとして示す。
【0204】
該系において生産されたウイルスの量は、トランスフェクトされた293T細胞から生産されたウイルスの蓄積よりもむしろT細胞の新規な感染の効力を反映する。抗−CD147mAb(UM−8D6)は、CsA−耐性A224Eウイルスの複製を阻害しなかったが、野生型ウイルスの複製は有意に減少された。CsA−処理した293T細胞から収集されたA224Eウイルスは、そのCsA−耐性表現型と一致して、非処理細胞から収集されたウイルスと同レベルまで複製したが(Braatenら、J. Virol. 70: 5170−5176, 1996)、CsAの存在下で収集された野生型ウイルスは有意に減弱された。
したがって、抗−CD147mAb(UM−8D6)の阻害効果に対するウイルス耐性はCsAに対する耐性と相関した。これらのデータは、該抗体がウイルス感染におけるCyPA−依存工程を干渉する付加的な証拠を提供する。
【0205】
実施例8
EMMPRINの膜貫通領域由来のペプチドは、HIV−1コアを有する偽型レトロウイルスによるCHO−EMM細胞およびヒトPBMCの感染を実質的に阻害した。
該実施例は、EMMPRIN蛋白質の膜貫通領域由来のペプチドがHIV−1感染を阻害することを示すイン・ビトロ実験およびアッセイを提供する。詳細には、EMMPRIN膜貫通ドメインのアミノ末端領域(配列番号2参照)に対応する8−アミノ酸ポリペプチド(配列番号3)が、各々、CHO−EMM細胞(図9)およびヒトPBMCのEnvMuLV−およびEnvADA−偽型luc−HIV−1ウイルスによる感染を阻害した。
【0206】
方法
CHO細胞系統、EnvMuLV−偽型luc−HIV−1変種でのCHO細胞の感染および1サイクルのルシフェラーゼアッセイは、実施例5の「方法」に上記したとおりであった。PHA−活性化ヒトPBMCの調製およびEnvADA−偽型luc−HIV−1での感染は、実施例5および6の「方法」に上記したとおりであった。PBMCルシフェラーゼアッセイは、CHO細胞系統のために記載したとおりに行った。
【0207】
ペプチド
ペプチド1(配列番号3)、2(配列番号4)およびスクランブルペプチド1(配列番号5)は、Research Genetics (Huntsville, Alabama)からカスタムポリペプチドとして得た。
【0208】
CD147の膜貫通領域由来のペプチドは、CHO−EMM細胞のMuLV−偽型HIV−1感染を阻害する。
EMMPRIN膜貫通ドメインは、EMMPRIN蛋白質配列(配列番号2)のアミノ酸204−228に対応する。本発明の新規なEMMPRIN/CyP相互作用を考慮して、EMMPRIN膜貫通領域内のサブ領域に対応するペプチドを調製して、それらがHIV−1感染を阻害することができるかを決定した。ペプチド1(LAALWPFL)は、EMMPRINのアミノ酸206−213に対応する8アミノ酸配列(配列番号3)である。ペプチド2(GIVAEVLVL)は、EMMPRINのアミノ酸214−222に対応する9アミノ酸ポリペプチド配列(配列番号4)である。「スクランブルペプチド1」(FAWPLLLA)、ランダム化した配列対照は、ペプチド1のアミノ酸残基のランダム化配列にしたがって作成された。
【0209】
CHOおよびCHO−EMM(”CHO.CD147”)細胞を上記のように、所定濃度のペプチド1、2またはスクランブルペプチド1の存在下、またはペプチドの不在下、MuLV外被を有する偽型の組換えルシフェラーゼ発現性HIV−1で感染させた。ルシフェラーゼ発現は、感染の4日後にルミノメーターを用いて測定された。
【0210】
図9は、CHO−EMM細胞のMuLV−偽型HIV−1感染が、濃度に依存してペプチド1(配列番号3)によって実質的および特異的に阻害されたことを示す。HIV−1感染は本質的に、1nMのペプチド1の存在下で阻害された。ペプチド2もスクランブルペプチド1も、該アッセイにおいてHIV−1感染を阻害しなかった。
【0211】
CD147の膜貫通領域由来のペプチドは、ヒトPBMCのHIV−1感染を阻害する。
PHA−活性化ヒトPBMC培養体を所定濃度のペプチド1、2またはスクランブルペプチド1の存在下、EnvADA−偽型luc−HIV−1で感染させた。CHO−EMM細胞のEnvMuLV−偽型HIV−1感染について上記したように、PBMCのEnvADA−偽型luc−HIV−1感染は本質的に1nMペプチド1の存在下で阻害された。ペプチド2もスクランブルペプチド1も、該アッセイにおいてEnvADA−偽型luc−HIV−1感染を阻害しなかった。
【0212】
EMMPRIN膜貫通ポリペプチドはCyP/EMMPRIN相互作用を拮抗する。
CHO−EMM細胞およびPBMCの各々、EnvMuLV−およびEnvADA−偽型luc−HIV−1による感染の阻害におけるペプチド1(配列番号3)の上記で同定された活性は、CyPA−被覆セファロースビーズによるEMMPRINの保持に関する上記実施例1に示したデータの解釈に関連する。実施例1において、EMMPRINとCyPAとの間の特異的イン・ビトロ結合相互作用は、全長EMMPRIN(ecd、tmおよびicdドメインを含有している)蛋白質でのみ観察され、tmおよびicdドメインを欠くEMMPRINでは観察されなかった。実施例1で述べたように、該結果は、セファロースビーズ上のCyPAに対するecd−CyP結合部位の適当な提示のためにEMMPRIN膜貫通および/または細胞内ドメインが必要であることを反映するか、またはCyPAが直接tmドメインと、ecdまたはtmドメインと、または両方のドメインと相互作用するメカニズムと一致した。
【0213】
いずれかの特定のメカニズムに拘束されることなく、EMMPRIN膜貫通ペプチド1によるHIV−1感染の上記で同定された阻害は、CyPが直接、EMMPRIN膜貫通ドメインの領域と相互作用し、ここに、該相互作用がCHO−EMM細胞およびPBMCの両方においてペプチド1(配列番号3)によって有効に拮抗されたCyP/EMMPRIN相互作用のためのメカニズムと一致する。
【0214】
要約:
CyP/EMMPRIN結合相互作用を修飾する薬剤は、HIV−1感染、AIDSおよびAIDS−関連障害、RAおよび癌のような局所的または全身性のCyP放出、合成または結合によって特徴付けられる症状の治療または予防に有用である。
【0215】
慢性関節リウマチ(RA)
本発明の実施例および具体例は、CyPが以前に知られた幅広く分布した細胞表面蛋白質、EMMPRINと相互作用し、特異的に該蛋白質に結合することを示す。有意には、EMMPRINは本発明の以前にはリガンドが知られておらず、単に、細胞−細胞相互作用の媒介となることのできる(すなわち、細胞−表面「リガンド」として作用することのできる)潜在的な接着分子であると考えられていた。
【0216】
さらに、本発明の実施例および具体例は、CyPが、その表面にEMMPRINを構造発現するCHO−EMM細胞においてシグナル変換を誘導することを明らかにする。該応答は、抗−EMMPRIN特異的抗体の添加によって阻害されたので、特異的であることが示された。さらに、チロシンキナーゼ阻害剤ゲニステインは、CHO−EMM細胞においてCyPにより誘導されるCa2+動員を完全に排除し、EMMPRIN−媒介性Ca2+動員が既知の細胞内シグナル変換経路を介して起こることを示した。
【0217】
さらに、培養したヒト初代肺繊維芽細胞のCyPでの処理は、プロMMP−1の放出を誘導し、プロMMP−3の生産を増強した。これら2つのマトリックスメタロプロテイナーゼは、RA患者の滑液および組織中でアップレギュレートされることが知られている(McCachren, Arthritis Rheum. 34: 1085−1093, 1991; Keyszerら、J. Rheumatol. 26: 251−258, 1991; Keyszeら、Z. Rheumatology 57: 392−398, 1998; Matsuyama, Pediatr. Int. 41: 239−245, 1999)。
【0218】
本発明の実施例および具体例は、CyPAが好中球に対し化学走性であり(Sherryら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3511−3515, 1992; Xuら、J. Biol. Chem. 267: 11968−11971, 1992; Leiva & Lyttle, Biochem. Biophys. Res. Commun. 186: 1178−1183, 1992)、CyPAが活性なRA疾患患者の関節において顕著にアップレギュレートされ、RA疾患の重篤度と相関する(Billichら、J. Exp. Med. 185:975−980, 1997)という本発明者らおよびその他による以前の証明を考慮して、CyPが、RA関節に存在する好中球および繊維芽細胞上に発現されているEMMPRINへの結合および該EMMPRINを介するシグナリングを介して、慢性関節リウマチに関連する病理のいくつかの媒介となることを示す。
【0219】
該相互作用を阻害することは、炎症を起こした関節中への好中球の浸潤を抑制し、滑膜中へ放出されるプロMMP−1およびプロMMP−3の量を減少させ、それにより、疾患関連病理を減少させ、最終的に患者に利益を提供するであろう。
【0220】
HIV−1感染および後天性免疫不全症候群(AIDS)
本発明の実施例および具体例はまた、付加的および新規な関係分子としてEMMPRINを提供し、かくして、HIV−1感染の間にウイルス性蛋白質および細胞性蛋白質間の複雑な相互作用における新規な治療的介入標的を提供する。詳細には、抗−CD147(すなわち、抗−EMMPRIN)mAb(UM−8D6)は、ウイルス−細胞融合後であって逆転写を支持する機能的組み込み前複合体(PIC)の形成前であるHIV−1複製における工程を阻害した。
【0221】
特定の理論に限定されることなく、本発明に一致した最も有望なメカニズムは、EMMPRINがウイルスの脱外被および逆転写を起こすことのできる細胞レベル以下のコンパートメント(すなわち、細胞骨格)中への移動を容易にすることである。有意には、抗−CD147(UM−8D6)は、CyPA−独立性感染を展示するCsA−耐性HIV−1変異体(CA蛋白質変異を有するA224E)の複製を阻害しなかったが、ウイルス感染におけるCyPA−依存性工程を干渉する。
よって、HIVウイルスは、その目的に全CyPA/EMMPRIN相互作用経路を徴用する。
【0222】
癌および結合組織疾患
本発明はまた、癌および多くの結合組織疾患の治療法を提供する。かかる有用性は、(1)EMMPRIN−発現性腫瘍細胞がそれと共培養された繊維芽細胞においてMMPsの発現をアップレギュレートすることを示されたという事実(Biswasら、Cancer Res. 55: 434−439, 1995)によって、(2)本明細書中に開示されたような、ヒト繊維芽細胞におけるCyPにより活性化および/または増強されるMMP生産によって、および(3)MMPsの脱調節された作用が、例えば、関節炎、歯周炎、組織潰瘍を包含する多くの結合組織疾患ならびに癌細胞侵入および転移において細胞外マトリックスの病理学上の崩壊に寄与する(Kahariら、Exp. Dermatol. 6: 199−213, 1997; Keyszerら、J. Rheumatol. 26: 251−258, 1999; Benbowら、J. Biol. Chem. 274:25371−25378, 1999; Keyszerら、Z. Rheumatology 57: 392−398, 1998)。
【図面の簡単な説明】
【図1A】図1Aは、本発明によって単離されたcDNAクローン(配列番号1)によってコードされるヒトEMMPRIN蛋白質の概略図を示す。
【図1B】図1Bは、[35S]−標識したEMMPRINがCyPAセファロースアフィニティー樹脂によって特異的に保持されたことを示す。
【図2】図2は、空のベクターで安定にトランスフェクトされたCHO細胞(CHO)またはEMMPRIN発現CHO細胞系統(CHO−EMM)におけるEMMPRIN発現のFACS分析を示す。
【図3】図3は、CHO(EMMPRIN発現なし)またはCHO−EMM細胞(安定な構造的EMMPRIN発現)におけるCa2+動員が外来的に加えられたCyPA(10μg/ml)によって誘導されたことを示す(左側のパネル)。
【図4】図4は、ゲニステイン(チロシンキナーゼ阻害剤)がCHO−EMM細胞においてCyPAにより誘導されるEMMPRIN媒介性Ca2+動員を完全に排除したことを示す。
【図5】図5は、WI−38ヒト初代肺繊維芽細胞におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)発現に対するCyPA処理の影響のウェスタンイムノブロット分析を示す。
【図6】図6は、ルシフェラーゼ(図6Aおよび図6B)およびHIV−1逆転写酵素活性(図6C)の分析を示す。
【図7A】図7Aは、抗−CD147mAbがヒト初代PBMCにおけるHIV−1複製を阻害したことを示す。
【図7B】図7Bは、抗−CD147mAbがヒトPBMCへのHIV付着を阻害しなかったことを示す。
【図7C】図7Cは、抗−CD147mAbが、PBMCとHIV−1 ADAおよびLAV外被を発現しているHeLa細胞との間のHIV Env媒介性融合を阻害せず、また、ウイルス性p24の細胞インターナリゼーションを減少させなかったことを示す。
【図7D】図7Dは、抗−CD147mAbがHIV−1逆転写量を減少させたことを示す。
【図7E】図7Eは、HIV−1蛋白質の細胞レベル以下の分布に対する抗−CD147mAbの影響を示す。
【図8】図8は、CsA耐性HIVウイルス株の複製が抗−CD147mAbによって阻害されなかったことを示す。
【図9】図9は、EMMPRIN膜貫通領域のアミノ末端由来の8アミノ酸ポリペプチド(配列番号3)がEnvMuLV偽型ルシフェラーゼ発現性HIV−1によるCHO−EMM細胞の感染を阻害したことを示す。左側のパネルは、CD147の概略構造(”sp”=シグナルペプチド、”e”=細胞外ドメイン、”t”=膜貫通ドメインおよび”c”=細胞質ドメイン)およびその膜貫通ドメイン由来の2つのペプチド(”ペプチド1”および”ペプチド2”)を示す。右側のパネルは、所定濃度のペプチド1、2および”スクランブルペプチド1”の存在下、組換えEnvMuLV−偽型ルシフェラーゼ発現性HIV−1で感染させたCHOおよびCHO−EMM細胞の感染後4日目のルシフェラーゼ発現データを示す。
(技術分野)
本発明は、シクロフィリン(CyP)およびヒト細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導蛋白質(EMMPRIN)間のリガンド/受容体関係のアンタゴニストを利用するHIV感染、後天性免疫不全症候群(AIDS)、慢性関節リウマチ(RA)、結合組織障害および癌の治療法を提供する。本発明は、さらに、CyP/EMMPRIN結合相互作用を修飾することによって治療活性を提供する抗−EMMPRIN抗体およびEMMPRINまたはEMMPRINペプチドの可溶性形態を提供する。本発明は、さらに、CyP/EMMPRIN結合相互作用を修飾する化合物の同定のためのスクリーニングアッセイを提供する。
【0002】
(背景技術)
本発明は、シクロフィリン、シクロフィリンの細胞受容体とのその同種相互作用およびシクロフィリン関連障害の治療に関する。例えば、シクロフィリンAは、とりわけ、(1)HIV感染由来の後天性免疫不全症候群(AIDS)に関連する症状および(2)炎症性疾患(例えば、慢性関節リウマチ)の病因に関与する。
【0003】
(1)後天性免疫不全症候群(AIDS)
ヒト免疫不全ウイルス(HIV)は、レトロウイルスのレンチウイルスファミリーのメンバーである(Teichら、RNA Tumor Viruses, Weissら、eds. CSH−Press, pp. 949−956, 1984)。HIVは、後天性免疫不全症候群(AIDS)と呼ばれる遅変性免疫系疾患の主要な原因として関係している(Barre−Sinoussiら、Science 220: 868−870, 1983; Galloら、Science 224: 500−503, 1984)。ヒトにおいて、HIV複製は、CD4+Tリンパ球およびマクロファージ集団において顕著に起こり、HIV感染はT細胞の涸渇を導き、結局、免疫不全、日和見感染、神経機能不全、新生物成長および最終的には死を導く。
HIVウイルス粒子のコアは、キャプシド抗原(CA)蛋白質をウイルスRNAゲノムおよび初期複製事象に必要な酵素と一緒に含む。ミリスチル化マトリックス抗原(MA)蛋白質は、ウイルスコアと感染された細胞膜由来の脂質膜外被との間の空間を埋める。HIV外被表面糖蛋白質は、ウイルス出芽の間に細胞性プロテアーゼによって2つの糖蛋白質、gp41およびgp120に切断される1つの160Kd前駆体蛋白質として合成される。ウイルス性gp41は膜貫通型糖タンパク質であり、gp120は、おそらく3量体または多量体形態において、gp41と非共有結合したままの細胞外糖蛋白質である(Hammarskjold & Redosh, Biochem. Biophys Acta 989: 269−280, 1989)。
【0004】
CD4はHIV−1ウイルスの細胞受容体として作用するので、HIVはCD4+宿主細胞を標的とする(Dalgleshら、Nature 312: 763−767, 1984; Klatzmannら、Nature 312: 767−768, 1984; Maddonら、Cell 47: 333−348, 1986)。細胞中へのウイルス侵入は、gp120が細胞のCD4受容体分子に結合することに依存し(McDougalら、Science 231: 382−385, 1986; Maddonら、Cell 47: 333−348, 1986)、gp120はHIVのCD4+細胞に対する親和性を明らかにし、一方、gp41はウイルス膜中の外被糖蛋白質複合体を固定する。これらのウイルス:細胞相互作用は感染に必要であるが、付加的なウイルス:細胞相互作用もまた必要とされるという証拠がある。
HIV感染は世界的に流行しており、HIV関連疾患は主要な世界的な健康問題の代表である。不運にも、HIV感染および/またはAIDSに対する最終的に病気に効く抗レトロウイルス薬またはワクチンは存在しない。かかる薬剤およびワクチンを開発する試みは、HIV生活環の種々の段階に対応する分子を標的としてきた(例えば、逆転写酵素、後期ウイルス性プロテアーゼ、およびワクチンの場合、gp160、gp120およびgp41)。また、HIV感染の最も初期の段階である細胞中へのウイルスの侵入を阻害できる薬剤を開発するための試みもなされている。この点で、治療的介入の焦点がHIVの認識された細胞表面受容体であるCD4およびCCR5に向けられた。例えば、組換え型可溶性CD4は、いくつかのHIV−1株によるCD4+T細胞の感染を阻害することが示された(Smithら、Sicience 238: 1704−1707, 1987)。しかしながら、ある種の初代HIV−1単離株は、組換え型CD4による阻害に対し比較的感受性ではない(Daarら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6574−6579, 1990)。さらに、組換え型可溶性CD4の臨床試験は結論に達しない結果をもたらした(Schooleyら、Ann. Int. Med. 112:247−253, 1990; Kahnら、Ann. Int. Med. 112:254−261, 1990; Yarchoanら、Proc. Vth Int. Conf. on AIDS, p.564, MCP 137, 1989)。
したがって、たとえ、かなりの努力が抗レトロウイルス薬およびワクチンの設計および試験に向けられていても、効果的で非毒性の治療に対する当該分野における要望がある。
【0005】
AIDSに対する新規な治療的介入の標的;シクロフィリンA
シクロフィリンA(本明細書では以後、「CyPA」という)は、幅広い種類の細胞において発現される19KD蛋白質である。CyPAは免疫抑制剤シクロスポリンA(以後、「CsA」という)に結合し(Etzkornら、Current Biology 3; 929−933, 1993; Liu, Immunol. Today. 14: 290−295, 1993(Immunol. Today 14(8):399, 1993に正誤表が発表された)、ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼ(PPIase)活性および蛋白質折りたたみまたは「シャペロン」活性を有する(Galat, Eur. J. Biochem. 216:689−707, 1993; Kofronら、Biochemistry. 30:6127−6134, 1991 (Bichemistry 30(44):10818, 1991において正誤表が発表された)。CyPAは、免疫の調節に関与する関連細胞因子の1群である「イムノフィリンファミリー」のメンバーである(Galat, Eur. J. Biochem. 216−689−707, 1993; Frumanら、FASEB. J. 8:391−400, 1994)。少なくとも4つの型の哺乳類シクロフィリンがクローン化されている(CyPA、CyPB、CyPCおよびhCyP3)(Friedmanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6815−6819, 1993)。
【0006】
CyPAは、移植片拒絶の予防において幅広く使用される強力な免疫抑制剤であるCsAに対する宿主細胞受容体の1つであると認識される。CsAは、強力な免疫抑制、抗寄生虫、殺真菌および慢性抗炎症特性を示す疎水性環状ウンデカペプチドのファミリーのメンバーである。CsAは、T細胞活性化における初期段階を阻害することによってその免疫抑制効果を発揮すると考えられる。CsAは、T細胞増殖因子インターロイキン2(IL−2)のRNA転写を阻害し、前駆体細胞融解性Tリンパ球によるIL−2受容体の発現を阻害することが見出された(Palacios, J. Immunol. 128: 337, 1982)。CyPAは、免疫抑制を顕在化するのに必要なレベルと一致した値である10−8モル/Lの範囲の解離定数でCsAに結合する(Handschumacherら、Science 226:544, 1984)。
【0007】
CyPAとHIVビリオンのGag蛋白質、詳細にはそのキャプシド抗原部分との機能的結合が同定された(lubanら、Cell, 1993)。CyPAは特異的にHIV−1ビリオン中に組み込まれ、Gag−シクロフィリン相互作用の崩壊がCyPAのビリオン中への組み込みおよびHIV−1複製の両方を妨げることが報告された(Frankeら、Nature 372:359−362, 1995; Thaliら、Nature 372:363−365, 1994)。これらのデータは、GagとCyPAとの相互作用が感染性HIV−1ビリオンの形成に必要であるというモデル(Braatenら、J.Virol. 70: 3551−3561, 1996)と一致する。
【0008】
CsAは、イン・ビトロでGag−シクロフィリン相互作用を干渉し、シクロフィリンのビリオン中への組み込みを阻害し、細胞培養におけるHIV−1の複製を阻害することが示された(Frankeら、上掲;Thaliら、上掲;Billichら、J.Virol. 69:2451−2461, 1995)。CsAがHIV−1ウイルスと直接相互作用することは示されていない。CsAおよびその類似体がHIV生活環における2つの段階にて干渉すると仮定される。第1に、感染の確立の間にCyPAと相互作用することによる。ここに、CsA処理は、環状HIV DNAの形成およびプロウイルスDNAの宿主ゲノム中への組み込みによって測定した場合、感染細胞のゲノム中への組み込みの前にHIV感染を阻害する(Sherryら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 1758−1763, 1998)。第2に、ウイルス複製の後期にてCyPAと相互作用し、HIV−1粒子中へのCyPA組み込みを妨げることによって、ウイルスを非感受性にすることによる(Billichら、上掲)。したがって、研究活動は、抗HIV剤を開発するための試みにおいて、ウイルス性Gag蛋白質と細胞性CyPA蛋白質との間の相互作用を崩壊させることに集中している。
【0009】
上述の観察にもかかわらず、患者におけるHIV感染の治療としてのCsAの有用性は厳格に制限されている。第1に、CsAは強力な免疫抑制剤である。したがって、免疫系が損なわれるであろうHIV感染患者におけるその使用は禁忌である。さらに、CsAおよびその類似体のHIV阻害効果は、CsAを用いて免疫抑制を実現するのに必要な量よりも10〜100倍高い薬物濃度を必要とする。やや逆説的には、シクロスポリンの一般的に全身性免疫系を抑制する能力は、HIV感染の治療として提案されている(米国特許第4814323号参照)。しかしながら、激しく免疫抑制された状態のHIV感染患者では、該治療法はひどい不利益を有する。
【0010】
したがって、当該分野において、新規なCyPA関連性介入標的および結合剤を同定し、特徴付けること、およびHIV感染の治療および予防のための新規な化合物および方法を同定するためのそれらの使用に対する要望がある。当該分野において、CyPAが特異的に細胞と相互作用してHIV感染の媒介となる手段を同定および機構的に理解すること、およびかかるメカニズムの治療上の使用方法または新規な治療剤を見出すこと、または新規かつ有用な診断的および予後的アッセイを提供することに対する要望がある。
【0011】
(2)慢性関節リウマチ
慢性関節リウマチ(以後、RAという)は、関節の慢性炎症性疾患である。RAは、相当な罹病率、機能的無能力および高い死亡率を伴う(Harris, N. Engl. J. Med. 322:1277−1289, 1990 (N. Engl. J. Med. 323:996, 1990に正誤表が発表された;コメント参照))。米国において概算で2−4百万ケースのRAがあり、そのピークの発病率は35歳〜45歳である(Brooks, 上掲)。RAの病因は知られていない。
【0012】
T細胞依存性メカニズムによって開始すると考えられる持続性炎症性滑膜炎は、代表的なRAの1つであり、通常、対称性多発関節炎として周囲の関節に影響を及ぼす(Brooks,上掲)。該炎症性滑膜炎は、(a)酸素ラジカルおよび蛋白質分解酵素を放出する好中球を浸潤させ、(b)好中球プロテアーゼによって自体活性化されるマトリックスメタロプロテイナーゼのプロ酵素形態を放出し、次いで軟骨崩壊を引き起こす内在性繊維芽細胞様滑膜細胞によって、悪化すると考えられている。したがって、滑膜炎症は軟骨崩壊および骨腐食、次いで関節変形をもたらす(Zvaifler & Firestein, Arthritis Rheum. 37: 783−789, 1994; Sewell & Trentham, Lancet 341: 283−286, 1993)。
【0013】
T細胞関与
RAの開始および永久化におけるT細胞の役割について強力な証拠が蓄積しているが、他の細胞型(例えば、樹状細胞、繊維芽細胞様滑膜細胞、および初代B細胞)は特徴的な進行性の関節崩壊に寄与している(Thomasら、J. Leukoc. Biol. 66: 286−292, 1999; McCachren, Arthritis Rheum. 34: 1085−1093, 1991; Zvaifler & Firestein, 上掲)。相当な証拠が好中球および好中球生産物が関節崩壊に関与することを示す(Edwards & Hallett, Immunol. Today 18:320−324, 1997; Harris, 上掲;Kakimotoら、Cell Immunol. 165: 26−32, 1995; Janusz & Durham, Inflamm. Res. 46:503−508, 1997; Griffithsら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:517−521, 1995)。
【0014】
したがって、慢性関節リウマチは、複数の細胞型が関与する複雑な進行性の疾患である。RA患者における治療的介入戦略は、第1に、該疾患の発病および進行を阻害することに向けられており、第2に、関節の損傷および傷害の媒介となる局所的な関節炎症を阻害することに向けられている(Harris, N. Engl. J. Med. 322: 1277−1289, 1990 (N. Engl. J. Med. 323:996, 1990に正誤表が発表された;コメント参照),Brooks, Lancet 341:286−290, 1993)。
【0015】
RAにおける滑液の過形成に対する刺激は、古典的には、免疫媒介性炎症過程として記載されてきた(Zvaifler & Firestein, Arthritis Rheum. 37: 783−7899, 1994)。かかる炎症は、RA滑膜の内膜下浸潤物中における有力な細胞である活性化したCD4+細胞によって生成される因子に対する応答であると考えられる(Zvaifler & Firestein, Arthritis Rheum. 37: 783−7899, 1994; McCachren, Arthritis Rheum. 34: 1085−1093, 1991)。さらに、特異的クラスII MHC多形がRAに対する危険性を与えるという観察は、T細胞がRAの発達において中枢的な役割を果たすことを強く示唆する(Gregersenら、Am. J. Med. 85: 17−19. 1988; Winchesterら、Rheum. Dis. Clin. North Am. 18:761−783, 1992)。
【0016】
T細胞がRAの病因の肝要な役割を果たすという事実は、RA患者における治療薬としてのシクロフィリンA(以後、「CsA」という)の使用をもたらした(Yocum, Semin. Arthritis Rheum. 29: 27−35, 1999; Brooks, Lancet 341: 286−290, 1993; de Wynterら、Stem. Cells 16: 349−356, 1998)。CsAは、シクロフィリンの細胞内貯蔵への結合を介して作用すると推定される強力な免疫抑制剤である(Erlanger, Immunol. Today. 13: 487−490, 1992; Liu, Immunol. Today 14: 290−295, 1993 (Immunol. Today 14(8):399, 1993に正誤表が発表された(コメント参照))。
【0017】
RAにおける非T細胞因子;好中球およびマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMPs)
2つの主張が、RA関連病理において、T細胞のほかに他の因子の決定的な関与を示す。第1に、T細胞産物がRA滑液または抽出物中で明らかにされなかった(Edwards & Hallett, Immunol. Today 18:320−324, 1997)。第2に、T細胞媒介性免疫応答の修飾に基づく現行の戦略は効き目がなく、深刻な毒性を伴う可能性がある。さらに、特に、該疾患がいったん確立されたならば(すなわち、およそ1年目以降に)、かかるT細胞に基づく戦略が骨および軟骨破壊の進行を制限できるという証拠がない(Zvaifler & Firestein, Arthritis Rheum. 37: 783−789, 1994; Yocum, Semin. Arthritis Rheum. 29:27−35, 1999)。
【0018】
好中球
RAは、滑液中の大量の好中球の蓄積によって特徴付けられる。C5a、ロイコトリエンB4、血小板活性化因子(PAF)およびIL−8のような化学誘引物質(Harris, N. Engl. J. Med. 322: 1277−1289, 1990 (N. Engl. J. Med. 323: 996, 1990に正誤表が発表された;コメント参照); Edwards & Hallett, Immunol. Today 18: 320−324, 1997; Premack & Schall, Nature Med. 2: 1174−1178, 1996)は、特徴的な好中球流入の顕在化において役割を果たすと考えられる。好中球は、おそらく細胞破壊物および免疫複合体の食作用によって、滑液内で活性化し、その結果、脱顆粒およびプロテイナーゼおよび反応性オキシダントの放出をもたらす(Harris, N. Engl. J. Med. 322: 1277−1289, 1990 (N.Engl. J. Med. 323: 996, 1990に正誤表が発表された;コメント参照))。さらに、活性化された好中球は、RA滑液中で検出可能なサイトカインの多く:IL−1β、IL−8、IL−12、TNF−α、TGF−およびGRO−αを分泌する(Edwards & Hallett, Immunol. Today 18: 320−324, 1997)。好中球はまた、おそらく、破壊する関節中に酵素(例えば、エラスターゼ)を放出するので、組織破壊において中心的な役割を果たす(Swell & Trentham, Lancet 341: 283−286, 1993; Edwards & Hallett, Immunol. Today 18: 320−324, 1997)。したがって、特異的な阻害剤(例えば、MDL101、146およびONO−5046)を用いて好中球エラスターゼを阻害することは、関節炎動物モデルにおいて軟骨破壊の減少をもたらす(Janusz & Durham, Inflamm. Res. 46:503−508, 1997; Kakimotoら、Cell Immunol. 165: 26−32, 1995)。
【0019】
マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMPs)
マトリックスメタロプロテイナーゼ(以後、「MMPs」という)は、細胞外マトリックス成分を破壊することのできる構造的に関連する亜鉛メタロエンドペプチダーゼの群を含む(Nagaseら、Matrix Suppl. 1:237−244, 1992; Giambernardiら、Matrix Biol. 16: 483−496, 1998)。MMPsは、MMP活性が種々の細胞型において正確に調節される正常組織リモデリング過程において重要な有益な役割を果たす。MMP活性は、前駆体活性化(プロMMPからMMPへ)または内在性阻害剤、例えば、α2−マクログロブリンおよびメタロプロテイナーゼの組織阻害剤(TIMPs)による活性化された種の阻害のいずれかによって、細胞性遺伝子発現レベルにて調節されるだけでなく、蛋白質レベルでも調節される(Nagaseら、Matrix Suppl. 1:237−244, 1992; Ogataら、J. Biol. Chem. 270:18506−18511, 1995; Zuckerら、J. Biol. Chem. 273: 1216−1222, 1998)。
しかしながら、MMPsの脱調節作用は、関節炎、歯周炎、組織潰瘍、ならびに癌細胞侵入および転移などの多くの結合組織疾患における細胞外マトリックスの病理学的破壊に寄与する(Kahariら、Exp. Dermatol. 6: 199−213, 1997; Keyszerら、J. Rheumatol. 26: 251−258, 1999; Benbowら、J. Biol. Chem. 274: 25371−25378, 1999; Keyszerら、Z. Rheumatology 57: 392−398, 1998)。
【0020】
RAの新規な治療的介入標的:シクロフィリン
RAにおける病理学的プロセスの正確な原因はまだ論争中である。典型的には、RAの治療は、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)および遅効性抗リューマチ薬(SAARD)の組み合わせを用いる多くの専門分野にわたるアプローチを含んでいた。かかる組み合わせ療法は、しばしば効果的であるが、重大な副作用をもたらす。例えば、NSAIDは関節炎症の重大な症状の軽減を提供するが、腎臓および胃に蓄積して、胃腸の不快感、腎臓損傷および皮膚反応を包含する有害な反応をもたらす可能性がある(Yocum, Semin. Arthritis Rheum. 29: 27−35, 1999; Brooks, Lancet 341: 286−290, 1993)。
したがって、RAの新規な治療法の設計を可能にするであろう新規な治療標的を同定することに対し、当該分野において要望がある。RAにおける治療的介入のための3つの幅広い病理学的プロセス領域は:異常なT細胞活性化応答;滑液細胞の異常増殖ならびに滑液細胞による過剰なサイトカインおよびMMP生産;および末梢血から管外部位への白血球の移動である。
【0021】
シクロフィリンA
上記の3つプロセス領域の全てに関連する1の特異的治療標的は、CsAの遍在的に分布した宿主細胞受容体であるシクロフィリンA(以後、「CyPA」という)である。CyPAは、完全に細胞内蛋白質ではないが、また、炎症刺激に応答して細胞により分泌される(Sherryら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3511−3515, 1992)。細胞外CyPAは、イン・ビトロでの強力な好中性および好酸性化学誘引物質であり、イン・ビボで注射されたとき、好中球の迅速な流入によって特徴付けられる炎症応答を顕在化する(Sherryら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3511−3515, 1992; Xuら、J. Biol. Chem. 267: 11968−11971, 1992; Leiva & Lyttle, Biochem. Biophys. Res. Commun. 186: 1178−11836, 1992)。CyPAの白血球誘引活性はCsAの存在下で阻害されるが、CsAの非免疫抑制類似体であるシクロフィリンGによって阻害されない(Sherryら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3511−3515, 1992; Xuら、J. Biol. Chem. 267: 11968−11971, 1992)。
【0022】
RA患者の関節中の滑液は、高レベルのCyPAを含有しており、かかるCyPAレベルは滑液中の好中球の数および疾患の重篤度の両方と相関する(Billichら、J. Exp. Med. 185: 975−980, 1997)。滑液中に放出されたCyPAが好中球を誘引しており、それが到達すると活性化し、次いで、蛋白質分解性酵素およびオキシダントを放出し、軟骨破壊を促進し、疾患を悪化させると仮定するのが論理的である。したがって、RAを軽減することにおけるCsAの有効性は2つの方法において明らかにされうる。第1に、そのT細胞活性化干渉能を介して作用することができ、よって疾患プロセスの開始を干渉しうる。第2に、CsAは、活性な疾患の期間中、関節において放出されるCyPAに結合することによって作用することができ、それにより、CyPAの好中性化学誘引活性を阻害しうる。
しかしながら、CsA処理は本質的に毒性であり、その結果、肝臓破壊、免疫抑制をもたらし、また、日和見感染に感染しやすくなる。これらの毒性影響は、CsAが膜浸透性であり、全ての細胞中に容易に侵入するという事実の結果である。
【0023】
したがって、当該分野において、RA病因および進行、HIV感染およびこれらのプロセスのメカニズムの悪化の基本的病態生理学のさらなる理解を得る必要がある。したがって、当該分野において、新規なシクロフィリン関連介入標的を同定し、特徴付ける必要があり、また、炎症疾患を治療するための、およびHIV感染を予防するための新規な化合物および方法を同定するためにかかる標的を使用する必要がある。当該分野において、シクロフィリンが特異的に細胞と相互作用してシグナル変換およびHIV感染の媒介となる手段を同定し、そのメカニズムを理解する必要がある。最後に、当該分野において、いったん同定されたならば、かかるメカニズムがどのように治療上使用できるかを理解するか、または新規な治療剤を見出すか、またはこれらの症状の新規かつ有用な診断的および予後的アッセイを提供する必要がある。
【0024】
(発明の開示)
本発明は、以前に知られた細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導蛋白質(”EMMPRIN”)(配列番号2)(CD147としても知られる)がシクロフィリン(”CyP”)の新規な細胞表面受容体であるという驚くべき知見に基づいている。したがって、本発明の実施例および具体例は、HIV−1感染、後天性免疫不全症候群(”AIDS”)、炎症性および自己免疫疾患(例えば、慢性関節リウマチ(”RA”)、EAE、ARDSおよび歯周炎)、結合組織障害、腫瘍成長または移転、あるいは治療の必要な患者における局所的または全身性のCyP放出、合成または結合によって特徴付けられるいずれかの症状などの徴候のための治療法、医薬組成物およびかかる徴候に対する治療活性を有する試験化合物のスクリーニングアッセイを提供する。
【0025】
治療法
本発明は、炎症性疾患、自己免疫疾患、組織潰瘍、腫瘍成長または転移、あるいは治療の必要な患者における局所的または全身性のCyP放出、合成または結合によって特徴付けられるいずれかの症状を治療または予防するための方法であって、治療上有効量のCyP/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストを患者に投与することを特徴とする方法を提供する。好ましくは、CyP/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストは、抗−EMMPRIN抗体、可溶性EMMPRIN蛋白質またはポリペプチド、CyP蛋白質またはポリペプチドおよびその組み合わせである。好ましくは、炎症性または自己免疫疾患は、関節炎、EAE、ARDSまたは歯周炎である。好ましくは、CyP/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストは、抗−EMMPRIN抗体である。好ましくは、抗−EMMPRIN抗体はEMMPRINの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインに結合する。好ましくは、抗−EMMPRIN抗体はモノクローナル抗体である。好ましくは、抗−EMMPRINモノクローナル抗体は、1本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはFabフラグメントである。最も好ましくは、抗−EMMPRIN抗体は、UM−8D6抗−CD147モノクローナル抗体によって認識されるエピトープに結合する。好ましくは、CyP/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストは、EMMPRIN膜貫通ドメインに対応する配列番号2のおよその残基206からおよその残基229までにわたる配列から取り出した約5〜14個のアミノ酸のアミノ酸配列を含むEMMPRNポリペプチドである。
【0026】
本発明は、さらに、炎症性疾患、自己免疫疾患、組織潰瘍、腫瘍成長または転移あるいは治療の必要な患者における局所的または全身性のCyP放出、合成または結合によって特徴付けられるいずれかの症状を治療または予防する方法であって、治療上有効量の式I:
I R1−R2−R3−R4−R5−R6−Pro−R7−R8−R9
[式中、R1−は、His−、SerHis−、ArgSerHis−、Lys−、LysLys−、Arg−であるか、または存在せず;R2、R3およびR4は独立して、Leu、Ile、Ala、Metであるか、または存在せず;R5およびR8は独立して、Leu、Ile、AlaまたはMetであり;R6およびR7は独立して、Phe、TrpまたはTyrであり;−R9は、−Gly、−GlyIle、−GlyIleValであるか、または存在しない]
で示される化合物を患者に投与することを特徴とする方法を提供する。好ましくは、R1−がHis−、SerHis−、ArgSerHis−、Lys−、LysLys−、Arg−であるか、または存在せず;R2−がLeuであり;R3がAlaであり;R4がAlaであり;R5がLeuであり;R6がTrpであり;R7がPheであり;R8がLeuであり;−R9が存在しない式Iである。好ましくは、R1−が存在せず;R2がLeuであり;R3がAlaであり;R4がAlaであり;R5がLeuであり;R6がTrpであり;R7がPheであり;R8がLeuであり;−R9が存在しない式Iである。
【0027】
本発明は、さらに、細胞が機能的EMMPRIN受容体を発現し、レトロウイルスがウイルス感染の組み込み前工程において該EMMPRIN受容体を利用するレトロウイルス感染に対する細胞の感受性を減少させる方法であって、レトロウイルス感染の組み込み前工程を阻害するのに十分な量のCyP/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストと該細胞とを接触させることを特徴とする方法を提供する。好ましくは、CyP/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストは、抗−EMMPRIN抗体、可溶性EMMPRIN蛋白質またはペプチド、CyP誘導体またはペプチド、およびその組み合わせである。好ましくは、CyP/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストは、抗−EMMPRIN抗体である。好ましくは、抗−EMMPRIN抗体はEMMPRINの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインに結合する。好ましくは、抗−EMMPRIN抗体はモノクローナル抗体である。好ましくは、抗−EMMPRINモノクローナル抗体は、1本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはFabフラグメントである。最も好ましくは、抗−EMMPRIN抗体は、UM−8D6抗−CD147モノクローナル抗体によって認識されるエピトープに結合する。好ましくは、CyP/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストは、EMMPRIN膜貫通ドメインに対応する配列番号2のおよその残基206からおよその残基229までにわたる配列から取り出した約5〜14個のアミノ酸のアミノ酸配列を含むEMMPRNポリペプチドである。
【0028】
本発明は、さらに、細胞が機能的EMMPRIN受容体を発現し、レトロウイルスがウイルス感染の組み込み前工程においてEMMPRIN受容体を利用するレトロウイルス感染に対する細胞の感受性を減少させる方法であって、該細胞をレトロウイルス感染の組み込み前工程を阻害するのに十分な量の式I:
I R1−R2−R3−R4−R5−R6−Pro−R7−R8−R9
[式中、R1−は、His−、SerHis−、ArgSerHis−、Lys−、LysLys−、Arg−であるか、または存在せず;R2、R3およびR4は独立して、Leu、Ile、Ala、Metであるか、または存在せず;R5およびR8は独立して、Leu、Ile、AlaまたはMetであり;R6およびR7は独立して、Phe、TrpまたはTyrであり;−R9は、−Gly、−GlyIle、−GlyIleValであるか、または存在しない]
で示される化合物と接触させることを特徴とする方法を提供する。好ましくは、R1−がHis−、SerHis−、ArgSerHis−、Lys−、LysLys−、Arg−であるか、または存在せず;R2がLeuであり;R3がAlaであり;R4がAlaであり;R5がLeuであり;R6がTrpであり;R7がPheであり;R8がLeuであり;−R9が存在しない式Iである。好ましくは、R1−が存在せず;R2がLeuであり;R3がAlaであり;R4がAlaであり;R5がLeuであり;R6がTrpであり;R7がPheであり;R8がLeuであり;−R9が存在しない式Iである。
【0029】
本発明は、さらに、HIV感染、AIDSまたはAIDS関連障害をその治療が必要な患者において治療または予防する方法であって、治療上有効量のCyPA/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストを患者に投与することを特徴とする方法を提供する。好ましくは、CyP/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストは、抗−EMMPRIN抗体、可溶性EMMPRIN蛋白質またはペプチド、CyPA誘導体またはペプチドおよびその組み合わせである。好ましくは、CyP/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストは抗−EMMPRIN抗体である。好ましくは、抗−EMMPRIN抗体は、EMMPRINの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインに結合する。好ましくは、抗−EMMPRIN抗体はモノクローナル抗体である。好ましくは、抗−EMMPRINモノクローナル抗体は、1本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはFabフラグメントである。最も好ましくは、抗−EMMPRIN抗体はUM−8D6抗−CD147モノクローナル抗体によって認識されるエピトープに結合する。
【0030】
本発明は、さらに、HIV感染、AIDSまたはAIDS関連障害をその治療が必要な患者において治療または予防する方法であって、治療上有効量の式I:
I R1−R2−R3−R4−R5−R6−Pro−R7−R8−R9
[式中、R1−は、His−、SerHis−、ArgSerHis−、Lys−、LysLys−、Arg−であるか、または存在せず;R2、R3およびR4は独立して、Leu、Ile、Ala、Metであるか、または存在せず;R5およびR8は独立して、Leu、Ile、AlaまたはMetであり;R6およびR7は独立して、Phe、TrpまたはTyrであり;−R9は、−Gly、−GlyIle、−GlyIleValであるか、または存在しない]
で示される化合物を患者に投与することを特徴とする方法を提供する。好ましくは、R1−がHis−、SerHis−、ArgSerHis−、Lys−、LysLys−、Arg−であるか、または存在せず;R2がLeuであり;R3がAlaであり;R4がAlaであり;R5がLeuであり;R6がTrpであり;R7がPheであり;R8がLeuであり;−R9が存在しない式Iである。好ましくは、R1−が存在せず;R2がLeuであり;R3がAlaであり;R4がAlaであり;R5がLeuであり;R6がTrpであり;R7がPheであり;R8がLeuであり;−R9が存在しない式Iである。
【0031】
スクリーニングアッセイ
本発明はさらに、HIV感染、AIDSまたはAIDS関連障害、炎症性疾患、自己免疫疾患、腫瘍成長または転移あるいは治療が必要な患者における局所的または全身性のCyP放出、合成または結合によって特徴付けられるいずれかの症状に対して治療活性を有する試験化合物を同定する方法であって:(a)試験化合物を機能的CyP蛋白質および機能的EMMPRIN蛋白質と接触させ、ここに、該蛋白質の少なくとも1つが検出可能なラベルを有し;(b)いずれかの得られるEMMPRIN/CyP複合体を該ラベルの存在に関してアッセイし;次いで(c)試験化合物がCyP蛋白質のEMMPRIN蛋白質への結合を阻害したかどうかを決定し、それにより、CyP蛋白質のEMMPRIN蛋白質への結合を阻害する試験化合物が治療化合物として同定されることを特徴とする方法を提供する。好ましくは、機能的EMMPRIN蛋白質または機能的CyP蛋白質のいずれかを固相上に固定する。好ましくは、CyP蛋白質またはEMMPRIN蛋白質を放射能ラベル、蛍光レポーターまたはクエンチャー部分、比色または蛍光変化を触媒する酵素ラベルまたはその組み合わせで標識する。好ましくは、炎症性または自己免疫疾患は関節炎、EAE、ARDSまたは歯周炎である。
【0032】
本発明は、さらに、HIV感染、AIDSまたはAIDS関連障害、炎症性疾患、自己免疫疾患、腫瘍成長または転移あるいは治療の必要に患者における局所的または全身性のCyP放出、合成または結合によって特徴付けられるいずれかの症状に対する治療活性を有する試験化合物を同定する方法であって:(a)試験化合物を機能的CyP蛋白質の存在下、機能的EMMPRIN蛋白質を発現している細胞と接触させ;次いで(b)試験化合物がCyP蛋白質のEMMPRIN蛋白質への結合を阻害するかどうかを決定し、それにより、CyP蛋白質のEMMPRIN蛋白質への結合を阻害する試験化合物が治療化合物として同定されることを特徴とする方法を提供する。好ましくは、炎症性または自己免疫疾患は関節炎、EAE、ARDSまたは歯周炎である。好ましくは、細胞は組換えEMMPRIN、CD4、CXCR4またはその組み合わせを発現する。好ましくは、CyP蛋白質のEMMPRIN蛋白質への結合の阻害の決定は、CyP/EMMPRINアンタゴニストアッセイ、受容体感作または脱感作アッセイ、受容体アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションアッセイ、EMMPRIN媒介性シグナル変換アッセイ、Ca2+動員アッセイ、マトリックスメタロプロテイナーゼ発現または活性アッセイ、細胞成長率アッセイ、HIV−1感染アッセイ、および細胞サイクルまたは細胞分化の特異的マーカーの検出に基づくアッセイよりなる群から選択されるアッセイを基礎とする。好ましくは、EMMPRIN媒介性シグナル変換アッセイは、細胞内蛋白質のリン酸化または活性化状態の決定に基づき、ここに、細胞内蛋白質は、Ras、PKA、RAP1、B−Raf、MekおよびMAPKよりなる群から選択され、それにより、該細胞内蛋白質のリン酸化または活性化状態を対照細胞におけるそのリン酸化または活性化状態と比べて変化させる試験化合物が治療化合物として同定される。好ましくは、細胞周期または細胞分化の特異的マーカーは、細胞周期調節蛋白質サイクリンD1、サイクリンEおよびp21/Waf1よりなる群から選択され、それにより、該細胞周期マーカーを対照細胞におけるその状態と比べて変化させる試験化合物が癌治療化合物として同定される。好ましくは、マトリックスメタロプロテイナーゼ発現アッセイは、プロMMP−1、プロMMP−3、プロMMP−9、MMP−1、MMP−3またはMMP−9の発現または活性を測定する。好ましくは、HIV−1感染アッセイは、ウイルス性逆転写酵素活性またはウイルスに指示されるルシフェラーゼ発現を測定する。
【0033】
医薬組成物
本発明はさらに、式Iの化合物またはその医薬上許容される塩および医薬上許容される担体を含んでなる医薬組成物を提供し、ここに、式Iは
I R1−R2−R3−R4−R5−R6−Pro−R7−R8−R9
[式中、R1−は、His−、SerHis−、ArgSerHis−、Lys−、LysLys−、Arg−であるか、または存在せず;R2、R3およびR4は独立して、Leu、Ile、Ala、Metであるか、または存在せず;R5およびR8は独立して、Leu、Ile、AlaまたはMetであり;R6およびR7は独立して、Phe、TrpまたはTyrであり;−R9は、−Gly、−GlyIle、−GlyIleValであるか、または存在しない]
である。好ましくは、R1−がHis−、SerHis−、ArgSerHis−、Lys−、LysLys−、Arg−であるか、または存在せず;R2がLeuであり;R3がAlaであり;R4がAlaであり;R5がLeuであり;R6がTrpであり;R7がPheであり;R8がLeuであり;−R9が存在しない式Iである。好ましくは、R1−が存在せず;R2−がLeuであり;R3がAlaであり;R4がAlaであり;R5がLeuであり;R6がTrpであり;R7がPheであり;R8がLeuであり;−R9が存在しない式Iである。
【0034】
図面の簡単な記載
図1(左側のパネル)は、本発明によって単離されたcDNAクローン(配列番号1)によってコードされるヒトEMMPRIN蛋白質の概略図を示す。269アミノ酸EMMPRIN蛋白質は、シグナルペプチド(sp)、細胞外ドメイン(ecd)、膜貫通ドメイン(tm)および細胞内ドメイン(icd)を包含する数個の機能的ドメインに分けられる。結合研究に用いられたEMM.C1およびEMM.C2構築物の両方がシグナルペプチドを欠き、一方(EMM.C1)は細胞外ドメインのみを有していた。図1の右側のパネルは、[35S]−標識したEMMPRINがCyPAセファロースアフィニティー樹脂によって特異的に保持されたことを示す。アフィニティーに結合されたEMMPRINを溶出し、電気泳動およびオートラジオグラフィーによって分析した。EMMPRINはCyPAを欠く対照樹脂によって保持されなかった。
図2は、空のベクターで安定にトランスフェクトされたCHO細胞(CHO)またはEMMPRIN発現CHO細胞系統(CHO−EMM)におけるEMMPRIN発現のFACS分析を示す。EMMPRIN発現は、抗−CD147(M6FT)、市販の抗−EMMPRIN抗体(Research Diagnostics, Inc.; Flanders, NJ)を用いてFACSによって分析された。CHO細胞は安定にトランスフェクトされて高レベルのEMMPRINを発現することができる。
【0035】
図3は、CHO(EMMPRIN発現なし)またはCHO−EMM細胞(安定な構造的EMMPRIN発現)におけるCa2+動員が外来的に加えられたCyPA(10μg/ml)によって誘導されたことを示す(左側のパネル)。CHO−EMM細胞におけるCyPAに誘導されたシグナリングは、抗−CD147mAb(M6FT)抗体(すなわち、抗−EMPRINmAB)によって阻害されたが、イソ型対照抗体によって阻害されなかった(右側のパネル)。
図4は、ゲニステイン(チロシンキナーゼ阻害剤)がCHO−EMM細胞においてCyPAにより誘導されるEMMPRIN媒介性Ca2+動員を完全に排除したことを示す。CyPAにより誘導されるCa2+動員は、細胞内シグナルの変換に関与することが知られている種々のキナーゼの種々の阻害剤を用いて前処理されたCHO−EMM細胞において測定された。曲線は、上方から下方へ、阻害剤なし、百日咳毒(PTX)B−オリゴマー(ケモカイン受容体の交差脱感作を誘導する)、PTX(Gi−GoおよびGt−蛋白質ファミリーのメンバーによって媒介されるシグナリング経路を不活性化する)、PD98059(MAPK阻害剤)、ビシンドリルマレイミドI(PKC阻害剤)およびゲニステインでの前処理を示す。ゲニステインは、CHO−EMM細胞においてCyPAにより誘導されるCa2+動員を完全に排除した。
【0036】
図5は、WI−38ヒト初代肺繊維芽細胞におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)発現に対するCyPA処理の影響のウェスタンイムノブロット分析を示す。ヒトWI−38繊維芽細胞をCyPAまたは培地のみで処理し、次いで、上清を収集し、ろ過し、マウスモノクローナル抗体(Cal Biochem, La Jolla, CA)を用いて、MMP−1、MMP−3およびMMP−9反応性についてウェスタンイムノブロットによって分析した。CyPA−処理は、プロMMP−1の発現および放出を活性化し、プロMMP−3のそれを増加させた。
【0037】
図6は、ルシフェラーゼ(左側および中央パネル)およびHIV−1逆転写酵素活性(右側パネル)の分析を示し、細胞表面EMMPRIN発現がCHO−EMMPRIN(CHO−EMM)細胞のMuLV−およびHIV−1LAV−偽型HIV−1(Luc−HIV−1)感染をCHO(対照)細胞と比べて増加させること、その増加効果が抗−CD147mAb(UM−8D6)によって大いに減少されること、およびその増加効果がプロウイルスDNAの組み込みの前の段階で明らかにされることを示す。
左側のパネルは、ルシフェラーゼを発現しているMuLV−偽型HIV−1で感染させたCHO(対照)またはCHO−EMM(EMMPRINを構造発現している)細胞におけるルシフェラーゼ発現(感染後4日目に測定され、対照に相対的なパーセンテージとして表した)を示す。細胞表面EMMPRINの存在はルシフェラーゼ発現を5〜6倍に増加させた。さらに、この増加は、感染中に抗−CD147mAb(UM−8D6)を加えた場合、大いに減少された。
中央パネルは、CD4−およびCXCR−発現ベクターで一過性トランスフェクトし、次いで、侵入に関してCD4およびCXCR4に依存するHIV−1LAV由来のEnvを有する偽型であるLuc−HIV−1で感染させたCHOまたはCHO−EMM細胞の3連培養におけるルシフェラーゼ発現を示す。ルシフェラーゼ発現は、対照(CHO/CD4/CXCR4細胞;100%とする)に相対的な発現のパーセンテージとして表わす。ルシフェラーゼ発現における3〜4倍の増加がEMMPRINを発現している細胞において観察された。
右側のパネルは、CD4−およびCXCR4−発現ベクターで一過性トランスフェクトし、次いで、抗−CD147mAb(UM−8D6)またはイソ型に合致する不適切な抗体の存在下、EnvMuLV−またはEnvLA1−偽型luc−HIV−1で感染させたCHOおよびCHO−EMM細胞における逆転写酵素活性を示す。ウイルス性DNAは、PCRによって、初期逆転写産物に特異的なプライマーLTR R/U5を用いて、感染の2時間後に分析された。結果は、ダイレクトイメージャー(Packard)において定量化され、対照(イソ型で処理したCHO/CD4/CXCR4細胞;100とする)に相対的なLTR/gag−特異的シグナルに関連する放射能として表わす。EnvMuLVおよびEnvLAV−偽型ウイルスでの感染後のLTR R/U5逆転写産物の量は、CHO/CD4/CXCR4細胞と比べてCHO−EMM/CD4/CXCR4細胞において3〜4倍に増加した。さらに、抗−CD147mAbはEMMPRINの増加効果を減少させた。
【0038】
図7Aは、抗−CD147mAbがヒト初代PBMCにおけるHIV−1複製を阻害したことを示す。PHA活性化PBMCの3連培養物をT−リンパ親和性X4株HIV−1LAVまたはマクロファージ親和性R5HIV−1ADA(左側のパネル)、あるいはLAVまたはADA株由来の外被を有するルシフェラーゼを発現している組換えHIV−1偽型(右側のパネル)のいずれかで感染させた。抗−CD147mAb(UM−8D6)またはイソ型に合致した対照mAbを感染の30分前に加え、実験の間中存在させた。ウイルス複製は、21日目の培養上清におけるRT活性(左側のパネル)または感染後4日目のルシフェラーゼ活性(右側のパネル)によって評価した。結果は、対照(イソ型に合致した不適切なmAbで処理した細胞;100%とする)に相対的なRTまたはルシフェラーゼ活性として表わす。結果は、EMMPRINがHIV−1感染に関与したことを示す。
【0039】
図7Bは、抗−CD147mAbがヒトPBMCへのHIV付着を阻害しなかったことを示す。3連PBMC培養物を37℃にて、抗−CD147mAb(UM−8D6;50μg/ml)、抗−CD4mAb(5μg/ml)またはヘパリナーゼIII(3x10−4IU/ml)で前処理し、次いで洗浄し、HIV−1LAV(p24の10ng/ml)と一緒に4℃で1時間インキュベートした。細胞に結合したウイルス性p24の量をELISAによってアッセイした。示される結果は、異なるドナー由来のPBMCを用いて行った3つの実験のうち1つの代表実験についてのものである。抗−CD147mAb(UM−8D6)は、ヒトPBMCへのHIV−1LAV付着を阻害しなかったが、抗−CD4mAbは付着を有意に減少させた。
【0040】
図7Cは、抗−CD147mAbが、PBMCとHIV−1 ADAおよびLAV外被を発現しているHeLa細胞との間のHIV Env媒介性融合を阻害せず、また、ウイルス性p24の細胞インターナリゼーションを減少させなかったことを示す。左側のパネル:PBMCとHIV−1Env(X4 LAVまたはR5 Ba−L)を発現しているHeLa細胞との間の融合は、抗−CD147(UM−8D6;50μg/ml)または抗−CD4(5μg/ml)mAbの存在下、β−Gal発現によって評価された(「方法」実施例6を参照のこと)。結果は、正の対照(非処理細胞;100%とする)に相対的なβ−Gal活性として表わし、同じドナー由来の細胞を用いる3つの独立した測定値の平均±SDとして示す。右側のパネル:ウイルス−細胞融合の分析の場合、PBMCをHIV−1LAVと一緒にインキュベートした(「方法」、実施例6を参照のこと)。次いで、細胞をトリプシン(0.025%、30分間、37℃)で処理し、溶解し、ウイルス性p24をELISAにより溶解物中において測定した。これらのデータは、抗−CD147mAb(UM−8D6)のHIV−1感染に対する阻害効果が融合後メカニズムによって媒介されたことを示す。
【0041】
図7Dは、抗−CD147mAbがHIV−1逆転写量を減少させたことを示す。左上および右側のパネル:PHA−活性化ヒトPBMCを抗−CD147mAb(UM−8D6;50μg/ml)または抗−CD4mAb(2μg/ml)、または対応するイソ型に合致した対照mAb(50μg/ml)のいずれかで、HIV−1感染の2時間前に処理した。HIV−1逆転写の分析は、HIV−1LAVでのPBMCの感染の2時間後に、「ストロング−ストップ」初期逆転写産物に特異的なLTR R/U5プライマーを用いて行った。PCR結果は、ダイレクトイメージャー(Packard)において定量化され、抗体−非処理対照(100%とする)に相対的な処理細胞におけるカウントパーセンテージとして示す。抗−CD147mAb(UM−8D6)は、逆転写産物の量をおよそ2倍減少させた。予測どおり(実施例6参照)、抗−CD4mAbはLTR R/U5増幅フラグメントの量をより一層減少させた。左下のパネル:細胞あたり1つのHIV−1ゲノムを含有する8E5/LAI細胞の希釈物をPCR標準物として用いた。
【0042】
図7Eは、HIV−1蛋白質の細胞レベル以下の分布に対する抗−CD147mAbの影響を示す。50μg/mlの抗−CD147mAb(Ancell)またはイソ型に合致した対照mAbの存在下、MT−4細胞に4℃にてHIV−1LAIを接種した。アリコート(1x106細胞)を蛋白質分析のために30分後に回収し(すなわち、0時間p.i.時点試料)(上方のパネル)、一方、接種した培養物を37℃に移し、1.5時間インキュベートした(下方のパネル)。細胞分画を行い(「方法」、実施例6参照)、サイトソル(C)、膜(M)および細胞骨格(CS)画分中の蛋白質を、アクチン、CAおよびMAに対するモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロットおよびECLによって分析した。ウイルス性MA蛋白質およびCAは、抗−CD147mAbの不在下、感染の1.5時間後に膜(M)から各々、細胞骨格(CS)およびサイトソル画分へ輸送された(イソ型パネル、各々、レーン「CS」および「C」)。しかしながら、MAおよびCAの両方が抗−CD147mAb(UM−8D6)で処理されたMT−4細胞における細胞膜画分に結合したままであり(α−CD147パネル、レーン「M」)、それは、EMMPRINがHIV−1脱外被の調節に関与したことを示す。
【0043】
図8は、CsA耐性HIVウイルス株の複製が抗−CD147mAbによって阻害されなかったことを示す。293T細胞をシクロスポリンA(1μM)の不在下(”C”)または存在下(”CsA”)、HIV−1NL4−3(”WT”)(左のパネル)または変異体(”A224E”)(右のパネル)ウイルスの分子クローンでトランスフェクトした。ウイルス生産性のトランスフェクト細胞を洗浄し、4連でさらに4日間、CD8+T細胞涸渇PBMCおよび抗−CD147mAb(UM−8D6;100μg/ml)を添加して(”293T+CD4+T細胞”)または添加しないで(”293T”)培養した。ウイルス複製は、培養上清中のRT活性を測定することによってアッセイした。結果は平均±SEとして示す。抗−CD147mAb(UM−8D6)は、CsA耐性A224Eウイルスの複製を阻害しなかったが、野生型ウイルスの複製を有意に減少させた。
【0044】
図9は、EMMPRIN膜貫通領域のアミノ末端由来の8アミノ酸ポリペプチド(配列番号3)がEnvMuLV偽型ルシフェラーゼ発現性HIV−1によるCHO−EMM細胞の感染を阻害したことを示す。左側のパネルは、CD147の概略構造(”sp”=シグナルペプチド、”e”=細胞外ドメイン、”t”=膜貫通ドメインおよび”c”=細胞質ドメイン)およびその膜貫通ドメイン由来の2つのペプチド(”ペプチド1”および”ペプチド2”)を示す。右側のパネルは、所定濃度のペプチド1、2および”スクランブルペプチド1”の存在下、組換えEnvMuLV−偽型ルシフェラーゼ発現性HIV−1で感染させたCHOおよびCHO−EMM細胞の感染後4日目のルシフェラーゼ発現データを示す。ペプチド1(LAALWPFL)は、EMMPRIN膜貫通ドメインのアミノ酸206−213に対応する8アミノ酸配列(配列番号3)である。ペプチド2(GIVAEVLVL)は、EMMPRIN膜貫通ドメインのアミノ酸214−222に対応する9アミノ酸ポリペプチド配列(配列番号4)である。ランダム化した配列対照であるスクランブルペプチド1(FAWPLLLA)は、ペプチド1のアミノ酸残基のランダム化配列にしたがって作成された。
【0045】
発明の詳細な記載
定義
CyPは蛋白質シクロフィリンを示し、その少なくとも4つの型、CyPA(シクロスポリンAの宿主細胞受容体)、CyPB、CyPCおよびhCyP3、シクロフィリンのいずれかの誘導体、またはシクロフィリンに対応するアミノ酸配列を有するいずれかのフラグメントまたはペプチドが知られている。CyPのポリペプチドまたはペプチドフラグメントは、CyPポリペプチドまたはCyPペプチドと呼ばれ、CyP、CyPポリペプチドまたはペプチドフラグメントの誘導体、およびCyP、CyPポリペプチドまたはペプチドフラグメントの無関係な蛋白質への融合(本明細書において、各々、CyP誘導体およびCyP融合蛋白質という)を包含する。機能的CyPとは、その同種のCyP結合蛋白質またはリガンドにイン・ビボまたはイン・ビトロで結合する蛋白質をいう。例えば、機能的CyPAは、EMMPRIN、CsA、HIV−gag蛋白質(特に、そのキャプシド抗原部分と)またはその組み合わせに結合するCyPA蛋白質、ペプチド、ポリペプチドまたは融合蛋白質である。
【0046】
CyP結合蛋白質は、シクロフィリン特異的結合活性を有するいずれかの細胞結合蛋白質、細胞表面結合蛋白質または受容体、細胞外受容体、可溶性受容体または細胞内結合蛋白質を意味する。例えば、本明細書に開示されるように、EMMPRINは細胞表面CyP結合蛋白質(すなわち、CyPの細胞表面受容体)である。
CsAはシクロスポリンA、シクロスポリンAのいずれかの誘導体、またはシクロスポリンAに対応するアミノ酸配列を有するいずれかのフラグメントまたはペプチドである。
【0047】
EMMPRIN(配列番号2)は、ヒト細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導蛋白質であり、細胞表面CyPAまたはCyPB受容体である。EMMPRINは別名で、当該分野において、CD147、バシジンおよびM6−抗原と呼ばれる。EMMPRINのポリペプチドまたはペプチドフラグメントは、EMMPRINポリペプチドまたはEMMPRINペプチドと呼ばれ、EMMPRIN、EMMPRINポリペプチドまたはペプチドフラグメントの誘導体、およびEMMPRIN、EMMPRINポリペプチドまたはペプチドフラグメントの無関係な蛋白質への融合(本明細書において、各々、EMMPRIN誘導体およびEMMPRIN融合蛋白質という)を包含する。機能的EMMPRIN蛋白質、ペプチド、ポリペプチドまたは融合蛋白質は、CyP蛋白質、ペプチドまたはその誘導体に結合するか、あるいはレトロウイルス関連CyPA蛋白質またはペプチドにイン・ビボまたはイン・ビトロで結合するEMMPRIN蛋白質、ペプチド、ポリペプチド、融合蛋白質、細胞受容体、可溶性受容体または細胞内結合蛋白質をいう。
【0048】
CD147はEMMPRIN(配列番号2)を意味する。
抗−EMMPRIN抗体は抗−CD147抗体を意味する。
抗−CD147または抗−EMMPRIN抗体は、EMMPRINまたはEMMPRINの保存的変種またはEMMPRINのペプチドフラグメントの1以上のエピトープを特異的に認識する抗体を意味し、限定するものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb)、ヒト化またはキメラ抗体、1本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fab発現ライブラリーによって生産されるフラグメント、抗−イディオタイプ(抗−Id)抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを包含する。
【0049】
抗−CD147mAb(UM−8D6)またはUM−8D6抗−CD147モノクローナル抗体は詳細には、Ancell Immunology Research Products (Bayport, MN)から市販されているネズミIgG1抗−CD147モノクローナル抗体をいう。該抗体を下記の実施例5−7に使用した。
抗−CD147mAB(M6F)は詳細には、Research Diagnostic, Inc. (”RDI”, Flanders, NJ)から市販されている抗−CD147モノクローナル抗体RDI−CD147−M6FTをいう。該抗体を下記の実施例2に使用した。
【0050】
MMPsは、マトリックスメタロプロテイナーゼを意味する。プロMMPは、蛋白質分解性切断によって活性化できる対応するMMPの不活性チモーゲン(プロ酵素)形態を意味する。例えば、MMP−1はプロMMP−1の蛋白質分解性切断によって生産される。
PICはHIV−1組み込み前複合体を意味する。
MAはHIV−1マトリックス抗原蛋白質を意味する。
CAはHIV−1キャプシド抗原蛋白質を意味する。
PHAはフィトヘマグルチニン抗原を意味する。
293T細胞は、当該分野で認識されたHIV−1感受性胚性腎細胞系統をいう。
【0051】
CHO細胞は、当該分野で認識されたチャイニーズハムスター卵巣細胞系統をいう。
CHO−EMM細胞は、高レベルのEMMPRINを構造発現する安定にトランスフェクトされたCHO細胞系統をいう。
MT−4細胞は当該分野で認識されたヒトT細胞系統をいう。
PBMCは初代ヒト末梢血単核細胞をいう。
A224Eは、当該分野で認識されたCsA耐性HIV−1 CA変異株をいう。
【0052】
概観
本発明は、シクロフィリン(”CyP”)と細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導因子(”EMMPRIN”)との間のリガンド/受容体関係という出願人の驚くべき知見に基づく。さらに、EMMPRINの細胞外ドメインに結合する抗−CD147(すなわち、抗−EMMPRIN)モノクローナル抗体がCyPのEMMPRINへの結合(実施例1)、CyP/EMMPRIN媒介性シグナル変換(実施例2)およびCyPA−関連HIV−1感染/複製を阻害した。したがって、CyP/EMMPRIN相互作用を修飾する薬剤はCyP−およびEMMPRIN−の両方に関連する治療的有用性を有する。
【0053】
治療およびスクリーニング方法
本発明は、CyP/EMMPRIN相互作用を修飾し、それにより、HIV−1感染、後天性免疫不全症候群(”AIDS”)、炎症性および自己免疫疾患(例えば、慢性関節リウマチ(”RA”)、EAE、ARDS、歯周炎)、腫瘍成長または転移あるいは治療の必要な患者における局所的または全身性のCyPA放出、合成または結合によって特徴付けられるいずれかの症状などの徴候に対する治療法において治療的有用性を有する試験化合物を同定するためのスクリーニング法(例えば、アッセイ)を提供する。本発明の方法によって達成される化合物は、小型分子、大型分子(例えば、EMMPRINまたはCyP蛋白質、そのペプチド)および抗体を包含する。
【0054】
EMMPRIN、および/またはCyPと相互作用して、これらの分子間の結合を模倣、変調または拮抗するか、および/またはEMMPRIN、CyPまたはEMMPRIN:CyP複合体の活性を変調する化合物を同定するために、細胞性および非細胞性アッセイを用いることができる。細胞ベースのアッセイは、例えば、EMMPRIN、CyPまたはEMMPRIN:CyP複合体の活性、移動または細胞コンパートメント化、あるいは他の蛋白質(例えば、HIV−1 MAおよびCA蛋白質)のEMMPRIN媒介性細胞コンパートメント化に影響を及ぼす化合物または組成物を同定するために用いることができる。該アッセイは、他のパラメーターのなかでも、EMMPRIN、CyP、またはEMMPRIN:CyP複合体への直接の結合を測定できるか、または下流のシグナル変換経路に関与する細胞内因子に対する間接的な影響または該細胞内因子による間接的な影響を測定できる。かかる細胞ベースのアッセイは、EMMPRINおよび/またはCyP蛋白質またはペプチドあるいは無関係の蛋白質またはペプチドとのその融合を発現する細胞、細胞系統、または操作された細胞もしくは細胞系統を利用する。該細胞は、さらに、EMMPRIN媒介性シグナリング活性を変調する化合物の同定を援助するために、EMMPRIN、CyP、またはEMMPRIN:CyP複合体によって変換されるシグナルに連結されたレポーター分子を組み込むように操作することができる。
【0055】
EMMPRINおよびCyP蛋白質、ポリペプチドおよび融合蛋白質は、抗体を生産するための、ならびに診断および治療のための、EMMPRIN、CyP、またはEMMPRIN:CyP複合体と相互作用する、および/またはEMMPRIN、CyP、またはEMMPRIN:CyP複合体の活性を変調する化合物をスクリーニングするための細胞および非細胞ベースのアッセイにおいて使用される。
【0056】
EMMPRINまたはCyP蛋白質産物は、EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストとして治療上使用される。かかるEMMPRINまたはCyP蛋白質産物は、限定するものではないが、1以上のEMMPRINまたはCyPドメイン(例えば、CyPのEMMPRIN相互作用ドメイン)に対応するペプチドまたはポリペプチド、1以上のEMMPRINまたはCyPドメイン(例えば、EMMPRINの場合、細胞外および/または膜貫通ドメインなど)を欠く末端切断型EMMPRINまたはCyPポリペプチド、EMMPRINまたはCyP融合蛋白質産物(例えば、EGFPおよびFLAG融合を包含するGST融合、またはエピトープタグ付加融合)、およびEMMPRINまたはCyP蛋白質もしくはペプチド誘導体または複合体を包含する。
【0057】
例えば、有効量の適当な可溶性EMMPRIN蛋白質またはペプチド、またはEMMPRIN融合蛋白質(例えば、EMMPRINHA)を患者に投与し、それにより、それが内在性CyPと相互作用し、あるいは、内在性CyPを「活性化」、「中和」または「排除」して、EMMPRIN、CyP、またはEMMPRIN:CyP複合体の活性を変調する。また別の具体例において、かかるEMMPRIN産物をコードしているヌクレオチド構築物を用いて、かかるEMMPRIN産物をイン・ビボで発現するように宿主細胞を遺伝子操作する。これらの遺伝子操作された細胞は、体内で「バイオリアクター」として機能し、別法で内在性CyPを「活性化」、「中和」または「排除」するであろう適当な可溶性EMMPRIN産物の連続的な供給をデリバリーする。
【0058】
別法では、EMMPRINに対する抗体、あるいはEMMPRINアゴニストもしくはアンタゴニストであり、および/またはEMMPRIN媒介性シグナル変換を変調し、およびEMMPRIN媒介性シグナル変換経路における下流の標的に対して作用する他の薬剤を治療剤として用いる。
【0059】
CyP/EMMPRIN結合相互作用は、慢性関節リウマチ(RA)のような局所的または全身性のCyP放出、合成または結合によって特徴付けられる症状のための新規な治療的介入標的である
CyP/EMMPRIN結合相互作用は、RAのようなCyPA−関連治療的徴候のための新規な介入標的である。なぜならば、(1)EMMPRINはCyP結合蛋白質であり;(2)EMMPRINはCyPのシグナリング受容体であり、チロシンキナーゼ依存性シグナル変換の媒介となり;および(3)CyP処理はWI−38初代ヒト繊維芽細胞におけるプロMMP−1およびプロMMP−3の発現および放出を活性化および増強するからである。
【0060】
(1)EMMPRINはCyPA結合蛋白質として同定された。
詳細には、EMMPRIN cDNAクローン(配列番号1)が単離され、始めに標準的な酵母2−ハイブリッドプロトコールによってCyPA相互作用蛋白質として同定された(実施例1および図1)。次いで、CyPA/EMMPRIN結合相互作用を、[35S]−標識化EMMPRINのCyPAセファロースアフィニティー樹脂へ特異的結合を明らかにすることによって確認した(実施例1、図1、右側のパネル)。
【0061】
(2)EMMPRINはCyPのシグナリング受容体として同定され、チロシンキナーゼ依存性シグナル変換の媒介となった。
詳細には、CyPAまたはCyPBはCHO−EMM細胞(EMMPRIN発現ベクターで安定にトランスフェクトされており、EMMPRINを構造的に発現している)においてCa2+動員を誘導したが、対照CHO細胞(EMMPRINを発現しない)において誘導しなかった(実施例2および図3、左側のパネル)。さらに、イソ型対照抗体ではなく、抗−CD147mAb(M6FT)(すなわち、抗−EMMPRIN mAb)がCHO−EMM細胞におけるCyPA媒介性Ca2+動員を阻害した(図3、右側のパネル)。さらに、チロシンキナーゼ阻害剤ゲニステインは、CHO−EMM細胞におけるCyPAにより誘導されるシグナリングの阻害において有効であった(図4)。したがって、EMMPRINはCyPAおよびCyPBの細胞受容体として同定され、チロシンキナーゼ依存性経路を介する細胞内シグナル変換の媒介をした。
【0062】
(3)CyPA処理は、WI−38初代ヒト繊維芽細胞においてプロMMP−1の発現を活性化し、プロMMP−3の放出を増強した。
WI−38初代ヒト繊維芽細胞のCyPAでの処理は、メタロプロテイナーゼチモーゲンプロMMP−1の発現および放出を活性化し、プロMMP−3の放出を増強した(実施例4および図5)。メタロプロテイナーゼMMP−1およびMMP−3は、RA患者の滑液中において上昇されることが知られており、RA疾患関連病理に寄与すると考えられる。活性型MMP−1およびMMP−3種は、通常、周囲の組織によって放出される蛋白質分解酵素(例えば、RA患者の滑液中の蛋白質分解酵素)によって、対応する分泌された不活性型チモーゲン、プロMMP−1およびプロMMP−3から生じる。
【0063】
したがって、EMMPRINがMMP生産を刺激するメカニズムは、EMMPRINを細胞−細胞相互作用に関与する付着型分子として狭く特徴付ける初期の文献によって示されたものより複雑である。EMMPRINはまた、(本明細書に開示されるように)、その可溶性リガンドであるCyPAを介してシグナルを受けることによってMMP生産を刺激したシグナル変換受容体として同定された。
【0064】
したがって、本発明は、活性なRA疾患の間、炎症した関節中に放出されたCyPが、好中球表面のEMMPRINへのCyP結合を介して関節に好中球を誘引するモデルを支持する。これらの好中球は次いで、CyP依存性およびCyP非依存性メカニズムを介して関節中で活性化されて、RA疾患を悪化させる酵素(例えば、好中球エラスターゼ)を放出する。したがって、抗−EMMPRIN抗体またはEMMPRINアゴニストもしくはアンタゴニストとして作用する他の薬剤は、RAあるいは局所的または全身性のCyP放出、合成または結合によって特徴付けられる他の症状(すなわち、CyP−関連治療的徴候)の治療または予防のための治療的有用性を有する。
【0065】
CyP/EMMPRIN結合相互作用は、HIV−1感染および/またはAIDSもしくはAIDS関連障害の治療または予防などの局所的または全身性のCyP放出、合成または結合によって特徴付けられる症状のための新規な治療的介入標的である。
CyPA/EMMPRIN結合相互作用は、HIV感染および/またはAIDSもしくはAIDS関連障害のための新規な介入標的である。なぜならば、(1)細胞表面EMMPRINは、MuLV−、およびHIV−1コアを担持するHIV−1偽型レトロウイルスによるCHO細胞の細胞性感染の組み込み前工程に対して実質的な増強効果を有し、(2)細胞表面EMMPRINは、初代ヒト細胞(末梢血単核細胞;PBMC)のHIV感染の組み込み前工程に対して実質的な増強効果を有し;および(3)抗−CD147mAb(UM−8D6)の阻害効果に対するウイルス耐性はCsAに対する耐性に相関するからである。
【0066】
(1)細胞表面EMMPRINは、MuLV−、およびHIV−1コアを担持するHIV−1−偽型レトロウイルスによるCHO細胞の細胞性感染の組み込み前工程に対して実質的な増強効果を有した。
CHO細胞の細胞表面上のEMMPRIN蛋白質の存在は、MuLV偽型HIVによる感染を増強した(実施例5および図6、左側のパネル)。さらに、この増強は、抗−CD147mAb(UM−8D6)によって大いに減少され(実施例5および図6、左側のパネル)、かかる感染はEMMPRIN膜貫通ドメインペプチド1(配列番号3)によって阻害された(実施例8および図9)。
【0067】
さらに、EMMPRINは、HIV−1偽型HIVによるCHO/CD4/CXCR4細胞(CD4−およびCXCR4−発現ベクターでトランスフェクトされたCHO細胞)感染を増強した(実施例5および図6、中央のパネル)。さらに、EnvADA−偽型luc−HIV−1によるPHA−活性化ヒトPBMCの感染はペプチド1(配列番号3)によって阻害された(実施例8)。
【0068】
最後に、EMMPRINは、ウイルス組み込み前段階にてHIV感染を増強した。詳細には、HIV−特異的逆転写は、EMMPRINの存在下で(すなわち、CHO−EMM/CD4/CXCR4において、CHO/CD4/CXCR4細胞と比べて)3〜4倍増加した。有意には、抗−CD147mAbはこの増強効果を減少させ(図6、右側のパネル)、それはEMMPRINがウイルス組み込み前段階で作用することを示す。
【0069】
(2)細胞表面EMMPRINは、PBMCのHIV感染の融合後の組み込み前工程に対して実質的な増強効果を有した。
抗−EMMPRIN mAb(UM−8D6)は、ヒト初代PBMC中でのHIV−1株の複製を阻害した(実施例6および図7A)。詳細には、イソ型に合致した対照mAbではなく、抗−CD147mAb(UM−8D6)が初代PBMC中でのマクロファージ−親和性(ADA)およびT細胞系統−適応性(LAV)HIV−1株の複製を阻害した(実施例6および図7A、左側および右側のパネル)。
【0070】
有意には、抗−CD4mAbとは対照的に、抗−CD147mAb(UM−8D6)は、ヒトPBMCをHIV−1と一緒に4℃でインキュベーション後に細胞結合型ウイルス性p24の量を測定することによって決定した場合、ヒトPBMCに対するHIV結合を阻害しなかった(実施例6および図7B)。したがって、抗−CD147mAb(UM−8D6)は、ウイルス結合と組み込みとの間の工程にてHIV−1感染を阻害したのである。
【0071】
さらに、抗−CD4mAbとは対照的に、抗−CD147mAb(UM−8D6)は、PBMCとHIV−1 ADAおよびLAV外被を発現しているHeLa細胞との間のHIV Env媒介性融合を阻害せず(実施例6および図7C、左側のパネル)、また、ウイルス性p24の細胞性インターナリゼーションも減少させなかった(実施例6および図7C、左のパネル)。したがって、本発明によると、EMMPRINはHIV−1感染における融合後工程で作用する。
【0072】
したがって、抗CD147mAb(UM−8D6)は、HIV−1感染の間、初期および後期の両方のHIV−1逆転写量を減少させた(実施例6および図7D)。HIV−1逆転写は、組み込み前の複合体(”PIC”)の進行性成熟を示す融合後過程である。したがって、抗−CD147mAb(UM−8D6)は、ウイルス−細胞融合と逆転写の開始との間のHIV−1感染における工程を干渉した。
【0073】
さらに、抗−CD147mAb(UM−8D6)は、新たな感染後初期のHIV−1マトリックス(MA)およびキャプシド(CA)蛋白質の正常な移動を阻害した。詳細には、抗−CD147mAb(UM−8D6)の存在下、ウイルスは細胞膜に保持され、それは、EMMPRINがHIV−1脱外被において役割を果たすことを示す(実施例6および図7E)。
【0074】
(3)抗−CD147mAbの阻害効果に対するウイルス耐性は、CsAに対する耐性と相関した。
ヒトPBMCにおけるA224E(CsA−耐性、CA変異体HIV株)の複製は、抗−CD147mAb(UM−8D6)での処理に対し耐性であった(実施例7および図8)。
したがって、抗−CD147mAbは、ウイルス−細胞融合と逆転写の開始との間のHIV−1感染におけるCyPA依存性工程(すなわち、融合後の組み込み前工程)を干渉した。したがって、EMMPRINは、HIV−1感染における融合後の組み込み前工程(例えば、ウイルス脱外被)の媒介となった。
【0075】
したがって、理論に拘束されることなく、CyPAがHIV−1感染の媒介となるメカニズムは、ビリオン中のHIV−gag蛋白質および細胞表面ヘパラン(本発明以前には、「独占的なCyPA受容体」でると断言されていた、Saphireら、EMBO J. 18:6771−6785, 1999)と相互作用する蛋白質としてCyPAを狭く特徴付けている先行技術によって示されるよりも複雑である。驚くべきことに、本明細書に開示されるように、EMMPRINはHIV−1感染におけるCyPA依存性工程の媒介となった。よって、CyPAは、HIV−1感染の間のHIV−gag、ヘパランおよびEMMPRINとの複数の相互作用に関与した。さらに、EMMPRINは、新たな感染後初期のHIV−1 MAおよびCA蛋白質の正常な移動の媒介となった。抗−CD147mAb(UM−8D6)が新規なCyPA/EMMPRIN結合相互作用(およびそれにより媒介されるシグナル変換)を拮抗したという証明は、さらに、HIV−1感染および/またはAIDS、および/または局所的または全身性のCyPA放出もしくは合成によって特徴付けられる他の症状(すなわち、CyPA−関連治療的徴候)の治療または予防のための方法において有用な該相互作用を修飾する他の薬剤の使用を可能にする。
【0076】
CyP/EMMPRIN結合相互作用は、癌のような局所的または全身性のCyP放出、合成もしくは結合によって特徴付けられる症状のための新規な治療的介入標的である。
CyPA/EMMPRIN結合相互作用は、癌のための新規な介入標的である。なぜならば、(1)EMMPRIN発現腫瘍細胞は、それと共培養された繊維芽細胞中のMMPsの発現をアップレギュレートすることが知られており(Biswasら、Cancer Res. 55: 434−439, 1995);(2)本明細書中で開示されるように、CyPはヒト繊維芽細胞中のMMP生産を活性化および/または増強し;および(3)MMPsの脱調節された作用は、例えば、関節炎、歯周炎、組織潰瘍を包含する多くの結合組織疾患における、および癌細胞侵入および転移における細胞外マトリックスの病理学的破壊に寄与するからである(Kahariら、Exp. Dermatol. 6:199−213, 1997; Keyszerら、J. Rheumatol. 26: 251−258, 1999; Benbowら、J. Biol. Chem. 274: 25371−25378, 1999; Keyszerら、Z. Rheumatology 57: 392−398, 1998)。
【0077】
EMMPRIN蛋白質、ポリペプチドおよび抗体
EMMPRINまたはCyP蛋白質およびポリペプチド、および変異形態、末端切断形態または欠失形態のEMMPRINまたはCyPおよび/またはEMMPRINまたはCyP融合蛋白質は、限定するものではないが、抗体の生産、診断アッセイの試薬として、例えば、HIV−1感染、AIDS、RAおよび癌の治療および予防に使用できる治療化合物のためのスクリーニングアッセイの試薬として、および例えば、HIV−1感染、AIDSおよびAIDS関連障害、RAおよび癌の治療に有用な医薬的試薬としての使用を包含する種々の使用のために調製することができる。
【0078】
EMMPRINおよびCyP蛋白質およびポリペプチドの生産
EMMPRINをコードしているcDNA配列を、対応する推定アミノ酸配列(配列番号2)と共に配列番号1に示す。図1は、EMMPRINのシグナルペプチド、細胞外(ecd)、膜貫通(tm)および細胞内(icd)ドメインを概略的に示す。EMMPRINまたはCyPの1以上のドメイン(例えば、EMMPRINecdまたはtmドメイン)に対応するペプチド、末端切断型または欠失型EMMPRINまたはCyP(例えば、1以上の領域またはドメインが欠失しているEMMPRINまたはCyP)ならびに全長EMMPRINまたはCyP、EMMPRINまたはCyPペプチドあるいは末端切断型EMMPRINまたはCyPが無関係の蛋白質に融合している融合蛋白質(例えば、GST、FLAGおよびEGFP融合)もまた、本発明の範囲内である。例えば、かかる可溶性EMMPRIN蛋白質、ペプチドまたは融合蛋白質、または循環性CyPに結合して「活性化」、「中和」または「排除」する抗体(抗−イディオタイプ抗体を包含する)を本明細書に記載のように用いて、例えば、HIV−1感染、AIDS、RAおよび癌を治療または予防することができる。この目的のために、EMMPRINの個々のドメインに対応するペプチド、EMMPRINの可溶性欠失変異体、またはEMMPRIN蛋白質全体を別のポリペプチド(例えば、IgFcポリペプチド、またはエピトープタグ)に融合することができる。別法では、EMMPRIN受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するCyP蛋白質、ペプチドまたは融合蛋白質を本明細書に記載のように用いて、例えば、HIV−1感染、AIDSおよびAIDS関連障害、RAおよび癌を治療または予防することができる。
【0079】
かかるペプチド、ポリペプチド、および融合蛋白質は、組換えDNA技術によって調製できる。例えば、1以上のEMMPRIN領域またはドメインをコードしているヌクレオチド配列を合成またはクローン化し、可溶性受容体または可溶性結合蛋白質またはペプチドのような可溶性EMMPRIN蛋白質をコードするように一緒に連結する(例えば、配列番号3、配列番号4、配列番号5)。1以上のEMMPRIN領域またはドメインをコードしているDNA配列を直接またはペプチドスペーサーをコードするリンカーオリゴヌクレオチドを介して一緒に連結することができる。かかるリンカーは、フレキシブルなグリシンに富むアミノ酸配列をコードすることができ、それにより、一緒に繋ぎ合わされたドメインにEMMPRINリガンド(例えば、CyPAまたはCyPB)に結合できるコンホメーションをとらせる。別法では、個々の領域またはドメインをコードしているヌクレオチド配列を用いてEMMPRINペプチドを発現することができる。1以上のCyP領域またはドメインをコードしているヌクレオチド配列を用いて、同様の構造を調製することができる。
【0080】
EMMPRINまたはCyPの適当な領域をコードしているヌクレオチド配列を発現させてかかるポリペプチドを生産するために、種々の宿主発現ベクター系を用いてもよい。得られるペプチドまたはポリペプチドが可溶性誘導体である場合、該ペプチド、ポリペプチドを培養培地から回収することができる。ポリペプチドまたは蛋白質が分泌されない場合、EMMPRINまたはCyP産物を宿主細胞自体から回収することができる。
【0081】
宿主発現ベクター系はまた、EMMPRINまたはCyPまたは機能的等価物を発現する操作された宿主細胞を包含する。かかる発現系からのEMMPRINまたはCyP蛋白質、ペプチドおよび融合蛋白質の精製または濃縮は、当業者によく知られた適当な方法を用いて達成できる。しかしながら、かかる操作された宿主細胞自体は、EMMPRINまたはCyP蛋白質、ペプチドおよび融合蛋白質の構造的および機能的特徴を保持することだけでなく、例えば、薬物スクリーニングアッセイにおいて、生物学的活性を評価することも重要である状況において使用されうる。
【0082】
本発明の目的に使用されうる宿主発現ベクター系は、限定するものではないが、EMMPRINまたはCyPヌクレオチド配列を含有する組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌(例えば、イー・コリ(E. coli)、ビー・ズブチリス(B. subtilis))などの微生物;EMMPRINまたはCyPヌクレオチド配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母(例えば、サッカロマイセス(Saccharomyces)、ピチア(Pichia));EMMPRINまたはCyP配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)で感染させた昆虫細胞系;EMMPRINまたはCyPヌクレオチド配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)で感染させた、またはEMMPRINまたはCyPヌクレオチド配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換された植物細胞系;または哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター、またはワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含有する組換え発現構築物を収容している哺乳動物細胞系(例えば、COS、CHO、BHK、293、3T3、MCF−7、Hs578T)を包含する。
【0083】
細菌系において、EMMPRINまたはCyP遺伝子産物の発現が意図される使用に依存して、いくつかの発現ベクターが有利に選択されうる。例えば、大量のかかる蛋白質を生産しようとする場合、EMMPRINまたはCyP蛋白質、ペプチドおよび融合蛋白質の医薬組成物の生産のために、またはEMMPRINまたはCyP蛋白質に対する抗体を生産するために、容易に精製される融合蛋白質産物の高レベルの発現を指示するベクターが望ましい。かかるベクターは、限定するものではないが、融合蛋白質が生産されるようにEMMPRINまたはCyPAコーディング配列がベクター中にフレーム内においてlacZコーディング領域と個々に連結されうるイー・コリ発現ベクターpUR278(Rutherら、EMBO J. 2:1791, 1983);pINベクター(Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13: 3101−3109, 1985; Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264: 5503−5509, 1989)などを包含する。また、PGEXベクターを使用して、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)との融合蛋白質として外来性ポリペプチドを発現させてもよい。一般に、かかる融合蛋白質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着、次いで、遊離のグルタチオンの存在下での溶離によって溶解細胞から容易に精製することができる。クローン化された標的遺伝子産物をGST部分からはずすことができるように、PGEXベクターは、トロンビンまたは因子Xaプロテアーゼ切断部位を包含するように設計される。
【0084】
別法では、発現されている融合蛋白質に特異的な抗体または他のアフィニティー相互作用の利用がいずれかの融合蛋白質の精製を容易にできるようにする。例えば、ワクシニア発現/アフィニティー精製系は、ヒト細胞系統において発現された非変性融合蛋白質の容易な発現および精製を可能にする(Janknechtら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972−8976, 1991)。該系において、目的の遺伝子のオープンリーディングフレームが翻訳的に6個のヒスチジン残基よりなるアミノ末端タグに融合するように、目的の遺伝子をワクシニア組換えプラスミド中にサブクローン化する。組換えワクシニアウイルスで感染させた細胞由来の抽出物をNi2+:ニトリロ酢酸−アガロースカラム上に負荷し、イミダゾール含有バッファーを用いてヒスチジンタグ付加された蛋白質を選択的に溶出させる。
【0085】
昆虫系
昆虫系において外来遺伝子を発現させるために、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)多角体病ウイルス(AcNPV)をベクターとして用いることができる。該ウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞中で増殖する。EMMPRIN−またはCyP−コーディング配列は、ウイルスの非必須領域(例えば、ポリヒドリン遺伝子)中に個々にクローン化し、AcNPVプロモーター(例えば、ポリヒドリンプロモーター)の調節下に置いてもよい。EMMPRIN−またはCyP−コーディング配列の成功した挿入は、ポリヒドリン遺伝子の不活性化および非閉塞性組換えウイルス(すなわち、ポリヒドリン遺伝子によってコードされるタンパク質性外被を欠くウイルス)の生産をもたらすであろう。次いで、組換えウイルスを用いて細胞を感染させ、ここに、挿入遺伝子を発現させる(Smithら、J. Virol. 46: 584, 1983; Smith, 米国特許第4,215,051号)。
【0086】
哺乳動物宿主細胞において、いくつかのウイルスに基づく発現系を用いてもよい。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、目的のEMMPRINまたはCyPヌクレオチド配列をアデノウイルス転写/翻訳調節複合体、例えば、後期プロモーターおよびトリパータイト(tripartite)リーダー配列に連結してもよい。次いで、該キメラ遺伝子をアデノウイルスゲノム中にイン・ビトロまたはイン・ビボ組換えによって挿入してもよい。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、領域E1またはE3)における挿入は、生存能力があり、かつ、感染宿主においてEMMPRINまたはCyP遺伝子産物を発現できる組換えウイルスをもたらすであろう(Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655−3659, 1984)。特異的開始シグナルもまた、挿入されたEMMPRINまたはCyPヌクレオチド配列の効率のよい翻訳に必要とされうる。これらのシグナルは、ATG開始コドンおよび隣接配列を包含する。それ自体の開始コドンおよび隣接配列を包含する全EMMPRINまたはCyP遺伝子またはcDNAが適当な発現ベクター中に挿入される場合、付加的な翻訳調節シグナルは必要とされないこともある。しかしながら、EMMPRIN−またはCyP−コーディング配列の部分のみが挿入される場合、おそらくATG開始コドンを包含する外来性翻訳調節シグナルが提供されなければならない。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために、所望のコーディング配列のリーディングフレームと共に「フレーム内」になければならない。これらの外来性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の種々の起源であることができる。発現効率は、適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含むことによって増加しうる(Bittnerら、Methods Enzymol. 153: 516−544, 1987)。
【0087】
さらに、挿入配列の発現を変調するか、または所望される特異的様式で遺伝子産物を修飾および加工処理する宿主細胞株を選択してもよい。蛋白質産物のかかる修飾(例えば、グリコシル化)およびプロセッシング(例えば、切断)は、蛋白質の機能にとって重要である。異なる宿主細胞は、蛋白質および遺伝子産物の翻訳後プロセッシングおよび修飾のための特徴的および特異的メカニズムを有する。発現された外来性蛋白質の正確な修飾およびプロセッシングを確実にするために適当な細胞系統または宿主系を選択することができる。したがって、一次転写産物の正しいプロセッシング、グリコシル化、および遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞を用いてもよい。かかる哺乳動物宿主細胞は、限定するものではないが、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、MCF−7、Hs578TおよびWI38細胞系統を包含する。
【0088】
組換え蛋白質の長期間の高収率の生産のために、安定な発現が好ましい。例えば、EMMPRINまたはCyP配列を安定に発現する細胞系統を操作してもよい。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを用いるよりもむしろ、適当な発現調節エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)によって調節されるDNAおよび選択マーカーを用いて宿主細胞を形質転換することができる。外来性DNAの導入後、操作した細胞を栄養培地中で1−2日間増殖させてもよく、次いで、選択培地に移す。組換えプラスミド中の選択マーカーは該選択に対する耐性を与え、細胞の染色体中にプラスミドを安定に組み込ませ、増殖させて、次いで、細胞系統中にクローン化し、膨張することができる細胞増殖巣を形成させる。該方法は、有利なことに、EMMPRINまたはCyP遺伝子産物を発現する安定な細胞系統(例えば、下記実施例2において論じられるCHO−EMM細胞系統)を操作するために使用されうる。かかる操作された細胞系統は、特に、EMMPRIN遺伝子産物の内在活性に影響を及ぼす化合物のスクリーニングおよび評価において有用でありうる。
【0089】
限定するものではないが、各々、tk−、hgprt−またはaprt−細胞において用いることのできるヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ(Wiglerら、Cell 11:223, 1977)、ヒポキサチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. USA 48: 2026, 1962)、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowら、Cell 22: 817, 1980)遺伝子を包含するいくつかの選択系を用いてもよい。また、抗−代謝産物耐性を下記の遺伝子:メソトレキセートに対する耐性を与えるdhfr(Wiglerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567, 1980; O’Hareら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527, 1981);マイコフェノール酸に対する耐性を与えるgpt(Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072, 1981);アミノグリコシドG−418に対する耐性を与えるneo(Colberre−Garapinら、J. Mol. Biol. 150:1, 1981)およびヒグロマイシンに対する耐性を与えるhygro(Santerreら、Gene 30: 147, 1984)の選択の基礎として用いることができる。
【0090】
EMMPRINまたはCyPAポリペプチドに対する抗体
EMMPRINまたはCyPの1以上のエピトープあるいはEMMPRINまたはCyPの保存的変種のエピトープあるいはEMMPRINまたはCyPのペプチドフラグメントを特異的に認識する抗体もまた、本発明に包含される。かかる抗体は、限定するものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb)、ヒト化またはキメラ抗体、1本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fab発現ライブラリーによって生産されるフラグメント、抗−イディオタイプ(抗−Id)抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを包含する。
【0091】
かかる抗体は、正常または異常なEMMPRIN活性の変調のための方法として用いられ(実施例2、5、6および7参照)、したがって、例えば、HIV−1感染、AIDS、RAおよび癌の治療および/または予防のための方法の一部として有用である。
さらに、本発明の抗体は、例えば、生物学的試料中のEMMPRINの検出において用いられるので、EMMPRINの異常量について患者または組織試料を試験しうるところの診断的または予後的技術の一部として有用である。かかる抗体は、また、例えば、EMMPRIN遺伝子産物の発現および/または活性に対する試験化合物の影響を評価するための化合物スクリーニングスキームと一緒に使用される。さらに、かかる抗体は、下記される遺伝子療法技術と一緒に使用して、例えば、正常および/または操作されたEMMPRIN−またはCyP−発現細胞を患者へのその導入前に評価することができる。
【0092】
抗体産生
抗体の産生のために、種々の宿主動物をEMMPRINまたはCyP、EMMPRINまたはCyPペプチド(例えば、膜貫通型、細胞外またはCyP−相互作用ドメインなどのEMMPRINまたはCyPの機能的ドメインに対応するもの)、末端切断型EMMPRINまたはCyPポリペプチド(1以上のドメイン、例えば、膜貫通型またはCyP−相互作用ドメインが欠失しているEMMPRINまたはCyP)、EMMPRINまたはCyPの機能的等価物あるいはEMMPRINまたはCyPの変異体を用いる注射によって免疫化する。かかる宿主動物は、限定するものではないが、ウサギ、マウス、ハムスターおよびラットを包含する。宿主種に依存する種々のアジュバンドを用いて、免疫学的応答を増加させてもよく、該アジュバンドは、限定するものではないが、フロイントの(完全および不完全)アジュバンド、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの表面活性物質、プルロニック(pluronic)ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、スカシガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバンド、例えば、BCG(bacille Calmette−Guerin)およびコリネバクテリウム・パルバム(Corynebacterium parvum)を包含する。
【0093】
ポリクローナル抗体は、免疫化された動物の血清由来の抗体分子の異種集団である。特定の抗原に対する抗体の同種集団であるモノクローナル抗体は、培養中の継続的細胞系統による抗体分子の生産を提供するいずれかの技術によって得られる。これらは、限定するものではないが、KohlerおよびMilstein(Nature 256: 495−497, 1975;および米国特許第4,376,110号)のハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kosborら、Immunology Today 4:72, 1983; Coleら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026−2030, 1983)およびEBV−ハイブリドーマ技術(Coleら、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77−96, 1985)を包含する。かかる抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDおよびそのいずれかのサブクラスを包含するいずれかの免疫グロブリンクラスのものであってもよい。本発明のmAbを生産するハイブリドーマは、イン・ビトロまたはイン・ビボで培養してもよい。イン・ビボでの高力価のmAbの生産により、これは現在の好ましい生産方法とされる。
【0094】
さらに、適当な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を適当な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒にスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の生産のために開発された技術(Morrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851−6855, 1984; Neubergerら、Nature, 312: 604−608, 1984; Takedaら、Nature, 314: 452−454, 1985)を用いることができる。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子、例えば、ネズミmAb由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域(ヒト化)を有する分子である。
【0095】
別法では、1本鎖抗体の生産のために記載された技術(米国特許第4,946,778号;Bird, Science 242:423−426, 1988; Hustonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879−5883, 1988;およびWardら、Nature 334: 544−546, 1989)を、EMMPRINまたはCyP遺伝子産物に対する1本鎖抗体を生産するように適応させる。1本鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してFv領域のH鎖およびL鎖フラグメントを連結することによって形成され、その結果、1本鎖ポリペプチドを生じる。
【0096】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは既知の技術によって生産される。例えば、かかるフラグメントは、限定するものではないが、抗体分子のペプシン消化によって生産されるF(ab’)2フラグメント;およびF(ab’)2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生じるFabフラグメントを包含する。別法では、Fab発現ライブラリーを構築して(Huseら、Science, 246: 1275−1281, 1981)、所望の特異性を用いるモノクローナルFabフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にする。
【0097】
次いで、EMMPRINまたはCyPに対する抗体を利用して、当業者によく知られた技術を用い、EMMPRINまたはCyPを「模倣」する抗−イディオタイプ抗体を生産する(Greenspan & Bona, FASEB J. 7:437−444, 1993; およびNissinoff, J. Immunol. 147: 2429−2438, 1991)。例えば、CyPに結合し、EMMPRINの結合を拮抗的に阻害するEMMPRINまたはCyPに対する抗体を用いて、EMMPRINまたはCyPを「模倣」し、それによって、EMMPRINを結合および中和する抗−イディオタイプを生じる。かかる中和性抗−イディオタイプまたはかかる抗−イディオタイプのFabフラグメントは、EMMPRINを中和するための治療計画において用いられる。
【0098】
別法では、EMMPRIN活性のアンタゴニストとして作用する、すなわち、EMMPRINによる活性化またはシグナリングを阻害するEMMPRINに対する抗体を生産する(下記の実施例2において示される)。かかる抗体は、例えば、HIV−1感染、AIDSおよびAIDS関連障害、RAまたは癌を治療するために、治療上使用される。同様に、EMMPRINのアゴニストとして作用する抗体を生産する。かかる抗体はEMMPRINに結合し、そのシグナル変換活性を活性化する。
【0099】
例えば、HIV−1感染、AIDSおよびAIDS関連障害、RA、癌および局所的または全身性のCyP放出、合成または結合によって特徴付けられる症状の治療において有用な薬物のスクリーニングアッセイ
EMMPRIN活性またはEMMPRIN遺伝子発現を変調し、それいよって、例えば、HIV−1感染、AIDS、RAまたは癌を変調する化合物または組成物を同定するために、多くの異なるアッセイ系(例えば、均一、不均一、細胞ベースおよび非細胞ベース)を設計し、使用できる。下記の系はキット中に処方されてもよい。この目的のために、試薬(例えば、EMMPRINまたはCyP蛋白質あるいはEMMPRINまたはCyP蛋白質を発現している細胞)を種々の容器、例えば、バイアル、チューブ、ミクロタイターウェルプレート、ボトルなどの中にパックする。他の試薬、例えば、正の対照試料、負の対照試料、EMMPRINまたはCyP蛋白質、ペプチド、バッファー、細胞培養培地、抗体などを分離した容器中に入れ、キットを提供することができる。
【0100】
スクリーニングアッセイの基本的な設計および原理
本明細書中で論じられる特定の具体例に限らず、他の当該分野で認識された可能性のなかでも、EMMPRIN、CyPまたはCyP:EMMPRIN複合体に結合するか;CyPとEMMPRINとの間の相互作用を干渉するか;あるいは蛋白質(例えば、HIV−1 MAおよびCA蛋白質)のEMMPRIN−媒介性シグナル変換またはEMMPRIN−媒介性細胞コンパートメント化をもたらす化合物または組成物を同定するために、下記のアッセイが設計される。CyP/EMMPRIN相互作用のアンタゴニストまたはアゴニストとして、あるいはEMMPRIN−媒介性シグナル変換または他のEMMPRIN−媒介性活性の修飾剤として同定された化合物は、例えば、HIV−1感染、AIDSおよびAIDS関連障害、RAまたは癌の治療および予防に対する治療的有用性を有する。
【0101】
CyP/EMMPRIN相互作用を阻害する化合物を同定するためのアッセイの原理は、試験化合物、機能的CyPおよびEMMPRIN蛋白質(または一部、EMMPRIN蛋白質を含む細胞調製物)を含有する反応混合物を調製し、成分が相互作用し、結合する(すなわち、除去および/または検出できる複合体が形成される)のに十分な時間、該反応混合物をインキュベートすることを含む。例えば、アンタゴニスト活性について化合物を試験するために、反応混合物を試験化合物の存在下および不在下で調製する。試験化合物は、最初に反応混合物中に含有されてもよく、またはCyPおよびEMMPRIN蛋白質の添加後に加えられてもよい。対照反応混合物は、試験化合物を用いずにインキュベートするか、または対照薬剤と共にインキュベートする。次いで、いずれかのCyP:EMMPRIN複合体の形成を検出する。対照反応中で複合体が形成するが、試験化合物を含有する反応混合物中では形成しないことは、該化合物がCyP/EMMPRIN相互作用を拮抗することを示す。さらに、試験化合物ならびに正常なCyPおよびEMMPRIN蛋白質を含有する反応混合物内での複合体形成をまた、試験化合物および誘導体化または変異体CyPまたはEMMPRIN蛋白質を含有する反応混合物内での複合体形成と比較してもよい。
【0102】
均一および不均一アッセイフォーマット
CyP/EMMPRIN相互作用のアンタゴニストおよびアゴニストのためのスクリーニングアッセイは、均一または不均一フォーマットのいずれかにおいて行われる。均一アッセイは、細胞ベースまたは非細胞ベースのいずれかであり、ここに、全反応が液相中で行われる。不均一アッセイは、一般に(常にではない;例えば、細胞表面EMMPRINを展示している固定化細胞)非細胞ベースであり、リガンドまたは受容体のいずれかを固相上に固定し、反応の最後に固相上に固定された複合体を検出することを含む。
【0103】
いずれかのアプローチにおいて、反応物の添加順序を変えて、試験されている化合物について異なる情報を得る。例えば、拮抗によって、リガンド/受容体相互作用を干渉する試験化合物は、試験物質の存在下で反応を行うことによって;すなわち、リガンドおよび相互作用する細胞性または細胞外受容体より前または同時に、試験物質を反応混合物に加えることによって同定される。別法では、予め形成された複合体を崩壊させる試験化合物、例えば、該複合体由来の成分の1つを置き換えるより高い結合定数を有する化合物を、リガンド/受容体複合体が形成した後に反応混合物に試験化合物を加えることによって試験する。種々のフォーマットを簡単に下記する。
【0104】
不均一の細胞ベースおよび非細胞ベースアッセイ
不均一アッセイ系において、リガンドあるいは相互作用する細胞または細胞外受容体のいずれかを固体表面上に固定する一方で、非固定種を直接的または間接的に標識する。実際には、ミクロタイタープレートを利用する。固定される種は、非共有または共有結合によって固定される。非共有結合は、固体表面をリガンド、受容体蛋白質または受容体を発現している細胞の溶液で被覆し、所望により乾燥させることによって達成される。別法では、固定されるべき種に特異的な固定化抗体を用いて、固体表面に該種を固定する。該表面は予め調製していてもよい。
【0105】
アッセイは、試験化合物を用いて、または用いないで、被覆された表面に固定された種の結合パートナーを曝露することによって行われる。反応完了後に非反応成分は除去され(例えば、洗浄によって)、形成されたいずれの複合体も固体表面上に固定されたままであろう。
【0106】
固定された複合体の検出は、下記に限定されないいくつかの方法において達成される。第1に、非固定種が予め標識されている場合、固定された標識の検出は複合体が形成されたことを示す。第2に、非固定種が予め標識されていない場合、間接的な標識を用いて固定された複合体を検出する;例えば、最初に固定されない種に特異的な標識抗体を用いる(次いで、抗体は、直接的に標識されるか、または標識された抗−Ig抗体で間接的に標識されてもよい)。反応成分の添加順序に依存して、複合体形成を阻害するか、または予め形成された複合体を崩壊させる試験化合物が検出される。
【0107】
別法では、反応は、試験化合物の存在下または不在下で液相中で行うことができ、反応産物を非反応成分から分離し、次いで、複合体を例えば、溶液中で形成されたいずれかの複合体を固定するための結合成分の1つに特異的な固定化抗体を用い、他の結合パートナーに特異的な別の標識化抗体を用いてかかる固定された複合体を検出することによって、不均一に検出する。複合体形成を阻害するか、または予め形成された複合体を崩壊させる試験化合物は、最初の均一液相中における反応物添加の順序に依存して同定される。
【0108】
例えば、不均一アッセイにおいて、まず、固定化のために、リガンドまたは受容体蛋白質を慣例の組換えDNA技術を用いて調製する。例えば、pGEX−5X−1のような融合ベクターを用いて、得られる融合蛋白質中でその結合活性が維持されるような方法で、リガンド遺伝子コーディング領域をグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)遺伝子に融合する。相互作用する受容体を精製し、放射性異性体125Iで標識できるモノクローナル抗体を生産するために用いる。GST−リガンド融合蛋白質をグルタチオン−アガロースビーズに固定する。次いで、試験化合物の存在下または不在下で、相互作用および結合を起こさせる方法で、相互作用する受容体を加える。反応期間の最後に非結合材料を洗い去り、標識したモノクローナル抗体を該系に加え、複合体化した成分に結合させる。リガンド/受容体相互作用は、グルタチオン−アガロースビーズに結合したままの放射能量を測定することによって検出される。試験化合物による相互作用の阻害の成功は、測定される放射能の減少をもたらす。
【0109】
別法では、GST−リガンド融合蛋白質および相互作用受容体を、固体グルタチオン−アガロースビーズの不在下、液体中で一緒に混合する。該種を相互作用させる間または相互作用させた後に、試験化合物を加える。次いで、該混合物をグルタチオン−アガロースビーズに加え、非結合材料を洗い去る。リガンド/受容体相互作用の阻害の程度を、標識抗体を添加し、ビーズと結合した放射能を測定することによって検出する。
【0110】
したがって、本発明は、細胞ベースおよび非細胞ベースの不均一アッセイを提供し、ここに、組換え発現されたEMMPRIN蛋白質、ポリペプチドまたは融合蛋白質、またはCyP:EMMPRIN複合体、またはEMMPRIN受容体を発現している細胞は固体基質(例えば、試験管、ミクロタイターウェル、またはカラム)に結合している。次いで、試験化合物を、固定化EMMPRIN蛋白質、ポリペプチドまたは融合蛋白質、またはCyP:EMMPRIN複合体のいずれかに結合できるその能力について、またはCyP蛋白質、ポリペプチドまたは融合蛋白質の固定化EMMPRIN蛋白質、ポリペプチドまたは融合蛋白質への結合を拮抗または促進できるその能力についてアッセイする。
【0111】
したがって、EMMPRINとEMMPRINリガンド、例えば、CyPAまたはCyPBとの間の相互作用を模倣する化合物を同定するためのスクリーンが設計される。かかるスクリーンにおいて、試験化合物を標識し、固定化EMMPRIN蛋白質、ポリペプチドまたは融合蛋白質に結合できるその能力についてアッセイする。本発明の別の態様において、EMMPRINとEMMPRINリガンド、例えば、CyPAまたはCyPBとの間の相互作用を拮抗する化合物を同定するためのスクリーンが設計される。かかるスクリーンにおいて、EMMPRINリガンドを標識し、試験化合物を、標識リガンドのEMMPRINへの結合を拮抗できるその能力についいてアッセイする。
【0112】
均一の細胞ベースおよび非細胞ベースアッセイ
均一アッセイは、細胞ベースまたは非細胞ベースのいずれかであり、ここに、全反応を液相中で行う。
細胞ベースアッセイ
均一の細胞ベースアッセイ系を用いて、例えば、HIV−1感染、AIDS、RAまたは癌の治療のための化合物を同定するために、EMMPRINの活性を変調する化合物についてスクリーンする。この目的のために、EMMPRINまたはCyPを内在性発現する細胞を化合物のスクリーンに用いる。別法では、293細胞、COS細胞、CHO細胞、MCF−7細胞、Hs578T細胞、繊維芽細胞などの細胞系統を遺伝子操作してEMMPRINまたはCyPを発現させて、スクリーニング目的に用いる。好ましくは、CyPまたはCyPペプチドまたは融合蛋白質による活性化に応答する機能的EMMPRIN蛋白質を発現するように遺伝子操作された宿主細胞をアッセイの終了点として用いる。かかる終了点は、例えば、化学的、生理学的、生物学的、または表現型特性における当該分野で認識された変化、例えば、宿主細胞遺伝子またはレポーター遺伝子(例えば、MMPs)の誘導、cAMPレベル、アデニリルシクラーゼ活性、カルシウム動員、宿主細胞G−蛋白質活性、宿主細胞キナーゼ活性、シグナル変換経路の活性化、細胞外酸性化率、増殖、分化、ウイルス感染に対する感受性、受容体改変(例えば、感作、脱感作、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション)などの測定によって提供される。
【0113】
スクリーニングアッセイにおいて有用であるためには、機能的EMMPRINまたはCyP蛋白質を発現している宿主細胞は、有意なEMMPRINに基づく終了点応答、好ましくはバックグラウンドより5倍大きい誘導を提供すべきである。EMMPRINに基づく誘導応答を最大化するために、宿主細胞は、好ましくは、その読出しに依存していくつかの特徴を有する。例えば、CREレポーター遺伝子の誘導を検出するために、(a)低い天然レベルのcAMP、(b)高レベルのアデニリルシクラーゼ、(c)高レベルの蛋白質キナーゼA、(d)低レベルのホスホジエステラーゼおよび(e)高レベルのcAMP応答エレメント結合蛋白質を含む1組のアッセイ条件が有益である。さらに、CRE受容体の誘導のための別の経路を排除して基底レベルを減少させる。EMMPRINに基づく応答を増加させるために、より大量の好ましい因子(例えば、EMMPRINアンタゴニストとして作用する化合物についてスクリーニングする場合、増強されたまたは構造的EMMPRINおよび/またはCyP発現)またはより少量の好ましくない因子(例えば、EMMPRINアゴニストについてスクリーニングする場合、増強されたCyP発現)を発現するように宿主細胞を操作する。
【0114】
かかる細胞系の使用において、EMMPRINまたはCyP蛋白質を発現している細胞を試験化合物または対照に曝露する。曝露後、細胞をアッセイしてEMMPRINシグナル変換経路の成分の発現および/または活性を測定する。別法では、シグナル変換経路自体の活性をアッセイする。例えば、曝露後、細胞溶解物をカルシウム動員(実施例3参照)、cAMPの誘導、または蛋白質チロシンキナーゼ(PTK)(実施例3)、セリン/スレオニンキナーゼ、g−蛋白質、Ras、PKA、RAP1、B−Raf、Mek、またはMAPK活性またはリン酸化の変調についてアッセイする。特定のシグナル変換経路および上流のアクチベーターの活性化または不活化は多くの転写因子の活性化または不活化を導くことができ、それは、次いで、特に細胞増殖、分化、休止または死の媒介となることができる。これは、小型GTP−結合蛋白質、Rap1上の活性部位のPKAのリン酸化ならびにその後のセリン/スレオニンキナーゼ、B−RafおよびMAPKの活性化を導くMAPKキナーゼ、Mekの活性化によるPC12細胞の神経細胞分化において例示される。この同じ経路は、特定の前立腺癌細胞系統、例えばLNCaPおよびPC−3MのNE分化に関係している。
【0115】
EMMPRINのアゴニストとして作用しうる化合物についてのスクリーニングにおいて、CyPをほとんど発現しないか、または発現しない細胞系統を用いて、対照と比較した試験化合物によるシグナル変換の活性化について試験することが有利である。EMMPRINのアンタゴニストとして作用する化合物についてのスクリーニングにおいて、CyPを過剰発現させるか、または外来性CyPを提供して、対照と比較した試験化合物によるシグナル変換の阻害について試験することが有利である。
【0116】
EMMPRINは、新たな感染後初期にHIV−1マトリックス(MA)およびキャプシド(CA)蛋白質の正常な細胞内移動の媒介となることが本明細書中に示された(実施例6および実施例7E)。よって、別の具体例において、試験化合物は、ウイルス感染後のHIV−1マトリックス(MA)およびキャプシド(CA)蛋白質の細胞内移動を調節するその能力に基づいて選択される。
【0117】
非細胞ベースアッセイ
均一な細胞ベースアッセイのほかに、均一な非細胞ベースアッセイ系を用いて、EMMPRIN、CyPまたはCyP:EMMPRIN複合体と相互作用する、例えば、それらに結合する化合物を同定する。かかる化合物は、EMMPRIN活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し、例えば、HIV−1感染、AIDS、RAまたは癌の治療において使用される。組換えEMMPRIN蛋白質、ポリペプチド、融合蛋白質または可溶性EMMPRIN蛋白質を発現させ、非細胞ベースアッセイにおいて利用して(CyP蛋白質、ポリペプチドまたは融合蛋白質を用いて、または用いずに)、EMMPRIN、CyPまたはCyP:EMMPRIN複合体に結合する化合物を同定する。別法では、1以上のEMMPRINまたはCyPドメインに対応するポリペプチド、または1以上のEMMPRINまたはCyPドメインを含有する融合蛋白質を非細胞ベースアッセイ系において用いて、EMMPRIN、CyPまたはCyP:EMMPRIN複合体に結合する化合物を同定する。同定された化合物は、EMMPRIN媒介性活性、例えば、シグナル変換を変調するのに治療上有用である。
【0118】
例えば、蛍光レポーター部分に基づくアッセイが均一の非細胞ベースアッセイの例である。かかるアッセイは、例えば、蛍光「レポーター部分」および「クエンチャー部分」を含み、その各々がリンカー部分(例えば、フォスフォルアミダイト、または当該分野で使用可能な他の適当なリンカー)に共有結合し、それにより、各々が相互作用蛋白質対の1メンバーに互いに結合する(例えば、レポーター部分はリガンドに結合し、クエンチャー部分は相互作用受容体に結合した)。適当なレポーターおよびクエンチャー分子の例は、5’蛍光レポーター色素6FAM(「FAM」;2,7−ジメトキシ−4,5−ジクロロ−6−カルボキシ−フルオレセイン)、TET(6−カルボキシ−4,7,2’,7’−テトラクロロフルオレセイン)および3’クエンチャー色素TAMRA(6−カルボキシテトラメチルローダミン)(Livakら、PCR Methods Appl. 4: 357−362, 1995; Gibsonら、Genome Res. 6: 995−1001;およびHeidら、Genome Res. 6:986−994, 1996)。
【0119】
レポーターおよびクエンチャー部分が極めて接近している場合、レポーター部分発光はクエンチング部分へ効率よく移動し、蛍光−発光スペクトル(例えば、518nm)はクエンチされるかまたは遮蔽される。しかしながら、分離すると、レポーター部分発光はもはやクエンチング部分へ効率よく移動せず、その結果、レポーター部分蛍光−発光スペクトルの増加をもたらす。典型的には、反応の間、クエンチング部分(例えば、TAMRA)の蛍光強度があまり変化しないような蛍光色素が選択される。マグネシウムおよび塩濃度、反応条件(時間および温度)、蛋白質配列、大きさおよび組成を包含するいくつかの因子は、かかる蛍光に基づくアッセイの効率に影響を及ぼす。所定のゲノム座について最適な蛍光強度を生じるためのこれらの因子の最適化は、当業者に明らかである。
【0120】
したがって、本発明に包含される1の具体例において、予め形成されたCyP:EMMPRIN複合体を調製し、ここに、CyPまたはEMMPRINのいずれか(または両方)は適当な蛍光タグで標識されており、複合体形成のために標識またはタグにより生じるシグナルはクエンチされる(例えば、米国特許第4,109,496号参照)。予め形成された複合体由来の種の1つと競合し、それを置換する試験物質の添加は、バックグラウンドより大きいシグナルの生成をもたらす。このように、CyP:EMMPRIN相互作用を拮抗する試験物質が同定される。
【0121】
スクリーニング化合物
上記のアッセイを用いて、EMMPRINまたはCyP:EMMPRIN複合体活性に影響を及ぼす化合物を同定する。例えば、EMMPRINまたはCyP:EMMPRIN複合体活性に影響を及ぼす化合物は、限定するものではないが、EMMPRINに結合して天然リガンド(CyP)の結合を阻害するかまたは阻害せず、シグナル変換を活性化する(アゴニスト)かまたは活性化を阻害する(アンタゴニスト)化合物、およびCyP(例えば、可溶性EMMPRIN蛋白質またはペプチド、またはCsA誘導体)に結合し、それにより、CyP−媒介性EMMPRIN活性を拮抗または増強する化合物を包含する。
【0122】
EMMPRINシグナル変換を変調する化合物(例えば、下流のシグナリング事象、カルシウム動員(実施例3参照)、cAMPの誘導、蛋白質チロシンキナーゼ(PTK)(実施例3)またはセリン/スレオニンキナーゼ、G蛋白質、Ras、PKA、RAP1、B−Raf、MekまたはMAPK活性またはリン酸化の変調(それは、CyPがEMMPRINに結合することによって活性化されるシグナルの変換に関係しうる)に影響を及ぼす化合物)もまた、本発明のアッセイ法によって同定される。本発明は、EMMPRINの下流のシグナリング事象に影響を及ぼし、よって、CyPおよびEMMPRINのHIV感染、AIDS、RAおよび癌に対する影響を変調するような化合物の同定および使用を提供する。
【0123】
しかしながら、EMMPRIN遺伝子活性に影響を及ぼす化合物(EMMPRIN遺伝子発現に影響を及ぼすことによって、転写に影響を及ぼすかまたはスプライス事象を干渉し、その結果、全長または末端切断型のEMMPRINの発現を変調できる分子、例えば、蛋白質または小型有機分子を包含する)もまた、本発明のアッセイ法によって同定される。
【0124】
本発明にしたがってスクリーンされる化合物は、限定するものではないが、EMMPRINまたはCyP:EMMPRIN複合体に結合し、CyPによって引き起こされる活性を模倣する(すなわち、アゴニスト)かまたはCyPによって引き起こされる活性を阻害する(すなわち、アンタゴニスト)ペプチド、抗体およびそのフラグメント、および他の有機化合物(例えば、ペプチド模倣物);ならびにCyPに結合し、それにより、CyP−媒介性EMMPRIN活性を「活性化」または「中和」するペプチド、抗体またはそのフラグメント、および他の有機化合物(変異体または末端切断型EMMPRIN分子(またはその一部)を包含する)を包含する。化合物は、限定するものではないが、ランダムペプチドライブラリー;(Lamら、Nature 354: 82−84, 1991; Houghtenら、Nature 354: 84−86, 1991)、およびD−および/またはL−配置アミノ酸、ホスホペプチド(限定するものではないが、ランダムまたは部分変性した特異的(directed)ホスホペプチドライブラリーを包含する;例えば、Songyangら、Cell 72: 67−778, 1993)、抗体(限定するものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗−イディオタイプ、キメラまたは1本鎖抗体、およびFAb、F(ab’)2およびFAb発現ライブラリーフラグメント、およびそのエピトープ結合フラグメントを包含する)および小型有機または無機分子より作成されるコンビナトリアル化学に由来する分子ライブラリーのメンバーを包含するがそれに限定されるものではないペプチド、例えば可溶性ペプチドを包含する。本発明にしたがってスクリーンされる他の化合物は、限定するものではないが、血脳関門を横切り、適当な細胞中へ侵入し、(例えば、遺伝子発現に関与する調節領域または転写因子と相互作用することにより)EMMPRIN遺伝子またはEMMPRINシグナル変換経路に関与するいくつかの他の遺伝子の発現に影響を及ぼすことのできる小型有機分子;またはEMMPRINの活性またはEMMPRINシグナル変換経路に関与するいくつかの他の細胞内因子の活性(例えば、カルシウム動員、cAMPの誘導、蛋白質チロシンキナーゼ(PTK)、セリン/スレオニンキナーゼ、G蛋白質、Ras、PKA、RAP1、B−Raf、MekまたはMAPK活性またはリン酸化の変調)に影響を及ぼすような化合物を包含する。
【0125】
また、CyP/EMMPRIN相互作用の同定により、当該分野で認められたコンピューターモデリング(例えば、X線結晶学、NMRに基づいた活性部位モデリングなど)およびデータベース検索技術を応用して、EMMPRIN発現または活性を変調できる化合物の同定、またはすでに同定された該化合物の改善が可能となる。
【0126】
医薬処方および癌の治療法
CyP−媒介性EMMPRIN活性、例えば、EMMPRIN−媒介性シグナル変換を減少または増強する本発明のアッセイにおいて同定された化合物を用いて、例えば、HIV−1感染、AIDSおよびAIDS関連障害、RAまたは癌を治療することができる。特定の方法、処方および投与様式は、治療上の徴候、および化合物の物理化学的特性、および標的器官または組織に依存するであろう。異なるアプローチが議論される。
【0127】
本発明によると、治療上関連のあるEMMPRIN発現細胞のイン・ビトロでの抗−CD147mAbを用いる処理は、HIV−1による感染を阻害しただけでなく、CyP−媒介性EMMPRINシグナル変換をも阻害した(実施例2、3、5、6および7参照)。したがって、適当な患者におけるイン・ビボでのCyP−媒介性EMMPRIN活性の拮抗(例えば、抗−EMMPRIN抗体の投与による、または下流のシグナリング事象を標的とすることによって)は、例えば、HIV−1感染、AIDSおよびAIDS関連障害、RAまたは癌の治療において有用であろう。別法では、CyP−媒介性EMMPRIN活性のアゴニストは、例えば、正常な組織リモデリング過程を増強するのに有用である。
【0128】
治療化合物のCyP/EMMPRIN相互作用に対する絶対的な特異性が明らかである必要はない。例えば、EMMPRINおよび他の未知のCyP相互作用分子の両方を作動する化合物を使用することができた。かかる化合物は、例えばHIV−1感染、AIDS、RAまたは癌治療を達成するように、関節、血液、胸部組織、前立腺またはその他へのデリバリーが最も効果的になるように、および潜在的な副作用が最小限になるように、投与することができた。CyP/EMMPRIN相互作用に対する特異性が明らかではない化合物は、他の分子(例えば、他のCyP相互作用蛋白質)の変調に起因しうる副作用を制御するための別の療法または薬剤と共に投与することができるが、CyP/EMMPRIN相互作用に対する優先性または選択性が明らかな化合物が好ましい。
【0129】
投与量決定
かかる化合物の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物において、例えば、LD50(集団の50%までの致死量)およびED50(集団の50%における治療上有効な投与量)を決定するための標準的な医薬および毒物学的手法によって決定される。毒性および治療的効果の間の投与量比は治療的指標であり、それは、LD50/ED50比として表すことができる。大きい治療的指標を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を用いてもよいが、非感染細胞への損傷の可能性を最小限にし、それにより副作用を減少させるために、かかる化合物が冒された組織の部位を標的とするデリバリーシステムを設計するよう取り計らうべきである。
【0130】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量範囲を計画するのに使用される。かかる化合物の投与量は、好ましくは、毒性をほとんど伴わないか、または毒性を伴わないED50を包含する循環濃度の範囲内にある。該投与量は、使用される投薬形態および利用される投与経路に依存して該範囲内で変化してもよい。本発明の方法で使用されるいずれかの化合物の場合、治療上有効な投与量は典型的に、細胞培養アッセイから最初に見積もられる。投与量は、細胞培養において決定されるIC50(すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度)を包含する循環血漿濃度範囲に達するように、動物モデルにおいて処方されてもよい。かかる情報を用いて、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定する。例えば、高速液体クロマトグラフィーによって、血漿中レベルを測定する。治療上有効な投与量はさらに、HIV感染を阻害するのに十分な化合物の量をいう。治療上有効な投与量は、単独で、またはHIV感染もしくは関連疾患のための他の治療と組み合わせて補助療法として投与されてもよい。
【0131】
治療上有効な投与量はさらに、HIV感染を阻害する、またはAIDS−、RA−もしくは癌−関連過程の進行を阻害するのに十分な化合物の量をいう。治療上有効な投与量は、単独で、またはHIV感染もしくは関連疾患のための他の治療と組み合わせて補助療法として投与されてもよい。
【0132】
処方および使用
本発明の化合物の処方および投与のための技術は、例えば、”Remington’s Pharmaceutical Sciences” Mack Publishing Co., Easton, PA, 最新版において見出される。本発明にしたがう使用のための医薬組成物は、1以上の生理学上許容される担体または賦形剤を用いて常法において処方される。
したがって、該化合物およびその生理学上許容される塩および溶媒和物は、例えば、吸入または吹き入れ(口または鼻を介する)、経口、バッカル、直腸、経粘膜、または腸内投与、粘膜内、皮下、骨髄内注射ならびにくも膜下、直接的脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射を包含する非経口デリバリーを包含する適当な経路を介する投与のために処方され、デポーまたは徐放性製剤に処方されてもよい。さらに、本発明の薬剤を標的とされるドラッグデリバリーシステムにおいて、例えば、抗−CD4抗体で被覆したリポソームにおいて投与してもよい。かかるリポソームは、CD4を発現している細胞を標的とし、該細胞によって選択的に拾い上げられる。
【0133】
経口投与の場合、医薬組成物は、医薬錠許容される賦形剤、例えば:結合剤(例えば、糊化トウモロコシ澱粉、コムギ澱粉、コメ澱粉、ジャガイモ澱粉、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および/またはポリビニルピロリドン(PVP);充填剤(例えば、ラクトース、シュークロース、マンニトール、またはソルビトール、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム);滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ);崩壊剤(例えば、ジャガイモ澱粉、澱粉グリコール酸ナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩、例えば、アルギン酸ナトリウム);または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)を用いて常法によって調製される、例えば、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などの形態をとる。錠剤は、当該分野でよく知られた方法によって被覆される。経口投与用の液体調製物は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液であり、またはそれらは、使用前に水または他の適当なビヒクルで復元するための乾燥産物として提供されてもよい。かかる液体調製物は、医薬上許容される添加物、例えば、懸濁化剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素添加食用脂肪);乳化剤(例えば、レシチンまたはアラビアゴム);非水性ビヒクル(例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分別植物油);および保存料(例えば、メチルまたはプロピル−p−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸)を用いて常法によって調製される。該調製物はまた、緩衝塩、フレーバー、着色料および甘味料を適宜含有していてもよい。経口投与用調製物は、活性化合物の制御された放出を与えるように適当に処方されうる。バッカル投与の場合、組成物は、常法において処方される錠剤またはロゼンジの形態をとっていてもよい。
【0134】
吸入による投与の場合、本発明による使用のための化合物は、通常、適当なプロペラント、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガスを用いて、加圧パックまたはネブライザーから与えられるエーロゾルスプレーの形態でデリバリーされる。加圧エーロゾルの場合、投薬単位は、計量した量をデリバリーするためのバルブを提供することによって決定されうる。吸入器または吹き入れ器中において使用するための化合物と適当な粉末基剤、例えば、ラクトースまたは澱粉の粉末混合物を含有しているゼラチンのカプセルおよびカートリッジを処方してもよい。
【0135】
注射の場合、本発明の薬剤を水性溶液、好ましくは生理学上相溶性のバッファー、例えば、ハンク溶液、リンガー溶液または生理学的セーラインバッファー中で処方してもよい。
化合物は、ボーラス注射による注射または連続的注入による非経口投与用に処方されてもよい。注射用処方は、保存料を添加したアンプルまたは複数回投与量用の容器中における単位投与量形態において提供されうる。非経口投与用の医薬処方は、水溶性形態における活性化合物の水溶液を包含する。さらに、活性化合物の懸濁液は、適当な油性注射懸濁液として調製されうる。適当な脂肪親和性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを包含する。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘性を増加する物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含有しうる。所望により、懸濁液はまた、高濃度溶液の調製可能とするために、適当な安定化剤または化合物の可溶性を増加させる薬剤を含有してもよい。
【0136】
経粘膜投与の場合、浸透されるべき障壁に適当な浸透剤を処方に用いる。
さらに、化合物はまた、デポー製剤として処方されうる。かかる長期作用性処方は、植え込みによって(例えば、皮下または筋内に)または筋内注射によって投与されうる。したがって、例えば、化合物は、適当な高分子または疎水性材料(例えば、許容できる油中のエマルジョンとして)またはイオン交換樹脂と共に、または可溶性の乏しい誘導体として、例えば、可溶性の乏しい塩として処方されうる。
【0137】
CyP/EMMPRIN相互作用のモジュレーターとして同定された本発明の化合物の多くは、医薬上適合性のカウンターイオンとの塩として提供されうる。医薬上適合性の塩は、限定するものではないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを包含する多くの酸または塩基と共に形成されうる。塩は、対応する遊離の塩基形態である水性または他のプロトン性溶媒中でより可溶性である傾向がある。医薬上許容される塩、担体または賦形剤の例は、当業者によく知られており、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A.R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990において見出すことができる。かかる塩は、限定するものではないが、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、塩化水素、臭化水素、ヨウ化水素、酢酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩などを包含する。
【0138】
所望により、化合物を、活性成分を含有する1以上の単位投与形態を含有しうるパックまたはディスペンサー装置中に提供してもよい。パックは、例えば、金属またはプラスチック箔、例えばブリスターパックを含みうる。パックまたはディスペンサー装置には、投与説明書が付随しうる。
【0139】
EMMPRIN活性を制御し、HIV−1感染、AIDSおよびAIDS関連障害、RA、癌または局所的もしくは全身性のCyP放出、合成もしくは結合によって特徴付けられる他の症状を治療または予防することに対する細胞ベースの遺伝子療法アプローチ
患者におけるEMMPRIN遺伝子発現および/またはEMMPRIN活性の全レベルを変調するために利用されうる付加的な方法は、可溶性EMMPRINまたはCyPドメイン、その融合蛋白質(例えば、EMMPRINまたはCyPの融合Ig分子)、またはシクロフィリン(CyPを包含する)変異体、例えばCyP/EMMPRIN相互作用を干渉することによって、HIV感染またはEMMPRIN媒介性シグナル変換を阻害するEMMPRINまたはCyPの分子デコイまたは他の模倣物を発現する適当な組換え(遺伝子操作された)または非組換え細胞の導入を包含する。かかる細胞、好ましくは自己細胞は、適当な解剖学上の部位に(例えば、RA関節に)、またはそれらが可溶性分子の供給をデリバリーする「バイオリアクター」として機能しうる体内の異なる部位に配置される組織移植片の一部として、イン・ビボで投与される。かかる可溶性EMMPRINまたはCyPポリペプチドおよび融合蛋白質は、適当な濃度で発現される場合、内在性EMMPRIN活性を拮抗または作動することにおいて、あるいは場合により、EMMPRINの天然リガンド(すなわち、CyP)を中和、「排除」または「活性化」することにおいて有用であり、かくして、例えば、HIV−1感染、AIDSおよびAIDS関連障害、RAおよび癌の治療のために、EMMPRIN活性のモジュレーターとして作用する。かかる細胞ベースの遺伝子療法技術は、当業者によく知られている(Andersonら、米国特許第5,399,349号;Mulligan & Wilson, 米国特許第5,460,959号)。例えば、これらの方法は、近年、ヒト糖尿病の治療への応用が成功し、それにより、糖尿病患者は、インスリン分泌性膵臓小島細胞の移植(生着)によって毎日のインスリン注射から開放された(Shapiroら、N. Engl. J. Med. 343: 230−238, 2000)。
【0140】
実施例1
EMMPRINはCyP相互作用蛋白質である。
該実施例は、CyPAを「餌(bait)」として(すなわち、相互作用標的として)用いる酵母2−ハイブリッドプロトコール(Clontech Laboratories, Inc.; Palo Alto, CA)を用いるイン・ビトロ実験を提供して、Bリンパ球から調製されたcDNA「捕獲(prey)」ライブラリーをスクリーニングすることによってCyPA−相互作用蛋白質を同定する。特に、以前に知られた膜貫通蛋白質EMMPRINは、本発明の該具体例においてCyPA−相互作用蛋白質として同定された。
【0141】
方法 酵母2−ハイブリッドスクリーニング
簡単に言うと、ヒトCyPAとして同定された「発現された配列タグ」をATCC(ATCC#78809D)から得た。イン・ビトロでの翻訳および配列決定は、該配列が全長CyPA cDNA(本質的にGenBank#Y00052と相同性)を示すことを確認した。配列をベクターpAS2−1(ClonTech)中にクローン化して、CyPA−GAL4 DNA結合ドメイン(BD)融合蛋白質をコードしているプラスミドpAS2−1−CyPAを作成した。該プラスミドを「餌」として用いて、GAL4活性化ドメイン(AD)をコードしているpSE1107中に構築されたヒトB−細胞cDNAライブラリー(すなわち、「捕獲」ライブラリー)(Dr. S. Fields, SUNY, Stony Brook由来)(ライブラリー複雑度≒108)をスクリーンした。
【0142】
スクリーニングは、MATCHMAKERTM(登録商標)2−ハイブリッドシステム2(Clontech Laboratories, Inc.; Palo Alto,CA)を用いて本質的に製造者による示唆通りに行った。対照実験において、pAS2−1−CypAは、酵母レポーター宿主株(Y187またはY190)中に単独で導入された場合、または「空の」GAL4活性化ドメイン(AD)ベクター(pACT2,Clontench)と同時形質転換した場合、GAL4プロモーター由来の転写を活性化しなかった(ベータ−ガラクトシダーゼ活性として測定された)(負の対照)。pAS2−1−CypAがpGAD424−GAG構築物(全長HIV−1gag蛋白質とGAL4 ADとの間の融合を発現している;Luban ら、Cell 73: 1067−1078, 1993)と同時形質転換された場合に、強力な正のシグナルが検出された(正の対照)。実際のスクリーニングは、pAS2−1−CypAをpSE1107−細胞ライブラリーと一緒にY190酵母レポーター宿主株中へ同時形質転換することによって行われた。相互作用性同時形質転換体についての選択は、3連のドロップ−アウトプレート(SD/−His/−Trp/−Leu)上に培養物を播種し、次いで、標準的なフィルターアッセイプロトコールによりlacZレポーター遺伝子の発現についてコロニーを試験することによって行った。全ての青色コロニーをさらに、ClonTechプロトコールにたがってシクロヘキシイミドカウンター−選択によってスクリーンして、偽陽性を同定した。最後に、真の陽性コロニー由来のプラスミドを単離し、配列決定した。
【0143】
単離したEMPRINクローン
約106個のcDNAクローンをスクリーンした。数ラウンドのスクリーニングの後、10個のクローンを真の陽性として選択し(上記の「方法」を参照)、配列決定した。該スクリーンにおいて比較的強く相互作用したクローンのうち1つは、その配列決定された5’側の186個のヌクレオチドにおいてヒト細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導因子(EMMPRIN)cDNA(DeCastroら、J. Invest. Dermatol. 106: 1260−1265, 1996)と97%同一であるインサートを有した。EMMPRINは、CyPA相互作用性クローンのなかで唯一の膜貫通蛋白質であり、それによりCyPA受容体という役目の良好な候補物質とされたので、さらなる分析のために選択された(図1)。EMMPRIN(ヒト)のDNAおよび蛋白質配列を各々、配列番号1および配列番号2に示す。
【0144】
EMMPRINは、50−60kDaの分子量および特徴的なシグナルペプチド(sp)、細胞外(ecd)、膜貫通(tm)および細胞内(icd)ドメインを有する269−アミノ酸の高度にグリコシル化された細胞表面蛋白質である(図1、左パネル)。構造的に、EMMPRINは免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリーに属する(Miyauchiら、J. Biochem. (Tokyo) 107: 316−323, 1990; Kasinrerkら、J. Immunol. 149: 847−854, 1992)。別法では、EMMPRINは、ヒトにおいてCD147、バシジン(basigin)およびM6−抗原(Miyauchiら、J. Biochem. (Tokyo) 107: 316−323, 1990; Kasinrerkら、J. Immunol. 149: 847−854, 1992)、ニワトリにおいてニューロセリンおよびHT7(Albrechtら、Brain Res. 535: 49−61, 1990)、マウス胚においてバシジンおよびgp42蛋白質(Altrudaら、Gene 85: 445−451, 1989; Igakuraら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 224: 33−36, 1996)およびラットにおいてOX−47(Fossumら、Eur. J. Immunol. 21: 671−679, 1991)細胞ともいう。これらの分子の全てに関するアミノ酸配列および予測第三構造は、高いホモロジーおよび決定的なアミノ酸の保存を共有する。
【0145】
EMMPRINは、いくつかの腫瘍細胞の細胞表面上に発現され、それにより、培養中、非常に高レベルのコラゲナーゼ活性を生じるように繊維芽細胞を刺激する(Biswasら、Cancer Res. 55: 434−439, 1995)。コラゲナーゼおよび他のメタロプロテイナーゼの分泌は、基底膜の細胞外マトリックス成分の分解、腫瘍細胞侵入および転移における決定的な工程を導き、慢性関節リウマチにおける軟骨崩壊に寄与する(McCachren, Arthritis Rheum. 34: 1085−1093, 1991; Firestein, Arthritis Rheum. 39: 1781−1790, 1996)。
【0146】
EMMPRINはまた、幅広い正常細胞において発現される。例えば、EMMPRINは、網膜発達におけるニューロン−グリア細胞相互作用(Fadool & Linser, Dev. Dyn. 196: 252−262, 1993)および免疫応答および細胞−細胞認識の調節(Berditchevskiら、J. Biol. Chem. 272: 29174−29180, 1997)に関与することが知られている。バシジン欠失マウスは、両性の生殖不能症を示し、短期間の記憶および学習における欠陥を示す(Igakuraら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 224: 33−3649, 1996)。EMMPRINの発現は、PHAによるT細胞活性化においてアップレギュレートされる。該アップレギュレーションは、該表面におけるEMMPRINの二量体化を導き、それにより、容易に抗体認識可能になる(Edwards & Hallett, Immunol. Today 18: 320−324, 1997)。
【0147】
EMMPRINがCyPA結合蛋白質である確認
本発明の別の具体例において、固定化CyPAおよびイン・ビトロで転写および翻訳された[35S]−標識化EMMPRINを用いてアフィニティー樹脂結合分析を行って、酵母2−ハイブリッド実験において観察されたEMMPRIN−CyPA相互作用を確認した。図1は、[35S]−標識化EMMPRINが特にCyPA−誘導体化セファロースビーズによって保持されたことを示す(図1、右側のパネル)。
【0148】
方法 [35S]−標識化EMMPRINの調製
EMM.C1(ecd、tmおよびicdドメインを含有する)およびEMM.C2(tmおよびicdドメインを欠く)フラグメントをpT7Blueベクター中にクローン化し、標準的なPromegaプロトコールにしたがって、TnT−結合型網状赤血球ライゼートシステム(Promega)を用いる結合型イン・ビトロ転写−翻訳反応に付した。
【0149】
CyPAアフィニティービーズの調製および結合反応条件
CyPAアフィニティー樹脂は、製造者の指示書にしたがって、組換え体ヒトCyPAをセファロースに結合させることによって調製した。簡単に言うと、1gの凍結乾燥したCNBr−活性化セファロース4B(Pharmacia; Piscataway, NJ)を1mM HCl中で再水和し、焼結ガラス漏斗上、1mM HCl(200ml/g凍結乾燥粉末)で15分間洗浄した。洗浄した樹脂を、3.3mlの0.1M NaHCO3/0.5M NaClバッファー(pH8)中に溶解した6mgの組換え体ヒトCyPAと混合した。混合物を室温で2時間振盪し、そのとき、0.15mlの1Mエタノールアミン−HCl(pH9.0)を加え、混合物をさらに2時間振盪させて過剰の反応性基をクエンチし、次いで、樹脂を三サイクルの別のpHで広範囲に洗浄した。対照樹脂は、最初のカップリング工程の間にCyPAが加えられなかったことをのぞき、同様に処理された。結合反応は、結合バッファー(20mM HEPES,pH6.8;150mM KOAc;2mM Mg(OAc)2;2mM DTT;0.1%Tween20;0.1mM PMSF,1μg/mlアプロチニン,1μg/mlペプスタチン)中、室温で90分間行った。
【0150】
EMMPRINは、CyPA−被覆セファロースビーズによって特異的に保持された。
[35S]−標識化EMMPRINのアリコートをCyPAアフィニティー樹脂または対照樹脂と一緒にインキュベートした。結合した蛋白質を標準Laemmliバッファーで溶出し、電気泳動およびオートラジオグラフィーによって明らかにした(図1、右側のパネル)。[35S]−標識化EMMPRINは、CyPAセファロースビーズによって特異的に保持されたが、CyPAを欠く対照ビーズには保持されなかった。
【0151】
該特異的なイン・ビトロ結合相互作用は、全長EMMPRIN構築物EMM.C2(ecd、tmおよびicdドメインを含有する)でのみ観察され、tmおよびicdドメインを欠くEMM.C1 EMMPRIN構築物では観察されなかった。さらに、CyPAは、無傷細胞上の細胞表面EMMPRINに結合し、細胞内シグナリングを誘導する(下記参照)。これらの結果は、おそらく、セファロースビーズ上のCyPAに対するecd CyP−結合部位の適当な提示のためにEMMPRIN膜貫通および/または細胞内ドメインが必要であること、またはCyPAが直接tmドメインと、ecdまたはtmドメインのいずれかと、または両方のドメインと相互作用するメカニズムを反映する。
【0152】
実施例2
EMMPRINはCyPAに対するシグナリング受容体である。
該実施例は、EMMPRIN−トランスフェクトCHO細胞が高レベルのEMMPRINを細胞表面上に発現したこと、CyPAおよびCyPBがかかるCHO−EMMPRIN細胞においてCa2+動員を誘導したこと、およびかかるCHO−EMMPRIN細胞におけるCyPにより誘導されるCa2+動員が抗−EMMPRIN抗体の添加によって阻害されたことを明らかにし、EMMPRINがCyPのシグナリング受容体であることを示すイン・ビトロ実験およびアッセイを提供する。
【0153】
実施例1の具体例に示される結果(図1)は、イン・ビトロで発現されたEMMPRINがセファロースアフィニティー樹脂上に固定されたCyPAに結合することを明らかにする。CyPが細胞表面に発現されたEMMPRINに結合するかどうか、該相互作用が細胞内シグナリングカスケードを引き起こすかどうかを評価するために、さらに実験が行われた。
【0154】
CHO細胞系統はEMMPRIN−陰性であるが、高レベルのEMMPRINを発現するようにトランスフェクトされた。
試験された全てのヒトおよびほとんどのマウス細胞系統は、すでにEMMPRINを発現していた。したがって、CyP−EMMPRIN相互作用の分子メカニズムを分析するために、検出可能なEMMPRINを有さないCHO細胞が選択された。ヒトEMMPRIN発現ベクターですでに一過性トランスフェクトされているCHO細胞の不均一集団をブライアン・トゥール(Brian Toole)博士(Trufts University; Boston, MA)から得た。高レベルのEMMPRINを安定に発現した個々のクローンを、市販の抗−ヒトEMMPRINモノクローナル抗体(抗−CD147、Research Diagnostics, Inc.; Flanders, NJ)を用いるFACSソーティングによって該不均一集団から単離した。図2は、最も高レベルのEMMPRINをその表面に発現しているCHOクローン(CHO−EMM)のFACS分析を示す。CHO−EMMクローンを増殖させ、さらなる実験の全てに使用した。
【0155】
外来的に加えられたCyPAまたはCyPBは、CHO−EMMPRIN細胞においてCa2+動員を誘導した。
EMMPRIN−トランスフェクト(CHO−EMM)および対照(ベクター−トランスフェクト)CHO細胞におけるカルシウムの細胞内貯蓄の相対的動員を分析して、CyP−EMMPRIN相互作用が細胞内シグナル変換を導くかどうかを決定した。
【0156】
方法 Ca2+動員
Ca2+動員アッセイは、本質的にSherryら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 1758−1763, 1998に記載のとおりに行った。簡単に言うと、3x106個のFura−2−AM−負荷CHOまたはCHO−EMM細胞(5x106細胞/ml)を1試料あたり10μgのヒトCyPAで刺激し、340および380nmの蛍光発光をPerkin−ElmerルミネセンススペクトロメーターLS50B上で測定した。
CyPAは、CHO−EMMにおいて特徴的なCa2+動員を誘導したが、対照CHO細胞において誘導しなかった(図3、左側のパネル)。付加的な実験が10μg/ml CyPA濃度でのシグナリング応答の飽和を示したので、図3に示される結果は該濃度を用いて得られた。これらの結果は、EMMPRINがCyPAのシグナル変換受容体であることを明らかにする。同様の結果が、CHO−EMM Ca2+動員アッセイにおいてCyPBを用いて得られた。
【0157】
CHO−EMMPRIN細胞におけるCyPにより誘導されるCa2+動員は、抗−EMMPRIN抗体の添加によって阻害された。
観察されたカルシウム動員が特異的にEMMPRIN媒介性であったという付加的な証拠を得るために、抗−EMMPRIN抗体またはイソ型対照抗体の存在下でのカルシウム動員実験を行った(図3、右側のパネル)。
【0158】
方法 Ca2+動員
Ca2+動員アッセイは、抗−CD147mAb(M6FT)(Research Diagnostic, Inc)およびイソ型対照抗体(33814X, Pharmingen)をFura−2−AM負荷工程の間に500ng/ml濃度で加えたことを除き、本明細書に上記されたとおりに行った。
【0159】
抗−CD147mAb(M6FT)の存在下、CyPAはCHO−EMM細胞においてCa2+シグナリングを誘導せず(図3、右側パネル)、細胞表面EMMPRINに結合する抗−CD147抗体およびCyPAが相互に排他的であることを確立した。付加的な対照実験は、抗−CD147mAb(M6FT)自体が、CHOまたはCHO−EMM細胞においてCa2+シグナリングを誘導しなかったことを示した。合わせて考慮し、使用された抗体の文書で証明された特異性を考慮すると、これらのデータはEMMPRINがCyPAのシグナリング受容体であることを証明する。
【0160】
実施例3
CHO−EMMPRIN細胞におけるCyPAにより誘導されるCa2+動員はゲニステインによって阻害された。
該実施例は、CyPに誘導されるEMMPRIN媒介性Ca2+動員が既知の細胞内シグナル変換経路を介して起きることを明らかにするイン・ビトロ実験およびアッセイを提供する。CyPAにより誘導されるCa2+動員は、細胞内シグナルの変換に関与することが知られている種々のキナーゼの阻害剤で前処理された細胞において測定された。特に、チロシンキナーゼ阻害剤、ゲニステインは、EMMPRINを安定に発現したCHO−EMM細胞においてCyPAにより誘導されるCa2+動員を完全に排除した(図4)。
【0161】
方法 Ca2+動員の阻害分析
CHO−EMMPRIN細胞は、まず、細胞のFura−2負荷の間、下記の薬剤:ビス−インドリルマレイミド(10nM)、PKC阻害剤;PD98059(100μM)、MAPK阻害剤およびゲニステイン(67μM)、チロシンキナーゼ阻害剤で45分間前処理した。次いで、該細胞を10μg/mlのCyPAで刺激し、上記のようにCa2+動員分析に付した。別法では、Gi−GoおよびGt−蛋白質ファミリーのメンバーによって媒介されるシグナリング経路を不活化するボルデテラ・パルツシス(Bordetella pertussis)毒素(PTX;100ng/ml)、または近年、ケモカイン受容体の交差−脱感作を誘導することが示された(Alfanoら、J. Exp. Med. 190: 597−606, 1999)PTX B−オリゴマー(100ng/ml)を10μg/ml CyPAでの刺激およびCa2+動員分析の12時間前に加えた。
【0162】
ゲニステインは、CHO−EMM細胞においてCyPAに誘導されるEMMPRIN−媒介性Ca2+動員を完全に排除した。
図4は、ビス−インドリルマレイミドI(PKC阻害剤)およびPD98059(MAPK阻害剤)が、CHO−EMM細胞におけるCyPAにより誘導されるCa2+動員に対して影響を及ぼさなかったことを示す。同様に、百日咳毒(PTX)またはPTX B−オリゴマーでの細胞の処理は、CHO−EMM細胞におけるCyPAにより誘導されるCa2+シグナリングを阻害しなかった。対照的に、チロシンキナーゼの阻害剤であるゲニステインは、CyPAに刺激されたCHO−EMMPRIN細胞においてCa2+動員を完全に排除した(図4、下方の曲線)。これらのデータは、CyPAに誘導されるEMMPRIN−媒介性シグナル変換がチロシンキナーゼ依存性経路を介して起こることを示す。
【0163】
実施例4
CyPA−処理は、培養された繊維芽細胞によるプロMMP発現および放出をアップレギュレートした。
該実施例は、CyP−処理が初代肺繊維芽細胞におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ(以後、「MMP」という)発現をアップレギュレートするかどうかを決定するためのイン・ビトロ実験およびアッセイを提供する。本発明の具体例は、CyPA−処理がWI−38培養ヒト初代肺繊維芽細胞によるMMP−1の発現および放出を活性化し、MMP−3のそれを増強したことを明らかにする(図5)。
【0164】
方法 初代ヒト肺繊維芽細胞のCyP−処理;ウェスタンイムノ−ブロット分析
まず、初代WI−38ヒト肺繊維芽細胞(高レベルのEMMPRINを発現している)を80%集密度まで増殖させ、一晩、血清欠乏にし、次いで、単独または100ng/ml CyPAの存在下で5時間インキュベートした。次いで、細胞上清および膜を収集し、特異的マウス抗体を用いるウェスタンイムノ−ブロット分析によってMMP発現について分析した(Cal Biochem; La Jolla, CA)。
【0165】
CyPA処理は、WI−38繊維芽細胞によるプロMMP−1の発現および放出を活性化し、プロMMP−3の発現および放出を増強した。
MMP−1、MMP−3およびMMP−9は、慢性関節リウマチ患者の滑液中で上昇することが報告されており、疾患関連病理に寄与すると考えられるので(Sorsaら、Semin. Arthritis Rheum. 22: 44−53, 1992; Keyszerら、J. Rheumatol. 26: 251−258, 1999; Soら、Rheumatology (Oxford). 38: 407−410, 1999; McCachren, Arthritis Rheum. 34: 1085−1093, 1991)、CyPAがMMP−1、MMP−3およびMMP−9の発現を誘導するかという疑問を調べた。
図5は、非処理繊維芽細胞ではなく、CyPAで処理されたWI−38繊維芽細胞がMMP−1を培養流体中に発現および放出したことを示す。さらに、CyPAは、MMP−3の発現および放出を増強し、さもなければ、それはこれらの細胞によって構造的に分泌された。MMP−9は、非処理またはCyPA−処理細胞の上清流体中で観察されなかった。
【0166】
さらに、SDS−PAGE分析によって評価される分子量に基づき、プロ酵素形態のMMP−1およびMMP−3がCyPAに応答して放出されたことが決定された。チモグラフィーを用いて活性なMMPを分析する平行実験では、各々、成熟した活性なMMP−1およびMMP−3に相当するであろう45kDaおよび33kDaのバンドが現れなかった。MMP発現は本発明の具体例にしたがって、培養中の休止繊維芽細胞の精製された集団において調べられていたので、これは驚くべきことではなかった。MMPファミリーの全メンバーは、周囲の細胞および組織によって放出される蛋白質分解性酵素によって細胞外でその後に活性化される不活性なチモーゲン(例えば、プロMMP−1およびプロMMP−3)として分泌されることが知られている(Woessner, FASEB J. 5:2145−2154, 1991)。正常な関節と比べて炎症を起こしたRA関節では、プロMMP−1およびプロMMP−3をその活性形態へ最終的に切断する酵素の供給源であると考えられる好中球の数が著しく増加している。次いで、活性化したMMPsは、軟骨を分解するように作用して関節崩壊を導く(Edwards & Hallett, Immunol. Today 18: 320−324, 1997)。
【0167】
これらのデータは、イン・ビボでのマトリックスメタロプロテイナーゼ活性のEMMPRIN−媒介性刺激のための二元的メカニズムであって、それにより、EMMPRINが細胞外CyPリガンドを介するシグナルを受け(すなわち、シグナル変換細胞受容体として)、別の細胞上のカウンター受容体との細胞−細胞付着−型相互作用を介してシグナルを与える(すなわち、固定された細胞表面「リガンド」として)メカニズムを支持する。
【0168】
実施例5
細胞表面EMMPRINは、HIV−1コアを担持するMuLV−偽型レトロウイルスによるCHO細胞の細胞感染の組み込み前工程に対する実質的な増強効果を有した。
該実施例は、CHO細胞において、EMMPRINがHIV感染に関与することを示すイン・ビトロ実験およびアッセイを提供する。特に、本発明の具体例によると、細胞表面EMMPRINの存在は、HIV−1コアを有するMuLV−偽型レトロウイルスによる細胞感染の組み込み前工程に対して実質的な増強効果を有した(図6)。
【0169】
方法 CHO細胞系統
HIV−1感染におけるEMMPRINの役割を調べるためのDNAトランスフェクション実験において、EMMPRINを発現しないCHO細胞が最初に使用された。これは、試験された全ての潜在的にHIV−1感受性のヒト細胞(初代T細胞およびマクロファージ、Tリンパ球および単核細胞HOS、293TおよびHeLa細胞系統)がすでに比較的高レベルのEMMPRINを発現していたからである。いくつかのCHO−EMMクローンが、ブライアン・トゥール博士(Tufts University, Boston, MA)によって提供され、高レベルのEMMPRINを発現していたEMMPRIN−トランスフェクトCHO細胞から選択された(実施例2参照)。対照(pcDNA−トランスフェクト)CHO細胞においてEMMPRINは検出されなかった。
【0170】
CHO細胞のトランスフェクション
75ccフラスコ中80%集密度まで増殖させたCHO細胞を、Fugene(Boehringer Mannheim)を用い、製造者によって提供されたプロトコールにしたがって、10μgのCD4またはCXCR4発現ベクター(各々、pBABE−T4およびpBABE−CXCR4)でトランスフェクトした。トランスフェクション効率は、フローサイトメトリック分析によって明らかにしたところ、典型的に15−20%であった。
【0171】
抗体
抗−CD147mAb(UM−8D6)は、Ancell Immunology Research Products(Bayport, MN)から得、イソ型に合致した(IgG1κ)対照mAbはBD PharMingen (San Diego, CA) から得た。抗−CD4mAbは、Beckton Dickinson (Parsippany, NJ) から得た。
【0172】
ルシフェラーゼを発現している偽型HIV−1変種での感染
Env−偽型ルシフェラーゼ発現HIV−1組換え体を用いる単一サイクルアッセイを本質的に以前の記載(Connorら、J. Exp. Med. 185: 621−628, 1997; Dragicら、Nature 381: 667−673, 1996)どおりに行った。簡単に言うと、偽型ルシフェラーゼレポーターウイルスを、外被欠損NL4−3構築物を発現しているプラスミドおよびX4株HxB2または両栄養性ネズミ白血病ウイルス(MuLV)のいずれか由来のウイルス性外被を発現しているプラスミドでの293T細胞の同時トランスフェクションによって生産した。培養4日後に、偽型ウイルスで感染された細胞(106細胞あたり5ngのp24)をレポーター溶解バッファー(Promega)を用いて溶解し、Dynex MLXミクロプレートルミノメーターを用いて、相対光単位においてルシフェラーゼ活性を測定した。
【0173】
EMMPRINは、MuLV偽型HIVによるCHO細胞感染を増強した。
EMMPRINがHIV感染を増強するかどうかを決定するために、ネズミ白血病ウイルス(MuLV)の両栄養性外被を有する偽型の組換えルシフェラーゼ発現性HIV−1でのCHO−EMMまたは対照CHO細胞の感染のルシフェラーゼ活性分析を行った。
CHO−EMMまたは対照(pcDNA−トランスフェクト)CHO細胞の三連培養を50μg/mlの抗−CD147(すなわち、抗−EMMPRIN)mAbまたはイソ型に合致した対照mAbの存在または不在下、MuLV由来のEnvを有する偽型のルシフェラーゼ発現性HIV−1(Luc−HIV−1)で感染させた。37℃で1時間感染させる前に、ヘパリナーゼIII(3x10−4IU/ml)を細胞に加えた。ルシフェラーゼ発現を感染の4日後に測定し、100%とされる対照(CHO−pcDNA細胞)に相対的な発現のパーセンテージとして表す。
細胞表面EMMPRINは、CHO細胞においてルシフェラーゼ発現を5−ないし6−倍増加した(図6、左側のパネル)。さらに、該増加は、抗−CD147mAbが感染の間に加えられた場合、大きく減少した(図6、左側のパネル、第三の垂直バー)。
【0174】
EMMPRINはHIV−1偽型HIVによるCHO細胞感染を増強した。
EMMPRINがHIV−1外被を有する偽型のウイルスの複製を増強するかどうかを決定するために、CHO−EMMまたは対照CHO細胞をCD4−およびCXCR4−発現ベクターで一過性トランスフェクトし、次いで、LAV外被を有する偽型のルシフェラーゼ発現性HIV−1構築物で感染させた。
CHOまたはCHO−EMM細胞の三連培養をCD−4発現性pBABE−T4およびCXCR4−発現性pBABE−CXCR4で一過性トランスフェクトし、侵入のためにCD4およびCXCR4に依存するHIV−1LAV由来のEnvを有する偽型のLuc−HIV−1で感染させた。ルシフェラーゼ発現を上記のように検出し、100%とされる対照細胞(CHO/CD4/CXCR4)に相対的な発現のパーセンテージとして表す。
MuLV外被を用いる上記の結果と同様に、ルシフェラーゼ発現における3−ないし4−倍の増加が、EMMPRINを発現している細胞において観察された(図6、中央のパネル)。
【0175】
EMMPRINはウイルス組み込み前段階でHIV感染を増強した。
EMMPRINのHIV感染に対する増強効果がプロウイルスDNAの組み込み前の段階で発現するかどうかを決定するために、感染CHO細胞中、抗−CD147mAbの存在下または不在下でHIV−1逆転写量を測定した。
CHOおよびCHO−EMM細胞の2連培養をCD4−およびCXCR4−発現ベクターで一過性トランスフェクトし、次いで、抗−CD147mAb(UM−8D6)またはイソ型に合致した対照抗体の存在下、EnvMuLVまたはEnvLAVのいずれかを有する偽型のluc−HIV−1で感染させた。感染の2時間後、LTR R/U5プライマー(配列番号2)(配列番号3)、および初期逆転写産物に特異的なプローブ(配列番号4)(Schmidtmayerovaら、J. Virol. 72: 4633−4642, 1998)を用いて、ウイルスDNAをPCRによって分析した。結果をダイレクトイメージャー(Direct Imager)(Packard)で定量化し、100%とされる対照細胞(イソ型処理したCHO/CD4/CXCR4)に相対的なLTR/gag−特異的シグナルに関連する放射能として表した。
【0176】
EnvMuLV−およびEnvLAV−偽型ウイルスでの感染後のLTR R/U5逆転写産物の量は、CHO/CD4/CXCR4細胞と比べたCHO−EMM/CD4/CXCR4細胞において3−ないし4−倍に増加した(図6、右側パネル)。さらに、ルシフェラーゼ発現に対する上記の抗−CD147mAb(UM−8D6)効果と一致して、抗−CD147mAb(UM−8D6)は、CD147の該増強効果を減少させた(図6、右側のパネル、各シリーズにおける最後の垂直バー)。抗−CD147mAb(UM−8D6)によるCD147活性の不完全な抑制の理由は、おそらく、CHO−EMM細胞における高レベルのEMMPRIN発現および/またはウイルス付随CyPAと比べた該抗体によって認識されるEMMPRINエピトープにおける差に起因した。
【0177】
したがって、EMMPRINは、HIV−1コアを有するレトロウイルスによる細胞感染の組み込み前工程に対する増強効果を有した。有意には、該効果は、偽型化に使用されたEnvの同一性に依存しなかった。したがって、HIV−1感染の増強におけるEMMPRINの活性は、侵入に用いられる受容体の性質に依存しないようである。かかる受容体独立性作用様式は、CyPAの活性に似ており、それは、ヘパランとの相互作用を介して偽型HIV−1コア含有ウイルスの付着の媒介となることが報告されている(Saphireら、EMBO J. 18:6771−6785, 1999)。しかしながら、ヘパランは、ルシフェラーゼ発現EnvMuLV−偽型HIV−1の複製に対するEMMPRINの増強効果に必要とされない。HIV−1付着を有意に減少させたCHO−EMM細胞のヘパリナーゼIIIでの処理(図7B)は、EMMPRIN−媒介性ルシフェラーゼ活性を減少させなかった(図6、左側パネル)。
したがって、本発明のデータは、ヘパラン(潜在的にgp120−媒介性付着に関与する(Mondorら、J. Virol. 72: 3623−3634, 1998))がウイルス組み込み前のHIV−1感染工程に対するEMMPRIN−媒介性増強効果に寄与しないメカニズムと一致する。
【0178】
実施例6
細胞表面EMMPRINは、初代ヒトPBMCのHIV−1感染の融合後の組み込み前工程に対する実質的な増強効果を有した。
該実施例は、EMMPRINがヒト初代末梢血単核細胞(PBMC)のHIV感染に関与することを示すイン・ビトロ実験およびアッセイを提供する。特に、PBMC上の細胞表面EMMPRINの存在は、T細胞適応性またはマクロファージ栄養性HIV−1株による、またはHIV−1コアを有する偽型レトロウイルスによる細胞感染の融合後の組み込み前工程に対する実質的な増強効果を有した(図7A−E)。
【0179】
方法 末梢血単核細胞(PBMC)の調製および感染
ヒト初代末梢血単核細胞(PBMC)は、標準的なFicoll−Hypaque勾配遠心分離法を用いて、全血から得られた。PHA(5μg/ml)を用いて2日間、細胞を活性化し、次いで、種々の濃度の抗−CD147mAb(UM−8D6)またはイソ型に合致した対照mAbの存在下、HIV−1LAVまたはHIV−1ADA(1x106細胞あたり5x103cpmのRT活性)で感染させた。ウイルス複製は、培養上清中のRT活性を測定することによってアッセイされた。
【0180】
ルシフェラーゼ発現性偽型HIV−1変種での感染
偽型Luc−HIV−1株の調製およびその感染は、外被がLAVまたはADA株のいずれか由来であることを除き、上記実施例5に記載のとおりに行った。
【0181】
ウイルス付着アッセイ
PHA−活性化PBMCを37℃で2時間、抗−CD147mAb(UM−8D6;50μg/ml)、抗−CD4mAb(5μg/ml)またはヘパリナーゼIII(3x10−4IU/ml)と一緒にインキュベートし、次いで、洗浄し、HIV−1LAV(10ng/mlのp24)と一緒に4℃で1時間インキュベートした。4℃でHIV−1LAVを用いる1時間のインキュベーション期間に、ヘパリナーゼではなく抗体が存在した。細胞の広範囲な洗浄後、細胞結合したウイルス性p24の量をELISAによってアッセイした。
【0182】
融合アッセイ 細胞−細胞融合
HIV−1 Env−媒介性細胞融合は、比色融合技術(Alkhatibら、J. Virol. 70: 5487−5494, 1996)を用いてアッセイした。簡単に言うと、初代PHA−活性化PBMCをT7 RNAポリメラーゼを発現しているワクシニアウイルス(vTF7−3,Fuerstら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 8122−8126, 1986)で感染させ、抗−CD147mAb(UM−8D6)またはイソ型に合致した対照mAbの存在下で2.5時間、HIV−1Env(X4 EnvLAVを発現するためのvCB−41、およびR5 EnvBa−Lを発現するためのvCB−43;Broder & Berger, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 9004−9008, 1995)およびT7プロモーターに連結されたイー・コリlacZ遺伝子(vCB−21R−lacZ,Alkhatibら、J. Virol. 70: 5487−5494, 1996)を発現しているワクシニアウイルスに同時感染させたHeLa細胞を5:1の比率で用いて同時インキュベートして細胞融合させた。細胞融合を評価するために、β−Gal活性を測定する標準的な比色アッセイを洗剤性細胞溶解液と共に用いた。得られた結果は、正の対照(非抗体処理、100%とする)に相対的なβ−Gal活性として表し、同じドナー由来の細胞を用いる3つの独立した測定値の平均±SDとして下記に示した。
【0183】
ウイルス−細胞融合
ウイルス−細胞融合の分析のために、PHA−活性化PBMCをHIV−1LAVと一緒に37℃で2時間、所定の抗体の存在下または不在下(すなわち、「対照」)でインキュベートした。細胞をトリプシン(0.025%、37℃で30分)で処理し、溶解し、溶解液中、ELISAによって細胞内に取り込まれたウイルス性p24を測定した。細胞を4℃にて抗体を用いずにウイルスと一緒にインキュベートし、次いで、トリプシンの存在下37℃に移すことによって、該アッセイのバックグラウンド(すなわち、4℃「対照」)を決定した。該値は、トリプシンの存在下でどうにか細胞に侵入することのできるウイルスの量を反映する。
【0184】
PCRによるHIV−1特異的DNAの検出(逆転写酵素アッセイ)
PHA−活性化ヒトPBMCを、HIV−1感染の2時間前に、抗−CD147mAb(UM−8D6;50μg/ml)、抗−CD4mAb(2μg/ml)または対応するイソ型に合致した対照mAb(50μg/ml)で処理した。次いで、PBMCのHIV−1LAVでの感染の2時間後に所定のプライマーを用い、本質的にSchmidtmayerovaら、J. Virol. 72: 4633−4642, 1998に記載の通りに、HIV−1逆転写の分析を行った。
【0185】
簡単に言うと、細胞をプロテイナーゼKを含有する標準PCRバッファー中に溶解した。プロテイナーゼKは熱不活性化され、25μlアリコートを、0.2μMオリゴヌクレオチドプライマー、200μMの各デオキシヌクレオチド、50mM KCl、10mM Tris(pH8.3)、2mM MgCl2および1.25UのTaqポリメラーゼ(Perkin−Elmer)を含有する全量50μlの35サイクルのPCRに付した。各サイクルは、94℃の変性工程30秒、アニーリング工程(プライマーの各ペアにつきTm−5℃)30秒および72℃の伸長工程1分より構成された。アガロースゲル電気泳動後、増幅されたDNAを、[32P]−標識プローブを用いるサザンブロットハイブリダイゼーションによって分析した。次いで、インスタント・イメージャー(Packard)を用いて正しいサイズの増幅フラグメントを定量し、抗体非処理対照(100%とする)と比較した抗体処理におけるカウントのパーセンテージとして表した。下記のプライマーおよびプローブを用いた:LTR R/U5、センスプライマー(5’−GGCTAACTAGGGAACCCACTG−3’)[配列番号6]、アンチセンスプライマー(5’−CTGCTAGAGATTTTCCACACTGAC−3’)[配列番号7]、およびプローブ(5’−TGTGTGCCCGTCTGTTGTGTG−3’)[配列番号8];LTR/gagプライマー、センスプライマー(5’−CAGATATCCACTGACCTTTGG−3’)[配列番号9]、アンチセンスプライマー(5’−GCTTAATACTGACGCTCTCGCA−3’)[配列番号10]、およびプローブ(5’−GAGGCTTAAGCAGTGGGTTC−3’)[配列番号11](Schmidtmayerovaら、上掲参照)。
【0186】
細胞分画およびウェスタンブロット分析
いくつかの修飾を伴う以前に公表されたプロトコール(Bukrinskayaら、J. Exp. Med. 188: 2113−2125, 1998)を用いて、HIV−1LAIに感染させたMT−4細胞の細胞画分を調製した。簡単に言うと、細胞をペレット化し、低張性バッファー(10mM HEPES、pH6.9、10mM KCl、0.1mM PMSFおよび1μg/mlアプロチニン)中、氷上で15分間インキュベートした。次いで、細胞をDounceホモジェネーションによって崩壊させ、核を1,500xgで5分間ペレット化し、捨てた。上清画分を除去し、18,000xgで45分間遠心分離した。この第2の遠心分離由来の上清を保存し、本明細書においてこれを「サイトソル」画分という。細胞骨格および膜画分を含有する第2遠心分離由来のペレットを、1%n−オクチル−β−D−グリコピラノシドを補足したNTENTバッファー(150mM NaCl、10mM Tris−HCl、pH7.2、1mM EDTA、1%Triton X−100、0.1mM PMSFおよび1μg/mlアプロチニン)中に再懸濁し、18,000xgで30分間遠心分離した。この第3の遠心分離由来の上清を保存し、本明細書においてこれを「膜」画分といい、一方、対応するペレットは「細胞骨格」画分を示す。2x106細胞/レーンの等価物由来の細胞画分を12%SDS−PAGE上で分画し、MA、CA(どちらもABI由来)およびアクチン(Sigma)に対するモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロットアッセイによって分析した。
【0187】
抗−EMMPRIN mAbは、ヒト初代PBMCにおけるHIV−1株の複製を阻害した。
抗−CD147(すなわち、抗−EMMPRIN)mAb(UM−8D6)を用いて、初代ヒトPBMCにおけるEMMPRIN活性のメカニズムをさらに研究した(図7A)。
PHA−活性化PBMCの三連培養にT細胞系統−適応性X4 HIV−1LAV株またはマクロファージ−栄養性R5HIV−1ADA株のいずれか(図7A、左パネル)、またはLAVまたはADA株のいずれか由来の外被を有する偽型のルシフェラーゼ−発現性組換えHIV−1(図7A、右パネル)を感染させた。所定量の抗−CD147mAb(UM−8D6)(右パネルにおける実験に50μg/mlが使用された)またはイソ型に合致した対照mAb(全対照試料において50μg/ml)を感染の30分前に加え、実験期間中存在した。ウイルス複製は、21日目の培養上清中のRT活性によって(図7A、左パネル)、または感染後4日目のルシフェラーゼ活性によって(右パネル)評価された。結果は、対照(イソ型に合致した無関係のmAbで処理された細胞;100%とする)に相対的なRTのパーセンテージ(LTR R/U5プライマー(配列番号6)および(配列番号7)、およびプローブ(配列番号8)を用いる)またはルシフェラーゼ活性として示される。
イソ型に合致した対照mAbではなく、抗−CD147mAb(UM−8D6)が、初代PBMCにおいてマクロファージ−栄養性(ADA)およびT細胞系統−適応性(LAV)HIV−1株の複製を阻害した(図7A、左パネル)。同様の結果が、ADAまたはLAV外被を有する偽型の組換えルシフェラーゼ−発現ウイルスを用いて観察された(図7A、右パネル)。
【0188】
抗−CD147mAb(UM−8D6)は、ヒトPBMCへのHIV付着を阻害しなかった。
HIV−1複製の異なる初期工程(例えば、ウイルス付着、融合、脱外被など)に対する抗−CD147mAb(UM−8D6)の効果を分析して、HIV感染に対するその阻害活性のメカニズムを定義付けた(図7B)。
【0189】
ウイルス付着工程は、ウイルス粒子を細胞と一緒に4℃でインキュベートし、次いで、細胞に結合したウイルス性p24の量を測定することによって分析された。詳細には、上記の該実施例の「方法」に記載のように、三連PBMC培養を37℃で抗−CD147mAb(UM−8D6;50μg/ml)、抗−CD4(5μg/ml)mAbまたはヘパリナーゼIII(3x10−4IU/ml)で前処理し、次いで洗浄し、HIV−1LAV(10ng/mlのp24)と一緒に4℃で1時間インキュベートした。細胞に結合したp24の量をELISAによってアッセイし、結果を異なるドナー由来の細胞を用いて行った三つの実験のうち1つの代表的実験について示す。
【0190】
有意には、抗−CD147mAb(UM−8D6)は、ヒトPBMCへのHIV−1LAV付着を阻害しなかったが、抗−CD4mAbはそれを有意に減少した(図7B)。予測どおり、HIV−1LAV付着はまた、HIV−1付着におけるヘパランの仮定された役割と一致して(Saphireら、EMBO J. 18:6771−6785, 1999(宿主CyPAは、ヘパランを介して標的細胞へのHIV−1付着の媒介となる);Mondorら、J. Virol. 72: 3623−3634, 1998(HeLa CD4+細胞へのHIV−1付着はCD4−独立性のgp120依存性であり、細胞表面ヘパランを必要とする)、ヘパリナーゼIIIでの細胞の前処理によって減少した。したがって、これらのデータは、抗−CD147mAb(UM−8D6)がウイルス付着と組み込みとの間のどこかの工程でHIV感染を阻害したことを示す。
【0191】
抗−CD147mAb(UM−8D6)は、PBMCとHIV−1 ADAおよびLAV外被を発現しているHeLa細胞との間のHIV Env−媒介性融合を阻害せず、また、ウイルス性p24の細胞インタナリゼーションも減少しなかった。
PBMCとHIV−1 ADAおよびLAV外被を発現しているHeLa細胞との間のHIV−1 Env−媒介性融合に対する抗−CD147mAb(UM−8D6)の効果を分析して、EMMPRINが複製のウイルス細胞融合工程に関与するかどうかを決定した(図7C、左パネル)。さらに、HIV−1感染に関連して、融合に対する抗−CD147mAb(UM−8D6)の効果を、トリプシン処理後のHIV−1LAV−接種したPBMCに結合したままであるウイルス性p24の量(すなわち、細胞内に取り込まれたp24に相当する)を測定することによって分析した(図7C、右パネル)。
【0192】
細胞−細胞融合
PBMCとHIV−1 Env(X4 LAVまたはR5 Ba−L)を発現しているHeLa細胞との間の融合を抗−CD147(UM−8D6;50μg/ml)または抗−CD4(5μg/ml)mAbの存在下、該実施例の「方法」において本明細書に上記されるようにβ−Gal発現によって評価した。T7 RNAポリメラーゼ発現性PBMCとT7プロモーターに連結されたイー・コリLacZ遺伝子のみを発現しているHeLa細胞との共培養において検出されたバックグラウンド活性を全ての値から引いた。抗−CD147mAb(UM−8D6)は、HIV−1 env−媒介性細胞−細胞融合を阻害しなかったが、予想通り、抗−CD4mAbは有意に細胞融合を減少させた(図7C、左パネル)。
【0193】
ウイルス−細胞融合
ウイルス−細胞融合の分析のために、上記の該実施例の「方法」に記載されるようにPBMCをHIV−1LAVと一緒にインキュベートした。抗−CD147mAb(UM−8D6)は、ウイルス性p24インターナリゼーションを阻害しなかったが、予想通り、抗−CD4mAbは細胞内に取り込まれたp24の量をバックグラウンドレベルまで減少させた(図7C、右パネル)。したがって、抗−CD147抗体は、ウイルス−細胞融合の結果としてトリプシン消化に対して耐性になったウイルス性蛋白質の量を減少しなかった。
したがって、図7C(両方のパネル)の合わせた結果は、HIV−1感染に対する抗−CD147mAbの阻害効果が融合後メカニズムによって媒介されることを示す。
【0194】
抗CD147mAb(UM−8D6)は初期および後期の両方のHIV−1逆転写の量を減少させた。
半定量的なPCR法を用いて、組み込み前の複合体(PIC)の進行性成熟を代表する融合後工程であるHIV−1特異的逆転写の量を分析した(図7D)。
PHA−活性化ヒトPBMCをHIV−1感染の2時間前に、抗−CD147mAb(UM−8D6;50μg/ml)または抗−CD4mAb(2μg/ml)、または対応するイソ型に合致した対照mAb(50μg/ml)のいずれかで処理した。次いで、「方法」に上記されるようなHIV−1LAVでのPBMCの感染の2時間後に、プライマーLTR R/U5(配列番号6)および(配列番号7)、および「ストロング−ストップ(strong−stop)」初期逆転写産物意特異的なプローブ(配列番号8)を用いて、HIV−1逆転写の分析を行った(Schmidtmayerovaら、J. Virol. 72: 4633−4642, 1998)。PCR結果をダイレクトイメージャー(Packard)上で定量化し、抗体非処理対照(100%とする)に相対的な処理試料中のカウントのパーセンテージとして示す。細胞あたり1個のHIV−1ゲノムを含有する8E5/LAI細胞の希釈(Folksら、J. Exp.Med. 164: 280−290, 1986)をPCR標準として用いた(図7D、左下パネル)。データは、2連で行った3つの独立した実験を示す。
【0195】
抗−CD147mAb(UM−8D6)は、「ストロング−ストップ」逆転写産物の量を約2倍減少させた(図7D、左上および右側のパネル)。この短いDNAフラグメントは、ウイルス侵入後すぐに生産され、その量は逆転写の開始を反映する(Zackら、Cell 61: 213−222, 1990)。予想通り、抗−CD4mAbは、ウイルス付着およびウイルス−細胞融合に対する該mAbの本明細書に記載した効果に一致して(図7Bおよび7C)、より一層LTR R/U5−増幅フラグメントの量を減少させた(図7D、左上および右側のパネル)。抗−CD147mAb(UM−8D6)の同様の効果が、後期逆転写産物を各々、増幅および検出するLTR/gagプライマー(配列番号9)および(配列番号10)ならびにプローブ(配列番号11)を用いて検出されたPCRフラグメントの量において観察された(Schmidtmayerovaら、J. Virol. 72: 4633−4642, 1998)。
【0196】
したがって、該具体例の結果は、図7A、7Bおよび7Cにおいて本明細書中に提示されるデータと共に、抗−CD147mAb(UM−8D6)がウイルス−細胞融合と逆転写の開始との間の工程を干渉したことを示す。かかる活性の1つの有望なメカニズムは、いずれかの特定の理論に限定されるものではなく、組み込み前の複合体(PIC)形成の阻害であり、それにより、CD147はHIV−1脱外被において役割を果たす。
【0197】
抗CD147mAb(UM−8D6)は、新たな感染後初期にHIV−1マトリックス(MA)およびキャプシド(CA)蛋白質の正常な移動を阻害し、それは、EMMPRINがHIV−1脱外被に関与したことを示す。
ウイルス「脱外被」はHIV感染後すぐに起こり、ウイルスマトリックス蛋白質(MA)および核蛋白質複合体からのウイルス性キャプシド蛋白質(CA)の解離を含む(Bukrinskyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6125−6129, 1993; Millerら、J. Virol. 71: 5382−5390, 1997)。詳細には、MAは膜から細胞骨格へ移動するが、CAはサイトソル中に保持される(Boukrinskayaら、J. Exp. Med. 188: 2113−2125, 1998)。蛋白質再配置の該パターンは、HIV−1逆転写複合体と細胞骨格の結合に相関し、PIC形成の初期工程における細胞骨格の関与を示唆する(Bukrinskayaら、j. Exp. Med. 188: 2113−2125, 1998)。
【0198】
新たな感染後初期のHIV−1マトリックス(MA)およびキャプシド(CA)蛋白質の細胞内分布は、EMMPRINが感染の間のHIV−1「脱外被」工程に関与したかどうかを決定するために研究された(図7E)。
MT−4細胞に4℃にて、抗−CD147mAb(UM−8D6;50μg/ml)またはイソ型に合致した対照mAbの存在下でHIV−1LAVを接種した。アリコート(1x106細胞)を蛋白質分析のために30分後に回収し(すなわち、0時間p.i.時点試料)(図7E、上方パネル)、一方、接種した培養物を37℃に移し、1.5時間インキュベートした(図7E、下方パネル)。細胞分画を該実施例の「方法」に上記したように行い、サイトソル(C)、膜(M)および細胞骨格(CS)画分中の蛋白質をアクチン、CAおよびMAに特異的なモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロッティングおよびECLによって分析した。
【0199】
得られたウイルスMAおよびCA蛋白質の細胞内分布は、抗−CD147mAbの不在下、本明細書に上記した先行文献におけるものと一致した。すなわち、感染の1.5時間後、ウイルスMAおよびCA蛋白質は、各々、膜(M)から細胞骨格(CS)およびサイトソル画分中へ特徴的な移動を行った(図7E、イソ型パネル、各々、レーン「CS」および「C」)。
しかしながら、かかる蛋白質移動は抗−CD147mAb(UM−8D6)で処理したMT−4細胞において観察されず、ここに、MAおよびCAの両方は細胞膜画分と結合したままであった(図7E、α−CD147パネル、レーン「MT」)。したがって、抗−CD147mAb(UM−8D6)の存在下、ウイルスは細胞膜に保持され、それは、EMMPRINが感染の間のHIV−1脱外被工程の調節に関与することを示す。
【0200】
実施例7
抗−CD147mAbの阻害効果に対するウイルス耐性はCsAに対する耐性と相関した。
該実施例は、抗−CD147mAbの阻害効果に対するHIV耐性がCsAに対する耐性に相関したことを示し、該抗体がウイルス感染におけるCyPA−依存性工程を干渉したことを示すイン・ビトロ実験およびアッセイを提供する。詳細には、ヒトPBMCにおけるA224E(CsA−耐性、CA変異HIV株)の複製は抗−CD147mAb(UM−8D6)での処理に対して耐性であった(図8)。
【0201】
方法 新たなHIV感染のための共培養プロトコール
293T細胞を同系野生型またはA224E CA変異体ウイルスの分子クローンでトランスフェクトし、CsA(1μM)の存在下または不在下で3日間培養した。トランスフェクション後3日目に細胞を洗浄し、CsAを用いずにさらに4日間培養するか、または抗−CD147mAb(UM−8D6;100μg/ml)の存在下または不在下でCsAを添加せずに(両方のウイルスの複製に影響を及ぼしたT細胞に対する該薬剤のウイルスに無関係な免疫抑制効果を回避するために)、PHA−活性化CD8+T細胞−欠乏PBMC(1個の293T細胞につき20個の血液単核細胞)との共培養に用いた。共培養の4日後、ウイルス複製を、実施例6の「方法」に上記したように、LTR U/5プライマー(配列番号6)および(配列番号7)ならびにプローブ(配列番号8)を用いて培養上清中の逆転写酵素(RT)活性によってアッセイした。
【0202】
ヒトPBMC中におけるA224E(CsA−耐性、CA変異HIV株)の複製は、抗−CD147mAbでの処理に対して耐性であった。
CsAはCyPAと相互作用し、それにより、イン・ビトロでGag(CA抗原部分)−CyPA相互作用を干渉し、シクロフィリンのビリオン中への組み込みを阻害し、細胞培養においてHIV−1の複製を阻害することが示された。上記した本明細書中の「背景」におけるまとめを参照のこと。これらのデータは、GagとCyPAの相互作用が感染性HIV−1ビリオンの形成に必要であるというモデルと一致する(Sherryら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 1758−1763, 1998)。したがって、CsA−耐性HIV株(例えば、CsA耐性、CyPA−依存特性を与えるCA変異を有する株)による感染は、CyPAに依存しないか、またはCyPA受容体アンタゴニストによって特異に影響を及ぼされていることが無理なく予測され得る。
【0203】
したがって、抗−CD147mAbの阻害効果がCsAに対する耐性と相関するかどうかを決定するために、CsA耐性を与えるCA変異を有するA224Eウイルス株による感染が分析された。かかる相関は、CD147抗体がウイルス感染におけるCyPA−依存工程を干渉する付加的な証拠であろう。
該実施例の「方法」において本明細書に上記したように、293T細胞をシクロスポリンA(1μM)の不在下(”C”)または存在下(”CsA”)、HIV−1NL4−3(WT)(図8、左パネル)または変異体A224E(図8、右パネル)ウイルスの分子クローンでトランスフェクトした。ウイルス生産性トランスフェクト細胞を洗浄し、CD8+T細胞欠損PBMCおよび抗−CD147mAb(UM−8D6;100μg/ml)を添加して(”293T+CD4+T細胞”)または添加せずに(”293T”)さらに4日間、4連で培養した。ウイルス複製は、「方法」において上記したように、培養上清中のRT活性を測定することによってアッセイした。結果を平均±SEとして示す。
【0204】
該系において生産されたウイルスの量は、トランスフェクトされた293T細胞から生産されたウイルスの蓄積よりもむしろT細胞の新規な感染の効力を反映する。抗−CD147mAb(UM−8D6)は、CsA−耐性A224Eウイルスの複製を阻害しなかったが、野生型ウイルスの複製は有意に減少された。CsA−処理した293T細胞から収集されたA224Eウイルスは、そのCsA−耐性表現型と一致して、非処理細胞から収集されたウイルスと同レベルまで複製したが(Braatenら、J. Virol. 70: 5170−5176, 1996)、CsAの存在下で収集された野生型ウイルスは有意に減弱された。
したがって、抗−CD147mAb(UM−8D6)の阻害効果に対するウイルス耐性はCsAに対する耐性と相関した。これらのデータは、該抗体がウイルス感染におけるCyPA−依存工程を干渉する付加的な証拠を提供する。
【0205】
実施例8
EMMPRINの膜貫通領域由来のペプチドは、HIV−1コアを有する偽型レトロウイルスによるCHO−EMM細胞およびヒトPBMCの感染を実質的に阻害した。
該実施例は、EMMPRIN蛋白質の膜貫通領域由来のペプチドがHIV−1感染を阻害することを示すイン・ビトロ実験およびアッセイを提供する。詳細には、EMMPRIN膜貫通ドメインのアミノ末端領域(配列番号2参照)に対応する8−アミノ酸ポリペプチド(配列番号3)が、各々、CHO−EMM細胞(図9)およびヒトPBMCのEnvMuLV−およびEnvADA−偽型luc−HIV−1ウイルスによる感染を阻害した。
【0206】
方法
CHO細胞系統、EnvMuLV−偽型luc−HIV−1変種でのCHO細胞の感染および1サイクルのルシフェラーゼアッセイは、実施例5の「方法」に上記したとおりであった。PHA−活性化ヒトPBMCの調製およびEnvADA−偽型luc−HIV−1での感染は、実施例5および6の「方法」に上記したとおりであった。PBMCルシフェラーゼアッセイは、CHO細胞系統のために記載したとおりに行った。
【0207】
ペプチド
ペプチド1(配列番号3)、2(配列番号4)およびスクランブルペプチド1(配列番号5)は、Research Genetics (Huntsville, Alabama)からカスタムポリペプチドとして得た。
【0208】
CD147の膜貫通領域由来のペプチドは、CHO−EMM細胞のMuLV−偽型HIV−1感染を阻害する。
EMMPRIN膜貫通ドメインは、EMMPRIN蛋白質配列(配列番号2)のアミノ酸204−228に対応する。本発明の新規なEMMPRIN/CyP相互作用を考慮して、EMMPRIN膜貫通領域内のサブ領域に対応するペプチドを調製して、それらがHIV−1感染を阻害することができるかを決定した。ペプチド1(LAALWPFL)は、EMMPRINのアミノ酸206−213に対応する8アミノ酸配列(配列番号3)である。ペプチド2(GIVAEVLVL)は、EMMPRINのアミノ酸214−222に対応する9アミノ酸ポリペプチド配列(配列番号4)である。「スクランブルペプチド1」(FAWPLLLA)、ランダム化した配列対照は、ペプチド1のアミノ酸残基のランダム化配列にしたがって作成された。
【0209】
CHOおよびCHO−EMM(”CHO.CD147”)細胞を上記のように、所定濃度のペプチド1、2またはスクランブルペプチド1の存在下、またはペプチドの不在下、MuLV外被を有する偽型の組換えルシフェラーゼ発現性HIV−1で感染させた。ルシフェラーゼ発現は、感染の4日後にルミノメーターを用いて測定された。
【0210】
図9は、CHO−EMM細胞のMuLV−偽型HIV−1感染が、濃度に依存してペプチド1(配列番号3)によって実質的および特異的に阻害されたことを示す。HIV−1感染は本質的に、1nMのペプチド1の存在下で阻害された。ペプチド2もスクランブルペプチド1も、該アッセイにおいてHIV−1感染を阻害しなかった。
【0211】
CD147の膜貫通領域由来のペプチドは、ヒトPBMCのHIV−1感染を阻害する。
PHA−活性化ヒトPBMC培養体を所定濃度のペプチド1、2またはスクランブルペプチド1の存在下、EnvADA−偽型luc−HIV−1で感染させた。CHO−EMM細胞のEnvMuLV−偽型HIV−1感染について上記したように、PBMCのEnvADA−偽型luc−HIV−1感染は本質的に1nMペプチド1の存在下で阻害された。ペプチド2もスクランブルペプチド1も、該アッセイにおいてEnvADA−偽型luc−HIV−1感染を阻害しなかった。
【0212】
EMMPRIN膜貫通ポリペプチドはCyP/EMMPRIN相互作用を拮抗する。
CHO−EMM細胞およびPBMCの各々、EnvMuLV−およびEnvADA−偽型luc−HIV−1による感染の阻害におけるペプチド1(配列番号3)の上記で同定された活性は、CyPA−被覆セファロースビーズによるEMMPRINの保持に関する上記実施例1に示したデータの解釈に関連する。実施例1において、EMMPRINとCyPAとの間の特異的イン・ビトロ結合相互作用は、全長EMMPRIN(ecd、tmおよびicdドメインを含有している)蛋白質でのみ観察され、tmおよびicdドメインを欠くEMMPRINでは観察されなかった。実施例1で述べたように、該結果は、セファロースビーズ上のCyPAに対するecd−CyP結合部位の適当な提示のためにEMMPRIN膜貫通および/または細胞内ドメインが必要であることを反映するか、またはCyPAが直接tmドメインと、ecdまたはtmドメインと、または両方のドメインと相互作用するメカニズムと一致した。
【0213】
いずれかの特定のメカニズムに拘束されることなく、EMMPRIN膜貫通ペプチド1によるHIV−1感染の上記で同定された阻害は、CyPが直接、EMMPRIN膜貫通ドメインの領域と相互作用し、ここに、該相互作用がCHO−EMM細胞およびPBMCの両方においてペプチド1(配列番号3)によって有効に拮抗されたCyP/EMMPRIN相互作用のためのメカニズムと一致する。
【0214】
要約:
CyP/EMMPRIN結合相互作用を修飾する薬剤は、HIV−1感染、AIDSおよびAIDS−関連障害、RAおよび癌のような局所的または全身性のCyP放出、合成または結合によって特徴付けられる症状の治療または予防に有用である。
【0215】
慢性関節リウマチ(RA)
本発明の実施例および具体例は、CyPが以前に知られた幅広く分布した細胞表面蛋白質、EMMPRINと相互作用し、特異的に該蛋白質に結合することを示す。有意には、EMMPRINは本発明の以前にはリガンドが知られておらず、単に、細胞−細胞相互作用の媒介となることのできる(すなわち、細胞−表面「リガンド」として作用することのできる)潜在的な接着分子であると考えられていた。
【0216】
さらに、本発明の実施例および具体例は、CyPが、その表面にEMMPRINを構造発現するCHO−EMM細胞においてシグナル変換を誘導することを明らかにする。該応答は、抗−EMMPRIN特異的抗体の添加によって阻害されたので、特異的であることが示された。さらに、チロシンキナーゼ阻害剤ゲニステインは、CHO−EMM細胞においてCyPにより誘導されるCa2+動員を完全に排除し、EMMPRIN−媒介性Ca2+動員が既知の細胞内シグナル変換経路を介して起こることを示した。
【0217】
さらに、培養したヒト初代肺繊維芽細胞のCyPでの処理は、プロMMP−1の放出を誘導し、プロMMP−3の生産を増強した。これら2つのマトリックスメタロプロテイナーゼは、RA患者の滑液および組織中でアップレギュレートされることが知られている(McCachren, Arthritis Rheum. 34: 1085−1093, 1991; Keyszerら、J. Rheumatol. 26: 251−258, 1991; Keyszeら、Z. Rheumatology 57: 392−398, 1998; Matsuyama, Pediatr. Int. 41: 239−245, 1999)。
【0218】
本発明の実施例および具体例は、CyPAが好中球に対し化学走性であり(Sherryら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3511−3515, 1992; Xuら、J. Biol. Chem. 267: 11968−11971, 1992; Leiva & Lyttle, Biochem. Biophys. Res. Commun. 186: 1178−1183, 1992)、CyPAが活性なRA疾患患者の関節において顕著にアップレギュレートされ、RA疾患の重篤度と相関する(Billichら、J. Exp. Med. 185:975−980, 1997)という本発明者らおよびその他による以前の証明を考慮して、CyPが、RA関節に存在する好中球および繊維芽細胞上に発現されているEMMPRINへの結合および該EMMPRINを介するシグナリングを介して、慢性関節リウマチに関連する病理のいくつかの媒介となることを示す。
【0219】
該相互作用を阻害することは、炎症を起こした関節中への好中球の浸潤を抑制し、滑膜中へ放出されるプロMMP−1およびプロMMP−3の量を減少させ、それにより、疾患関連病理を減少させ、最終的に患者に利益を提供するであろう。
【0220】
HIV−1感染および後天性免疫不全症候群(AIDS)
本発明の実施例および具体例はまた、付加的および新規な関係分子としてEMMPRINを提供し、かくして、HIV−1感染の間にウイルス性蛋白質および細胞性蛋白質間の複雑な相互作用における新規な治療的介入標的を提供する。詳細には、抗−CD147(すなわち、抗−EMMPRIN)mAb(UM−8D6)は、ウイルス−細胞融合後であって逆転写を支持する機能的組み込み前複合体(PIC)の形成前であるHIV−1複製における工程を阻害した。
【0221】
特定の理論に限定されることなく、本発明に一致した最も有望なメカニズムは、EMMPRINがウイルスの脱外被および逆転写を起こすことのできる細胞レベル以下のコンパートメント(すなわち、細胞骨格)中への移動を容易にすることである。有意には、抗−CD147(UM−8D6)は、CyPA−独立性感染を展示するCsA−耐性HIV−1変異体(CA蛋白質変異を有するA224E)の複製を阻害しなかったが、ウイルス感染におけるCyPA−依存性工程を干渉する。
よって、HIVウイルスは、その目的に全CyPA/EMMPRIN相互作用経路を徴用する。
【0222】
癌および結合組織疾患
本発明はまた、癌および多くの結合組織疾患の治療法を提供する。かかる有用性は、(1)EMMPRIN−発現性腫瘍細胞がそれと共培養された繊維芽細胞においてMMPsの発現をアップレギュレートすることを示されたという事実(Biswasら、Cancer Res. 55: 434−439, 1995)によって、(2)本明細書中に開示されたような、ヒト繊維芽細胞におけるCyPにより活性化および/または増強されるMMP生産によって、および(3)MMPsの脱調節された作用が、例えば、関節炎、歯周炎、組織潰瘍を包含する多くの結合組織疾患ならびに癌細胞侵入および転移において細胞外マトリックスの病理学上の崩壊に寄与する(Kahariら、Exp. Dermatol. 6: 199−213, 1997; Keyszerら、J. Rheumatol. 26: 251−258, 1999; Benbowら、J. Biol. Chem. 274:25371−25378, 1999; Keyszerら、Z. Rheumatology 57: 392−398, 1998)。
【図面の簡単な説明】
【図1A】図1Aは、本発明によって単離されたcDNAクローン(配列番号1)によってコードされるヒトEMMPRIN蛋白質の概略図を示す。
【図1B】図1Bは、[35S]−標識したEMMPRINがCyPAセファロースアフィニティー樹脂によって特異的に保持されたことを示す。
【図2】図2は、空のベクターで安定にトランスフェクトされたCHO細胞(CHO)またはEMMPRIN発現CHO細胞系統(CHO−EMM)におけるEMMPRIN発現のFACS分析を示す。
【図3】図3は、CHO(EMMPRIN発現なし)またはCHO−EMM細胞(安定な構造的EMMPRIN発現)におけるCa2+動員が外来的に加えられたCyPA(10μg/ml)によって誘導されたことを示す(左側のパネル)。
【図4】図4は、ゲニステイン(チロシンキナーゼ阻害剤)がCHO−EMM細胞においてCyPAにより誘導されるEMMPRIN媒介性Ca2+動員を完全に排除したことを示す。
【図5】図5は、WI−38ヒト初代肺繊維芽細胞におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)発現に対するCyPA処理の影響のウェスタンイムノブロット分析を示す。
【図6】図6は、ルシフェラーゼ(図6Aおよび図6B)およびHIV−1逆転写酵素活性(図6C)の分析を示す。
【図7A】図7Aは、抗−CD147mAbがヒト初代PBMCにおけるHIV−1複製を阻害したことを示す。
【図7B】図7Bは、抗−CD147mAbがヒトPBMCへのHIV付着を阻害しなかったことを示す。
【図7C】図7Cは、抗−CD147mAbが、PBMCとHIV−1 ADAおよびLAV外被を発現しているHeLa細胞との間のHIV Env媒介性融合を阻害せず、また、ウイルス性p24の細胞インターナリゼーションを減少させなかったことを示す。
【図7D】図7Dは、抗−CD147mAbがHIV−1逆転写量を減少させたことを示す。
【図7E】図7Eは、HIV−1蛋白質の細胞レベル以下の分布に対する抗−CD147mAbの影響を示す。
【図8】図8は、CsA耐性HIVウイルス株の複製が抗−CD147mAbによって阻害されなかったことを示す。
【図9】図9は、EMMPRIN膜貫通領域のアミノ末端由来の8アミノ酸ポリペプチド(配列番号3)がEnvMuLV偽型ルシフェラーゼ発現性HIV−1によるCHO−EMM細胞の感染を阻害したことを示す。左側のパネルは、CD147の概略構造(”sp”=シグナルペプチド、”e”=細胞外ドメイン、”t”=膜貫通ドメインおよび”c”=細胞質ドメイン)およびその膜貫通ドメイン由来の2つのペプチド(”ペプチド1”および”ペプチド2”)を示す。右側のパネルは、所定濃度のペプチド1、2および”スクランブルペプチド1”の存在下、組換えEnvMuLV−偽型ルシフェラーゼ発現性HIV−1で感染させたCHOおよびCHO−EMM細胞の感染後4日目のルシフェラーゼ発現データを示す。
Claims (42)
- 炎症性疾患、自己免疫疾患、組織潰瘍、腫瘍成長または転移あるいは治療が必要な患者における局所的または全身性のCyP放出、合成または結合によって特徴付けられるいずれかの症状を治療または予防する方法であって、抗−EMMPRIN抗体、可溶性EMMPRIN蛋白質またはポリペプチド、CyP蛋白質またはポリペプチドおよびその組み合わせよりなる群から選択されるCyP/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストの治療上有効量を患者に投与することを特徴とする方法。
- 炎症性または自己免疫疾患が関節炎、EAE、ARDSまたは歯周炎である請求項1記載の方法。
- CyP/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストが抗−EMMPRIN抗体である請求項1記載の方法。
- 抗−EMMPRIN抗体がEMMPRINの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインに結合する請求項3記載の方法。
- 抗−EMMPRIN抗体がUM−8D6抗−CD147モノクローナル抗体によって認識されるエピトープに結合する請求項4記載の方法。
- CyP/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストが、EMMPRIN膜貫通ドメインに対応する配列番号2のおよその残基206からおよその残基229までにわたる配列から取り出した約5〜14個のアミノ酸のアミノ酸配列を含むEMMPRNポリペプチドである請求項1記載の方法。
- 炎症性疾患、自己免疫疾患、組織潰瘍、腫瘍成長または転移あるいは治療が必要な患者における局所的または全身性のCyP放出、合成または結合によって特徴付けられるいずれかの症状を治療または予防する方法であって、治療上有効量の式I:
I R1−R2−R3−R4−R5−R6−Pro−R7−R8−R9
[式中、R1−は、His−、SerHis−、ArgSerHis−、Lys−、LysLys−、Arg−であるか、または存在せず;R2、R3およびR4は独立して、Leu、Ile、Ala、Metであるか、または存在せず;R5およびR8は独立して、Leu、Ile、AlaまたはMetであり;R6およびR7は独立して、Phe、TrpまたはTyrであり;−R9は、−Gly、−GlyIle、−GlyIleValであるか、または存在しない]
で示される化合物を患者に投与することを特徴とする方法。 - 式I中、R1−は、His−、SerHis−、ArgSerHis−、Lys−、LysLys−、Arg−であるか、または存在せず;R2−はLeuであり;R3はAlaであり;R4はAlaであり;R5はLeuであり;R6はTrpであり;R7はPheであり;R8はLeuであり;−R9は存在しない請求項7記載の方法。
- 式I中、R1−は存在せず;R2−はLeuであり;R3はAlaであり;R4はAlaであり;R5はLeuであり;R6はTrpであり;R7はPheであり;R8はLeuであり;−R9は存在しない請求項8記載の方法。
- 細胞が機能的EMMPRIN受容体を発現し、レトロウイルスがウイルス感染の組み込み前工程において該EMMPRIN受容体を利用するレトロウイルス感染に対する細胞の感受性を減少させる方法であって、レトロウイルス感染の組み込み前工程を阻害するのに十分な量のCyPA/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストと該細胞とを接触させることを特徴とし、ここに、CyPA/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストが抗−EMMPRIN抗体、可溶性EMMPRIN蛋白質またはポリペプチド、CyPA蛋白質またはポリペプチドおよびその組み合わせからなる群より選択される方法。
- CyPA/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストが抗−EMMPRIN抗体である請求項10記載の方法。
- 抗−EMMPRIN抗体がEMMPRINの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインに結合する請求項11記載の方法。
- 抗−EMMPRIN抗体がUM−8D6抗−CD147モノクローナル抗体によって認識されるエピトープに結合する請求項12記載の方法。
- CyP/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストが、EMMPRIN膜貫通ドメインに対応する配列番号2のおよその残基206からおよその残基229までにわたる配列から取り出した約5〜14個のアミノ酸のアミノ酸配列を含むEMMPRNポリペプチドである請求項10記載の方法。
- 細胞が機能的EMMPRIN受容体を発現し、レトロウイルスがウイルス感染の組み込み前工程においてEMMPRIN受容体を利用するレトロウイルス感染に対する細胞の感受性を減少させる方法であって、該細胞をレトロウイルス感染の組み込み前工程を阻害するのに十分な量の式I:
I R1−R2−R3−R4−R5−R6−Pro−R7−R8−R9
[式中、R1−は、His−、SerHis−、ArgSerHis−、Lys−、LysLys−、Arg−であるか、または存在せず;R2、R3およびR4は独立して、Leu、Ile、Ala、Metであるか、または存在せず;R5およびR8は独立して、Leu、Ile、AlaまたはMetであり;R6およびR7は独立して、Phe、TrpまたはTyrであり;−R9は、−Gly、−GlyIle、−GlyIleValであるか、または存在しない]
で示される化合物と接触させることを特徴とする方法。 - 式I中、R1−は、His−、SerHis−、ArgSerHis−、Lys−、LysLys−、Arg−であるか、または存在せず;R2はLeuであり;R3はAlaであり;R4はAlaであり;R5はLeuであり;R6はTrpであり;R7はPheであり;R8はLeuであり;−R9は存在しない請求項15記載の方法。
- 式I中、R1−は存在せず;R2−はLeuであり;R3はAlaであり;R4はAlaであり;R5はLeuであり;R6はTrpであり;R7はPheであり;R8はLeuであり;−R9は存在しない請求項16記載の方法。
- HIV感染、AIDSまたはAIDS関連障害をその治療が必要な患者において治療または予防する方法であって、抗−EMMPRIN抗体、可溶性EMMPRIN蛋白質またはポリペプチド、CyPA蛋白質またはポリペプチドおよびその組み合わせよりなる群から選択されるCyPA/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストの治療上有効量を患者に投与することを特徴とする方法。
- CyPA/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストが抗−EMMPRIN抗体である請求項18記載の方法。
- 抗−EMMPRIN抗体がEMMPRINの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインに結合する請求項19記載の方法。
- 抗−EMMPRIN抗体がUM−8D6抗−CD147モノクローナル抗体によって認識されるエピトープに結合する請求項20記載の方法。
- CyP/EMMPRINアンタゴニストまたはアゴニストが、EMMPRIN膜貫通ドメインに対応する配列番号2のおよその残基206からおよその残基229までにわたる配列から取り出した約5〜14個のアミノ酸のアミノ酸配列を含むEMMPRNポリペプチドである請求項18記載の方法
- HIV感染、AIDSまたはAIDS関連障害をその治療が必要な患者において治療または予防する方法であって、治療上有効量の式I:
I R1−R2−R3−R4−R5−R6−Pro−R7−R8−R9
[式中、R1−は、His−、SerHis−、ArgSerHis−、Lys−、LysLys−、Arg−であるか、または存在せず;R2、R3およびR4は独立して、Leu、Ile、Ala、Metであるか、または存在せず;R5およびR8は独立して、Leu、Ile、AlaまたはMetであり;R6およびR7は独立して、Phe、TrpまたはTyrであり;−R9は、−Gly、−GlyIle、−GlyIleValであるか、または存在しない]
で示される化合物を患者に投与することを特徴とする方法。 - 式I中、R1−は、His−、SerHis−、ArgSerHis−、Lys−、LysLys−、Arg−であるか、または存在せず;R2はLeuであり;R3はAlaであり;R4はAlaであり;R5はLeuであり;R6はTrpであり;R7はPheであり;R8はLeuであり;−R9は存在しない請求項23記載の方法。
- 式I中、R1−は存在せず;R2はLeuであり;R3はAlaであり;R4はAlaであり;R5はLeuであり;R6はTrpであり;R7はPheであり;R8はLeuであり;−R9は存在しない請求項24記載の方法。
- 抗体がモノクローナル抗体である請求項3、11または19のいずれか1項記載の方法。
- モノクローナル抗体が1本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはFabフラグメントである請求項26記載の方法。
- HIV感染、AIDSまたはAIDS関連障害、炎症性疾患、自己免疫疾患、組織潰瘍、腫瘍成長または転移あるいは治療が必要な患者における局所的または全身性のCyP放出、合成または結合によって特徴付けられるいずれかの症状に対して治療活性を有する試験化合物を同定する方法であって:
(a)試験化合物を機能的CyP蛋白質および機能的EMMPRIN蛋白質と接触させ、ここに、該蛋白質の少なくとも1つが検出可能なラベルを有し;
(b)いずれかの得られるEMMPRIN/CyP複合体を該ラベルの存在についてアッセイし;次いで
(c)試験化合物がCyP蛋白質のEMMPRIN蛋白質への結合を阻害したかどうかを決定し、それにより、CyP蛋白質のEMMPRIN蛋白質への結合を阻害する試験化合物が治療化合物として同定される
ことを特徴とする方法。 - 機能的EMMPRIN蛋白質または機能的CyP蛋白質のいずれかが固相上に固定されている請求項28記載の方法。
- CyP蛋白質またはEMMPRIN蛋白質が放射能ラベル、蛍光レポーターまたはクエンチャー部分、比色または蛍光変化を触媒する酵素ラベルあるいはその組み合わせで標識されている請求項28記載の方法。
- 炎症性または自己免疫疾患が関節炎、EAE、ARDSまたは歯周炎である請求項28記載の方法。
- HIV感染、AIDSまたはAIDS関連障害、炎症性疾患、自己免疫疾患、腫瘍成長または転移あるいは治療が必要な患者における局所的または全身性のCyP放出、合成または結合によって特徴付けられるいずれかの症状に対して治療活性を有する試験化合物を同定する方法であって:
(a)試験化合物を機能的CyP蛋白質の存在下、機能的EMMPRIN蛋白質を発現している細胞と接触させ;次いで
(b)試験化合物がCyP蛋白質のEMMPRIN蛋白質への結合を阻害するかどうかを決定し、それにより、CyP蛋白質のEMMPRIN蛋白質への結合を阻害する試験化合物が治療化合物として同定される
ことを特徴とする方法。 - 炎症性または自己免疫疾患が関節炎、EAE、ARDSまたは歯周炎である請求項32記載の方法。
- 細胞が組換え型EMMPRIN、CD4、CXCR4またはその組み合わせを発現する請求項32記載の方法。
- CyP蛋白質のEMMPRIN蛋白質への結合の阻害の決定が、CyP/EMMPRINアンタゴニストアッセイ、受容体感作または脱感作アッセイ、受容体アップまたはダウンレギュレーションアッセイ、EMMPRIN媒介性シグナル変換アッセイ、Ca2+動員アッセイ、マトリックスメタロプロテイナーゼ発現または活性アッセイ、細胞成長率アッセイ、HIV−1感染アッセイ、および細胞周期または細胞分化の特異的マーカーの検出に基づくアッセイよりなる群から選択されるアッセイに基づいている請求項32記載の方法。
- EMMPRIN媒介性シグナル変換アッセイが、Ras、PKA、RAP1、B−Raf、MekおよびMAPKよりなる群から選択される細胞内蛋白質のリン酸化または活性化状態の決定をし、それにより、該蛋白質のリン酸化または活性化状態を、対照細胞におけるそのリン酸化または活性化状態と比べて変化させる試験化合物が治療化合物として同定されることに基づく請求項35記載の方法。
- 細胞周期または細胞分化の特異的マーカーが、細胞周期調節蛋白質サイクリンD1、サイクリンEおよびp21/Waf1よりなる群から選択され、それにより、該細胞周期マーカーを、対照細胞におけるその状態と比べて変化させる試験化合物が治療化合物として同定される請求項35記載の方法。
- マトリックスメタロプロテイナーゼ発現アッセイがプロMMP−1、プロMMP−3、プロMMP−9、MMP−1、MMP−3またはMMP−9の発現または活性を測定する請求項35記載の方法。
- HIV−1感染アッセイがウイルス性逆転写酵素活性またはウイルスに指示されたルシフェラーゼ発現を測定する請求項35記載の方法。
- 式I:
I R1−R2−R3−R4−R5−R6−Pro−R7−R8−R9
[式中、R1−は、His−、SerHis−、ArgSerHis−、Lys−、LysLys−、Arg−であるか、または存在せず;R2、R3およびR4は独立して、Leu、Ile、Ala、Metであるか、または存在せず;R5およびR8は独立して、Leu、Ile、AlaまたはMetであり;R6およびR7は独立して、Phe、TrpまたはTyrであり;−R9は、−Gly、−GlyIle、−GlyIleValであるか、または存在しない]
で示される化合物またはその医薬上許容される塩、および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。 - 式I中、R1−は、His−、SerHis−、ArgSerHis−、Lys−、LysLys−、Arg−であるか、または存在せず;R2はLeuであり;R3はAlaであり;R4はAlaであり;R5はLeuであり;R6はTrpであり;R7はPheであり;R8はLeuであり;−R9は存在しない請求項40記載の医薬組成物。
- 式I中、R1−は存在せず;R2はLeuであり;R3はAlaであり;R4はAlaであり;R5はLeuであり;R6はTrpであり;R7はPheであり;R8はLeuであり;−R9は存在しない請求項41記載の医薬組成物。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007126418A (ja) * | 2005-11-07 | 2007-05-24 | Tokyo Univ Of Pharmacy & Life Science | Mmp−1の部分ペプチドを用いた癌浸潤・転移阻害薬 |
JP2008511289A (ja) * | 2004-07-23 | 2008-04-17 | ジーイー・ヘルスケア・ユーケイ・リミテッド | 細胞周期フェーズマーカー |
JP2015524418A (ja) * | 2012-07-27 | 2015-08-24 | アンスティテュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル | 血管内皮細胞への髄膜炎菌の線毛媒介接着の受容体としてのcd147 |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1442203A (zh) * | 2003-05-15 | 2003-09-17 | 陈志南 | Sars冠状病毒和aids病毒(hiv-1)-cd147受体靶位拮抗剂 |
AU2004317548A1 (en) * | 2004-03-25 | 2005-10-06 | Centocor, Inc. | Use of EMMPRIN antagonists for the treatment of diseases associated with excessive angiogenesis |
US8007808B2 (en) * | 2008-04-04 | 2011-08-30 | The Board Of Trustees Of The Univeristy Of Illinois | Composition and method for facilitating the internalization of a therapeutic agent into a cell |
CA2725534A1 (en) * | 2008-05-23 | 2009-11-26 | Uti Limited Partnership | Inhibition of emmprin to treat multiple sclerosis |
US8338171B2 (en) * | 2009-08-31 | 2012-12-25 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Baboon homolog of human CD147 |
WO2016054354A1 (en) * | 2014-10-02 | 2016-04-07 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods for treating malignancies |
CN111420048B (zh) * | 2020-03-11 | 2023-09-19 | 中国人民解放军第四军医大学 | 抗basigin人源化抗体用于制备治疗新型冠状病毒肺炎药物的应用 |
CN117187190A (zh) * | 2023-11-07 | 2023-12-08 | 深圳湾实验室 | 抗亲环素a单抗及其在类风湿性关节炎治疗中的应用 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5840305A (en) * | 1996-03-14 | 1998-11-24 | The Picower Institute For Medical Research | Treatment of HIV-Infection by interfering with host cell cyclophilin receptor activity |
JP2002505097A (ja) * | 1998-03-03 | 2002-02-19 | アブジェニックス インク. | 治療薬としてのcd147結合分子 |
-
2001
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- 2001-08-10 AU AU2001283295A patent/AU2001283295A1/en not_active Abandoned
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008511289A (ja) * | 2004-07-23 | 2008-04-17 | ジーイー・ヘルスケア・ユーケイ・リミテッド | 細胞周期フェーズマーカー |
JP2007126418A (ja) * | 2005-11-07 | 2007-05-24 | Tokyo Univ Of Pharmacy & Life Science | Mmp−1の部分ペプチドを用いた癌浸潤・転移阻害薬 |
JP2015524418A (ja) * | 2012-07-27 | 2015-08-24 | アンスティテュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル | 血管内皮細胞への髄膜炎菌の線毛媒介接着の受容体としてのcd147 |
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