JP2004501923A - 発色団の改善及び発色団に関する改善 - Google Patents
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Abstract
本発明は、新規なポルフィリン及びポルフィリン系発色団並びにポルフィリンとポルフィリン系発色団との組合せに関し、これらは特に、光化学治療及び蛍光分析及び画像処理を含む光線力学的な適用に広く有用である。特に、本発明は、新規で有用なポルフィリン、クロリン及びバクテリオクロリン発色団；かかる発色団の製造方法；及びかかる発色団の分析及び医学での使用方法を提供する。
Description
【０００１】
〔発明の属する技術分野〕
本発明は、新規なポルフィリン及びポルフィリン系発色団及びポルフィリン及びポルフィリン系発色団の組合せに関し、これらは特に、光化学治療及び蛍光分析及び画像処理を含む光線力学的な適用に広く有用である。
【０００２】
〔従来の技術〕
例えば蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）における研究道具、及び光線力学的治療（ＰＤＴ）におけるインビボでの標的にされた細胞の消滅をもたらすための治療薬としての、ポルフィリン及びポルフィリン系発色団の双方の重要性は、この技術で広く認識されている。これらの適用のそれぞれは、入射光線によって一重項の励起状態に励起され、及び結果的なエネルギーの放出を伴ってより一層低いエネルギー状態に減衰されるべき発色団の能力に依存する。このエネルギーは特定の波長での蛍光の光の形態で放出される場合があり、それによって、減衰する発色団に付着した細胞又は生物学的構造物が、可視化され、及び／又はＦＡＣＳによって選別され得る。あるいはまた、励起のエネルギーは、最初の一重項発色団の三重項励起状態への転換によって逸散され、次いで、二原子酸素のような他の三重項へエネルギーを転移し、結果的な一重項酸素の形成を伴うことがある。一重項酸素は強力な細胞障害性の薬剤であり、従ってこの後者の過程が細胞においてか又は細胞のすぐ近くで発生すると、それは通常その細胞に死を招く。したがって、発色団は、その蛍光特性、及び光増感剤として働く能力の双方のために用いることができる。
【０００３】
明らかに、蛍光画像処理又は分析、又はＰＤＴのために、インビトロ又はインビボにおいて、ある程度の発色団の局在性の制御が必須である。このことは、特に、光線力学的治療において重要であり、発色団の減衰によって生成する一重項酸素の照射の代表的範囲が直径０．１μｍ未満の場合、結果として、標的細胞の死をもたらすために、発色団は通常その細胞のすぐそば、又は好ましくはその細胞内に位置しなければならない。
【０００４】
〔発明が解決しようとする課題〕
しかし、これまでに、ＰＤＴの目的のために、インビボでの特定の標的細胞に対するポルフィリンの光増感剤のターゲティングを制御することについて、わずかの試みが行われているに過ぎない。その代わり、代表的に、ポルフィリンが、腫瘍構造物からのリンパのドレナージがない場合には、腫瘍に蓄積する固有の傾向があることに信頼性が置かれている。Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（Ｒ）〔ホトフリン（登録商標）〕、ヘマトポルフィリン−ＩＸから酸でに処理によって誘導されるポルフィリン構造体の混合物からなる光増感性薬剤は、癌腫及び肉腫の処置に商業上用いられており、例えば、任意のターゲティング媒体又は手段を用いることなく、患者に従来どおり全身的に投与されている。このことは、明らかに、望ましくなく、光増感剤の間違った局在性が、光化学治療の効率を低下させるだけでなく、健康な細胞の死を招くことがある。
【０００５】
特に、ＦＡＣＳ及び蛍光画像処理の目的のために、発色団を適切なタンパク質送達分子に共有結合的に接合させることによって、発色団の生物学的標的へのインビトロでの特定の付着を達成するための努力が行われてきた。しかし、この手法は種々の問題にさらされた。第一に、細胞表面へのポルフィリン発色団の非特異的結合によって生じるバックグランド蛍光の程度を減少させるのが困難であることが分かった。第二に、発色団のタンパク質分子への付着によって、近位のタンパク質による著しい程度の励起状態のクエンチングが生じ、これが、マーカーとしてか、又は標的にされた光線力学的適用における発色団の有効性を明らかに減少させることが見出された。
これらの影響の減少が引き続き望ましい目標である。
【０００６】
〔課題を解決するための手段〕
したがって、本発明の１つの見地によれば、次の式（Ｉ）のポルフィリン発色団：
【化３７】
又は次の式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、及び（Ｖ）のいずれかのクロリン発色団：
【化３８】
【化３９】
【化４０】
【化４１】
又は次の式（ＶＩ）及び（ＶＩＩ）のいずれかのバクテリオクロリン発色団：
【化４２】
及び
【化４３】
〔式中、Ｒ１がアリール部分であり、このアリール部分が接合基Ｚに連結し、この接合基がインビトロ又はインビボの所定の生物学的標的に発色団を送達するためのポリペプチド分子に前記発色団を接合させることができ；
Ｒ２が親水性アリール部分であり；
Ｒ３がＨ又は親水性アリール又は親水性非芳香族部分であり；
及びＸ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４のそれぞれが、無関係に、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、Ｃ１〜３アルキル及びＯＣ１〜３アルキルから選ばれるか、又は隣接するＣ−Ｃ結合を有するＸ１及びＸ２及び／又はＸ３及びＸ４がエポキシド又はシクロプロパニル構造を形成するように、Ｘ１及びＸ２及び／又はＸ３及びＸ４が互いに、Ｏ、ＣＨ２、ＣＨＣ１〜３アルキル、又はＣ（Ｃ１〜３アルキル）２から選ばれる架橋部分を形成し；
式中、前記Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が随意に、更に１又はそれ以上の回数、−ＯＨ、−ＣＮ、−ＮＯ２、ハロゲン，−Ｔ、又は−ＯＴ（式中、ＴがＣ１〜１５アルキル、シクロアルキル又はアリール基又はそれらのヒドロキシル化、ハロゲン化、硫酸化、スルホン化又はアミノ化誘導体又はそれらのカルボン酸、エステル、エーテル、ポリエーテル、アミド、アルデヒド又はケトン誘導体である。）によって置換されている。〕
を提供する。
【０００７】
本発明に従って発色団のコアの周りに１又はそれ以上の親水性置換基を含めることは、タンパク質の生物学的接合（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）において通常用いられる塩基性緩衝液／ＤＭＳＯ又はＤＭＦ共溶液中での高められた溶解度を招く。また、高められた親水性は、非共有結合的にタンパク質に結合する発色団の傾向を著しく低下させる。発色団が、例えば、ＰＤＴ又はＦＡＣＳの目的のために、所定の細胞又は組織に送達するためのモノクローナル抗体のようなターゲティングタンパク質に接合すべきである場合、発色団とタンパク質との間の非共有結合の減少は、発色団が細胞表面に非特異的に転移する程度を減少させ、興味のある細胞又は組織への発色団のターゲティングの精度を実質的に向上させる。
【０００８】
したがって、本発明の他の見地はまた、それぞれが親水性又は両親媒性部分を有する１又はそれ以上の親水性発色団、及びあまり親水性でない複数の物質及び／又は分子を含む混合物を分離するにあたり、前記混合物を疎水性溶離液に導入し、及び、前記１又はそれ以上の発色団が前記固相上に停止すると共に前記物質及び／又は分子が前記固相から前記溶出溶媒によって溶出するか、又は実質的に溶出するように、前記混合物及び前記溶出溶媒を親水性又は極性固相上に通す工程を含む方法を提供する。
【０００９】
例えば、前記方法は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｒ）〔セファデックス（登録商標）、（デキストラン）〕カラム、又は逆相ＨＰＬＣ上のクロマトグラフィを含む。代表的に、前記あまり親水性でない物質及び／又は分子の混合物は、細胞及び／又は膜の混合物を含むことができる。有利には、前記１又はそれ以上の親水性発色団は、本発明にかかる１又はそれ以上の発色団を含む。
【００１０】
いくつかの具体例では、Ｘ１〜Ｘ４のそれぞれか、又はいくつかがＨである。しかし、特に好ましい具体例では、Ｘ１〜Ｘ４のそれぞれがＯＨである。したがって、前記発色団は、上記式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）又は（Ｖ）のジヒドロキシクロリン又は上記式（ＶＩ）又は（ＶＩＩ）のテトラヒドロキシバクテリオクロリンであってもよい。ジヒドロキシクロリン及びテトラヒドロキシバクテリオクロリンの親水性は、相当するポルフィリンのものよりも、発色団のコアの周りの特別な親水性ヒドロキシ基の存在によって、高いことが見出される。
【００１１】
好ましくは、前記アリール部分Ｒ１はフェニル環を含んでおり、このフェニル環は、前記発色団の大環状コアに、単結合によって連結しているのが好ましく、あるいはまたＣ１〜６の分枝状又は線状アルキル鎖によってそれに連結していてもよい。有利には、前記接合基Ｚは前記フェニル環にそのパラ（４’）位に連結することができる。
【００１２】
接合基Ｚは、ポリペプチド分子上のアミン基に共有結合で結合することができる基；例えば、イソシアナート、イソチオシアナート、又はＮＨＳエステル基を含むことができる。したがって、有利には、前記ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリンの周りのメソ置換基のそれぞれが、前記接合基Ｚに共有結合することになる場合がある−ＮＨ２、−ＮＨ２ ＋−又は−ＮＨ３ ＋を含まないべきである。このことは、前記発色団内の内部架橋の可能性を減少させるように働く。あるいはまた、前記接合基Ｚは、他の任意のタンパク質接合基、例えば、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）、マレアミド、ヨードアセトアミド、ケトン又はアルデヒドを含むことができる。かかる基のタンパク質分子への接合を達成する方法は、この技術において既知である。
【００１３】
特に好ましい具体例では、前記接合基はイソチオシアナート基を含む。イソチオシアナートはリジン残基とたやすく反応してタンパク質に対する安定な連鎖を生じ、従って本発明の発色団の生物学的接合にとって特に安定である。
【００１４】
前記接合基Ｚは前記アリール部分Ｒ１に単結合によって直接連結されることができる。あるいはまた、前記接合基Ｚは、前記アリール部分Ｒ１に、比較的高い程度の剛直性及び／又は立体障害を有する連結部分によって連結され得る。前記連結部分は、例えば、１０００ｇモル−１よりも大きくない全分子量を有する融合されたか、又は連結されたシクロアルキル及び／又はシクロアルキル環構造物の鎖を含むことができる。特に、前記連結部分は、アントラセン、アクリジン、アントラニル、ナフチル又はナフタレン部分、又はポリアセチレン、フェニルアセチレン、又はポリフェニルアセチレン部分を含むことができる。前記発色団がポリペプチド分子に対する前記接合基Ｚによって接合する場合、従って前記連結部分が前記ポリペプチドとは別の前記発色団の光活動性のコアを保持する役目を果たすことができ、これによって、前記発色団が蛍光を生じる場合に前記ポリペプチドによって生じることがある蛍光消光（クエンチング）を減少させるのに役立つ。前記連結部分は上述した種類の親水性又は両親媒性部分、例えば、Ｃ２〜Ｃ３０ポリエチレングリコール部分を含むことができる。このことは、発色団の親水性が前記連結部分の存在によって損なわれないことを確実にするのに役立つ。
【００１５】
随意に、前記アリール部分Ｒ１は、更に１又はそれ以上の、ヒドロキシのような、前記発色団の親水性を改善する役目を果たす、親水性置換基によって置換されていてもよい。
【００１６】
前記親水性アリール部分Ｒ２は、フェニル環を含んでいることができ、このフェニル環が１又はそれ以上の回数、好ましくは少なくとも２回、１又はそれ以上の親水性置換基によって置換されていてもよく、この親水性置換基は前記アリール部分Ｒ２の親水性を高める役目を果たす。前記フェニル環は、好ましくは、単結合によって、前記発色団の大環状コアに連結されるか、又は代わりに、Ｃ１〜６の分枝状又は線状アルキル鎖によってそれに連結されてもよい。あるいはまた、前記親水性アリール部分Ｒ２は、ピリジル又は四級化（ｑｕａｒｔｅｎｉｓｅｄ）ピリジル｛ピリジニウミル（ｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍｙｌ）｝環のようなヘテロアリール環を含んでよく、ヘテロアリール環は随意に１又はそれ以上の回数、好ましくは少なくとも２回、１又はそれ以上の親水性置換基によって置換されることができ、親水性置換基は前記アリール部分Ｒ２の親水性を高める役目を果たす。前記ヘテロアリール環は、好ましくは、単結合によって、前記発色団の大環状コアに連結されるか、又は代わりに、Ｃ１〜６の分枝状又は線状アルキル鎖によってそれに連結されてもよい。前記１又はそれ以上の親水性置換基は、有利には、ヒドロキシ；メトキシ又はエトキシのようなアルコキシ；Ｃ２〜Ｃ１５ポリエチレングリコール；Ｎ−メチルピリジニウミルのような四級化ピリジル（ピリジニウミル）；モノ−、ジ−又はポリ−糖類；Ｃ１〜６アルキルスルホン酸；ホスホニウム基Ｒ４Ｐ（Ｒ５）（Ｒ６）（Ｒ７）（式中、Ｒ４が、単結合か、又はＣ１〜６アルキルであり、及びＲ５、Ｒ６及びＲ７のそれぞれが、無関係に、水素、フェニル環のようなアリール環、ピリジル環のようなヘテロアリール環、及びＣ１〜６アルキル鎖から選ばれ、これらアリール環、ヘテロアリール環又はＣ１〜６アルキル鎖が置換されていないか、又は１又はそれ以上の回数、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルキル又はアルコキシ、アリール、オキソ、ハロゲン、ニトロ、アミノ又はシアノによって置換されている。）；又はリン酸基又はホスホネート基｛それぞれ、Ｒ８ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ９）（ＯＲ１０）又はＲ８Ｐ（Ｏ）（ＯＲ９）（ＯＲ１０）で表され、式中、Ｒ８が、単結合か、又はＣ１〜６アルキルであり、及びＲ９及びＲ１０のそれぞれが無関係に水素及びＣ１〜６アルキルから選ばれている。｝から選ぶことができる。好ましくは、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７のそれぞれは同じであることができ、及び有利には、置換されていないフェニルでよい。適切には、前記Ｒ８はメチルでよい。有利には、前記Ｒ９及びＲ１０は同じであることができ、及び／又はメチル又はエチルでよい。
【００１７】
特に好ましい具体例では、前記親水性アリール部分Ｒ２は、
ｍ，ｍ−（ジヒドロキシ）フェニル
【化４４】
又はそのＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）誘導体；
ｍ，ｍ，ｐ−（トリヒドロキシ）フェニル
【化４５】
又はそのＰＥＧ化誘導体；
ｏ，ｐ，ｏ−（トリヒドロキシ）フェニル
【化４６】
又はそのＰＥＧ化誘導体；
ｐ−（メチルトリフェニルホスホニウム）フェニル
【化４７】
のようなｍ−又はｐ−（（Ｃ１〜６）アルキルトリフェニルホスホニウム）フェニル；
ｐ−メチルホスホノ−ジ−エトキシ）フェニル
【化４８】
のようなｍ−又はｐ−（Ｃ１〜６アルキルホスホノ−ジ−アルコキシ）フェニル；
ｐ−メチルホスホナト−ジ−エトキシ）フェニル
【化４９】
のようなｍ−又はｐ−（Ｃ１〜６アルキルホスホナト−ジ−アルコキシ）フェニル；
ｍ−又はｐ−（Ｎ−メチル−ピリジニウミル）フェニル
【化５０】
；ペントース−、ヘキソース−又は二糖類−置換フェニル
【化５１】
のようなメタ−又はパラ−糖−置換フェニル
から選ばれる。
【００１８】
他の好ましい具体例では、前記親水性アリール部分Ｒ２は、ｐ−Ｎ−（Ｃ１〜６アルキル）ピリジニウミル基又はｍ−Ｎ−（Ｃ１〜６アルキル）ピリジニウミル基のような四級化ピリジル（ピリジニウミル）基を含む。四級化ピリジル（ピリジニウミル）基は高度に親水性であり、及び本発明の発色団に組み込まれる場合、有利な特性を示す。この点で特に好ましい基は、ｍ−又はｐ−Ｎ−（（Ｃ１〜６）アルキル）ピリジニウミル基、例えば、ｍ−Ｎ−メチルピリジニウミル
【化５２】
又はｐ−Ｎ−メチルピリジニウミル
【化５３】
である。
【００１９】
他の特に好ましい具体例では、前記四級化ピリミジニウミル基は、ｐ−Ｎ−（Ｃ１〜６アルキルスルホン酸）ピリジニウミル又はｍ−Ｎ−（Ｃ１〜６アルキルスルホン酸）ピリジニウミル；特に、ｐ−Ｎ−（プロピルスルホン酸）ピリジニウミル
【化５４】
又はｍ−Ｎ−（プロピルスルホン酸）ピリジニウミル
【化５５】
のような双性イオン基からなることができる。
【００２０】
好ましくは、その又はそれぞれの四級化ピリジニウミル基Ｒ２は、ヨウ化物対イオン、又は、最も好ましい具体例では、塩化物対イオンのようなハロゲン化物対イオンと結び付くことができる。
【００２１】
いくつかの有利な具体例では、Ｒ３はＨであり、前記発色団は５，１５−ジアリール−ポルフィリン、−クロリン又は−バクテリオクロリンを構成する。他の有利な具体例では、前記Ｒ３は、親水性アリールであるか、又は非芳香族部分である。例えば、前記Ｒ３は、Ｒ２に関して、上記に規定するように親水性アリール部分を含むことができる。前記親水性アリール部分Ｒ３は、前記親水性アリール部分Ｒ２と同じでよく、発色団は、その１０，１５及び２０位に同じ置換基を持つか；又は前記親水性アリール部分Ｒ２と異なっていてもよい。あるいはまた、前記Ｒ３は、１又はそれ以上の回数、ヒドロキシ又はＣ２〜１５ポリエチレングリコールのような１又はそれ以上の親水性置換基によって置換されているＣ１〜６アルキル鎖のような親水性のアルキル部分を含むことができる。特に好ましい具体例では、前記Ｒ３は、１，２−ジヒドロキシエチルのようなポリヒドロキシ（Ｃ１〜６アルキル）からなる。
【００２２】
Ｒ２がＲ３と同じ本発明の発色団は、この技術において既知の方法、例えば、ピロールを用いるベンズアルデヒドの酸触媒縮合によるか、又はジピロメタンからのポルフィリンを合成するための“ＭａｃＤｏｎａｌｄ（マクドナルド）２＋２”法〔Ａｒｓｅｎａｕｌｔ（アルセナート）等のＪ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６０，８２：４３８４〜４３８９−参考として本明細書に組み入れる。〕に従って合成することができる。
【００２３】
本発明の５−イソチオシアナトフェニル−１５−ピリジニウムポルフィリン、クロリン及びバクテリオクロリンを合成するための一般化された図式を、次の図式１として提示するが、式中、“ＲＸ”は、式（Ｉ）から（ＶＩＩ）に関して上記に規定するようなＣ１〜６アルキル又は親水性置換基のような四級化する基を示す：
【化５６】
【００２４】
本発明の５−イソチオシアナトフェニル−１５−メチルホスホニウムフェニルポルフィリン、クロリン及びバクテリオクロリンを合成するための一般化された図式を、次の図式２として提示するが、式中、Ｒは、水素、Ｃ１〜６アルキル、ヘテロ環式基又は芳香族基を示す：
【化５７】
【００２５】
Ｒ２及び随意にＲ３がピリジニウミルフェニルからなる本発明のポルフィリン、クロリン及びバクテリオクロリンは、図式３として次に提示する一般化された反応図式に従って合成することができ、式中、“Ｒ”は、式（Ｉ）から（ＶＩＩ）に関して上記に規定するような水素か、又は１又はそれ以上の親水性置換基を示す：
【化５８】
【００２６】
前記Ｒ２及び随意にＲ３がアルキルホスホナトフェニル又はアルキルホスホノフェニルからなる本発明のポルフィリン、クロリン及びバクテリオクロリンは、図式４として次に提示する一般化された反応図式に従って合成することができ、式中、“Ｒ”は、ＯＨ、ＯＮａ、又はＯ（Ｃ１〜６アルキル）を示す：
【化５９】
【００２７】
本発明の更なる見地においては、５，１０，１５及び２０メソ−位に選定された置換基を有する５，１０，１５，２０−テトラ−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリン発色団を合成するための新規な方法であって；５，１５−ジ−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリン発色団を提供する工程；脱離基Ｑを前記発色団の１０及び２０メソ−位に付着させる工程であって、脱離基Ｑがハロゲン化物及びトリフレートから選ばれている工程；連関（カップリング）試薬（Ｒ１１Ｏ）（Ｒ１２Ｏ）ＢＲ１３を提供する工程であって、Ｒ１１及びＲ１２が、無関係に、Ｈ又はＣ１〜６アルキルから選ばれているか、又はＲ１１及びＲ１２が互いに前記２つのＯ原子でつながれているＣ１〜６アルキル鎖を構成し、及びＲ１３が、上記Ｒ３に関して規定される親水性アリール部分のようなビニル又はアリールである工程；及び前記発色団と前記連関試薬とを、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、炭酸セシウム及び水酸化バリウムから選ばれる塩基、及びＰｄ０触媒の存在下に反応させる工程を含み；前記Ｒ１３を前記発色団の１０−及び２０−メソ位で前記離脱基Ｑと交換する方法を提供する。
【００２８】
ボロン酸又はボロンエステル試薬を用いるＰｄ０−触媒Ｓｕｚｕｋｉ（スズキ）カップリング反応は、この技術において既知であり、及び例えば、Ｍｉｙａｕｒａ（ミヤウラ）及びＳｕｚｕｋｉの、オルガノボロン化合物のパラジウム−触媒クロス−カップリング反応、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．（１９９５）９５：２４５７〜２４８３に記載されており；その開示を参考としてここに組み入れる。しかし、これまでに、ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリンのメソ−位で、選定された置換基を前記メソ位上に取り込む手段として、Ｓｕｚｕｋｉ−カップリングを行う試みは失敗している。しかし、本発明者は、本発明にかかる反応条件下に、Ｓｕｚｕｋｉ−カップリングが、出発ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリンの１０−及び２０−メソ位で速やかに及び首尾よく進むことを見出した。この方法は、それに関して、テトラ−メソ−置換されたポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリンの都合のよい合成をＳｕｚｕｋｉ−カップリングによって可能にする。
【００２９】
前記脱離基Ｑは、塩化物、臭化物、ヨウ化物又はトリフレート（トリフルオロメタンスルホネート）でよい。適切には、前記離脱基Ｑは臭化物でよい。ジ−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリンのメソ−ブロム化のための方法は、この技術において既知である。例えば、前記５，１５−ジ−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリン発色団は、その１０−及び２０−メソ−位で、ブロモスクシンイミドのようなハロスクシンイミドとの反応によりハロゲン化することができる。
【００３０】
前記連関試薬は、ボロン酸エステル又はボロン酸からなることができる。好ましい具体例では、前記Ｒ１１及びＲ１２のそれぞれはＨであり、前記連関試薬はボロン酸である。
【００３１】
有利には、前記５，１５−ジ−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリン発色団は、本発明の発色団であるか、又はその保護された形態である。したがって、前記５，１５−ジ−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリン発色団は、次の式（ＶＩＩＩ）のポルフィリン発色団：
【化６０】
又は次の式（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、及び（ＸＩＩ）のいずれかのクロリン発色団：
【化６１】
【化６２】
【化６３】
【化６４】
又は次の式（ＸＩＩＩ）及び（ＸＩＶ）のいずれかのバクテリオクロリン発色団：
【化６５】
【化６６】
から選ぶことができ、
式中、Ｒ４は、式（Ｉ）から（ＶＩＩ）に関して上記に規定するような基Ｒ１であるか、又はその保護形態であるか、又はそれに対して転換できる基であり；Ｒ５は、式（Ｉ）から（ＶＩＩ）に関して上記に規定するような基Ｒ２であるか、又はその保護形態であるか、又はそれに対して転換できる基であり；及びＸ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４のそれぞれは、無関係に、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、Ｃ１〜３アルキル及びＯＣ１〜３アルキルから選ばれるか、又は隣接するＣ−Ｃ結合を有するＸ１及びＸ２及び／又はＸ３及びＸ４がエポキシド又はシクロプロパニル構造を形成するように、Ｘ１及びＸ２及び／又はＸ３及びＸ４は互いに、Ｏ、ＣＨ２、ＣＨＣ１〜３アルキル、又はＣ（Ｃ１〜３アルキル）２から選ばれる架橋（ｂｒｉｄｇｉｎｇ）部分を形成する。
【００３２】
したがって、式中、Ｒ１３は、Ｒ３に関して上記に規定するような親水性アリール置換基であり、また、前記５，１０，１５，２０−テトラ−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリン発色団は、本発明の発色団を構成することができる。
【００３３】
前記Ｐｄ０触媒は、例えば、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２、又はＰｄ（ＯＡｃ）２からなることができる。有利には、前記Ｐｄ０触媒はＰｄ（ＰＰｈ３）４からなることができる。
【００３４】
前記連関反応は、溶媒中で行われ、溶媒はトルエン又はドライＴＨＦから選ぶことができる。連関反応はドライＴＨＦ中ですばやく進むことがわかったので、ドライＴＨＦが溶媒として好ましい。
【００３５】
随意に、式中、前記Ｒ１３はビニルであり、前記５，１０，１５，２０−テトラ−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリン発色団は、前記連関反応に次いで、前記１０−及び２０−ビニル置換基をヒドロキシアルキルに転換させるような、ＯｓＯ４を用いるオスミレーション反応を受けさせることができる。前記オスミレーション反応は、ポルフィリンをジ−ベータ−ヒドロキシ−クロリンに転換し次いでテトラ−ベータ−ヒドロキシ−バクテリオクロリンにするのに適切な条件と同じ条件下で行うことができる。この工程が、本発明により、ＤｉＭａｇｎｏ（ジマグノ）等のＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９３：５８，５９８３〜５９９３，（参考としてここに組み入れる。）に記載されたビニルトリブチルスズを連関試薬として用いる方法に従って、前記５，１５−ジ−メソ−置換発色団において行われたＰｄ−触媒Ｓｔｉｌｌｅ（シュティレ）カップリングによる方法のような本発明の方法によらないで得られた５，１０（ビニル），１５，２０（ビニル）−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリン発色団上でも行えることが注目される。
【００３６】
前記テトラ−メソ−置換発色団がポルフィリン又はクロリン発色団である場合、前記発色団は、それぞれ、この技術における熟練者に既知の方法に従って、クロリン又はバクテリオクロリン発色団にか、又はバクテリオクロリン発色団に転換させることができる。例えば、前記ポルフィリン又はクロリン発色団は、ジ−ベータ−ヒドロキシ−クロリン又はテトラ−ベータ−ヒドロキシ−バクテリオクロリンを生成させるような、ＯｓＯ４を用いる反応によってオスミレーションすることができる。
【００３７】
本発明にかかる反応のための一般化された図式を次の図式５及び６において提示する。図式５において、“Ｒ” 及び“Ｒ１”は、それぞれ、Ｒ２及びＲ３のそれぞれに関して上記に規定するような１又はそれ以上の親水性置換基を示す。図式６において、“Ｒ” は、Ｒ２に関して上記に規定するような１又はそれ以上の親水性置換基を示し、及び“Ｘ”は炭素又は窒素原子を示す。
【化６７】
【化６８】
【００３８】
本発明の他の見地において、５，１５−ジフェニルポルフィリン、５，１５−ジフェニルクロリン又は５，１５−ジフェニルバクテリオクロリン発色団であって、５−及び１５−フェニル基のそれぞれのオルト−、メタ−、及び／又はパラ−位のそれぞれが、置換基Ｐ１〜Ｐ５及びＱ１〜Ｑ５のそれぞれによって置換されており、それら置換基が無関係にＨ又は不活性置換基であり、この置換基が他の置換基Ｐ１〜Ｐ５及びＱ１〜Ｑ５と相まって発色団の蛍光特性を実質的に損なうことなく；及び発色団が更に接合基Ｚを含み、この接合基がインビトロ又はインビボの所定の生物学的標的に発色団を送達するためのポリペプチド分子に前記発色団を接合させることができる発色団を提供する。
【００３９】
かかる発色団は、新規であり、及びそれぞれが、異なり及び実質的に重なりのない波長での蛍光の光を発光させる励起において有能である。上記に示したように、接合基Ｚの提供は、本発明の発色団が所定の生物学的標的を特異的に標的にするのを可能にし、従って、インビトロ又はインビボでの発色団の局在性の制御を促進する。したがって、本発明の発色団は、蛍光分析及び画像処理適用（ＦＡＣＳを含む）、又はＰＤＴにおいて、有効に用いることができる。
【００４０】
有利には、前記蛍光色素は、次の化合物：
【化６９】
【化７０】
【化７１】
【化７２】
【化７３】
【化７４】
【化７５】
から選ばれ、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４のそれぞれは、本発明の第１の見地に関して上記に規定されるようなものである。随意に、前記発色団は、更に、１又はそれ以上のその２，３，７，８，１２，１３，１７又は１８位で、Ｃ１〜３アルキル置換基によって置換されることができる。
【００４１】
上記化学構造式において、Ｚは、明確にするために除外している。しかし、前記Ｚ置換基は、各発色団の任意の１〜４，６〜１４，又は１６〜２０位に付着することができるか、又は置換基Ｐ１〜Ｐ５又はＱ１〜Ｑ５の１つでよいか、又は前記置換基Ｐ１〜Ｐ５又はＱ１〜Ｑ５の１つによって５−又は１５−フェニル基の１つに付着することができる。
【００４２】
いくつかの具体例において、Ｐ１〜Ｐ５のそれぞれは、前記２つの主要なフェニル環が対称的に置換されるように、前記Ｑ１〜Ｑ５の相当する１種と同じであるか、又は実質的に同じである。他の具体例では、Ｐ１〜Ｐ５の１又はそれ以上は、前記２つの主要なフェニル環が対称的に置換されないように、Ｑ１〜Ｑ５の相当する１種と同じでない。特に、Ｐ１〜Ｐ５のすべて及び／又はＱ１〜Ｑ５のすべては、前記２つの主要なフェニル環の一方又は双方が置換されないように、Ｈからなることができる。
【００４３】
有利には、前記置換基Ｐ１〜Ｐ５及びＱ１〜Ｑ５が、全体として、前記発色団の自発的酸化の速度を減少させるのに十分な程度の前記発色団のコアの周りの立体障害を提供し、前記発色団が空気中で実質的に不活性であるが、実質的な範囲で、前記発色団のコアの周りの２、３、７、８、１２、１３、１７又は１８位での選択的な付加又は置換を抑制しない。したがって、Ｐ１、Ｐ５、Ｑ１及びＱ５のそれぞれはＨでよい。代表的に、前記置換基Ｐ１〜Ｐ５のすべての累積的な分子量は１０００ｇモル−１を超えず、及び前記置換基Ｑ１〜Ｑ５のすべての累積的な分子量は１０００ｇモル−１を超えない。
【００４４】
前記置換基Ｐ１〜Ｐ５及びＱ１〜Ｑ５の１又はそれ以上は、−ＯＨ、−ＣＮ、−ＮＯ２、ハロゲン、−Ｔ、又は−ＯＴからなることができ、式中、ＴはＣ１〜１５アルキル、シクロアルキル又はアリール基又はそれらのヒドロキシル化、ハロゲン化、硫酸化又はアミノ化誘導体又はそれらのカルボン酸、エステル、エーテル、ポリエーテル、アミド、アルデヒド又はケトン誘導体である。前記置換基Ｐ１〜Ｐ５及びＱ１〜Ｑ５の１又はそれ以上は、追加として又は代わりに、Ｃ３〜１２シクロアルキル及び／又はアリール環構造、又は２と６との間の、好ましくは２〜３の、融合されたか、又は連結されたＣ３〜１２シクロアルキル及び／又はアリール環構造からなることができ、それらの環構造のそれぞれが随意に１又はそれ以上のＮ、Ｏ又はＳ原子を含むことがある。特に、１又はそれ以上の前記置換基Ｐ１〜Ｐ５及びＱ１〜Ｑ５は、Ｎ−メチルピリジル（ピリジニウミル）基のような四級化アミン又はピリジル基からなることができる。
【００４５】
好ましくは、Ｐ１〜Ｐ５及びＱ１〜Ｑ５の１種は前記接合基Ｚからなる接合置換基である。特に好ましい具体例では、前記接合置換基はＰ３又はＱ３であり、前記接合基Ｚは２つの主要なフェニル環の１つのパラ位上に提供される。
【００４６】
適切には、前記接合基は、本発明の第１の見地に関して上記に規定されるようなものである。
【００４７】
特に、前記置換基Ｐ１〜Ｐ５及びＱ１〜Ｑ５の１又はそれ以上は、前記接合置換基でなく、Ａ１Ｚ１Ａ１４
からなる群より無関係に選ばれる一員からなることができ、式中、Ｚ１は、Ｚ２、Ｚ２Ａ５又はＺ２Ａ５Ａ６であり；
Ａ１及びＡ５は、無関係に、−（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−Ｃ（Ｙ）（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−Ｃ（Ｙ）Ｙ’（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−Ｃ（Ｙ）ＮＡ４（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−ＮＡ４Ｃ（Ｙ）（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−ＮＡ４（ＣＡ２Ａ３）ｎ、−ＹＣ（Ｙ’）（ＣＡ２Ａ３）ｎ−及び−Ｙ（ＣＡ２Ａ３）ｎ−から選ばれており；ｎ＝０〜６であり；Ｙ及びＹ’は無関係にＯ又はＳであり；Ａ２、Ａ３及びＡ４は無関係にＨ又はＣ１〜２アルキルであり、このアルキルは置換されていないか、又は１又はそれ以上のフッ素によって置換されており；
Ａ６＝−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｍ−又は−Ｓ（Ｏ）ｐであり；ｍ＝１〜１２であり；ｐ＝０〜２であり；
Ｚ２は単結合又はＺ３であり；Ｚ３はＺ４、Ｚ５及びＺ６から選ばれており、このＺ３は、置換されていないか、又は１又はそれ以上の回数、ＯＨ、ハロ、ＣＮ、ＮＯ２、Ａ１Ａ１０、Ａ６Ａ８、ＮＡ１０Ａ１１、Ｃ（Ｙ）Ａ７、Ｃ（Ｙ）Ｙ’Ａ７、Ｙ（ＣＨ２）ｑＹ’Ａ７、Ｙ（ＣＨ２）ｑＡ７、Ｃ（Ｙ）ＮＡ１０Ａ１１、Ｙ（ＣＨ２）ｑＣ（Ｙ’）ＮＡ１０Ａ１１、Ｙ（ＣＨ２）ｑＣ（Ｙ’）Ａ９、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）ＮＡ１０Ａ１１、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ａ１１、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｙ’Ａ９、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｚ６、Ｃ（ＮＡ１０）ＮＡ１０Ａ１１、Ｃ（ＮＣＮ）ＮＡ１０Ａ１１、Ｃ（ＮＣＮ）ＳＡ９、ＮＡ１０Ｃ（ＮＣＮ）ＳＡ９、ＮＡ１０Ｃ（ＮＣＮ）ＮＡ１０Ａ１１、ＮＡ１０Ｓ（Ｏ）２Ａ９、Ｓ（Ｏ）ｒＡ９、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｃ（Ｙ’）ＮＡ１０Ａ１１、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｃ（Ｙ’）Ａ１０又はＺ６によって置換されており；ｑ＝０、１又は２であり；ｒ＝０〜２であり；Ａ７は無関係にＨ及びＡ９から選ばれており；Ａ８はＯ又はＡ９であり；Ａ９はＣ１〜４アルキルであり、このアルキルは置換されていないか、又は１又はそれ以上のフッ素によって置換されており；Ａ１０はＯＡ９又はＡ１１であり；Ａ１１は、Ａ７であるか、又はＡ１０及びＡ１１がＮＡ１０Ａ１１としてのときには、それらが窒素と共に、炭素原子だけからなるか、又は炭素原子と、Ｏ、Ｎ及びＳから選ばれる少なくとも１つのヘテロ原子とからなる５乃至７員環を形成することができ；
Ｚ４はＣ６〜１２アリール又はアリールオキシＣ１〜３アルキルであり；
Ｚ５は、フラニル、テトラヒドロフラニル、インダニル、インデニル、テトラヒドロピラニル、ピラニル、チオピラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロチエニル、チエニル、１又は２の不飽和結合を含むＣ３〜８シクロアルキル又はＣ４〜８シクロアルキル、及びＣ７〜１１ポリシクロアルキルから選ばれており；
Ｚ６は、Ｎ−アゾリル、ジオキサジアジニル、ジオキサジアゾリル、ジオキサニル、２−Ｎ−ジオキサトリアジニル、ジオキサジニル、Ｎ−ジオキサゾリル、ジオキソリル、ジチアジアジニル、ジチアジアゾリル、Ｎ−ジチアトリアジニル、ジチアジニル、Ｎ−ジチアゾリル、１−Ｎ−イミダゾリル、Ｎ−モルフォリニル、ピロールイル、テトラゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、オキサジニル、オキサゾリル、ナフチドリニル、オキサジアジニル、オキサジアゾリル、オキサテトラジニル、オキサトリアジニル、オキサトリアゾリル、オキサジニル、オキサゾリル、ペンタジニル、フタルアジニル、Ｎ−ピペリジニル、Ｎ，Ｎ−ピペラジニル、１−Ｎ−ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニル、テトラチアジニル、テトラジニル、１−Ｎ−テトラゾリル、テトロキサジニル、チアジアジニル、チアジアゾリル、チアテトラジニル、チアトリアジニル、チアトリアゾリル、チアゾリル、トリアジニル、１−Ｎ−トリアゾリル、トリオキサダジニル、トリオキサニル、トリオキサジニル、トリオキサゾリル、トリチアジアジニル、トリチアジニル、トリチアジアゾリルから選ばれており；
Ｚ４、Ｚ５又はＺ６は、Ｚ４、Ｚ５及びＺ６から無関係に選ばれる１又はそれ以上の他の構成員に融合することができ；
Ａ１４は、水素、メチル、ヒドロキシ、アリール、ハロ置換アリール、アリールオキシＣ１〜３アルキル、ハロ置換アリールオキシＣ１〜３アルキル、インダニル、インデニル、Ｃ７〜１１ポリシクロアルキル、テトラヒドロフラニル、フラニル、テトラヒドロピラニル、ピラニル、テトラヒドロチエニル、チエニル、テトラヒドロチオピラニル、チオピラニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、又は１又は２の不飽和結合を含むＣ４〜６シクロアルキル｛シクロアルキル又は複素環式部分が置換されていないか、又は１〜３のメチル基、１つのエチル基、又はヒドロキシル基によって置換されている。｝である。
【００４８】
前記接合置換基は、Ａ１Ｚ１Ｚからなる群より選ばれる一員からなることができ、
式中、Ｚ１はＺ２、Ｚ２Ａ５又はＺ２Ａ５Ａ６であり；
Ａ１及びＡ５は、無関係に、−（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−Ｃ（Ｙ）（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−Ｃ（Ｙ）Ｙ’（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−Ｃ（Ｙ）ＮＡ４（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−ＮＡ４Ｃ（Ｙ）（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−ＮＡ４（ＣＡ２Ａ３）ｎ、−ＹＣ（Ｙ’）（ＣＡ２Ａ３）ｎ−及び−Ｙ（ＣＡ２Ａ３）ｎ−から選ばれており；ｎ＝０〜６であり；Ｙ及びＹ’は無関係にＯ又はＳであり；Ａ２、Ａ３及びＡ４は無関係にＨ又はＣ１〜２アルキルであり、このアルキルは置換されていないか、又は１又はそれ以上のフッ素によって置換されており；
Ａ６＝−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｍ−又は−Ｓ（Ｏ）ｐであり；ｍ＝１〜１２であり；ｐ＝０〜２であり；
Ｚ２は単結合又はＺ３であり；Ｚ３はＺ４、Ｚ５及びＺ６から選ばれており、 このＺ３は、置換されていないか、又は１又はそれ以上の回数、ＯＨ、ハロ、ＣＮ、ＮＯ２、Ａ１Ａ１０、Ａ６Ａ８、ＮＡ１０Ａ１１、Ｃ（Ｙ）Ａ７、Ｃ（Ｙ）Ｙ’Ａ７、Ｙ（ＣＨ２）ｑＹ’Ａ７、Ｙ（ＣＨ２）ｑＡ７、Ｃ（Ｙ）ＮＡ１０Ａ１１、Ｙ（ＣＨ２）ｑＣ（Ｙ’）ＮＡ１０Ａ１１、Ｙ（ＣＨ２）ｑＣ（Ｙ’）Ａ９、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）ＮＡ１０Ａ１１、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ａ１１、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｙ’Ａ９、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｚ６、Ｃ（ＮＡ１０）ＮＡ１０Ａ１１、Ｃ（ＮＣＮ）ＮＡ１０Ａ１１、Ｃ（ＮＣＮ）ＳＡ９、ＮＡ１０Ｃ（ＮＣＮ）ＳＡ９、ＮＡ１０Ｃ（ＮＣＮ）ＮＡ１０Ａ１１、ＮＡ１０Ｓ（Ｏ）２Ａ９、Ｓ（Ｏ）ｒＡ９、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｃ（Ｙ’）ＮＡ１０Ａ１１、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｃ（Ｙ’）Ａ１０又はＺ６によって置換されており；ｑ＝０、１又は２であり；ｒ＝０〜２であり；Ａ７は無関係にＨ及びＡ９から選ばれており；Ａ８はＯ又はＡ９であり；Ａ９はＣ１〜４アルキルであり、このアルキルは置換されていないか、又は１又はそれ以上のフッ素によって置換されており；Ａ１０はＯＡ９又はＡ１１であり；Ａ１１は、Ａ７であるか、又はＡ１０及びＡ１１がＮＡ１０Ａ１１としてのときには、それらが窒素と共に、炭素原子だけからなるか、又は炭素原子と、Ｏ、Ｎ及びＳから選ばれる少なくとも１つのヘテロ原子とからなる５乃至７員環を形成することができ；
Ｚ４はＣ６〜１２アリール又はアリールオキシＣ１〜３アルキルであり；
Ｚ５は、フラニル、テトラヒドロフラニル、インダニル、インデニル、テトラヒドロピラニル、ピラニル、チオピラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロチエニル、チエニル、１又は２の不飽和結合を含むＣ３〜８シクロアルキル又はＣ４〜８シクロアルキル、及びＣ７〜１１ポリシクロアルキルから選ばれており；
Ｚ６は、Ｎ−アゾリル、ジオキサジアジニル、ジオキサジアゾリル、ジオキサニル、２−Ｎ−ジオキサトリアジニル、ジオキサジニル、Ｎ−ジオキサゾリル、ジオキソリル、ジチアジアジニル、ジチアジアゾリル、Ｎ−ジチアトリアジニル、ジチアジニル、Ｎ−ジチアゾリル、１−Ｎ−イミダゾリル、Ｎ−モルフォリニル、ピロールイル、テトラゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、オキサジニル、オキサゾリル、ナフチドリニル、オキサジアジニル、オキサジアゾリル、オキサテトラジニル、オキサトリアジニル、オキサトリアゾリル、オキサジニル、オキサゾリル、ペンタジニル、フタルアジニル、Ｎ−ピペリジニル、Ｎ，Ｎ−ピペラジニル、１−Ｎ−ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニル、テトラチアジニル、テトラジニル、１−Ｎ−テトラゾリル、テトロキサジニル、チアジアジニル、チアジアゾリル、チアテトラジニル、チアトリアジニル、チアトリアゾリル、チアゾリル、トリアジニル、１−Ｎ−トリアゾリル、トリオキサダジニル、トリオキサニル、トリオキサジニル、トリオキサゾリル、トリチアジアジニル、トリチアジニル、トリチアジアゾリルから選ばれており；
Ｚ４、Ｚ５又はＺ６は、Ｚ４、Ｚ５及びＺ６から無関係に選ばれる１又はそれ以上の他の構成員に融合することができる。
【００４９】
本発明の特に好ましい具体例では、前記発色団は、次の（ｘ）、（ｙ）又は（ｚ）
として提示される構造を有する発色団からなることができ：
【化７６】
【化７７】
【化７８】
式中、Ｒ及びＲ’は、以下の組合せ：
Ｒ Ｒ’
４−Ｈ ４−ＮＣＳ
４−Ｍｅ ４−ＮＣＳ
４−Ｂｒ ４−ＮＣＳ
４−ＣＯ２Ｍｅ ４−ＮＣＳ
３，４，５−トリス（ＯＭｅ） ４−ＮＣＳ
４−ＮＣＳ ４−ＯＭｅ
４−ＮＣＳ ４−Ｍｅ
４−ＮＣＳ ４−ＣＯ２Ｍｅ
４−ＮＣＳ ４−Ｂｒ
４−ＮＣＳ ４−ＣＮ
４−ＮＣＳ ４−ＣＯ２Ｍｅ
のいずれかであることができる。
【００５０】
本発明の他の具体例では、前記発色団は次に提示する構造を有するポルフィリン発色団からなることができ：
【化７９】
式中、ｍ＝０〜６であり；ｐ＝０〜１５、好ましくは０〜５であり；又は相当するクロリン又はバクテリオクロリン発色団である。
【００５１】
本発明の他の見地においては、マルチカラー蛍光色素分析用の蛍光色素マーカーの組合せであって、ポルフィリン発色団、クロリン発色団及びバクテリオクロリン発色団からなる群より選ばれる少なくとも２つの発色団からなり、それらの各発色団が同じポルフィリン骨格からなり、それらの各発色団が前記ポルフィリン骨格上の１又はそれ以上の置換基を含んでおり、それらの置換基の１つが接合基Ｚを含む接合置換基Ｌであり、Ｚが、複数の異なる所定の生物学的標的の１つに各発色団を送達するためのポリペプチド分子に、前記各発色団を接合させることができる接合基である組合せを提供する。
【００５２】
好ましくは、骨格上の他の前記置換基のそれぞれは、無関係に、Ｈ、又は前記接合置換基Ｌ及びすべての他のコア置換基とともに各発色団の蛍光特性を実質的に損なわない不活性置換基Ｒである。
【００５３】
本発明の組合せにおける各発色団が、励起において、異なる別々の波長で蛍光の光を放出することが見出された。したがって、組合せ中のすべての発色団は、単一レーザーによって励起され、実質的に個々に消散（ｒｅｓｏｌｖｅ）されることがある分かれた放出バンドを生成する。さらに、前記組合せにおいて提供される発色団のすべては、同じ分子構造を実質的に共有し、及び従って、与えられた条件下での生物学的標的に対する生物学的接合の同じ程度の効率を実質的に含む、同じ生物学的及び物理化学的特性を実質的に共有する。したがって、本発明の発色団の組合せは、ＦＡＣＳを含む、種々の種類の細胞又は他の生物学的標的の都合のよい選別及び分析のための蛍光分析及び選別の適用に有効に用いることができる。かかる組合せの構成成分は、例えば、１又はそれ以上の前記異なる所定の生物学的標的を含む混合物に、各発色団をそのそれぞれの所定の生物学的標的に送達させる条件の下で導入され；及び前記混合物は、前記発色団に蛍光を生じさせるように光に曝されることができる。次いで、マルチカラー分析を、各発色団によって生じる異なる放出バンドを確認するために実行し、それによって、それぞれの異なる生物学的標的の位置の計数及び可視化を可能にすることができる。
【００５４】
前記発色団の組合せは、特に、本発明の任意の見地の２又はそれ以上のポルフィリン発色団、相当するクロリン発色団、及び相当するバクテリオクロリン発色団からなることができる（ここで、“相当する”は、分子の大環状コアの周りに同じメソ−置換基を有することを意味する）。
【００５５】
本発明の発色団において、又は本発明の発色団の組合せのそれぞれの構成員において、前記接合基Ｚは、前記生物学的標的に対する特異的な結合に適合する結合タンパク質に接合することができる。あるいはまた、前記接合基Ｚは、架橋ポリペプチドに接合することができ、この架橋ポリペプチドは、前記発色団を相補的架橋ポリペプチドに連関させるために、前記相補的架橋ポリペプチドに対する結合に適合する。
【００５６】
いくつかの具体例では、前記架橋ポリペプチドは、前記相補的架橋ポリペプチドに結合することができ、及び前記相補的架橋ポリペプチドは、前記生物学的標的に対する特異的な結合に適合する結合タンパク質からなるか、これに連関するか、又はこれと融合することができる。したがって、前記発色団は、前記結合タンパク質と、前記架橋ポリペプチド及び前記相補的架橋ポリペプチドによって共有結合的に連結される場合がある。
【００５７】
本発明の他の見地においては、本発明の発色団又は本発明の発色団の組合せからなるキットであって、前記発色団又は各発色団が架橋ポリペプチドに接合され、この架橋ポリペプチドが、前記発色団を相補的な架橋ポリペプチドに連関させるために、前記相補的な架橋ポリペプチドに対する結合に適合し；及び構成物又は複数の構成物が、それぞれ、前記生物学的標的に対する特異的な結合に適合する結合タンパク質に融合するか、又は連関する前記相補的な架橋ポリペプチドからなり；その配列が、前記発色団又は各発色団を、前記所定の生物学的標的に対して特異性を有する結合タンパク質に連結させるために、キット中の前記発色団又は各発色団を、前記所定の生物学的標的に対して特異性を有するキット中での異なる構成物への結合に適合されているキットを提供する。
【００５８】
例えば、前記結合タンパク質は、前記生物学的標的の表面上の標的特異的分子に対して特異性を有するモノクローナル又はポリクローナル抗体又はそれらの断片のような抗体でよい。特に、前記抗体は、ファージ抗体であり、バクテリオファージの表面上に発現される抗体であることができる。あるいはまた、前記結合タンパク質は、血清アルブミンタンパク質のような１又はそれ以上の細胞表面分子又は受容体に対する結合に適合するタンパク質からなることができる。また更に代わりとして、前記結合タンパク質は、細胞膜中への挿入のために適合される脂肪酸鎖のような低密度リポタンパク質からなることができる。発色団に接合させる場合、かかるリポタンパク質は、発色団を細胞膜に固定する役目を果たすことができる。
【００５９】
前記架橋ポリペプチドは、カルモジュリンからなることができ、及び前記相補的架橋ポリペプチドは、カルモジュリン結合ペプチドからなることができ；又は逆もまた同じである。しかし、好ましくは、前記架橋ポリペプチドは、アビジン又はストレプトアビジンからなることができ、及び前記相補的架橋ポリペプチドはビオチンからなることができ；又は逆もまた同じである。特に、本発明のキット中の前記発色団又は各発色団は、アビジンに接合することができ、及び前記構成物又は各構成物は、前記生物学的標的の表面上の標的特異的分子に対して特異性を有するビオチン化モノクローナル抗体からなることができる。したがって、前記アビジン−連結発色団が前記ビオチン化抗体を結合させる場合、前記発色団は前記抗体にしっかりと連結することになる。都合のよいことには、前記発色団又は各発色団を望ましい生物学的標的に送達させるために、キット中の前記ビオチン化モノクローナル抗体又は各ビオチン化モノクローナル抗体は、選定され及び／又はたやすく置換することができる。モノクローナル抗体の調製のための及びそのビオチン化のための方法は、この技術においてよく知られている。
【００６０】
本発明の他の見地においては、本発明の発色団又は本発明の発色団の組合せを、前記所定の生物学的標的又は標的群に対して付着させるにあたり、本発明のキットを提供する工程、及び前記キットの成分を、前記結合タンパク質又は各結合タンパク質の前記所定の生物学的標的又は標的群に対する結合を可能にするための適切な条件下に、前記所定の生物学的標的又は標的群の近くに導入する工程を含む方法を提供する。有利には、前記キットの成分は、前記発色団又は各発色団に接合する架橋ポリペプチドを、キット中の１つの前記構成物上に提供される相補的な架橋ポリペプチドに結合させるために、前記標的又は標的群の導入に先立って、互いに結び付かせることができる。このことは、キット中の前記発色団又は各発色団が、前記発色団の前記標的又は標的群への導入に先立って、結合タンパク質に連結するのを確実にする。あるいはまた、前記キットの成分は、前記標的又は標的群に次いで導入することができる。
【００６１】
代表的に、前記所定の生物学的標的は、細胞又は膜でよい。前記所定の生物学的標的は、インビボ又はインビトロ（エクスビボ）であってよい。例えば、前記生物学的標的は、癌細胞、腫瘍細胞、ＨＩＶにか、又は任意の他の微生物又はウイルスに感染した細胞、自己免疫疾患において有害な活性を引き起こす細胞、外来のか、又は異常細胞（ｄｉｓｅａｓｅｄ ｃｅｌｌ）、又は任意の他のそのような細胞である場合がある。
【００６２】
本発明のいくつかの具体例では、前記生物学的標的は、インビトロの細胞であり、及び前記標的特異的分子は、ポリペプチド、糖質（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）、脂肪酸、リポタンパク質、リン脂質又は他の生物学的分子のような、前記細胞の表面上に露出する分子からなる。好ましくは、前記標的特異的分子は、前記細胞によって特異的に発現されるか、又は余分に発現（ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓ）されている。例えば、前記標的特異的分子は、ＣＤ４又はＣＤ８のようなＴ細胞マーカーでよい。したがって、本発明の発色団又は本発明の発色団の組合せの一部分を形成する発色団は、前記細胞に付着し、及び前記細胞が、前記発色団の蛍光を生じさせるために照射され、発色団の蛍光によって、前記細胞が可視化され、及びＦＡＣＳによる計数が行われ及び／又は選別される。
【００６３】
したがって、本発明の更なる見地においては、細胞の混合物から標的細胞を蛍光活性化選別するにあたり、本発明の発色団又は本発明の発色団の組合せを前記標的細胞に付着させ、前記標的細胞に付着した前記発色団の１又はそれ以上の蛍光を生じさせるために、細胞の前記混合物に照射をし、蛍光を発する細胞に荷電を与え、及び前記荷電細胞を前記混合物から分離するか、又は分離させるために、細胞の混合物を偏極環境（ｐｏｌａｒｉｓｅｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）に通す工程を含む方法を提供する。
【００６４】
本発明の他の見地においては、複数の標的細胞であって、前記標的細胞が２又は３の異なる細胞種の細胞を含んでいる複数の標的細胞の可視化及び／又は計数にあたり、本発明の発色団の組合せを提供する工程であって、発色団の組合せが２又は３の発色団を含み、各発色団が異なる１つの前記細胞種に送達されるのに適合する工程；その組合せ中の前記発色団を本発明の方法に従って前記標的細胞に付着させる工程；前記発色団によって蛍光の発光を生じさせるために、前記標的細胞に照射をする工程；前記各発色団によって生じる蛍光発光バンドを検出する工程；及び随意に前記各バンドについて、それぞれの個別の細胞種の蛍光細胞の数の測定値を得るために、発光／波長曲線の下での領域を測定する工程を含む方法を提供する。
【００６５】
本発明の他の具体例では、前記標的細胞は、癌細胞、腫瘍細胞、又は感染したか、外来のか又は異常細胞のようなインビトロの細胞であり、及び前記標的特異的分子は、前記標的細胞の表面によって発現されるか、又は余分に発現されるか、又はそれに付着するか、及びその上に露出する；標的細胞特異的膜タンパク質のような標的細胞特異的分子である。したがって、本発明の発色団が前記標的特異的分子に送達される場合、前記発色団は前記細胞に対して付着することになる。前記細胞が次いで、前記発色団の励起を起こさせるのに適切な波長で光を用いて照射される場合、前記細胞に付着する前記発色団は、励起を起こされ、及びこれが前記細胞のすぐ近くにおいて一重項酸素の生成を招き、従ってその細胞の死をもたらす。
【００６６】
特に好ましい具体例では、前記標的細胞特異的分子は、前記細胞の表面上の内部移行（インターナリゼーション）受容体からなり、この内部移行受容体は前記結合タンパク質と結合することができ、及びそれによって前記細胞内での前記発色団の内部移行を媒介する。したがって、その後の、前記発色団の励起を起こさせるのに適切な波長での前記細胞の光を用いる照射は、前記細胞内での一重項酸素の生成を招き、従って前記細胞の死をもたらす。
【００６７】
したがって、本発明は、標的細胞の消滅を起こさせるにあたり、本発明の発色団を前記細胞に付着させ及び一重項酸素の生成を前記細胞の近くで起こさせるために、前記細胞に照射をする工程を含み、それによって、細胞の死を起こさせる方法を包含する。好ましくは、前記発色団は、前記細胞の表面上の内部移行受容体に付着し、この内部移行受容体は、前記細胞内での前記発色団の内部移行を媒介することができ、及び前記細胞はその後、前記細胞内での一重項酸素の生成が生じるように照射をされ、それによって細胞の死が生じる。
【００６８】
好ましくは、前記発色団が細胞内に内部移行されるのに適合する場合、前記発色団は、ミトコンドリア膜上の正味負電荷（ｎｅｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅ）によって、細胞のミトコンドリアの周りの前記発色団の細胞内蓄積を促進するために、四級化アミン又はピリジル（ピリジニウミル）基、又はホスホニウム基のような、陽イオン性の基を含む。このことは、発色団の崩壊（ｄｅｃａｙ）による一重項酸素の提示があった場合に、細胞の迅速でかつ効率的な消滅をもたらす。
【００６９】
本発明の他の見地においては、腫瘍、癌、ＨＩＶ感染のようなウイルス感染、又はリウマチ様関節炎又は多発性硬化症のような自己免疫疾患のような、異常細胞か又は望ましくない細胞の体内での存在によって特徴付けられる疾病又は障害を処置するにあたり、本発明の発色団の有効な量をそれを必要としている患者に投与する工程であって、その発色団が前記細胞への付着を生じるように、その発色団が前記異常細胞か又は望ましくない細胞の表面上の標的細胞特異的分子に対してそれらへの付着のための標的にされるのに適合し、及び前記細胞の近くで一重項酸素の生成を生じさせるために、光を用いて前記細胞に照射をする工程を含み、それによって前記細胞を死滅させる方法を提供する。適切には、前記標的細胞特異的分子は内部移行受容体からなり、及び前記発色団は、前記内部移行受容体への送達において細胞内に内部移行するのに適合し、その照射によって前記細胞内での一重項酸素の生成が可能にされる。
【００７０】
前記発色団は、局所的にか、又は全身的に前記患者に投与することができる。例えば、前記発色団は注射によって投与することができる。
【００７１】
本発明の更に他の見地においては、腫瘍、癌、ＨＩＶ感染のようなウイルス感染、又はリウマチ様関節炎又は多発性硬化症のような自己免疫疾患のような、異常細胞か又は望ましくない細胞の体内での存在によって特徴付けられる疾病又は障害を処置するために患者に投与される薬学組成物であって、組成物が、本発明の発色団であって、前記異常細胞か又は望ましくない細胞へ送達されるのに適合する発色団、及び適切な担体からなる薬学組成物を提供する。
【００７２】
本発明の更に他の見地は、腫瘍、癌、ＨＩＶ感染のようなウイルス感染、又はリウマチ様関節炎又は多発性硬化症のような自己免疫疾患のような、異常細胞か又は望ましくない細胞の体内での存在によって特徴付けられる疾病又は障害を患う患者の処置において用いる薬剤の製造において使用するための、本発明の発色団であって；前記発色団が、前記異常細胞か又は望ましくない細胞に対する送達のために適合する発色団を構想する。
【００７３】
本発明の例の詳細な説明
以下は、実例としてのみの、本発明の具体例及び本発明を実施するための方法の説明及び例である。
発色団の合成
計測手段（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）及び材料
融点は修正しない。１Ｈ／１３Ｃ ＮＭＲスペクトルをＪｅｏｌ ＪＮＭ ＥＸ２７０ＦＴ−ＮＭＲ分光計上で記録し、特に明記しない限り、テトラメチルシランを基準にした。Ｉ．Ｒ．スペクトルを一連の１６００ ＦＴ−Ｉ．Ｒを用いて得、及び公称マススペクトルをＫｒａｔｏｓ Ｋｏｍｐａｃｔ（クラトスコンパクト）ＭＡＬＤＩ ＩＩ分光計によって得た。正確な質量をＥＰＳＲＣ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ（マススペクトロメトリーサービス），Ｓｗａｎｓｅａ（スウォンジ）から得た。電子スペクトルをＵｎｉｃａｍ（ユニカム）ＵＶ−２又はＵＶ−４分光計を用いて得、及び特に明記しない限り、ＤＣＭにおいて取得した。すべての試薬及び溶媒は、市場で入手できるもので、試薬等級又はより一層高い等級であり、及び特別の定めのない限り、受け取ったものとして用いた。ＴＬＣ分析をＭｅｒｃｋ ｓｉｌｉｃａ−ｇｅｌ（メルクシリカゲル）６０プレート（Ｆ２５４，５００μｍの厚さ）上で行った。メルクシリカゲル６０（２３０〜４００メッシュ）をフラッシュクロマトグラフィーの精製のために用いた。
【００７４】
説明
（１） ５−｛４−アセトアミドフェニル−１０，１５，２０−トリス（３，５−ジメトキシフェニル）ポルフィリン
【化８０】
４−アセトアミドベンズアルデヒド（３．３６ｇ，０．０２モル）及び３，５−ジメトキシベンズアルデヒド（１０ｍＬ，０．０６モル）をプロピオン酸（３００ｍＬ）中９０℃で撹拌した。ピロール（５．５ｍＬ，０．０８モル）を添加し、及びその混合物を３０分間還流させながら撹拌した。冷却の際に、反応混合物を減圧中で蒸発させ、濃い紫色（ｄａｒｋ ｐｕｒｐｌｅ）の固体を得た。ポルフィリン異性体の粗製の混合物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、溶出液：ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ，４：１）によって精製した。関連した画分を組み合わせ、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させ、及び減圧中に蒸発させ、紫色の固体（１．５５ｇ，９．１％）としての１を得た；Ｒｆ＝０．５０（シリカ、ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ，４：１）；融点＞３５０℃分解（ｄｅｃｏｍｐ．）；１Ｈ ＮＭＲ［２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３］δ−２．９６（２Ｈ，ｂｒ ｓ，ＮＨ），２．２３（３Ｈ，ｓ，ＮＨＣＯＣＨ３），３．９３（１８Ｈ，ｓ，３，５−ＯＣＨ３），６．９９（３Ｈ，ｓ，１０，１５，２０−Ａｒ−４−Ｈ），７．０７（２Ｈ，ｍ，Ｊ＊＝８Ｈｚ，５−Ａｒ−３，５−Ｈ），７．３８（６Ｈ，ｓ，１０，１５，２０−Ａｒ−２，６−Ｈ），７．４４（２Ｈ，ｍ，Ｊ＊＝８Ｈｚ，５−Ａｒ−２，６−Ｈ），８．８６−８．９３（８Ｈ，ｍ，β−Ｈ），１０．４２（１Ｈ，ｂｒ ｓ，ＮＨＣＯＣＨ３）；１３Ｃ ＮＭＲ［６７．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３］δ２０．４，２３．９，１０３．９，１１３．５，１１７．３，１１９，１１９．４，１１９．６，１２０，１２９，１３１．１，１３１．３，１３１．４，１３１．８，１３４．５，１３５．６，１３６．８，１３９．３，１４３．１，１５８．６，１６０．３，１６７．９，１６８．７；ＵＶ−ｖｉｓ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ４２１，５１５，５５１，５９０，６５０ｎｍ；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ８５２（Ｍ＋，１００％）。
【００７５】
（２） ５−（４−アミノフェニル）−１０，１５，２０−トリス（３，５−ジメトキシフェニル）ポルフィリン
【化８１】
ポルフィリン１（５００ｍｇ，０．５８７ミリモル）を１８％ＨＣｌ（１００ｍＬ）中に溶解し、及びその溶液を還流下に２時間加熱した。冷却の際に、反応混合物を減圧中に蒸発させ、粗製の緑色の固体を得た。その固体を９：１の混合物のジクロロメタン／トリエチルアミン（２００ｍＬ）中に再び溶解し、及び室温で１０分間撹拌した。次いで、その溶液を、水（３×２００ｍＬ）及び鹹水（ｂｒｉｎｅ）（２００ｍＬ）を用いて洗浄し、その有機層を分離し、及び乾燥（Ｎａ２Ｓ０４）させた。過剰の溶媒を減圧中で蒸発させ、及びその粗製の紫色固体をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、溶出液：ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ，４：１）によって精製した。関連する画分を組み合わせ、乾燥（Ｎａ２Ｓ０４）させ、及び減圧中で蒸発させて紫色の固体（４２６ｍｇ，８９．７％）としての２を得た；Ｒｆ＝０．８９（シリカ，ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ，４：１）；融点＞３５０℃分解；１Ｈ ＮＭＲ［２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３］δ−２．８０（２Ｈ，ｂｒ ｓ，ＮＨ），３．９６（１８Ｈ，ｓ，３，５−ＯＣＨ３），６．９０（３Ｈ，ｓ，１０，１５，２０−Ａｒ−４−Ｈ），７．０６（２Ｈ，ｍ，Ｊ＊＝８Ｈｚ，５−Ａｒ−３，５−Ｈ），７．４０（６Ｈ，ｓ，１０，１５，２０−Ａｒ−２，６−Ｈ），７．９８（２Ｈ，ｍ，Ｊ＊＝８Ｈｚ，５−Ａｒ−２，６−Ｈ），８．９３（８Ｈ，ｍ，β−Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ［６７．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３］δ２０．１３，１００．６，１１３．９，１１４．３，１１５．７，１１９．８，１２０．１，１２１．４，１３０．２，１３１．４，１３２．７，１３６．１，１４４．５，１４４．６，１４６．５，１５９．３；ＵＶ−ｖｉｓ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ４２２，５１７，５５３，５９３，６５１ｎｍ；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ８０９（Ｍ＋，１００％）。
【００７６】
（３） ５−（４−アミノフェニル）−１０，１５，２０−トリス（３，５−ジヒドロキシフェニル）ポルフィリン
【化８２】
新しく蒸留したクロロホルム（５０ｍＬ）中の２の撹拌した溶液（１ｇ，１．２３ミリモル）に、三臭化ホウ素（１．１７ｍＬ，０．０１２モル）を添加した。反応を、アルゴン下に１７時間、室温で進ませた。次いで、反応物を０℃に冷却し、水（２０ｍＬ）を添加し、及びその溶液を更に６０分間撹拌した。反応物を減圧中で蒸発乾燥し、及び９：１の混合物のクロロホルム／トリエチルアミン（５００ｍＬ）中に再び溶解した。その溶液を、水（３×５００ｍＬ）及び鹹水（かん水５００ｍＬ）を用いて洗浄し、その有機層を分離し、乾燥（Ｎａ２Ｓ０４）させ、及び減圧中で蒸発させて粗製の紫色固体を得た。その粗製の固体をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、溶出液：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，９：１）によって精製した。関連した画分を組み合わせ、乾燥（Ｎａ２Ｓ０４）させ、及び減圧中で蒸発させて紫色の固体（６６７ｍｇ，７４．５％）としての３を得た；Ｒｆ＝０．１９（シリカ，ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，９：１）；融点＞３５０℃分解；１Ｈ ＮＭＲ［２７０ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ］δ−２．９５（２Ｈ，ｂｒ ｓ，ＮＨ），５．５６（２Ｈ，ｂｒ ｓ，ＮＨ２），６．６９（３Ｈ，ｓ，１０，１５，２０−Ａｒ−４−Ｈ），７．０２（２Ｈ，ｍ，Ｊ＊＝８Ｈｚ，５−Ａｒ−３，５−Ｈ），７．０６（６Ｈ，ｓ，１０，１５，２０−Ａｒ−２，６−Ｈ），７．８７（２Ｈ，ｍ，Ｊ＊＝８Ｈｚ，５−Ａｒ−２，６−Ｈ），８．９４（８Ｈ，ｓ，β−Ｈ），９．７５（６Ｈ，ｂｒ ｓ，３，５−ＯＨ）；１３Ｃ ＮＭＲ［６７．５ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ］δ１０２．３，１１２．５，１１３．９，１１４．１，１１９．２，１１９．７，１２１．５，１２７．５，１２８．３，１３０．７−１３１．３，１３５．５，１４２．８，１４２．９，１４８．６，１５６．４，１５６．５；ＵＶ−ｖｉｓ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ４２２，５１７，５５３，５９２，６４９ｎｍ；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ７２６（Ｍ＋，１００％）。
【００７７】
（４） ５−（４−アセトアミドフェニル）−１０，１５，２０−トリス（４−ピリジル）ポルフィリン
【化８３】
４−アセトアミドベンズアルデヒド（３．２６ｇ，０．０２モル）及び４−ピリジンカルボキシアルデヒド（５．６６ｍＬ，０．０６モル）をプロピオン酸（３００ｍＬ）中、９０℃で撹拌した。ピロール（５．４ｍＬ，０．０８モル）を添加し、及びその混合物を還流下に３０分間撹拌した。冷却の際に、反応混合物を減圧中で蒸発させ、濃い紫色の固体を得た。ポルフィリン異性体の粗製の混合物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、溶出液：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，１９：１）によって精製した。関連した画分を組み合わせ、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させ、及び減圧中に蒸発させて紫色の固体（５２６ｍｇ，３．９％）としての４を得た；Ｒｆ＝０．２２（シリカ，ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，１９：１）；融点＞３５０℃分解；１Ｈ ＮＭＲ［２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３］δ−２．７９（２Ｈ，ｂｒ ｓ，ＮＨ），２．４９（３Ｈ，ｓ，ＮＨＣＯＣＨ３），８．０７（２Ｈ，ｍ，Ｊ＊＝８Ｈｚ，５−Ａｒ−３，５−Ｈ），８．２１−８．２８（８Ｈ，ｍ（重複），５−Ａｒ−２，６−Ｈ及び１０，１５，２０−Ｐｙ−２，６−Ｈ），８．８４−９．０６（８Ｈ，ｍ，β−Ｈ），９．１０−９．１５（６Ｈ，ｍ，１０，１５，２０−Ｐｙ−３，５−Ｈ），１０．３５（１Ｈ，ｂｒ ｓ，ＮＨＣＯＣＨ３）；１３Ｃ ＮＭＲ［６７．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３］δ２６．８，１０６．９，１１０．１，１１０．２，１１７．９，１２１．１，１２１．５，１２２．１，１２２．２，１２３．３，１２３．８，１２３．９，１３４．７，１４０．１，１４２．５，１４５．１，１４８．２，１４９，１４９．３，１４９．４，１４９．６，１５０．１，１７５．２；ＵＶ−ｖｉｓ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ４１８，５１４，５４８，５８７，６４４ｎｍ；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ６７５（Ｍ＋，１００％）。
【００７８】
（５） ５−（４−アミノフェニル）−１０，１５，２０−トリス（４−ピリジル）ポルフィリン
【化８４】
ポルフィリン４（５００ｍｇ，０．７４ミリモル）を１８％ＨＣｌ（１００ｍＬ）中に溶解し、及びその溶液を還流下に２時間加熱した。冷却の際に、反応混合物を減圧中で蒸発させ、粗製の緑色の固体を得た。その固体を９：１の混合物のジクロロメタン／トリエチルアミン（２００ｍＬ）中に再び溶解し、１０分間室温で撹拌した。次いで、その溶液を、水（３×２００ｍＬ）及びかん水（２００ｍＬ）を用いて洗浄し、その有機層を分離し、乾燥（Ｎａ２Ｓ０４）させた。過剰の溶媒を減圧中で蒸発させ、及び紫色の粗製の固体をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、溶出液：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，２０：１）によって精製した。関連した画分を組み合わせ、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させ、及び減圧中に蒸発させて紫色の固体（４２２ｍｇ，９０．１％）としての５を得た；Ｒｆ＝０．３１（シリカ，ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，２０：１）；融点＞３５０℃分解；１Ｈ ＮＭＲ［２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３］δ−２．８６（２Ｈ，ｂｒ ｓ，ＮＨ），４．０９（２Ｈ，ｂｒ ｓ，ＮＨ２），７．０８（２Ｈ，ｍ，Ｊ＊＝８Ｈｚ，５−Ａｒ−３，５−Ｈ），７．９８（２Ｈ，ｍ，Ｊ＊＝８Ｈｚ，５−Ａｒ−２，６−Ｈ），８．１６（６Ｈ，ｍ，Ｊ＊＝５Ｈｚ，１０，１５，２０−Ｐｙ−２，６−Ｈ），８．８０−９．０１（８Ｈ，ｍ，β−Ｈ），９．０４（６Ｈ，ｍ，Ｊ＊＝５Ｈｚ，１０，１５，２０−Ｐｙ−３，５−Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ［６７．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３］δ１１３．６，１１６．７，１１７．４，１１７．９，１２２．７，１２９．５，１３１．７，１３５．９，１４６．５，１４８．４，１４８．５，１４９．８，１５０．２；ＵＶ−ｖｉｓ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ４１８，５１５，５５２，５９２，６５３ｎｍ；ＭＳ（ＦＡＢ）ｍ／ｚ６３３（Ｍ＋，１００％）。
【００７９】
（６） ５−（４−アセトアミドフェニル）−１０，１５，２０−トリス（３−ピリジル）ポルフィリン
【化８５】
４−アセトアミドベンズアルデヒド（５ｇ，０．０３１モル）及び３−ピリジンカルボキシアルデヒド（８．６７ｍＬ，０．０９２モル）を、プロピオン酸（３００ｍＬ）中９０℃で撹拌した。ピロール（８．５ｍＬ，０．１２３モル）を添加し、及びその混合物を還流下に３０分間撹拌した。冷却の際に、反応混合物を減圧中に蒸発させて濃い紫色の固体を得た。そのポルフィリン異性体の粗製の混合物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ，溶出液：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，１９：１）によって精製した。関連した画分を組み合わせて、乾燥（Ｎａ２Ｓ０４）し、及び減圧中で蒸発させて紫色の固体（０．９６ｇ，４．６％）としての６を得た；Ｒｆ＝０．２６（シリカ，ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，１９：１）；融点＞３５０℃分解；１Ｈ ＮＭＲ［２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３］δ−２．９７（２Ｈ，ｂｒ ｓ，ＮＨ），２．１７（３Ｈ，ｓ，ＮＨＣＯＣＨ３），７．４０（２Ｈ，ｍ，Ｊ＊＝８Ｈｚ，５−Ａｒ−３，５−Ｈ），７．４９（３Ｈ，ｍ，１０，１５，２０−Ｐｙ−５−Ｈ），７．９８（２Ｈ，ｍ，Ｊ＊＝８Ｈｚ，５−Ａｒ−２，６−Ｈ），８．２１−８．３３（３Ｈ，ｍ，１０，１５，２０−Ｐｙ−６−Ｈ），８．５７−８．８２（１１Ｈ，ｍ（重複），１０，１５，２０−Ｐｙ−４−Ｈ及びβ−Ｈ），８．９９（１Ｈ，ｂｒ ｓ，ＮＨＣＯＣＨ３），９．２６（３Ｈ，ｍ，１０，１５，２０−Ｐｙ−２−Ｈ）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ４１９，５１６，５５２，５９２，６４８ｎｍ；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ６７５（Ｍ＋，１００％）。
【００８０】
（７） ５−（４−アミノフェニル）−１０，１５，２０−トリス（３−ピリジル）ポルフィリン
【化８６】
ポルフィリン６（３００ｍｇ，０．４５ミリモル）を１８％ＨＣｌ（１００ｍＬ）中に溶解し、及びその溶液を還流下に２時間加熱した。冷却の際に、反応混合物を減圧中で蒸発させて粗製の緑色の固体を得た。その固体を９：１の混合物のジクロロメタン／トリエチルアミン（２００ｍＬ）中に再び溶解し、及び１０分間室温で撹拌した。次いで、その溶液を、水（３×２００ｍＬ）及びかん水（２００ｍＬ）を用いて洗浄し、その有機層を分離し、及び乾燥（Ｎａ２Ｓ０４）させた。過剰の溶媒を減圧中で蒸発させ、及び紫色の粗製の固体をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ，溶出液：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，２０：１）によって精製した。関連した画分を組み合わせて、乾燥（Ｎａ２Ｓ０４）させ、及び減圧中で蒸発させて紫色の固体（２０６ｍｇ，６８．５％）としての７を得た；Ｒｆ＝０．３８（シリカ，ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，２０：１）；融点＞３５０℃分解；１Ｈ ＮＭＲ［２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３］δ−２．７４（２Ｈ，ｂｒ ｓ，ＮＨ），３．９３（２Ｈ，ｂｒ ｓ，ＮＨ２），６．９１（２Ｈ，ｍ，Ｊ＊＝８Ｈｚ，５−Ａｒ−３，５−Ｈ），７．６７（３Ｈ，ｍ，１０，１５，２０−Ｐｙ−５−Ｈ），７．９３（２Ｈ，ｍ，Ｊ＊＝８Ｈｚ，５−Ａｒ−２，６−Ｈ），８．４８（３Ｈ，ｍ，１０，１５，２０−Ｐｙ−６−Ｈ），８．７９−９．０２（１１Ｈ，ｍ（重複），１０，１５，２０−Ｐｙ−４−Ｈ及びβ−Ｈ），９．４７（３Ｈ，ｓ，１０，１５，２０−Ｐｙ−２−Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ［６７．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３］δ１１３．３，１１５．６，１１６．１，１１６．７，１２１．９，１２２．３，１３１，１３１．４，１３１．８，１３２．１，１３２．３，１３５．７，１３７．５，１３７．７，１３７．８，１４０．８，１４６．３，１４９，１４９．２，１５３．５；ＵＶ−ｖｉｓ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ４２０，５１７，５５３，５９７，６４９ｎｍ；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ６３２（Ｍ＋，１００％）。
【００８１】
（８） ５−（４−アセトアミドフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン，
Ｄｏｌｐｈｉｎ（ダルフィン）等の方法（１９９８年、５−フェニルジピロメタン及び５，１５−ジフェニルポルフィリン Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．７６，２８７〜２９３参考としてここに組み入れる）に従ってＤＤＰを合成した。３つのポルフィリンの得られた混合物を、クロマトグラフ処理し、５，１５−（４−メトキシ）−ＤＤＰを除去させるために最初にＤＣＭを用いて溶出し、及び次いで、酢酸エチル／ＤＣＭ（１：４）を続けて紫色の結晶（１５０ｍｇ，１２％）としての所要の生成物を溶出した；Ｒｆ＝０．４０（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，１９：１）；融点３０５〜３０７℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）４１０（１．０），５０２（０．０４），５３８（０．０２），５７８（０．０１５），６３０（０．０１）ｎｍ；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１０．３５（ｓ，２Ｈ，１０＋２０−Ｈ），９．４３（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．１４（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．６５（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，５−ｍ−Ａｒ），８．２２−８．１２（ｍ，４Ｈ，（重複），Ｊ＝８．１Ｈｚ，５＋１５−ｏ−Ａｒ），７．５６（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１５−ｍ−Ａｒ），４．１４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），−３．００（ｂｒ ｓ，２Ｈ，ＮＨ）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ５５０．３（Ｍ＋，１００％）。
【００８２】
（９） ５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン，
５−（４−アセトアミドフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン８（１等量（ｅｑ．），１００ｍｇ，０．１８２ミリモル）を５ＭのＨＣｌ水溶液（１００ｍＬ）中に溶解し、及びその溶液を還流下に３時間加熱した。熱い反応混合物を減圧中で濃縮して粗製の緑色の固体を得た。その固体を、ＤＣＭ／トリエチルアミン（９：１）（２００ｍＬ）の混合物中に再び溶解し、及び１０分間室温で撹拌した。次いで、その溶液を、水（３×２００ｍＬ）、飽和かん水（２００ｍＬ）を用いて洗浄し、及びその有機層を分離し、及び乾燥（Ｎａ２Ｓ０４）させ、次いで、減圧中で濃縮した。粗製の紫色の固体を、クロマトグラフ処理し、ＤＣＭを用いて溶出して、及び紫色の結晶性固体（５１ｍｇ，５４％）としての望ましいポルフィリンを与えた，Ｒｆ＝０．３０（ＤＣＭ），融点３００℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）４１０（１．０），５０３（０．０４５），５３８（０．０２），５７８（０．０１５），６３０（０．００５）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ）λｍａｘ６３４ｎｍ（λ励起＝４１０ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１０．３０（ｓ，２Ｈ，１０＋２０−Ｈ），９．３９（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，β−Ｈ），９．１７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，β−Ｈ），９．１０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，β−Ｈ），８．１９（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１５−ｏ−Ａｒ），８．０７（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，５−ｏ−Ａｒ），７．３５（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１５−ｍ−Ａｒ），７．１４（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，５−ｍ−Ａｒ），４．１３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），４．０８（ｂｒ ｓ，２Ｈ，ＮＨ），−３．０６（ｂｒ ｓ，２Ｈ ＮＨ）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ５０８．３（［Ｍ＋１］＋，１００％）。Ｃ３３Ｈ２６Ｎ５Ｏ（［Ｍ＋１］＋）に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは、５０８．２１３７、見出されたのは５０８．２１４４である。
【００８３】
（１０） １７，１８−ジヒドロキシ−５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリン及び
（１１） ７，８−ジヒドロキシ５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリンのレジオイソマー，
ポルフィリン９（２８ｍｇ，５５．２μモル）を、Ｓｕｔｔｏｎ（サットン）等の方法（２０００ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｅｄ ｄｉｐｈｅｎｙｌｃｈｌｏｒｉｎｓ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｉｎｓ−ｔｈｅｉｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｔｕｍｏｕｒ ｃｅｌｌ ｉｍａｇｉｎｇ Ｊ． Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ａｎｄ Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｓ ４，６５５−６５８）に従って、クロリンレジオイソマーの所要の混合物に転換させた。次いで、その粗製の反応混合物を、クロマトグラフ処理し、ＤＣＭ中の１％ＭｅＯＨを用いて溶出させた。最初に、いくつかの未反応の出発物質を溶出させ、次いで、茶色っぽい紫色（ｂｒｏｗｎ−ｐｕｒｐｌｅ）の結晶性固体としてのより一層高いＲｆ値のクロリン異性体１０を溶出した；Ｒｆ＝０．２８（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，１９：１）。より一層低いＲｆ値の異性体１１を、ＤＣＭ中の２．５％ＭｅＯＨを用いる更なる溶出によって得、及びまた、茶色っぽい紫色の結晶性固体（Ｒｆ＝０．１７（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，１９：１））を与えた。高いＲｆ値のクロリンレジオイソマー（以前与えられた１７，１８−ジヒドロキシ−１５−（４−メトキシフェニル）−５−（４−アミノフェニル）クロリン（２６））（７．０ｍｇ，２４％），融点１６５〜１６７℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）４０１（０．９９），４１４（１．０），５０３（０．０８），５３５（０．０７），５８２（０．０３５），６３６（０．２２）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ）λｍａｘ６３９ｎｍ（λ励起＝４１２ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＣＤ３ＯＤ）δ９．９５（ｓ，１Ｈ，１０−Ｈ），９．４２（ｓ，１Ｈ，２０−Ｈ），９．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．９７（ｓ，２Ｈ，β−Ｈ），８．７８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．５１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．０５（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｏ−Ａｒ），７．９４（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｏ’−Ａｒ），７．２５（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｍ−Ａｒ），７．１２（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｍ’−Ａｒ），６．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１７−Ｈ），６．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１８−Ｈ），４．０８（ｓ，３Ｈ．，ＣＨ３），｛ＮＨのものの交換及びＯＨのものは観察されない（ＮＨ’ｓ ｅｘｃｈａｎｇｅｄ ＆ ＯＨ’ｓ ｎｏｔ ｏｂｓｅｒｖｅｄ）｝；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ５４２．２（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）；Ｃ３３Ｈ２８Ｎ５Ｏ３（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは、５４２．２１９２、見出されたのは５４２．２１８７である。 低いＲｆのクロリンレジオオソマー（７，８−ジヒドロキシ−５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリン）（８．５ｍｇ，３０％），融点１６８〜１７１℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）４０１（０．９９），４１３（１．０），５０７（０．０８），５３６（０．０６），５８６（０．０２５），６３７（０．２０）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ）λｍａｘ６３９ｎｍ（λ励起＝４１２ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＣＤ３ＯＤ）δ９．９６（ｓ，１Ｈ，２０−Ｈ），９．４０（ｓ，１Ｈ，１０−Ｈ），９．１８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．０５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．９８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ）８．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．５８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．１３（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｏ−Ａｒ），８．０８（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｏ−Ａｒ），７．９５（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｏ’−Ａｒ），７．７９（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｏ’−Ａｒ），７．３６（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｍ−Ａｒ），７．３０（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｍ−Ａｒ），７．１１（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｍ’−Ａｒ），７．０５（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｍ’−Ａｒ），６．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，７−Ｈ），６．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，８−Ｈ），４．１１（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），（ＮＨのものの交換及びＯＨのものの交換は観察されない）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ５４２．２（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）Ｃ３３Ｈ２８Ｎ５Ｏ３（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは、５４２．２１９２、見出されたのは５４２．２１８５である。
【００８４】
（１２） ５−（４−フルオレニルメチルアミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン，
無水の１，４−ジオキサン（２．５ｍＬ）中のポルフィリン９（２８ｍｇ，５５μモル）の撹拌した溶液中に、固体の炭酸水素ナトリウム（６等量，２８ｍｇ，０．３３ミリモル）を添加した。次いで、この混合物に、Ｎ２下、１，４−ジオキサン（０．５ｍＬ）中の９−フルオレニルメチルクロロホルメート（２等量，０．１１ミリモル，２８．５ｍｇ）の溶液を添加した。反応フラスコをアルミニウムホイルで覆い、光を遮り、及び室温で３時間撹拌した。このときに、反応が完結した（ＴＬＣによって監視されたように）。１，４−ジオキサンを減圧中で除去し、及び残留物が水（２５ｍＬ）及びＤＣＭ（２×２５ｍＬ）の間に分配された。組み合わせられた有機抽出物を飽和かん水（２５ｍＬ）を用いて洗浄し、次いで乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、ろ過し、及び減圧中で濃縮した。所要のポルフィリンを、ＤＣＭで溶出するクロマトグラフィーによって得た。望ましいポルフィリンが紫色の結晶（３８ｍｇ，９５％）として得られた，Ｒｆ＝０．３９（ＤＣＭ），融点２９２〜２９５℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）４１０（１．０），５０５（０．０４２），５４１（０．０２），５７８（０．０１５），６３３（０．０１）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ）λｍａｘ６３５ｎｍ（λ励起＝４１０ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１０．３５（ｓ，２Ｈ，１０＋２０−Ｈ），９．６９（ｂｒ．ｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．４４（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．１２（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．２０−８．１７（ｍ（重複），４Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，５＋１５−ｏ−Ａｒ），７．８５（ｍ，４Ｈ，５＋１５−ｍ−Ａｒ），７．７６−７．６６（ｍ，２Ｈ，フルオレノ−Ａｒ），７．５１−７．３０（ｍ，６Ｈ，フルオレノ−Ａｒ），４．６９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ２），４．３０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ），４．１３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），−３．１５（ｂｒ．ｓ，２Ｈ，ＮＨ）；ＭＡＬＤ−ＭＳｍ／ｚ７３１．５（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％），５０８．３（［Ｍ−ＦＭＯＣ＋２］＋，５０％）；Ｃ４８Ｈ３６Ｎ５Ｏ３（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは、７３０．２８１８、見出されたのは７３０．２８０９である。
【００８５】
（１３，１４） シス／トランス−７，８，１７，１８−テトラヒドロキシ−５−（４−フルオレニルメチルアミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）バクテリオクロリン
ポルフィリン１２（３５ｍｇ，４８．０μモル）を、Ｓｕｔｔｏｎ等の方法（２０００ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｅｄ ｄｉｐｈｅｎｙｌｃｈｌｏｒｉｎｓ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｉｎｓ−ｔｈｅｉｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｔｕｍｏｕｒ ｃｅｌｌ ｉｍａｇｉｎｇ Ｊ． Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ａｎｄ Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｓ ４，６５５−６５８−参考としてここに組み入れる。）の軽微な修正によって、バクテリオクロリン立体異性体の所要の混合物に転換した（反応は、１２を溶解させるために１，４−ジオキサン（５ｍＬ）を用いて行った。）。粗製の反応混合物を、最初にＤＣＭ中の１％ＭｅＯＨを用いてクロリン副産物を除去するクロマトグラフ処理した。さらに、２％ＭｅＯＨ／ＤＣＭを用いる溶出によって、双方の立体異性のバクテリオクロリンテトロールを分離させた。より一層高いＲｆ−トランスバクテリオクロリン異性体１３をピンク−グリーンの結晶性固体として単離した、（６ｍｇ，１５％），Ｒｆ＝０．２５（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，１９：１），融点１４２〜１４５℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）３７４（１．０），５１２（０．２３），７０２（０．５２）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ）λｍａｘ７０８ｎｍ（λ励起＝５１２ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＣＤ３ＯＤ）δ９．２０（ｓ，２Ｈ，１０＋２０−Ｈ），８．７８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．３６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），７．９５（ｍ，２Ｈ，ｏ−Ａｒ），７．８５（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，フルオレノ−Ａｒ），７．７９（ｍ，２Ｈ ｏ’−Ａｒ），７．６５（ｍ，２Ｈ，ｍ’−Ａｒ），７．４７−７．３８（ｍ，６Ｈ，フルオレノ−Ａｒ），７．２４（ｍ，２Ｈ，ｍ−Ａｒ），６．２７−６．２４（ｍ，２Ｈ，７＋１７−Ｈ），５．８５（ｍ，２Ｈ，８＋１８−Ｈ），４．６５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ２），４．３９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ），４．０６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），−１．９４（ｂｒ ｓ（部分的に交換），２Ｈ，ＮＨ），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ８００．４（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）；Ｃ４８Ｈ４０Ｎ５Ｏ７（［Ｍ＋Ｈ］＋）］に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは、７９８．２９２７、見出されたのは７９８．２９２１である。
より一層低いＲｆのシス−バクテリオクロリン異性体１４をピンク−グリーンの結晶性固体として単離した、（８．５ｍｇ，２１％），Ｒｆ＝０．２（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，１９：１），融点１４８〜１５０℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）３７４（１．０），５１２（０．２４），７０３（０．５４）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ）λｍａｘ７０８ｎｍ（λ励起＝５１２ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＣＤ３ＯＤ）δ９．１２（ｓ，２Ｈ，１０＋２０−Ｈ），８．７６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．３４（ｄ（重複），２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．０２（ｍ，２Ｈ，ｏ−Ａｒ），７．８５（ｍ（不明瞭），２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，ｏ’−Ａｒ），７．８３（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，フルオレノ−Ａｒ），７．７６（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，ｍ’−Ａｒ），７．５０−７．３８（ｍ，６Ｈ，フルオレノ−Ａｒ），７．２４（ｍ，２Ｈ，ｍ−Ａｒ），６．２７−６．２３（ｍ，２Ｈ，７＋１７−Ｈ），５．８５−５．８２（ｍ，２Ｈ，８＋１８−Ｈ），４．６５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ２），４．３９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ），４．０５（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），−１．８８（ｂｒ．ｓ（部分的に交換），２Ｈ，ＮＨ），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ８００．４（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）；Ｃ４８Ｈ４０Ｎ５Ｏ７（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは、７９８．２９２７、見出されたのは７９８．２９２１である。
【００８６】
（１５） ５−（３，４，５−トリスメトキシフェニル）ジピロメタン
３，４，５−トリスメトキシベンズアルデヒド（５．０ｇ，２５．５ミリモル）を新しく蒸留したピロール（７５ｍＬ）中に溶解し、及びその溶液を、乾燥Ｎ２を用いる１０分間の通気によって脱気した。ＴＦＡ（０．０７５等量，０．１５ｍＬ，１．９１ミリモル）を添加し、及びその混合物を、最初のアルデヒドがＴＬＣ（約（ｃａ．）１０分）によって検出されないようになるまでＮ２下で撹拌した。反応混合物を減圧中、水吸引器圧（蒸発装置水浴温度７５℃）で、次いで高い減圧下で１６時間濃縮し、過剰のピロールを除去した。粗製の生成物を熱エチルアセテート／ｎヘキサンから再結晶し、及び白色の固体としての所要のジピロメタンを与えた，（５．４１ｇ，６８％）：νｍａｘ（ヌジョールマル）／ｃｍ−１３３７８（ｂｒ．ＮＨ），１５９４（Ｃ＝Ｃ），１２３３，１０４０；ＵＶ−ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ／（相対強度（ｒｅｌ．ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ））２２２（１．０），２８０（０．７５）ｎｍ；δＨ（２７０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）８．０７（２Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ），７．５３（２Ｈ，ｍ，１−Ｈ），６．６８（２Ｈ，ｓ，２’−Ｈ），６．３７（２Ｈ，ｍ，２−Ｈ），５．９３（２Ｈ，ｍ，３−Ｈ），５．３８（１Ｈ，ｓ，メタン），３．８０（３Ｈ，ｓ，４’−ＯＣＨ３），３．７３（６Ｈ，ｓ，３’＋５’−ＯＣＨ３）；δＣ（６８ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）１５２．７（ＣＨ，２’−Ｃ），１３７．３（ｑ，３’＋５’−Ｃ），１３６．１（ｑ，４’−Ｃ），１３１．８（ｑ，４−Ｃ），１１６．７（ＣＨ，１−Ｃ），１０７．９（ＣＨ，２−Ｃ），１０６．６（ＣＨ，３−Ｃ），１０４．９（ｑ，１’−Ｃ），６０．３（ＣＨ３），５５．５（ＣＨ３），４３．７（ＣＨ．，メタン）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｅ３１１．２（１００％，（Ｍ−１）＋）。
【００８７】
（１６） ５−（４−アセトミドフェニル）ジピロメタン
ジピロメタンを、最初のアルデヒドの同じモル量を用いる上記詳述の一般的な方法を用いて合成した。粗製の反応混合物をフラッシュシリカゲル（３５０ｍＬ）上でクロマトグラフ処理し、（５０ｍＬのフラッシュシリカゲルにエチルアセテートから乾燥負荷（ｄｒｙ ｌｏａｄ）し）、及び４０％のエチルアセテート／ＤＣＭで溶出し、及びオフホワイトの固体としての純粋な生成物を与えた，（４．３ｇ，５０％）：νｍａｘ（ヌジョールマル）／ｃｍ−１３４０９（ＮＨ，アミド），３２４８（ｂｒ．ＮＨ），１６５０（Ｃ＝Ｏ），１５９３（Ｃ＝Ｃ），１３２０，１００９；ＵＶ−ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ／（相対強度）２２４（１．０）ｎｍ；δＨ（２７０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）８．００（２Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ），７．４０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，ｏ−Ａｒ），７．３０（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ−アセトミド），７．１３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，ｍ−Ａｒ），６．６８（２Ｈ，ｍ，１−Ｈ），６．１６（２Ｈ，ｍ，２−Ｈ），５．９０（２Ｈ，ｍ，３−Ｈ），５．４２（１Ｈ，ｓ，メタン），２．１４（３Ｈ，ｓ，ＮＨＣＨ ３ ）；δＣ（６８ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）１６８．４（ｑ，ＣＯＣＨ３），１３８．２（ｑ，４’−Ｃ），１３６．５（ｑ，２’−Ｃ），１３２．４（ｑ，４−Ｃ），１２８．９（ＣＨ，２’−Ｃ），１２０．３（ＣＨ，３’−Ｃ），１１７．２（ＣＨ，１−Ｃ），１０８．４（ＣＨ，２−Ｃ），１０７．１（ＣＨ，３−Ｃ），４３．４（ＣＨ．，メタン），２４．５（ＣＨ３）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｅ２７９．４（１００％，（Ｍ）＋）。
【００８８】
（１７） ５−（４−メトキシフェニル）ジピロメタン
ジピロメタンを最初のアルデヒドの同じモル量を用いる上記詳述の一般的な方法を用いて合成した。粗製の反応混合物をフラッシュシリカゲル（３５０ｍＬ）上でクロマトグラフ処理し、（５０ｍＬのフラッシュシリカゲルにエチルアセテートから乾燥負荷し）、及び３０％のｎヘキサン／ＤＣＭで溶出し、及びオフホワイトの固体としての純粋な生成物を与えた，（４．３ｇ，５０％）：νｍａｘ（ヌジョールマル）／ｃｍ−１，３３８２（ｂｒ．ＮＨ），１５９８（Ｃ＝Ｃ），１３００，１０５０；ＵＶ−ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ／（相対強度）２２４（１．０）ｎｍ；δＨ（２７０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）７．８７（２Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ），７．１０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，ｍ−Ａｒ），６．８３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，ｏ−Ａｒ），６．６６（２Ｈ，ｍ，１−Ｈ），６．１４（２Ｈ，ｍ，２−Ｈ），５．８９（２Ｈ，ｍ，３−Ｈ），５．４０（１Ｈ，ｓ，メタン）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｅ２５２．４（１００％，（Ｍ）＋）。
【００８９】
例１
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリス（３，５−ジヒドロキシフェニル）ポルフィリン
【化８７】
新しく蒸留したＴＨＦ（２５ｍＬ）中の３（１００ｍｇ，０．１３７ミリモル）の撹拌した溶液に、１，１’−チオカルボニルジ−２−（１Ｈ）−ピリドン（６４ｍｇ，０．２７６ミリモル）を添加した。反応を、アルゴン下に４時間、室温で進ませた。過剰の溶媒を減圧中で蒸発させて粗製の紫色固体を得た。この固体を、最少量のクロロホルム／メタノール（９：１）中に溶解し、及びフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、溶出液：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，９：１）によって精製した。関連した画分を組み合わせ、乾燥（Ｎａ２Ｓ０４）させ、及び減圧中で蒸発させて紫色の固体（６７．５ｍｇ，６３．８％）としての上記化合物を得た；Ｒｆ＝０．２９（シリカ，ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，９：１）；融点＞３５０℃分解；１Ｈ ＮＭＲ［２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ，３：１］δ６．７７（３Ｈ，ｓ，１０，１５，２０−Ａｒ−４−Ｈ），７．１２（６Ｈ，ｓ，１０，１５，２０−Ａｒ−２，６−Ｈ），７．６４（２Ｈ，ｍ，Ｊ＊＝８Ｈｚ，５−Ａｒ−３，５−Ｈ），８．１９（２Ｈ，ｍ，Ｊ＊＝８Ｈｚ，５−Ａｒ−２，６−Ｈ），８．７６−９．０（８Ｈ，ｍ，β−Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ［６７．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ，３：１］δ１０１．９，１０７．１，１１４．７，１１７．６，１１９．９，１２０，１２０．１，１２３．９，１３０．９，１３４，１３５．２，１３６．１，１４１．２，１４２，１４３．６，１５５．８；ＵＶ−ｖｉｓ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ４２２，５１６，５５２，５９２，６４８ｎｍ；Ｃ４５Ｈ２９Ｎ５Ｏ６Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算されたＨＲＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚは７６８．１９１４、見出されたのは７６８．１９０８である。【００９０】
例２
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリス（４−ピリジル）ポルフィリン
【化８８】
新しく蒸留したジクロロメタン（２０ｍＬ）中の５（１００ｍｇ，０．１５８ミリモル）の撹拌した溶液に、１，１’−チオカルボニルジ−２（１Ｈ）−ピリドン（３２０ｍｇ，１．３８ミリモル）を添加した。反応を、アルゴン下に４時間、室温で進ませた。過剰の溶媒を減圧中で蒸発させて粗製の紫色固体を得た。この固体を、最少量のクロロホルム中に溶解し、及びフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、溶出液：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，４９：１）によって精製した。関連した画分を組み合わせ、乾燥（Ｎａ２Ｓ０４）させ、及び減圧中で蒸発させて紫色の固体（１０４ｍｇ，９７．５％）としての上記化合物を得た；Ｒｆ＝０．５７（シリカ，ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，４９：１）；融点＞３５０℃分解；１Ｈ ＮＭＲ［２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３］δ−２．９１（２Ｈ，ｂｒ ｓ，ＮＨ），７．６５（２Ｈ，ｍ，Ｊ＊＝８Ｈｚ，５−Ａｒ−３，５−Ｈ），８．１５−８．２１（８Ｈ，ｍ（重複），１０，１５，２０−Ｐｙ−２，６−Ｈ及び５−Ａｒ−２，６−Ｈ），８．６７（８Ｈ，ｂｒ ｓ，β−Ｈ），９．０６（６Ｈ，ｍ，Ｊ＊＝５Ｈｚ，１０，１５，２０−Ｐｙ−３，５−Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ［６７．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３］δ１１７．４，１１７．６，１１９．７，１２４．７，１２９．３，１３１．６，１３５．４，１３６．９，１４０．６，１４８．４，１４９．８；ＵＶ−ｖｉｓ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ４１７，５１４，５４８，５８７，６４３ｎｍ；Ｃ４ ２Ｈ２ ６Ｎ８Ｓ（Ｍ＋Ｈ）に対する計算されたＨＲＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚは６７５．２０７９、見出されたのは６７５．２０７８である。
【００９１】
例３
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリス（３−ピリジル）ポルフィリン（１６０）
【化８９】
新しく蒸留したジクロロメタン（４０ｍＬ）中の７（２００ｍｇ，０．３１６ミリモル）の撹拌した溶液に、１，１’−チオカルボニルジ−２（１Ｈ）−ピリドン（６４０ｍｇ，２．７６ミリモル）を添加した。反応を、アルゴン下に１７時間、室温で進ませた。過剰の溶媒を減圧中で蒸発させ粗製の紫色固体を得た。この固体を、最少量のクロロホルム中に溶解し、及びフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、溶出液：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，４９：１）によって精製した。関連した画分を組み合わせ、乾燥（Ｎａ２Ｓ０４）させ、及び減圧中で蒸発させて紫色の固体（１７１ｍｇ，８０．３％）としての上記化合物を得た；Ｒｆ＝０．５５（シリカ，ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，４９：１）；融点＞３５０℃分解；１Ｈ ＮＭＲ［２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３］δ−２．８３（２Ｈ，ｂｒ ｓ，ＮＨ），７．６５（２Ｈ，ｍ，Ｊ＊＝８Ｈｚ，５−Ａｒ−３，５−Ｈ），７．７８（３Ｈ，ｍ，１０，１５，２０−Ｐｙ−５−Ｈ），８．２０（２Ｈ，ｍ，Ｊ＊＝８Ｈｚ，５−Ａｒ−２，６−Ｈ），８．５４（３Ｈ，ｍ，１０，１５，２０−Ｐｙ−６−Ｈ），８．８３−８．８８（８Ｈ，ｍ，β−Ｈ），９．０７（３Ｈ，ｍ，１０，１５，２０−Ｐｙ−４−Ｈ），９．０７（３Ｈ，ｓ，１０，１５，２０−Ｐｙ−２−Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ［６７．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３］δ１１６．６，１２２．１，１２４．２，１３１．５，１３５．５，１３７．７，１４０．８，１４０．９，１４９．２，１５３．５；ＵＶ−ｖｉｓ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ４２１，５１３，５４７，５８７，６５７ｎｍ；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ６７４（Ｍ＋，１００％）。
【００９２】
例４
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリス（４−Ｎ−メチルピラジニウミル）ポルフィリントリヨウ化物
【化９０】
無水ＤＭＦ（１０ｍＬ，ＣａＨ２から蒸留した、０．１トル）中の例２（５０ｍｇ，０．０７４ミリモル）の溶液に、ヨードメタン（１ｍＬ，０．０１６モル）を添加した。反応物を、アルゴン下、３時間、室温で撹拌し、及び水／飽和硝酸カリウム水溶液／アセトニトリル（１：１：８）溶媒系中のＴＬＣ（順相シリカ）によって監視した。反応の完結の際に、過剰のＤＭＦを減圧（０．１トル）中、３０〜４０℃で蒸発させて光沢のある紫色の固体（７７ｍｇ，９５％）としての上記化合物を得た； Ｒｆ＝０．３２（シリカ，Ｈ２Ｏ／飽和ＫＮＯ３水溶液／ＭｅＣＮ，１：１：８）；融点＞３５０℃分解；１Ｈ ＮＭＲ［２７０ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ］δ−３．０３（２Ｈ，ｂｒ ｓ，ＮＨ），４．７４（９Ｈ，ｂｒ ｓ，Ｎ−ＣＨ３−ピリジン），７．９６（２Ｈ，ｍ，Ｊ＊＝８Ｈｚ，５−Ａｒ−３，５−Ｈ），８．３２（２Ｈ，ｍ，Ｊ＊＝８Ｈｚ，５−Ａｒ−２，６−Ｈ），９．０３（６Ｈ，ｍ，Ｊ＊＝６Ｈｚ，１０，１５，２０−Ｐｙ−２，６−Ｈ），９．１６（８Ｈ，ｍ，β−Ｈ），９．５０（６Ｈ，ｍ，Ｊ＊＝６Ｈｚ，１０，１５，２０−Ｐｙ−３，５−Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ［６７．５ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ］δ４７．９，１１４．７，１１５．３，１２１．１，１２４．８，１３０．６，１３２，１３４．７，１３５．４，１３９．７，１４４．１，１５６．３，１５６．４；ＵＶ−ｖｉｓ（Ｈ２Ｏ）λｍａｘ４２３，５２０，５８５ｎｍ；ＭＳ（ＦＡＢ）ｍ／ｚ７１９（Ｍ＋，１００％），７０４（Ｍ−ＣＨ３，２６％），６８９（Ｍ−２ＣＨ３，２０％），６７４（Ｍ−３ＣＨ３，５％）；Ｃ４５Ｈ３５Ｎ８Ｓ（Ｍ＋Ｈ）に対する計算されたＨＲＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚは７１９．２７０５、見出されたのは７１９．２６８６である。
【００９３】
例５
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリス（３−Ｎ−メチルピリジニウミル）ポルフィリントリヨウ化物
【化９１】
無水ＤＭＦ（５ｍＬ，ＣａＨから蒸留した、０．１トル）中の例３（５０ｍｇ，０．０７４ミリモル）の溶液に、ヨードメタン（１ｍＬ，０．０１６モル）を添加した。反応物を、アルゴン下、４時間、室温で撹拌し、及び水／飽和硝酸カリウム水溶液／アセトニトリル（１：１：８）溶媒系中のＴＬＣ（順相シリカ）によって監視した。反応の完結の際に、過剰のＤＭＦを減圧（０．１トル）中、３０〜４０℃で蒸発させて光沢のある紫色の固体（７２ｍｇ，８９％）としての上記化合物を得た； Ｒｆ＝０．４６（シリカ，Ｈ２Ｏ／飽和ＫＮＯ３水溶液／ＭｅＣＮ，１：１：８）；融点＞３５０℃分解；１Ｈ ＮＭＲ［２７０ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ］δ−３．０７（２Ｈ，ｂｒ ｓ，ＮＨ），４．６９（９Ｈ，ｂｒ ｓ，Ｎ−ＣＨ３−ピリジン），７．９７（２Ｈ，ｍ，Ｊ＊＝８Ｈｚ，５−Ａｒ−３，５−Ｈ），８．３１（２Ｈ，ｍ，Ｊ＊＝８Ｈｚ，５−Ａｒ−２，６−Ｈ），８．６４（３Ｈ，ｍ，１０，１５，２０−Ｐｙ−５−Ｈ），９．０３−９．２５（８Ｈ，ｍ，β−Ｈ），９．３５（３Ｈ，ｍ，１０，１５，２０−Ｐｙ−６−Ｈ），９．５７（３Ｈ，ｍ，１０，１５，２０−Ｐｙ−４−Ｈ），１０．０３（３Ｈ，ｓ，１０，１５，２０−Ｐｙ−２−Ｈ），；１３Ｃ ＮＭＲ［６７．５ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ］δ４８．３，１１２．３，１１２．９，１２０．７，１２４．８，１２６．３，１２６．４，１２６．６，１３０．６，１３２．１，１３２．３，１３２．４，１３２．６，１３２．８，１３３．１，１３３．４，１３４．７，１３５．４，１３９．８，１３９．９，１４０，１４５．５，１４５．６，１４７．４，１４７．５，１４７．８，１４７．９，１４８．５，１５５．９；ＵＶ−ｖｉｓ（Ｈ２Ｏ）λｍａｘ４１９，５１６，５５２，５８１，６３７ｎｍ；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ６８９（［Ｍ−２ＣＨ３］＋，１００％）。
【００９４】
例６
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリス（４−Ｎ−メチルピリジニウミル）ポルフィリントリ塩化物
【化９２】
無水メタノール（３０ｍＬ）中の例４（３０ｍｇ，０．０２７ミリモル）の溶液に、アンバーライト〔Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（Ｒ）、登録商標〕ＩＲＡ４００（１ｇ）を添加し、及びその混合物を１時間室温で撹拌した。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（Ｒ） ＩＲＡ４００樹脂を減圧下にろ過し、及びポルフィリンろ液を回収し、乾燥（Ｎａ２Ｓ０４）させ、及び減圧中で蒸発させて水溶性の紫色の固体（２２ｍｇ，９６．４％）としての上記化合物を得た。例４及び６のポルフィリンは、それらのそれぞれの水における溶解度によってだけ区別された。
【００９５】
例７
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリス（４−Ｎ−メチルピリジニウミル）ポルフィリントリ塩化物
【化９３】
無水メタノール（３０ｍＬ）中の例５（３０ｍｇ，０．０２７ミリモル）の溶液に、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（Ｒ）ＩＲＡ４００（１ｇ）を添加し、及びその混合物を１時間室温で撹拌した。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（Ｒ）ＩＲＡ４００樹脂を減圧下にろ過し、及びポルフィリンろ液を回収し、乾燥（Ｎａ２Ｓ０４）させ、及び減圧中で蒸発させて水溶性の紫色の固体（２１ｍｇ，９２．０％）としての上記化合物を得た。例５及び７のポルフィリンは、それらのそれぞれの水における溶解度によってだけ区別された。
【００９６】
例８
１７，１８−ジヒドロキシ−５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリン，
より一層高いＲｆのレジオイソマーのクロリン１０（１７．５ｍｇ，２３．２μモル）を以下の方法によって相当するイソチオシアナートに転換した。新しく蒸留したＤＣＭ（２０ｍＬ）中の１０（１等量，５０ｍｇ，０．０９９ミリモル）の撹拌した溶液に、１，１’−チオカルボニルジ−２（１Ｈ）−ピリドン（２等量，４６ｍｇ，０．１９８ミリモル）を添加した。反応物をアルゴン下に、２時間室温で撹拌させ、その後反応混合物をろ過し、及び濃縮し次いでクロマトグラフ処理し、ＤＣＭ中の１％ＭｅＯＨで溶出して表題の化合物を与えた。表題の化合物を茶色っぽい紫色の結晶性固体として単離した、（１７ｍｇ，９０％）， Ｒｆ＝０．３６（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，１９：１）；融点１５５〜１５８℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）４１０（１．０），５０５（０．０９），５３４（０．０６），５８６（０．０４），６３７（０．１８）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ）λｍａｘ６３９ｎｍ（λ励起＝４１２ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＣＤ３ＯＤ）δ１０．０（ｓ，１Ｈ，１０−Ｈ），９．４５（ｓ，１Ｈ，２０−Ｈ），９．２０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），９．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．８４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．２１（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，５−ｏ−Ａｒ），８．１５（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，５−ｏ−Ａｒ），８．０５（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１５−ｏ−Ａｒ），７．９３（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１５−ｏ−Ａｒ），７．６５（ｍ，２Ｈ，５−ｍ−Ａｒ），７．２４（ｍ，２Ｈ，１５−ｍ−Ａｒ），６．４３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１７−Ｈ），６．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１８−Ｈ），４．０８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），（ＮＨのものの交換及びＯＨのものは観察されない）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ５８３．７（［Ｍ＝Ｈ］＋，１００％）；Ｃ３４Ｈ２６Ｎ５Ｏ３Ｓ（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対しての計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは５８４．１７５７、見出されたのは５８４．１７５６である。
【００９７】
例９
シス−７，８，１７，１８−テトラヒドロキシ−５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）バクテリオクロリン
ＤＣＭにおける２５％ＭｅＯＨ（１．２５ｍＬ）中のシス−バクテリオクロリン１４（８．５ｍｇ，１０．７μモル）をピペリジン（５０等量，５３μＬ，０．５３ミリモル）を用いて処理し、及び光を遮って３時間の間室温でＮ２下に撹拌させた。反応混合物を減圧（０．１トル）中で濃縮しピペリジンのすべての痕跡量を除去した。次いで、粗製のアミンを上述の方法に従って所要のイソチオシアナートに転換した。このシス−バクテリオクロリン＿イソチオシアナートをピンク−グリーンの結晶性固体（５．０ｍｇ，７６％）として単離した，Ｒｆ＝０．４０（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，１９：１），融点１３２〜１３５℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）３７５（１．０），５１６（０．２２），７０２（０．４８）ｎｍ；蛍光λｍａｘ７０９ｎｍ（λ励起＝５１６ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＣＤ３ＯＤ）δ９．２０（ｓ，１Ｈ，メソ−Ｈ），９．１８（ｓ，１Ｈ，メソ−Ｈ），８．７７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．１４（ｍ，２Ｈ，ｏ−Ａｒ），８．０５（ｍ，２Ｈ，ｏ’−Ａｒ），７．４２−７．０８（ｍ，４Ｈ，５＋１５−ｍ−Ａｒ），６．２０（ｍ，２Ｈ，７＋１７−Ｈ），５．９８（ｍ，１Ｈ，８−Ｈ），５．９３（ｍ，１Ｈ，１８−Ｈ），４．０４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），−１．８０（ｂｒ ｓ，２Ｈ，部分的に交換した−ＮＨ），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ６１８．９（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）；Ｃ３４Ｈ２８Ｎ５Ｏ５Ｓ（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは６１８．１８１５、見出されたのは６１８．１８１０である。
【００９８】
例１０，１１，１２，１３
１７，１８−ジヒドロキシ−５−（４−アセトアミドフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリン／７，８−ジヒドロキシ−５−（４−アセトアミドフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリンレジオイソマー，及び
シス／トランス−７，８，１７，１８−テトラヒドロキシ−５−（４−アセトアミドフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）バクテリオクロリン立体異性体，
ポルフィリン８（１００ｍｇ，０．１８ミリモル）を、単一反応において、Ｓｕｔｔｏｎ等の方法に従ってクロリンジオール／バクテリオクロリンテトロールの混合物に転換した。３８時間後、反応を停止させた。次いで、粗製の反応混合物をクロマトグラフ処理し、ＤＣＭ中の１０％ＭｅＯＨでの溶出を用い、最初の、いくつかの未反応の出発物質、次いで、茶色っぽい紫色の結晶性固体（５ｍｇ，５％）としての例１０のより一層高いＲｆのクロリン異性体を与えた。例１１のより一層低いＲｆの異性体は、ＤＣＭ中の３．５％ＭｅＯＨを用いる更なる溶出によって得、及びまた茶色っぽい紫色の結晶性固体（７．０ｍｇ，７％）を与えた。ＤＣＭ中の５％ＭｅＯＨを用いる更なる溶出は、例１２及び１３のそれぞれの所要のトランス／シスバクテリオクロリンテトールを、それぞれ、ピンク／グリーンの固体（５．０ｍｇ，５％）及び（７．０ｍｇ，７％）として与えた。 例１０の高いＲｆのクロリンレジオイソマー〔これまでのデータに基づいて割り当てられた１７，１８−ジヒドロキシ−１５−（４−メトキシフェニル）−５−（４−アセトアミドフェニル）クロリン〕（２６）Ｒｆ＝０．４０（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，３７：３），融点１８６〜１８８℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）４１０（１．０），５０５．５（０．１２），５３５（０．０８），５８５．５（０．０５），６３７（０．１８）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ）λｍａｘ６３９ｎｍ（λ励起＝４１０ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．９７（ｓ，１Ｈ，１０−Ｈ），９．４２（ｓ，１Ｈ，２０−Ｈ），９．１９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），９．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．９８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．８９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．５２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．１４−８．１０（ｍ，３Ｈ，５−ｏ／ｍ−Ａｒ），７．９６−７．８２（ｍ，３Ｈ，５＋１５−ｏ／ｍ−Ａｒ），７．５０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．３４（ｍ，２Ｈ，１５−ｍ−Ａｒ），６．４８（ｍ，１Ｈ，１７−Ｈ），６．２０（ｍ，１Ｈ，１８−Ｈ），４．０８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），２．３８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），−１．８９，−２．２０（ｓ，２Ｈ，ＮＨ）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ５８２．６（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）；Ｃ３５Ｈ２８Ｎ５Ｏ４（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは５８２．２１４１、見出されたのは５８２．２１３７である。
例１１の低いＲｆのクロリンレジオイソマー〔７，８−ジヒドロキシ−５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリン〕Ｒｆ＝０．３５（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，３７：３），融点１８２〜１８５℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）４１０（１．０），５０５．５（０．１），５３５（０．０７），５８５（０．０４），６３６（０．１９）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ） λｍａｘ６３９ｎｍ（λ励起＝４１０ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．９６（ｓ，１Ｈ，１０−Ｈ），９．９２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．４２（ｓ，１Ｈ，２０−Ｈ），９．２２（ｍ，１Ｈ，β−Ｈ），９．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．００（ｍ，１Ｈ，β−Ｈ），８．９２（ｍ，１Ｈ，β−Ｈ），８．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．５３（ｍ，１Ｈ，β−Ｈ），８．１８−７．９１（ｍ，６Ｈ，５＋１５−ｏ／ｍ−Ａｒ），７．３３−７．２８（ｍ，２Ｈ，１５−ｍ−Ａｒ），６．３６（ｍ，１Ｈ，７−Ｈ），５．９６（ｍ，１Ｈ，８−Ｈ），４．１０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），２．３０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），−１．７４，−２．１７（ｓ，２Ｈ，ＮＨ）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ５８２．６（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）。Ｃ３５Ｈ２８Ｎ５Ｏ４（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは５８２．２１４１、見出されたのは５８２．２１３５である。
例１２の高いＲｆ−トランスバクテリオクロリン；Ｒｆ＝０．２９（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，３７：３：１），融点１５２〜１５５℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）３７３．５（１．０），５１４（０．２５），７０２（０．４９）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ）λｍａｘ７０８ｎｍ（λ励起＝５１４ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１０．２７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．１６（ｓ，２Ｈ，１０＋２０−Ｈ），８．９６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．２４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），７．９９−７．８９（ｍ，６Ｈ，５＋１５−ｏ／ｍ−Ａｒ），７．２５（ｍ，２Ｈ，１５−ｍ−Ａｒ），６．３０（ｍ，２Ｈ，７＋１７−Ｈ），６．１５（ｍ，２Ｈ，８＋１８−Ｈ），５．６３（ｍ，２Ｈ，ＯＨ），５．３２（ｍ，２Ｈ，ＯＨ），３．９９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），２．２０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），−１．８７（ｂｒ ｓ，２Ｈ，ＮＨ）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ６１６．３（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）。Ｃ３５Ｈ３０Ｎ５Ｏ６（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは６１６．２１９６、見出されたのは６１６．２１９２である。
低いＲｆシス−トランスバクテリオクロリン１３；Ｒｆ＝０．２４（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，１９：１），融点１４８〜１５１℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）３７３．５（１．０），５１４．５（０．２４），７０３（０．５０）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ）λｍａｘ７０８ｎｍ（λ励起＝５１４ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の２０％ＣＤ３ＯＤ）δ９．２０（ｓ，２Ｈ，１０＋２０−Ｈ），８．７８（ｍ，２Ｈ，β−Ｈ），８．３５（ｍ，２Ｈ，β−Ｈ），８．０５（ｍ，２Ｈ，５−ｏ−Ａｒ），７．８９−７．８６（ｍ，３Ｈ，５＋１５−ｏ／ｍ−Ａｒ），７．７５（ｍ，１Ｈ，１５−ｏ−Ａｒ），７．２０−７．１７（ｍ，２Ｈ，１５−ｍ−Ａｒ），６．２５（ｍ，２Ｈ，７＋１７−Ｈ），５．８６（ｍ，２Ｈ，８＋１８−Ｈ），４．０６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），２．３１（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），（ＮＨのものの交換）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ６１６．４（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）。Ｃ３５Ｈ３０Ｎ５Ｏ６（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは６１６．２１９６、見出されたのは６１６．２１９２である。
【００９９】
例１６
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリ（４−メチルホスホニウムフェニル）−ポルフィリン及び５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−（４−メチルホスホニウムフェニル）−ポルフィリン−一般的合成方法
ボック（Ｂｏｃ）Ｎ−保護された５−（４−アミノフェニル）−１０，２５，２０−トリ−（４−カルボメトキシフェニル）ポルフィリン及び５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−カルボメトキシフェニル）ポルフィリンを、それぞれ、Ｌｉｎｄｓｅｙ（リンジー）条件〔Ｌｉｎｄｓｅｙ，Ｊ．Ｓ．，Ｓｃｈｒｅｉｍａｎ（シュレイマン），Ｉ．Ｃ．，Ｈｓｕ（スウ），Ｈ．Ｃ．，Ｋｅａｒｎｅｙ（カーニー），Ｐ．Ｃ．，Ｍａｒｇｕｅｒｅｔｔａｚ（マルグレッタ），Ａ．Ｍ．（１９８７）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５２，８２７〕を用いる混合凝縮（ｍｉｘｅｄ ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）又はＢｏｙｌｅ（ボイル）等の〔Ｂｏｙｌｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｂｒｕｃｋｎｅｒ（ブルックナー），Ｃ．，Ｐｏｓａｋｏｎｙ（ポサコニー），Ｊ．，Ｊａｍｅｓ（ジェームス），Ｂ．Ｒ．，Ｄｏｌｐｈｉｎ（ドルフィン），Ｄ．（１９９９）Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ．７６，２８７−参考としてここに組み入れる。〕により記載されているように適切に置換された５−フェニルジピロメタンによる２＋２凝縮法によって合成した。次いで、これらのポルフィリン上の（４−カルボメトキシフェニル）基を、次の標準的な方法：ポルフィリン（０．２ミリモル）を乾燥ＴＨＦ（２５ｍＬ）中に０℃で溶解し、及びアルゴン下に１０分間撹拌する方法を用いて、（４−（１−ブロモメチル）フェニル）基に転換した。リチウムアルミニウム水素化物（０．７ミリモル）を添加し、及び撹拌を２４時間続けた。反応物をＴＬＣによって監視し、反応が完結したとき、エチルアセテート（２ｍＬ）を添加し、及び反応物をＨＣｌ水溶液（０．２Ｍ，２０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（３０ｍＬ）及び最後にかん水（２０ｍＬ）を用いて洗浄した。その有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、及び乾くまで蒸発させて、３つ又は１つの還元型のカルボメトキシ基をそれぞれ有する相当する（４−（１−ヒドロキシメチル）フェニル）置換ポルフィリンを得た。（４−（１−ヒドロキシメチル）フェニル）置換ポルフィリン（０．２ミリモル）を乾燥クロロホルム（４０ｍＬ）中に溶解し、及びアルゴン下で撹拌し、一方でトリフェニルホスフィン（１．０ミリモル）及び四臭化炭素（１．６ミリモル）を添加した。反応物を、暗所で２４時間撹拌し、及び次いでＴＬＣによって監視した。一旦すべてのヒドロキシメチル基をブロモメチル基に転換させて、反応混合物をジクロロメタン（４０ｍＬ）を用いて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム（２×２ｍＬ）次いでかん水（２×２ｍＬ）を用いて洗浄し、及び有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）させた。減圧中での溶媒の除去によって紫色の結晶性固体としての相当するブロモメチルポルフィリンを与えた。
ボックＮ−保護された５−（アミノフェニル）−１０，２５，２０−トリ−（４−ブロモメチルフェニル）ポルフィリン及び５−（アミノフェニル）−１５−（４−ブロモメチルフェニル）ポルフィリン（０．７５ミリモル）を、乾燥ジクロロメタン（５０ｍＬ）中に、アルゴン雰囲気下２５℃で溶解した。ジクロロメタン（１０ｍＬ）中に溶解したトリアリール又はトリアルキルホスフィン（７．５ミリモル）をシリンジによって注入し、及び反応の進行の後にはＴＬＣを行った。完結の際に、溶媒を減圧中で反応物から蒸発させ、及び粗製の生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；勾配溶出：ジクロロメタンからメタノールまで）によって精製し、光沢のある紫色の結晶性固体としての所要のボック−Ｎ−保護−５−（アミノフェニル）−メチルホスホニウム−メソ−アリールポルフィリンを得た。ボック保護基を、溶解度及びトリメチルシリルヨウ化物（５．０等量）の添加に応じて、クロロホルム又はアセトニトリル中のポルフィリンの溶解によって除去し、３０分後、メタノール（１０ｍＬ）を用いて反応をクエンチングさせた。蒸発による溶媒の除去、次いで、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；勾配：ジクロロメタンからメタノールまで）によって、５−（アミノフェニル）−メチルホスホニウム−メソ−アリールポルフィリンを与え、これは、標準的な方法〔Ｃｌａｒｋｅ（クラーク），Ｏ．Ｊ．及びＢｏｙｌｅ，Ｒ．Ｗ．（１９９９．Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２３１）〕を用いる１，１’−チオカルボニルジ−２（１Ｈ）−ピリドンでの処理によって所要のモノ−４−（イソシアナトフェニル）化合物に転換された。
【０１００】
例１７
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリ（（４−メチルホスホノ−ジ−エトキシ）フェニル）−ポルフィリン及び５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−（（４−メチルホスホノ−ジ−エトキシ）フェニル）−ポルフィリン−一般的な合成方法
ボックＮ−保護された５−（４−アミノフェニル）−１０，１５，２０−トリ−（４−ブロモメチルフェニル）ポルフィリン及び５−（アミノフェニル）−１５−（４−ブロモメチルフェニル）ポルフィリン（０．７５ミリモル）をトリエチル亜リン酸エステル（１５ミリモル）及び乾燥アセトニトリル（５０ｍＬ）の混合物中に溶解した。還流冷却器を装着し、及びアルゴン下に還流させた。反応物をＴＬＣにかけ、及び完結の際に、飽和炭酸水素ナトリウム（２×２０ｍＬ）、水（２×２０ｍＬ）及びかん水（２×２０ｍＬ）を用いて洗浄した。次いで、有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、及び溶媒を減圧中に蒸発させた。次いで、粗製の生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；勾配溶出：ジクロロメタンからエチルアセテートまで）によって精製し、紫色の結晶性固体としての表題の化合物を与えた。次いで、メチルホスホノ−ジ−エトキシ基を、水酸化ナトリウム水溶液中での１時間の超音波処理、次いで逆相中圧クロマトグラフィー〔Ｃ１８；勾配溶出０．１％ＴＦＡ水溶液からメタノールまで〕（Ｂｏｙｌｅ，Ｒ．Ｗ．及びｖａｎ Ｌｉｅｒ（ファンリエル），Ｊ．Ｅ．（１９９３）Ｓｙｎｌｅｔｔ３５１）によるメチルホスホノ−モノ−エトキシナトリウム基にか、又はブロモトリエチルシラン（メチルホスホノ−ジ−エトキシ基当たり２等量）を用いる２時間の処理、次いで、逆相クロマトグラフィーによる精製クロマトグラフィ（Ｃ１８；勾配溶出０．１％ＴＦＡ水溶液からメタノールまで）〔ＭｃＫｅｎｎａ（マッケナ），Ｃ．Ｅ．，Ｈｉｇａ（ヒガ），Ｍ．Ｔ．，Ｃｈｅｕｎｇ（チューン），Ｎ．Ｈ．，ＭｃＫｅｎｎａ，Ｍ−Ｃ．（１９７７）２，１５５〕による十分に脱保護されたメチルホスホン酸にかのいずれかに脱保護した。ボックの脱保護（上記参照）に次いで、マスクされてない４−（アミノフェニル）基のそのイソチオシアナト類似体への転換を、標準的な方法（Ｃｌａｒｋｅ，Ｏ．Ｊ．及びＢｏｙｌｅ，Ｒ．Ｗ．（１９９９Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２３１）を用いて行った。
【０１０１】
例１８
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリ（（４−メチルホスホナト−ジ−エトキシ）フェニル）−ポルフィリン及び５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−（（４−メチルホスホナト−ジ−エトキシ）フェニル）−ポルフィリン−一般的な合成方法
ボックＮ−保護された５−（アミノフェニル）−１０，１５，２０−トリ−（４−ヒドロキシメチルフェニル）ポルフィリン及び５−（アミノフェニル）−１５−（４−ヒドロキシメチルフェニル）ポルフィリン（０．７５ミリモル）を、アルゴン雰囲気下に、ジクロロメタン及びピリジン（４：１）の混合物中に溶解した。ジエチルクロロホスフェート（ヒドロキシメチル基当たり２等量）を注入し、及び混合物を１６時間撹拌した。反応混合物からの溶媒の蒸発に次いで、クロマトグラフィーによる精製によって相当するトリ又はモノ（（４−メチルホスホナト−ジ−エトキシ）フェニル）ポルフィリンを与えた。水酸化ナトリウム（１Ｍ）を用いる処理によって、トリ又はモノ（（４−メチルホスホナトエトキシ）フェニル）ポルフィリンのナトリウム塩を与えた（Ｂｏｙｌｅ，Ｒ．Ｗ．及びｖａｎ Ｌｉｅｒ，Ｊ．Ｅ．（１９９５）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ１０７９）。ボック脱保護及びイソチオシアナート基の生成は上述の様にして行った。
【０１０２】
例１９
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリ（（４−メチルピリジニウミル）フェニル）−ポルフィリン及び５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−（（４−メチルピリジニウミル）フェニル）−ポルフィリン−一般的な合成方法
ボックＮ−保護５−（アミノフェニル）−１０，２５，２０−トリ−（４−ブロモメチルフェニル）ポルフィリン及び５−（アミノフェニル）−１５−（４−ブロモメチルフェニル）ポルフィリン（０．７５ミリモル）を、ジクロロメタン（５０ｍＬ）及びピリジン（１５ミリモル）中に溶解し、又は置換されたピリジン（１５ミリモル）を要求に応じ添加した。還流冷却器を装着し、及び反応物をアルゴン下に還流させた。反応物をＴＬＣにかけ、完結の際に、乾くまで減圧中で蒸発させた。残留物を逆相媒体圧クロマトグラフィー〔Ｃ１８；勾配溶出０．１％ＴＦＡ水溶液からメタノールまで〕によって精製し、Ｎ−ボック保護４−アミノフェニル化合物を得た。アミノフェニル基（複数）の脱保護及びイソチオシアナト類似体（複数）への転換を標準的なプロトコル（上記参照）を用いて行った。
【０１０３】
例２０
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−アリール−１０，２０−（１，２−ジヒドロキシエチル）−ポルフィリン−一般的な合成方法
エフモック（Ｆｍｏｃ）保護された５−（４−アミノフェニル）−１５−アリールポルフィリン（０．８ミリモル）を乾燥クロロホルム（３００ｍＬ）中にアルゴンの雰囲気下で溶解した。乾燥クロロホルム（２０ｍＬ）中に、新しく再結晶したＮ−ブロモスクシンイミド（１．８ミリモル）をシリンジによって注入し、及び混合物を３０分間撹拌した。次いで、溶媒を減圧中で蒸発させ、及び粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；勾配溶出：ヘキサンからエチルアセテートまで）によって精製し、紫色の結晶性固体としての所要の５，１５−ジブロモ−１０，２０−ジアリールポルフィリンを与えた。次いで、生成物を、酢酸亜鉛二水和物（８０ミリモル）のクロロホルム／メタノール（９：１）溶液中での還流によってメタレートした。メタレーションに次いで、可視分光法を行い、完結の際に、中性のアルミナの短いカラムに通し、配位してない亜鉛を除去した。亜鉛５，１５−ジブロモ−１０，２０−ジアリールポルフィリン（０，６ミリモル）を乾燥ＴＨＦ中に溶解し、それにテトラキス（トリフェニルホスフィン）−パラジウム（０）（０．６ミリモル）及びビニルトリブチルスズ（１．４ミリモル）を添加した。混合物を窒素下に４８時間還流させ、その後、溶媒を減圧中で蒸発させ、及び残留物をフラッシュカラム（シリカ；勾配溶出：ジクロロメタンからエチルアセテートまで）によってクロマトグラフ処理し、紫色の結晶性固体としてのジンク５−（エフモックアミノフェニル）−１５−アリール−１０，２０−ジエテニルポルフィリンを与えた。ジンク５−（エフモックアミノフェニル）−１５−アリール−１０，２０−ジエテニルポルフィリンを、ジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸（１％ｖ／ｖ）の溶液における溶解によって脱メタレーションし、水を用いる抽出及び減圧中での有機層からの溶媒の蒸発後に、５−（エフモックアミノフェニル）−１５−アリール−１０，２０−ジエテニルポルフィリンを与えた。最後に、１０及び２０のエテニル基を、記載したように（Ｓｕｔｔｏｎ Ｊ， Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ（フェルナンデス）Ｎ，Ｂｏｙｌｅ ＲＷ（２０００）Ｊ．Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ ａｎｄ Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｓ ４，６５５）、四酸化オスミウムによってヒドロキシル化するが、エテニル基と四酸化オスミウムとの間の反応が迅速であるために、反応時間及び化学量論の制御によってこれらの基の選択的なヒドロキシル化が可能であった。条件の代表的な組合せにおいては、５−（エフモックアミノフェニル−１５−アリール−１０，２０−ジエテニルポルフィリンは、１０％ピリジン／クロロホルム中の四酸化オスミウム（５等量）を用いて２４〜４８時間処理する場合に、望ましい５−（エフモックアミノフェニル）−１５−アリール−１０，２０−ビス（１，２−ジヒドロキシエチル）ポルフィリンを与え、一方で、より一層長い反応時間（７２時間）及び四酸化オスミウムのより一層高いモル比（７．５又は１０等量）を同じ条件下で用いる場合は、５−（エフモックアミノフェニル）−１５−アリール−１０，２０−ビス（１，２−ジヒドロキシエチル）７，８−ジヒドロキシクロリン及び５−（エフモックアミノフェニル）−１５−アリール−１０，２０−ビス（１，２−ジヒドロキシエチル）７，８，１７，１８−テトラヒドロキシバクテリオクロリンのそれぞれが得られる。すべての上記生成物は、アミノ基のピペリジン媒介脱保護（上記参照）及び標準的な方法（Ｃｌａｒｋｅ，Ｏ．Ｊ．及びＢｏｙｌｅ，Ｒ．Ｗ．（１９９９，Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２３１））を用いる１，１’−チオカルボニルジ−２（１Ｈ）−ピリドンでの処理の際に、相当するイソチオシアナートにきれいに転換される。
【０１０４】
例２１
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−フェニル−１０，２０−（ジアリール）−ポルフィリン−ＰＤ０媒介Ｓｕｚｕｋｉカップリングによる５，１５−ジフェニルポルフィリンからの合成
ボックＮ−保護５−（アミノフェニル）−１５−フェニルポルフィリンを上述したように１０及び２０メソ位でブロム化した。メソ１０，２０−ジブロム化した生成物（０．７５ミリモル）を乾燥ＴＨＦ（５０ｍＬ）又はトルエン（５０ｍＬ）中に溶解し、カップリング反応で用いるボロン酸に応じて、テトラキス−（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．７５ミリモル）及び無水リン酸カリウム（０．７５ミリモル）を添加し、次いで、還流冷却器をフラスコに装着し、及び全体の装置をアルゴン雰囲気下に配置した。次いで、所要のアリール又は複素環式ボロン酸を適切な溶媒（１０ｍＬ）中の溶液として注入によって添加した。反応物を還流させ、ＴＬＣによって完結させた。完結の際に、粗製の反応混合物をジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈し、及び飽和炭酸水素ナトリウム（２×５０ｍＬ）、水（２×５０ｍＬ）及びかん水（２×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、及び減圧中の蒸発によって濃縮した。最後に、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；勾配溶出：ジクロロメタンからメタノールまで）によって精製し、紫色の結晶性固体としてのボックＮ−保護５−（アミノフェニル）−１５−フェニル−１０，２０−（ジアリール）−ポルフィリンを与えた。ボック保護基を、クロロホルム又はアセトニトリル中のポルフィリンの溶解、溶解度に応じ、更にトリメチルシリルヨウ化物（１．２等量）の添加によって除去し、３０分後、メタノール（１０ｍＬ）を用いて反応をクエンチングさせた。蒸発による溶媒の除去、次いで、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；勾配：ジクロロメタンからメタノールまで）によって精製し、５−（アミノフェニル）−１５−フェニル−１０，２０−（ジアリール）−ポルフィリンを与え、これを標準的な方法〔Ｃｌａｒｋｅ，Ｏ．Ｊ．及びＢｏｙｌｅ，Ｒ．Ｗ．（１９９９．Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２３１）〕を用いる１，１’−チオカルボニルジ−２（１Ｈ）−ピリドンでの処理によって表題の化合物に転換した。
【０１０５】
例２２
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリ（４−グリコシルフェニル）−ポルフィリン及び５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−（４−グリコシルフェニル）−ポルフィリン−一般的な合成方法
４−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ）ベンズアルデヒドを、Ｌｉｎｄｓｅｙ（リンジー）条件〔Ｓｏｌ（ソル），Ｖ．，Ｂｌａｉｓ（ブレイズ），Ｊ．Ｃ．，Ｃａｒｒｅ（カレ），Ｖ．，Ｇｒａｎｅｔ（グラネ），Ｒ．，Ｇｕｉｌｌｏｔｏｎ（ギロトン），Ｍ．，Ｓｐｉｒｏ（シュピーロ），Ｍ．，Ｋｒａｕｓｚ（クラウス），Ｐ．（１９９９）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４，４４３１〕を用いて、４−ニトロベンズアルデヒド及びピロールで凝縮させ、及び粗製の反応混合物をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、５−（４−ニトロフェニル）−１０，１５，２０−トリス［４−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−β−グルコピラノシルオキシ）フェニル］ポルフィリンを与えた。あるいはまた、４−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシロキシ）ベンズアルデヒドを用い、Ｂｏｙｌｅの方法（Ｂｏｙｌｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｂｒｕｃｋｎｅｒ，Ｃ．，Ｐｏｓａｋｏｎｙ，Ｊ．，Ｊａｍｅｓ，Ｂ．Ｒ．，Ｄｏｌｐｈｉｎ，Ｄ．（１９９９）Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ．７６，２８７）を用いることで、５−（４−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシロキシ）フェニル）ジピロメタンを合成し、次いで凝縮して、５−（４−ニトロフェニル）−１５，−［４−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−β−グルコピラノシルオキシ）フェニル］ポルフィリンを与えた。これらのポルフィリンのニトロ基の還元をＴＨＦ中への溶解及び炭素上での１０％パラジウムの添加によって行った。混合物のＨ２下での５時間の撹拌に次いでＣｅｌｉｔｅ（セライト）によるろ過を行い、及びフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して相当するアミノポルフィリンを与え、これを、アルゴン下、無水１，４−ジオキサンにおいて炭酸水素ナトリウム（６等量）の存在下にエフモッククロライド（２等量）と反応させることによってＮ保護した。反応をＴＬＣによって監視し、及び完結の際、ジクロロメタンで希釈し、及び水で洗浄し次いで有機層の乾燥（ＭｇＳＯ４）の前にかん水で洗浄した。フラッシュカラムクロマトグラフィーによる精製は、エフモックＮ−保護５−（４−アミノフェニル）−１０，１５，２０−トリス［４−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−β−グルコピラノシルオキシ）フェニル］ポルフィリン又は５−（４−アミノフェニル）−１５，−［４−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−β−グルコピラノシルオキシ）フェニル］ポルフィリンを与えた。Ｎ及びＯ保護基を、ジクロロメタン／モルフォリン（１：１）中でのポルフィリンの溶解及び１時間の撹拌によって除去した。減圧中での蒸発による溶媒の除去に次いで残留物をジクロロメタン及びメタノール（４：１）中で再溶解した。乾燥メタノール中のナトリウムメタノレート（ｓｏｄｉｕｍ ｍｅｔｈａｎｏｌａｔｅ）（ＯＡｃ基当たり１．５等量）を添加し、及びその混合物を１時間撹拌した。十分に脱保護したポルフィリンを、ヘキサンを用いた沈殿によって回収した。最後に、５−（４−アミノフェニル）ポルフィリンを乾燥メタノール中で溶解し、及び１，１’−チオカルボニルジ−２（１Ｈ）−ピリドン（２等量）を添加した。反応物を、アルゴン下、２時間撹拌し、及びＴＬＣによって監視し、完結の際、溶媒を減圧中で蒸発させ、及び粗生成物を調製用の媒体圧逆相クロマトグラフィー（Ｃ１８；勾配溶出：０．１％ＴＦＡ水溶液からメタノールまで）によって精製した。
【０１０６】
例２３：
対称的なポルフィリン／クロリンジオール／バクテリオクロリンテトロールシリーズ
５，１５−（３，４，５−トリスメトキシフェニル）ポルフィリン（一般的方法）
３Ｌの丸底フラスコに、５−（３，４，５−トリスメトキシフェニル）ジピロメタン（１．８６ｇ，６ミリモル）、次いで、Ｎ２下にＤＣＭ（１Ｌ）を添加した。この撹拌した溶液に、オルトギ酸トリメチル（４８ｍＬ，ミリモル）を添加した。次いで、ＤＣＭ（５００ｍＬ）中のトリクロロ酢酸（２３．０ｇ，ミリモル）の溶液を含有する圧均等滴下漏斗をそのフラスコに装着し、及びその溶液をその反応混合物に１０分間にかけて滴下して加えた。反応容器をアルミニウムホイル中に被覆して光を遮り、及びＮ２下に３．５時間撹拌した。次いで、ピリジンを反応混合物中に、迅速に撹拌しながら添加し、及び反応物を更に１６時間、光を遮りながら、Ｎ２の下に室温で撹拌させた。アルミニウムホイルを除去し、及びその溶液中で空気を２０分間泡立てた。この後、その反応物を更に３時間室温でアルミニウムホイルを除去した状態で栓なしで撹拌させた。次いで、反応混合物を減圧中で濃縮して、蒸発、次いで高い減圧によってＤＣＭ及び残留するピリジンを除去した。次いで、粗製の反応混合物をフラッシュシリカゲル（２５０ｍＬ）上でクロマトグラフ処理し（ＤＣＭ及び少しのメタノールから５０ｍＬのフラッシュシリカゲルに乾燥負荷して完全な溶解性を確保した。）、クロロホルムを用いて溶出した。表題の化合物を紫色の結晶性固体として得た（３４７ｍｇ，１８％）；λｍａｘ／（相対強度）４１０（１．０），５０２（０．０４），５３８（０．０２），５７８（０．０１５），６３０（０．０１）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ＝６３４ｎｍ（λ励起＝４０８ｎｍ）；（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１０．３２（２Ｈ，ｓ，１０−Ｈ，２０−Ｈ），９．４０（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．１８（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），７．５２（４Ｈ，ｓ，ｏ−Ａｒ），４．２０（６Ｈ，ｓ，ＣＨ３），４．００（１２Ｈ，ｓ，ＣＨ３），−３．１０（２Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝６４３．４（１００％，Ｍ＋）。
【０１０７】
７，８−ジヒドロキシ５，１５−（３，４，５−トリスメトキシフェニル）クロリン（一般的方法）
ＨＰＬＣ等級のクロロホルム（５．０ｍＬ）中の５，１５−（３，４，５−トリスメトキシフェニル）ポルフィリン（５０ｍｇ，７７．８μモル）の撹拌した溶液に、無水ピリジン（０．５ｍＬ）中の四酸化オスミウム（２．５等量，０．１９５ミリモル，４９ｍｇ）の溶液を添加した。反応容器にＮ２を流し、及びわずかに油を塗ったガラス栓を用いて密封し、次いでアルミニウムホイル中に被覆し光を遮り、及び７２時間室温で撹拌させた。この期間の後、反応容器のガラス栓をプラスチック栓と置き換え、及び硫化水素ガスの連続した流れによって反応混合物中を５分間泡立てた（ガス出口ニードルを取り付け、及び過剰な硫化水素ガスを、鉱油及び漂白溶液でそれぞれ満たされた一連のＤｒｅｓｈｅｌ（ドレッシェル）ボトル中に逃がした）。この時間の後、反応混合物をＣｅｌｉｔｅ（Ｒ）（登録商標）によってろ過し、及び次いで減圧中で濃縮した。いくらかの過剰なピリジンを高減圧下に除去した。次いで、粗製の反応混合物をフラッシュシリカゲル（１００ｍＬ）上でクロマトグラフ処理し（ＤＣＭ及び少しのメタノールから２０ｍＬのフラッシュシリカゲルに乾燥負荷して完全な溶解性を確保した。）、ＤＣＭ中の１％メタノールを用いて溶出した。いくつかの出発物質を回収し（１５％）、及び表題の化合物をブラウニー−パープルの結晶性固体として得た、（２６ｍｇ，５０％）；融点１７０℃（分解）；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ（相対強度）４１０（１．０），５０４（０．０９），５３４（０．０６），５８２（０．０４），６３６（０．１８）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ６３９ｎｍ（λ励起４１０ｎｍ）；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）９．９８（１Ｈ，ｓ，１０−Ｈ），９．４２（１Ｈ，ｓ，２０−Ｈ），９．２０（１Ｈ，ｍ，β−Ｈ），９．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．９９（２Ｈ，ｓ，β−Ｈ），８．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．６６（１Ｈ，ｍ，β−Ｈ），７．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１５−ｏ−Ａｒ），７．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１５−ｏ−Ａｒ），７．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，５−ｏ−Ａｒ），７．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１５−Ｏ−Ａｒ），６．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，７−Ｈ），６．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，８−Ｈ），４．１７（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），４．１５（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），４．０４（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），４．００（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），３．９８（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），３．９１（３Ｈ，ＣＨ３），−１．８０（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ），−２．１９（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝６７７．３（１００％，Ｍ＋）；Ｃ３８Ｈ３６Ｎ４Ｏ８についての計算されたＨＲＭＳは：６７６．２５３３、見出されたのは：６７６．２５８７である。
【０１０８】
７，８，１７，１８−テトラヒドロキシ−５，１５−（３，４，５−トリスメトキシフェニル）バクテリオクロリン（一般的方法）
ＨＰＬＣ等級のクロロホルム（５．０ｍＬ）中の５，１５−（３，４，５−トリスメトキシフェニル）ポルフィリン（５０ｍｇ，７７．８μモル）の撹拌した溶液に、無水ピリジン（０．５ｍＬ）中の四酸化オスミウム（５．０等量，０．３９ミリモル，４９ｍｇ）の溶液を添加した。反応容器にＮ２を流し、及びしっかりと油を塗ったガラス栓を用いて密封し、次いでアルミニウムホイル中に被覆し光を遮り、及び７２時間室温で撹拌させた。この期間の後、反応容器のガラス栓をプラスチック栓と置き換え、及び硫化水素ガスの連続した流れによって反応混合物中を５分間泡立てた（ガス出口ニードルを取り付け、及び過剰な硫化水素ガスを、鉱油及び漂白溶液でそれぞれ満たされた一連のドレッシェルボトル中に逃がした）。この時間の後、反応混合物をＣｅｌｉｔｅ（Ｒ）によってろ過し、及び次いで減圧中で濃縮した。いくらかの過剰なピリジンを高減圧下に除去した。次いで、粗製の反応混合物をフラッシュシリカゲル（１００ｍＬ）上でクロマトグラフ処理し（ＤＣＭ及び少しのメタノールから２０ｍＬのフラッシュシリカゲルに乾燥負荷して完全な溶解性を確保した。）、最初にＤＣＭ中の１％メタノールを用いる溶出でクロリン副産物を溶出し、次いでＤＣＭ中の２．５％メタノールで、主要なバクテリオクロリン異性体〔トランス型と思われるＢｒｕｃｋｎｅｒ（ブレックナー）等の（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３６，９４２５〕を溶出させた。表題の化合物を緑がかった−ピンク（ｇｒｅｅｎｙ−ｐｉｎｋ）の結晶性固体として得た、（２０ｍｇ，３６％）；融点１３５℃（分解）；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ（相対強度）３７４（１．０），５１２（０．２３），７０２（０．５２）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ７０８ｎｍ（λ励起５１２ｎｍ）；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）９．２３（２Ｈ，ｓ，１０−Ｈ，２０−Ｈ），８．７９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，β−Ｈ），８．４４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，β−Ｈ），７．３７（２Ｈ，ｓ，５＋１５−ｏ−Ａｒ），７．１３（２Ｈ，ｓ，５＋１５−ｏ−Ａｒ），６．３１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，７−Ｈ，１７−Ｈ），６．０１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，８−Ｈ，１８−Ｈ），４．１２（６Ｈ，ｓ，ＣＨ３），３．９２（６Ｈ，ｓ，ＣＨ３），３．８９（６Ｈ，ｓ，ＣＨ３），−１．９７（２Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝７１２．４（１００％，（Ｍ＋１）＋）；Ｃ３８Ｈ３６Ｎ４Ｏ１０についての計算されたＨＲＭＳは：７１０．２５９０、見出されたのは：７１０．２６０７である。
【０１０９】
例２４
生物学的接合のための非対称ポルフィリン／クロリンジオール／バクテリオクロリンテトロール蛍光色素の組合せ
５−（４−アセトミドフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン
所要の非対称ジフェニルポルフィリンを、先立って概要を述べた一般的な方法を用いるが、わずかな改変のみを行って合成した。この例では、ジピロメタンの混合物を用いた。それぞれのジピロメタンの異なる反応性により、混合されたポルフィリンの最適化に必要な量は異なっていた。同じ規模の反応のために、５−（４−メトキシフェニル）ジピロメタン（５０５ｍｇ，２ミリモル）及び５−（４−アセトミドフェニル）ジピロメタン（８３８ｍｇ，３ミリモル）を用いた。ポルフィリン混合物をシリカゲル（４００ｍＬ）上でクロマトグラフ処理し（ＤＣＭ及び少しのメタノールから２０ｍＬのフラッシュシリカゲルに乾燥負荷して完全な溶解性を確保した。）、最初にＤＣＭ（１ガラスピペットいっぱいのトリエチルアミンを溶出液の５００ｍＬに添加し溶出を助けた。）を用いて溶出し、５，１５−（メトキシフェニル）ポルフィリンの副産物を除去した。この成分の分離後、溶出をクロロホルムで続け、５−（４−アセトミドフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリンを収集した。望ましいポルフィリンを紫色の結晶として得た（１５０ｍｇ，１２％）；λｍａｘ／（相対強度）４１０（１．０），５０２（０．０４），５３８（０．０２），５７８（０．０１５），６３０（０．０１）ｎｍ；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１０．３５（２Ｈ，ｓ，１０−Ｈ，２０−Ｈ），９．４３（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．１４（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．６５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，５−ｍ−Ａｒ），８．２２−８．１２（４Ｈ，ｄ（重複），Ｊ＝８．１Ｈｚ，５−ｏ−Ａｒ＋１５−ｏ−Ａｒ），７．５６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１５−ｍ−Ａｒ），４．１４（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），−３．００（２Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝５５０．３（１００％，Ｍ＋）。
【０１１０】
５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン
５−（４−アセトミドフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン（１００ｍｇ，０．１８２ミリモル）を１８％塩酸（２００ｍＬ）で処理し、及び空気冷却機を取り付けた。緑色の溶液を３時間８５℃に温めた。冷却に先立って、反応混合物を減圧中で濃縮し（水流吸引機；蒸発装置水浴７５℃）、過剰の塩酸を除去し、次いで、ＤＣＭ中のトリエチルアミン（５０ｍＬ）の溶液を用いて慎重に処理した。有機抽出物を、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）に先立って、水（１００ｍＬ）次いで飽和かん水（１００ｍＬ）で洗浄し、ブフナー漏斗によってろ過し、及び最後に減圧中で濃縮した。所要のポルフィリンをシリカゲル（１００ｍＬ）上のクロマトグラフィー（１０ｍＬのＤＣＭ中での液体負荷）、ＤＣＭ（１ガラスピペットいっぱいのトリエチルアミンを５００ｍＬの溶出液に添加し溶出を助けた。）を用いる溶出によって得た。望ましいポルフィリンを、紫色の結晶として得た；（１５０ｍｇ，１２％）；λｍａｘ／（相対強度）４１０（１．０），５０３（０．０４５），５３８（０．０２），５７８（０．０１５），６３０（０．００５）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ＝６３４ｎｍ（λ励起＝４１０ｎｍ）；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１０．３０（２Ｈ，ｓ，１０−Ｈ，２０−Ｈ），９．３９（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，β−Ｈ），９．１７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，β−Ｈ）９．１０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，β−Ｈ），８．１９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１５−ｏ−Ａｒ），８．０７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，５−ｏ−Ａｒ），７．３５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１５−ｍ−Ａｒ），７．１４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，５−ｍ−Ａｒ），４．１３（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），４．０８（２Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ），−３．０６（２Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝５０８．３（１００％，（Ｍ＋１）＋）。
【０１１１】
５−（４−フルオレノメチルアミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン
無水１，４−ジオキサン（２．５ｍＬ）中の５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン（２８ｍｇ，５５μモル）の撹拌した溶液に、固体の炭酸水素ナトリウム（６等量，２８ｍｇ，０．３３ミリモル）を添加した。次いで、この混合物に、１，４−ジオキサン（０．５ｍＬ）中の９−フルオレノメチルクロロフォルメート（２等量，０．１１ミリモル，２８．５ｍｇ）の溶液をＮ２下に添加した。反応フラスコをアルミニウムホイルで被覆し光を遮り、及び室温で３時間撹拌した。このとき、反応が完結した（ＴＬＣによって監視したように）。１，４−ジオキサンを減圧中で除去し、及び残留物を水（２５ｍＬ）とＤＣＭ（２×２５ｍＬ）との間に分配させた。組み合わせた有機抽出物を飽和かん水（２５ｍＬ）で洗浄し、次いで乾燥させ（無水Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、及び減圧中で濃縮した。所要のポルフィリンをシリカゲル（１００ｍＬ）上のクロマトグラフィー（溶解のためにＤＣＭ及び少しのメタノールから１０ｍＬのフラッシュシリカゲルに乾燥負荷した。）、ＤＣＭを用いる溶出によって得た。望ましいポルフィリンを、紫色の結晶として得た；（３８ｍｇ，９５％）；λｍａｘ／（相対強度）４１０（１．０），５０５（０．０４２），５４１（０．０２），５７８（０．０１５），６３３（０．０１）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ＝６３５ｎｍ（λ励起＝４１０ｎｍ）；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１０．３５（２Ｈ，ｓ，１０−Ｈ，２０−Ｈ），９．６９（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ），９．４４（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．１２（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．２０−８．１７（４Ｈ，２×ｄ（重複），Ｊ＝８．１Ｈｚ，５＋１５−ｏ−Ａｒ），７．８５（４Ｈ，ｍ，５＋１５−ｍ−Ａｒ），７．７６−７．６６（２Ｈ，ｍ，フルオレノ−Ａｒ），７．５１−７．３０（６Ｈ，ｍ，フルオレノ−Ａｒ），４．６９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ２），４．３０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ），４．１３（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），−３．１５（２Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝７３１．５（１００％，（Ｍ＋１）＋），５０８．３（５２％，（Ｍ−ＦＭＯＣ＋１）＋）。
【０１１２】
１７，１８−ジヒドロキシ−５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリン及び７，８−ジヒドロキシ５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリンレジオイソマー
５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン（２８ｍｇ，５５．２μモル）を、先立って述べた一般的なクロリン形成方法を用いて、クロリンジオールのレジオイソマーの混合物に転換した。次いで、粗製の反応混合物をフラッシュシリカゲル（２００ｍＬ）上でクロマトグラフ処理し（ＤＣＭ及び少しのメタノールから２０ｍＬのフラッシュシリカゲルに乾燥負荷し完全な溶解性を確保した。）、ＤＣＭ中の１％メタノールで溶出し、最初にいくつかの未反応出発物質、次いでブラウニー−パープルの結晶性固体としてのより一層高いＲｆのクロリン異性体を溶出した。より一層低いＲｆの異性体を、更にＤＣＭ中の２．５％のメタノールでの溶出によって得、及びまたブラウニー−パープルの結晶性固体を与えた。
高いＲ ｆ のクロリンレジオイソマー〔２，３−ジヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−１５−（４−アミノフェニル）クロリン，ｎＯｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ（ノエメジャーメンツ）及びＪＰＰ ｐａｐｅｒ（ペーパー）から〕：（８．５ｍｇ，３０％）；融点１６５℃（分解）；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ（相対強度）４０１（０．９９），４１４（１．０），５０３（０．０８），５３５（０．０７），５８２（０．０３５），６３６（０．２２）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ６３９ｎｍ（λ励起４１２ｎｍ）；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＭｅＯＨ−ｄ４）９．９５（１Ｈ，ｓ，１０−Ｈ），９．４２（１Ｈ，ｓ，２０−Ｈ），９．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．９７（２Ｈ，ｓ，β−Ｈ），８．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．５１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．０５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｏ−Ａｒ），７．９４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｏ’−Ａｒ），７．２５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｍ−Ａｒ），７．１２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｍ’−Ａｒ），６．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１７−Ｈ），６．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１８−Ｈ），４．０８（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），（ＮＨのものの交換），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝６４２．２（１００％，（Ｍ＋１）＋）。
低いＲ ｆ のクロリンレジオイソマー〔ｎＯｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ及びＪＰＰ ｐａｐｅｒからの２，３−ジヒドロキシ−５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリン〕：（８．５ｍｇ，３０％）；融点１６８℃（分解）；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ（相対強度）４０１（０．９９），４１３（１．０），５０７（０．０８），５３６（０．０６），５８６（０．０２５），６３７（０．２０）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ６３９ｎｍ（λ励起４１２ｎｍ）；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＭｅＯＨ−ｄ４）９．９６（１Ｈ，ｓ，２０−Ｈ），９．４０（１Ｈ，ｓ，１０−Ｈ），９．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０，β−Ｈ），８．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．７４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．５８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｏ−Ａｒ），８．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｏ−Ａｒ），７．９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｏ’−Ａｒ），７．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｏ’−Ａｒ），７．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｍ−Ａｒ），７．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｍ−Ａｒ），７．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｍ’−Ａｒ），７．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｍ’−Ａｒ），６．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，７−Ｈ），６．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，８−Ｈ），４．１１（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），（ＮＨのものの交換），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝６４２．２（１００％，（Ｍ＋１）＋）。
【０１１３】
１７，１８−ジヒドロキシ−５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリン（より一層高いＲｆレジオイソマー）
ＤＣＭ（２５ｍＬ）中の１，ｌ’−チオカルボニルジ−２（１Ｈ）−ピリドン（１．０７等量，７．６ｍｇ，４３．５ミリモル）の撹拌した溶液に、（活性化アルミナカラム中の通過によって乾燥させた。）、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の１７，１８−ジヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−１５−（４−アミノフェニル）クロリン（１７．５ｍｇ，２３．２□モル）の溶液を添加した。反応フラスコをアルミニウムホイルで被覆し光を遮り、及びＮ２下に２時間撹拌し、その時間でＴＬＣが出発物質の完全な消失を示した。次いで、反応混合物を水（２×５０ｍＬ）及び飽和かん水（５０ｍＬ）で洗浄し、次いで、乾燥した（無水Ｎａ２ＳＯ４）。次いで、有機抽出物をろ過し、及び１０ｍＬのフラッシュシリカゲル上で濃縮し、及びフラッシュシリカゲル（１００ｍＬ）上でクロマトグラフ処理し、ＤＣＭ中の１％メタノールで溶出して所要のイソチオシアナトクロリンジオールを溶出した（すべてのＴＤＰのＮＢ．微量成分を、カラムクロマトグラフィーからの生成物の濃縮に先立って除去しなければならず、さもないと、３つのより一層高いＲｆの副産物に対していくつかの分解が発生する。これらのことは、このときには確認できない。）表題の化合物をブラウニー−パープルの結晶性固体として得た（１７ｍｇ，９０％）；融点１５５℃（分解）；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ（相対強度）４１０（１．０），５０５（０．０９），５３４（０．０６），５８６（０．０４），６３７（０．１８）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ６３９ｎｍ（λ励起４１２ｎｍ）；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＭｅＯＨ−ｄ４）１０．０（１Ｈ，ｓ，１０−Ｈ），９．４５（１Ｈ，ｓ，２０−Ｈ），９．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），９．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．６４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｏ−Ａｒ），８．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｏ−Ａｒ），８．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｏ’−Ａｒ），７．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｏ’−Ａｒ），７．６５（２Ｈ，ｍ，ｍ−Ａｒ），７．２４（２Ｈ，ｍ，ｍ’−Ａｒ），６．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１７−Ｈ），６．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１８−Ｈ），４．０８（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），（ＮＨのものの交換），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝５８３．７（１００％，Ｍ＋）；Ｃ３４Ｈ２６Ｎ５Ｏ３Ｓについての計算されたＨＲＭＳは：５８４．１７５７、見出されたのは：５８４．１７５６（（Ｍ＋１）＋）である。
【０１１４】
７，８，１７，１８−テトラヒドロキシ−５−（４−フルオレノメチルアミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）バクテリオクロリン（シス／トランス立体異性体）
５−（４−フルオレノメチルアミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン（３５ｍｇ，４８．０□モル）を、先立って述べた一般的なバクテリオクロリン形成方法を用いて、バクテリオクロリンの立体異性体の混合物に転換した。次いで、粗製の反応混合物をフラッシュシリカゲル（２００ｍＬ）上でクロマトグラフ処理し（ＤＣＭ及び少しのメタノールから２０ｍＬのフラッシュシリカゲルに乾燥負荷し完全な溶解性を確保した。）、ＤＣＭ中の１％メタノールで最初に溶出し、より一層高いＲｆのクロリン副産物を溶出し、次いで２％メタノール／ＤＣＭで２つの立体異性のバクテリオクロリンを別々に溶出した。より一層高いＲ ｆ −トランスのバクテリオクロリン異性体を、ピンキー−グリーンの結晶性固体として単離した（６ｍｇ，１５％）；融点１４２℃（分解）；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ（相対強度）３７４（１．０），５１２（０．２３），７０２（０．５２）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ７０８ｎｍ（λ励起５１２ｎｍ）；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＭｅＯＨ−ｄ４）９．２０（２Ｈ，ｓ，１０−Ｈ，２０−Ｈ），８．７８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．３６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），７．９５（２Ｈ，ｍ，ｏ−Ａｒ），７．８５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，フルオレノ−Ａｒ），７．７９（２Ｈ，ｍ，ｏ’−Ａｒ），７．６５（２Ｈ，ｍ，ｍ’−Ａｒ），７．４７−７．３８（６Ｈ，ｍ，フルオレノ−Ａｒ），７．２４（２Ｈ，ｍ，ｍ−Ａｒ），６．２７−６．２４（２Ｈ，２×ｄ（重複），Ｊ＝６．５Ｈｚ，７−Ｈ，１７−Ｈ），５．８５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，８−Ｈ，１８−Ｈ），４．６５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ２），４．３９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ），４．０６（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），−１．９４（２Ｈ，ｂｒ．ｓ（部分的に交換），ＮＨ），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝８００．４（１００％，（Ｍ＋１）＋）。
より一層低いＲ ｆ −シスのバクテリオクロリン異性体を、ピンキー−グリーンの結晶性固体として単離した（８．５ｍｇ，２１％）；融点１４８℃（分解）；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ（相対強度）３７４（１．０），５１２（０．２４），７０３（０．５４）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ７０８ｎｍ（λ励起５１２ｎｍ）；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＭｅＯＨ−ｄ４）９．１２（２Ｈ，ｓ，１０−Ｈ，２０−Ｈ），８．７６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．３４（２Ｈ，２×ｄ（重複），Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．０２（２Ｈ，ｍ，ｏ−Ａｒ），７．８５（２Ｈ，ｄ（不明瞭），Ｊ＝８．０Ｈｚ，ｏ’−Ａｒ），７．８３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，フルオレノ−Ａｒ），７．７６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，ｍ’−Ａｒ），７．５０−７．３８（６Ｈ，ｍ，フルオレノ−Ａｒ），７．２４（２Ｈ，ｍ，ｍ−Ａｒ），６．２７−６．２３（２Ｈ，２×ｄ（重複），Ｊ＝６．５Ｈｚ，７−Ｈ，１７−Ｈ），５．８５−５．８２（２Ｈ，２×ｄ（重複），Ｊ＝６．５Ｈｚ，８−Ｈ，１８−Ｈ），４．６５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ２），４．３９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ），４．０５（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），−１．８８（２Ｈ，ｂｒ．ｓ（部分的に交換），ＮＨ），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝８００．４（１００％，（Ｍ＋１）＋）。
【０１１５】
７，８，１７，１８−テトラヒドロキシ−５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）バクテリオクロリン（より一層低いＲｆシス立体異性体）
ＤＣＭ中の２５％メタノール（１．２５ｍＬ）における７，８，１７，１８−テトラヒドロキシ−５−（４−フルオレノメチアミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）バクテリオクロリン（より一層低いＲｆシス立体異性体）（８．５ｍｇ，１０．７μモル）の溶液をピペリジン（５０等量，５３μＬ，０．５３ミリモル）で処理し、及び３時間の時間光を遮ってＮ２下に室温で撹拌した。反応混合物を減圧中に濃縮しピペリジンのすべての微量成分を除去した（高い減圧が必要である。）。ＤＣＭ中の１，１’−チオカルボニルジ−２（１Ｈ）−ピリドン（１．０７等量，７．６ｍｇ，４３．５ミリモル）（２５ｍＬ）の撹拌した溶液に、（活性化させたアルミナカラムに通すことによって乾燥させて）ＤＣＭ中の２，３，１２，１３−テトラヒドロキシ−５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）バクテリオクロリン（６．１ｍｇ，１０．７μモル）（１０ｍＬ）の溶液を添加した。反応フラスコをアルミニウムホイルで被覆し光を遮り、及びＮ２下に２時間、ＴＬＣが出発物質の完全な減少を示す時間撹拌させた。次いで、反応混合物を水（２×５０ｍＬ）で及び飽和かん水（５０ｍＬ）で洗浄し、次いで乾燥させた（無水Ｎａ２ＳＯ４）。次いで、有機抽出物をろ過し、及び１０ｍＬのフラッシュシリカゲル上で濃縮してフラッシュシリカゲル（１００ｍＬ）上でクロマトグラフ処理し、ＤＣＭ中の２％メタノールで溶出して所要のイソチオシアナトバクテリオクロリンテトロールを溶出させた（すべてのＴＤＰのＮＢ．微量成分を、カラムクロマトグラフィからの生成物の濃縮に先立って除去しなければならず、さもなければ、若干の分解が起こる。）。より一層低いＲ ｆ シスバクテリオクロリン異性体をピンキー−グリーンの結晶性固体として単離した（５．０ｍｇ，７６％）；融点１３２℃（分解）；）ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ（相対強度）３７５（１．０），５１６（０．２２），７０２（０．４８）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ７０９ｎｍ（λ励起５１６ｎｍ）；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＭｅＯＨ−ｄ４）９．２０（１Ｈ，ｓ，メソ−Ｈ）、９．１８（１Ｈ，ｓ，メソ’−Ｈ），８．７７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．１４（２Ｈ，ｍ，ｏ−Ａｒ），８．０５（２Ｈ，ｍ，ｏ’−Ａｒ），７．４２−７．０８（４Ｈ，ｍ，５＋１５−ｍ−Ａｒ），６．２０（２Ｈ，２×ｄ（重複），Ｊ＝６．５Ｈｚ，７−Ｈ，１７−Ｈ），５．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，８−Ｈ），５．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１８−Ｈ），４．０４（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），−１．８０（２Ｈ，ｂｒ．ｓ（部分的に交換），ＮＨ），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝６１８．９（１００％，（Ｍ＋１）＋）；Ｃ３４Ｈ２８Ｎ５Ｏ５Ｓについて計算されたＨＲＭＳは：６１８．１８１５、見出されたのは：６１８．１８１０（（Ｍ＋１）＋）である。
【０１１６】
また、さらなる合成プロトコル及び方法論プロトコルは、Ｓｕｔｔｏｎ等のＰｏｒｐｈｙｒｉｎ， Ｃｈｌｏｒｉｎ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｉｎ Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅｓ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｓ＆Ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｓｅｒｓ−印刷中）及びＯｌｉｖｅｒ（オリバ）Ｊ Ｃｌａｒｋｅ（クラーク），Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏ Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ ｆｏｒ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ（博士号論文，２００１年４月，エセックス大学）に記載されている；各々のすべての内容を参考として本明細書に組み入れる。
【０１１７】
方法論の記載１：一般的な生物学的接合プロトコル
ヘキサヒドロキシＰＩＴＣ＋抗体
ＤＭＳＯ中のヘキサヒドロキシＰＩＴＣの保存溶液を０．０２７のモル濃度に調製し、この溶液を乾燥させ及び必要なときまで０℃で貯蔵した。抗体の溶液を滅菌したＰＢＳに対して大規模に透析しアジ化物の任意の微量成分を除去した。次いで、透析した抗体の溶液を遠心性の濃縮によって１０ｍｇ／ｍＬの濃度に調整し、及び２５０μＬのアリコートに分けた。
炭酸水素ナトリウムの１Ｍ溶液を調製し、及び２Ｍ水酸化ナトリウムを用いてｐＨ９．０に調整した。
抗体の２５０μＬのアリコートに、３０μＬの１Ｍ炭酸水素ナトリウムを添加した。次いで、所定の容積のヘキサヒドロキシＰＩＴＣの保存溶液を添加し、望ましいモル比（ＭＲ）のポルフィリンを抗体に与えた。例えば、２０のＭＲは、２５０μＬの１０ｍｇ／ｍＬの抗体に１０μＬの保存溶液の添加によって達成された。生物学的接合反応混合物中でのＤＭＳＯの一定の濃度を維持するために、保存溶液のすべてのアリコートを更に一部のＤＭＳＯを用いて２５μＬに希釈した。
【０１１８】
【０１１９】
ＰＩＴＣの添加に次いで、生物学的接合の反応物を２５℃で１時間緩徐に撹拌した。１時間後、粗製の生物学的接合反応混合物を、滅菌したＰＢＳ（２５ｍＬ）で前もって平衡化された予め包装されたＰＤ１０寸法排除カラムの頂上に直接負荷した。カラムを無菌のＰＢＳで溶出させた。抗体−ポルフィリン接合物を最初の色のバンド／画分中に溶出させた。抗体−ポルフィリン接合物の濃度はクロマトグラフィーの間の希釈により１．２５ｍｇ／ｍＬとして測定された。抗体に対するポルフィリンの標識の程度（ＤＯＬ，ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ）を、ポルフィリン及びタンパク質の双方についてのモル吸光率の既知の定数を用いる標準的な分光法によって算出した。
抗体−ポルフィリン接合物を、更に濃縮することなく、他に断らない限り、ＰＢＳ＋アジ化物中、０℃で保存した。
【０１２０】
Ｎ−メチルピリジニウムクロライドＰＩＴＣ＋抗体
ＤＭＳＯ中のＮ−メチルピリジニウムクロライドＰＩＴＣの保存溶液を０．０２７モル濃度に調製し、この溶液を乾燥させ、及び用いるまで０℃で保存した。抗体の溶液を滅菌したＰＢＳに対して大規模に透析しアジ化物の任意の微量成分を除去した。次いで、透析した抗体の溶液を遠心性の濃縮によって１０ｍｇ／ｍＬの濃度に調整し、及び２５０μＬのアリコートに分けた。
炭酸水素ナトリウムの１Ｍ溶液を調製し、及び２Ｍ水酸化ナトリウムを用いてｐＨ９．０に調整した。
抗体の２５０μＬのアリコートに、２５０μＬの滅菌ＰＢＳ、次いで６０μＬの１Ｍ炭酸水素ナトリウムを添加した。次いで、所定の容積のＮ−メチルピリジニウムクロライドＰＩＴＣの保存溶液を添加し、望ましいモル比（ＭＲ）のポルフィリンを抗体に与えた。例えば、２０のＭＲは、５００μＬの５ｍｇ／ｍＬの抗体に１０μＬの保存溶液を添加することによって達成された。生物学的接合反応混合物中でのＤＭＳＯの一定の濃度を維持するために、保存溶液のすべてのアリコートを更に一部のＤＭＳＯを用いて２５μＬに希釈した。
【０１２１】
【０１２２】
ＰＩＴＣの添加に次いで、生物学的接合の反応物を２５℃で１時間緩徐に撹拌した。１時間後、粗製の生物学的接合反応混合物を、滅菌ＰＢＳ（２５ｍＬ）で前もって平衡化された予め包装されたＰＤ１０寸法排除カラムの頂上に直接負荷した。カラムを滅菌ＰＢＳで溶出させた。抗体−ポルフィリン接合物を最初の色のバンド／画分中に溶出させた。抗体−ポルフィリン接合物の濃度はクロマトグラフィーの間の希釈によって１．２５ｍｇ／ｍＬとして測定された。抗体に対するポルフィリンの標識の程度（ＤＯＬ）を、ポルフィリン及びタンパク質の双方についてのモル吸光率の既知の定数を用いる標準的な分光法によって算出した。
抗体−ポルフィリン接合物を、更に濃縮することなく、他に断らない限り、ＰＢＳ＋アジ化物中、０℃で保存した。
【０１２３】
方法論の記載２：標準的な光細胞障害性
細胞を、集密にまでか、又は適当な密度にまで増殖させ、次いで２回ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で洗浄し、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）のすべての痕跡成分を除去した。細胞密度を、ＦＢＳを含まない培地中で１．５×１０６細胞／ｍＬに調整し、及び次いで、これらを１時間、暗所（３７度Ｃ，５％ＣＯ２）、光増感剤／接合物濃度の範囲で温置する。温置後、細胞を更に培地（ＦＢＳを含まない）で洗浄して結合しない光増感剤を除去し、次いで再懸濁させ、及びクワドルプレート（ｑｕａｄｒｕｐｌａｔｅ）中の９６ウェルプレート（１×１０５細胞／ウェル）に播種した。次いで、プレートを照射するか（フィルターを通した赤色光□６００ｎｍの３．６Ｊ／ｃｍ２）、又は暗所中で“暗所毒性コントロール”として、同じ時間（〜１４分）の間放置するかのいずれかを行う。ＦＢＳの５マイクロリットル（５％／ウェル）を、照射／暗所の期間の後、添加し、及びプレートを、一昼夜の温置に戻す。処理後１２から２４時間まで、１０μＬのＭＴＴ溶液〔ＰＢＳ中のＳｉｇｍａ Ｔｈｉａｚｏｌｙｌ ｂｌｕｅ（シグマチアゾリルブルー）、４．８×１０−４Ｍ〕を、ウェル当たりに添加し、及びプレートを、発色まで（１及び４時間の間）インキュベータに戻す。酸−アルコールの溶液（イソプロパノール中の０．０４ＮのＨＣｌの１００μＬ／ウェル）を添加し、及び十分に混合し濃青色の結晶を溶解する。次いで、プレートをマイクロプレート読み取り機において５７０ｎｍで読み取り、及びその％の細胞生存率をコントロールに対して算出する。
【０１２４】
方法論の記載３：初期（ｉｎｉｔｉａｌ）フローサイトメトリー発色団分析
２つの蛍光色素プローブを、２，３−ジヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−１５−（４−イソチオシアナトフェニル）クロリン（より一層高いＲｆのレジオイソマー）及び２，３，１２，１３−テトラヒドロキシ−５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）バクテリオクロリン（より一層低いＲｆシス立体異性体）とアビジンとの先立って述べた標準的な生物学的接合プロトコルの下での別々の反応から作製した。初期フロー実験をこれらの各々のアビジンのＲＡＪＩ細胞及びビオチンモノクローナル抗体（ＨＬＡ−ＤＲＩ，Ｌ２４３）との接合物を利用することによって行った（レーザ励起４８８ｎｍ，＜６４０ｎｍ（ＦＬ２）＞６７０ｎｍ（ＦＬ３）での発光の収集）。データは、ＤＰＢＣ試料からの信号が、発光フィルター（ＦＬ３）に良好に適合するために、著しく高いことを示した。アビジンＤＰＣＨ又はＤＰＢＣのＬ２４３抗体との接合物はコントロールに比べ蛍光において中程度の増加を示した。アビジン−ＤＰＣＨ／ＤＰＢＣのより一層高い濃度を用いることによって、ピークの蛍光が増加し、それは接合物の初期濃度が、受容体を飽和させるのにか、又はそれほどではないにせよ、若干の非共有性の結合にとって余りに低いためのいずれかかもしれない。アビジン−ＤＰＣＨ／ＤＰＢＣ（抗体のない）とのコントロール試料は、Ｌ２４３抗体の不存在下に若干の背景蛍光を示し、接合物のＲＡＪＩ細胞に対する若干の非特異的結合が生じるか、又は若干の量の非共有的に結合するフルオロフォアがタンパク質から細胞表面に移ったことを示唆する。ＦＩＴＣ−アビジンのコントロールは、わずかにより一層高い信号がＦＬ２に存在し、それはまた広い発光バンドのためにＦＬ３にも現れることを示した。Ｌ２４３抗体の存在において、平均の信号は１５０％の増加を示した。このことは、非共有結合がＦＩＴＣ−アビジン接合物に対してあまり重要でないことを示した。
【０１２５】
実験を、フルオロフォアのタンパク質表面（ＢＳＡ及びアビジン）に対する非共有結合のレベルを決定するために行った。非反応性のＤＰＣＨ及びＤＰＢＣ誘導体２，３−ジヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−１５−（４−アセトミドフェニル）クロリン（より一層高いＲｆのレジオイソマー）及び２，３，１２，１３−テトラヒドロキシ−５−（４−アセトミドフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）バクテリオクロリン（より一層高いＲｆのトランス立体異性体）とＢＳＡ及びアビジンの双方の混合物を用いる‘ブランク’の生物学的接合を実行し、及び得られたタンパク質溶液を先に記載した反応性プローブのために記載したように、ゲルろ過（ＰＤ−１０）によって精製した。ＵＶ分析は、ほぼ同様の量の非反応性プローブがタンパク質に非共有的に結合することを示した。ＢＳＡ又はアビジンにとって、１つの非反応性ＤＰＣＨが各タンパク質分子に結合するが、ＤＰＢＣは、おそらくその増加した極性及び非両親媒性の性質によって１つより少ない。
【０１２６】
初期の研究を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、タンパク質（ＢＳＡ及びアビジン）から、非共有的に結合したフルオロフォアを除去した。‘ブランク’の生物学的接合の混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかける場合、すべての非共有的に結合したフルオロフォアの分離が行えた（可溶化したゲルセグメントの、ＢＳＡについての６６０００Ｄ及びアビジンモノマーについての１６５００ＤのＵＶ／蛍光は信号を示さなかった。）。さらに、これらの検討に加えて、我々は、ＢＳＡ（又はアビジン）に非共有結合するフルオロフォアがヒーラ細胞の表面に移ることを示すことができた。ヒーラ細胞を非共有結合的なフルオロフォア−タンパク質複合体の溶液に添加し、及び２０分間温置する場合、ヒーラ細胞を除去した溶液から蛍光が除去された。この効果は、２，３−ジヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−１５−（４−アセトミドフェニル）クロリン（より一層高いＲｆのレジオイソマー）で２，３，１２，１３−テトラヒドロキシ−５−（４−アセトミドフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）バクテリオクロリン（より一層高いＲｆのトランス立体異性体）よりも極めて顕著であった。細胞の再懸濁及び蛍光の測定は、ＤＰＣＨの場合において蛍光の１０倍の増加を示したが、ＤＰＢＣだけは中程度の増加を示した。これらの測定によって、タンパク質によるＤＰＣＨ及びＤＰＢＣの双方の重大な蛍光クエンチングが起こること、及びＤＰＣＨの両親媒性の性質がヒーラ細胞の膜中に組み込まれてほとんど完全な蛍光の修復が起こることを示唆する。ＤＰＢＣは、非両親媒性であり、それがタンパク質に対して行うように同様な方法でヒーラ細胞の表面を複雑にすることができ、同様な蛍光のクエンチングを起こす。
【０１２７】
フルオロフォア接合物がＳＤＳ−ＰＡＧＥによって精製できるので、我々は、非共有結合的に結合したフルオロフォアの除去のための技術として、調製用電気泳動の使用を検討した。このために、我々は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ミリポア社）から購入したＣｅｎｔｒｉｌｕｔｏｒ（Ｒ）（セントリルータ、登録商標）ｍｉｃｒｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｅｒ（マイクロ−エレクトロエルータ）を用いた。この装置はＳＤＳゲルから純粋なタンパク質フルオロフォア接合物を回収させた。
【０１２８】
方法論の記載４：Ｍｉｃｒｏ−Ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｅｒを用いるＳＤＳ ＰＡＧＥからの接合物の溶出
・著しく抑制した照明での作業、所要のタンパク質接合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを小さなストリップに切断し、及びセントリルータ試料管に添加し、及びその頂上を閉じた（半分以下、３〜４試料管を用いた）。
・エレクトロエルータのより一層低い緩衝液チャンバーを脱気したＳＤＳランニング緩衝液を用いて第１電極のレベルまで満たした。
・ミリポア社からの３から４のＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｒ）（セントリコン、登録商標）の遠心装置（ＢＳＡ接合物のためのＹＭ−３０及びアビジン接合物のためのＹＭ−３を用いた。）をエレクトロエルータの上側緩衝液チャンバーラック中の孔に下から（フィルター膜を下にして）しっかり挿入し、及びそのラックの空の孔を、ラックの下側から栓を設けることにより塞いだ。
・上側の緩衝液チャンバーを、エレクトロエルータの同じ側に並べた双方の電極を有する下側の緩衝液チャンバー中に配置した。
・次いで、上側の緩衝液チャンバーを、脱気したＳＤＳランニング緩衝液（上述のような）によって、すべてのＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｒ）ユニットの頂上が完全に浸漬するまで満たした。漏出が検出されない場合、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｒ）ユニットの下に捕捉された気泡を、曲がったプラスチックピペット（ペーパークリップを用いて強化した）によって除去した。
・次いで、セントリルータ試料管をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｒ）ユニットの頂上中に配置して、試料管がぴったりと装着されるようにし、及び試料緩衝液（気泡を上述の様に除去した）で完全に満たした。
・エレクトロエルータの安全カバーを追加し、及び電源装置を接続した（２００Ｖ，５０ｍＡを用いた）。
・２〜３時間の後、電源装置を除去し、及びＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｒ）フィルターをエレクトロエルータの上側緩衝液チャンバーから引き出した。
・ろ液バイアルをフィルターユニットに追加し、及び濃縮水のトップ（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ ｔｏｐ）を追加した。次いで、過剰の緩衝液を、５０００Ｇ（ＢＳＡ）及び７，５００Ｇ（アビジン）で２時間の遠心分離によって除去した。新鮮な０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｒ）ユニットに添加し、及びその方法をすべてのＳＤＳが除去されるまで繰り返した。
・次いで、濃縮された精製接合物を、フィルターユニットの濃縮水バイアル中に、反転及び遠心分離によって収集した。アジ化ナトリウム（２Ｍ，２０ｍＬ）を添加し、及び接合物を４℃で保存した。
【０１２９】
方法論の記載５：ＦＡＣＳ接合物結合プロトコル
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．３を用いて細胞のフラスコを洗浄する。ＰＢＳ中の５ｍＭのＥＤＴＡを用いて３７℃で１０分間処理する。フラスコを軽くたたいて細胞を移動させ、５０ｍＬのポリプロピレン管中に配置し、及び４００ｇの３分間で小さく丸める。１０ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁し、及び細胞を計数する。ＦＡＣＳ管〔ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）２０５４〕中に２×１０５で配置し、及び１ｍＬのＰＢＳを用いて遠心分離（４００ｇ３分）によって洗浄し、及びかき混ぜによって再懸濁させる。
細胞を、５００μＬのＰＢＳ中の２％マーベルミルク粉末、１％ＢＳＡ中で３０分間室温でブロックする。
細胞を１ｍＬのＰＢＳ／ＢＳＡ／アジ化物遠心分離中で洗浄し、及びペレットを再懸濁させる（上述のように）。
１０μＬの適切な希釈度の抗体を添加する。氷上で１時間温置する。
細胞を１ｍＬのＰＢＳ／ＢＳＡ／アジ化物遠心分離中で洗浄し、及びペレットを再懸濁させる（上述のように）。
５０μＬのラビット抗−マウス：ＦＩＴＣ〔Ｓｅｒｏｔｅｃ（セロテック），１／１００希釈〕を添加し、及び氷上暗所で１時間温置する。
細胞を１ｍＬのＰＢＳ／ＢＳＡ／アジ化物遠心分離中で洗浄し（上述のように）、及びペレットを４００μＬのＰＢＳ／ＢＳＡ／アジ化物中で再懸濁させる。
試料を、ＦＡＣＳ機械に、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（セルクエスト）捕捉（ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ）ソフトウェアを用いて通し、データを収集する。
ＰＢＳ／ＢＳＡ／アジ化物
２５０ｍＬ ＰＢＳ
０．６２５ｇ ＢＳＡ
１．５６ｍＬアジ化ナトリウム（１．６Ｍ）
【０１３０】
方法論の記載６：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
分離ゲル
成分 ゲルの％ ５ ２０
アクリルアミド／ビス（４０％ｗ／ｖ） １．６７ｍＬ ６．６６ｍＬ
１．５Ｍのトリス−塩酸（ｐＨ８．８） ２．５ｍＬ ２．５ｍＬ
水 ５．６７ｍＬ ０．７ｍＬ
ＴＥＭＥＤ １０μＬ １０μＬ
１０％過硫酸アンモニウム ５０μＬ ５０μＬ
ＳＤＳ １００μＬ １００μＬ
勾配ゲル５〜２０％のために、ペリスタポンプに連通させた勾配撹拌機を用いる。
スタッキングゲル（３％）
成分 ｍＬ
アクリルアミド／ビス（４０％ｗ／ｖ） １．３
１Ｍのトリス−塩酸（ｐＨ６．８） １．２５
水 ７．４
ＴＥＭＥＤ ２０μＬ
１０％過硫酸アンモニウム ５０μＬ
ＳＤＳ １００μＬ
ランニング緩衝液
０．０２５Ｍトリス，０．１９２Ｍグリシン，０．１％ＳＤＳ，水中ｐＨ８．３。
サンプル緩衝液
１Ｍのトリス−塩酸（ｐＨ６．８） １３ｍＬ
２０％ＳＤＳ ６．５ｍＬ
グリセロール ５．２ｍＬ
０．５％ブロモフェノールブルー ０．２６ｍＬ
ＢＩＯＲＡＤ（バイオラド社）プロテアン２（Ｐｒｏｔｅａｎ２）装置を製造者の指示に従って用いた。
試料（１〜１０μｇの試料タンパク質を含有する全量１５〜２０μＬ）をゲル上に負荷した。
ゲルを２００Ｖで約１時間運転した。次いで、ゲルを光によってスキャンし、その後、それらを、クーマシーブルー染色を用いて染色し、次いで、酢酸／メタノールを用いて脱染した。
【０１３１】
本発明の更なる例証
我々の独創的な研究において、特に、ＳｕｔｔｏｎＪ， Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｎ，及びＢｏｙｌｅ，Ｒ．Ｗ．（２０００）Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｅｄ Ｄｉｐｈｅｎｙｌｃｈｌｏｒｉｎｓ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｉｎｓ−Ｔｈｅｉｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｔｕｍｏｕｒ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ．Ｊ．Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ａｎｄ Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｓ ４，６５５−６５８）；及びＣｌａｒｋｅ，Ｏ．Ｊ．及びＢｏｙｌｅ，Ｒ．Ｗ．（１９９９）Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ，ｕｓｅｆｕｌ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ ｗｉｔｈ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔｓ．，Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２３１−２２３２に記載されるように、それらのそれぞれを参考として本明細書に組み入れ、それは、ポルフィリン、クロリン及びバクテリオクロリン分子の組合せが、安定なチオ尿素結合によってタンパク質に効率的に接合することができ、及びこれらの接合物が蛍光造影剤としての潜在能力を有することを示した。
【０１３２】
本発明の例証として、我々は次に、ヒトの癌細胞に高度な特異性を有するモノクローナル抗体と、ポルフィリン系の光増感剤の我々の組合せとの間に接合を形成するためのこの方法の使用を記載する。この方法で形成された接合物は、相当する癌腫細胞に対する光線力学的な活性について、及びまた、標的でない細胞の存在下にこれらの標的の細胞に選択的に結合し、及び光増感するそれらの能力についてアッセイした。また、我々は、ポルフィリン−ＢＳＡ接合物のヒーラ細胞への特異的な内部移行を例示する。
【０１３３】
我々の例は、５，１０，１５−トリス（３，５−ジヒドロキシフェニル）−２０−（４−イソチオシアナトフェニル）ポルフィリン（ＯＨ６）及び５，１０，１５−トリス（ピリジル）−２０−（４−イソチオシアナトフェニル）ポルフィリン（ＰＹＲ）を用い、我々が我々の以前の研究から見出したように、これらの発色団のそれぞれの光活動性のポルフィリンコアの周りの親水性置換基のパターンがタンパク質との効率的な接合を導き；親水性置換基がまた、より一層疎水性のポルフィリンで多く見られるように、光増感剤のタンパク質に対する非共有結合を最小化する。これらの発色団のための合成プロトコルを上記の例１及び２にそれぞれ記載する。
【化９４】
【化９５】
【０１３４】
例２５−抗体に対する安定な接合
ＯＨ６及びＰＹＲを上記例１及び２にそれぞれ記載したように調製した。抗体１７．１Ａを生物学的接合の方法のために選定した。１７．１Ａは結腸直腸の癌細胞、特に、Ｃｏｌｏ（コロ）３２０細胞（ＥＣＡＣＣ，寄託番号８７０６１２０５）上に余分に発現する受容体と特異的に反応する抗体である。しかし、適切な細胞系上で余分に発現する任意の抗原に対し反応する任意の抗体を、本発明にしたがって用いることができる。かかる抗体の例には、Ｂｅｒ−ＥＰ４及びＭＯＫ−３１が含まれ、それぞれはＤＡＫＯ Ｌｔｄ（ダコ社），Ｅｌｙ（イーリー），ケンブリッジシャー州から商業的に入手でき、及びそれぞれは上皮細胞上に余分に発現する抗原に対して反応性である。
【０１３５】
抗体調製物の緩衝液ｐＨを約ｐＨ９に増加させるために、先立って、及び生物学的接合の方法の目的のために、モノクローナル抗体調製物を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ遠心機を用いるか、又はリン酸緩衝液を酢酸緩衝液に交換するために、透析にかけて、リン酸から酢酸緩衝液に交換した。
【０１３６】
ＯＨ６及びＰＹＲのそれぞれを、１７．１Ａモノクローナル抗体と、方法論の記載１に記載した方法に従って別々に接合させ、２．５，５，１０及び２０のそれぞれのＭＲを有する接合希釈率の範囲を得た。
【０１３７】
酢酸緩衝化抗体調製物及びそれから得られたさまざまな希釈率の接合物を方法論の記載６に説明した方法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。結果を図１〜３にそれぞれ示す。図１は緩衝液交換した１７．１Ａの抗体（レーン１）、及び緩衝液交換した抗体／ＯＨ６接合物のＭＲ２．５（レーン２，３）、５（レーン４，５）、１０（レーン６，７）及び２０（レーン８，９）、及び分子量マーカー（レーン１０）を用いて負荷したゲルを示す。図２は透析した１７．１Ａの抗体（レーン１）、及び透析した抗体／ＯＨ６接合物のＭＲ２．５（レーン２，３）、５（レーン４，５）、１０（レーン６，７）及び２０（レーン８，９）、及び分子量マーカー（レーン１０）を用いて負荷したゲルを示す。図３は緩衝液交換した１７．１Ａの抗体（レーン１）、及び緩衝液交換した抗体／ＰＹＲ接合物のＭＲ２．５（レーン２，６）、５（レーン３，７）、１０（レーン４，８）及び２０（レーン５，９）、及び分子量マーカー（レーン１０）を用いて負荷したゲルを示す。
【０１３８】
これらの図に示すように、緩衝液交換か、又は透析かのいずれの方法も、抗体構造を分裂させず、軽鎖及び重鎖は互いと結合したままであり、及びゲル（レーン１）のそれぞれに共に移動する。また、ＯＨ６及びＰＹＲの各ＭＲでの接合をゲル（レーン２〜９）上で確認することができる。
【０１３９】
例２６−ＦＡＣＳ分析
ＦＡＣＳ分析を方法論の記載５に従って行った。
図４はＦＩＴＣ標識化１７．１Ａ及びＣｏｌｏ３２０細胞（３回繰り返し）を用いて引き出した結果を示し、及び抗体の細胞への結合が起こっていることを示す（すなわち、Ｃｏｌｏ３２０細胞が１７．１Ａに特異的な抗原を発現する）。
図５は検出のためのＦＩＴＣ標識化した抗１７．１Ａ抗体と共にＯＨ６／１７．１Ａ接合物及びＣｏｌｏ３２０細胞（３回繰り返し）を用いて引き出した結果を示し、及びＯＨ６／１７．１Ａ接合物が細胞に結合していることを示す。
図６は検出のためのＦＩＴＣ標識化した抗１７．１Ａ抗体と共にＰＹＲ／１７．１Ａ接合物及びＣｏｌｏ３２０細胞（３回繰り返し）を用いて引き出した結果を示し、及びＰＹＲ／１７．１Ａ接合物が細胞に結合していることを示す。
図７は、ＦＩＴＣ標識化ＯＸ−３４（３回繰り返し）を用いて引き出した結果を示し、ＯＸ−３４は１７．１Ａと同じクラス（ＩｇＧ２ａ）の抗体であるが、異なった高原特異性を有する。これらの結果は、ＯＸ−３４がＣｏｌｏ３２０細胞に結合せず、従ってＣｏｌｏ３２０細胞上にはＯＸ−３４のための結合部位がないことを示す。
【０１４０】
例２７−光細胞障害性の実験
方法論の記載２に説明した方法に従う光細胞障害性の試験を、種々の抗体接合物を用いてＣｏｌｏ３２０細胞上で行った。
図８及び９はＯＨ６／ＯＸ−３４及びＰＹＲ／ＯＸ−３４接合物のそれぞれを用いて行ったコントロール実験の結果を示す。例１６に示すように、ＯＸ−３４はＣｏｌｏ３２０細胞の表面に発現する任意の抗原に対して特異性を欠くことが見出された。したがって、予想通りに、これらのコントロール実験は照射後の光細胞障害性を示さない。
【０１４１】
図１０及び１１は”キャップ（ｃａｐｐｅｄ）”ＯＨ６及びＰＹＲのそれぞれを用いて行った更なるコントロール実験の結果を示す。”キャップ”法は、各発色団上のＮＣＳ基とプロピルアミンとの反応を含み、血清タンパク質の接合をブロックする。図１０では、暗所での細胞障害性を示さず、ＯＨ６がＣｏｌｏ３２０細胞に対して無毒であることを示す。しかし、照射において、若干の光細胞障害性が観察され、キャップＯＨ６のある量がＣｏｌｏ細胞の表面に移ったことが示される。一方、図１１は暗所での若干の細胞障害性を示し、ＰＹＲがＣｏｌｏ３２０細胞に対する若干の程度の細胞障害性に関し、及び照射による光細胞障害性を増加させることを示唆し、再び、キャップＰＹＲのある量がＣｏｌｏ３２０細胞の表面に移ったことを示す。
【０１４２】
任意の抗体の欠損下で、キャップ発色団の細胞膜への移動は、おそらくキャップ発色団の両親媒性の性質に起因し、これはポルフィリンのコアの周りの親水性基及び疎水性プロピルアミンの”キャッピング”基の双方を有する。このことは特にそれらをＣｏｌｏ３２０細胞膜のような脂質膜中に包埋させ易くする。
【０１４３】
図１２及び１３は、ＯＨ６／１７．１Ａ及びＰＹＲ／１７．１Ａ接合物をそれぞれ用い、種々の接合物希釈率（ＯＨ６／１７．１Ａについて２．５，５，１０，２０；ＰＹＲ／１７．１Ａについて１０及び２０）で得た結果を示す。これらの結果は、照射による細胞障害性の有意な増加を示し、生物学的接合物の細胞表面に対する結合が細胞上の感光性を与えることを示す。したがって、これらの種類はＰＤＴの適切な候補である。
【０１４４】
例２８−インビボの光線力学的治療
本発明にかかる接合物を用いる、インビボでの光線力学的治療を行い評価するプロトコルは、Ｒ Ｂｏｙｌｅ等の、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９２）６５：８１３−８１７；Ｒ Ｂｏｙｌｅ等の、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９３）６７：１１７７−１１８１；Ｒ Ｂｏｙｌｅ等の、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９６）７３：４９−５３；及びＬａｐｏｉｎｔｅ（ラポワント）等の、Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．５（Ｍａｙ １９９９）８７６−８８２に多様に記載されており；これらの各内容を参考として本明細書に組み入れる。
【０１４５】
これらの論文に記載されているように、腫瘍をマウスのような動物に誘導するか、又は移植することができ、及び次いでその動物に、本発明にかかる抗原に特異性を有する抗体に接合した光増感剤のある量を注射することができ、この抗原は腫瘍細胞の表面上に特異的に発現されるか、又は余分に発現される。その後、動物に照射をすることができ、及び腫瘍に対する効果を、質的にか、又は計量的に、腫瘍の代謝を参照して評価することができる（Ｌａｐｏｉｎｔｅ等の、Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．５（Ｍａｙ １９９９）８７６−８８２に記載されているように）。また、Ｒ Ｂｏｙｌｅ等のＢｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９６）７３：４９−５３に記載されているように、インビボでの光増感剤の分布を、体内分布及び／又は血管性静止アッセイ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｔａｓｉｓ ａｓｓａｙｓ）によって測定することができる。
【０１４６】
例２９−共焦点レーザー顕微鏡
１０，１５，２０−トリス（３，５−ジヒドロキシフェニル）５−イソチオシアナトフェニルポルフィリン（ＯＨ６−ＮＣＳ）とＢＳＡとの接合物の細胞内局在性の予試験を、共焦点レーザー顕微鏡を用いて行った。容易に入手できる上皮性のヒト癌腫細胞系ヒーラを、接合物との温置のために選定した。すべての温置は、ヒーラ細胞のサブ集密的な（ｓｕｂ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）培養物を用いて、一連の、標識していないＢＳＡのコントロール溶液、１０，１５，２０−トリス（３，５−ジヒドロキシフェニル）５−アミノフェニルポルフィリン（ＯＨ６−ＮＨ２，ＯＨ６−ＮＣＳのアミノ前駆体）、及びＰＢＳのそのままでのものを含む、３通りで行った。細胞を３５ｍｍの皿においてカバーガラスの上に播種した。
【０１４７】
細胞の蛍光画像を、６０×（ＮＡ１．４）の油浸対物レンズを用いる倒立のオリンパスＩＸ７０顕微鏡上のＢｉｏ−Ｒａｄ Ｒａｄｉａｎｃｅ（バイオラドラジアンス）２０００の共焦点レーザー顕微鏡〔Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（バイオラドマイクロサイエンス），ケンブリッジ，ＭＡ〕を用いて得た。照明源は２５ｍＷアルゴンイオンレーザーからの５１４ｎｍ線であった。ポルフィリンを、５１４ｎｍのバンドパス励起フィルター、５１０ｎｍの２色性ミラー、及び５７０ｎｍの長波長パス発光フィルターを用いて可視化した。
【０１４８】
細胞の各フィールドを、一連の焦平面からの記録画像によって３次元的に区分化した。１つの焦平面から他のものへの移動は、顕微鏡のファインフォーカスコントロールに関連するステッピングモーターによって達成され、増分量（ｓｔｅｐ ｓｉｚｅｓ）（０．５μｍから１．２５μｍまでの範囲における）は用いられる開口寸法に関して選定し、隣接する区分の間に若干の重複が存在する。十分な垂直区分を採用し、各フィールドにおけるすべての細胞の頂部及び底部を記録する。収集された各画像は共焦点顕微鏡の通常の走査速度での４つの走査の平均値であった。各画像化セッション較正の間に、画像を：（ｉ）培地を含む顕微鏡スライド、背景レベルを測定するため；（ｉｉ）ＤＭＳＯ中に溶解したＩＴＣポルフィリンＯＨ６−ＮＣＳを含むスライド；及び（ｉｉｉ）プローブでない（ｕｎ−ｐｒｏｂｅｄ）ヒーラ細胞のみを有するスライドで採取した。
【０１４９】
画像データの取得及び遠隔顕微鏡の操作はＢｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｓｅｒｓｈａｒｐ２０００ソフトウェアを用いて行った。すべての画像を、Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ａｓｓｉｓｔａｎｔ（コンフォクルアシスタント）バージョン４．０２、（構築１０１）１９９４−１９９６ Ｔｏｄｄ Ｃｌａｒｋ Ｂｒｅｌｊｅ（トッドクラークブレルヘ）を用いて管理した。人工的な色を標準的なＢｉｏ−Ｒａｄの参照表（ｌｏｏｋ−ｕｐ ｔａｂｌｅｓ，ＬＵＴ）を用いてあてはめた。
【０１５０】
設定されたＣＬＳＭ上で入手できる励起レーザー線のそれぞれでのＯＨ６−ＮＣＳの蛍光の予備的な評価は、ＤＭＳＯ中のＯＨ６の０．０１ｍＭ溶液について行った。図１４はＯＨ６−ＮＣＳのＵＶ−可視スペクトルを示し、その主要な吸収帯を確認できる。残念ながら、レーザー線はＯＨ６−ＮＣＳをそのソレー帯λｍａｘで励起するために入手できなかった。図１５は４２２ｎｍ（最適）、及び４種の波長、４５７、４７６、４８８、及び５１４ｎｍのアルゴンイオンレーザーで励起した場合のＯＨ６−ＮＣＳについての蛍光発光の相対的強度を示す。
【０１５１】
５１４ｎｍで励起した場合のＯＨ６−ＮＣＳの溶液によって発光した蛍光の強度が、４５７、４７６、及び４８８ｎｍの励起波長での蛍光発光よりおよそ３倍大きいことが示された。ＯＨ６−ＮＣＳのＵＶ−可視吸収スペクトルは、５１６ｎｍのアルゴン−イオンレーザー線がＯＨ６−ＮＣＳに適合する唯一の励起源であることを示した。３種の最も強いレーザー線、４５７、４７６、及び４８８ｎｍは、ＯＨ６−ＮＣＳのソレー帯及び第１帯の間の領域においてすべて励起し、一方、５１４線は５１６ｎｍでＱ帯と十分に重複した。
【０１５２】
別々に接合物ＯＨ６−ＮＣＳ−ＢＳＡ及び各々の３つのコントロールと温置した細胞培養物を、次いで、洗浄し及び固定した。次いで、温置した細胞を含むカバースリップを標準ガラス顕微鏡スライド上に注意して取り付け、画像化の準備をした。すべての４種のアルゴン−イオンレーザー線を試験するが、予想通り、蛍光の良好な解像度は５１４ｎｍのレーザー線を用いることでのみ達成することができた。
【０１５３】
ＯＨ６−ＮＣＳ−ＢＳＡと温置したヒーラ細胞のＺ−系列の蛍光画像を図１６に示す（この図は左上から右下に見るべきである）。連続した区分を、顕微鏡によって分離された各焦平面の間の２μＭのステップで走査し、従って、細胞内での接合物の局在性の３次元の可視化を可能にする。明らかに、接合物ＯＨ６−ＮＣＳ−ＢＳＡが細胞に入り、細胞の取り込みの性質の研究は行っていないが、取り込みが飲食細胞運動によって起こっている可能性が最も高い。接合物が核に入らないと思われ、細胞質の至るところに大部分分布していることがわかった。
【０１５４】
画像化のとき、ＢＳＡコントロール又はＰＢＳコントロールと温置した細胞は、極めて低い、かろうじて検出できる程度の蛍光のみを示し、通常の程度の細胞の自己蛍光のせいである。ＯＨ６−ＮＨ２（接合していないポルフィリンコントロール）の局在性を図１７に示すが、これは、ポルフィリンコントロール細胞のズーム画を伴うＣＬＳＭ画像を示す。細胞内から発する蛍光は観察されず、代わりに、大多数のＯＨ６−ＮＨ２は形質膜上に局在した。明らかに、接合物のＢＳＡ成分はポルフィリンが細胞の内部に運ばれるのを促進するために必要である。
【０１５５】
要約すれば、ポルフィリン−ＢＳＡ接合物の細胞での局在性が、共有結合性のチオ尿素結合の形成によって構成され、通常のＣＬＳＭ技術を用いて画像化できることが示された。接合していないポルフィリンＯＨ６−ＮＨ２は、細胞の膜を浸透しないことがわかったが、有意な程度の蛍光がＯＨ６−ＮＣＳ−ＢＳＡと温置した細胞の内部から検出され、良好な接合物の浸透が示された。
【図面の簡単な説明】
【図１】緩衝液交換した１７．１Ａの抗体等を負荷したゲルを示す図である。
【図２】透析した１７．１Ａの抗体等を負荷したゲルを示す図である。
【図３】緩衝液交換した１７．１Ａの抗体等を負荷したゲルを示す図である。
【図４】ＦＩＴＣ標識化１７．１Ａ及びＣｏｌｏ３２０細胞の結果を示す図である。
【図５】検出のためのＦＩＴＣ標識化した抗１７．１Ａ抗体と共にＯＨ６／１７．１Ａ接合物及びＣｏｌｏ３２０細胞を用いた結果を示す図である。
【図６】検出のためのＦＩＴＣ標識化した抗１７．１Ａ抗体と共にＰＹＲ／１７．１Ａ接合物及びＣｏｌｏ３２０細胞を用いた結果を示す図である。
【図７】ＦＩＴＣ標識化ＯＸ−３４を用いた結果を示す図である。
【図８】ＯＨ６／ＯＸ−３４接合物のコントロール実験の結果を示す図である。
【図９】ＰＹＲ／ＯＸ−３４接合物のコントロール実験の結果を示す図である。
【図１０】キャップＯＨ６の更なるコントロール実験の結果を示す図である。
【図１１】キャップＰＹＲの更なるコントロール実験の結果を示す図である。
【図１２】ＯＨ６／１７．１Ａ接合物の種々の希釈率の結果を示す図である。
【図１３】ＰＹＲ／１７．１Ａ接合物の種々の希釈率の結果を示す図である。
【図１４】ＯＨ６−ＮＣＳのＵＶ−可視スペクトルを示す図である。
【図１５】４種の波長で励起した場合のＯＨ６−ＮＣＳの蛍光発光の相対的強度を示す図である。
【図１６】ＯＨ６−ＮＣＳ−ＢＳＡと温置したヒーラ細胞のＺ−系列の蛍光画像を示す図である。
【図１７】ＯＨ６−ＮＨ２の局在性を示す図である。
〔発明の属する技術分野〕
本発明は、新規なポルフィリン及びポルフィリン系発色団及びポルフィリン及びポルフィリン系発色団の組合せに関し、これらは特に、光化学治療及び蛍光分析及び画像処理を含む光線力学的な適用に広く有用である。
【０００２】
〔従来の技術〕
例えば蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）における研究道具、及び光線力学的治療（ＰＤＴ）におけるインビボでの標的にされた細胞の消滅をもたらすための治療薬としての、ポルフィリン及びポルフィリン系発色団の双方の重要性は、この技術で広く認識されている。これらの適用のそれぞれは、入射光線によって一重項の励起状態に励起され、及び結果的なエネルギーの放出を伴ってより一層低いエネルギー状態に減衰されるべき発色団の能力に依存する。このエネルギーは特定の波長での蛍光の光の形態で放出される場合があり、それによって、減衰する発色団に付着した細胞又は生物学的構造物が、可視化され、及び／又はＦＡＣＳによって選別され得る。あるいはまた、励起のエネルギーは、最初の一重項発色団の三重項励起状態への転換によって逸散され、次いで、二原子酸素のような他の三重項へエネルギーを転移し、結果的な一重項酸素の形成を伴うことがある。一重項酸素は強力な細胞障害性の薬剤であり、従ってこの後者の過程が細胞においてか又は細胞のすぐ近くで発生すると、それは通常その細胞に死を招く。したがって、発色団は、その蛍光特性、及び光増感剤として働く能力の双方のために用いることができる。
【０００３】
明らかに、蛍光画像処理又は分析、又はＰＤＴのために、インビトロ又はインビボにおいて、ある程度の発色団の局在性の制御が必須である。このことは、特に、光線力学的治療において重要であり、発色団の減衰によって生成する一重項酸素の照射の代表的範囲が直径０．１μｍ未満の場合、結果として、標的細胞の死をもたらすために、発色団は通常その細胞のすぐそば、又は好ましくはその細胞内に位置しなければならない。
【０００４】
〔発明が解決しようとする課題〕
しかし、これまでに、ＰＤＴの目的のために、インビボでの特定の標的細胞に対するポルフィリンの光増感剤のターゲティングを制御することについて、わずかの試みが行われているに過ぎない。その代わり、代表的に、ポルフィリンが、腫瘍構造物からのリンパのドレナージがない場合には、腫瘍に蓄積する固有の傾向があることに信頼性が置かれている。Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（Ｒ）〔ホトフリン（登録商標）〕、ヘマトポルフィリン−ＩＸから酸でに処理によって誘導されるポルフィリン構造体の混合物からなる光増感性薬剤は、癌腫及び肉腫の処置に商業上用いられており、例えば、任意のターゲティング媒体又は手段を用いることなく、患者に従来どおり全身的に投与されている。このことは、明らかに、望ましくなく、光増感剤の間違った局在性が、光化学治療の効率を低下させるだけでなく、健康な細胞の死を招くことがある。
【０００５】
特に、ＦＡＣＳ及び蛍光画像処理の目的のために、発色団を適切なタンパク質送達分子に共有結合的に接合させることによって、発色団の生物学的標的へのインビトロでの特定の付着を達成するための努力が行われてきた。しかし、この手法は種々の問題にさらされた。第一に、細胞表面へのポルフィリン発色団の非特異的結合によって生じるバックグランド蛍光の程度を減少させるのが困難であることが分かった。第二に、発色団のタンパク質分子への付着によって、近位のタンパク質による著しい程度の励起状態のクエンチングが生じ、これが、マーカーとしてか、又は標的にされた光線力学的適用における発色団の有効性を明らかに減少させることが見出された。
これらの影響の減少が引き続き望ましい目標である。
【０００６】
〔課題を解決するための手段〕
したがって、本発明の１つの見地によれば、次の式（Ｉ）のポルフィリン発色団：
【化３７】
【化３８】
【化４２】
【化４３】
Ｒ２が親水性アリール部分であり；
Ｒ３がＨ又は親水性アリール又は親水性非芳香族部分であり；
及びＸ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４のそれぞれが、無関係に、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、Ｃ１〜３アルキル及びＯＣ１〜３アルキルから選ばれるか、又は隣接するＣ−Ｃ結合を有するＸ１及びＸ２及び／又はＸ３及びＸ４がエポキシド又はシクロプロパニル構造を形成するように、Ｘ１及びＸ２及び／又はＸ３及びＸ４が互いに、Ｏ、ＣＨ２、ＣＨＣ１〜３アルキル、又はＣ（Ｃ１〜３アルキル）２から選ばれる架橋部分を形成し；
式中、前記Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が随意に、更に１又はそれ以上の回数、−ＯＨ、−ＣＮ、−ＮＯ２、ハロゲン，−Ｔ、又は−ＯＴ（式中、ＴがＣ１〜１５アルキル、シクロアルキル又はアリール基又はそれらのヒドロキシル化、ハロゲン化、硫酸化、スルホン化又はアミノ化誘導体又はそれらのカルボン酸、エステル、エーテル、ポリエーテル、アミド、アルデヒド又はケトン誘導体である。）によって置換されている。〕
を提供する。
【０００７】
本発明に従って発色団のコアの周りに１又はそれ以上の親水性置換基を含めることは、タンパク質の生物学的接合（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）において通常用いられる塩基性緩衝液／ＤＭＳＯ又はＤＭＦ共溶液中での高められた溶解度を招く。また、高められた親水性は、非共有結合的にタンパク質に結合する発色団の傾向を著しく低下させる。発色団が、例えば、ＰＤＴ又はＦＡＣＳの目的のために、所定の細胞又は組織に送達するためのモノクローナル抗体のようなターゲティングタンパク質に接合すべきである場合、発色団とタンパク質との間の非共有結合の減少は、発色団が細胞表面に非特異的に転移する程度を減少させ、興味のある細胞又は組織への発色団のターゲティングの精度を実質的に向上させる。
【０００８】
したがって、本発明の他の見地はまた、それぞれが親水性又は両親媒性部分を有する１又はそれ以上の親水性発色団、及びあまり親水性でない複数の物質及び／又は分子を含む混合物を分離するにあたり、前記混合物を疎水性溶離液に導入し、及び、前記１又はそれ以上の発色団が前記固相上に停止すると共に前記物質及び／又は分子が前記固相から前記溶出溶媒によって溶出するか、又は実質的に溶出するように、前記混合物及び前記溶出溶媒を親水性又は極性固相上に通す工程を含む方法を提供する。
【０００９】
例えば、前記方法は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｒ）〔セファデックス（登録商標）、（デキストラン）〕カラム、又は逆相ＨＰＬＣ上のクロマトグラフィを含む。代表的に、前記あまり親水性でない物質及び／又は分子の混合物は、細胞及び／又は膜の混合物を含むことができる。有利には、前記１又はそれ以上の親水性発色団は、本発明にかかる１又はそれ以上の発色団を含む。
【００１０】
いくつかの具体例では、Ｘ１〜Ｘ４のそれぞれか、又はいくつかがＨである。しかし、特に好ましい具体例では、Ｘ１〜Ｘ４のそれぞれがＯＨである。したがって、前記発色団は、上記式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）又は（Ｖ）のジヒドロキシクロリン又は上記式（ＶＩ）又は（ＶＩＩ）のテトラヒドロキシバクテリオクロリンであってもよい。ジヒドロキシクロリン及びテトラヒドロキシバクテリオクロリンの親水性は、相当するポルフィリンのものよりも、発色団のコアの周りの特別な親水性ヒドロキシ基の存在によって、高いことが見出される。
【００１１】
好ましくは、前記アリール部分Ｒ１はフェニル環を含んでおり、このフェニル環は、前記発色団の大環状コアに、単結合によって連結しているのが好ましく、あるいはまたＣ１〜６の分枝状又は線状アルキル鎖によってそれに連結していてもよい。有利には、前記接合基Ｚは前記フェニル環にそのパラ（４’）位に連結することができる。
【００１２】
接合基Ｚは、ポリペプチド分子上のアミン基に共有結合で結合することができる基；例えば、イソシアナート、イソチオシアナート、又はＮＨＳエステル基を含むことができる。したがって、有利には、前記ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリンの周りのメソ置換基のそれぞれが、前記接合基Ｚに共有結合することになる場合がある−ＮＨ２、−ＮＨ２ ＋−又は−ＮＨ３ ＋を含まないべきである。このことは、前記発色団内の内部架橋の可能性を減少させるように働く。あるいはまた、前記接合基Ｚは、他の任意のタンパク質接合基、例えば、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）、マレアミド、ヨードアセトアミド、ケトン又はアルデヒドを含むことができる。かかる基のタンパク質分子への接合を達成する方法は、この技術において既知である。
【００１３】
特に好ましい具体例では、前記接合基はイソチオシアナート基を含む。イソチオシアナートはリジン残基とたやすく反応してタンパク質に対する安定な連鎖を生じ、従って本発明の発色団の生物学的接合にとって特に安定である。
【００１４】
前記接合基Ｚは前記アリール部分Ｒ１に単結合によって直接連結されることができる。あるいはまた、前記接合基Ｚは、前記アリール部分Ｒ１に、比較的高い程度の剛直性及び／又は立体障害を有する連結部分によって連結され得る。前記連結部分は、例えば、１０００ｇモル−１よりも大きくない全分子量を有する融合されたか、又は連結されたシクロアルキル及び／又はシクロアルキル環構造物の鎖を含むことができる。特に、前記連結部分は、アントラセン、アクリジン、アントラニル、ナフチル又はナフタレン部分、又はポリアセチレン、フェニルアセチレン、又はポリフェニルアセチレン部分を含むことができる。前記発色団がポリペプチド分子に対する前記接合基Ｚによって接合する場合、従って前記連結部分が前記ポリペプチドとは別の前記発色団の光活動性のコアを保持する役目を果たすことができ、これによって、前記発色団が蛍光を生じる場合に前記ポリペプチドによって生じることがある蛍光消光（クエンチング）を減少させるのに役立つ。前記連結部分は上述した種類の親水性又は両親媒性部分、例えば、Ｃ２〜Ｃ３０ポリエチレングリコール部分を含むことができる。このことは、発色団の親水性が前記連結部分の存在によって損なわれないことを確実にするのに役立つ。
【００１５】
随意に、前記アリール部分Ｒ１は、更に１又はそれ以上の、ヒドロキシのような、前記発色団の親水性を改善する役目を果たす、親水性置換基によって置換されていてもよい。
【００１６】
前記親水性アリール部分Ｒ２は、フェニル環を含んでいることができ、このフェニル環が１又はそれ以上の回数、好ましくは少なくとも２回、１又はそれ以上の親水性置換基によって置換されていてもよく、この親水性置換基は前記アリール部分Ｒ２の親水性を高める役目を果たす。前記フェニル環は、好ましくは、単結合によって、前記発色団の大環状コアに連結されるか、又は代わりに、Ｃ１〜６の分枝状又は線状アルキル鎖によってそれに連結されてもよい。あるいはまた、前記親水性アリール部分Ｒ２は、ピリジル又は四級化（ｑｕａｒｔｅｎｉｓｅｄ）ピリジル｛ピリジニウミル（ｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍｙｌ）｝環のようなヘテロアリール環を含んでよく、ヘテロアリール環は随意に１又はそれ以上の回数、好ましくは少なくとも２回、１又はそれ以上の親水性置換基によって置換されることができ、親水性置換基は前記アリール部分Ｒ２の親水性を高める役目を果たす。前記ヘテロアリール環は、好ましくは、単結合によって、前記発色団の大環状コアに連結されるか、又は代わりに、Ｃ１〜６の分枝状又は線状アルキル鎖によってそれに連結されてもよい。前記１又はそれ以上の親水性置換基は、有利には、ヒドロキシ；メトキシ又はエトキシのようなアルコキシ；Ｃ２〜Ｃ１５ポリエチレングリコール；Ｎ−メチルピリジニウミルのような四級化ピリジル（ピリジニウミル）；モノ−、ジ−又はポリ−糖類；Ｃ１〜６アルキルスルホン酸；ホスホニウム基Ｒ４Ｐ（Ｒ５）（Ｒ６）（Ｒ７）（式中、Ｒ４が、単結合か、又はＣ１〜６アルキルであり、及びＲ５、Ｒ６及びＲ７のそれぞれが、無関係に、水素、フェニル環のようなアリール環、ピリジル環のようなヘテロアリール環、及びＣ１〜６アルキル鎖から選ばれ、これらアリール環、ヘテロアリール環又はＣ１〜６アルキル鎖が置換されていないか、又は１又はそれ以上の回数、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルキル又はアルコキシ、アリール、オキソ、ハロゲン、ニトロ、アミノ又はシアノによって置換されている。）；又はリン酸基又はホスホネート基｛それぞれ、Ｒ８ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ９）（ＯＲ１０）又はＲ８Ｐ（Ｏ）（ＯＲ９）（ＯＲ１０）で表され、式中、Ｒ８が、単結合か、又はＣ１〜６アルキルであり、及びＲ９及びＲ１０のそれぞれが無関係に水素及びＣ１〜６アルキルから選ばれている。｝から選ぶことができる。好ましくは、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７のそれぞれは同じであることができ、及び有利には、置換されていないフェニルでよい。適切には、前記Ｒ８はメチルでよい。有利には、前記Ｒ９及びＲ１０は同じであることができ、及び／又はメチル又はエチルでよい。
【００１７】
特に好ましい具体例では、前記親水性アリール部分Ｒ２は、
ｍ，ｍ−（ジヒドロキシ）フェニル
【化４４】
ｍ，ｍ，ｐ−（トリヒドロキシ）フェニル
【化４５】
ｏ，ｐ，ｏ−（トリヒドロキシ）フェニル
【化４６】
ｐ−（メチルトリフェニルホスホニウム）フェニル
【化４７】
ｐ−メチルホスホノ−ジ−エトキシ）フェニル
【化４８】
ｐ−メチルホスホナト−ジ−エトキシ）フェニル
【化４９】
ｍ−又はｐ−（Ｎ−メチル−ピリジニウミル）フェニル
【化５０】
【化５１】
から選ばれる。
【００１８】
他の好ましい具体例では、前記親水性アリール部分Ｒ２は、ｐ−Ｎ−（Ｃ１〜６アルキル）ピリジニウミル基又はｍ−Ｎ−（Ｃ１〜６アルキル）ピリジニウミル基のような四級化ピリジル（ピリジニウミル）基を含む。四級化ピリジル（ピリジニウミル）基は高度に親水性であり、及び本発明の発色団に組み込まれる場合、有利な特性を示す。この点で特に好ましい基は、ｍ−又はｐ−Ｎ−（（Ｃ１〜６）アルキル）ピリジニウミル基、例えば、ｍ−Ｎ−メチルピリジニウミル
【化５２】
【化５３】
【００１９】
他の特に好ましい具体例では、前記四級化ピリミジニウミル基は、ｐ−Ｎ−（Ｃ１〜６アルキルスルホン酸）ピリジニウミル又はｍ−Ｎ−（Ｃ１〜６アルキルスルホン酸）ピリジニウミル；特に、ｐ−Ｎ−（プロピルスルホン酸）ピリジニウミル
【化５４】
【化５５】
【００２０】
好ましくは、その又はそれぞれの四級化ピリジニウミル基Ｒ２は、ヨウ化物対イオン、又は、最も好ましい具体例では、塩化物対イオンのようなハロゲン化物対イオンと結び付くことができる。
【００２１】
いくつかの有利な具体例では、Ｒ３はＨであり、前記発色団は５，１５−ジアリール−ポルフィリン、−クロリン又は−バクテリオクロリンを構成する。他の有利な具体例では、前記Ｒ３は、親水性アリールであるか、又は非芳香族部分である。例えば、前記Ｒ３は、Ｒ２に関して、上記に規定するように親水性アリール部分を含むことができる。前記親水性アリール部分Ｒ３は、前記親水性アリール部分Ｒ２と同じでよく、発色団は、その１０，１５及び２０位に同じ置換基を持つか；又は前記親水性アリール部分Ｒ２と異なっていてもよい。あるいはまた、前記Ｒ３は、１又はそれ以上の回数、ヒドロキシ又はＣ２〜１５ポリエチレングリコールのような１又はそれ以上の親水性置換基によって置換されているＣ１〜６アルキル鎖のような親水性のアルキル部分を含むことができる。特に好ましい具体例では、前記Ｒ３は、１，２−ジヒドロキシエチルのようなポリヒドロキシ（Ｃ１〜６アルキル）からなる。
【００２２】
Ｒ２がＲ３と同じ本発明の発色団は、この技術において既知の方法、例えば、ピロールを用いるベンズアルデヒドの酸触媒縮合によるか、又はジピロメタンからのポルフィリンを合成するための“ＭａｃＤｏｎａｌｄ（マクドナルド）２＋２”法〔Ａｒｓｅｎａｕｌｔ（アルセナート）等のＪ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６０，８２：４３８４〜４３８９−参考として本明細書に組み入れる。〕に従って合成することができる。
【００２３】
本発明の５−イソチオシアナトフェニル−１５−ピリジニウムポルフィリン、クロリン及びバクテリオクロリンを合成するための一般化された図式を、次の図式１として提示するが、式中、“ＲＸ”は、式（Ｉ）から（ＶＩＩ）に関して上記に規定するようなＣ１〜６アルキル又は親水性置換基のような四級化する基を示す：
【化５６】
本発明の５−イソチオシアナトフェニル−１５−メチルホスホニウムフェニルポルフィリン、クロリン及びバクテリオクロリンを合成するための一般化された図式を、次の図式２として提示するが、式中、Ｒは、水素、Ｃ１〜６アルキル、ヘテロ環式基又は芳香族基を示す：
【化５７】
Ｒ２及び随意にＲ３がピリジニウミルフェニルからなる本発明のポルフィリン、クロリン及びバクテリオクロリンは、図式３として次に提示する一般化された反応図式に従って合成することができ、式中、“Ｒ”は、式（Ｉ）から（ＶＩＩ）に関して上記に規定するような水素か、又は１又はそれ以上の親水性置換基を示す：
【化５８】
前記Ｒ２及び随意にＲ３がアルキルホスホナトフェニル又はアルキルホスホノフェニルからなる本発明のポルフィリン、クロリン及びバクテリオクロリンは、図式４として次に提示する一般化された反応図式に従って合成することができ、式中、“Ｒ”は、ＯＨ、ＯＮａ、又はＯ（Ｃ１〜６アルキル）を示す：
【化５９】
本発明の更なる見地においては、５，１０，１５及び２０メソ−位に選定された置換基を有する５，１０，１５，２０−テトラ−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリン発色団を合成するための新規な方法であって；５，１５−ジ−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリン発色団を提供する工程；脱離基Ｑを前記発色団の１０及び２０メソ−位に付着させる工程であって、脱離基Ｑがハロゲン化物及びトリフレートから選ばれている工程；連関（カップリング）試薬（Ｒ１１Ｏ）（Ｒ１２Ｏ）ＢＲ１３を提供する工程であって、Ｒ１１及びＲ１２が、無関係に、Ｈ又はＣ１〜６アルキルから選ばれているか、又はＲ１１及びＲ１２が互いに前記２つのＯ原子でつながれているＣ１〜６アルキル鎖を構成し、及びＲ１３が、上記Ｒ３に関して規定される親水性アリール部分のようなビニル又はアリールである工程；及び前記発色団と前記連関試薬とを、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、炭酸セシウム及び水酸化バリウムから選ばれる塩基、及びＰｄ０触媒の存在下に反応させる工程を含み；前記Ｒ１３を前記発色団の１０−及び２０−メソ位で前記離脱基Ｑと交換する方法を提供する。
【００２８】
ボロン酸又はボロンエステル試薬を用いるＰｄ０−触媒Ｓｕｚｕｋｉ（スズキ）カップリング反応は、この技術において既知であり、及び例えば、Ｍｉｙａｕｒａ（ミヤウラ）及びＳｕｚｕｋｉの、オルガノボロン化合物のパラジウム−触媒クロス−カップリング反応、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．（１９９５）９５：２４５７〜２４８３に記載されており；その開示を参考としてここに組み入れる。しかし、これまでに、ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリンのメソ−位で、選定された置換基を前記メソ位上に取り込む手段として、Ｓｕｚｕｋｉ−カップリングを行う試みは失敗している。しかし、本発明者は、本発明にかかる反応条件下に、Ｓｕｚｕｋｉ−カップリングが、出発ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリンの１０−及び２０−メソ位で速やかに及び首尾よく進むことを見出した。この方法は、それに関して、テトラ−メソ−置換されたポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリンの都合のよい合成をＳｕｚｕｋｉ−カップリングによって可能にする。
【００２９】
前記脱離基Ｑは、塩化物、臭化物、ヨウ化物又はトリフレート（トリフルオロメタンスルホネート）でよい。適切には、前記離脱基Ｑは臭化物でよい。ジ−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリンのメソ−ブロム化のための方法は、この技術において既知である。例えば、前記５，１５−ジ−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリン発色団は、その１０−及び２０−メソ−位で、ブロモスクシンイミドのようなハロスクシンイミドとの反応によりハロゲン化することができる。
【００３０】
前記連関試薬は、ボロン酸エステル又はボロン酸からなることができる。好ましい具体例では、前記Ｒ１１及びＲ１２のそれぞれはＨであり、前記連関試薬はボロン酸である。
【００３１】
有利には、前記５，１５−ジ−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリン発色団は、本発明の発色団であるか、又はその保護された形態である。したがって、前記５，１５−ジ−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリン発色団は、次の式（ＶＩＩＩ）のポルフィリン発色団：
【化６０】
【化６１】
【化６５】
式中、Ｒ４は、式（Ｉ）から（ＶＩＩ）に関して上記に規定するような基Ｒ１であるか、又はその保護形態であるか、又はそれに対して転換できる基であり；Ｒ５は、式（Ｉ）から（ＶＩＩ）に関して上記に規定するような基Ｒ２であるか、又はその保護形態であるか、又はそれに対して転換できる基であり；及びＸ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４のそれぞれは、無関係に、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、Ｃ１〜３アルキル及びＯＣ１〜３アルキルから選ばれるか、又は隣接するＣ−Ｃ結合を有するＸ１及びＸ２及び／又はＸ３及びＸ４がエポキシド又はシクロプロパニル構造を形成するように、Ｘ１及びＸ２及び／又はＸ３及びＸ４は互いに、Ｏ、ＣＨ２、ＣＨＣ１〜３アルキル、又はＣ（Ｃ１〜３アルキル）２から選ばれる架橋（ｂｒｉｄｇｉｎｇ）部分を形成する。
【００３２】
したがって、式中、Ｒ１３は、Ｒ３に関して上記に規定するような親水性アリール置換基であり、また、前記５，１０，１５，２０−テトラ−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリン発色団は、本発明の発色団を構成することができる。
【００３３】
前記Ｐｄ０触媒は、例えば、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２、又はＰｄ（ＯＡｃ）２からなることができる。有利には、前記Ｐｄ０触媒はＰｄ（ＰＰｈ３）４からなることができる。
【００３４】
前記連関反応は、溶媒中で行われ、溶媒はトルエン又はドライＴＨＦから選ぶことができる。連関反応はドライＴＨＦ中ですばやく進むことがわかったので、ドライＴＨＦが溶媒として好ましい。
【００３５】
随意に、式中、前記Ｒ１３はビニルであり、前記５，１０，１５，２０−テトラ−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリン発色団は、前記連関反応に次いで、前記１０−及び２０−ビニル置換基をヒドロキシアルキルに転換させるような、ＯｓＯ４を用いるオスミレーション反応を受けさせることができる。前記オスミレーション反応は、ポルフィリンをジ−ベータ−ヒドロキシ−クロリンに転換し次いでテトラ−ベータ−ヒドロキシ−バクテリオクロリンにするのに適切な条件と同じ条件下で行うことができる。この工程が、本発明により、ＤｉＭａｇｎｏ（ジマグノ）等のＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９３：５８，５９８３〜５９９３，（参考としてここに組み入れる。）に記載されたビニルトリブチルスズを連関試薬として用いる方法に従って、前記５，１５−ジ−メソ−置換発色団において行われたＰｄ−触媒Ｓｔｉｌｌｅ（シュティレ）カップリングによる方法のような本発明の方法によらないで得られた５，１０（ビニル），１５，２０（ビニル）−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリン発色団上でも行えることが注目される。
【００３６】
前記テトラ−メソ−置換発色団がポルフィリン又はクロリン発色団である場合、前記発色団は、それぞれ、この技術における熟練者に既知の方法に従って、クロリン又はバクテリオクロリン発色団にか、又はバクテリオクロリン発色団に転換させることができる。例えば、前記ポルフィリン又はクロリン発色団は、ジ−ベータ−ヒドロキシ−クロリン又はテトラ−ベータ−ヒドロキシ−バクテリオクロリンを生成させるような、ＯｓＯ４を用いる反応によってオスミレーションすることができる。
【００３７】
本発明にかかる反応のための一般化された図式を次の図式５及び６において提示する。図式５において、“Ｒ” 及び“Ｒ１”は、それぞれ、Ｒ２及びＲ３のそれぞれに関して上記に規定するような１又はそれ以上の親水性置換基を示す。図式６において、“Ｒ” は、Ｒ２に関して上記に規定するような１又はそれ以上の親水性置換基を示し、及び“Ｘ”は炭素又は窒素原子を示す。
【化６７】
本発明の他の見地において、５，１５−ジフェニルポルフィリン、５，１５−ジフェニルクロリン又は５，１５−ジフェニルバクテリオクロリン発色団であって、５−及び１５−フェニル基のそれぞれのオルト−、メタ−、及び／又はパラ−位のそれぞれが、置換基Ｐ１〜Ｐ５及びＱ１〜Ｑ５のそれぞれによって置換されており、それら置換基が無関係にＨ又は不活性置換基であり、この置換基が他の置換基Ｐ１〜Ｐ５及びＱ１〜Ｑ５と相まって発色団の蛍光特性を実質的に損なうことなく；及び発色団が更に接合基Ｚを含み、この接合基がインビトロ又はインビボの所定の生物学的標的に発色団を送達するためのポリペプチド分子に前記発色団を接合させることができる発色団を提供する。
【００３９】
かかる発色団は、新規であり、及びそれぞれが、異なり及び実質的に重なりのない波長での蛍光の光を発光させる励起において有能である。上記に示したように、接合基Ｚの提供は、本発明の発色団が所定の生物学的標的を特異的に標的にするのを可能にし、従って、インビトロ又はインビボでの発色団の局在性の制御を促進する。したがって、本発明の発色団は、蛍光分析及び画像処理適用（ＦＡＣＳを含む）、又はＰＤＴにおいて、有効に用いることができる。
【００４０】
有利には、前記蛍光色素は、次の化合物：
【化６９】
【００４１】
上記化学構造式において、Ｚは、明確にするために除外している。しかし、前記Ｚ置換基は、各発色団の任意の１〜４，６〜１４，又は１６〜２０位に付着することができるか、又は置換基Ｐ１〜Ｐ５又はＱ１〜Ｑ５の１つでよいか、又は前記置換基Ｐ１〜Ｐ５又はＱ１〜Ｑ５の１つによって５−又は１５−フェニル基の１つに付着することができる。
【００４２】
いくつかの具体例において、Ｐ１〜Ｐ５のそれぞれは、前記２つの主要なフェニル環が対称的に置換されるように、前記Ｑ１〜Ｑ５の相当する１種と同じであるか、又は実質的に同じである。他の具体例では、Ｐ１〜Ｐ５の１又はそれ以上は、前記２つの主要なフェニル環が対称的に置換されないように、Ｑ１〜Ｑ５の相当する１種と同じでない。特に、Ｐ１〜Ｐ５のすべて及び／又はＱ１〜Ｑ５のすべては、前記２つの主要なフェニル環の一方又は双方が置換されないように、Ｈからなることができる。
【００４３】
有利には、前記置換基Ｐ１〜Ｐ５及びＱ１〜Ｑ５が、全体として、前記発色団の自発的酸化の速度を減少させるのに十分な程度の前記発色団のコアの周りの立体障害を提供し、前記発色団が空気中で実質的に不活性であるが、実質的な範囲で、前記発色団のコアの周りの２、３、７、８、１２、１３、１７又は１８位での選択的な付加又は置換を抑制しない。したがって、Ｐ１、Ｐ５、Ｑ１及びＱ５のそれぞれはＨでよい。代表的に、前記置換基Ｐ１〜Ｐ５のすべての累積的な分子量は１０００ｇモル−１を超えず、及び前記置換基Ｑ１〜Ｑ５のすべての累積的な分子量は１０００ｇモル−１を超えない。
【００４４】
前記置換基Ｐ１〜Ｐ５及びＱ１〜Ｑ５の１又はそれ以上は、−ＯＨ、−ＣＮ、−ＮＯ２、ハロゲン、−Ｔ、又は−ＯＴからなることができ、式中、ＴはＣ１〜１５アルキル、シクロアルキル又はアリール基又はそれらのヒドロキシル化、ハロゲン化、硫酸化又はアミノ化誘導体又はそれらのカルボン酸、エステル、エーテル、ポリエーテル、アミド、アルデヒド又はケトン誘導体である。前記置換基Ｐ１〜Ｐ５及びＱ１〜Ｑ５の１又はそれ以上は、追加として又は代わりに、Ｃ３〜１２シクロアルキル及び／又はアリール環構造、又は２と６との間の、好ましくは２〜３の、融合されたか、又は連結されたＣ３〜１２シクロアルキル及び／又はアリール環構造からなることができ、それらの環構造のそれぞれが随意に１又はそれ以上のＮ、Ｏ又はＳ原子を含むことがある。特に、１又はそれ以上の前記置換基Ｐ１〜Ｐ５及びＱ１〜Ｑ５は、Ｎ−メチルピリジル（ピリジニウミル）基のような四級化アミン又はピリジル基からなることができる。
【００４５】
好ましくは、Ｐ１〜Ｐ５及びＱ１〜Ｑ５の１種は前記接合基Ｚからなる接合置換基である。特に好ましい具体例では、前記接合置換基はＰ３又はＱ３であり、前記接合基Ｚは２つの主要なフェニル環の１つのパラ位上に提供される。
【００４６】
適切には、前記接合基は、本発明の第１の見地に関して上記に規定されるようなものである。
【００４７】
特に、前記置換基Ｐ１〜Ｐ５及びＱ１〜Ｑ５の１又はそれ以上は、前記接合置換基でなく、Ａ１Ｚ１Ａ１４
からなる群より無関係に選ばれる一員からなることができ、式中、Ｚ１は、Ｚ２、Ｚ２Ａ５又はＺ２Ａ５Ａ６であり；
Ａ１及びＡ５は、無関係に、−（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−Ｃ（Ｙ）（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−Ｃ（Ｙ）Ｙ’（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−Ｃ（Ｙ）ＮＡ４（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−ＮＡ４Ｃ（Ｙ）（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−ＮＡ４（ＣＡ２Ａ３）ｎ、−ＹＣ（Ｙ’）（ＣＡ２Ａ３）ｎ−及び−Ｙ（ＣＡ２Ａ３）ｎ−から選ばれており；ｎ＝０〜６であり；Ｙ及びＹ’は無関係にＯ又はＳであり；Ａ２、Ａ３及びＡ４は無関係にＨ又はＣ１〜２アルキルであり、このアルキルは置換されていないか、又は１又はそれ以上のフッ素によって置換されており；
Ａ６＝−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｍ−又は−Ｓ（Ｏ）ｐであり；ｍ＝１〜１２であり；ｐ＝０〜２であり；
Ｚ２は単結合又はＺ３であり；Ｚ３はＺ４、Ｚ５及びＺ６から選ばれており、このＺ３は、置換されていないか、又は１又はそれ以上の回数、ＯＨ、ハロ、ＣＮ、ＮＯ２、Ａ１Ａ１０、Ａ６Ａ８、ＮＡ１０Ａ１１、Ｃ（Ｙ）Ａ７、Ｃ（Ｙ）Ｙ’Ａ７、Ｙ（ＣＨ２）ｑＹ’Ａ７、Ｙ（ＣＨ２）ｑＡ７、Ｃ（Ｙ）ＮＡ１０Ａ１１、Ｙ（ＣＨ２）ｑＣ（Ｙ’）ＮＡ１０Ａ１１、Ｙ（ＣＨ２）ｑＣ（Ｙ’）Ａ９、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）ＮＡ１０Ａ１１、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ａ１１、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｙ’Ａ９、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｚ６、Ｃ（ＮＡ１０）ＮＡ１０Ａ１１、Ｃ（ＮＣＮ）ＮＡ１０Ａ１１、Ｃ（ＮＣＮ）ＳＡ９、ＮＡ１０Ｃ（ＮＣＮ）ＳＡ９、ＮＡ１０Ｃ（ＮＣＮ）ＮＡ１０Ａ１１、ＮＡ１０Ｓ（Ｏ）２Ａ９、Ｓ（Ｏ）ｒＡ９、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｃ（Ｙ’）ＮＡ１０Ａ１１、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｃ（Ｙ’）Ａ１０又はＺ６によって置換されており；ｑ＝０、１又は２であり；ｒ＝０〜２であり；Ａ７は無関係にＨ及びＡ９から選ばれており；Ａ８はＯ又はＡ９であり；Ａ９はＣ１〜４アルキルであり、このアルキルは置換されていないか、又は１又はそれ以上のフッ素によって置換されており；Ａ１０はＯＡ９又はＡ１１であり；Ａ１１は、Ａ７であるか、又はＡ１０及びＡ１１がＮＡ１０Ａ１１としてのときには、それらが窒素と共に、炭素原子だけからなるか、又は炭素原子と、Ｏ、Ｎ及びＳから選ばれる少なくとも１つのヘテロ原子とからなる５乃至７員環を形成することができ；
Ｚ４はＣ６〜１２アリール又はアリールオキシＣ１〜３アルキルであり；
Ｚ５は、フラニル、テトラヒドロフラニル、インダニル、インデニル、テトラヒドロピラニル、ピラニル、チオピラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロチエニル、チエニル、１又は２の不飽和結合を含むＣ３〜８シクロアルキル又はＣ４〜８シクロアルキル、及びＣ７〜１１ポリシクロアルキルから選ばれており；
Ｚ６は、Ｎ−アゾリル、ジオキサジアジニル、ジオキサジアゾリル、ジオキサニル、２−Ｎ−ジオキサトリアジニル、ジオキサジニル、Ｎ−ジオキサゾリル、ジオキソリル、ジチアジアジニル、ジチアジアゾリル、Ｎ−ジチアトリアジニル、ジチアジニル、Ｎ−ジチアゾリル、１−Ｎ−イミダゾリル、Ｎ−モルフォリニル、ピロールイル、テトラゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、オキサジニル、オキサゾリル、ナフチドリニル、オキサジアジニル、オキサジアゾリル、オキサテトラジニル、オキサトリアジニル、オキサトリアゾリル、オキサジニル、オキサゾリル、ペンタジニル、フタルアジニル、Ｎ−ピペリジニル、Ｎ，Ｎ−ピペラジニル、１−Ｎ−ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニル、テトラチアジニル、テトラジニル、１−Ｎ−テトラゾリル、テトロキサジニル、チアジアジニル、チアジアゾリル、チアテトラジニル、チアトリアジニル、チアトリアゾリル、チアゾリル、トリアジニル、１−Ｎ−トリアゾリル、トリオキサダジニル、トリオキサニル、トリオキサジニル、トリオキサゾリル、トリチアジアジニル、トリチアジニル、トリチアジアゾリルから選ばれており；
Ｚ４、Ｚ５又はＺ６は、Ｚ４、Ｚ５及びＺ６から無関係に選ばれる１又はそれ以上の他の構成員に融合することができ；
Ａ１４は、水素、メチル、ヒドロキシ、アリール、ハロ置換アリール、アリールオキシＣ１〜３アルキル、ハロ置換アリールオキシＣ１〜３アルキル、インダニル、インデニル、Ｃ７〜１１ポリシクロアルキル、テトラヒドロフラニル、フラニル、テトラヒドロピラニル、ピラニル、テトラヒドロチエニル、チエニル、テトラヒドロチオピラニル、チオピラニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、又は１又は２の不飽和結合を含むＣ４〜６シクロアルキル｛シクロアルキル又は複素環式部分が置換されていないか、又は１〜３のメチル基、１つのエチル基、又はヒドロキシル基によって置換されている。｝である。
【００４８】
前記接合置換基は、Ａ１Ｚ１Ｚからなる群より選ばれる一員からなることができ、
式中、Ｚ１はＺ２、Ｚ２Ａ５又はＺ２Ａ５Ａ６であり；
Ａ１及びＡ５は、無関係に、−（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−Ｃ（Ｙ）（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−Ｃ（Ｙ）Ｙ’（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−Ｃ（Ｙ）ＮＡ４（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−ＮＡ４Ｃ（Ｙ）（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−ＮＡ４（ＣＡ２Ａ３）ｎ、−ＹＣ（Ｙ’）（ＣＡ２Ａ３）ｎ−及び−Ｙ（ＣＡ２Ａ３）ｎ−から選ばれており；ｎ＝０〜６であり；Ｙ及びＹ’は無関係にＯ又はＳであり；Ａ２、Ａ３及びＡ４は無関係にＨ又はＣ１〜２アルキルであり、このアルキルは置換されていないか、又は１又はそれ以上のフッ素によって置換されており；
Ａ６＝−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｍ−又は−Ｓ（Ｏ）ｐであり；ｍ＝１〜１２であり；ｐ＝０〜２であり；
Ｚ２は単結合又はＺ３であり；Ｚ３はＺ４、Ｚ５及びＺ６から選ばれており、 このＺ３は、置換されていないか、又は１又はそれ以上の回数、ＯＨ、ハロ、ＣＮ、ＮＯ２、Ａ１Ａ１０、Ａ６Ａ８、ＮＡ１０Ａ１１、Ｃ（Ｙ）Ａ７、Ｃ（Ｙ）Ｙ’Ａ７、Ｙ（ＣＨ２）ｑＹ’Ａ７、Ｙ（ＣＨ２）ｑＡ７、Ｃ（Ｙ）ＮＡ１０Ａ１１、Ｙ（ＣＨ２）ｑＣ（Ｙ’）ＮＡ１０Ａ１１、Ｙ（ＣＨ２）ｑＣ（Ｙ’）Ａ９、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）ＮＡ１０Ａ１１、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ａ１１、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｙ’Ａ９、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｚ６、Ｃ（ＮＡ１０）ＮＡ１０Ａ１１、Ｃ（ＮＣＮ）ＮＡ１０Ａ１１、Ｃ（ＮＣＮ）ＳＡ９、ＮＡ１０Ｃ（ＮＣＮ）ＳＡ９、ＮＡ１０Ｃ（ＮＣＮ）ＮＡ１０Ａ１１、ＮＡ１０Ｓ（Ｏ）２Ａ９、Ｓ（Ｏ）ｒＡ９、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｃ（Ｙ’）ＮＡ１０Ａ１１、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｃ（Ｙ’）Ａ１０又はＺ６によって置換されており；ｑ＝０、１又は２であり；ｒ＝０〜２であり；Ａ７は無関係にＨ及びＡ９から選ばれており；Ａ８はＯ又はＡ９であり；Ａ９はＣ１〜４アルキルであり、このアルキルは置換されていないか、又は１又はそれ以上のフッ素によって置換されており；Ａ１０はＯＡ９又はＡ１１であり；Ａ１１は、Ａ７であるか、又はＡ１０及びＡ１１がＮＡ１０Ａ１１としてのときには、それらが窒素と共に、炭素原子だけからなるか、又は炭素原子と、Ｏ、Ｎ及びＳから選ばれる少なくとも１つのヘテロ原子とからなる５乃至７員環を形成することができ；
Ｚ４はＣ６〜１２アリール又はアリールオキシＣ１〜３アルキルであり；
Ｚ５は、フラニル、テトラヒドロフラニル、インダニル、インデニル、テトラヒドロピラニル、ピラニル、チオピラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロチエニル、チエニル、１又は２の不飽和結合を含むＣ３〜８シクロアルキル又はＣ４〜８シクロアルキル、及びＣ７〜１１ポリシクロアルキルから選ばれており；
Ｚ６は、Ｎ−アゾリル、ジオキサジアジニル、ジオキサジアゾリル、ジオキサニル、２−Ｎ−ジオキサトリアジニル、ジオキサジニル、Ｎ−ジオキサゾリル、ジオキソリル、ジチアジアジニル、ジチアジアゾリル、Ｎ−ジチアトリアジニル、ジチアジニル、Ｎ−ジチアゾリル、１−Ｎ−イミダゾリル、Ｎ−モルフォリニル、ピロールイル、テトラゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、オキサジニル、オキサゾリル、ナフチドリニル、オキサジアジニル、オキサジアゾリル、オキサテトラジニル、オキサトリアジニル、オキサトリアゾリル、オキサジニル、オキサゾリル、ペンタジニル、フタルアジニル、Ｎ−ピペリジニル、Ｎ，Ｎ−ピペラジニル、１−Ｎ−ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニル、テトラチアジニル、テトラジニル、１−Ｎ−テトラゾリル、テトロキサジニル、チアジアジニル、チアジアゾリル、チアテトラジニル、チアトリアジニル、チアトリアゾリル、チアゾリル、トリアジニル、１−Ｎ−トリアゾリル、トリオキサダジニル、トリオキサニル、トリオキサジニル、トリオキサゾリル、トリチアジアジニル、トリチアジニル、トリチアジアゾリルから選ばれており；
Ｚ４、Ｚ５又はＺ６は、Ｚ４、Ｚ５及びＺ６から無関係に選ばれる１又はそれ以上の他の構成員に融合することができる。
【００４９】
本発明の特に好ましい具体例では、前記発色団は、次の（ｘ）、（ｙ）又は（ｚ）
として提示される構造を有する発色団からなることができ：
【化７６】
Ｒ Ｒ’
４−Ｈ ４−ＮＣＳ
４−Ｍｅ ４−ＮＣＳ
４−Ｂｒ ４−ＮＣＳ
４−ＣＯ２Ｍｅ ４−ＮＣＳ
３，４，５−トリス（ＯＭｅ） ４−ＮＣＳ
４−ＮＣＳ ４−ＯＭｅ
４−ＮＣＳ ４−Ｍｅ
４−ＮＣＳ ４−ＣＯ２Ｍｅ
４−ＮＣＳ ４−Ｂｒ
４−ＮＣＳ ４−ＣＮ
４−ＮＣＳ ４−ＣＯ２Ｍｅ
のいずれかであることができる。
【００５０】
本発明の他の具体例では、前記発色団は次に提示する構造を有するポルフィリン発色団からなることができ：
【化７９】
【００５１】
本発明の他の見地においては、マルチカラー蛍光色素分析用の蛍光色素マーカーの組合せであって、ポルフィリン発色団、クロリン発色団及びバクテリオクロリン発色団からなる群より選ばれる少なくとも２つの発色団からなり、それらの各発色団が同じポルフィリン骨格からなり、それらの各発色団が前記ポルフィリン骨格上の１又はそれ以上の置換基を含んでおり、それらの置換基の１つが接合基Ｚを含む接合置換基Ｌであり、Ｚが、複数の異なる所定の生物学的標的の１つに各発色団を送達するためのポリペプチド分子に、前記各発色団を接合させることができる接合基である組合せを提供する。
【００５２】
好ましくは、骨格上の他の前記置換基のそれぞれは、無関係に、Ｈ、又は前記接合置換基Ｌ及びすべての他のコア置換基とともに各発色団の蛍光特性を実質的に損なわない不活性置換基Ｒである。
【００５３】
本発明の組合せにおける各発色団が、励起において、異なる別々の波長で蛍光の光を放出することが見出された。したがって、組合せ中のすべての発色団は、単一レーザーによって励起され、実質的に個々に消散（ｒｅｓｏｌｖｅ）されることがある分かれた放出バンドを生成する。さらに、前記組合せにおいて提供される発色団のすべては、同じ分子構造を実質的に共有し、及び従って、与えられた条件下での生物学的標的に対する生物学的接合の同じ程度の効率を実質的に含む、同じ生物学的及び物理化学的特性を実質的に共有する。したがって、本発明の発色団の組合せは、ＦＡＣＳを含む、種々の種類の細胞又は他の生物学的標的の都合のよい選別及び分析のための蛍光分析及び選別の適用に有効に用いることができる。かかる組合せの構成成分は、例えば、１又はそれ以上の前記異なる所定の生物学的標的を含む混合物に、各発色団をそのそれぞれの所定の生物学的標的に送達させる条件の下で導入され；及び前記混合物は、前記発色団に蛍光を生じさせるように光に曝されることができる。次いで、マルチカラー分析を、各発色団によって生じる異なる放出バンドを確認するために実行し、それによって、それぞれの異なる生物学的標的の位置の計数及び可視化を可能にすることができる。
【００５４】
前記発色団の組合せは、特に、本発明の任意の見地の２又はそれ以上のポルフィリン発色団、相当するクロリン発色団、及び相当するバクテリオクロリン発色団からなることができる（ここで、“相当する”は、分子の大環状コアの周りに同じメソ−置換基を有することを意味する）。
【００５５】
本発明の発色団において、又は本発明の発色団の組合せのそれぞれの構成員において、前記接合基Ｚは、前記生物学的標的に対する特異的な結合に適合する結合タンパク質に接合することができる。あるいはまた、前記接合基Ｚは、架橋ポリペプチドに接合することができ、この架橋ポリペプチドは、前記発色団を相補的架橋ポリペプチドに連関させるために、前記相補的架橋ポリペプチドに対する結合に適合する。
【００５６】
いくつかの具体例では、前記架橋ポリペプチドは、前記相補的架橋ポリペプチドに結合することができ、及び前記相補的架橋ポリペプチドは、前記生物学的標的に対する特異的な結合に適合する結合タンパク質からなるか、これに連関するか、又はこれと融合することができる。したがって、前記発色団は、前記結合タンパク質と、前記架橋ポリペプチド及び前記相補的架橋ポリペプチドによって共有結合的に連結される場合がある。
【００５７】
本発明の他の見地においては、本発明の発色団又は本発明の発色団の組合せからなるキットであって、前記発色団又は各発色団が架橋ポリペプチドに接合され、この架橋ポリペプチドが、前記発色団を相補的な架橋ポリペプチドに連関させるために、前記相補的な架橋ポリペプチドに対する結合に適合し；及び構成物又は複数の構成物が、それぞれ、前記生物学的標的に対する特異的な結合に適合する結合タンパク質に融合するか、又は連関する前記相補的な架橋ポリペプチドからなり；その配列が、前記発色団又は各発色団を、前記所定の生物学的標的に対して特異性を有する結合タンパク質に連結させるために、キット中の前記発色団又は各発色団を、前記所定の生物学的標的に対して特異性を有するキット中での異なる構成物への結合に適合されているキットを提供する。
【００５８】
例えば、前記結合タンパク質は、前記生物学的標的の表面上の標的特異的分子に対して特異性を有するモノクローナル又はポリクローナル抗体又はそれらの断片のような抗体でよい。特に、前記抗体は、ファージ抗体であり、バクテリオファージの表面上に発現される抗体であることができる。あるいはまた、前記結合タンパク質は、血清アルブミンタンパク質のような１又はそれ以上の細胞表面分子又は受容体に対する結合に適合するタンパク質からなることができる。また更に代わりとして、前記結合タンパク質は、細胞膜中への挿入のために適合される脂肪酸鎖のような低密度リポタンパク質からなることができる。発色団に接合させる場合、かかるリポタンパク質は、発色団を細胞膜に固定する役目を果たすことができる。
【００５９】
前記架橋ポリペプチドは、カルモジュリンからなることができ、及び前記相補的架橋ポリペプチドは、カルモジュリン結合ペプチドからなることができ；又は逆もまた同じである。しかし、好ましくは、前記架橋ポリペプチドは、アビジン又はストレプトアビジンからなることができ、及び前記相補的架橋ポリペプチドはビオチンからなることができ；又は逆もまた同じである。特に、本発明のキット中の前記発色団又は各発色団は、アビジンに接合することができ、及び前記構成物又は各構成物は、前記生物学的標的の表面上の標的特異的分子に対して特異性を有するビオチン化モノクローナル抗体からなることができる。したがって、前記アビジン−連結発色団が前記ビオチン化抗体を結合させる場合、前記発色団は前記抗体にしっかりと連結することになる。都合のよいことには、前記発色団又は各発色団を望ましい生物学的標的に送達させるために、キット中の前記ビオチン化モノクローナル抗体又は各ビオチン化モノクローナル抗体は、選定され及び／又はたやすく置換することができる。モノクローナル抗体の調製のための及びそのビオチン化のための方法は、この技術においてよく知られている。
【００６０】
本発明の他の見地においては、本発明の発色団又は本発明の発色団の組合せを、前記所定の生物学的標的又は標的群に対して付着させるにあたり、本発明のキットを提供する工程、及び前記キットの成分を、前記結合タンパク質又は各結合タンパク質の前記所定の生物学的標的又は標的群に対する結合を可能にするための適切な条件下に、前記所定の生物学的標的又は標的群の近くに導入する工程を含む方法を提供する。有利には、前記キットの成分は、前記発色団又は各発色団に接合する架橋ポリペプチドを、キット中の１つの前記構成物上に提供される相補的な架橋ポリペプチドに結合させるために、前記標的又は標的群の導入に先立って、互いに結び付かせることができる。このことは、キット中の前記発色団又は各発色団が、前記発色団の前記標的又は標的群への導入に先立って、結合タンパク質に連結するのを確実にする。あるいはまた、前記キットの成分は、前記標的又は標的群に次いで導入することができる。
【００６１】
代表的に、前記所定の生物学的標的は、細胞又は膜でよい。前記所定の生物学的標的は、インビボ又はインビトロ（エクスビボ）であってよい。例えば、前記生物学的標的は、癌細胞、腫瘍細胞、ＨＩＶにか、又は任意の他の微生物又はウイルスに感染した細胞、自己免疫疾患において有害な活性を引き起こす細胞、外来のか、又は異常細胞（ｄｉｓｅａｓｅｄ ｃｅｌｌ）、又は任意の他のそのような細胞である場合がある。
【００６２】
本発明のいくつかの具体例では、前記生物学的標的は、インビトロの細胞であり、及び前記標的特異的分子は、ポリペプチド、糖質（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）、脂肪酸、リポタンパク質、リン脂質又は他の生物学的分子のような、前記細胞の表面上に露出する分子からなる。好ましくは、前記標的特異的分子は、前記細胞によって特異的に発現されるか、又は余分に発現（ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓ）されている。例えば、前記標的特異的分子は、ＣＤ４又はＣＤ８のようなＴ細胞マーカーでよい。したがって、本発明の発色団又は本発明の発色団の組合せの一部分を形成する発色団は、前記細胞に付着し、及び前記細胞が、前記発色団の蛍光を生じさせるために照射され、発色団の蛍光によって、前記細胞が可視化され、及びＦＡＣＳによる計数が行われ及び／又は選別される。
【００６３】
したがって、本発明の更なる見地においては、細胞の混合物から標的細胞を蛍光活性化選別するにあたり、本発明の発色団又は本発明の発色団の組合せを前記標的細胞に付着させ、前記標的細胞に付着した前記発色団の１又はそれ以上の蛍光を生じさせるために、細胞の前記混合物に照射をし、蛍光を発する細胞に荷電を与え、及び前記荷電細胞を前記混合物から分離するか、又は分離させるために、細胞の混合物を偏極環境（ｐｏｌａｒｉｓｅｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）に通す工程を含む方法を提供する。
【００６４】
本発明の他の見地においては、複数の標的細胞であって、前記標的細胞が２又は３の異なる細胞種の細胞を含んでいる複数の標的細胞の可視化及び／又は計数にあたり、本発明の発色団の組合せを提供する工程であって、発色団の組合せが２又は３の発色団を含み、各発色団が異なる１つの前記細胞種に送達されるのに適合する工程；その組合せ中の前記発色団を本発明の方法に従って前記標的細胞に付着させる工程；前記発色団によって蛍光の発光を生じさせるために、前記標的細胞に照射をする工程；前記各発色団によって生じる蛍光発光バンドを検出する工程；及び随意に前記各バンドについて、それぞれの個別の細胞種の蛍光細胞の数の測定値を得るために、発光／波長曲線の下での領域を測定する工程を含む方法を提供する。
【００６５】
本発明の他の具体例では、前記標的細胞は、癌細胞、腫瘍細胞、又は感染したか、外来のか又は異常細胞のようなインビトロの細胞であり、及び前記標的特異的分子は、前記標的細胞の表面によって発現されるか、又は余分に発現されるか、又はそれに付着するか、及びその上に露出する；標的細胞特異的膜タンパク質のような標的細胞特異的分子である。したがって、本発明の発色団が前記標的特異的分子に送達される場合、前記発色団は前記細胞に対して付着することになる。前記細胞が次いで、前記発色団の励起を起こさせるのに適切な波長で光を用いて照射される場合、前記細胞に付着する前記発色団は、励起を起こされ、及びこれが前記細胞のすぐ近くにおいて一重項酸素の生成を招き、従ってその細胞の死をもたらす。
【００６６】
特に好ましい具体例では、前記標的細胞特異的分子は、前記細胞の表面上の内部移行（インターナリゼーション）受容体からなり、この内部移行受容体は前記結合タンパク質と結合することができ、及びそれによって前記細胞内での前記発色団の内部移行を媒介する。したがって、その後の、前記発色団の励起を起こさせるのに適切な波長での前記細胞の光を用いる照射は、前記細胞内での一重項酸素の生成を招き、従って前記細胞の死をもたらす。
【００６７】
したがって、本発明は、標的細胞の消滅を起こさせるにあたり、本発明の発色団を前記細胞に付着させ及び一重項酸素の生成を前記細胞の近くで起こさせるために、前記細胞に照射をする工程を含み、それによって、細胞の死を起こさせる方法を包含する。好ましくは、前記発色団は、前記細胞の表面上の内部移行受容体に付着し、この内部移行受容体は、前記細胞内での前記発色団の内部移行を媒介することができ、及び前記細胞はその後、前記細胞内での一重項酸素の生成が生じるように照射をされ、それによって細胞の死が生じる。
【００６８】
好ましくは、前記発色団が細胞内に内部移行されるのに適合する場合、前記発色団は、ミトコンドリア膜上の正味負電荷（ｎｅｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅ）によって、細胞のミトコンドリアの周りの前記発色団の細胞内蓄積を促進するために、四級化アミン又はピリジル（ピリジニウミル）基、又はホスホニウム基のような、陽イオン性の基を含む。このことは、発色団の崩壊（ｄｅｃａｙ）による一重項酸素の提示があった場合に、細胞の迅速でかつ効率的な消滅をもたらす。
【００６９】
本発明の他の見地においては、腫瘍、癌、ＨＩＶ感染のようなウイルス感染、又はリウマチ様関節炎又は多発性硬化症のような自己免疫疾患のような、異常細胞か又は望ましくない細胞の体内での存在によって特徴付けられる疾病又は障害を処置するにあたり、本発明の発色団の有効な量をそれを必要としている患者に投与する工程であって、その発色団が前記細胞への付着を生じるように、その発色団が前記異常細胞か又は望ましくない細胞の表面上の標的細胞特異的分子に対してそれらへの付着のための標的にされるのに適合し、及び前記細胞の近くで一重項酸素の生成を生じさせるために、光を用いて前記細胞に照射をする工程を含み、それによって前記細胞を死滅させる方法を提供する。適切には、前記標的細胞特異的分子は内部移行受容体からなり、及び前記発色団は、前記内部移行受容体への送達において細胞内に内部移行するのに適合し、その照射によって前記細胞内での一重項酸素の生成が可能にされる。
【００７０】
前記発色団は、局所的にか、又は全身的に前記患者に投与することができる。例えば、前記発色団は注射によって投与することができる。
【００７１】
本発明の更に他の見地においては、腫瘍、癌、ＨＩＶ感染のようなウイルス感染、又はリウマチ様関節炎又は多発性硬化症のような自己免疫疾患のような、異常細胞か又は望ましくない細胞の体内での存在によって特徴付けられる疾病又は障害を処置するために患者に投与される薬学組成物であって、組成物が、本発明の発色団であって、前記異常細胞か又は望ましくない細胞へ送達されるのに適合する発色団、及び適切な担体からなる薬学組成物を提供する。
【００７２】
本発明の更に他の見地は、腫瘍、癌、ＨＩＶ感染のようなウイルス感染、又はリウマチ様関節炎又は多発性硬化症のような自己免疫疾患のような、異常細胞か又は望ましくない細胞の体内での存在によって特徴付けられる疾病又は障害を患う患者の処置において用いる薬剤の製造において使用するための、本発明の発色団であって；前記発色団が、前記異常細胞か又は望ましくない細胞に対する送達のために適合する発色団を構想する。
【００７３】
本発明の例の詳細な説明
以下は、実例としてのみの、本発明の具体例及び本発明を実施するための方法の説明及び例である。
発色団の合成
計測手段（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）及び材料
融点は修正しない。１Ｈ／１３Ｃ ＮＭＲスペクトルをＪｅｏｌ ＪＮＭ ＥＸ２７０ＦＴ−ＮＭＲ分光計上で記録し、特に明記しない限り、テトラメチルシランを基準にした。Ｉ．Ｒ．スペクトルを一連の１６００ ＦＴ−Ｉ．Ｒを用いて得、及び公称マススペクトルをＫｒａｔｏｓ Ｋｏｍｐａｃｔ（クラトスコンパクト）ＭＡＬＤＩ ＩＩ分光計によって得た。正確な質量をＥＰＳＲＣ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ（マススペクトロメトリーサービス），Ｓｗａｎｓｅａ（スウォンジ）から得た。電子スペクトルをＵｎｉｃａｍ（ユニカム）ＵＶ−２又はＵＶ−４分光計を用いて得、及び特に明記しない限り、ＤＣＭにおいて取得した。すべての試薬及び溶媒は、市場で入手できるもので、試薬等級又はより一層高い等級であり、及び特別の定めのない限り、受け取ったものとして用いた。ＴＬＣ分析をＭｅｒｃｋ ｓｉｌｉｃａ−ｇｅｌ（メルクシリカゲル）６０プレート（Ｆ２５４，５００μｍの厚さ）上で行った。メルクシリカゲル６０（２３０〜４００メッシュ）をフラッシュクロマトグラフィーの精製のために用いた。
【００７４】
説明
（１） ５−｛４−アセトアミドフェニル−１０，１５，２０−トリス（３，５−ジメトキシフェニル）ポルフィリン
【化８０】
【００７５】
（２） ５−（４−アミノフェニル）−１０，１５，２０−トリス（３，５−ジメトキシフェニル）ポルフィリン
【化８１】
【００７６】
（３） ５−（４−アミノフェニル）−１０，１５，２０−トリス（３，５−ジヒドロキシフェニル）ポルフィリン
【化８２】
【００７７】
（４） ５−（４−アセトアミドフェニル）−１０，１５，２０−トリス（４−ピリジル）ポルフィリン
【化８３】
【００７８】
（５） ５−（４−アミノフェニル）−１０，１５，２０−トリス（４−ピリジル）ポルフィリン
【化８４】
【００７９】
（６） ５−（４−アセトアミドフェニル）−１０，１５，２０−トリス（３−ピリジル）ポルフィリン
【化８５】
【００８０】
（７） ５−（４−アミノフェニル）−１０，１５，２０−トリス（３−ピリジル）ポルフィリン
【化８６】
【００８１】
（８） ５−（４−アセトアミドフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン，
Ｄｏｌｐｈｉｎ（ダルフィン）等の方法（１９９８年、５−フェニルジピロメタン及び５，１５−ジフェニルポルフィリン Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．７６，２８７〜２９３参考としてここに組み入れる）に従ってＤＤＰを合成した。３つのポルフィリンの得られた混合物を、クロマトグラフ処理し、５，１５−（４−メトキシ）−ＤＤＰを除去させるために最初にＤＣＭを用いて溶出し、及び次いで、酢酸エチル／ＤＣＭ（１：４）を続けて紫色の結晶（１５０ｍｇ，１２％）としての所要の生成物を溶出した；Ｒｆ＝０．４０（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，１９：１）；融点３０５〜３０７℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）４１０（１．０），５０２（０．０４），５３８（０．０２），５７８（０．０１５），６３０（０．０１）ｎｍ；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１０．３５（ｓ，２Ｈ，１０＋２０−Ｈ），９．４３（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．１４（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．６５（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，５−ｍ−Ａｒ），８．２２−８．１２（ｍ，４Ｈ，（重複），Ｊ＝８．１Ｈｚ，５＋１５−ｏ−Ａｒ），７．５６（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１５−ｍ−Ａｒ），４．１４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），−３．００（ｂｒ ｓ，２Ｈ，ＮＨ）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ５５０．３（Ｍ＋，１００％）。
【００８２】
（９） ５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン，
５−（４−アセトアミドフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン８（１等量（ｅｑ．），１００ｍｇ，０．１８２ミリモル）を５ＭのＨＣｌ水溶液（１００ｍＬ）中に溶解し、及びその溶液を還流下に３時間加熱した。熱い反応混合物を減圧中で濃縮して粗製の緑色の固体を得た。その固体を、ＤＣＭ／トリエチルアミン（９：１）（２００ｍＬ）の混合物中に再び溶解し、及び１０分間室温で撹拌した。次いで、その溶液を、水（３×２００ｍＬ）、飽和かん水（２００ｍＬ）を用いて洗浄し、及びその有機層を分離し、及び乾燥（Ｎａ２Ｓ０４）させ、次いで、減圧中で濃縮した。粗製の紫色の固体を、クロマトグラフ処理し、ＤＣＭを用いて溶出して、及び紫色の結晶性固体（５１ｍｇ，５４％）としての望ましいポルフィリンを与えた，Ｒｆ＝０．３０（ＤＣＭ），融点３００℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）４１０（１．０），５０３（０．０４５），５３８（０．０２），５７８（０．０１５），６３０（０．００５）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ）λｍａｘ６３４ｎｍ（λ励起＝４１０ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１０．３０（ｓ，２Ｈ，１０＋２０−Ｈ），９．３９（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，β−Ｈ），９．１７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，β−Ｈ），９．１０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，β−Ｈ），８．１９（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１５−ｏ−Ａｒ），８．０７（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，５−ｏ−Ａｒ），７．３５（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１５−ｍ−Ａｒ），７．１４（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，５−ｍ−Ａｒ），４．１３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），４．０８（ｂｒ ｓ，２Ｈ，ＮＨ），−３．０６（ｂｒ ｓ，２Ｈ ＮＨ）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ５０８．３（［Ｍ＋１］＋，１００％）。Ｃ３３Ｈ２６Ｎ５Ｏ（［Ｍ＋１］＋）に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは、５０８．２１３７、見出されたのは５０８．２１４４である。
【００８３】
（１０） １７，１８−ジヒドロキシ−５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリン及び
（１１） ７，８−ジヒドロキシ５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリンのレジオイソマー，
ポルフィリン９（２８ｍｇ，５５．２μモル）を、Ｓｕｔｔｏｎ（サットン）等の方法（２０００ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｅｄ ｄｉｐｈｅｎｙｌｃｈｌｏｒｉｎｓ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｉｎｓ−ｔｈｅｉｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｔｕｍｏｕｒ ｃｅｌｌ ｉｍａｇｉｎｇ Ｊ． Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ａｎｄ Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｓ ４，６５５−６５８）に従って、クロリンレジオイソマーの所要の混合物に転換させた。次いで、その粗製の反応混合物を、クロマトグラフ処理し、ＤＣＭ中の１％ＭｅＯＨを用いて溶出させた。最初に、いくつかの未反応の出発物質を溶出させ、次いで、茶色っぽい紫色（ｂｒｏｗｎ−ｐｕｒｐｌｅ）の結晶性固体としてのより一層高いＲｆ値のクロリン異性体１０を溶出した；Ｒｆ＝０．２８（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，１９：１）。より一層低いＲｆ値の異性体１１を、ＤＣＭ中の２．５％ＭｅＯＨを用いる更なる溶出によって得、及びまた、茶色っぽい紫色の結晶性固体（Ｒｆ＝０．１７（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，１９：１））を与えた。高いＲｆ値のクロリンレジオイソマー（以前与えられた１７，１８−ジヒドロキシ−１５−（４−メトキシフェニル）−５−（４−アミノフェニル）クロリン（２６））（７．０ｍｇ，２４％），融点１６５〜１６７℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）４０１（０．９９），４１４（１．０），５０３（０．０８），５３５（０．０７），５８２（０．０３５），６３６（０．２２）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ）λｍａｘ６３９ｎｍ（λ励起＝４１２ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＣＤ３ＯＤ）δ９．９５（ｓ，１Ｈ，１０−Ｈ），９．４２（ｓ，１Ｈ，２０−Ｈ），９．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．９７（ｓ，２Ｈ，β−Ｈ），８．７８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．５１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．０５（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｏ−Ａｒ），７．９４（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｏ’−Ａｒ），７．２５（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｍ−Ａｒ），７．１２（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｍ’−Ａｒ），６．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１７−Ｈ），６．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１８−Ｈ），４．０８（ｓ，３Ｈ．，ＣＨ３），｛ＮＨのものの交換及びＯＨのものは観察されない（ＮＨ’ｓ ｅｘｃｈａｎｇｅｄ ＆ ＯＨ’ｓ ｎｏｔ ｏｂｓｅｒｖｅｄ）｝；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ５４２．２（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）；Ｃ３３Ｈ２８Ｎ５Ｏ３（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは、５４２．２１９２、見出されたのは５４２．２１８７である。 低いＲｆのクロリンレジオオソマー（７，８−ジヒドロキシ−５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリン）（８．５ｍｇ，３０％），融点１６８〜１７１℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）４０１（０．９９），４１３（１．０），５０７（０．０８），５３６（０．０６），５８６（０．０２５），６３７（０．２０）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ）λｍａｘ６３９ｎｍ（λ励起＝４１２ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＣＤ３ＯＤ）δ９．９６（ｓ，１Ｈ，２０−Ｈ），９．４０（ｓ，１Ｈ，１０−Ｈ），９．１８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．０５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．９８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ）８．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．５８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．１３（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｏ−Ａｒ），８．０８（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｏ−Ａｒ），７．９５（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｏ’−Ａｒ），７．７９（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｏ’−Ａｒ），７．３６（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｍ−Ａｒ），７．３０（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｍ−Ａｒ），７．１１（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｍ’−Ａｒ），７．０５（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｍ’−Ａｒ），６．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，７−Ｈ），６．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，８−Ｈ），４．１１（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），（ＮＨのものの交換及びＯＨのものの交換は観察されない）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ５４２．２（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）Ｃ３３Ｈ２８Ｎ５Ｏ３（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは、５４２．２１９２、見出されたのは５４２．２１８５である。
【００８４】
（１２） ５−（４−フルオレニルメチルアミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン，
無水の１，４−ジオキサン（２．５ｍＬ）中のポルフィリン９（２８ｍｇ，５５μモル）の撹拌した溶液中に、固体の炭酸水素ナトリウム（６等量，２８ｍｇ，０．３３ミリモル）を添加した。次いで、この混合物に、Ｎ２下、１，４−ジオキサン（０．５ｍＬ）中の９−フルオレニルメチルクロロホルメート（２等量，０．１１ミリモル，２８．５ｍｇ）の溶液を添加した。反応フラスコをアルミニウムホイルで覆い、光を遮り、及び室温で３時間撹拌した。このときに、反応が完結した（ＴＬＣによって監視されたように）。１，４−ジオキサンを減圧中で除去し、及び残留物が水（２５ｍＬ）及びＤＣＭ（２×２５ｍＬ）の間に分配された。組み合わせられた有機抽出物を飽和かん水（２５ｍＬ）を用いて洗浄し、次いで乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、ろ過し、及び減圧中で濃縮した。所要のポルフィリンを、ＤＣＭで溶出するクロマトグラフィーによって得た。望ましいポルフィリンが紫色の結晶（３８ｍｇ，９５％）として得られた，Ｒｆ＝０．３９（ＤＣＭ），融点２９２〜２９５℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）４１０（１．０），５０５（０．０４２），５４１（０．０２），５７８（０．０１５），６３３（０．０１）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ）λｍａｘ６３５ｎｍ（λ励起＝４１０ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１０．３５（ｓ，２Ｈ，１０＋２０−Ｈ），９．６９（ｂｒ．ｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．４４（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．１２（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．２０−８．１７（ｍ（重複），４Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，５＋１５−ｏ−Ａｒ），７．８５（ｍ，４Ｈ，５＋１５−ｍ−Ａｒ），７．７６−７．６６（ｍ，２Ｈ，フルオレノ−Ａｒ），７．５１−７．３０（ｍ，６Ｈ，フルオレノ−Ａｒ），４．６９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ２），４．３０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ），４．１３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），−３．１５（ｂｒ．ｓ，２Ｈ，ＮＨ）；ＭＡＬＤ−ＭＳｍ／ｚ７３１．５（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％），５０８．３（［Ｍ−ＦＭＯＣ＋２］＋，５０％）；Ｃ４８Ｈ３６Ｎ５Ｏ３（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは、７３０．２８１８、見出されたのは７３０．２８０９である。
【００８５】
（１３，１４） シス／トランス−７，８，１７，１８−テトラヒドロキシ−５−（４−フルオレニルメチルアミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）バクテリオクロリン
ポルフィリン１２（３５ｍｇ，４８．０μモル）を、Ｓｕｔｔｏｎ等の方法（２０００ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｅｄ ｄｉｐｈｅｎｙｌｃｈｌｏｒｉｎｓ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｉｎｓ−ｔｈｅｉｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｔｕｍｏｕｒ ｃｅｌｌ ｉｍａｇｉｎｇ Ｊ． Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ａｎｄ Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｓ ４，６５５−６５８−参考としてここに組み入れる。）の軽微な修正によって、バクテリオクロリン立体異性体の所要の混合物に転換した（反応は、１２を溶解させるために１，４−ジオキサン（５ｍＬ）を用いて行った。）。粗製の反応混合物を、最初にＤＣＭ中の１％ＭｅＯＨを用いてクロリン副産物を除去するクロマトグラフ処理した。さらに、２％ＭｅＯＨ／ＤＣＭを用いる溶出によって、双方の立体異性のバクテリオクロリンテトロールを分離させた。より一層高いＲｆ−トランスバクテリオクロリン異性体１３をピンク−グリーンの結晶性固体として単離した、（６ｍｇ，１５％），Ｒｆ＝０．２５（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，１９：１），融点１４２〜１４５℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）３７４（１．０），５１２（０．２３），７０２（０．５２）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ）λｍａｘ７０８ｎｍ（λ励起＝５１２ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＣＤ３ＯＤ）δ９．２０（ｓ，２Ｈ，１０＋２０−Ｈ），８．７８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．３６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），７．９５（ｍ，２Ｈ，ｏ−Ａｒ），７．８５（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，フルオレノ−Ａｒ），７．７９（ｍ，２Ｈ ｏ’−Ａｒ），７．６５（ｍ，２Ｈ，ｍ’−Ａｒ），７．４７−７．３８（ｍ，６Ｈ，フルオレノ−Ａｒ），７．２４（ｍ，２Ｈ，ｍ−Ａｒ），６．２７−６．２４（ｍ，２Ｈ，７＋１７−Ｈ），５．８５（ｍ，２Ｈ，８＋１８−Ｈ），４．６５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ２），４．３９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ），４．０６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），−１．９４（ｂｒ ｓ（部分的に交換），２Ｈ，ＮＨ），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ８００．４（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）；Ｃ４８Ｈ４０Ｎ５Ｏ７（［Ｍ＋Ｈ］＋）］に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは、７９８．２９２７、見出されたのは７９８．２９２１である。
より一層低いＲｆのシス−バクテリオクロリン異性体１４をピンク−グリーンの結晶性固体として単離した、（８．５ｍｇ，２１％），Ｒｆ＝０．２（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，１９：１），融点１４８〜１５０℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）３７４（１．０），５１２（０．２４），７０３（０．５４）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ）λｍａｘ７０８ｎｍ（λ励起＝５１２ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＣＤ３ＯＤ）δ９．１２（ｓ，２Ｈ，１０＋２０−Ｈ），８．７６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．３４（ｄ（重複），２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．０２（ｍ，２Ｈ，ｏ−Ａｒ），７．８５（ｍ（不明瞭），２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，ｏ’−Ａｒ），７．８３（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，フルオレノ−Ａｒ），７．７６（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，ｍ’−Ａｒ），７．５０−７．３８（ｍ，６Ｈ，フルオレノ−Ａｒ），７．２４（ｍ，２Ｈ，ｍ−Ａｒ），６．２７−６．２３（ｍ，２Ｈ，７＋１７−Ｈ），５．８５−５．８２（ｍ，２Ｈ，８＋１８−Ｈ），４．６５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ２），４．３９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ），４．０５（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），−１．８８（ｂｒ．ｓ（部分的に交換），２Ｈ，ＮＨ），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ８００．４（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）；Ｃ４８Ｈ４０Ｎ５Ｏ７（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは、７９８．２９２７、見出されたのは７９８．２９２１である。
【００８６】
（１５） ５−（３，４，５−トリスメトキシフェニル）ジピロメタン
３，４，５−トリスメトキシベンズアルデヒド（５．０ｇ，２５．５ミリモル）を新しく蒸留したピロール（７５ｍＬ）中に溶解し、及びその溶液を、乾燥Ｎ２を用いる１０分間の通気によって脱気した。ＴＦＡ（０．０７５等量，０．１５ｍＬ，１．９１ミリモル）を添加し、及びその混合物を、最初のアルデヒドがＴＬＣ（約（ｃａ．）１０分）によって検出されないようになるまでＮ２下で撹拌した。反応混合物を減圧中、水吸引器圧（蒸発装置水浴温度７５℃）で、次いで高い減圧下で１６時間濃縮し、過剰のピロールを除去した。粗製の生成物を熱エチルアセテート／ｎヘキサンから再結晶し、及び白色の固体としての所要のジピロメタンを与えた，（５．４１ｇ，６８％）：νｍａｘ（ヌジョールマル）／ｃｍ−１３３７８（ｂｒ．ＮＨ），１５９４（Ｃ＝Ｃ），１２３３，１０４０；ＵＶ−ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ／（相対強度（ｒｅｌ．ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ））２２２（１．０），２８０（０．７５）ｎｍ；δＨ（２７０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）８．０７（２Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ），７．５３（２Ｈ，ｍ，１−Ｈ），６．６８（２Ｈ，ｓ，２’−Ｈ），６．３７（２Ｈ，ｍ，２−Ｈ），５．９３（２Ｈ，ｍ，３−Ｈ），５．３８（１Ｈ，ｓ，メタン），３．８０（３Ｈ，ｓ，４’−ＯＣＨ３），３．７３（６Ｈ，ｓ，３’＋５’−ＯＣＨ３）；δＣ（６８ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）１５２．７（ＣＨ，２’−Ｃ），１３７．３（ｑ，３’＋５’−Ｃ），１３６．１（ｑ，４’−Ｃ），１３１．８（ｑ，４−Ｃ），１１６．７（ＣＨ，１−Ｃ），１０７．９（ＣＨ，２−Ｃ），１０６．６（ＣＨ，３−Ｃ），１０４．９（ｑ，１’−Ｃ），６０．３（ＣＨ３），５５．５（ＣＨ３），４３．７（ＣＨ．，メタン）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｅ３１１．２（１００％，（Ｍ−１）＋）。
【００８７】
（１６） ５−（４−アセトミドフェニル）ジピロメタン
ジピロメタンを、最初のアルデヒドの同じモル量を用いる上記詳述の一般的な方法を用いて合成した。粗製の反応混合物をフラッシュシリカゲル（３５０ｍＬ）上でクロマトグラフ処理し、（５０ｍＬのフラッシュシリカゲルにエチルアセテートから乾燥負荷（ｄｒｙ ｌｏａｄ）し）、及び４０％のエチルアセテート／ＤＣＭで溶出し、及びオフホワイトの固体としての純粋な生成物を与えた，（４．３ｇ，５０％）：νｍａｘ（ヌジョールマル）／ｃｍ−１３４０９（ＮＨ，アミド），３２４８（ｂｒ．ＮＨ），１６５０（Ｃ＝Ｏ），１５９３（Ｃ＝Ｃ），１３２０，１００９；ＵＶ−ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ／（相対強度）２２４（１．０）ｎｍ；δＨ（２７０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）８．００（２Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ），７．４０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，ｏ−Ａｒ），７．３０（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ−アセトミド），７．１３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，ｍ−Ａｒ），６．６８（２Ｈ，ｍ，１−Ｈ），６．１６（２Ｈ，ｍ，２−Ｈ），５．９０（２Ｈ，ｍ，３−Ｈ），５．４２（１Ｈ，ｓ，メタン），２．１４（３Ｈ，ｓ，ＮＨＣＨ ３ ）；δＣ（６８ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）１６８．４（ｑ，ＣＯＣＨ３），１３８．２（ｑ，４’−Ｃ），１３６．５（ｑ，２’−Ｃ），１３２．４（ｑ，４−Ｃ），１２８．９（ＣＨ，２’−Ｃ），１２０．３（ＣＨ，３’−Ｃ），１１７．２（ＣＨ，１−Ｃ），１０８．４（ＣＨ，２−Ｃ），１０７．１（ＣＨ，３−Ｃ），４３．４（ＣＨ．，メタン），２４．５（ＣＨ３）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｅ２７９．４（１００％，（Ｍ）＋）。
【００８８】
（１７） ５−（４−メトキシフェニル）ジピロメタン
ジピロメタンを最初のアルデヒドの同じモル量を用いる上記詳述の一般的な方法を用いて合成した。粗製の反応混合物をフラッシュシリカゲル（３５０ｍＬ）上でクロマトグラフ処理し、（５０ｍＬのフラッシュシリカゲルにエチルアセテートから乾燥負荷し）、及び３０％のｎヘキサン／ＤＣＭで溶出し、及びオフホワイトの固体としての純粋な生成物を与えた，（４．３ｇ，５０％）：νｍａｘ（ヌジョールマル）／ｃｍ−１，３３８２（ｂｒ．ＮＨ），１５９８（Ｃ＝Ｃ），１３００，１０５０；ＵＶ−ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ／（相対強度）２２４（１．０）ｎｍ；δＨ（２７０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）７．８７（２Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ），７．１０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，ｍ−Ａｒ），６．８３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，ｏ−Ａｒ），６．６６（２Ｈ，ｍ，１−Ｈ），６．１４（２Ｈ，ｍ，２−Ｈ），５．８９（２Ｈ，ｍ，３−Ｈ），５．４０（１Ｈ，ｓ，メタン）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｅ２５２．４（１００％，（Ｍ）＋）。
【００８９】
例１
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリス（３，５−ジヒドロキシフェニル）ポルフィリン
【化８７】
例２
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリス（４−ピリジル）ポルフィリン
【化８８】
【００９１】
例３
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリス（３−ピリジル）ポルフィリン（１６０）
【化８９】
【００９２】
例４
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリス（４−Ｎ−メチルピラジニウミル）ポルフィリントリヨウ化物
【化９０】
【００９３】
例５
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリス（３−Ｎ−メチルピリジニウミル）ポルフィリントリヨウ化物
【化９１】
【００９４】
例６
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリス（４−Ｎ−メチルピリジニウミル）ポルフィリントリ塩化物
【化９２】
【００９５】
例７
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリス（４−Ｎ−メチルピリジニウミル）ポルフィリントリ塩化物
【化９３】
【００９６】
例８
１７，１８−ジヒドロキシ−５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリン，
より一層高いＲｆのレジオイソマーのクロリン１０（１７．５ｍｇ，２３．２μモル）を以下の方法によって相当するイソチオシアナートに転換した。新しく蒸留したＤＣＭ（２０ｍＬ）中の１０（１等量，５０ｍｇ，０．０９９ミリモル）の撹拌した溶液に、１，１’−チオカルボニルジ−２（１Ｈ）−ピリドン（２等量，４６ｍｇ，０．１９８ミリモル）を添加した。反応物をアルゴン下に、２時間室温で撹拌させ、その後反応混合物をろ過し、及び濃縮し次いでクロマトグラフ処理し、ＤＣＭ中の１％ＭｅＯＨで溶出して表題の化合物を与えた。表題の化合物を茶色っぽい紫色の結晶性固体として単離した、（１７ｍｇ，９０％）， Ｒｆ＝０．３６（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，１９：１）；融点１５５〜１５８℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）４１０（１．０），５０５（０．０９），５３４（０．０６），５８６（０．０４），６３７（０．１８）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ）λｍａｘ６３９ｎｍ（λ励起＝４１２ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＣＤ３ＯＤ）δ１０．０（ｓ，１Ｈ，１０−Ｈ），９．４５（ｓ，１Ｈ，２０−Ｈ），９．２０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），９．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．８４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．２１（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，５−ｏ−Ａｒ），８．１５（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，５−ｏ−Ａｒ），８．０５（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１５−ｏ−Ａｒ），７．９３（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１５−ｏ−Ａｒ），７．６５（ｍ，２Ｈ，５−ｍ−Ａｒ），７．２４（ｍ，２Ｈ，１５−ｍ−Ａｒ），６．４３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１７−Ｈ），６．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１８−Ｈ），４．０８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），（ＮＨのものの交換及びＯＨのものは観察されない）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ５８３．７（［Ｍ＝Ｈ］＋，１００％）；Ｃ３４Ｈ２６Ｎ５Ｏ３Ｓ（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対しての計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは５８４．１７５７、見出されたのは５８４．１７５６である。
【００９７】
例９
シス−７，８，１７，１８−テトラヒドロキシ−５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）バクテリオクロリン
ＤＣＭにおける２５％ＭｅＯＨ（１．２５ｍＬ）中のシス−バクテリオクロリン１４（８．５ｍｇ，１０．７μモル）をピペリジン（５０等量，５３μＬ，０．５３ミリモル）を用いて処理し、及び光を遮って３時間の間室温でＮ２下に撹拌させた。反応混合物を減圧（０．１トル）中で濃縮しピペリジンのすべての痕跡量を除去した。次いで、粗製のアミンを上述の方法に従って所要のイソチオシアナートに転換した。このシス−バクテリオクロリン＿イソチオシアナートをピンク−グリーンの結晶性固体（５．０ｍｇ，７６％）として単離した，Ｒｆ＝０．４０（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，１９：１），融点１３２〜１３５℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）３７５（１．０），５１６（０．２２），７０２（０．４８）ｎｍ；蛍光λｍａｘ７０９ｎｍ（λ励起＝５１６ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＣＤ３ＯＤ）δ９．２０（ｓ，１Ｈ，メソ−Ｈ），９．１８（ｓ，１Ｈ，メソ−Ｈ），８．７７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．１４（ｍ，２Ｈ，ｏ−Ａｒ），８．０５（ｍ，２Ｈ，ｏ’−Ａｒ），７．４２−７．０８（ｍ，４Ｈ，５＋１５−ｍ−Ａｒ），６．２０（ｍ，２Ｈ，７＋１７−Ｈ），５．９８（ｍ，１Ｈ，８−Ｈ），５．９３（ｍ，１Ｈ，１８−Ｈ），４．０４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），−１．８０（ｂｒ ｓ，２Ｈ，部分的に交換した−ＮＨ），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ６１８．９（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）；Ｃ３４Ｈ２８Ｎ５Ｏ５Ｓ（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは６１８．１８１５、見出されたのは６１８．１８１０である。
【００９８】
例１０，１１，１２，１３
１７，１８−ジヒドロキシ−５−（４−アセトアミドフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリン／７，８−ジヒドロキシ−５−（４−アセトアミドフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリンレジオイソマー，及び
シス／トランス−７，８，１７，１８−テトラヒドロキシ−５−（４−アセトアミドフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）バクテリオクロリン立体異性体，
ポルフィリン８（１００ｍｇ，０．１８ミリモル）を、単一反応において、Ｓｕｔｔｏｎ等の方法に従ってクロリンジオール／バクテリオクロリンテトロールの混合物に転換した。３８時間後、反応を停止させた。次いで、粗製の反応混合物をクロマトグラフ処理し、ＤＣＭ中の１０％ＭｅＯＨでの溶出を用い、最初の、いくつかの未反応の出発物質、次いで、茶色っぽい紫色の結晶性固体（５ｍｇ，５％）としての例１０のより一層高いＲｆのクロリン異性体を与えた。例１１のより一層低いＲｆの異性体は、ＤＣＭ中の３．５％ＭｅＯＨを用いる更なる溶出によって得、及びまた茶色っぽい紫色の結晶性固体（７．０ｍｇ，７％）を与えた。ＤＣＭ中の５％ＭｅＯＨを用いる更なる溶出は、例１２及び１３のそれぞれの所要のトランス／シスバクテリオクロリンテトールを、それぞれ、ピンク／グリーンの固体（５．０ｍｇ，５％）及び（７．０ｍｇ，７％）として与えた。 例１０の高いＲｆのクロリンレジオイソマー〔これまでのデータに基づいて割り当てられた１７，１８−ジヒドロキシ−１５−（４−メトキシフェニル）−５−（４−アセトアミドフェニル）クロリン〕（２６）Ｒｆ＝０．４０（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，３７：３），融点１８６〜１８８℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）４１０（１．０），５０５．５（０．１２），５３５（０．０８），５８５．５（０．０５），６３７（０．１８）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ）λｍａｘ６３９ｎｍ（λ励起＝４１０ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．９７（ｓ，１Ｈ，１０−Ｈ），９．４２（ｓ，１Ｈ，２０−Ｈ），９．１９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），９．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．９８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．８９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．５２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．１４−８．１０（ｍ，３Ｈ，５−ｏ／ｍ−Ａｒ），７．９６−７．８２（ｍ，３Ｈ，５＋１５−ｏ／ｍ−Ａｒ），７．５０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．３４（ｍ，２Ｈ，１５−ｍ−Ａｒ），６．４８（ｍ，１Ｈ，１７−Ｈ），６．２０（ｍ，１Ｈ，１８−Ｈ），４．０８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），２．３８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），−１．８９，−２．２０（ｓ，２Ｈ，ＮＨ）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ５８２．６（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）；Ｃ３５Ｈ２８Ｎ５Ｏ４（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは５８２．２１４１、見出されたのは５８２．２１３７である。
例１１の低いＲｆのクロリンレジオイソマー〔７，８−ジヒドロキシ−５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリン〕Ｒｆ＝０．３５（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，３７：３），融点１８２〜１８５℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）４１０（１．０），５０５．５（０．１），５３５（０．０７），５８５（０．０４），６３６（０．１９）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ） λｍａｘ６３９ｎｍ（λ励起＝４１０ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．９６（ｓ，１Ｈ，１０−Ｈ），９．９２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．４２（ｓ，１Ｈ，２０−Ｈ），９．２２（ｍ，１Ｈ，β−Ｈ），９．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．００（ｍ，１Ｈ，β−Ｈ），８．９２（ｍ，１Ｈ，β−Ｈ），８．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．５３（ｍ，１Ｈ，β−Ｈ），８．１８−７．９１（ｍ，６Ｈ，５＋１５−ｏ／ｍ−Ａｒ），７．３３−７．２８（ｍ，２Ｈ，１５−ｍ−Ａｒ），６．３６（ｍ，１Ｈ，７−Ｈ），５．９６（ｍ，１Ｈ，８−Ｈ），４．１０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），２．３０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），−１．７４，−２．１７（ｓ，２Ｈ，ＮＨ）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ５８２．６（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）。Ｃ３５Ｈ２８Ｎ５Ｏ４（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは５８２．２１４１、見出されたのは５８２．２１３５である。
例１２の高いＲｆ−トランスバクテリオクロリン；Ｒｆ＝０．２９（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，３７：３：１），融点１５２〜１５５℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）３７３．５（１．０），５１４（０．２５），７０２（０．４９）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ）λｍａｘ７０８ｎｍ（λ励起＝５１４ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１０．２７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．１６（ｓ，２Ｈ，１０＋２０−Ｈ），８．９６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．２４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），７．９９−７．８９（ｍ，６Ｈ，５＋１５−ｏ／ｍ−Ａｒ），７．２５（ｍ，２Ｈ，１５−ｍ−Ａｒ），６．３０（ｍ，２Ｈ，７＋１７−Ｈ），６．１５（ｍ，２Ｈ，８＋１８−Ｈ），５．６３（ｍ，２Ｈ，ＯＨ），５．３２（ｍ，２Ｈ，ＯＨ），３．９９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），２．２０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），−１．８７（ｂｒ ｓ，２Ｈ，ＮＨ）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ６１６．３（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）。Ｃ３５Ｈ３０Ｎ５Ｏ６（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは６１６．２１９６、見出されたのは６１６．２１９２である。
低いＲｆシス−トランスバクテリオクロリン１３；Ｒｆ＝０．２４（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，１９：１），融点１４８〜１５１℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）３７３．５（１．０），５１４．５（０．２４），７０３（０．５０）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ）λｍａｘ７０８ｎｍ（λ励起＝５１４ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の２０％ＣＤ３ＯＤ）δ９．２０（ｓ，２Ｈ，１０＋２０−Ｈ），８．７８（ｍ，２Ｈ，β−Ｈ），８．３５（ｍ，２Ｈ，β−Ｈ），８．０５（ｍ，２Ｈ，５−ｏ−Ａｒ），７．８９−７．８６（ｍ，３Ｈ，５＋１５−ｏ／ｍ−Ａｒ），７．７５（ｍ，１Ｈ，１５−ｏ−Ａｒ），７．２０−７．１７（ｍ，２Ｈ，１５−ｍ−Ａｒ），６．２５（ｍ，２Ｈ，７＋１７−Ｈ），５．８６（ｍ，２Ｈ，８＋１８−Ｈ），４．０６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），２．３１（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），（ＮＨのものの交換）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ６１６．４（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）。Ｃ３５Ｈ３０Ｎ５Ｏ６（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは６１６．２１９６、見出されたのは６１６．２１９２である。
【００９９】
例１６
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリ（４−メチルホスホニウムフェニル）−ポルフィリン及び５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−（４−メチルホスホニウムフェニル）−ポルフィリン−一般的合成方法
ボック（Ｂｏｃ）Ｎ−保護された５−（４−アミノフェニル）−１０，２５，２０−トリ−（４−カルボメトキシフェニル）ポルフィリン及び５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−カルボメトキシフェニル）ポルフィリンを、それぞれ、Ｌｉｎｄｓｅｙ（リンジー）条件〔Ｌｉｎｄｓｅｙ，Ｊ．Ｓ．，Ｓｃｈｒｅｉｍａｎ（シュレイマン），Ｉ．Ｃ．，Ｈｓｕ（スウ），Ｈ．Ｃ．，Ｋｅａｒｎｅｙ（カーニー），Ｐ．Ｃ．，Ｍａｒｇｕｅｒｅｔｔａｚ（マルグレッタ），Ａ．Ｍ．（１９８７）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５２，８２７〕を用いる混合凝縮（ｍｉｘｅｄ ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）又はＢｏｙｌｅ（ボイル）等の〔Ｂｏｙｌｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｂｒｕｃｋｎｅｒ（ブルックナー），Ｃ．，Ｐｏｓａｋｏｎｙ（ポサコニー），Ｊ．，Ｊａｍｅｓ（ジェームス），Ｂ．Ｒ．，Ｄｏｌｐｈｉｎ（ドルフィン），Ｄ．（１９９９）Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ．７６，２８７−参考としてここに組み入れる。〕により記載されているように適切に置換された５−フェニルジピロメタンによる２＋２凝縮法によって合成した。次いで、これらのポルフィリン上の（４−カルボメトキシフェニル）基を、次の標準的な方法：ポルフィリン（０．２ミリモル）を乾燥ＴＨＦ（２５ｍＬ）中に０℃で溶解し、及びアルゴン下に１０分間撹拌する方法を用いて、（４−（１−ブロモメチル）フェニル）基に転換した。リチウムアルミニウム水素化物（０．７ミリモル）を添加し、及び撹拌を２４時間続けた。反応物をＴＬＣによって監視し、反応が完結したとき、エチルアセテート（２ｍＬ）を添加し、及び反応物をＨＣｌ水溶液（０．２Ｍ，２０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（３０ｍＬ）及び最後にかん水（２０ｍＬ）を用いて洗浄した。その有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、及び乾くまで蒸発させて、３つ又は１つの還元型のカルボメトキシ基をそれぞれ有する相当する（４−（１−ヒドロキシメチル）フェニル）置換ポルフィリンを得た。（４−（１−ヒドロキシメチル）フェニル）置換ポルフィリン（０．２ミリモル）を乾燥クロロホルム（４０ｍＬ）中に溶解し、及びアルゴン下で撹拌し、一方でトリフェニルホスフィン（１．０ミリモル）及び四臭化炭素（１．６ミリモル）を添加した。反応物を、暗所で２４時間撹拌し、及び次いでＴＬＣによって監視した。一旦すべてのヒドロキシメチル基をブロモメチル基に転換させて、反応混合物をジクロロメタン（４０ｍＬ）を用いて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム（２×２ｍＬ）次いでかん水（２×２ｍＬ）を用いて洗浄し、及び有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）させた。減圧中での溶媒の除去によって紫色の結晶性固体としての相当するブロモメチルポルフィリンを与えた。
ボックＮ−保護された５−（アミノフェニル）−１０，２５，２０−トリ−（４−ブロモメチルフェニル）ポルフィリン及び５−（アミノフェニル）−１５−（４−ブロモメチルフェニル）ポルフィリン（０．７５ミリモル）を、乾燥ジクロロメタン（５０ｍＬ）中に、アルゴン雰囲気下２５℃で溶解した。ジクロロメタン（１０ｍＬ）中に溶解したトリアリール又はトリアルキルホスフィン（７．５ミリモル）をシリンジによって注入し、及び反応の進行の後にはＴＬＣを行った。完結の際に、溶媒を減圧中で反応物から蒸発させ、及び粗製の生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；勾配溶出：ジクロロメタンからメタノールまで）によって精製し、光沢のある紫色の結晶性固体としての所要のボック−Ｎ−保護−５−（アミノフェニル）−メチルホスホニウム−メソ−アリールポルフィリンを得た。ボック保護基を、溶解度及びトリメチルシリルヨウ化物（５．０等量）の添加に応じて、クロロホルム又はアセトニトリル中のポルフィリンの溶解によって除去し、３０分後、メタノール（１０ｍＬ）を用いて反応をクエンチングさせた。蒸発による溶媒の除去、次いで、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；勾配：ジクロロメタンからメタノールまで）によって、５−（アミノフェニル）−メチルホスホニウム−メソ−アリールポルフィリンを与え、これは、標準的な方法〔Ｃｌａｒｋｅ（クラーク），Ｏ．Ｊ．及びＢｏｙｌｅ，Ｒ．Ｗ．（１９９９．Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２３１）〕を用いる１，１’−チオカルボニルジ−２（１Ｈ）−ピリドンでの処理によって所要のモノ−４−（イソシアナトフェニル）化合物に転換された。
【０１００】
例１７
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリ（（４−メチルホスホノ−ジ−エトキシ）フェニル）−ポルフィリン及び５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−（（４−メチルホスホノ−ジ−エトキシ）フェニル）−ポルフィリン−一般的な合成方法
ボックＮ−保護された５−（４−アミノフェニル）−１０，１５，２０−トリ−（４−ブロモメチルフェニル）ポルフィリン及び５−（アミノフェニル）−１５−（４−ブロモメチルフェニル）ポルフィリン（０．７５ミリモル）をトリエチル亜リン酸エステル（１５ミリモル）及び乾燥アセトニトリル（５０ｍＬ）の混合物中に溶解した。還流冷却器を装着し、及びアルゴン下に還流させた。反応物をＴＬＣにかけ、及び完結の際に、飽和炭酸水素ナトリウム（２×２０ｍＬ）、水（２×２０ｍＬ）及びかん水（２×２０ｍＬ）を用いて洗浄した。次いで、有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、及び溶媒を減圧中に蒸発させた。次いで、粗製の生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；勾配溶出：ジクロロメタンからエチルアセテートまで）によって精製し、紫色の結晶性固体としての表題の化合物を与えた。次いで、メチルホスホノ−ジ−エトキシ基を、水酸化ナトリウム水溶液中での１時間の超音波処理、次いで逆相中圧クロマトグラフィー〔Ｃ１８；勾配溶出０．１％ＴＦＡ水溶液からメタノールまで〕（Ｂｏｙｌｅ，Ｒ．Ｗ．及びｖａｎ Ｌｉｅｒ（ファンリエル），Ｊ．Ｅ．（１９９３）Ｓｙｎｌｅｔｔ３５１）によるメチルホスホノ−モノ−エトキシナトリウム基にか、又はブロモトリエチルシラン（メチルホスホノ−ジ−エトキシ基当たり２等量）を用いる２時間の処理、次いで、逆相クロマトグラフィーによる精製クロマトグラフィ（Ｃ１８；勾配溶出０．１％ＴＦＡ水溶液からメタノールまで）〔ＭｃＫｅｎｎａ（マッケナ），Ｃ．Ｅ．，Ｈｉｇａ（ヒガ），Ｍ．Ｔ．，Ｃｈｅｕｎｇ（チューン），Ｎ．Ｈ．，ＭｃＫｅｎｎａ，Ｍ−Ｃ．（１９７７）２，１５５〕による十分に脱保護されたメチルホスホン酸にかのいずれかに脱保護した。ボックの脱保護（上記参照）に次いで、マスクされてない４−（アミノフェニル）基のそのイソチオシアナト類似体への転換を、標準的な方法（Ｃｌａｒｋｅ，Ｏ．Ｊ．及びＢｏｙｌｅ，Ｒ．Ｗ．（１９９９Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２３１）を用いて行った。
【０１０１】
例１８
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリ（（４−メチルホスホナト−ジ−エトキシ）フェニル）−ポルフィリン及び５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−（（４−メチルホスホナト−ジ−エトキシ）フェニル）−ポルフィリン−一般的な合成方法
ボックＮ−保護された５−（アミノフェニル）−１０，１５，２０−トリ−（４−ヒドロキシメチルフェニル）ポルフィリン及び５−（アミノフェニル）−１５−（４−ヒドロキシメチルフェニル）ポルフィリン（０．７５ミリモル）を、アルゴン雰囲気下に、ジクロロメタン及びピリジン（４：１）の混合物中に溶解した。ジエチルクロロホスフェート（ヒドロキシメチル基当たり２等量）を注入し、及び混合物を１６時間撹拌した。反応混合物からの溶媒の蒸発に次いで、クロマトグラフィーによる精製によって相当するトリ又はモノ（（４−メチルホスホナト−ジ−エトキシ）フェニル）ポルフィリンを与えた。水酸化ナトリウム（１Ｍ）を用いる処理によって、トリ又はモノ（（４−メチルホスホナトエトキシ）フェニル）ポルフィリンのナトリウム塩を与えた（Ｂｏｙｌｅ，Ｒ．Ｗ．及びｖａｎ Ｌｉｅｒ，Ｊ．Ｅ．（１９９５）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ１０７９）。ボック脱保護及びイソチオシアナート基の生成は上述の様にして行った。
【０１０２】
例１９
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリ（（４−メチルピリジニウミル）フェニル）−ポルフィリン及び５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−（（４−メチルピリジニウミル）フェニル）−ポルフィリン−一般的な合成方法
ボックＮ−保護５−（アミノフェニル）−１０，２５，２０−トリ−（４−ブロモメチルフェニル）ポルフィリン及び５−（アミノフェニル）−１５−（４−ブロモメチルフェニル）ポルフィリン（０．７５ミリモル）を、ジクロロメタン（５０ｍＬ）及びピリジン（１５ミリモル）中に溶解し、又は置換されたピリジン（１５ミリモル）を要求に応じ添加した。還流冷却器を装着し、及び反応物をアルゴン下に還流させた。反応物をＴＬＣにかけ、完結の際に、乾くまで減圧中で蒸発させた。残留物を逆相媒体圧クロマトグラフィー〔Ｃ１８；勾配溶出０．１％ＴＦＡ水溶液からメタノールまで〕によって精製し、Ｎ−ボック保護４−アミノフェニル化合物を得た。アミノフェニル基（複数）の脱保護及びイソチオシアナト類似体（複数）への転換を標準的なプロトコル（上記参照）を用いて行った。
【０１０３】
例２０
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−アリール−１０，２０−（１，２−ジヒドロキシエチル）−ポルフィリン−一般的な合成方法
エフモック（Ｆｍｏｃ）保護された５−（４−アミノフェニル）−１５−アリールポルフィリン（０．８ミリモル）を乾燥クロロホルム（３００ｍＬ）中にアルゴンの雰囲気下で溶解した。乾燥クロロホルム（２０ｍＬ）中に、新しく再結晶したＮ−ブロモスクシンイミド（１．８ミリモル）をシリンジによって注入し、及び混合物を３０分間撹拌した。次いで、溶媒を減圧中で蒸発させ、及び粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；勾配溶出：ヘキサンからエチルアセテートまで）によって精製し、紫色の結晶性固体としての所要の５，１５−ジブロモ−１０，２０−ジアリールポルフィリンを与えた。次いで、生成物を、酢酸亜鉛二水和物（８０ミリモル）のクロロホルム／メタノール（９：１）溶液中での還流によってメタレートした。メタレーションに次いで、可視分光法を行い、完結の際に、中性のアルミナの短いカラムに通し、配位してない亜鉛を除去した。亜鉛５，１５−ジブロモ−１０，２０−ジアリールポルフィリン（０，６ミリモル）を乾燥ＴＨＦ中に溶解し、それにテトラキス（トリフェニルホスフィン）−パラジウム（０）（０．６ミリモル）及びビニルトリブチルスズ（１．４ミリモル）を添加した。混合物を窒素下に４８時間還流させ、その後、溶媒を減圧中で蒸発させ、及び残留物をフラッシュカラム（シリカ；勾配溶出：ジクロロメタンからエチルアセテートまで）によってクロマトグラフ処理し、紫色の結晶性固体としてのジンク５−（エフモックアミノフェニル）−１５−アリール−１０，２０−ジエテニルポルフィリンを与えた。ジンク５−（エフモックアミノフェニル）−１５−アリール−１０，２０−ジエテニルポルフィリンを、ジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸（１％ｖ／ｖ）の溶液における溶解によって脱メタレーションし、水を用いる抽出及び減圧中での有機層からの溶媒の蒸発後に、５−（エフモックアミノフェニル）−１５−アリール−１０，２０−ジエテニルポルフィリンを与えた。最後に、１０及び２０のエテニル基を、記載したように（Ｓｕｔｔｏｎ Ｊ， Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ（フェルナンデス）Ｎ，Ｂｏｙｌｅ ＲＷ（２０００）Ｊ．Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ ａｎｄ Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｓ ４，６５５）、四酸化オスミウムによってヒドロキシル化するが、エテニル基と四酸化オスミウムとの間の反応が迅速であるために、反応時間及び化学量論の制御によってこれらの基の選択的なヒドロキシル化が可能であった。条件の代表的な組合せにおいては、５−（エフモックアミノフェニル−１５−アリール−１０，２０−ジエテニルポルフィリンは、１０％ピリジン／クロロホルム中の四酸化オスミウム（５等量）を用いて２４〜４８時間処理する場合に、望ましい５−（エフモックアミノフェニル）−１５−アリール−１０，２０−ビス（１，２−ジヒドロキシエチル）ポルフィリンを与え、一方で、より一層長い反応時間（７２時間）及び四酸化オスミウムのより一層高いモル比（７．５又は１０等量）を同じ条件下で用いる場合は、５−（エフモックアミノフェニル）−１５−アリール−１０，２０−ビス（１，２−ジヒドロキシエチル）７，８−ジヒドロキシクロリン及び５−（エフモックアミノフェニル）−１５−アリール−１０，２０−ビス（１，２−ジヒドロキシエチル）７，８，１７，１８−テトラヒドロキシバクテリオクロリンのそれぞれが得られる。すべての上記生成物は、アミノ基のピペリジン媒介脱保護（上記参照）及び標準的な方法（Ｃｌａｒｋｅ，Ｏ．Ｊ．及びＢｏｙｌｅ，Ｒ．Ｗ．（１９９９，Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２３１））を用いる１，１’−チオカルボニルジ−２（１Ｈ）−ピリドンでの処理の際に、相当するイソチオシアナートにきれいに転換される。
【０１０４】
例２１
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−フェニル−１０，２０−（ジアリール）−ポルフィリン−ＰＤ０媒介Ｓｕｚｕｋｉカップリングによる５，１５−ジフェニルポルフィリンからの合成
ボックＮ−保護５−（アミノフェニル）−１５−フェニルポルフィリンを上述したように１０及び２０メソ位でブロム化した。メソ１０，２０−ジブロム化した生成物（０．７５ミリモル）を乾燥ＴＨＦ（５０ｍＬ）又はトルエン（５０ｍＬ）中に溶解し、カップリング反応で用いるボロン酸に応じて、テトラキス−（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．７５ミリモル）及び無水リン酸カリウム（０．７５ミリモル）を添加し、次いで、還流冷却器をフラスコに装着し、及び全体の装置をアルゴン雰囲気下に配置した。次いで、所要のアリール又は複素環式ボロン酸を適切な溶媒（１０ｍＬ）中の溶液として注入によって添加した。反応物を還流させ、ＴＬＣによって完結させた。完結の際に、粗製の反応混合物をジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈し、及び飽和炭酸水素ナトリウム（２×５０ｍＬ）、水（２×５０ｍＬ）及びかん水（２×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、及び減圧中の蒸発によって濃縮した。最後に、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；勾配溶出：ジクロロメタンからメタノールまで）によって精製し、紫色の結晶性固体としてのボックＮ−保護５−（アミノフェニル）−１５−フェニル−１０，２０−（ジアリール）−ポルフィリンを与えた。ボック保護基を、クロロホルム又はアセトニトリル中のポルフィリンの溶解、溶解度に応じ、更にトリメチルシリルヨウ化物（１．２等量）の添加によって除去し、３０分後、メタノール（１０ｍＬ）を用いて反応をクエンチングさせた。蒸発による溶媒の除去、次いで、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；勾配：ジクロロメタンからメタノールまで）によって精製し、５−（アミノフェニル）−１５−フェニル−１０，２０−（ジアリール）−ポルフィリンを与え、これを標準的な方法〔Ｃｌａｒｋｅ，Ｏ．Ｊ．及びＢｏｙｌｅ，Ｒ．Ｗ．（１９９９．Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２３１）〕を用いる１，１’−チオカルボニルジ−２（１Ｈ）−ピリドンでの処理によって表題の化合物に転換した。
【０１０５】
例２２
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリ（４−グリコシルフェニル）−ポルフィリン及び５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−（４−グリコシルフェニル）−ポルフィリン−一般的な合成方法
４−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ）ベンズアルデヒドを、Ｌｉｎｄｓｅｙ（リンジー）条件〔Ｓｏｌ（ソル），Ｖ．，Ｂｌａｉｓ（ブレイズ），Ｊ．Ｃ．，Ｃａｒｒｅ（カレ），Ｖ．，Ｇｒａｎｅｔ（グラネ），Ｒ．，Ｇｕｉｌｌｏｔｏｎ（ギロトン），Ｍ．，Ｓｐｉｒｏ（シュピーロ），Ｍ．，Ｋｒａｕｓｚ（クラウス），Ｐ．（１９９９）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４，４４３１〕を用いて、４−ニトロベンズアルデヒド及びピロールで凝縮させ、及び粗製の反応混合物をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、５−（４−ニトロフェニル）−１０，１５，２０−トリス［４−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−β−グルコピラノシルオキシ）フェニル］ポルフィリンを与えた。あるいはまた、４−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシロキシ）ベンズアルデヒドを用い、Ｂｏｙｌｅの方法（Ｂｏｙｌｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｂｒｕｃｋｎｅｒ，Ｃ．，Ｐｏｓａｋｏｎｙ，Ｊ．，Ｊａｍｅｓ，Ｂ．Ｒ．，Ｄｏｌｐｈｉｎ，Ｄ．（１９９９）Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ．７６，２８７）を用いることで、５−（４−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシロキシ）フェニル）ジピロメタンを合成し、次いで凝縮して、５−（４−ニトロフェニル）−１５，−［４−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−β−グルコピラノシルオキシ）フェニル］ポルフィリンを与えた。これらのポルフィリンのニトロ基の還元をＴＨＦ中への溶解及び炭素上での１０％パラジウムの添加によって行った。混合物のＨ２下での５時間の撹拌に次いでＣｅｌｉｔｅ（セライト）によるろ過を行い、及びフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して相当するアミノポルフィリンを与え、これを、アルゴン下、無水１，４−ジオキサンにおいて炭酸水素ナトリウム（６等量）の存在下にエフモッククロライド（２等量）と反応させることによってＮ保護した。反応をＴＬＣによって監視し、及び完結の際、ジクロロメタンで希釈し、及び水で洗浄し次いで有機層の乾燥（ＭｇＳＯ４）の前にかん水で洗浄した。フラッシュカラムクロマトグラフィーによる精製は、エフモックＮ−保護５−（４−アミノフェニル）−１０，１５，２０−トリス［４−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−β−グルコピラノシルオキシ）フェニル］ポルフィリン又は５−（４−アミノフェニル）−１５，−［４−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−β−グルコピラノシルオキシ）フェニル］ポルフィリンを与えた。Ｎ及びＯ保護基を、ジクロロメタン／モルフォリン（１：１）中でのポルフィリンの溶解及び１時間の撹拌によって除去した。減圧中での蒸発による溶媒の除去に次いで残留物をジクロロメタン及びメタノール（４：１）中で再溶解した。乾燥メタノール中のナトリウムメタノレート（ｓｏｄｉｕｍ ｍｅｔｈａｎｏｌａｔｅ）（ＯＡｃ基当たり１．５等量）を添加し、及びその混合物を１時間撹拌した。十分に脱保護したポルフィリンを、ヘキサンを用いた沈殿によって回収した。最後に、５−（４−アミノフェニル）ポルフィリンを乾燥メタノール中で溶解し、及び１，１’−チオカルボニルジ−２（１Ｈ）−ピリドン（２等量）を添加した。反応物を、アルゴン下、２時間撹拌し、及びＴＬＣによって監視し、完結の際、溶媒を減圧中で蒸発させ、及び粗生成物を調製用の媒体圧逆相クロマトグラフィー（Ｃ１８；勾配溶出：０．１％ＴＦＡ水溶液からメタノールまで）によって精製した。
【０１０６】
例２３：
対称的なポルフィリン／クロリンジオール／バクテリオクロリンテトロールシリーズ
５，１５−（３，４，５−トリスメトキシフェニル）ポルフィリン（一般的方法）
３Ｌの丸底フラスコに、５−（３，４，５−トリスメトキシフェニル）ジピロメタン（１．８６ｇ，６ミリモル）、次いで、Ｎ２下にＤＣＭ（１Ｌ）を添加した。この撹拌した溶液に、オルトギ酸トリメチル（４８ｍＬ，ミリモル）を添加した。次いで、ＤＣＭ（５００ｍＬ）中のトリクロロ酢酸（２３．０ｇ，ミリモル）の溶液を含有する圧均等滴下漏斗をそのフラスコに装着し、及びその溶液をその反応混合物に１０分間にかけて滴下して加えた。反応容器をアルミニウムホイル中に被覆して光を遮り、及びＮ２下に３．５時間撹拌した。次いで、ピリジンを反応混合物中に、迅速に撹拌しながら添加し、及び反応物を更に１６時間、光を遮りながら、Ｎ２の下に室温で撹拌させた。アルミニウムホイルを除去し、及びその溶液中で空気を２０分間泡立てた。この後、その反応物を更に３時間室温でアルミニウムホイルを除去した状態で栓なしで撹拌させた。次いで、反応混合物を減圧中で濃縮して、蒸発、次いで高い減圧によってＤＣＭ及び残留するピリジンを除去した。次いで、粗製の反応混合物をフラッシュシリカゲル（２５０ｍＬ）上でクロマトグラフ処理し（ＤＣＭ及び少しのメタノールから５０ｍＬのフラッシュシリカゲルに乾燥負荷して完全な溶解性を確保した。）、クロロホルムを用いて溶出した。表題の化合物を紫色の結晶性固体として得た（３４７ｍｇ，１８％）；λｍａｘ／（相対強度）４１０（１．０），５０２（０．０４），５３８（０．０２），５７８（０．０１５），６３０（０．０１）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ＝６３４ｎｍ（λ励起＝４０８ｎｍ）；（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１０．３２（２Ｈ，ｓ，１０−Ｈ，２０−Ｈ），９．４０（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．１８（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），７．５２（４Ｈ，ｓ，ｏ−Ａｒ），４．２０（６Ｈ，ｓ，ＣＨ３），４．００（１２Ｈ，ｓ，ＣＨ３），−３．１０（２Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝６４３．４（１００％，Ｍ＋）。
【０１０７】
７，８−ジヒドロキシ５，１５−（３，４，５−トリスメトキシフェニル）クロリン（一般的方法）
ＨＰＬＣ等級のクロロホルム（５．０ｍＬ）中の５，１５−（３，４，５−トリスメトキシフェニル）ポルフィリン（５０ｍｇ，７７．８μモル）の撹拌した溶液に、無水ピリジン（０．５ｍＬ）中の四酸化オスミウム（２．５等量，０．１９５ミリモル，４９ｍｇ）の溶液を添加した。反応容器にＮ２を流し、及びわずかに油を塗ったガラス栓を用いて密封し、次いでアルミニウムホイル中に被覆し光を遮り、及び７２時間室温で撹拌させた。この期間の後、反応容器のガラス栓をプラスチック栓と置き換え、及び硫化水素ガスの連続した流れによって反応混合物中を５分間泡立てた（ガス出口ニードルを取り付け、及び過剰な硫化水素ガスを、鉱油及び漂白溶液でそれぞれ満たされた一連のＤｒｅｓｈｅｌ（ドレッシェル）ボトル中に逃がした）。この時間の後、反応混合物をＣｅｌｉｔｅ（Ｒ）（登録商標）によってろ過し、及び次いで減圧中で濃縮した。いくらかの過剰なピリジンを高減圧下に除去した。次いで、粗製の反応混合物をフラッシュシリカゲル（１００ｍＬ）上でクロマトグラフ処理し（ＤＣＭ及び少しのメタノールから２０ｍＬのフラッシュシリカゲルに乾燥負荷して完全な溶解性を確保した。）、ＤＣＭ中の１％メタノールを用いて溶出した。いくつかの出発物質を回収し（１５％）、及び表題の化合物をブラウニー−パープルの結晶性固体として得た、（２６ｍｇ，５０％）；融点１７０℃（分解）；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ（相対強度）４１０（１．０），５０４（０．０９），５３４（０．０６），５８２（０．０４），６３６（０．１８）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ６３９ｎｍ（λ励起４１０ｎｍ）；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）９．９８（１Ｈ，ｓ，１０−Ｈ），９．４２（１Ｈ，ｓ，２０−Ｈ），９．２０（１Ｈ，ｍ，β−Ｈ），９．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．９９（２Ｈ，ｓ，β−Ｈ），８．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．６６（１Ｈ，ｍ，β−Ｈ），７．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１５−ｏ−Ａｒ），７．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１５−ｏ−Ａｒ），７．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，５−ｏ−Ａｒ），７．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１５−Ｏ−Ａｒ），６．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，７−Ｈ），６．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，８−Ｈ），４．１７（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），４．１５（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），４．０４（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），４．００（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），３．９８（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），３．９１（３Ｈ，ＣＨ３），−１．８０（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ），−２．１９（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝６７７．３（１００％，Ｍ＋）；Ｃ３８Ｈ３６Ｎ４Ｏ８についての計算されたＨＲＭＳは：６７６．２５３３、見出されたのは：６７６．２５８７である。
【０１０８】
７，８，１７，１８−テトラヒドロキシ−５，１５−（３，４，５−トリスメトキシフェニル）バクテリオクロリン（一般的方法）
ＨＰＬＣ等級のクロロホルム（５．０ｍＬ）中の５，１５−（３，４，５−トリスメトキシフェニル）ポルフィリン（５０ｍｇ，７７．８μモル）の撹拌した溶液に、無水ピリジン（０．５ｍＬ）中の四酸化オスミウム（５．０等量，０．３９ミリモル，４９ｍｇ）の溶液を添加した。反応容器にＮ２を流し、及びしっかりと油を塗ったガラス栓を用いて密封し、次いでアルミニウムホイル中に被覆し光を遮り、及び７２時間室温で撹拌させた。この期間の後、反応容器のガラス栓をプラスチック栓と置き換え、及び硫化水素ガスの連続した流れによって反応混合物中を５分間泡立てた（ガス出口ニードルを取り付け、及び過剰な硫化水素ガスを、鉱油及び漂白溶液でそれぞれ満たされた一連のドレッシェルボトル中に逃がした）。この時間の後、反応混合物をＣｅｌｉｔｅ（Ｒ）によってろ過し、及び次いで減圧中で濃縮した。いくらかの過剰なピリジンを高減圧下に除去した。次いで、粗製の反応混合物をフラッシュシリカゲル（１００ｍＬ）上でクロマトグラフ処理し（ＤＣＭ及び少しのメタノールから２０ｍＬのフラッシュシリカゲルに乾燥負荷して完全な溶解性を確保した。）、最初にＤＣＭ中の１％メタノールを用いる溶出でクロリン副産物を溶出し、次いでＤＣＭ中の２．５％メタノールで、主要なバクテリオクロリン異性体〔トランス型と思われるＢｒｕｃｋｎｅｒ（ブレックナー）等の（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３６，９４２５〕を溶出させた。表題の化合物を緑がかった−ピンク（ｇｒｅｅｎｙ−ｐｉｎｋ）の結晶性固体として得た、（２０ｍｇ，３６％）；融点１３５℃（分解）；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ（相対強度）３７４（１．０），５１２（０．２３），７０２（０．５２）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ７０８ｎｍ（λ励起５１２ｎｍ）；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）９．２３（２Ｈ，ｓ，１０−Ｈ，２０−Ｈ），８．７９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，β−Ｈ），８．４４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，β−Ｈ），７．３７（２Ｈ，ｓ，５＋１５−ｏ−Ａｒ），７．１３（２Ｈ，ｓ，５＋１５−ｏ−Ａｒ），６．３１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，７−Ｈ，１７−Ｈ），６．０１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，８−Ｈ，１８−Ｈ），４．１２（６Ｈ，ｓ，ＣＨ３），３．９２（６Ｈ，ｓ，ＣＨ３），３．８９（６Ｈ，ｓ，ＣＨ３），−１．９７（２Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝７１２．４（１００％，（Ｍ＋１）＋）；Ｃ３８Ｈ３６Ｎ４Ｏ１０についての計算されたＨＲＭＳは：７１０．２５９０、見出されたのは：７１０．２６０７である。
【０１０９】
例２４
生物学的接合のための非対称ポルフィリン／クロリンジオール／バクテリオクロリンテトロール蛍光色素の組合せ
５−（４−アセトミドフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン
所要の非対称ジフェニルポルフィリンを、先立って概要を述べた一般的な方法を用いるが、わずかな改変のみを行って合成した。この例では、ジピロメタンの混合物を用いた。それぞれのジピロメタンの異なる反応性により、混合されたポルフィリンの最適化に必要な量は異なっていた。同じ規模の反応のために、５−（４−メトキシフェニル）ジピロメタン（５０５ｍｇ，２ミリモル）及び５−（４−アセトミドフェニル）ジピロメタン（８３８ｍｇ，３ミリモル）を用いた。ポルフィリン混合物をシリカゲル（４００ｍＬ）上でクロマトグラフ処理し（ＤＣＭ及び少しのメタノールから２０ｍＬのフラッシュシリカゲルに乾燥負荷して完全な溶解性を確保した。）、最初にＤＣＭ（１ガラスピペットいっぱいのトリエチルアミンを溶出液の５００ｍＬに添加し溶出を助けた。）を用いて溶出し、５，１５−（メトキシフェニル）ポルフィリンの副産物を除去した。この成分の分離後、溶出をクロロホルムで続け、５−（４−アセトミドフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリンを収集した。望ましいポルフィリンを紫色の結晶として得た（１５０ｍｇ，１２％）；λｍａｘ／（相対強度）４１０（１．０），５０２（０．０４），５３８（０．０２），５７８（０．０１５），６３０（０．０１）ｎｍ；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１０．３５（２Ｈ，ｓ，１０−Ｈ，２０−Ｈ），９．４３（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．１４（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．６５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，５−ｍ−Ａｒ），８．２２−８．１２（４Ｈ，ｄ（重複），Ｊ＝８．１Ｈｚ，５−ｏ−Ａｒ＋１５−ｏ−Ａｒ），７．５６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１５−ｍ−Ａｒ），４．１４（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），−３．００（２Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝５５０．３（１００％，Ｍ＋）。
【０１１０】
５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン
５−（４−アセトミドフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン（１００ｍｇ，０．１８２ミリモル）を１８％塩酸（２００ｍＬ）で処理し、及び空気冷却機を取り付けた。緑色の溶液を３時間８５℃に温めた。冷却に先立って、反応混合物を減圧中で濃縮し（水流吸引機；蒸発装置水浴７５℃）、過剰の塩酸を除去し、次いで、ＤＣＭ中のトリエチルアミン（５０ｍＬ）の溶液を用いて慎重に処理した。有機抽出物を、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）に先立って、水（１００ｍＬ）次いで飽和かん水（１００ｍＬ）で洗浄し、ブフナー漏斗によってろ過し、及び最後に減圧中で濃縮した。所要のポルフィリンをシリカゲル（１００ｍＬ）上のクロマトグラフィー（１０ｍＬのＤＣＭ中での液体負荷）、ＤＣＭ（１ガラスピペットいっぱいのトリエチルアミンを５００ｍＬの溶出液に添加し溶出を助けた。）を用いる溶出によって得た。望ましいポルフィリンを、紫色の結晶として得た；（１５０ｍｇ，１２％）；λｍａｘ／（相対強度）４１０（１．０），５０３（０．０４５），５３８（０．０２），５７８（０．０１５），６３０（０．００５）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ＝６３４ｎｍ（λ励起＝４１０ｎｍ）；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１０．３０（２Ｈ，ｓ，１０−Ｈ，２０−Ｈ），９．３９（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，β−Ｈ），９．１７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，β−Ｈ）９．１０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，β−Ｈ），８．１９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１５−ｏ−Ａｒ），８．０７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，５−ｏ−Ａｒ），７．３５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１５−ｍ−Ａｒ），７．１４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，５−ｍ−Ａｒ），４．１３（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），４．０８（２Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ），−３．０６（２Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝５０８．３（１００％，（Ｍ＋１）＋）。
【０１１１】
５−（４−フルオレノメチルアミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン
無水１，４−ジオキサン（２．５ｍＬ）中の５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン（２８ｍｇ，５５μモル）の撹拌した溶液に、固体の炭酸水素ナトリウム（６等量，２８ｍｇ，０．３３ミリモル）を添加した。次いで、この混合物に、１，４−ジオキサン（０．５ｍＬ）中の９−フルオレノメチルクロロフォルメート（２等量，０．１１ミリモル，２８．５ｍｇ）の溶液をＮ２下に添加した。反応フラスコをアルミニウムホイルで被覆し光を遮り、及び室温で３時間撹拌した。このとき、反応が完結した（ＴＬＣによって監視したように）。１，４−ジオキサンを減圧中で除去し、及び残留物を水（２５ｍＬ）とＤＣＭ（２×２５ｍＬ）との間に分配させた。組み合わせた有機抽出物を飽和かん水（２５ｍＬ）で洗浄し、次いで乾燥させ（無水Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、及び減圧中で濃縮した。所要のポルフィリンをシリカゲル（１００ｍＬ）上のクロマトグラフィー（溶解のためにＤＣＭ及び少しのメタノールから１０ｍＬのフラッシュシリカゲルに乾燥負荷した。）、ＤＣＭを用いる溶出によって得た。望ましいポルフィリンを、紫色の結晶として得た；（３８ｍｇ，９５％）；λｍａｘ／（相対強度）４１０（１．０），５０５（０．０４２），５４１（０．０２），５７８（０．０１５），６３３（０．０１）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ＝６３５ｎｍ（λ励起＝４１０ｎｍ）；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１０．３５（２Ｈ，ｓ，１０−Ｈ，２０−Ｈ），９．６９（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ），９．４４（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．１２（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．２０−８．１７（４Ｈ，２×ｄ（重複），Ｊ＝８．１Ｈｚ，５＋１５−ｏ−Ａｒ），７．８５（４Ｈ，ｍ，５＋１５−ｍ−Ａｒ），７．７６−７．６６（２Ｈ，ｍ，フルオレノ−Ａｒ），７．５１−７．３０（６Ｈ，ｍ，フルオレノ−Ａｒ），４．６９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ２），４．３０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ），４．１３（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），−３．１５（２Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝７３１．５（１００％，（Ｍ＋１）＋），５０８．３（５２％，（Ｍ−ＦＭＯＣ＋１）＋）。
【０１１２】
１７，１８−ジヒドロキシ−５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリン及び７，８−ジヒドロキシ５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリンレジオイソマー
５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン（２８ｍｇ，５５．２μモル）を、先立って述べた一般的なクロリン形成方法を用いて、クロリンジオールのレジオイソマーの混合物に転換した。次いで、粗製の反応混合物をフラッシュシリカゲル（２００ｍＬ）上でクロマトグラフ処理し（ＤＣＭ及び少しのメタノールから２０ｍＬのフラッシュシリカゲルに乾燥負荷し完全な溶解性を確保した。）、ＤＣＭ中の１％メタノールで溶出し、最初にいくつかの未反応出発物質、次いでブラウニー−パープルの結晶性固体としてのより一層高いＲｆのクロリン異性体を溶出した。より一層低いＲｆの異性体を、更にＤＣＭ中の２．５％のメタノールでの溶出によって得、及びまたブラウニー−パープルの結晶性固体を与えた。
高いＲ ｆ のクロリンレジオイソマー〔２，３−ジヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−１５−（４−アミノフェニル）クロリン，ｎＯｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ（ノエメジャーメンツ）及びＪＰＰ ｐａｐｅｒ（ペーパー）から〕：（８．５ｍｇ，３０％）；融点１６５℃（分解）；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ（相対強度）４０１（０．９９），４１４（１．０），５０３（０．０８），５３５（０．０７），５８２（０．０３５），６３６（０．２２）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ６３９ｎｍ（λ励起４１２ｎｍ）；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＭｅＯＨ−ｄ４）９．９５（１Ｈ，ｓ，１０−Ｈ），９．４２（１Ｈ，ｓ，２０−Ｈ），９．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．９７（２Ｈ，ｓ，β−Ｈ），８．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．５１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．０５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｏ−Ａｒ），７．９４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｏ’−Ａｒ），７．２５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｍ−Ａｒ），７．１２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｍ’−Ａｒ），６．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１７−Ｈ），６．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１８−Ｈ），４．０８（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），（ＮＨのものの交換），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝６４２．２（１００％，（Ｍ＋１）＋）。
低いＲ ｆ のクロリンレジオイソマー〔ｎＯｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ及びＪＰＰ ｐａｐｅｒからの２，３−ジヒドロキシ−５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリン〕：（８．５ｍｇ，３０％）；融点１６８℃（分解）；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ（相対強度）４０１（０．９９），４１３（１．０），５０７（０．０８），５３６（０．０６），５８６（０．０２５），６３７（０．２０）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ６３９ｎｍ（λ励起４１２ｎｍ）；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＭｅＯＨ−ｄ４）９．９６（１Ｈ，ｓ，２０−Ｈ），９．４０（１Ｈ，ｓ，１０−Ｈ），９．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０，β−Ｈ），８．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．７４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．５８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｏ−Ａｒ），８．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｏ−Ａｒ），７．９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｏ’−Ａｒ），７．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｏ’−Ａｒ），７．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｍ−Ａｒ），７．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｍ−Ａｒ），７．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｍ’−Ａｒ），７．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｍ’−Ａｒ），６．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，７−Ｈ），６．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，８−Ｈ），４．１１（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），（ＮＨのものの交換），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝６４２．２（１００％，（Ｍ＋１）＋）。
【０１１３】
１７，１８−ジヒドロキシ−５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリン（より一層高いＲｆレジオイソマー）
ＤＣＭ（２５ｍＬ）中の１，ｌ’−チオカルボニルジ−２（１Ｈ）−ピリドン（１．０７等量，７．６ｍｇ，４３．５ミリモル）の撹拌した溶液に、（活性化アルミナカラム中の通過によって乾燥させた。）、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の１７，１８−ジヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−１５−（４−アミノフェニル）クロリン（１７．５ｍｇ，２３．２□モル）の溶液を添加した。反応フラスコをアルミニウムホイルで被覆し光を遮り、及びＮ２下に２時間撹拌し、その時間でＴＬＣが出発物質の完全な消失を示した。次いで、反応混合物を水（２×５０ｍＬ）及び飽和かん水（５０ｍＬ）で洗浄し、次いで、乾燥した（無水Ｎａ２ＳＯ４）。次いで、有機抽出物をろ過し、及び１０ｍＬのフラッシュシリカゲル上で濃縮し、及びフラッシュシリカゲル（１００ｍＬ）上でクロマトグラフ処理し、ＤＣＭ中の１％メタノールで溶出して所要のイソチオシアナトクロリンジオールを溶出した（すべてのＴＤＰのＮＢ．微量成分を、カラムクロマトグラフィーからの生成物の濃縮に先立って除去しなければならず、さもないと、３つのより一層高いＲｆの副産物に対していくつかの分解が発生する。これらのことは、このときには確認できない。）表題の化合物をブラウニー−パープルの結晶性固体として得た（１７ｍｇ，９０％）；融点１５５℃（分解）；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ（相対強度）４１０（１．０），５０５（０．０９），５３４（０．０６），５８６（０．０４），６３７（０．１８）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ６３９ｎｍ（λ励起４１２ｎｍ）；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＭｅＯＨ−ｄ４）１０．０（１Ｈ，ｓ，１０−Ｈ），９．４５（１Ｈ，ｓ，２０−Ｈ），９．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），９．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．６４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｏ−Ａｒ），８．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｏ−Ａｒ），８．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｏ’−Ａｒ），７．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｏ’−Ａｒ），７．６５（２Ｈ，ｍ，ｍ−Ａｒ），７．２４（２Ｈ，ｍ，ｍ’−Ａｒ），６．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１７−Ｈ），６．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１８−Ｈ），４．０８（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），（ＮＨのものの交換），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝５８３．７（１００％，Ｍ＋）；Ｃ３４Ｈ２６Ｎ５Ｏ３Ｓについての計算されたＨＲＭＳは：５８４．１７５７、見出されたのは：５８４．１７５６（（Ｍ＋１）＋）である。
【０１１４】
７，８，１７，１８−テトラヒドロキシ−５−（４−フルオレノメチルアミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）バクテリオクロリン（シス／トランス立体異性体）
５−（４−フルオレノメチルアミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン（３５ｍｇ，４８．０□モル）を、先立って述べた一般的なバクテリオクロリン形成方法を用いて、バクテリオクロリンの立体異性体の混合物に転換した。次いで、粗製の反応混合物をフラッシュシリカゲル（２００ｍＬ）上でクロマトグラフ処理し（ＤＣＭ及び少しのメタノールから２０ｍＬのフラッシュシリカゲルに乾燥負荷し完全な溶解性を確保した。）、ＤＣＭ中の１％メタノールで最初に溶出し、より一層高いＲｆのクロリン副産物を溶出し、次いで２％メタノール／ＤＣＭで２つの立体異性のバクテリオクロリンを別々に溶出した。より一層高いＲ ｆ −トランスのバクテリオクロリン異性体を、ピンキー−グリーンの結晶性固体として単離した（６ｍｇ，１５％）；融点１４２℃（分解）；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ（相対強度）３７４（１．０），５１２（０．２３），７０２（０．５２）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ７０８ｎｍ（λ励起５１２ｎｍ）；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＭｅＯＨ−ｄ４）９．２０（２Ｈ，ｓ，１０−Ｈ，２０−Ｈ），８．７８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．３６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），７．９５（２Ｈ，ｍ，ｏ−Ａｒ），７．８５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，フルオレノ−Ａｒ），７．７９（２Ｈ，ｍ，ｏ’−Ａｒ），７．６５（２Ｈ，ｍ，ｍ’−Ａｒ），７．４７−７．３８（６Ｈ，ｍ，フルオレノ−Ａｒ），７．２４（２Ｈ，ｍ，ｍ−Ａｒ），６．２７−６．２４（２Ｈ，２×ｄ（重複），Ｊ＝６．５Ｈｚ，７−Ｈ，１７−Ｈ），５．８５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，８−Ｈ，１８−Ｈ），４．６５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ２），４．３９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ），４．０６（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），−１．９４（２Ｈ，ｂｒ．ｓ（部分的に交換），ＮＨ），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝８００．４（１００％，（Ｍ＋１）＋）。
より一層低いＲ ｆ −シスのバクテリオクロリン異性体を、ピンキー−グリーンの結晶性固体として単離した（８．５ｍｇ，２１％）；融点１４８℃（分解）；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ（相対強度）３７４（１．０），５１２（０．２４），７０３（０．５４）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ７０８ｎｍ（λ励起５１２ｎｍ）；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＭｅＯＨ−ｄ４）９．１２（２Ｈ，ｓ，１０−Ｈ，２０−Ｈ），８．７６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．３４（２Ｈ，２×ｄ（重複），Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．０２（２Ｈ，ｍ，ｏ−Ａｒ），７．８５（２Ｈ，ｄ（不明瞭），Ｊ＝８．０Ｈｚ，ｏ’−Ａｒ），７．８３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，フルオレノ−Ａｒ），７．７６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，ｍ’−Ａｒ），７．５０−７．３８（６Ｈ，ｍ，フルオレノ−Ａｒ），７．２４（２Ｈ，ｍ，ｍ−Ａｒ），６．２７−６．２３（２Ｈ，２×ｄ（重複），Ｊ＝６．５Ｈｚ，７−Ｈ，１７−Ｈ），５．８５−５．８２（２Ｈ，２×ｄ（重複），Ｊ＝６．５Ｈｚ，８−Ｈ，１８−Ｈ），４．６５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ２），４．３９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ），４．０５（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），−１．８８（２Ｈ，ｂｒ．ｓ（部分的に交換），ＮＨ），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝８００．４（１００％，（Ｍ＋１）＋）。
【０１１５】
７，８，１７，１８−テトラヒドロキシ−５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）バクテリオクロリン（より一層低いＲｆシス立体異性体）
ＤＣＭ中の２５％メタノール（１．２５ｍＬ）における７，８，１７，１８−テトラヒドロキシ−５−（４−フルオレノメチアミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）バクテリオクロリン（より一層低いＲｆシス立体異性体）（８．５ｍｇ，１０．７μモル）の溶液をピペリジン（５０等量，５３μＬ，０．５３ミリモル）で処理し、及び３時間の時間光を遮ってＮ２下に室温で撹拌した。反応混合物を減圧中に濃縮しピペリジンのすべての微量成分を除去した（高い減圧が必要である。）。ＤＣＭ中の１，１’−チオカルボニルジ−２（１Ｈ）−ピリドン（１．０７等量，７．６ｍｇ，４３．５ミリモル）（２５ｍＬ）の撹拌した溶液に、（活性化させたアルミナカラムに通すことによって乾燥させて）ＤＣＭ中の２，３，１２，１３−テトラヒドロキシ−５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）バクテリオクロリン（６．１ｍｇ，１０．７μモル）（１０ｍＬ）の溶液を添加した。反応フラスコをアルミニウムホイルで被覆し光を遮り、及びＮ２下に２時間、ＴＬＣが出発物質の完全な減少を示す時間撹拌させた。次いで、反応混合物を水（２×５０ｍＬ）で及び飽和かん水（５０ｍＬ）で洗浄し、次いで乾燥させた（無水Ｎａ２ＳＯ４）。次いで、有機抽出物をろ過し、及び１０ｍＬのフラッシュシリカゲル上で濃縮してフラッシュシリカゲル（１００ｍＬ）上でクロマトグラフ処理し、ＤＣＭ中の２％メタノールで溶出して所要のイソチオシアナトバクテリオクロリンテトロールを溶出させた（すべてのＴＤＰのＮＢ．微量成分を、カラムクロマトグラフィからの生成物の濃縮に先立って除去しなければならず、さもなければ、若干の分解が起こる。）。より一層低いＲ ｆ シスバクテリオクロリン異性体をピンキー−グリーンの結晶性固体として単離した（５．０ｍｇ，７６％）；融点１３２℃（分解）；）ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ（相対強度）３７５（１．０），５１６（０．２２），７０２（０．４８）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ７０９ｎｍ（λ励起５１６ｎｍ）；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＭｅＯＨ−ｄ４）９．２０（１Ｈ，ｓ，メソ−Ｈ）、９．１８（１Ｈ，ｓ，メソ’−Ｈ），８．７７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．１４（２Ｈ，ｍ，ｏ−Ａｒ），８．０５（２Ｈ，ｍ，ｏ’−Ａｒ），７．４２−７．０８（４Ｈ，ｍ，５＋１５−ｍ−Ａｒ），６．２０（２Ｈ，２×ｄ（重複），Ｊ＝６．５Ｈｚ，７−Ｈ，１７−Ｈ），５．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，８−Ｈ），５．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１８−Ｈ），４．０４（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），−１．８０（２Ｈ，ｂｒ．ｓ（部分的に交換），ＮＨ），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝６１８．９（１００％，（Ｍ＋１）＋）；Ｃ３４Ｈ２８Ｎ５Ｏ５Ｓについて計算されたＨＲＭＳは：６１８．１８１５、見出されたのは：６１８．１８１０（（Ｍ＋１）＋）である。
【０１１６】
また、さらなる合成プロトコル及び方法論プロトコルは、Ｓｕｔｔｏｎ等のＰｏｒｐｈｙｒｉｎ， Ｃｈｌｏｒｉｎ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｉｎ Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅｓ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｓ＆Ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｓｅｒｓ−印刷中）及びＯｌｉｖｅｒ（オリバ）Ｊ Ｃｌａｒｋｅ（クラーク），Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏ Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ ｆｏｒ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ（博士号論文，２００１年４月，エセックス大学）に記載されている；各々のすべての内容を参考として本明細書に組み入れる。
【０１１７】
方法論の記載１：一般的な生物学的接合プロトコル
ヘキサヒドロキシＰＩＴＣ＋抗体
ＤＭＳＯ中のヘキサヒドロキシＰＩＴＣの保存溶液を０．０２７のモル濃度に調製し、この溶液を乾燥させ及び必要なときまで０℃で貯蔵した。抗体の溶液を滅菌したＰＢＳに対して大規模に透析しアジ化物の任意の微量成分を除去した。次いで、透析した抗体の溶液を遠心性の濃縮によって１０ｍｇ／ｍＬの濃度に調整し、及び２５０μＬのアリコートに分けた。
炭酸水素ナトリウムの１Ｍ溶液を調製し、及び２Ｍ水酸化ナトリウムを用いてｐＨ９．０に調整した。
抗体の２５０μＬのアリコートに、３０μＬの１Ｍ炭酸水素ナトリウムを添加した。次いで、所定の容積のヘキサヒドロキシＰＩＴＣの保存溶液を添加し、望ましいモル比（ＭＲ）のポルフィリンを抗体に与えた。例えば、２０のＭＲは、２５０μＬの１０ｍｇ／ｍＬの抗体に１０μＬの保存溶液の添加によって達成された。生物学的接合反応混合物中でのＤＭＳＯの一定の濃度を維持するために、保存溶液のすべてのアリコートを更に一部のＤＭＳＯを用いて２５μＬに希釈した。
【０１１８】
ＰＩＴＣの添加に次いで、生物学的接合の反応物を２５℃で１時間緩徐に撹拌した。１時間後、粗製の生物学的接合反応混合物を、滅菌したＰＢＳ（２５ｍＬ）で前もって平衡化された予め包装されたＰＤ１０寸法排除カラムの頂上に直接負荷した。カラムを無菌のＰＢＳで溶出させた。抗体−ポルフィリン接合物を最初の色のバンド／画分中に溶出させた。抗体−ポルフィリン接合物の濃度はクロマトグラフィーの間の希釈により１．２５ｍｇ／ｍＬとして測定された。抗体に対するポルフィリンの標識の程度（ＤＯＬ，ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ）を、ポルフィリン及びタンパク質の双方についてのモル吸光率の既知の定数を用いる標準的な分光法によって算出した。
抗体−ポルフィリン接合物を、更に濃縮することなく、他に断らない限り、ＰＢＳ＋アジ化物中、０℃で保存した。
【０１２０】
Ｎ−メチルピリジニウムクロライドＰＩＴＣ＋抗体
ＤＭＳＯ中のＮ−メチルピリジニウムクロライドＰＩＴＣの保存溶液を０．０２７モル濃度に調製し、この溶液を乾燥させ、及び用いるまで０℃で保存した。抗体の溶液を滅菌したＰＢＳに対して大規模に透析しアジ化物の任意の微量成分を除去した。次いで、透析した抗体の溶液を遠心性の濃縮によって１０ｍｇ／ｍＬの濃度に調整し、及び２５０μＬのアリコートに分けた。
炭酸水素ナトリウムの１Ｍ溶液を調製し、及び２Ｍ水酸化ナトリウムを用いてｐＨ９．０に調整した。
抗体の２５０μＬのアリコートに、２５０μＬの滅菌ＰＢＳ、次いで６０μＬの１Ｍ炭酸水素ナトリウムを添加した。次いで、所定の容積のＮ−メチルピリジニウムクロライドＰＩＴＣの保存溶液を添加し、望ましいモル比（ＭＲ）のポルフィリンを抗体に与えた。例えば、２０のＭＲは、５００μＬの５ｍｇ／ｍＬの抗体に１０μＬの保存溶液を添加することによって達成された。生物学的接合反応混合物中でのＤＭＳＯの一定の濃度を維持するために、保存溶液のすべてのアリコートを更に一部のＤＭＳＯを用いて２５μＬに希釈した。
【０１２１】
ＰＩＴＣの添加に次いで、生物学的接合の反応物を２５℃で１時間緩徐に撹拌した。１時間後、粗製の生物学的接合反応混合物を、滅菌ＰＢＳ（２５ｍＬ）で前もって平衡化された予め包装されたＰＤ１０寸法排除カラムの頂上に直接負荷した。カラムを滅菌ＰＢＳで溶出させた。抗体−ポルフィリン接合物を最初の色のバンド／画分中に溶出させた。抗体−ポルフィリン接合物の濃度はクロマトグラフィーの間の希釈によって１．２５ｍｇ／ｍＬとして測定された。抗体に対するポルフィリンの標識の程度（ＤＯＬ）を、ポルフィリン及びタンパク質の双方についてのモル吸光率の既知の定数を用いる標準的な分光法によって算出した。
抗体−ポルフィリン接合物を、更に濃縮することなく、他に断らない限り、ＰＢＳ＋アジ化物中、０℃で保存した。
【０１２３】
方法論の記載２：標準的な光細胞障害性
細胞を、集密にまでか、又は適当な密度にまで増殖させ、次いで２回ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で洗浄し、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）のすべての痕跡成分を除去した。細胞密度を、ＦＢＳを含まない培地中で１．５×１０６細胞／ｍＬに調整し、及び次いで、これらを１時間、暗所（３７度Ｃ，５％ＣＯ２）、光増感剤／接合物濃度の範囲で温置する。温置後、細胞を更に培地（ＦＢＳを含まない）で洗浄して結合しない光増感剤を除去し、次いで再懸濁させ、及びクワドルプレート（ｑｕａｄｒｕｐｌａｔｅ）中の９６ウェルプレート（１×１０５細胞／ウェル）に播種した。次いで、プレートを照射するか（フィルターを通した赤色光□６００ｎｍの３．６Ｊ／ｃｍ２）、又は暗所中で“暗所毒性コントロール”として、同じ時間（〜１４分）の間放置するかのいずれかを行う。ＦＢＳの５マイクロリットル（５％／ウェル）を、照射／暗所の期間の後、添加し、及びプレートを、一昼夜の温置に戻す。処理後１２から２４時間まで、１０μＬのＭＴＴ溶液〔ＰＢＳ中のＳｉｇｍａ Ｔｈｉａｚｏｌｙｌ ｂｌｕｅ（シグマチアゾリルブルー）、４．８×１０−４Ｍ〕を、ウェル当たりに添加し、及びプレートを、発色まで（１及び４時間の間）インキュベータに戻す。酸−アルコールの溶液（イソプロパノール中の０．０４ＮのＨＣｌの１００μＬ／ウェル）を添加し、及び十分に混合し濃青色の結晶を溶解する。次いで、プレートをマイクロプレート読み取り機において５７０ｎｍで読み取り、及びその％の細胞生存率をコントロールに対して算出する。
【０１２４】
方法論の記載３：初期（ｉｎｉｔｉａｌ）フローサイトメトリー発色団分析
２つの蛍光色素プローブを、２，３−ジヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−１５−（４−イソチオシアナトフェニル）クロリン（より一層高いＲｆのレジオイソマー）及び２，３，１２，１３−テトラヒドロキシ−５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）バクテリオクロリン（より一層低いＲｆシス立体異性体）とアビジンとの先立って述べた標準的な生物学的接合プロトコルの下での別々の反応から作製した。初期フロー実験をこれらの各々のアビジンのＲＡＪＩ細胞及びビオチンモノクローナル抗体（ＨＬＡ−ＤＲＩ，Ｌ２４３）との接合物を利用することによって行った（レーザ励起４８８ｎｍ，＜６４０ｎｍ（ＦＬ２）＞６７０ｎｍ（ＦＬ３）での発光の収集）。データは、ＤＰＢＣ試料からの信号が、発光フィルター（ＦＬ３）に良好に適合するために、著しく高いことを示した。アビジンＤＰＣＨ又はＤＰＢＣのＬ２４３抗体との接合物はコントロールに比べ蛍光において中程度の増加を示した。アビジン−ＤＰＣＨ／ＤＰＢＣのより一層高い濃度を用いることによって、ピークの蛍光が増加し、それは接合物の初期濃度が、受容体を飽和させるのにか、又はそれほどではないにせよ、若干の非共有性の結合にとって余りに低いためのいずれかかもしれない。アビジン−ＤＰＣＨ／ＤＰＢＣ（抗体のない）とのコントロール試料は、Ｌ２４３抗体の不存在下に若干の背景蛍光を示し、接合物のＲＡＪＩ細胞に対する若干の非特異的結合が生じるか、又は若干の量の非共有的に結合するフルオロフォアがタンパク質から細胞表面に移ったことを示唆する。ＦＩＴＣ−アビジンのコントロールは、わずかにより一層高い信号がＦＬ２に存在し、それはまた広い発光バンドのためにＦＬ３にも現れることを示した。Ｌ２４３抗体の存在において、平均の信号は１５０％の増加を示した。このことは、非共有結合がＦＩＴＣ−アビジン接合物に対してあまり重要でないことを示した。
【０１２５】
実験を、フルオロフォアのタンパク質表面（ＢＳＡ及びアビジン）に対する非共有結合のレベルを決定するために行った。非反応性のＤＰＣＨ及びＤＰＢＣ誘導体２，３−ジヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−１５−（４−アセトミドフェニル）クロリン（より一層高いＲｆのレジオイソマー）及び２，３，１２，１３−テトラヒドロキシ−５−（４−アセトミドフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）バクテリオクロリン（より一層高いＲｆのトランス立体異性体）とＢＳＡ及びアビジンの双方の混合物を用いる‘ブランク’の生物学的接合を実行し、及び得られたタンパク質溶液を先に記載した反応性プローブのために記載したように、ゲルろ過（ＰＤ−１０）によって精製した。ＵＶ分析は、ほぼ同様の量の非反応性プローブがタンパク質に非共有的に結合することを示した。ＢＳＡ又はアビジンにとって、１つの非反応性ＤＰＣＨが各タンパク質分子に結合するが、ＤＰＢＣは、おそらくその増加した極性及び非両親媒性の性質によって１つより少ない。
【０１２６】
初期の研究を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、タンパク質（ＢＳＡ及びアビジン）から、非共有的に結合したフルオロフォアを除去した。‘ブランク’の生物学的接合の混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかける場合、すべての非共有的に結合したフルオロフォアの分離が行えた（可溶化したゲルセグメントの、ＢＳＡについての６６０００Ｄ及びアビジンモノマーについての１６５００ＤのＵＶ／蛍光は信号を示さなかった。）。さらに、これらの検討に加えて、我々は、ＢＳＡ（又はアビジン）に非共有結合するフルオロフォアがヒーラ細胞の表面に移ることを示すことができた。ヒーラ細胞を非共有結合的なフルオロフォア−タンパク質複合体の溶液に添加し、及び２０分間温置する場合、ヒーラ細胞を除去した溶液から蛍光が除去された。この効果は、２，３−ジヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−１５−（４−アセトミドフェニル）クロリン（より一層高いＲｆのレジオイソマー）で２，３，１２，１３−テトラヒドロキシ−５−（４−アセトミドフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）バクテリオクロリン（より一層高いＲｆのトランス立体異性体）よりも極めて顕著であった。細胞の再懸濁及び蛍光の測定は、ＤＰＣＨの場合において蛍光の１０倍の増加を示したが、ＤＰＢＣだけは中程度の増加を示した。これらの測定によって、タンパク質によるＤＰＣＨ及びＤＰＢＣの双方の重大な蛍光クエンチングが起こること、及びＤＰＣＨの両親媒性の性質がヒーラ細胞の膜中に組み込まれてほとんど完全な蛍光の修復が起こることを示唆する。ＤＰＢＣは、非両親媒性であり、それがタンパク質に対して行うように同様な方法でヒーラ細胞の表面を複雑にすることができ、同様な蛍光のクエンチングを起こす。
【０１２７】
フルオロフォア接合物がＳＤＳ−ＰＡＧＥによって精製できるので、我々は、非共有結合的に結合したフルオロフォアの除去のための技術として、調製用電気泳動の使用を検討した。このために、我々は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ミリポア社）から購入したＣｅｎｔｒｉｌｕｔｏｒ（Ｒ）（セントリルータ、登録商標）ｍｉｃｒｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｅｒ（マイクロ−エレクトロエルータ）を用いた。この装置はＳＤＳゲルから純粋なタンパク質フルオロフォア接合物を回収させた。
【０１２８】
方法論の記載４：Ｍｉｃｒｏ−Ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｅｒを用いるＳＤＳ ＰＡＧＥからの接合物の溶出
・著しく抑制した照明での作業、所要のタンパク質接合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを小さなストリップに切断し、及びセントリルータ試料管に添加し、及びその頂上を閉じた（半分以下、３〜４試料管を用いた）。
・エレクトロエルータのより一層低い緩衝液チャンバーを脱気したＳＤＳランニング緩衝液を用いて第１電極のレベルまで満たした。
・ミリポア社からの３から４のＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｒ）（セントリコン、登録商標）の遠心装置（ＢＳＡ接合物のためのＹＭ−３０及びアビジン接合物のためのＹＭ−３を用いた。）をエレクトロエルータの上側緩衝液チャンバーラック中の孔に下から（フィルター膜を下にして）しっかり挿入し、及びそのラックの空の孔を、ラックの下側から栓を設けることにより塞いだ。
・上側の緩衝液チャンバーを、エレクトロエルータの同じ側に並べた双方の電極を有する下側の緩衝液チャンバー中に配置した。
・次いで、上側の緩衝液チャンバーを、脱気したＳＤＳランニング緩衝液（上述のような）によって、すべてのＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｒ）ユニットの頂上が完全に浸漬するまで満たした。漏出が検出されない場合、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｒ）ユニットの下に捕捉された気泡を、曲がったプラスチックピペット（ペーパークリップを用いて強化した）によって除去した。
・次いで、セントリルータ試料管をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｒ）ユニットの頂上中に配置して、試料管がぴったりと装着されるようにし、及び試料緩衝液（気泡を上述の様に除去した）で完全に満たした。
・エレクトロエルータの安全カバーを追加し、及び電源装置を接続した（２００Ｖ，５０ｍＡを用いた）。
・２〜３時間の後、電源装置を除去し、及びＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｒ）フィルターをエレクトロエルータの上側緩衝液チャンバーから引き出した。
・ろ液バイアルをフィルターユニットに追加し、及び濃縮水のトップ（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ ｔｏｐ）を追加した。次いで、過剰の緩衝液を、５０００Ｇ（ＢＳＡ）及び７，５００Ｇ（アビジン）で２時間の遠心分離によって除去した。新鮮な０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｒ）ユニットに添加し、及びその方法をすべてのＳＤＳが除去されるまで繰り返した。
・次いで、濃縮された精製接合物を、フィルターユニットの濃縮水バイアル中に、反転及び遠心分離によって収集した。アジ化ナトリウム（２Ｍ，２０ｍＬ）を添加し、及び接合物を４℃で保存した。
【０１２９】
方法論の記載５：ＦＡＣＳ接合物結合プロトコル
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．３を用いて細胞のフラスコを洗浄する。ＰＢＳ中の５ｍＭのＥＤＴＡを用いて３７℃で１０分間処理する。フラスコを軽くたたいて細胞を移動させ、５０ｍＬのポリプロピレン管中に配置し、及び４００ｇの３分間で小さく丸める。１０ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁し、及び細胞を計数する。ＦＡＣＳ管〔ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）２０５４〕中に２×１０５で配置し、及び１ｍＬのＰＢＳを用いて遠心分離（４００ｇ３分）によって洗浄し、及びかき混ぜによって再懸濁させる。
細胞を、５００μＬのＰＢＳ中の２％マーベルミルク粉末、１％ＢＳＡ中で３０分間室温でブロックする。
細胞を１ｍＬのＰＢＳ／ＢＳＡ／アジ化物遠心分離中で洗浄し、及びペレットを再懸濁させる（上述のように）。
１０μＬの適切な希釈度の抗体を添加する。氷上で１時間温置する。
細胞を１ｍＬのＰＢＳ／ＢＳＡ／アジ化物遠心分離中で洗浄し、及びペレットを再懸濁させる（上述のように）。
５０μＬのラビット抗−マウス：ＦＩＴＣ〔Ｓｅｒｏｔｅｃ（セロテック），１／１００希釈〕を添加し、及び氷上暗所で１時間温置する。
細胞を１ｍＬのＰＢＳ／ＢＳＡ／アジ化物遠心分離中で洗浄し（上述のように）、及びペレットを４００μＬのＰＢＳ／ＢＳＡ／アジ化物中で再懸濁させる。
試料を、ＦＡＣＳ機械に、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（セルクエスト）捕捉（ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ）ソフトウェアを用いて通し、データを収集する。
ＰＢＳ／ＢＳＡ／アジ化物
２５０ｍＬ ＰＢＳ
０．６２５ｇ ＢＳＡ
１．５６ｍＬアジ化ナトリウム（１．６Ｍ）
【０１３０】
方法論の記載６：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
分離ゲル
成分 ゲルの％ ５ ２０
アクリルアミド／ビス（４０％ｗ／ｖ） １．６７ｍＬ ６．６６ｍＬ
１．５Ｍのトリス−塩酸（ｐＨ８．８） ２．５ｍＬ ２．５ｍＬ
水 ５．６７ｍＬ ０．７ｍＬ
ＴＥＭＥＤ １０μＬ １０μＬ
１０％過硫酸アンモニウム ５０μＬ ５０μＬ
ＳＤＳ １００μＬ １００μＬ
勾配ゲル５〜２０％のために、ペリスタポンプに連通させた勾配撹拌機を用いる。
スタッキングゲル（３％）
成分 ｍＬ
アクリルアミド／ビス（４０％ｗ／ｖ） １．３
１Ｍのトリス−塩酸（ｐＨ６．８） １．２５
水 ７．４
ＴＥＭＥＤ ２０μＬ
１０％過硫酸アンモニウム ５０μＬ
ＳＤＳ １００μＬ
ランニング緩衝液
０．０２５Ｍトリス，０．１９２Ｍグリシン，０．１％ＳＤＳ，水中ｐＨ８．３。
サンプル緩衝液
１Ｍのトリス−塩酸（ｐＨ６．８） １３ｍＬ
２０％ＳＤＳ ６．５ｍＬ
グリセロール ５．２ｍＬ
０．５％ブロモフェノールブルー ０．２６ｍＬ
ＢＩＯＲＡＤ（バイオラド社）プロテアン２（Ｐｒｏｔｅａｎ２）装置を製造者の指示に従って用いた。
試料（１〜１０μｇの試料タンパク質を含有する全量１５〜２０μＬ）をゲル上に負荷した。
ゲルを２００Ｖで約１時間運転した。次いで、ゲルを光によってスキャンし、その後、それらを、クーマシーブルー染色を用いて染色し、次いで、酢酸／メタノールを用いて脱染した。
【０１３１】
本発明の更なる例証
我々の独創的な研究において、特に、ＳｕｔｔｏｎＪ， Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｎ，及びＢｏｙｌｅ，Ｒ．Ｗ．（２０００）Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｅｄ Ｄｉｐｈｅｎｙｌｃｈｌｏｒｉｎｓ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｉｎｓ−Ｔｈｅｉｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｔｕｍｏｕｒ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ．Ｊ．Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ａｎｄ Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｓ ４，６５５−６５８）；及びＣｌａｒｋｅ，Ｏ．Ｊ．及びＢｏｙｌｅ，Ｒ．Ｗ．（１９９９）Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ，ｕｓｅｆｕｌ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ ｗｉｔｈ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔｓ．，Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２３１−２２３２に記載されるように、それらのそれぞれを参考として本明細書に組み入れ、それは、ポルフィリン、クロリン及びバクテリオクロリン分子の組合せが、安定なチオ尿素結合によってタンパク質に効率的に接合することができ、及びこれらの接合物が蛍光造影剤としての潜在能力を有することを示した。
【０１３２】
本発明の例証として、我々は次に、ヒトの癌細胞に高度な特異性を有するモノクローナル抗体と、ポルフィリン系の光増感剤の我々の組合せとの間に接合を形成するためのこの方法の使用を記載する。この方法で形成された接合物は、相当する癌腫細胞に対する光線力学的な活性について、及びまた、標的でない細胞の存在下にこれらの標的の細胞に選択的に結合し、及び光増感するそれらの能力についてアッセイした。また、我々は、ポルフィリン−ＢＳＡ接合物のヒーラ細胞への特異的な内部移行を例示する。
【０１３３】
我々の例は、５，１０，１５−トリス（３，５−ジヒドロキシフェニル）−２０−（４−イソチオシアナトフェニル）ポルフィリン（ＯＨ６）及び５，１０，１５−トリス（ピリジル）−２０−（４−イソチオシアナトフェニル）ポルフィリン（ＰＹＲ）を用い、我々が我々の以前の研究から見出したように、これらの発色団のそれぞれの光活動性のポルフィリンコアの周りの親水性置換基のパターンがタンパク質との効率的な接合を導き；親水性置換基がまた、より一層疎水性のポルフィリンで多く見られるように、光増感剤のタンパク質に対する非共有結合を最小化する。これらの発色団のための合成プロトコルを上記の例１及び２にそれぞれ記載する。
【化９４】
例２５−抗体に対する安定な接合
ＯＨ６及びＰＹＲを上記例１及び２にそれぞれ記載したように調製した。抗体１７．１Ａを生物学的接合の方法のために選定した。１７．１Ａは結腸直腸の癌細胞、特に、Ｃｏｌｏ（コロ）３２０細胞（ＥＣＡＣＣ，寄託番号８７０６１２０５）上に余分に発現する受容体と特異的に反応する抗体である。しかし、適切な細胞系上で余分に発現する任意の抗原に対し反応する任意の抗体を、本発明にしたがって用いることができる。かかる抗体の例には、Ｂｅｒ−ＥＰ４及びＭＯＫ−３１が含まれ、それぞれはＤＡＫＯ Ｌｔｄ（ダコ社），Ｅｌｙ（イーリー），ケンブリッジシャー州から商業的に入手でき、及びそれぞれは上皮細胞上に余分に発現する抗原に対して反応性である。
【０１３５】
抗体調製物の緩衝液ｐＨを約ｐＨ９に増加させるために、先立って、及び生物学的接合の方法の目的のために、モノクローナル抗体調製物を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ遠心機を用いるか、又はリン酸緩衝液を酢酸緩衝液に交換するために、透析にかけて、リン酸から酢酸緩衝液に交換した。
【０１３６】
ＯＨ６及びＰＹＲのそれぞれを、１７．１Ａモノクローナル抗体と、方法論の記載１に記載した方法に従って別々に接合させ、２．５，５，１０及び２０のそれぞれのＭＲを有する接合希釈率の範囲を得た。
【０１３７】
酢酸緩衝化抗体調製物及びそれから得られたさまざまな希釈率の接合物を方法論の記載６に説明した方法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。結果を図１〜３にそれぞれ示す。図１は緩衝液交換した１７．１Ａの抗体（レーン１）、及び緩衝液交換した抗体／ＯＨ６接合物のＭＲ２．５（レーン２，３）、５（レーン４，５）、１０（レーン６，７）及び２０（レーン８，９）、及び分子量マーカー（レーン１０）を用いて負荷したゲルを示す。図２は透析した１７．１Ａの抗体（レーン１）、及び透析した抗体／ＯＨ６接合物のＭＲ２．５（レーン２，３）、５（レーン４，５）、１０（レーン６，７）及び２０（レーン８，９）、及び分子量マーカー（レーン１０）を用いて負荷したゲルを示す。図３は緩衝液交換した１７．１Ａの抗体（レーン１）、及び緩衝液交換した抗体／ＰＹＲ接合物のＭＲ２．５（レーン２，６）、５（レーン３，７）、１０（レーン４，８）及び２０（レーン５，９）、及び分子量マーカー（レーン１０）を用いて負荷したゲルを示す。
【０１３８】
これらの図に示すように、緩衝液交換か、又は透析かのいずれの方法も、抗体構造を分裂させず、軽鎖及び重鎖は互いと結合したままであり、及びゲル（レーン１）のそれぞれに共に移動する。また、ＯＨ６及びＰＹＲの各ＭＲでの接合をゲル（レーン２〜９）上で確認することができる。
【０１３９】
例２６−ＦＡＣＳ分析
ＦＡＣＳ分析を方法論の記載５に従って行った。
図４はＦＩＴＣ標識化１７．１Ａ及びＣｏｌｏ３２０細胞（３回繰り返し）を用いて引き出した結果を示し、及び抗体の細胞への結合が起こっていることを示す（すなわち、Ｃｏｌｏ３２０細胞が１７．１Ａに特異的な抗原を発現する）。
図５は検出のためのＦＩＴＣ標識化した抗１７．１Ａ抗体と共にＯＨ６／１７．１Ａ接合物及びＣｏｌｏ３２０細胞（３回繰り返し）を用いて引き出した結果を示し、及びＯＨ６／１７．１Ａ接合物が細胞に結合していることを示す。
図６は検出のためのＦＩＴＣ標識化した抗１７．１Ａ抗体と共にＰＹＲ／１７．１Ａ接合物及びＣｏｌｏ３２０細胞（３回繰り返し）を用いて引き出した結果を示し、及びＰＹＲ／１７．１Ａ接合物が細胞に結合していることを示す。
図７は、ＦＩＴＣ標識化ＯＸ−３４（３回繰り返し）を用いて引き出した結果を示し、ＯＸ−３４は１７．１Ａと同じクラス（ＩｇＧ２ａ）の抗体であるが、異なった高原特異性を有する。これらの結果は、ＯＸ−３４がＣｏｌｏ３２０細胞に結合せず、従ってＣｏｌｏ３２０細胞上にはＯＸ−３４のための結合部位がないことを示す。
【０１４０】
例２７−光細胞障害性の実験
方法論の記載２に説明した方法に従う光細胞障害性の試験を、種々の抗体接合物を用いてＣｏｌｏ３２０細胞上で行った。
図８及び９はＯＨ６／ＯＸ−３４及びＰＹＲ／ＯＸ−３４接合物のそれぞれを用いて行ったコントロール実験の結果を示す。例１６に示すように、ＯＸ−３４はＣｏｌｏ３２０細胞の表面に発現する任意の抗原に対して特異性を欠くことが見出された。したがって、予想通りに、これらのコントロール実験は照射後の光細胞障害性を示さない。
【０１４１】
図１０及び１１は”キャップ（ｃａｐｐｅｄ）”ＯＨ６及びＰＹＲのそれぞれを用いて行った更なるコントロール実験の結果を示す。”キャップ”法は、各発色団上のＮＣＳ基とプロピルアミンとの反応を含み、血清タンパク質の接合をブロックする。図１０では、暗所での細胞障害性を示さず、ＯＨ６がＣｏｌｏ３２０細胞に対して無毒であることを示す。しかし、照射において、若干の光細胞障害性が観察され、キャップＯＨ６のある量がＣｏｌｏ細胞の表面に移ったことが示される。一方、図１１は暗所での若干の細胞障害性を示し、ＰＹＲがＣｏｌｏ３２０細胞に対する若干の程度の細胞障害性に関し、及び照射による光細胞障害性を増加させることを示唆し、再び、キャップＰＹＲのある量がＣｏｌｏ３２０細胞の表面に移ったことを示す。
【０１４２】
任意の抗体の欠損下で、キャップ発色団の細胞膜への移動は、おそらくキャップ発色団の両親媒性の性質に起因し、これはポルフィリンのコアの周りの親水性基及び疎水性プロピルアミンの”キャッピング”基の双方を有する。このことは特にそれらをＣｏｌｏ３２０細胞膜のような脂質膜中に包埋させ易くする。
【０１４３】
図１２及び１３は、ＯＨ６／１７．１Ａ及びＰＹＲ／１７．１Ａ接合物をそれぞれ用い、種々の接合物希釈率（ＯＨ６／１７．１Ａについて２．５，５，１０，２０；ＰＹＲ／１７．１Ａについて１０及び２０）で得た結果を示す。これらの結果は、照射による細胞障害性の有意な増加を示し、生物学的接合物の細胞表面に対する結合が細胞上の感光性を与えることを示す。したがって、これらの種類はＰＤＴの適切な候補である。
【０１４４】
例２８−インビボの光線力学的治療
本発明にかかる接合物を用いる、インビボでの光線力学的治療を行い評価するプロトコルは、Ｒ Ｂｏｙｌｅ等の、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９２）６５：８１３−８１７；Ｒ Ｂｏｙｌｅ等の、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９３）６７：１１７７−１１８１；Ｒ Ｂｏｙｌｅ等の、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９６）７３：４９−５３；及びＬａｐｏｉｎｔｅ（ラポワント）等の、Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．５（Ｍａｙ １９９９）８７６−８８２に多様に記載されており；これらの各内容を参考として本明細書に組み入れる。
【０１４５】
これらの論文に記載されているように、腫瘍をマウスのような動物に誘導するか、又は移植することができ、及び次いでその動物に、本発明にかかる抗原に特異性を有する抗体に接合した光増感剤のある量を注射することができ、この抗原は腫瘍細胞の表面上に特異的に発現されるか、又は余分に発現される。その後、動物に照射をすることができ、及び腫瘍に対する効果を、質的にか、又は計量的に、腫瘍の代謝を参照して評価することができる（Ｌａｐｏｉｎｔｅ等の、Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．５（Ｍａｙ １９９９）８７６−８８２に記載されているように）。また、Ｒ Ｂｏｙｌｅ等のＢｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９６）７３：４９−５３に記載されているように、インビボでの光増感剤の分布を、体内分布及び／又は血管性静止アッセイ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｔａｓｉｓ ａｓｓａｙｓ）によって測定することができる。
【０１４６】
例２９−共焦点レーザー顕微鏡
１０，１５，２０−トリス（３，５−ジヒドロキシフェニル）５−イソチオシアナトフェニルポルフィリン（ＯＨ６−ＮＣＳ）とＢＳＡとの接合物の細胞内局在性の予試験を、共焦点レーザー顕微鏡を用いて行った。容易に入手できる上皮性のヒト癌腫細胞系ヒーラを、接合物との温置のために選定した。すべての温置は、ヒーラ細胞のサブ集密的な（ｓｕｂ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）培養物を用いて、一連の、標識していないＢＳＡのコントロール溶液、１０，１５，２０−トリス（３，５−ジヒドロキシフェニル）５−アミノフェニルポルフィリン（ＯＨ６−ＮＨ２，ＯＨ６−ＮＣＳのアミノ前駆体）、及びＰＢＳのそのままでのものを含む、３通りで行った。細胞を３５ｍｍの皿においてカバーガラスの上に播種した。
【０１４７】
細胞の蛍光画像を、６０×（ＮＡ１．４）の油浸対物レンズを用いる倒立のオリンパスＩＸ７０顕微鏡上のＢｉｏ−Ｒａｄ Ｒａｄｉａｎｃｅ（バイオラドラジアンス）２０００の共焦点レーザー顕微鏡〔Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（バイオラドマイクロサイエンス），ケンブリッジ，ＭＡ〕を用いて得た。照明源は２５ｍＷアルゴンイオンレーザーからの５１４ｎｍ線であった。ポルフィリンを、５１４ｎｍのバンドパス励起フィルター、５１０ｎｍの２色性ミラー、及び５７０ｎｍの長波長パス発光フィルターを用いて可視化した。
【０１４８】
細胞の各フィールドを、一連の焦平面からの記録画像によって３次元的に区分化した。１つの焦平面から他のものへの移動は、顕微鏡のファインフォーカスコントロールに関連するステッピングモーターによって達成され、増分量（ｓｔｅｐ ｓｉｚｅｓ）（０．５μｍから１．２５μｍまでの範囲における）は用いられる開口寸法に関して選定し、隣接する区分の間に若干の重複が存在する。十分な垂直区分を採用し、各フィールドにおけるすべての細胞の頂部及び底部を記録する。収集された各画像は共焦点顕微鏡の通常の走査速度での４つの走査の平均値であった。各画像化セッション較正の間に、画像を：（ｉ）培地を含む顕微鏡スライド、背景レベルを測定するため；（ｉｉ）ＤＭＳＯ中に溶解したＩＴＣポルフィリンＯＨ６−ＮＣＳを含むスライド；及び（ｉｉｉ）プローブでない（ｕｎ−ｐｒｏｂｅｄ）ヒーラ細胞のみを有するスライドで採取した。
【０１４９】
画像データの取得及び遠隔顕微鏡の操作はＢｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｓｅｒｓｈａｒｐ２０００ソフトウェアを用いて行った。すべての画像を、Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ａｓｓｉｓｔａｎｔ（コンフォクルアシスタント）バージョン４．０２、（構築１０１）１９９４−１９９６ Ｔｏｄｄ Ｃｌａｒｋ Ｂｒｅｌｊｅ（トッドクラークブレルヘ）を用いて管理した。人工的な色を標準的なＢｉｏ−Ｒａｄの参照表（ｌｏｏｋ−ｕｐ ｔａｂｌｅｓ，ＬＵＴ）を用いてあてはめた。
【０１５０】
設定されたＣＬＳＭ上で入手できる励起レーザー線のそれぞれでのＯＨ６−ＮＣＳの蛍光の予備的な評価は、ＤＭＳＯ中のＯＨ６の０．０１ｍＭ溶液について行った。図１４はＯＨ６−ＮＣＳのＵＶ−可視スペクトルを示し、その主要な吸収帯を確認できる。残念ながら、レーザー線はＯＨ６−ＮＣＳをそのソレー帯λｍａｘで励起するために入手できなかった。図１５は４２２ｎｍ（最適）、及び４種の波長、４５７、４７６、４８８、及び５１４ｎｍのアルゴンイオンレーザーで励起した場合のＯＨ６−ＮＣＳについての蛍光発光の相対的強度を示す。
【０１５１】
５１４ｎｍで励起した場合のＯＨ６−ＮＣＳの溶液によって発光した蛍光の強度が、４５７、４７６、及び４８８ｎｍの励起波長での蛍光発光よりおよそ３倍大きいことが示された。ＯＨ６−ＮＣＳのＵＶ−可視吸収スペクトルは、５１６ｎｍのアルゴン−イオンレーザー線がＯＨ６−ＮＣＳに適合する唯一の励起源であることを示した。３種の最も強いレーザー線、４５７、４７６、及び４８８ｎｍは、ＯＨ６−ＮＣＳのソレー帯及び第１帯の間の領域においてすべて励起し、一方、５１４線は５１６ｎｍでＱ帯と十分に重複した。
【０１５２】
別々に接合物ＯＨ６−ＮＣＳ−ＢＳＡ及び各々の３つのコントロールと温置した細胞培養物を、次いで、洗浄し及び固定した。次いで、温置した細胞を含むカバースリップを標準ガラス顕微鏡スライド上に注意して取り付け、画像化の準備をした。すべての４種のアルゴン−イオンレーザー線を試験するが、予想通り、蛍光の良好な解像度は５１４ｎｍのレーザー線を用いることでのみ達成することができた。
【０１５３】
ＯＨ６−ＮＣＳ−ＢＳＡと温置したヒーラ細胞のＺ−系列の蛍光画像を図１６に示す（この図は左上から右下に見るべきである）。連続した区分を、顕微鏡によって分離された各焦平面の間の２μＭのステップで走査し、従って、細胞内での接合物の局在性の３次元の可視化を可能にする。明らかに、接合物ＯＨ６−ＮＣＳ−ＢＳＡが細胞に入り、細胞の取り込みの性質の研究は行っていないが、取り込みが飲食細胞運動によって起こっている可能性が最も高い。接合物が核に入らないと思われ、細胞質の至るところに大部分分布していることがわかった。
【０１５４】
画像化のとき、ＢＳＡコントロール又はＰＢＳコントロールと温置した細胞は、極めて低い、かろうじて検出できる程度の蛍光のみを示し、通常の程度の細胞の自己蛍光のせいである。ＯＨ６−ＮＨ２（接合していないポルフィリンコントロール）の局在性を図１７に示すが、これは、ポルフィリンコントロール細胞のズーム画を伴うＣＬＳＭ画像を示す。細胞内から発する蛍光は観察されず、代わりに、大多数のＯＨ６−ＮＨ２は形質膜上に局在した。明らかに、接合物のＢＳＡ成分はポルフィリンが細胞の内部に運ばれるのを促進するために必要である。
【０１５５】
要約すれば、ポルフィリン−ＢＳＡ接合物の細胞での局在性が、共有結合性のチオ尿素結合の形成によって構成され、通常のＣＬＳＭ技術を用いて画像化できることが示された。接合していないポルフィリンＯＨ６−ＮＨ２は、細胞の膜を浸透しないことがわかったが、有意な程度の蛍光がＯＨ６−ＮＣＳ−ＢＳＡと温置した細胞の内部から検出され、良好な接合物の浸透が示された。
【図面の簡単な説明】
【図１】緩衝液交換した１７．１Ａの抗体等を負荷したゲルを示す図である。
【図２】透析した１７．１Ａの抗体等を負荷したゲルを示す図である。
【図３】緩衝液交換した１７．１Ａの抗体等を負荷したゲルを示す図である。
【図４】ＦＩＴＣ標識化１７．１Ａ及びＣｏｌｏ３２０細胞の結果を示す図である。
【図５】検出のためのＦＩＴＣ標識化した抗１７．１Ａ抗体と共にＯＨ６／１７．１Ａ接合物及びＣｏｌｏ３２０細胞を用いた結果を示す図である。
【図６】検出のためのＦＩＴＣ標識化した抗１７．１Ａ抗体と共にＰＹＲ／１７．１Ａ接合物及びＣｏｌｏ３２０細胞を用いた結果を示す図である。
【図７】ＦＩＴＣ標識化ＯＸ−３４を用いた結果を示す図である。
【図８】ＯＨ６／ＯＸ−３４接合物のコントロール実験の結果を示す図である。
【図９】ＰＹＲ／ＯＸ−３４接合物のコントロール実験の結果を示す図である。
【図１０】キャップＯＨ６の更なるコントロール実験の結果を示す図である。
【図１１】キャップＰＹＲの更なるコントロール実験の結果を示す図である。
【図１２】ＯＨ６／１７．１Ａ接合物の種々の希釈率の結果を示す図である。
【図１３】ＰＹＲ／１７．１Ａ接合物の種々の希釈率の結果を示す図である。
【図１４】ＯＨ６−ＮＣＳのＵＶ−可視スペクトルを示す図である。
【図１５】４種の波長で励起した場合のＯＨ６−ＮＣＳの蛍光発光の相対的強度を示す図である。
【図１６】ＯＨ６−ＮＣＳ−ＢＳＡと温置したヒーラ細胞のＺ−系列の蛍光画像を示す図である。
【図１７】ＯＨ６−ＮＨ２の局在性を示す図である。
Claims (43)
- 次の式（Ｉ）のポルフィリン発色団：
Ｒ２が親水性アリール部分であり；
Ｒ３がＨ又は親水性アリール又は親水性非芳香族部分であり；
及びＸ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４のそれぞれが、無関係に、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、Ｃ１〜３アルキル及びＯＣ１〜３アルキルから選ばれるか、又は隣接するＣ−Ｃ結合を有するＸ１及びＸ２及び／又はＸ３及びＸ４がエポキシド又はシクロプロパニル構造を形成するように、Ｘ１及びＸ２及び／又はＸ３及びＸ４が互いに、Ｏ、ＣＨ２、ＣＨＣ１〜３アルキル、又はＣ（Ｃ１〜３アルキル）２から選ばれる架橋部分を形成し；
式中、前記Ｒ２及び前記Ｒ３の一方又は双方が、フェニル環を含んでおり、このフェニル環が１又はそれ以上の回数、好ましくは少なくとも２回、１又はそれ以上の親水性置換基によって置換されており、この親水性置換基が前記Ｒ２及び／又は前記Ｒ３の親水性を高める役目を果たすか、又は四級化ピリジル（ピリジニウミル）環のようなヘテロアリール環を含んでおり、このヘテロアリール環が随意に１又はそれ以上の回数、好ましくは少なくとも２回、１又はそれ以上の親水性置換基によって置換されており、この親水性置換基が前記Ｒ２及び／又は前記Ｒ３の親水性を高める役目を果たしており；
前記１又はそれ以上の親水性置換基が、無関係に、ヒドロキシ；メトキシ又はエトキシのようなアルコキシ；Ｃ２〜Ｃ１５ポリエチレングリコール；Ｎ−メチルピリジニウミルのような四級化ピリジル（ピリジニウミル）；モノ−、ジ−又はポリ−糖類；Ｃ１〜６アルキルスルホン酸；ホスホニウム基Ｒ４Ｐ（Ｒ５）（Ｒ６）（Ｒ７）（式中、Ｒ４が、単結合か、又はＣ１〜６アルキルであり、及びＲ５、Ｒ６及びＲ７のそれぞれが、無関係に、水素、フェニル環のようなアリール環、ピリジル環のようなヘテロアリール環、及びＣ１〜６アルキル鎖から選ばれ、これらアリール環、ヘテロアリール環又はＣ１〜６アルキル鎖が置換されていないか、又は１又はそれ以上の回数、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルキル又はアルコキシ、アリール、オキソ、ハロゲン、ニトロ、アミノ又はシアノによって置換されている。）；又はリン酸基又はホスホネート基｛それぞれ、Ｒ８ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ９）（ＯＲ１０）又はＲ８Ｐ（Ｏ）（ＯＲ９）（ＯＲ１０）で表され、式中、Ｒ８が、単結合か、又はＣ１〜６アルキルであり、及びＲ９及びＲ１０のそれぞれが無関係に水素及びＣ１〜６アルキルから選ばれている。｝から選ばれており、
式中、前記Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のそれぞれが随意に、更に１又はそれ以上の回数、−ＯＨ、−ＣＮ、−ＮＯ２、ハロゲン，−Ｔ、又は−ＯＴ｛式中、ＴがＣ１〜１５アルキル、シクロアルキル又はアリール基又はそれらのヒドロキシル化、ハロゲン化、硫酸化、スルホン化又はアミノ化誘導体又はそれらのカルボン酸、エステル、エーテル、ポリエーテル、アミド、アルデヒド又はケトン誘導体である。｝によって置換されている。〕
であることを特徴とする発色団。 - 前記アリール部分Ｒ１がフェニル環を含んでおり、このフェニル環が前記発色団の大環状コアに、単結合によって連結しているか、又はＣ１〜６の分枝状又は線状アルキル鎖によって連結しているかのいずれかである請求項１記載の発色団。
- Ｒ３がＨであるか、又はＣ１〜６アルキル鎖のような親水性のアルキル部分であり、これが、１又はそれ以上の回数、ヒドロキシ又はＣ２〜１５ポリエチレングリコールのような１又はそれ以上の親水性置換基によって置換されている請求項１又は２記載の発色団。
- Ｒ３が親水性アリール部分からなり、このアリール部分が前記親水性アリール部分Ｒ２と同じである請求項１〜３のいずれか一項記載の発色団。
- 前記Ｒ２及び前記Ｒ３の一方又は双方が、無関係に、
ｍ，ｍ−（ジヒドロキシ）フェニル
ｍ，ｍ，ｐ−（トリヒドロキシ）フェニル
ｏ，ｐ，ｏ−（トリヒドロキシ）フェニル
ｐ−（メチルトリフェニルホスホニウム）フェニル
ｐ−（メチルホスホノ−ジ−エトキシ）フェニル
ｐ−（メチルホスホナト−ジ−エトキシ）フェニル
ｍ−又はｐ−（Ｎ−メチル−ピリジニウミル）フェニル
及びｍ−Ｎ−メチルピリジニウミル
及びｐ−Ｎ−（Ｃ１〜６アルキルスルホン酸）ピリジニウミル又はｍ−Ｎ−（Ｃ１〜６アルキルスルホン酸）ピリジニウミル、特に、ｐ−Ｎ−（プロピルスルホン酸）ピリジニウミル
から選ばれる請求項１〜４のいずれか一項記載の発色団。 - 前記Ｒ３がＨであり、及び前記Ｒ２が、
から選ばれることを特徴とする請求項１記載の発色団。 - 前記Ｒ２及び前記Ｒ３が、
の同じものであることを特徴とする請求項１記載の発色団。 - 前記Ｒ３が、
- ５，１５−ジフェニルポルフィリン、５，１５−ジフェニルクロリン又は５，１５−ジフェニルバクテリオクロリン発色団であって、５−及び１５−フェニル基の各オルト−、メタ−、及び／又はパラ−位のそれぞれが、置換基Ｐ１〜Ｐ５及びＱ１〜Ｑ５によってそれぞれ置換されており、それら置換基が無関係にＨ又は不活性置換基であり、この置換基が他の置換基Ｐ１〜Ｐ５及びＱ１〜Ｑ５と相まって発色団の蛍光特性を実質的に損なうことなく；及び発色団が更に接合基Ｚを含み、この接合基がインビトロ又はインビボの所定の生物学的標的に発色団を送達するためのポリペプチド分子に前記発色団を接合させることができることを特徴とする発色団。
- 次の化合物：
- 前記Ｐ１〜Ｐ５のそれぞれが、前記２つの主要なフェニル環が対称的に置換されるように、前記Ｑ１〜Ｑ５の相当する１種と同じであるか、又は実質的に同じである請求項９又は１０記載の発色団。
- 前記Ｐ１〜Ｐ５の１又はそれ以上が、前記２つの主要なフェニル環が対称的に置換されないように、前記Ｑ１〜Ｑ５の相当する１種と同じでない請求項９又は１０記載の発色団。
- 前記発色団が空気中で実質的に不活性であるが、実質的な範囲で、前記発色団のコアの周りの２、３、７、８、１２、１３、１７又は１８位での選択的な付加又は置換を抑制しないように、前記置換基Ｐ１〜Ｐ５及びＱ１〜Ｑ５が、全体として、前記発色団の自発的酸化の速度を減少させるのに十分な程度の前記発色団のコアの周りの立体障害を提供する請求項９〜１２のいずれか一項記載の発色団。
- 前記置換基Ｐ１〜Ｐ５及びＱ１〜Ｑ５の１又はそれ以上が、Ｈ、−ＯＨ、−ＣＮ、−ＮＯ２、ハロゲン、−Ｔ、又は−ＯＴ（式中、ＴがＣ１〜１５アルキル、シクロアルキル又はアリール基又はそれらのヒドロキシル化、ハロゲン化、硫酸化、スルホン化又はアミノ化誘導体又はそれらのカルボン酸、エステル、エーテル、ポリエーテル、アミド、アルデヒド又はケトン誘導体である。）；又はＣ３〜１２シクロアルキル及び／又はアリール環構造、又は２と６との間の、好ましくは２〜３の、融合されたか、又は連結されたＣ３〜１２シクロアルキル及び／又はアリール環構造（それらの各環構造が随意に１又はそれ以上のＮ、Ｏ又はＳ原子を含むことがある。）からなる請求項９〜１３のいずれか一項記載の発色団。
- 前記置換基Ｐ１〜Ｐ５及びＱ１〜Ｑ５の１又はそれ以上が、無関係に、Ａ１Ｚ１Ａ１４
〔式中、Ｚ１がＺ２、Ｚ２Ａ５又はＺ２Ａ５Ａ６であり；
Ａ１及びＡ５が、無関係に、−（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−Ｃ（Ｙ）（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−Ｃ（Ｙ）Ｙ’（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−Ｃ（Ｙ）ＮＡ４（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−ＮＡ４Ｃ（Ｙ）（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−ＮＡ４（ＣＡ２Ａ３）ｎ、−ＹＣ（Ｙ’）（ＣＡ２Ａ３）ｎ−及び−Ｙ（ＣＡ２Ａ３）ｎ−から選ばれており；ｎ＝０〜６であり；Ｙ及びＹ’が無関係にＯ又はＳであり；Ａ２、Ａ３及びＡ４が無関係にＨ又はＣ１〜２アルキルであり、この基が置換されていないか、又は１又はそれ以上のフッ素によって置換されており；
Ａ６＝−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｍ−又は−Ｓ（Ｏ）ｐであり；ｍ＝１〜１２であり；ｐ＝０〜２であり；
Ｚ２が単結合又はＺ３であり；Ｚ３がＺ４、Ｚ５及びＺ６から選ばれており、 このＺ３が、置換されていないか、又は１又はそれ以上の回数、ＯＨ、ハロ、ＣＮ、ＮＯ２、Ａ１Ａ１０、Ａ６Ａ８、ＮＡ１０Ａ１１、Ｃ（Ｙ）Ａ７、Ｃ（Ｙ）Ｙ’Ａ７、Ｙ（ＣＨ２）ｑＹ’Ａ７、Ｙ（ＣＨ２）ｑＡ７、Ｃ（Ｙ）ＮＡ１０Ａ１１、Ｙ（ＣＨ２）ｑＣ（Ｙ’）ＮＡ１０Ａ１１、Ｙ（ＣＨ２）ｑＣ（Ｙ’）Ａ９、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）ＮＡ１０Ａ１１、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ａ１１、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｙ’Ａ９、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｚ６、Ｃ（ＮＡ１０）ＮＡ１０Ａ１１、Ｃ（ＮＣＮ）ＮＡ１０Ａ１１、Ｃ（ＮＣＮ）ＳＡ９、ＮＡ１０Ｃ（ＮＣＮ）ＳＡ９、ＮＡ１０Ｃ（ＮＣＮ）ＮＡ１０Ａ１１、ＮＡ１０Ｓ（Ｏ）２Ａ９、Ｓ（Ｏ）ｒＡ９、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｃ（Ｙ’）ＮＡ１０Ａ１１、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｃ（Ｙ’）Ａ１０又はＺ６によって置換されており；ｑ＝０、１又は２であり；ｒ＝０〜２であり；Ａ７が無関係にＨ及びＡ９から選ばれており；Ａ８がＯ又はＡ９であり；Ａ９がＣ１〜４アルキルであり、このアルキルが置換されていないか、又は１又はそれ以上のフッ素によって置換されており；Ａ１０がＯＡ９又はＡ１１であり；Ａ１１は、Ａ７であるか、又はＡ１０及びＡ１１がＮＡ１０Ａ１１としてのときには、それらが窒素と共に、炭素原子だけからなるか、又は炭素原子と、Ｏ、Ｎ及びＳから選ばれる少なくとも１つのヘテロ原子とからなる５乃至７員環を形成することができ；
Ｚ４がＣ６〜１２アリール又はアリールオキシＣ１〜３アルキルであり；
Ｚ５が、フラニル、テトラヒドロフラニル、インダニル、インデニル、テトラヒドロピラニル、ピラニル、チオピラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロチエニル、チエニル、１又は２の不飽和結合を含むＣ３〜８シクロアルキル又はＣ４〜８シクロアルキル、及びＣ７〜１１ポリシクロアルキルから選ばれており；
Ｚ６が、Ｎ−アゾリル、ジオキサジアジニル、ジオキサジアゾリル、ジオキサニル、２−Ｎ−ジオキサトリアジニル、ジオキサジニル、Ｎ−ジオキサゾリル、ジオキソリル、ジチアジアジニル、ジチアジアゾリル、Ｎ−ジチアトリアジニル、ジチアジニル、Ｎ−ジチアゾリル、１−Ｎ−イミダゾリル、Ｎ−モルフォリニル、ピロールイル、テトラゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、オキサジニル、オキサゾリル、ナフチドリニル、オキサジアジニル、オキサジアゾリル、オキサテトラジニル、オキサトリアジニル、オキサトリアゾリル、オキサジニル、オキサゾリル、ペンタジニル、フタルアジニル、Ｎ−ピペリジニル、Ｎ，Ｎ−ピペラジニル、１−Ｎ−ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニル、テトラチアジニル、テトラジニル、１−Ｎ−テトラゾリル、テトロキサジニル、チアジアジニル、チアジアゾリル、チアテトラジニル、チアトリアジニル、チアトリアゾリル、チアゾリル、トリアジニル、１−Ｎ−トリアゾリル、トリオキサダジニル、トリオキサニル、トリオキサジニル、トリオキサゾリル、トリチアジアジニル、トリチアジニル、トリチアジアゾリルから選ばれており；
式中、Ｚ４、Ｚ５又はＺ６が、Ｚ４、Ｚ５及びＺ６から無関係に選ばれる１又はそれ以上の他の構成員に融合することができ；
Ａ１４が、水素、メチル、ヒドロキシ、アリール、ハロ置換アリール、アリールオキシＣ１〜３アルキル、ハロ置換アリールオキシＣ１〜３アルキル、インダニル、インデニル、Ｃ７〜１１ポリシクロアルキル、テトラヒドロフラニル、フラニル、テトラヒドロピラニル、ピラニル、テトラヒドロチエニル、チエニル、テトラヒドロチオピラニル、チオピラニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、又は１又は２の不飽和結合を含むＣ４〜６シクロアルキル（シクロアルキル又は複素環式部分が置換されていないか、又は１〜３のメチル基、１のエチル基、又はヒドロキシル基によって置換されている。）である。〕
からなる群より選ばれる一員からなる請求項９〜１４のいずれか一項記載の発色団。 - 前記Ｐ１〜Ｐ５及び前記Ｑ１〜Ｑ５の１つが前記接合基Ｚを含む接合置換基である請求項９〜１５記載の発色団。
- 前記接合置換基が、Ａ１Ｚ１Ｚ；
〔式中、Ｚ１がＺ２、Ｚ２Ａ５又はＺ２Ａ５Ａ６であり；
Ａ１及びＡ５が、無関係に、−（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−Ｃ（Ｙ）（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−Ｃ（Ｙ）Ｙ’（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−Ｃ（Ｙ）ＮＡ４（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−ＮＡ４Ｃ（Ｙ）（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−ＮＡ４（ＣＡ２Ａ３）ｎ、−ＹＣ（Ｙ’）（ＣＡ２Ａ３）ｎ−及び−Ｙ（ＣＡ２Ａ３）ｎ−から選ばれており；ｎ＝０〜６であり；Ｙ及びＹ’が無関係にＯ又はＳであり；Ａ２、Ａ３及びＡ４が無関係にＨ又はＣ１〜２アルキルであり、この基が置換されていないか、又は１又はそれ以上のフッ素によって置換されており；
Ａ６＝−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｍ−又は−Ｓ（Ｏ）ｐであり；ｍ＝１〜１２であり；ｐ＝０〜２であり；
Ｚ２が単結合又はＺ３であり；Ｚ３が、Ｚ４、Ｚ５及びＺ６から選ばれており、
このＺ３が、置換されていないか、又は１又はそれ以上の回数、ＯＨ、ハロ、ＣＮ、ＮＯ２、Ａ１Ａ１０、Ａ６Ａ８、ＮＡ１０Ａ１１、Ｃ（Ｙ）Ａ７、Ｃ（Ｙ）Ｙ’Ａ７、Ｙ（ＣＨ２）ｑＹ’Ａ７、Ｙ（ＣＨ２）ｑＡ７、Ｃ（Ｙ）ＮＡ１０Ａ１１、Ｙ（ＣＨ２）ｑＣ（Ｙ’）ＮＡ１０Ａ１１、Ｙ（ＣＨ２）ｑＣ（Ｙ’）Ａ９、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）ＮＡ１０Ａ１１、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ａ１１、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｙ’Ａ９、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｚ６、Ｃ（ＮＡ１０）ＮＡ１０Ａ１１、Ｃ（ＮＣＮ）ＮＡ１０Ａ１１、Ｃ（ＮＣＮ）ＳＡ９、ＮＡ１０Ｃ（ＮＣＮ）ＳＡ９、ＮＡ１０Ｃ（ＮＣＮ）ＮＡ１０Ａ１１、ＮＡ１０Ｓ（Ｏ）２Ａ９、Ｓ（Ｏ）ｒＡ９、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｃ（Ｙ’）ＮＡ１０Ａ１１、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｃ（Ｙ’）Ａ１０又はＺ６によって置換されており；ｑ＝０、１又は２であり；ｒ＝０〜２であり；Ａ７が無関係にＨ及びＡ９から選ばれており；Ａ８がＯ又はＡ９であり；Ａ９がＣ１〜４アルキルであり、このアルキルが置換されていないか、又は１又はそれ以上のフッ素によって置換されており；Ａ１０がＯＡ９又はＡ１１であり；Ａ１１は、Ａ７であるか、又はＡ１０及びＡ１１がＮＡ１０Ａ１１としてのときには、それらが窒素と共に、炭素原子だけからなるか、又は炭素原子と、Ｏ、Ｎ及びＳから選ばれる少なくとも１つのヘテロ原子とからなる５乃至７員環を形成することができ；
Ｚ４がＣ６〜１２アリール又はアリールオキシＣ１〜３アルキルであり；
Ｚ５が、フラニル、テトラヒドロフラニル、インダニル、インデニル、テトラヒドロピラニル、ピラニル、チオピラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロチエニル、チエニル、１又は２の不飽和結合を含むＣ３〜８シクロアルキル又はＣ４〜８シクロアルキル、及びＣ７〜１１ポリシクロアルキルから選ばれており；
Ｚ６が、Ｎ−アゾリル、ジオキサジアジニル、ジオキサジアゾリル、ジオキサニル、２−Ｎ−ジオキサトリアジニル、ジオキサジニル、Ｎ−ジオキサゾリル、ジオキソリル、ジチアジアジニル、ジチアジアゾリル、Ｎ−ジチアトリアジニル、ジチアジニル、Ｎ−ジチアゾリル、１−Ｎ−イミダゾリル、Ｎ−モルフォリニル、ピロールイル、テトラゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、オキサジニル、オキサゾリル、ナフチドリニル、オキサジアジニル、オキサジアゾリル、オキサテトラジニル、オキサトリアジニル、オキサトリアゾリル、オキサジニル、オキサゾリル、ペンタジニル、フタルアジニル、Ｎ−ピペリジニル、Ｎ，Ｎ−ピペラジニル、１−Ｎ−ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニル、テトラチアジニル、テトラジニル、１−Ｎ−テトラゾリル、テトロキサジニル、チアジアジニル、チアジアゾリル、チアテトラジニル、チアトリアジニル、チアトリアゾリル、チアゾリル、トリアジニル、１−Ｎ−トリアゾリル、トリオキサダジニル、トリオキサニル、トリオキサジニル、トリオキサゾリル、トリチアジアジニル、トリチアジニル、トリチアジアゾリルから選ばれており；
Ｚ４、Ｚ５又はＺ６が、無関係に、Ｚ４、Ｚ５及びＺ６から選ばれる１又はそれ以上の他の構成員に融合することができる。〕
からなる群より選ばれる一員からなる請求項１６記載の発色団。 - 次の（ｘ）、（ｙ）又は（ｚ）
Ｒ Ｒ’
４−Ｈ ４−ＮＣＳ
４−Ｍｅ ４−ＮＣＳ
４−Ｂｒ ４−ＮＣＳ
４−ＣＯ２Ｍｅ ４−ＮＣＳ
３，４，５−トリス（ＯＭｅ） ４−ＮＣＳ
４−ＮＣＳ ４−ＯＭｅ
４−ＮＣＳ ４−Ｍｅ
４−ＮＣＳ ４−ＣＯ２Ｍｅ
４−ＮＣＳ ４−Ｂｒ
４−ＮＣＳ ４−ＣＮ
４−ＮＣＳ ４−ＣＯ２Ｍｅ
のいずれかであることができる。）
として示される構造を有する請求項９〜１７のいずれか一項記載の発色団。 - Ｘ１〜Ｘ４のそれぞれ又はいくつかがＨ又はＯＨである請求項１〜１８のいずれか一項記載の発色団。
- 前記接合基Ｚが、イソシアナート、イソチオシアナート、又はＮＨＳエステル基；又は−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）、マレアミド、ヨードアセトアミド、ケトン又はアルデヒドのような；ポリペプチド分子に共有結合で結合することができる結合基からなる請求項１〜１９記載の発色団。
- 前記接合基Ｚが、比較的高い程度の剛直性及び／又は立体障害を有する連結部分を含んでおり、連結部分が、前記発色団の大環状コアに対する前記結合基の連結に適合する請求項２０記載の発色団。
- マルチカラー蛍光色素分析用の蛍光色素マーカーの組合せであって、ポルフィリン発色団、クロリン発色団及びバクテリオクロリン発色団からなる群より選ばれる少なくとも２つの発色団からなり、それらの各発色団が同じポルフィリン骨格からなり、それらの各発色団が前記ポルフィリン骨格上の１又はそれ以上の置換基を含んでおり、それらの置換基の１つが接合基Ｚを含む接合置換基Ｌであり、Ｚが、複数の異なる所定の生物学的標的の１つに各発色団を送達するためのポリペプチド分子に、前記各発色団を接合させることができる接合基であることを特徴とする蛍光色素マーカーの組合せ。
- 請求項１〜２１のいずれか一項記載の２又はそれ以上のポルフィリン、相当するクロリン、及び相当するバクテリオクロリンからなる請求項２２記載の蛍光色素マーカーの組合せ。
- 前記接合基Ｚが、前記生物学的標的に対する特異的な結合に適合する結合タンパク質に接合するか；又は架橋ポリペプチドに接合し、この架橋ポリペプチドが、前記発色団を相補的な架橋ポリペプチドに連関させるために、前記相補的な架橋ポリペプチドに対する結合に適合する請求項１〜２１のいずれか一項記載の発色団又は請求項２２又は２３記載の組合せ。
- 前記架橋ポリペプチドが前記相補的架橋ポリペプチドに結合し、及び前記相補的架橋ポリペプチドが、前記生物学的標的に対する特異的な結合に適合する結合タンパク質からなるか、これに連関するか、又はこれと融合する請求項２４記載の発色団又は組合せ。
- 請求項１〜２５のいずれか一項記載の発色団又は発色団の組合せからなる発色団のキットであって、前記発色団又は各発色団が架橋ポリペプチドに接合され、この架橋ポリペプチドが、前記発色団を相補的な架橋ポリペプチドに連関させるために、前記相補的な架橋ポリペプチドに対する結合に適合し；及び構成物又は複数の構成物が、それぞれ、前記生物学的標的に対する特異的な結合に適合する結合タンパク質に融合するか、又は連関する前記相補的な架橋ポリペプチドからなり；その配列が、前記発色団又は各発色団を、前記所定の生物学的標的に対して特異性を有する結合タンパク質に連結させるために、キット中の前記発色団又は各発色団を、前記所定の生物学的標的に対して特異性を有するキット中での異なる構成物への結合に適合させていることを特徴とする発色団のキット。
- 前記結合タンパク質が、前記生物学的標的の表面上の標的特異的分子に対して特異性を有するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体又はそれらの断片のような抗体からなる請求項２４〜２６のいずれか一項記載の発色団、発色団の組合せ又は発色団のキット。
- 前記抗体がファージ抗体であり、バクテリオファージの表面上に発現される抗体である請求項２７記載の発色団、発色団の組合せ又は発色団のキット。
- 前記結合タンパク質が、血清アルブミンタンパク質；又は細胞膜中への挿入のために適合される脂肪酸鎖のような低密度リポタンパク質のような１又はそれ以上の細胞表面分子又は受容体への結合に適合するタンパク質からなる請求項２４〜２６のいずれか一項記載の発色団、発色団の組合せ又は発色団のキット。
- 前記架橋ポリペプチドがカルモジュリンからなり、及び前記相補的な架橋ポリペプチドがカルモジュリン結合ペプチドからなり；又は逆もまた同じで；又は前記架橋ポリペプチドがアビジン又はストレプトアビジンからなり、及び前記相補的な架橋ポリペプチドがビオチンからなり；又は逆もまた同じである請求項２４〜２９のいずれか一項記載の発色団、発色団の組合せ又は発色団のキット。
- 前記発色団又は各発色団がアビジンに接合しており、及び前記構成物又は各構成物が、前記生物学的標的の表面上の標的特異的分子に対して特異性を有するビオチン化モノクローナル抗体からなる請求項３０記載の発色団のキット。
- 請求項１〜３０のいずれか一項記載の発色団を、前記所定の生物学的標的又は標的群に対して付着させるにあたり、請求項２６〜３１のいずれか一項記載のキットを提供する工程、及び前記キットの成分を、前記結合タンパク質又は各結合タンパク質の前記所定の生物学的標的又は標的群に対する結合を可能にするための適切な条件下に、前記所定の生物学的標的又は標的群の近くに導入する工程を含むことを特徴とする発色団の付着方法。
- 前記所定の生物学的標的が、癌細胞、腫瘍細胞、ＨＩＶにか、又は任意の他の微生物又はウイルスに感染した細胞、自己免疫疾患において有害な活性を引き起こす細胞、外来のか、又は異常細胞、又は任意の他のそのような細胞のような細胞又は膜である請求項１〜３２のいずれか一項記載の発色団、発色団の組合せ又は発色団のキット。
- 細胞の混合物から標的細胞を蛍光活性化選別するにあたり、請求項１〜３０のいずれか一項記載の発色団又は請求項２２〜３０のいずれか一項記載の発色団の組合せを前記標的細胞に付着させ、前記標的細胞に付着した前記発色団の１又はそれ以上の蛍光を生じさせるために、細胞の前記混合物に照射をし、蛍光を発する細胞に荷電を与え、及び前記荷電細胞を前記混合物から分離するか、又は分離させるために、細胞の前記混合物を偏光環境に通す工程を含むことを特徴とする蛍光活性化選別方法。
- ２又は３の異なる細胞種の細胞を含む複数の標的細胞を可視化するか及び／又は計数するにあたり、請求項２２〜３０のいずれか一項記載の発色団の組合せを提供する工程であって、この発色団の組合せが２又は３の発色団を含み、各発色団が異なる１つの前記細胞種に送達されるのに適合する工程；その組合せ中の前記発色団を前記標的細胞に付着させる工程；前記発色団によって蛍光の発光を生じさせるために、前記標的細胞に照射をする工程；前記各発色団によって生じる蛍光発光バンドを検出する工程；及び随意に前記各バンドについて、それぞれの個別の細胞種の蛍光細胞の数の測定値を得るために、発光／波長曲線の下での領域を測定する工程を含むことを特徴とする標的細胞の可視化及び／又は計数方法。
- 標的細胞を消滅させるにあたり、請求項１〜２１のいずれか一項記載の発色団を前記細胞に付着させ、及び一重項酸素の生成を前記細胞の近くで起こさせるために、前記細胞に照射をする工程を含み、それによって、細胞の死を起こさせることを特徴とする標的細胞の消滅方法。
- 腫瘍、癌、ＨＩＶ感染のようなウイルス感染、又はリウマチ様関節炎又は多発性硬化症のような自己免疫疾患のような、異常細胞か又は望ましくない細胞の体内での存在によって特徴付けられる疾病又は障害を処置するにあたり、請求項１〜２１のいずれか一項記載の発色団の有効な量を必要としている患者に投与する工程であって、その発色団が前記細胞への付着を生じるように、その発色団が前記異常細胞か又は望ましくない細胞の表面上の標的細胞特異的分子に対してそれらへの付着のための標的にされるのに適合し、及び前記細胞の近くで一重項酸素の生成を生じさせるために、光を用いて前記細胞に照射をする工程を含み、それによって前記細胞を死滅させることを特徴とする疾病又は障害の処置方法。
- 腫瘍、癌、ＨＩＶ感染のようなウイルス感染、又はリウマチ様関節炎又は多発性硬化症のような自己免疫疾患のような、異常細胞か又は望ましくない細胞の体内での存在によって特徴付けられる疾病又は障害を処置するために患者に投与される薬学組成物であって、組成物が、請求項１〜２１のいずれか一項記載の発色団であって、前記異常細胞か又は望ましくない細胞へ送達されるのに適合する発色団、及び適切な担体からなることを特徴とする薬学組成物。
- 腫瘍、癌、ＨＩＶ感染のようなウイルス感染、又はリウマチ様関節炎又は多発性硬化症のような自己免疫疾患のような、異常細胞か又は望ましくない細胞の体内での存在によって特徴付けられる疾病又は障害を患う患者の処置において用いる薬剤の製造における、請求項１〜２１のいずれか一項記載の発色団の使用であって；前記発色団が、前記異常細胞か又は望ましくない細胞に対する送達のために適合することを特徴とする発色団の使用。
- それぞれが親水性又は両親媒性部分を有している１又はそれ以上の親水性発色団、及びあまり親水性でない複数の物質及び／又は分子を含む混合物を分離するにあたり、前記混合物を疎水性溶出溶媒に導入し、及び、前記１又はそれ以上の発色団が前記固相上に停止すると共に前記物質及び／又は分子が前記固相から前記溶出溶媒によって溶出するか、又は実質的に溶出するように、前記混合物及び前記溶出溶媒を親水性又は極性固相上に通す工程を含むことを特徴とする混合物の分離方法。
- ５，１０，１５及び２０メソ−位に選定された置換基を有する５，１０，１５，２０−テトラ−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリン発色団を合成するにあたり；５，１５−ジ−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリン発色団を提供する工程；脱離基Ｑを前記発色団の１０及び２０メソ−位に付着させる工程であって、脱離基Ｑがハロゲン化物及びトリフレートから選ばれている工程；連関試薬（Ｒ１１Ｏ）（Ｒ１２Ｏ）ＢＲ１３を提供する工程であって、Ｒ１１及びＲ１２が、無関係に、Ｈ又はＣ１〜６アルキルから選ばれているか、又はＲ１１及びＲ１２が互いに前記２つのＯ原子でつながれているＣ１〜６アルキル鎖を構成し、及びＲ１３が、上記Ｒ３に関して規定される親水性アリール部分のようなビニル又はアリールである工程；及び前記発色団と前記連関試薬とを、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、炭酸セシウム及び水酸化バリウムから選ばれる塩基、及びＰｄ０触媒の存在下に反応させる工程を含み；前記Ｒ１３を前記発色団の１０−及び２０−メソ位で前記離脱基Ｑと交換することを特徴とするポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリンの合成方法。
- 前記５，１５−ジ−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリン発色団が、請求項１〜２１のいずれか一項記載の発色団であるか、又はそれらの保護形態である請求項４１記載の方法。
- 前記Ｒ１３がビニルであり、及び前記５，１０，１５，２０−テトラ−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリン発色団が、前記連関反応に次いで、前記１０−及び２０−ビニル置換基をヒドロキシアルキルに転換させるように、ＯｓＯ４によってオスミレーション反応を受ける請求項４１又は４２記載の方法。
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