CN1442203A - Sars冠状病毒和aids病毒（hiv－1）－cd147受体靶位拮抗剂 - Google Patents

Sars冠状病毒和aids病毒（hiv－1）－cd147受体靶位拮抗剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术及医药领域，特别是SARS冠状病毒、AIDS病毒－CD147受体靶位拮抗剂。本发明首次以HAb18G/CD147分子为靶点，设计、筛选并合成SARS冠状病毒和AIDS病毒(HIV－1)－CD147受体靶位系统产生的抗SARS冠状病毒抗体、多肽、免疫复合物、衍生物、小分子化合物等拮抗剂，能阻止SARS冠状病毒及AIDS病毒(HIV－1)侵入宿主细胞，从而发挥拮抗的抗病毒效应。经体外实验证明，这类拮抗剂对SARS冠状病毒、AIDS病毒(HIV－1)有抑制作用。因而具有新药研发应用前景。

Description

SARS冠状病毒和AIDS病毒(HIV-1)-CD147受体靶位拮抗剂
技术领域
本发明涉及生物技术及医药领域，特别是SARS冠状病毒、AIDS病毒(HIV-1)-CD147受体靶位拮抗剂。
背景技术
目前全世界近33个国家和地区流行非典型肺炎(SARS)疾病，截止5月12日全世界总患病人数达7447例，死亡病例达到552例，全国内地有25个省市流行发病，累计报告5013例，死亡252例。
由于SARS近距离传播，流行地区广泛，发病进展快，以发烧、干咳、肺渗出实变至呼吸衰竭。SARS病毒变异较快，又是新发现的传染病，目前世界上还来不及制备疫苗，也尚未找到特效的治疗药物，迄今为止，临床暂时试用方法主要有：1.使用抗病毒药，如神经氨酸酶抑制剂---奥司他韦，病毒唑--利巴韦林，胸腺肽。2.使用糖皮质激素，如地塞米松。3.使用持续气道正压通气。4.使用IgM。5.使用中医药等。但以上方法疗效均不明显。
AIDS是我国重点控制的重大疾病，也是全球关注的重要公共卫生和社会热点问题。联合国AIDS规划署和世界卫生组织于2002年12月1日世界AIDS日前发布最新统计数据表明，AIDS在全世界的流行不断加剧，每天新感染HIV的人数已从1995年以前的8000人上升到目前的15000人，在短短的二十年间全球AIDS病毒(HIV)感染者累计已超过6000万例，其中2000多万例已经死亡，仅2002年已有310万人死于AIDS。全球AIDS使南部非洲一些国家的国民人均期望寿命从60-70岁降回到40-50岁，国民总产值下降了10％。
目前亚洲已成为AIDS在全球流行最快的地域，我国的AIDS流行现状也十分严峻，专家估计感染人数超过100万人。如果没有强有力的控制措施，按此速度流行，到2010年HIV感染者有可能达到1000万人。如果不采取有力措施加以控制，我国人民生命财产和社会发展将蒙受巨大损失。
经Medline，Pubmedline，Google等检索工具检索，均表明无有关SARS治疗用途的单克隆抗体，多肽，衍生物，免疫复合物，小分子化合物等拮抗剂的研究报告。AIDS除了逆转录酶抑制剂以外，也无明确的治疗有效的受体拮抗剂等药物。因此筛选特异性抗SARS、AIDS病毒(HIV-1)药物乃当务之急，它是降低发病率及死亡率的有效手段。
发明内容
本发明的目的提供一种SARS冠状病毒、AIDS病毒(HIV-1)-CD147受体靶位拮抗剂。
SARS冠状病毒和AIDS病毒(HIV-1)-CD147受体靶位拮抗剂，包括HAb18抗体、HAb18G/CD147肽类拮抗剂或HAb18G/CD147系列相关抗体、多肽、免疫复合物、衍生物、小分子化合物。
所述的抗体HAb18的轻、重链可变区基因，其具有序列表<400>1、<400>2的序列。
HAB18G/CD147肽类拮抗剂，其具有序列表<400>3-11序列。
本发明是针对SARS冠状病毒、AIDS病毒-CD147系统的一组拮抗物。其主要技术特征为首次以HAb18G/CD147分子为靶点，设计、筛选并合成的抗体、肽类拮抗剂；能阻止SARS冠状病毒及AIDS病毒(HIV-1)侵入宿主细胞，从而发挥拮抗的抗病毒效应。经体外实验证明，这类拮抗剂对SARS冠状病毒、AIDS病毒(HIV-1)有抑制作用。因而具有新药研发应用前景。
具体实施方式
本申请人在长期从事肝癌免疫导向药物研究的基础上，获得肝癌高亲和力单抗HAb18。以此单抗为配体，用亲合层析方法纯化从HHCC(肝癌细胞)粗提的膜抗原，获得HAb18G天然纯抗原；并用该单抗从人肝癌组织cDNA文库中筛选得到相应的编码序列，查询Gene Bank发现该序列与白细胞分化抗原CD147分子高度同源，因此该分子属于CD147分子家族。由于是用抗体HAb18得到该蛋白分子，故将其命名为HAb18G/CD147。
通过基底膜侵袭实验和明胶酶谱实验分析，证实HAb18G分子在肿瘤、炎症及病毒感染作用方面有一定的相关性。基于以上研究基础，我们将HAb18G-AP-1，6，9和HAb18单抗加入293细胞(在本实验中，该细胞是SARS冠状病毒感染的宿主细胞)、MT-4细胞(在本实验中，该细胞是HIV-1感染的宿主细胞)中，分别采用病毒CPE法、病毒P24测定方法，观察以上不同浓度的HAb18G-AP-1，6，9和HAb18单抗对BJ04冠状病毒、HIV病毒的抑制效果，结果表明，以上药物候选物均具有抑制SARS冠状病毒的作用，HAb18G-AP-9对HIV病毒具有抑制作用。
因此，在本发明的第一方面，提供了来源于抗原发性肝细胞肝癌的相关分子HAb18G/CD147单抗HAb18的轻重链可变区基因，其序列如下：①重链可变区基因ggggatatcc  acc atg aac ttc ggg ctg agc tgg gtt ttc ata gtt att  49ctc tta aaa ggt gtc cag agt gaa gtg aag ctt gag gag tct gga gga  97ggc ttg gtg caa cct gga gga tcc atg aaa ctg tct tgt gtt gcc tct 145gga ttc act ttt agt gac gcc tgg atg gac tgg gtc cgc cag tct cca 193gag aag gga ctt gag tgg gtt gct gaa att aga agc aaa gct aat aat 241cat gca cca tac tat act gag tct gtg aaa ggg agg ttc acc atc tca 289cga gat gat tcc aaa agt att atc tac ctg caa atg aac aac tta aga 337gct gaa gac act ggc att tat tac tgt acc agg gat agc acg gct acc 385cac tgg ggc caa ggg act ctg gtc act gtc tct tca gct agc acg aca 433gcc cca  tca  gtc  445②轻链可变区基因ggggatatcc  acc atg gac tca cat act cag gtc ttt ata ttt cta ctg  49ctc tgt gtg tct ggt gcc cat ggg agt att gtg atg acc cag act ccc  97aca ttc ctg gtt gta tca gca gga gac agg gtt acc ata acc tgc aag 145gcc agt cag agt gtg att aat gat gta gct tgg tac caa cag aag cca 193ggg cag tct cct aaa ctg ctg ata ttc tat gca tcc aat cgc aac act 241gga gtt cct gat cgc ttc act ggc agt gga tat ggg acg gat ttc act 289ttc acc atc agc act gtg cag gct gaa gac ctg gca gtt tat ttc tgt 337cag cag gat tat agt cct cca ttc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ctg 385gaa atc aaa cgc  aag  tcg  act  gca  cca  act  gta  tcc  421
在本发明的第二方面，提供了HAb18G/CD147的肽类拮抗剂，其氨基酸序列如下：(1)Met Thr His Asp Pro Val Ile Ser Leu Pro Thr Thr；(2)Leu His Arg His Ser His Gly His Ser Tyr Lys Ser；(3)Gly His Trp His Asn His Arg His Gln Ala Pro Leu；(4)Lys Tyr Pro His Gln His Leu His Met His Asp Ser；(5)Ile Gly Trp His Tyr Tyr Leu Arg Thr Gln His Ser；(6)Tyr Pro Phe His His Lys His Trp His Arg Pro Asn；(7)Ala Asn Ile Val Pro Ile His Ala Asn His Phe Gln；(8)Met His Lys His Pro His Gly Ser Gln Gly Pro Thr；(9)Tyr Lys Leu Pro Gly His His His His Tyr Arg Pro。
9条靶向HAb18G/CD147的高亲和力肽类拮抗剂的理化性质肽    氨基酸序列    酸性氨基酸    碱性氨基酸    疏水性氨基酸   分子量    等电点    平均疏水指数   半衰期
                   (％)            (％)           (％)                                         (h)AP-1  MTHDPVISLPTT     8.3        8.3           41.7           1311.5    5.06        0.133         30.0AP-2  LHRHSHGHSYKS     0.0        50.0          16.7           1445.5    9.99       -1.792         5.5AP-3  GHWHNHRHQAPL     0.0        41.7          30.0           1489.6    9.78       -1.800         30.0AP-4  KYPHQHLHMHDS  8.3    41.7    16.7    1529.7  7.10    -1.808    1.3AP-5  IGWHYYLRTQHS  0.0    25.0    25.0    1560.7  8.60    -0.958   20.0AP-6  YPFHHKHWHRPN  0.0    50.0    25.0    1655.8  9.99    -2.275    2.8AP-7  ANIVPIHANHFQ  0.0    16.7    58.3    1360.5  6.96     0.092    4.4AP-8  MHKHPHGSQGPT  0.0    33.3    33.3    1313.4  8.56    -1.717   30.0AP-9  YKLPGHHHHYRP  0.0    50.0    33.3    1541.7  9.70    -1.967    2.8
在本发明的第三方面，提供了用于抑制SARS冠状病毒的HAb18G/CD147分子的拮抗剂。根据人类免疫缺陷病毒(HIV-1)可与环亲和素A(Cyclophilin A)形成复合物，而环亲和素A又可以通过与细胞膜上的受体CD147分子结合，促进病毒进入细胞的原理，考虑该拮抗剂抗SARS冠状病毒的机理，也是通过Cyclophilin A-CD147系统进入宿主细胞感染扩增的，因此采用CD147分子的拮抗剂(抗体、多肽、复合物、衍生物及小分子化合物)，是预防、治疗SARS疾病的有效途径。
抗SARS冠状病毒的药效学研究：
预备试验：
1.HAb18G-AP-1、AP-6、AP-9、HAb18对293细胞的毒性的测定
293细胞以40万/ml浓度接种96孔培养板，37℃、5％CO2培养24小时，加入验证药物，验证药物HAb18G-AP-1、AP-6、AP-9、HAb18倍比稀释为1000μg/ml～1.45μg/ml，阳性对照药物更昔洛韦稀释为6000μg/ml～11.7μg/ml，每浓度接种3孔，每孔100μl，同时设正常细胞对照，37℃、5％CO2孵箱培养6天，每天在倒置显微镜下观察细胞形态变化(CPE)，以25％以下形态变化为“+”，26％～50％形态变化为“++”，51％～75％形态变化为“+++”，76％～100％形态变化为“++++”，用Reed-Muench法，计算药物半数中毒浓度(TD50)和最大无毒浓度(TD50)。
2.在293细胞培养内对冠状病毒04号的毒力的测定
冠状病毒04号的分离(SARS病人血清分离)：
293细胞以每毫升40万浓度接种试管，37℃、5％CO2培养24小时，弃掉培养液，每管加入SARS病人血清0.2ml，33℃转鼓培养5～7天。细胞出现CPE变化后，采用PCR的方法检测冠状病毒，04号标本PCR阳性，确定为冠状病毒分离株。用终未稀释法纯化病毒2次，PCR检测冠状病毒仍为阳性，经免疫荧光测定双份SARS病人血清，IgM阳性，IgG4倍升高，确定为冠状病毒。采用病毒CPE法测定其效价。
病毒CPE法：
293细胞以每毫升40万浓度接种96孔培养板，37℃、5％CO2培养24小时，加入病毒液，病毒稀释101～10-8，8个浓度，每浓度3孔，每孔100μl，设正常细胞对照，37℃、5％CO2培养5～7天，每24小时在倒置显微镜下观察记录细胞形态变化(CPE)：以25％以下变化为“+”，26％～50％变化为“++”，51％～750％变化为“+++”，76％～100％变化为“++++”，用Reed-Muench法，计算病毒半数感染浓度TCID50。
正式试验：
HAb18G-AP-1、AP-6、AP-9、HAb18在293细胞培养内对冠状病毒04号的抑制作用
试验目的：
观察不同浓度的HAb18G-AP-1、AP-6、AP-9在293细胞培养内对冠状病毒04号的抑制作用，试验采用病毒细胞(CPE)法，计算药物的半数有效浓度(IC50)和最小浓度(MIC)及治疗指数TI，判断药效。
293细胞以40万/ml浓度接种96孔培养板，37℃、5％CO2培养24小时，细胞培养至单层，弃掉培养液，加入100 TCID50的冠状病毒液，同时设正常细胞对照和病毒对照，置37℃、5％CO2培养2小时后，弃掉病毒液，加入不同浓度的HAb18G-AP-1、AP-6、AP-9药液，药物选用对细胞的最大无毒浓度(TD0)2倍稀释10个浓度即1000μg/ml～1.45μg/ml，阳性对照药物更昔洛韦为2倍稀释10个浓度即6000μg/ml～11.7μg/ml，将稀释的药物分别加入细胞孔内，每浓度接种3孔，同时设正常细胞对照和病毒对照，置37℃、5％CO2培养箱培养5～7天，逐日在倒置显微镜下病毒CPE，以病毒对照出现+++-++++时结束试验，用Reed-Muench法，计算药物半数有效浓度(IC50)和最小浓度(MIC)及治疗指数(TI)判断药效，试验重复三次。
试验结果
预备试验结果：
HAb18G-AP-1、AP-6、AP-9、HAb18对293细胞的毒性作用
以上药物和阳性对照药物注射用更昔洛韦在293细胞培养内，采用细胞形态变化(CPE)法。计算药物最大浓度(TD0)和半数中毒浓度(TD50)，以下试验结果为三次试验结果的均值。
1、HAb18G-AP-1、AP-6、AP-9、HAb18对293细胞的毒性试验结果
验证药物：
HAb18G-AP-1：最大无毒浓度(TD0)为＞1000±0μg/ml，半数中毒浓度(TD50)为＞1000±0μg/ml
HAb18G-AP-6：最大无毒浓度(TD0)为＞1000±0μg/ml，半数中毒浓度(TD50)为＞1000±0μg/ml
HAb18G-AP-9：最大无毒浓度(TD0)为＞1000±0μg/ml，半数中毒浓度(TD50)为＞1000±0μg/ml
HAb18：最大无毒浓度(TD0)为＞1000±0μg/ml，半数中毒浓度(TD50)为＞1000±0μg/ml
阳性对照药物：
注射用更昔洛韦：最大无毒浓度(TD0)为＞6000±0μg/ml，半数中毒浓度(TD50)为＞6000±0μg/ml。
2.在293细胞培养内对冠状病毒04号的毒力的测定结果(TCID50)
冠状病毒04号：半数感染数量(TCID50)为10-3
正式试验结果
HAb18G-AP-1、AP-6、AP-9和HAb18在293细胞培养内对冠状病毒04号的抑制作用(以下试验数据为三次试验结果的均值)
验证药物：
HAb18G-AP-1：CPE法，药物的半数有效浓度(IC50)为31.25±0μg/ml，最小浓度(MIC)为62.25±0μg/ml，及治疗指数(TI)为16。
HAb18G-AP-6：CPE法，药物的半数有效浓度(IC50)为31.25±0μg/ml，最小浓度(MIC)为62.25±0μg/ml，及治疗指数(TI)为16。
HAb18G-AP-9：CPE法，药物的半数有效浓度(IC50)为31.25±0μg/ml，最小浓度(MIC)为62.25±0μg/ml，及治疗指数(TI)为16。
HAb18：CPE法，药物的半数有效浓度(IC50)为31.25±0μg/ml，最小浓度(MIC)为62.25±0μg/ml，及治疗指数(TI)为16。
阳性对照药物：
注射用更昔洛韦：CPE法，药物半数有效浓度(IC50)为11.7μg/ml±0μg/ml，最小浓度(MIC)为23.44μg/ml±0，治疗指数(TI)为256。
总结
以上试验表明HAb18G-AP-1、AP-6、AP-9及HAb18在293细胞培养内，采用病毒CPE法，具有抑制冠状病毒的作用。
抗HIV病毒的药效学研究：
1.HAb18G-AP-1、AP-6、AP-9对MT-4细胞的毒性的测定
MT-4细胞以40万/ml浓度接种96孔培养板，37℃、5％CO2培养24小时，加入验证药物，验证药物HAb18G-AP-1、AP-6、AP-9、HAb18倍比稀释为12000ng/ml～24ng/ml，每浓度接种3孔，每孔100μl，同时设正常细胞对照，37℃、5％CO2孵箱培养6天后用MTT法测定细胞生长情况。
试验结果显示：细胞生长未受影响，药物HAb18G-AP-1、AP-6、AP-9无毒副作用。
2 HAb18G-AP-1、AP-6、AP-9在MT-4细胞培养内对HIV病毒的抑制作用
试验目的：
观察不同浓度的HAb18G-AP-1、AP-6、AP-9在MT-4细胞培养内对HIV病毒的抑制作用，试验采用病毒P24测定法。
MT-4细胞以40万/ml浓度接种96孔培养板，37℃、5％CO2培养24小时，细胞培养至单层，弃掉培养液，加入100 TCID50的HIV病毒液，同时设正常细胞对照和病毒对照，置37℃、5％CO2培养2小时后，弃掉病毒液，加入不同浓度的HAb18G-AP-1、AP-6、AP-9药液，2倍稀释8个浓度为12000ng/ml～24ng/ml，每浓度接种3孔，置37℃、5％CO2培养箱培养5～7天后测定病毒P24蛋白，试验重复三次。
试验结果(下表)
结果显示HAb18G-AP-9对HIV-1病毒具有抑制作用，HAb18G-AP-1、AP-6对HIV-1病毒无抑制作用。
总结
以上试验表明HAb18G-AP-1、AP-6、AP-9在MT-4细胞培养内，采用病毒P24测定方法，HAb18G-AP-9对HIV-1病毒具有抑制作用，HAb18G-AP-1、AP-6对病毒无抑制作用。
                   HIV P24测定结果
肽的浓度(ng/ml)    24  240  480  750 1500   3000    6000   12000
  Ap-9Ap-1Ap-6   ＞3  ＞3  ＞3  ＞3  ＞3  0.265   0.396   0.298＞3  ＞3  ＞3  ＞3  ＞3   ＞3     ＞3      ＞3＞3  ＞3  ＞3  ＞3  ＞3   ＞3     ＞3      ＞3
以本发明所述的SARS冠状病毒和AIDS病毒(HIV-1)-CD147受体靶位，可以制备出针对病毒-CD147受体具体空间结构靶位的相关抗体、多肽、免疫复合物、衍生物、小分子化合物，这些不同的药物分子或前体药物分子均具有拮抗SARS冠状病毒、AIDS病毒感染人体细胞时结合细胞表面CD147受体分子同一空间结构靶位的共性。
以本发明所述的针对SARS冠状病毒和AIDS病毒(HIV-1)-CD147受体靶位的抗体的轻、重链可变区基因可以重构成一定形式的重组工程抗体(嵌合抗体、人源化抗体、小分子抗体、多价微型抗体、双特异性抗体等)、重组抗体融合蛋白、抗体蛋白免疫复合物，而用于拮抗SARS冠状病毒、AIDS病毒对人体细胞的感染。
以本发明所述的针对SARS冠状病毒和AIDS病毒(HIV-1)-CD147受体靶位的系列拮抗肽可以重构成一定形式的多肽及其复合物，可以模建成一定形式的肽类或其衍生物，可以衍生成一定形式的小分子化合物或复合物，而用于拮抗SARS冠状病毒、AIDS病毒对人体细胞的感染。

Claims (3)

1、SARS冠状病毒和AIDS病毒(HIV-1)-CD147受体靶位拮抗剂，其特征在于：包括HAb18抗体、HAb18G/CD147肽类拮抗剂或HAb18G/CD147系列相关抗体、多肽、免疫复合物、衍生物、小分子化合物。
2、如权利要求1所述的SARS冠状病毒和AIDS病毒(HIV-1)-CD147受体靶位拮抗剂，其特征在于：所述的抗体HAb18的轻、重链可变区基因，其具有序列表<400>1、<400>2的序列。
3、如权利要求1所述的SARS冠状病毒和AIDS病毒(HIV-1)-CD147受体靶位拮抗剂，其特征在于：HAB18G/CD147肽类拮抗剂，其具有序列表<400>3-11序列。
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