JP2004340974A - 生体分子スクリーニングのための質量分析的方法 - Google Patents

生体分子スクリーニングのための質量分析的方法 Download PDF

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Abstract


【課題】生体分子標的の構造、並びにリガンドと生体分子標的との間の相互作用の部位及び性質の決定のための方法を提供する。
【解決手段】質量分析を用いた、核酸などの生体分子標的の構造を決定する方法であって、核酸標的の一次配列構造だけでなく、ミスマッチした塩基対、ループ、湾曲（bulge）、もつれ（kink）、およびシステム構造を含む、核酸、ＲＮＡおよびＤＮＡの二次および三次構造に関する情報も含む。これは、１つの態様に一致し、デオキシヌクレオチド残基または他の修飾残基を、特定の部位でオリゴリボヌクレオチドに取り込んだ後、質量分析計中でこれらのハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ核酸を選択的に切断することにより、達成することが可能である。
【選択図】なし

Description

本出願は、１９９８年５月１２日に提出された米国特許出願第０９／０７６，２０６号、および１９９８年３月２日に提出された仮特許出願第６０／０７６，５３４号の一部継続出願であり、前記出願の開示は、全体として、本明細書に援用される。
本発明は、生体分子、特に核酸標的の構造、リガンドおよび標的の間の相互作用の部位、標的に対するリガンドの相対的な結合親和性の決定、並びに他の有用な情報のため質量分析を使用するための方法に関する。本発明はまた、選択された標的に結合し、そして製薬、獣医学的薬剤、農業的化学薬品、産業的化学薬品およびその他のものに用いることが可能な個々の化合物についての、化学薬品混合物またはライブラリー、特にコンビナトリアル(combinatorial) ライブラリーをスクリーニングするため質量分析を使用するための方法も提供する。本発明はさらに、例えば化合物のコンビナトリアルライブラリーに対し多数の標的を同時にスクリーニングするための方法に関する。
本発明のさらなる側面は、１つまたは複数の分子種、特に「小」分子、および核酸、特にＲＮＡ上の分子相互作用部位の間の相互作用を決定するための方法を提供する。
薬剤発見の過程は、本過程に影響を与えるいくつかの技術が迅速に進歩し発展しているため、急速に変化している。薬剤発見は、数十年前は、本質的に天然産物の無作為スクリーニングだったが、潜在的な生物活性物質、例えばリガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、および阻害剤などとしての多数の合成分子の合理的およびコンビナトリアル設計だけでなく、ポリペプチド、タンパク質、または核酸である可能性がある、それらの生物学的標的の同定、並びに物理的および構造的性質決定をも含む、科学的過程へと発展してきている。薬剤設計および構造的生物学のこれらの重要な分野は疾患の理解および治療に非常に重要である。しかし、特定の生物学的標的に対する高親和性リガンドを同定しようとするまたは開発しようとする際、重大なハードルを克服する必要がある。これらには、標的の構造および他の分子が結合するまたは関与する可能性がある標的を明らかにする作業を取り巻く困難、新規リードを生成するため、または現存するリードを最適化するため、スクリーニングする必要がある化合物が多数であること、これらの多数の化合物の間の構造的類似点および相違点を詳細に分析する必要があること、構造的特徴を活性および結合親和性に相関させること、並びに小さな構造的変化が化合物の生物学的活性に対する大きな影響につながる可能性があるという事実が含まれる。
伝統的には、薬剤発見および最適化は、漸増する構造的変化を持つ、単一の化合物の合成および評価の、高価でそして時間がかかる、そしてしたがって緩慢な過程を伴ってきている。天然産物を用いる場合、抽出物の個々の構成要素は、生物学的評価の前に、苦心して純粋な成分化合物に分離しなければならなかった。さらに、in vitro スクリーニングの前に、すべての化合物を注意深く分析し、そして性質決定しなければならなかった。これらのスクリーニングは、典型的には、標的に対する結合親和性に関する候補化合物の評価、リガンド結合部位に関する競合、あるいは阻害、細胞増殖、活性化または拮抗作用終点を介し決定されるような標的での有効性を含んだ。薬剤発見過程を遅らせる薬剤設計およびスクリーニングのこれらのすべての面を考慮し、発見作業に関わる研究者により、これらの問題を軽減するまたは取り除くためのいくつかのアプローチが実行されてきている。
薬剤発見過程が加速されている１つの方法は、多くの化合物のコレクション、ライブラリー、またはアレーの生成による。発見戦略は、個々に合成されそして試験される化合物の中から薬剤リードを選択することから、多くの化合物のコレクションのスクリーニングへと変化してきている。これらのコレクションは天然供給源由来であってもよい（Sternbergら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 1609-1613）し、またはコンビナトリアル化学 (combinatorial chemistry) などの合成法により生成してもよい（Ecker および Crooke, Bio/Technology, 1995, 13, 351-360 および米国特許第５，５７１，９０２号、本明細書に援用される）。これらの化合物コレクションは、例えば高処理平行合成を介し、または分割・混合 (split-mix) または他のコンビナトリアル法により合成した数百までのまたは数千もの分子の混合物またはプールとして合成した、個々のよく性質決定された化合物のライブラリーとして生成してもよい。こうしたコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングは、通常、リガンド・受容体相互作用の度合いを測定する結合アッセイを伴ってきている（Chu ら, J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 7827-35）。しばしば、リガンドまたは標的受容体がポリマービーズまたはプレートなどの表面に固定される。結合事象の検出後、リガンドを遊離させそして同定する。しかし、固相スクリーニングアッセイは、非特異的相互作用により困難になる可能性がある。
コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングが、固相、溶液法またはその他を介し行われようと、迅速でそして有効な方式で標的に結合し、そしてしたがって非常に興味深い、ライブラリー構成要素を同定するのは困難である可能性がある。これはコンビナトリアルおよび他の薬剤発見過程を容易にそして有効にするため改善する必要がある過程である。薬剤発見および開発の過程を加速するため、生体高分子および他の治療標的の構造理解を容易にするいくつかのアプローチもまた、開発されてきている。これらには、タンパク質および核酸の配列決定が含まれる（Smith, Protein Sequencing Protocols, Humana Press, ニュージャージー州トトワ, 1997; Findlay および Geisow, Protein Sequencing: A Practical Approach, IRL Press, オックスフォード, 1989; Brown, DNA Sequencing, IRL Oxford University Press, オックスフォード, 1994; Adams, Fields および Venter, Automated DNA Sequencing and Analysis, Academic Press, サンディエゴ, 1994）。これらにはまた、こうした生体高分子の二次構造および三次構造を、ＮＭＲ（Jefson, Ann. Rep. in Med. Chem., 1988, 23, 275; Erikson および Fesik, Ann. Rep. in Med. Chem., 1992, 27, 271-289）、Ｘ線結晶学（Erikson および Fesik, Ann. Rep. in Med. Chem., 1992, 27, 271-289）およびタンパク質フォールディングの予測を試みるコンピューターアルゴリズムの使用（Copeland, Methods of Protein Analysis: A Practical Guide to Laboratory Protocols, Chapman および Hall, New York, 1994; Creighton, Protein Folding, W.H.Freeman and Co., 1992）を介し、解明することが含まれる。ELISA（Kemenyおよび Challacombe, ELISA and other Solid Phase Immunoassays; Theoretical and Practical Aspects; Wiley, ニューヨーク, 1988）および放射性リガンド結合アッセイ（Berson および Yalow, Clin. Chim. Acta, 1968, 22, 51-60; Chard, “An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques," Elsevier Press, アムステルダム／ニューヨーク, 1982）などの実験、表面プラスモン共鳴（Karlsson, Michaelsson および Mattson, J. Immunol. Methods, 1991, 145, 229; Jonsson ら, Biotechniques, 1991, 11, 620）の使用、並びにシンチレーション近接アッセイ（Udenfriend, Gerber および Nelson, Anal. Biochem., 1987, 161, 494-500）が、受容体・リガンド相互作用の性質を理解するのに用いられている。
前述の実例および技術はすべて、現在、一般の当業者に利用可能であり、そして本明細書では、それらを理解しそして精通していると仮定する。
同様に、高処理生物学的スクリーニングのための化合物の化学合成が改善されてきている。コンビナトリアル化学、計算 (computational) 化学、および多くの化合物の混合物のコレクションまたは個々の化合物の合成はすべて、in vitro スクリーニングのための多数の化合物の迅速な合成を容易にしてきている。これらの進歩にも関わらず、薬剤発見の過程および最適化は、一連の困難な段階を伴う。この過程もまた、各段階に伴う費用および多数の個々の化合物をスクリーニングする必要性から、高価なものになる可能性がある。さらに、標的受容体の構造的特徴もまた、定義しにくい可能性がある。
生物活性化合物の同定における１つの段階は、望ましい生体高分子または他の受容体、例えば特定のタンパク質または核酸あるいはそれらの組み合わせなどに対する試験化合物の結合親和性の測定を伴う。コンビナトリアル化学に関しては、該ケミストリーが、in vitro 生物学的スクリーニングのための多数の化合物を合成する、または天然供給源から単離する能力を有するため、この困難が拡大される。コンビナトリアル化学は、しばしば混合物として単離される、多数の化合物または天然産物を生成するため、最も活性があるまたは受容体標的に最も高い親和性で結合する、ライブラリーまたは混合物のメンバーを迅速に決定することを可能にする方法が必要である。
関連した観点から、薬剤発見科学者には、生物学的に興味深い標的の構造解明、標的・リガンド相互作用の強度および化学量論の決定、並びにコンビナトリアル混合物の活性構成要素の決定のためのいくつかのツールおよび技術が利用可能である。
先に引用されたタンパク質および核酸などの生物学的標的の配列決定（例えば、Smith, Protein Sequencing Protocols, 1997 中、並びに Findlay および Geisow, Protein Sequencing: A Practical Approach, 1989 中）のための技術および器具類が利用可能である。これらの技術は有用であるが、こうした配列決定作業により配列決定されないいくつかの種類および構造の生体高分子標的があり、そしていずれにしろ、より簡便でそして経済的な方法が求められてきている。現在の配列決定技術の別の短所は、これらが標的の一次構造または配列以上のいかなるものも明らかにすることができないことである。
Ｘ線結晶学は、生体高分子標的のある程度の二次構造および三次構造の決定を可能にすることができる、非常に強力な技術である（Erikson および Fesik, Ann. Rep. in Med. Chem., 1992, 27, 271-289）が、本技術は、高価な方法であり、そして非常に達成困難な可能性がある。生体高分子の結晶化は非常に困難であり、適切な分解度で行うことが難しく、そしてしばしば科学と見なされるのと同じ位、技術と見なされる。薬剤発見過程におけるＸ線結晶構造の有用性をさらに混乱させるのは、結晶学が、溶液相、そしてしたがって生物学的に適切な、目的の標的の構造への洞察を明らかにできないことである。
リガンド（アゴニスト、アンタゴニスト、または阻害剤）およびその標的の間の相互作用の性質および強度のある程度の分析は、すべて先に引用された、ＥＬＩＳＡ（Kemeny および Challacombe, ELISA and other Solid Phase Immunoassays: 1988 中）、放射性リガンド結合アッセイ（Berson および Yalow, Clin. 1968; Chard,“An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques," 1982 中）、表面プラスモン共鳴（Karlsson, Michaelsson および Mattson, 1991; Jonsson ら, Biotechniques, 1991)、またはシンチレーション近接アッセイ（Udenfriend, Gerber および Nelson, Anal. Biochem., 1987）により行ってもよい。放射性リガンド結合アッセイは、典型的には、放射性リガンドのものに対する結合部位での未知の物質の競合結合を評価する際のみ有用であり、そしてまた放射能の使用を必要とする。表面プラスモン共鳴技術は、使用が、より直接的であるが、やはりかなり高価である。結合動力学、並びに解離および結合定数の慣用的な生化学アッセイもまた、標的・リガンド相互作用の性質を解明するのに有益である。
化合物のコンビナトリアル混合物をスクリーニングする際、薬剤発見科学者は、慣用的に活性プールを同定し、再合成を介し該プールを個々のメンバーに分割し（deconvolute）、そして別個の化合物の分析を介し、活性メンバーを同定するであろう。生物学的に適切な多様な標的に対するコンビナトリアルライブラリーの研究のための現在の技術およびプロトコルは、多くの短所を有する。上述のスクリーニング技術の冗長さ、高コスト、多段階特性、および低感度は、現在利用可能なツールの短所である。さらに、利用可能な技術は、常に最も適切な構造的情報、例えば溶液中の標的の構造を提供するわけではない。その代わり、これらは固相においてのみ存在する可能性がある標的構造への洞察を提供する。また、特定の作業に対し、試薬および実験をあつらえる必要があることは、現在の薬剤発見およびスクリーニング技術を実行する上で困難である。現在の方法はまた、プールまたは混合物の別個のメンバーの冗長な再合成および再分析を行う必要なく、ライブラリーの活性メンバーを分割し、そして同定するのに必要な簡便な解決法を提供することもできない。
したがって、標的およびリガンド両方の構造、標的およびリガンドの間の相互作用部位、並びに標的・リガンド相互作用強度の１つまたはそれ以上を決定することが可能であるような、複合体化学薬品ライブラリー、特にコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングおよび同定のための方法が非常に必要とされている。さらに、薬剤発見を加速するため、混合物から直接、生物活性メンバーを同定するための方法を提供し、そして単一の方法で、多数の生体分子標的のスクリーニングを可能にする、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする新規方法が必要とされる。生体高分子の選択的でそして調節された切断を可能にする一方、また、構造的情報を提供するため、多様なフラグメントを分析する、直接的な方法は、生化学および薬剤発見に関与する者に非常に価値があるであろうし、そして長く望まれてきている。また、生体高分子標的の１つの種類に限定されず、核酸、ペプチド、タンパク質およびオリゴ糖など、多様な標的に適用可能である方法が好ましい。
米国特許第５，５７１，９０２号 Sternbergら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 1609-1613 Ecker および Crooke, Bio/Technology, 1995, 13, 351-360 Chu ら, J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 7827-35 Smith, Protein Sequencing Protocols, Humana Press, ニュージャージー州トトワ, 1997 Findlay および Geisow, Protein Sequencing: A Practical Approach, IRL Press, オックスフォード, 1989 Brown, DNA Sequencing, IRL Oxford University Press, オックスフォード, 1994; Adams, Fields Venter, Automated DNA Sequencing and Analysis, Academic Press, サンディエゴ, 1994 Jefson, Ann. Rep. in Med. Chem., 1988, 23, 275 Erikson および Fesik, Ann. Rep. in Med. Chem., 1992, 27, 271-289 Erikson および Fesik, Ann. Rep. in Med. Chem., 1992, 27, 271-289 Copeland, Methods of Protein Analysis: A Practical Guide to Laboratory Protocols, Chapman および Hall, New York, 1994 Creighton, Protein Folding, W.H.Freeman and Co., 1992 Kemenyおよび Challacombe, ELISA and other Solid Phase Immunoassays; Theoretical and Practical Aspects; Wiley, ニューヨーク, 1988 Berson および Yalow, Clin. Chim. Acta, 1968, 22, 51-60 Chard, "An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques," Elsevier Press, アムステルダム／ニューヨーク, 1982 Karlsson, Michaelsson および Mattson, J. Immunol. Methods, 1991, 145, 229 Jonsson ら, Biotechniques, 1991, 11, 620 Udenfriend, Gerber および Nelson, Anal. Biochem., 1987, 161, 494-500 Smith, Protein Sequencing Protocols, 1997 Findlay および Geisow, Protein Sequencing: A Practical Approach, 1989 Erikson および Fesik, Ann. Rep. in Med. Chem., 1992, 27, 271-289 Kemeny および Challacombe, ELISA and other Solid Phase Immunoassays: 1988 Berson および Yalow, Clin. 1968; Chard,"An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques," 1982 Karlsson, Michaelsson および Mattson, 1991 Jonsson ら, Biotechniques, 1991 Udenfriend, Gerber および Nelson, Anal. Biochem., 1987
本発明の主な目的は、生体分子標的およびそれらと相互作用するリガンドの構造を決定するための新規方法を提供し、そしてこうした相互作用の性質および部位を確かめることである。
本発明のさらなる目的は、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、および核酸などの生体分子標的の構造的特徴、例えば生体高分子の一次配列、二次構造およびフォールディングした構造、並びに分子内および分子間相互作用から生じる、生体分子のより高次の三次および四次構造を決定することである。
本発明のさらに別の目的は、生体分子標的および単数または複数の結合リガンドの間の相互作用の部位および性質を決定することである。結合リガンドは「小」分子、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはオリゴ糖などの生体分子、天然産物、あるいはコンビナトリアルライブラリーのメンバーであってもよい。
本発明のさらなる目的は、生体高分子標的に結合するリガンドの相対結合親和性または解離定数を測定することである。好ましくは、これはＲＮＡ／ＤＮＡ標的などの生体高分子およびリガンド、例えばコンビナトリアル的に合成されたライブラリーのメンバーの間の相対結合親和性の測定をもたらす。
本発明のさらなる目的は、生体高分子標的に結合するリガンドの絶対結合親和性または解離定数を測定することである。
本発明のさらなる目的は、ライブラリーのどの構成要素が標的に結合するか決定するため、核酸などの生体分子標的に対する個々の化合物または化合物の混合物を含むコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングのための一般的な方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、生体分子標的に結合する、コンビナトリアルライブラリーのメンバーの分子量および構造を決定するための方法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、核酸、タンパク質、並びに他の生体分子およびオリゴマーなどの多数の標的を、化合物のコンビナトリアルライブラリーに対し、同時にスクリーニングするための方法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、化合物、特に「小」有機分子が、生物学的分子、特にＲＮＡなどの核酸の分子相互作用部位に結合するまたは該部位に相互作用する特異性および親和性を確かめることである。こうした分子は、こうした部位に相互作用する予測されたまたは計算された可能性に一致して段階付けられる、分子相互作用部位に関する、リガンドおよび潜在的なリガンドの段階付けられた階層を形成する可能性があり、そして好ましくは形成する。
本発明の別の目的は、スクリーニング標的の混合物およびコンビナトリアルまたは他の化合物の混合物の分析から生じる質量スペクトルにおけるピーク重複の問題を軽減することである。好ましい態様において、本発明は、コンビナトリアルまたは他の化合物の混合物における質量重複（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）の問題を解決する方法を提供し、そしてまた、スクリーニングされる標的の混合物における質量重複の問題を解決する方法も提供する。
本発明のさらなる目的は、コントロールと比較し、標的に対するリガンドの結合特異性を決定するための方法を提供することである。本発明は、選択性の決定、非特異的影響の同定および薬剤発見作業のためのさらなる考慮からの非特異的リガンドの除去を容易にする。
本発明は、とりわけ、非常に多様な生体分子標的に対するリガンドの構造および結合の性質の決定のための、一連の新規方法および適用を提供する。この新規アプローチは薬剤リード発見のため、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための構造的情報を提供する。
本発明の１つの側面は、質量分析を用いた、核酸などの生体分子標的の構造を決定する方法である。本方法は、核酸標的の一次配列構造だけでなく、ミスマッチした塩基対、ループ、湾曲（bulge）、もつれ（kink）、およびステム構造を含む、核酸、ＲＮＡおよびＤＮＡの二次および三次構造に関する情報も提供する。これは、１つの態様に一致し、デオキシヌクレオチド残基または他の修飾残基を、特定の部位でオリゴリボヌクレオチドに取り込んだ後、質量分析計中でこれらのハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ核酸を選択的に切断することにより、達成することが可能である。現在、核酸の電子スプレーイオン化、核酸の切断、およびそれに続くタンデムＭＳn スペクトロメトリーは、核酸配列および構造の指標である、フラグメントパターンをもたらすことが見出されてきている。切断は、デオキシヌクレオチドまたは他の異質な残基の取り込み部位および該核酸の二次構造によって決まる。本方法はしたがって、核酸の配列に存在する二次構造の部位および種類を同定する質量スペクトルデータを提供する。
本方法を生体分子標的および該標的に結合するリガンドまたは分子の混合物に対し行う場合、リガンドおよび生体分子の間の相互作用の度合いおよび本相互作用の位置を両方確かめることが可能である。生体分子へのリガンドの結合は、質量分析中の容易な切断から生体分子上の結合部位を保護する。したがって、本方法を用い、結合リガンドまたは薬剤の存在下および不存在下で、ＲＮＡ／ＤＮＡに関し、生じたＥＳＩ−ＭＳn 質量スペクトルを比較することにより、結合位置が明らかになる。この改変された切断パターンは、質量スペクトル中に明らかに識別され、そして核酸の配列および構造に相関する。したがって、本発明の方法により、試験リガンドの絶対結合親和性を決定することが可能である。核酸・リガンド非共有複合体イオンの存在量を、結合親和性が知られている標準化合物（例えば１６Ｓ ＲＮＡ Ａ部位へのパロモマイシン）から生じる、同様の複合体の存在量と比較することにより、試験リガンドの相対結合親和性の決定が可能になる。
本発明の方法は、多くの化合物のコレクションの迅速なスクリーニングに用いることが可能である。コンビナトリアルまたは他の手段を介し生成される、多数の化合物の混合物をスクリーニングすることもまた、可能である。多くの化合物の混合物を、生体分子標的、例えば核酸に曝露すると、リガンドの小さな分画は、該核酸に対しある程度の結合親和性を示す可能性がある。結合物質として検出される可能性があるリガンドの実際の数は、核酸標的の濃度、コンビナトリアル混合物の構成要素の相対濃度、並びにこれらの構成要素の絶対および相対結合親和性に基づく。本方法は、選択的イオントラップ、または集積などの技術を用い、異なる非共有複合体を分離し、そして、衝突活性化解離またはＭＳn 実験を用い、結合リガンドの構造および同一性に関し、各複合体を分析することが可能である。本発明の方法は、したがって、生体分子標的に結合する分子に関しコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする方法として働くことが可能であるだけでなく、直接的な方式で、結合リガンドの構造的同一性も提供することが可能である。この方式では、本方法は、高分解度分子質量を提供することが可能であり、そしてまた、タンデム法を用い、同一の分子質量のリガンドの異なる構造間の相違を識別することも可能であるため、コンビナトリアルライブラリーにおけるいかなる質量重複も問題を生じない。
好ましい態様に一致して、分子相互作用部位を有するＲＮＡなどの標的生体分子は、分子相互作用部位に対するリガンドの相互作用または結合が起こる可能性があるような条件下で、該相互作用部位に対する１つまたはそれ以上のリガンドまたは推測されるリガンドと共に提示される。生じた複合体は、ＲＮＡまたは他の生体分子とリガンドの、１つまたは１００であってもよい個々の複合体である可能性があるが、該複合体をその後、本発明に一致した質量分析的評価に供する。「分離用（preparative）」質量分析は、個々の複合体を単離することが可能であり、該複合体をその後、続く分析のため、質量分析環境内の調節された条件下で、フラグメント化してもよい。このように、分子相互作用部位に対するリガンドの結合の性質および度合い、または絶対結合親和性を確かめてもよい。特異的な強い結合リガンドの同定を行ってもよく、そして治療薬、農業的、産業的または他の化学薬品のいずれか、あるいはそれらに匹敵するものとして使用するため選択されたものを、こうした使用のため改善された形状へ引き続き修飾するためのリード化合物として用いてもよい。
本発明のさらなる適用は、化合物のコンビナトリアルライブラリーまたは混合物に対する多数の生体分子標的の同時スクリーニングのための質量分析的方法の使用である。このかなり複雑なスクリーニング法は、用いられる質量分析的方法およびスクリーニングが実行される方法を組み合わせることにより、可能になる。例えば、多数の標的核酸をスクリーニングする際、特に２つまたはそれ以上の標的が同様の配列構成または質量である場合、質量重複が懸念される。この問題は、本発明により、研究される異なる核酸標的に対し、特別の質量修飾分子量タグを用いることにより、軽減される。これらの質量修飾タグは、典型的には巨大分子量の非イオン性ポリマーであり、限定されるわけではないが、多くの異なる大きさおよび重量のものが入手可能で、そして核酸上の多くの異なる可能な部位の１つまたはそれ以上に結合することが可能な、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミドおよびデキストランが含まれる。したがって、同様の核酸標的を差別的にタグ化することが可能であり、そしてここで、その明らかに異なる質量対荷電比（ｍ／ｚシグナル）により、質量スペクトルにおいて、互いに容易に識別することが可能である。ここで、本発明の方法を用い、多数の化合物の混合物に対し、多数の標的を同時にスクリーニングすることが可能であるため、スクリーニング作業を顕著に加速することが可能である。
本発明の方法の別の関連した利点は、新規リガンドおよび生体分子標的の間の結合相互作用の特異性を測定する能力である。例えば、標的核酸および１つまたはそれ以上のコントロール核酸を、コンビナトリアルライブラリーまたは特定のリガンドに対し、同時にスクリーニングすることにより、本発明の方法を用い、リガンドが標的核酸のみに特異的に結合するのか、または標的で観察される結合がコントロール核酸でも再現され、そしてしたがって非特異的であるのかを確かめることが可能である。
本発明の方法は、非常に多様な生体分子標的の研究に適用可能であり、該標的には、限定されるわけではないが、ペプチド、タンパク質、受容体、抗体、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、核酸、オリゴ糖、炭水化物、および糖ペプチドが含まれる。本発明の方法を用いることにより、スクリーニングすることが可能な分子には、限定されるわけではないが、有機または無機、小ないし巨大分子量の個々の化合物、リガンド、阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト、基質、および生体高分子、例えばペプチド、核酸またはオリゴヌクレオチドの混合物およびコンビナトリアルライブラリーが含まれる。本発明の方法に用いてもよい質量分析技術には、限定されるわけではないが、ＭＳn 、衝突活性化解離（ＣＡＤ）および衝突誘起解離（ＣＩＤ）および赤外多光子解離（ＩＲＭＰＤ）が含まれる。多様なイオン化技術を用いてもよく、該技術には、限定されるわけではないが、電子スプレー、ＭＡＬＤＩおよびＦＡＢが含まれる。本発明の方法に用いられる質量検出装置には、限定されるわけではないが、ＦＴＩＣＲ、イオントラップ、四重極、磁気セクター、飛行時間型（ＴＯＦ）、Ｑ−ＴＯＦ、および三重四重極が含まれる。本発明の方法はまた、限定されるわけではないが、すべて、以下により完全に記載されるように、ＬＣ／ＭＳおよびＣＥ／ＭＳなどの「ハイフンでつながれた」技術を用いてもよい。
典型的な質量分析技術の概要
質量分析（ＭＳ）は、分子構造並びに小分子および巨大分子の間の相互作用の研究のための強力な分析ツールである。ＭＳの現在の最新技術は、質量分析を用い、フェントモル量未満の成分を容易に分析し、試料の分子内容物に関する情報を提供することが可能である程度である。試料の分子量が数百、または十万を上回る原子質量単位またはダルトン（Ｄａ）であるかに関わりなく、成分の分子量の正確な評価を迅速に得ることが可能である。質量分析が重要な生物学的分子の重大な側面を解明することが可能であることが、現在、見出されてきている。本発明と一致した分析ツールとしてのＭＳの有用性の１つの理由は、試料に関する異なる情報を提供することが可能な、多様な異なるＭＳ法、計器、および技術が利用可能であることである。
こうしたＭＳ技術の１つは、電子スプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）（Smith ら, Anal. Chem., 1990, 62, 882-899; Snyder, Biochemical and biotechnological applicaions of electrospray ionization mass, American Chemical Society, ワシントンＤＣ，１９９６中；Cole, Electrospray ionization mass spectrometry: fundamentals, instrumentation, Wiley, ニューヨーク，１９９７中）である。ＥＳＩは、非常に強い静電場の存在下で、試料溶液を穏やかに霧状にすることにより、研究する試料の、非常に荷電された小滴を生じる。これは、中性溶媒の蒸発のため縮む非常に荷電された小滴の生成を生じ、そして究極的には、穏やかな条件下で、典型的にはプロトン付加または除去を介し、試料成分の多荷電イオンをもたらす「クーロン爆発 (Coulombic explosion)」につながる。ＥＳＩ−ＭＳは、質量が１０ｋＤａより大きい、タンパク質および核酸などの非常に高分子量の生体高分子に特に有用であり、これは該方法が、いかなる重大な量のフラグメンテーションを引き起こすこともなく、試料生体高分子の多荷電分子の配給をもたらすためである。異なる電荷を持つイオンが形成されるため、１つの試料からいくつかのピークが観察されるという事実は、生体高分子の分子量を決定する際のＥＳＩ−ＭＳの正確さに貢献する。これは観察されるピーク各々が、試料の分子量の計算に独立した手段を提供するためである。こうして単一のＥＳＩ−質量スペクトルから得られた分子量の多数の読み取り値を平均化することにより、質量分析計により単一の分子イオンピークが提供された場合に得られるであろうより、はるかにより正確な分子量の概算がもたらされる。ＥＳＩ−ＭＳの柔軟性にさらに付け加えられるのは、陽性または陰性イオン化方式のどちらでも測定値を得ることが可能であることである。
近年、電子スプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）が分析技術として広く生長してきている。これは、該技術が、タンパク質、核酸、および炭水化物を含む巨大分子の分析に広く適用可能であるためである。Bowers ら, Journal of Physical Chemistry, 1996, 100, 12897-12910; Burlingame ら, J. Anal. Chem., 1998, 70, 647R-716R; Biemann, Ann. Rev. Biochem., 1992, 61, 977-1010; および Crain ら, Curr. Opin. Biotechnol., 1998, 9, 25-34。この分野の最も重大な発展の１つは、適切な溶液条件および分析物濃度下で、ガス相に促進されている特異的非共有結合巨大分子複合体が損なわれていないという観察である。Loo, Mass Spectrometry Reviews, 1997, 16, 1-23; Smith ら, Chemical Society Reviews, 1997, 26, 191-202; Ens ら, Standing, K.G および Chernushevich, I.V. 監修, New Methods for the Study of Biomolecular Complexes (Proceedings of the NATO Advanced Research Workshop,NATO ASI Ser., Ser. C．中，カナダ・アルベルタで１９９６年６月１６−２０日開催，1998; 510; Kluwer，オランダ・ドルドレヒト，１９９８。最近の例には、多量体タンパク質（Fitzgerald ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 6851-6856）、酵素・リガンド複合体（Ganguly ら, Tetrahedron, 1993, 49, 7985-7996）、タンパク質・ＤＮＡ複合体（Cheng ら, Proc.Nat'l. Acad. Sci. U.S.A., 1996, 93, 7022-7027）、多量体ＤＮＡ複合体（Griffey ら, Proc. SPIE-Int. Soc. Opt. Eng., 1997, 2985, 82-86）、およびＤＮＡ・薬剤複合体（Galeら, JACS, 1994, 116, 6027-6028）が含まれ、これらの開示は、全体として、本明細書に援用される。
Ｓｍｉｔｈおよびその共同研究者は、溶液中の競合結合条件下では、酵素・リガンド混合物のＥＳＩ−ＭＳ測定は、測定された溶液相解離定数（ＫD ）と相関する、ガス相イオン量を生じることを立証している。Cheng ら, JACS, 1995, 117, 8859-8860、この開示は、全体として、本明細書に援用される。彼らは、カルボニックアンヒドラーゼに対する修飾ベンゼンスルホンアミド阻害剤の２５６メンバーのライブラリーの結合親和性を階層付けることができた。遊離および結合リガンド並びに基質のレベルは、ＥＳＩ−ＭＳにより測定されるようなその相対存在量から直接定量化することが可能であり、そしてこれらの測定値を用い、溶液測定と一致する分子解離定数を定量的に決定することが可能である。Jorgensen および共同研究者は、Ｄ−およびＬ−トリペプチドおよびバンコマイシン群抗生物質の間に形成される非共有複合体の相対イオン存在量を用い、溶液結合定数を測定することが可能であることを立証している。Jorgensenら, Anal. Chem., 1998, 70, 4427-4432、この開示は、全体として、本明細書に援用される。Griffey および共同研究者は、タンデムＥＳＩ−ＭＳ法を用い、ＲＮＡ標的に結合する小分子に関し結合部位を決定することが可能であることを示している。Gale ら，Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 1995, 6, 1154-1164、この開示は、全体として、本明細書に援用される。
フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（ＦＴ−ＩＣＲ ＭＳ）は、非常に小さい質量相違を解像し、無比の正確さで分子質量の測定を提供することが可能である。Marshall ら, Mass Spectrom. Rev., 1998, 17, 1-35。特有の要素組成を持つ各小分子は、その正確な分子質量に対応する固有の質量標識を持つため、巨大分子標的に結合している、非常に関連しているライブラリーメンバーを同定するには、正確な分子質量を測定するだけでよい。標的および潜在的なリガンドは、放射標識、蛍光タグ化、または単一化合物再合成を介した分割（deconvolution）を必要としない。さらに、リガンドおよび標的濃度の調整により、ＥＳＩ−ＭＳアッセイを、競合的または非競合的結合条件下で、平行形式で行うことが可能になる。シグナルは＜１０ｎＭないし〜１００ｍＭの範囲の解離定数を持つ複合体から検出することが可能である。
ＲＮＡの構造化領域に結合する小分子が、治療効果を示す可能性がある。例えば、アミノグリコシド抗生物質は本質的なＲＮＡ・タンパク質およびＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用を分離することにより、細菌増殖を阻害する。De Stasio ら, EMBO J, 1989, 8, 1213-6 および Bryan, L.E. New dimensions in antimicrobial therapy; Root, R.K., Sande,M.A。監修, Churchill Livingstone, ニューヨーク, 1984 中; Vol.1, pp 17-35。パロモマイシンは、最も広く研究されているアミノグリコシドの１つであるが、〜２００ｎＭＫD で原核１６ＳｒＲＮＡ（Ａ部位）の解読部位に結合し、そして翻訳中の遺伝暗号の読み間違いを誘導する。Wong ら, Chem. Biol., 1998, 5, 397-406。しかし、結合特異性を提供する、ＲＮＡおよびアミノグリコシドの間の相互作用の特徴は、ほとんど性質決定されていない。本研究において、我々はＥＳＩ−ＦＴＩＣＲを使用し、原核および真核リボソームの解読部位に対応する２つの非常に関連しているモデルＲＮＡ構築物およびアミノグリコシド抗生物質のコレクションの個々のメンバーの間の特異的相互作用を検出する。
マトリックス介助レーザーデソープション／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）は、生体分子を研究するのに用いてもよい別の方法である（Hillenkamp ら, Anal. Chem., 1991, 63, 1193A-1203A）。本技術は、試料成分の付随するフラグメンテーションを最小にし、高分子量生体高分子をイオン化する。これは、典型的には、分析しようとする試料を、付随するＵＶまたはＩＲレーザーからの放射を吸収するマトリックスに取り込むことを介し、達成される。このエネルギーをその後、マトリックスから試料に移送し、試料をガス相に放出し、その後イオン化し、そしてフラグメンテーションを最小にする。ＥＳＩ−ＭＳに対するＭＡＬＤＩ−ＭＳの利点の１つは、ＭＡＬＤＩスペクトルは、一般的に単一の荷電種が優位を占めるため、得られるスペクトルが単純であることである。典型的には、ＭＡＬＤＩ技術により生成されるガス性イオンの検出は、これらのイオンの飛行時間（ＴＯ）を測定することにより検出されそして分析される。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳは高分解度技術ではないが、分解度は、こうした系を修飾することにより、タンデムＭＳ技術を使用することにより、またはフーリエ変換（ＦＴ）および四重極イオントラップなどの他の種類の分析装置を使用することにより、改善することが可能である。
フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）は、特に有用な分析技術である。これは該方法が、ＥＳＩまたはＭＡＬＤＩイオン化と結びつけると、他のＭＳ検出技術より優れた正確さおよび分解度を組み合わせた質量測定を行うことが可能であるためである（Amster, J. Mass Spectrom., 1996, 31, 1325-1337）。さらに、該方法は、他のイオン化技術のいずれにより生成されたイオンの高分解度質量スペクトルを得るのに用いてもよい。ＦＴＭＳの基本は、イオンサイクロトロン運動であり、これは一方向磁場とイオンの相互作用の結果である。イオンの質量対電荷比（ｍ／ｑまたはｍ／ｚ）は、イオンのサイクロトロン周波数を測定することにより、ＦＴＭＳ計器により決定する。イオンの運動エネルギーに対しサイクロトロン周波数が無反応であることは、ＦＴＭＳで達成可能である非常に高い分解度の基本的な理由の１つである。ＦＴＭＳは、ＥＳＩおよびＭＡＬＤＩを含む多様な異なるイオン化法により生成されたイオン、または衝突活性化解離（ＣＡＤ）から生じた産物イオンの分析のための、慣用的なまたはタンデム質量分析の優れた検出装置である。
衝突活性化解離（ＣＡＤ）はまた、衝突誘起解離（ＣＩＤ）としても知られる、分析物イオンが中性または荷電種とのエネルギー的な衝突により解離し、引き続き質量分析することが可能なフラグメントイオンを生じる方法である。選択されたペアレントイオン由来のフラグメントイオンの質量分析は、ペアレントイオンに関する特定の配列または他の構造情報を提供することが可能である。こうした方法は、一般的に、タンデム質量分析（ＭＳまたはＭＳ／ＭＳ）と称され、そして今日使用されている、ＭＳに基づく生体分子配列決定計画のいくつかの基本である。
ＦＴＩＣＲ−ＭＳは、イオントラップおよび四重極質量分析装置同様、実際に、巨大生体分子と別の分子の弱い非共有複合体である可能性があるイオンの選択を可能にし（Marshall および Grosshans, Anal. Chem., 1991, 63, A215-A229; Beu ら, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 1993, 4, 566-577; Winger ら, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 1993, 4, 566-577); (Huang および Henion, Anal. Chem., 1991, 63, 732-739)、またはＬＣ−ＭＳ（Bruins, Covey および Henion, Anal. Chem., 1987, 59, 2642-2646; Huang および Henion, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 1990, 1, 158-65; Huang および Henion, Anal. Chem., 1991, 63, 732-739）およびＣＥ−ＭＳ（Cai および Henion, J. Chromatogr., 1995, 703, 667-692）実験などのハイフンでつながれた技術も同様である。ＦＴＩＣＲ−ＭＳはまた、イオン・分子反応経路および動力学の研究にも適用されてきている。
いわゆる「ハイフンでつなげられた」技術は、分離および質量検出の二重の特徴を提供するため、構造解明に用いることが可能である。こうした技術は、天然産物、合成反応、またはコンビナトリアル化学から単離されたものなど、化合物の混合物の特定の構成要素の分離および同定に用いられてきている。ハイフンでつなげられた技術は、典型的には、第一段階として分離法を用い；液体クロマトグラフィー法、例えばＨＰＬＣ、微小穴ＬＣ、ミクロキャピラリーＬＣ、またはキャピラリー電気泳動が、こうした混合物の構成要素を分離するのに用いられる、典型的な分離法である。これらの分離法の多くは迅速であり、そして構成要素の高い分解度を提供する一方、また、ＭＳ検出と両立可能な低流速で行われる。流速がより速い場合、「大流量」ＥＳＩ供給源および試料分割技術の使用は、オンライン質量分析での実行を容易にしてきている。これらのハイフンでつなげられた分析技術の第二の段階は、分析計が第一の段階で分離された成分の質量および組成に関する情報を提供する検出装置として働くように、質量分析計に直接、分離された構成要素を注入することを伴う。多構成要素試料の多様な構成要素の質量の理解を得る観点から、これらの技術は有益であるが、これらは構造的な詳細を提供することができない。しかし、いくつかの構造的な詳細は、タンデム質量分析、例えば水素／ジュウテリウム交換または衝突誘起解離などの使用を通じ、確かめることが可能である。
典型的には、タンデム質量分析（ＭＳn ）は、質量分析の２つまたはそれ以上の段階のカップリングした使用を伴い、分離および検出段階はどちらも質量分析に基づく。第一の段階を用い、さらなる構造的情報を得ようとする試料のイオンまたは構成要素を選択する。この選択されたイオンをその後、（ＣＩＤ）または光解離によりフラグメント化する。その後、質量分析の第二の段階を用い、生じたフラグメントまたは産物イオンの質量を検出しそして測定する。ＦＴＩＣＲ−ＭＳの出現は、タンデム、ＭＳn 法の有用性に重大な影響を与えてきている。これは、ＦＴＩＣＲの、目的の特定のイオンを選択しそして捕捉する能力、並びにフラグメントイオンを検出する際のその高分解能および感度のためである。こうしたイオン選択後のフラグメンテーションの過程を多数回行い、試料の分子構造を本質的に完全に分析してもよい。二段階タンデムＭＳ実験は、ＭＳ−ＭＳ実験と呼ばれ、ｎ段階タンデムＭＳ実験は、ＭＳn 実験と呼ばれるであろう。試料の複雑さおよび望ましい構造的な詳細のレベルに応じ、２より以大きいｎの値でのＭＳn 実験を行ってもよい。
イオントラップに基づく質量分析計は、こうしたタンデム実験に特によく適している。これは、解離および測定段階が空間的に分離されているよりも時間的に分離されているためである。例えば、タンデム質量分析が行われる一般的なプラットホームは三重四重極質量分析計である。第一および第三の四重極は、質量フィルターとして働く一方、第二の四重極は、ＣＡＤの衝突セルとして働く。トラップに基づく質量分析計においては、ペアレントイオン選択および解離は、真空チャンバーの同じ部分で行われ、そしてトラップ要素に適用される高周波波長（radio frequency wavelength）および衝突ガス圧の調節により達成される。したがって、三重四重極質量分析装置が２段階の質量分析（すなわちＭＳ／ＭＳ）に限定される一方、イオントラップに基づく質量分析計は、ＭＳn 分析を行うことが可能であり、該分析中、ペアレントイオンが単離され、解離され、質量分析され、そして目的のフラグメントイオンが単離され、さらに解離され、そして質量分析されるなどする。いくつかのＭＳ4 法およびより高次のものが近年、文献に現れてきており、そしてここで用いてもよい（Chengら, Techniques in Protein Chemistry, VII, pp.13-21）。
ＥＳＩおよびＭＡＬＤＩ技術は、特定の生体分子の分子量の迅速で直接的な測定に適用を見出してきている（Feng および Konishi, Anal. Chem., 1992, 64, 2090-2095; Nelson, Dogruel および Williams, Rapid Commun. Mass Spectrom., 1994, 8, 627-631）。これらの技術は、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、糖タンパク質、オリゴ糖および炭水化物などの特定の生体分子の同一性および完全性を確認するのに用いられてきている。さらに、これらのＭＳ技術は、タンパク質に対する翻訳後修飾の検出および同定に生化学的適用を見出してきている。長さ１００塩基未満のＤＮＡおよびＲＮＡ配列の確認もまた、核酸の分子量を測定する、ＦＴＭＳを伴うＥＳＩを用い、達成されてきている（Little ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 2318-2322）。
ＥＳＩタンデムＭＳは、高分子量タンパク質の研究、ペプチドおよびタンパク質配列決定、リン酸化、硫酸塩化または糖鎖付加などの翻訳後修飾の同定、および酵素機構の研究に用いられてきている（Rossomando ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 5779-578; Knight ら, Biochemistry, 1993, 32, 2031-2035）。共有酵素・中間体または酵素・阻害剤複合体は、ＥＳＩを用いて検出され、そして酵素上の修飾部位を確かめるためのＥＳＩ−ＭＳにより分析されてきている。タンパク質配列決定の例が、文献に示されてきており、ここで損なわれていないタンパク質の多荷電イオンが衝突活性化解離に供され、配列情報を提供するフラグメントイオンをもたらす（Light-Wahl ら, Biol.Mass Spectrom., 1993, 22, 112-120）。ＥＳＩタンデムＭＳはまた、オリゴヌクレオチドおよび核酸の研究にも適用されてきている（Ni ら, Anal. Chem., 1996, 68, 1989-1999; Little, Thannhauser および McLafferty, Proc. Natl. Acad. Sci., 1995, 92, 2318-2322）。
オリゴヌクレオチドのタンデムＥＳＩ質量スペクトルはしばしば複雑であるが、いくつかのグループが大きなオリゴヌクレオチドの配列にＥＳＩタンデムＭＳを適用するのに成功してきている（McLuckey, Van Berkel および Glish, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 1992, 3, 60-70; McLuckey および Habibigoudarzi, J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 12085-12095; Little ら, J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 4893-4897)。McLuckey により明確に述べられたオリゴヌクレオチドの主な解離経路の一般的な規則（McLuckey, Van Berkel および Glish, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 1992, 3, 60-70; McLuckey および Habibigoudarzi, J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 12085-12095）は、オリゴヌクレオチドの質量スペクトルの解釈を補助してきており、そして例えば段階的な塩基の欠失後の相当する糖の３' −Ｃ−Ｏ結合の切断などのフラグメンテーションの観察を含む。オリゴヌクレオチド配列決定のためタンデムＭＳを伴うＥＳＩの使用に加え、２つの他の質量分析的方法もまた、利用可能である：オリゴヌクレオチドの酵素的切断の産物の質量分析（Pielesら, Nucleic Acids Res., 1993, 21, 3191-3196; Shaler ら, Rapid Commun. Mass Spectrom., 1995, 9, 942-947; Glover ら, Rapid Commun.Mass Spectrom., 1995, 9, 897-901）、および質量選択技術を使用しない、最初のイオン化／デソープション事象から生じるフラグメントイオンの質量分析（Little ら, Anal. Chem., 1994, 66, 2809-2815; Nordhoff ら, J. Mass Spectrom., 1995, 30, 99-112; Little ら, J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 4893-4897; Little および McLafferty, J. Am. Chem. Soc., 1995, 117, 6783-6784）である。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の配列はＥＳＩ−ＭＳおよびＣＩＤ技術を用い決定することが可能である（McLuckey, Van Berkel および Glish, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 1992, 3, 60-70; McLuckey および Habibigoudarzi, J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 12085-12095）が、ＲＮＡ配列の決定ははるかに困難である。したがって、質量分析を用い、小さいＲＮＡ、例えば６量体が配列決定されてきている（McCloskey ら, J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 12085-1095）が、より大きいＲＮＡは配列決定することが困難である。
電子スプレー質量分析は、リガンド、受容体、基質または阻害剤との酵素、タンパク質および核酸などの生体高分子の生化学的相互作用を研究するのに用いられてきている。生体高分子の共有修飾につながる相互作用はある期間研究されてきているが、非共有性の相互作用は、これまで、動力学技術（kinetic technology）以外の方法により研究することが特に困難であった。現在では、質量分析からこうした非共有相互作用の化学量論および性質に関する情報を得ることが可能である。ＭＳは、ガス相における生体高分子および他の分子の間の相互作用に関する情報を提供することが可能である；が、こうして生じたデータは、質量スペクトルが生じた溶液相現象を反映する可能性があることが立証されてきている。
ＥＳＩは穏やかなイオン化法で、重大な分子フラグメンテーションを生じず、そして生体高分子および他の分子の間の、弱く結合している複合体であっても、質量分析で損なわれず検出されるように、保存する。生体分子の多様な非共有複合体が、ＥＳＩ−ＭＳを用い研究されてきており、そして文献に報告されている（Loo, Bioconjugate Chemistry, 1995, 6, 644-665; Smith ら, J. Biol. Mass Spectrom.1993, 22, 493-501; Li ら, J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 8409-8413）。これらにはペプチド・タンパク質複合体（Busman ら, Rapid Commun. Mass Spectrom., 1994, 8, 211-216; Loo, Holsworth および Root-Bernstein, Biol. Mass Spectrom., 1994, 23, 6-12; Anderegg および Wagner, J. Am. Chem. Soc., 1995, 117, 1374-1377; Baczynskyj, Bronson および Kubiak, Rapid Commun. Mass Spectrom., 1994, 8, 280-286）、ポリペプチドおよび金属の相互作用（Loo, Hu および Smith, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 1994, 5, 959-965; Hu および Loo, J. Mass Spectrom., 1995, 30, 1076-1079; Witkowska ら, J. Am. Chem. Soc., 1995, 117, 3319-3324; Lane ら, J. Cell Biol., 1994, 125, 929-943)、タンパク質・小分子複合体（Ganem および Henion, Chem Tracts-Org. Chem., 1993, 6, 1-22; Henion ら, Ther. Drug Monit., 1993, 15, 563-569; Baca および Kent, J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 3992-3993）、多量体タンパク質の四次構造の研究（Baca および Kent, J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 3992-3993; Light-Wahl, Schwartz および Smith, J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 5271-5278; Loo, J. Mass Spectrom., 1995, 30, 180-183)、および核酸複合体の研究（Light-Wahl ら, J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 803-804; Galeら, J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 6027-6028; Goodlett ら, Biol. Mass Spectrom., 1993, 22, 181-183; Ganem, Li および Henion, Tet. Lett., 1993, 34, 1445-1448; Doctycz ら, Anal. Chem., 1994, 66, 3416-3422; Bayer ら, Anal. Chem., 1994, 66, 3858-3863; Greig ら, J. Am. Chem. Soc., 1995, 117, 10765-766）が含まれる。
弱い非共有相互作用に関しＥＳＩ−ＭＳ研究から生成されるデータおよび導かれる結論は、一般的に、ある程度、溶液相で見出される相互作用の性質を反映するが、文献には、遍在する非特異的相互作用の可能性を除くため、コントロール実験が必要であると指摘されてきている（Smith および Light-Wahl, Biol. Mass Spectrom., 1993, 22, 493-501）。電子スプレー／デソープション過程が穏やかであり、ガス相へ移送される際、水素結合、疎水性および／またはイオン性相互作用で共に保持されている、弱く結合している複合体を損なわれないままにすることを可能にするため、ＥＳＩ−ＭＳおよびＭＡＬＤＩ−ＭＳの使用を適用しているものもある。文献はガス相研究由来のＥＳＩ−ＭＳデータが、溶液中に見出される非共有相互作用を反映するだけでなく、こうした相互作用の強度もまた、測定することが可能であることを示す。多様なペプチド阻害剤の、ｓｒｃＳＨ２ドメインタンパク質に対する相互作用の結合定数は、ＥＳＩ−ＭＳで測定された場合、測定されるそれらの溶液相結合定数と一致することが見出された（Loo, Hu および Thanabal, Proc. 43rd ASMS Conf. on Mass Spectrom. and Allied Topics, 1995）。ＥＳＩ−ＭＳはまた、バンコマイシン抗生物質のトリペプチドリガンドとの結合定数を測定するスキャッチャードプロットを生成するのにも用いられてきている（Lim ら, J. Mass Spectrom., 1995, 30, 708-714）。
核酸の非共有相互作用を研究するのに、同様の実験が行われてきている。ＥＳＩ−ＭＳおよびＭＡＬＤＩ−ＭＳはどちらも、核酸およびタンパク質の非共有相互作用を研究するのに適用されてきている。ＭＡＬＤＩは、典型的には、損なわれていない非共有複合体の存続を可能にしないが、架橋法を使用し、複合体の構成要素間に共有結合を生成することにより、こうした研究にＭＡＬＤＩを使用することが可能になる。相互作用の化学量論および相互作用部位が核酸・タンパク質相互作用で確かめられてきている（Jensen ら, Rapid Commun. Mass Spectrom., 1993, 7, 496-501; Jensenら, 42ndASMS Conf. on Mass Spectrom. and Allied Topics, 1994, 923）。相互作用の部位は、典型的には、非共有または共有架橋複合体いずれかのタンパク質分解により決定される（Jensen ら, Rapid Commun. Mass Spectrom., 1993, 7, 496-501; Jensen ら, 42ndASMS Conf. on Mass Spectrom. and Allied Topics, 1994, 923; Cohenら, Protein Sci., 1995, 4, 1088-1099）。質量スペクトルを、タンパク質のみのタンパク質分解から生じたものと比較することにより、核酸・タンパク質複合体における切断部位接近可能性または保護に関する情報が提供され、そしてしたがって、複合体において相互作用するこれらの生体高分子の部分に関する情報が提供される。
電子スプレー質量分析はまた、タンパク質およびリガンド、酵素および阻害剤、並びにタンパク質および核酸の間のものなど、非共有巨大分子複合体の結合定数の測定にも、効果的に用いられてきている。Greig ら（J. Am. Chem. Soc., 1995, 117, 10765-10766）は、オリゴヌクレオチド・ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）複合体に関する解離定数（ＫD ）を測定するためのＥＳＩ−ＭＳの使用を報告している。ＥＳＩ−ＭＳで測定されたＫD 値は、キャピラリー電気泳動を用いて得られた溶液ＫD 値と一致すると報告された。
Cheng ら（J. Am. Chem. Soc., 1995, 117, 8859-8860）は、酵素カルボニックアンヒドラーゼの競合阻害剤の混合物の構造および相対結合定数を決定するための方法としてのＥＳＩ−ＦＴＩＣＲ質量分析の使用を報告している。単一のＥＳＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ実験を用い、これらの研究者は、これらの非共有複合体のイオンの相対存在量を測定することにより、阻害剤および酵素の間の非共有相互作用の相対結合定数を確認することができた。さらに、これらの化合物に関し、こうして測定されたＫD は、溶液におけるこれらの既知の結合定数に一致した。本方法はまた、ＦＴＩＣＲ技術によりもたらされる高分解能および多段階解離質量分析に基づき、少数の阻害剤の混合物由来の緊密に結合するリガンドの構造を同定することが可能であった。関連する研究において、Gao ら（J. Med. Chem., 1996, 39, 1949-55）は、カルボニックアンヒドラーゼＩＩの緊密に結合する阻害剤を検索する際、可溶性ペプチドのライブラリースクリーニングへのＥＳＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳの使用を報告している。緊密に結合するペプチド阻害剤の構造を同時に同定し、そしてその結合定数を測定した。質量スペクトルイオン存在量から決定される結合親和性は、溶液実験で決定されたものとよく相関することが見出された。さらに、本技術の薬剤発見作業への適用可能性は、タンパク質およびリガンドの間のこうした非共有相互作用の部位および方式に関し生じる情報が欠けていることにより、限定される。
また、これらの方法は、タンパク質とのリガンド相互作用研究を論じ、そしてこれらに限定されるようである。オリゴヌクレオチド、核酸、例えばＲＮＡおよびＤＮＡ、並びに他の生体高分子の非共有相互作用の研究に関する結合および解離定数の質量分析分析の本方法の適応性は、文献中に記載されてきていない。
薬剤発見過程は、最近、生物学的活性に関しスクリーニングする目的で、多数の合成化合物のコレクションおよび混合物をもたらす、高処理合成およびコンビナトリアル化学の導入により、急激に変化してきている。こうした多数の化合物の混合物およびプールは、バイオアッセイおよび分析化学者に対し重大な難問を引き起こす。この分析上の難問は、２種類である：混合物の活性構成要素の分離、およびその構造の同定である。ＬＣ、ＨＰＬＣ、およびＣＥを含む、多様な分離法が利用可能である。しかし、生物学的に活性がある構成要素を、１つまたはそれ以上の標的とコンビナトリアルライブラリーの混合物から分離するという観点から、リガンドおよび標的の間の複合体（通常、非共有）を選択しそして分離する方法の使用および開発が必要になる。アフィニティーカラム法は、化合物の混合物の結合構成要素を選択的に単離し、そして続いて分析するのに用いられてきている。例えば、Kassel ら（Kassel ら, Techniques in Protein Chemistry VI, J. Crabb 監修, Academic Press，サンディエゴ，1995, 39-46）は、高親和性結合リンペプチドの構造を、ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳにより分離しそしてその後分析するのに、固定化ｓｒｃ ＳＨ２ドメインタンパク質カラムを用いてきている。
同様の技術、ＡＣＥ−ＥＳＩ−ＭＳは、生体分子標的を化合物のコンビナトリアルライブラリーまたは混合物と混合した際、形成される、非共有複合体の分離を達成するのにアフィニティーキャピラリー電気泳動を使用する。受容体は、典型的には、キャピラリーに取り込まれ、その結果、コンビナトリアル混合物に存在するリガンドが標的と相互作用し、そしてキャピラリー中で保持されまたは遅くなる。分離後直ちに、これらの非共有複合体をＥＳＩ−ＭＳによりオンラインで分析し、複合体および結合構成要素の構造を確かめる。本方法は、以前別個に行われた２つの段階を１つに合併する：バンコマイシンで以前立証されたような、化合物／非共有複合体選択（Chu ら, Acc. Chem. Res., 1995, 28, 461-468; Chu ら, J. Org. Chem., 1993, 58, 648-52）および化合物同定の段階（Cai および Henion, J. Chromatogr., 1995, 703, 667-692)である。例えば、ＡＣＥ−ＥＳＩ−ＭＳはバンコマイシンとペプチドライブラリーの混合物に適用されてきており（Chu ら, J.Am. Chem. Soc., 1996, 118, 7827-35）、形成された非共有複合体の迅速なスクリーニング、およびバンコマイシンに結合するペプチドの同定が可能になっている。
コンビナトリアルライブラリーからの活性構成要素の分離および同定のための別の方法は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）使用後、ＬＣ／ＭＳまたはＣＥ／ＭＳ分析を使用する。サイズ排除は、生体高分子標的およびコンビナトリアルライブラリーの小分子メンバーとのその複合体を分離する、単純だが強力な方法である。ＳＥＣで分離後直ちに、これらの複合体を、変性溶液条件下で解離させ、そして最終的に質量分析により結合リガンドを分析する。本方法は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する、小分子のコンビナトリアルライブラリー由来の高親和性リガンドの同定に適用されてきている（Dunayevskiy ら, Rapid Commun. Mass Spectrom., 1997, 11, 1178-84）。
生体親和性（bio-affinity）性質決定質量分析（ＢＡＣＭＳ）は、リガンドの混合物および生体分子標的の非共有相互作用の性質決定のためのさらに別の方法である（Bruce ら, Rapid Commun. Mass Spectrom., 1995, 9, 644-50）。ＢＡＣＭＳは、親和性標的およびリガンドの混合物（又はコンビナトリアルライブラリー）両方を含む溶液の電子スプレーイオン化後、ＦＴＩＣＲイオントラップにおいてすべてのイオン種を捕捉することを伴う。目的の複合体をその後、質量スペクトルにおいて同定し、そして選択イオン集積により単離する。この後、低エネルギー解離または「加熱」を行い、複合体中に存在する高結合親和性リガンドを分離する。最後に、衝突活性化解離（ＣＡＤ）を用い、該高結合親和性リガンドに関する構造的情報を提供する。ＢＡＣＭＳの最大の利点は、アフィニティークロマトグラフィーなどの、複合体の分離および精製のための固体支持体の使用に続き、選択されたリガンドの性質決定のため分析する、ライブラリー研究に通常必要とされる時間がかかる技術がすべて一体となり、１つのＦＴＩＣＲ−ＭＳ実験になることである。現在まで、ＢＡＣＭＳはタンパク質標的の研究にのみ適用されてきている。
しかし、前述の方法のいずれも、多様な生体分子標的に対する適用可能性が立証されてきていない。さらに、こうした方法は、コンビナトリアル的に得られたリガンドおよび生体高分子の間の相互作用部位の迅速な決定を提供しない。
ＦＴＩＣＲ、三重四重極、またはイオントラップ質量分析計上の電子スプレーイオン化（ＥＳＩ）を用いて行われるような、タンデム質量分析は、生体分子の構造を決定するのに強力なツールであることが見出されてきている。電子スプレー技術を用い、小および大（＞３０００キロ塩基）どちらのＲＮＡおよびＤＮＡも溶液からガス相へ、損なわれていないイオンとして移送されることが可能であることが当業に知られている。さらに、当業者には、これらのイオンはある程度、ガス相のイオンとして、その溶液構造を保持することが知られている：これは、核酸およびタンパク質、並びに核酸および小分子の非共有複合体を、質量分析技術を用い、研究する際、特に有用である。
オリゴヌクレオチドおよび核酸は、衝突誘起解離（ＣＩＤ）中、特定のフラグメンテーションパターンにしたがい、そしてこれらのフラグメントおよびパターンを用い、核酸配列を決定することが可能であることが、研究により立証されてきている（McLuckey, Van Berkel および Glish, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 1992, 3, 60-70; McLuckey および Habibigoudarzi, J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 12085-12095）、電子スプレーイオン化は、核酸のいかなる重大なフラグメンテーションも伴わず、ペアレント核酸のいくつかの多荷電イオンを生じる。典型的には、核酸の単荷電状態は、三重四重極イオントラップ、またはイオンサイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）装置を用い、単離される。このイオンをその後、励起させ、そしてヘリウム、アルゴンまたは窒素などの中性ガスと衝突させ、核酸イオンの特定の結合の切断をもたらすようにし、あるいはレーザーパルスで励起させそしてフラグメント化する。典型的には、フラグメントイオンの２つの組が形成されることが見出されている：ａ−塩基（ａ−Ｂａｓｅ）の組、およびｗの組である。
ａ−塩基フラグメントの組は、Ｃ−２' プロトンの同時除去によるグリコシド結合の最初の切断に続く、３' −ホスフェート基およびＣ−４' プロトンの除去から生じる。本フラグメンテーション計画は、３' −リン酸に結合している残渣フランを生じ、そして核酸の５' −末端から連続的に増加する質量の、一連のａ−塩基フラグメントをもたらす。したがって、これらの衝突誘起フラグメントの質量を測定することにより、５' から３' 方向の核酸の配列が決定される。ｗフラグメントの組は、各フラグメント上に５' ホスフェート残基を残す方式での核酸の切断を介し、生じる。したがって、ｗフラグメントの組の質量をモニターすることにより、３' から５' 方向の核酸の配列決定が可能になる。両方の組のフラグメントから生じた配列情報を用い、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の配列を確かめることが可能である。リボ核酸（ＲＮＡ）に関する同様の質量分析情報を得ることは、より困難な作業である。ＲＮＡの衝突誘起解離（ＣＩＤ）は、ＲＮＡではグリコシド結合がより強いため、ＤＮＡの場合より、エネルギー的にはるかに好ましくない。したがって、ＣＩＤ ＭＳを用い、６量体などの小さなＲＮＡが配列決定されてきているが、より大きいＲＮＡの配列決定は、タンデムＭＳを用いた場合、一般的に成功してきていない。
生体分子、例えばタンパク質および核酸の構造決定は、溶液生化学的切断の後、質量分析を用い、試みることが可能である。しかし、これらの方法は、扱いにくく、そして切断産物のＭＳ分析前に、いくつかの生化学的切断および分離段階を行うことが必要であり、常に成功するわけではない。また、生体分子の二次および三次構造に関し提供される情報のレベルは制限される。科学的文献で入手可能な方法は、したがって、生体分子および生体分子標的について、これらが提供する配列および構造的情報に関し、非常に制限される。
本発明の１つの側面は、質量分析を用い、核酸などの生体分子標的の構造を決定するための方法を提供する。核酸、特にＲＮＡの構造は、しばしば確かめるのが困難であるが、本発明の方法を用い、容易に決定される。核酸の構造は、ＭＳn 実験で観察されるフラグメンテーションパターンから決定される。ＲＮＡの指示されるフラグメンテーションは、核酸配列における特定の残基位置でのデオキシヌクレオチドまたは他のヌクレオシド残基の選択的取り込みにより容易にされる。こうしたＲＮＡ／ＤＮＡキメラ核酸のＣＩＤ中、デオキシヌクレオチドまたは他の非天然残基が取り込まれた部位で、切断が容易になる。切断はまた、該生体分子の局部二次および三次構造によっても影響される。したがって、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドから観察される切断パターンは、ミスマッチした塩基対、湾曲領域および他の特徴を含む、核酸の局部構造を明らかにする。
曝露されたデオキシヌクレオチド残基は、ＭＳ実験においてＣＩＤ切断を受けやすいことが知られているため、こうした残基のＲＮＡへの体系的な取り込みは、ＲＮＡの局部構造の体系的な探求を可能にする。本発明の本態様を用いると、ミスマッチした塩基対、ループ、湾曲、およびもつれおよびステム構造などの特徴を含む、核酸の二次および三次構造を決定することが可能である。
ＲＮＡの構造決定は、以下のように、本発明の典型的な方法を用い、達成することが可能である。構造を決定しようとするＲＮＡを、自動化核酸合成装置で合成する。ＲＮＡ合成中、構造を探査しようとする特定の部位で、配列に選択的にデオキシヌクレオチドを取り込む。衝突活性化に敏感にした、このＲＮＡ／ＤＮＡキメラ核酸は、ここで、タンデムＭＳ実験を用いた配列および構造決定に用いられる。ＥＳＩ−ＭＳ後、選択したイオンの捕捉およびそれに続く各イオンのＣＩＤにより、核酸ハイブリッドのどの位置が乱れており（またはより高次の構造に関与しておらず）、そしてしたがって、切断可能であるかどうかに関する情報がもたらされる。試験ＲＮＡの配列へのデオキシヌクレオチド取り込みの体系的パターンは、核酸の特定の領域における、または核酸全体に関する、構造の体系的な質量分析的評価を可能にする。ＤＮＡの代わりに他の修飾核酸残基を用いてもよい。したがって、化学的に修飾された核酸サブユニット、例えばＺ1 −修飾された、例えば２1 −Ｏ−アルキル、塩基修飾された、骨格修飾された残基または他の残基を利用してもよい。こうした残基は、ＲＮＡと共にＤＮＡの評価を可能にするであろう。
本発明はまた、生体分子標的および結合リガンドの間の相互作用の部位および性質の決定のための方法も提供する。これは薬剤発見の過程に重大な価値を持つ情報である。生体分子スクリーニングの現在の方法は、結合リガンドおよび生体分子標的の間の相互作用の性質をも決定する、直接的な手段を提供しない。相互作用の化学量論および結合親和性などの情報は、しばしば、さらなる生化学的アッセイから確かめる必要があり、したがって、薬剤発見を遅らせそして費用を増大させる。生体分子標的、例えば核酸への薬剤またはリガンドの結合が、異なる構造への生体分子のコンホメーションの変化を導く可能性がある場合がしばしばある。これもまた、生体分子の切断からの保護に寄与する可能性がある。
本発明は、結合リガンドが相互作用する生体分子標的上の単数または複数の部位を決定するための簡便な方法を提供する。これは、複合体の切断が生体分子の曝露された部位でのみ起こるように、非共有生体分子・リガンド複合体の衝突活性化解離（ＣＩＤまたはＣＡＤ）を行うことが可能であるという知識に基づき、達成される。したがって、リガンドとの結合に関与する生体分子上に存在する切断部位は、ＣＩＤ中の結合事象由来の増大する構造順位（structual order）のため、保護される。結合リガンド（または薬剤）の存在下および不存在下で、本方法を用い生じるＥＳＩ−ＭＳn スペクトルは、リガンドが誘導する切断部位の保護のため、異なるフラグメンテーションパターンを示すであろう。結合リガンドの存在下および不存在下で生じる質量スペクトルの比較は、したがって、リガンドおよび生体分子の間の相互作用が発生する生体分子配列中の位置を明らかにするであろう。
結合リガンドおよび生体分子標的の間の相互作用の部位を決定するためのこれらの方法は、広く適用可能である。本方法を用い研究することが可能な生体分子標的には、限定されるわけではないが、ペプチド、タンパク質、抗体、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、他の核酸、糖ペプチド、およびオリゴ糖が含まれる。生体分子標的が核酸であることが好ましい。生体分子標的が、特定の位置で配列にデオキシヌクレオチド（または他の残基）を選択的に取り込むように合成された、キメラＲＮＡ／ＤＮＡ核酸であることがさらに好ましい。結合リガンドは、限定されるわけではないが、有機または無機、小ないし巨大分子量の個々の化合物、リガンド、阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト、基質、および生体高分子、例えばペプチドまたはオリゴヌクレオチドの混合物およびコンビナトリアルライブラリーを含む、分子群の１つであってもよい。
結合リガンドとの相互作用が起こるＲＮＡ標的上の部位の決定は、以下のように達成してもよい。生体分子標的として研究しようとするＲＮＡ標的を、自動化合成装置を用い調製し、そして特定の部位で配列にデオキシヌクレオチドを選択的に取り込む。このＲＮＡ／ＤＮＡキメラのアリコットを直接ＥＳＩ−ＭＳに用い、その後、選択的に集積したイオンのＣＩＤ分析を行い、本生体分子標的の天然構造および切断パターンを確かめる。ＲＮＡ／ＤＮＡキメラの第二のアリコットを、該生体分子標的に結合することが知られる薬剤またはリガンドの溶液と混合する。標的およびリガンドは、溶液中で相互作用し、非共有複合体を形成すると予測される。非共有生体分子・リガンド複合体の本溶液を、本発明の方法に供し、非共有相互作用および結合化学量論を保持しながら複合体のイオン化を導く。複合体のＣＩＤはその後、曝露されているフラグメンテーション部位での生体分子配列の切断を導く。そうでなければフラグメンテーションが起こるであろうが、生体分子に対するリガンドの結合に関与する部位は保護され、これらの部位でのまたはその近傍の切断は、ＣＩＤ段階中、妨げられる。本発明の方法に供される際の、結合リガンドの存在下および不存在下での生体分子のフラグメンテーションパターンの相違は、保護され、そしてしたがってリガンド結合に関与する生体分子上の部位を示す。
同様に、試験ＲＮＡの配列へのデオキシヌクレオチド取り込みの体系的なパターンは、本発明を用い、核酸の特定の領域における、または核酸全体に関する、結合部位および相互作用の体系的な質量分析的評価を可能にするであろう。本発明はまた、したがって、生体分子標的、特に核酸を「フットプリント」する新たな方法も提供する。質量分析による本フットプリントは、生体分子標的の構造およびこれらの標的とリガンドの相互作用の部位をマッピングするための、直接的な方法である。
結合リガンドおよび生体分子標的の間の相互作用の性質もまた、本発明の方法を用い、容易に研究される。したがって、生体分子・リガンド非共有複合体の化学量論並びに絶対および相対解離定数は、本発明の方法を用い、容易に確かめられる。非共有生体分子・リガンド複合体の形成に関与するリガンド分子の数および生体分子受容体の数の比は、生化学者および医化学者にとって非常に重要である。同様に、非共有複合体の強度、または生体分子標的に対するリガンドの結合親和性は、リガンドおよび生体分子の間の相補性の度合いの指標を提供するため、重要である。また、この結合親和性の測定は、一連のリガンドに関する構造・活性関係を提供し、そして特定の生体分子標的に関する、より強い結合リガンドの設計を容易にするための、異なるリガンドの階層付けに重要である。
本発明の方法はまた、スクリーニング研究でスクリーニングされる生体分子標的に対するリガンドの結合化学量論および親和性の両方を決定することも可能である。電子スプレーイオン化は、該イオン化が生成するガス性イオンにおいて、生体分子およびその非共有複合体の溶液相構造を、かなりの度合いまで保持することが知られている。したがって、非共有複合体の化学量論の決定は、単純に、リガンド、生体分子標的および非共有生体分子・リガンド複合体の質量に対するデータを必要とする。この決定を達成するのに必要とされるデータは、生体分子標的に対するリガンドの結合の構造および部位を決定するために実行してもよい質量分析実験から、実際に入手可能である。標的生体分子の構造および配列の知識に基づき、生体分子・リガンド複合体のＭＳ分析は、非共有複合体に存在するリガンドおよび標的生体分子の数を明らかにする。質量スペクトルから観察される非共有複合体イオンが標的生体分子およびリガンド各々の１つの分子のｍ／ｚ値の加算から予測されるものに等しいｍ／ｚであれば、非共有複合体は、生体分子およびリガンドの間の１：１の相互作用から形成されるはずである。標的およびリガンドの分子量および電荷に対する単純な数学的計算は、同様に、リガンドおよび生体分子の間のより高次のレベルの相互作用を決定することが可能である。ＦＴＩＣＲ質量分析計の高分解能により、非結合核酸と比較した、複合体の分子質量の正確な測定に基づき、結合リガンドの直接的な同定が可能になる。
本発明に一致した質量分析の使用は、試料から生じるイオンの質量対電荷比だけでなく、こうしたイオンの相対存在量に関する情報も提供することが可能である。したがって、標準化された実験条件下で、非共有生体分子・リガンド複合体イオンの存在量を、生体分子および標準分子、例えば既知の基質または阻害剤の間に形成される非共有複合体のイオン存在量と比較することが可能である。本比較を通じ、標準分子の既知の結合と比較した、生体分子に対するリガンドの結合親和性を確かめることが可能である。さらに、絶対結合親和性もまた、決定することが可能である。
生体分子標的とリガンドの相互作用の性質の決定は、核酸標的と小分子リガンドの結合に関し例証されたように行うことが可能である。試験リガンドに対する結合を研究しようとするキメラＲＮＡ／ＤＮＡ生体分子標的をまず、自動化合成プロトコルを介し調製する。既知の濃度のキメラ核酸のアリコットを、既知の濃度および量の、核酸に結合することが知られる標準化合物、例えばＲＮＡの１６Ｓ Ａ部位に結合することが知られるアミノグリコシド、パロモマイシンで処理する。パロモマイシン・核酸複合体のＥＳＩ−ＭＳの後、ＣＩＤにより、相互作用および複合体に関するコントロールスペクトルがもたらされる。キメラ核酸の第二のアリコットを次に、コントロール実験に用いられたのと同様の量および濃度を用い、試験リガンドで処理する。本発明の方法をこの核酸・リガンド非共有複合体に適用することにより、生体分子・リガンド相互作用の性質を明らかにする試験スペクトルがもたらされる。複合体の２つの構成要素の既知の分子量に基づく非共有核酸・リガンド複合体の分析により、複合体に存在する核酸分子およびリガンドの数の決定が可能になる。さらに、核酸・リガンド複合体イオンの存在量と、例えばパロモマイシン・核酸複合体（または他のいかなる既知の相互作用種でもよいものとの複合体）から生じるイオンの存在量との比較により、標準、パロモマイシンと比較した試験リガンドの結合親和性の簡便でそして直接的な概算が提供される。標準はよく性質決定されているため、その溶液結合親和性は、他の実験または文献供給源から知られるはずである。例えば、パロモマイシンは、試験２７量体ＲＮＡに、〜１μＭ親和性で結合する。ＭＳ実験由来のパロモマイシンと比較した試験リガンドの結合親和性がわかれば、ここで、研究している核酸標的に対する試験リガンドのマイクロモル結合親和性を決定することが可能である。相対結合親和性はまた、単一の試験アッセイにおいて、標的生体分子との混合物として、標準化合物および試験リガンドを同時に試験することにより、測定することも可能である。
本発明の別の目的は、薬剤発見のため、化合物のスクリーニングのための一般的な方法を提供することである。本発明は、限定されるわけではないが、ペプチド、タンパク質、受容体、抗体、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、核酸、オリゴ糖、炭水化物、および糖ペプチドを含む、非常に多様な生体分子標的のスクリーニングのための方法を提供する。本発明の方法を用いることにより、スクリーニングすることが可能な分子には、限定されるわけではないが、有機または無機、小ないし巨大分子量の個々の化合物、リガンド、阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト、基質、および生体高分子、例えばペプチドまたはオリゴヌクレオチドの混合物およびコンビナトリアルライブラリーが含まれる。
多くの化合物のコレクションおよび混合物をスクリーニングする際の主な問題は、生物学的に適当な活性は多くの異なる場合で立証されてきているため、該活性を見出すことでなく、こうしたスクリーニング、およびしばしば、活性であることが見出される化合物の混合物およびプールから活性構成要素を同定することにある。高処理薬剤発見において当業者に実施されてきている１つの解決法は、混合物の反復分割である。分割は、本質的に、目的の標的に対するスクリーニングにおいて活性があることが見出されたコンビナトリアルプールまたは混合物の再合成を伴う。再合成は、より小さいプールまたは混合物の組、あるいは単一の化合物の組の生成を生じる可能性がある。再スクリーニングおよび反復分割は、ペアレント混合物のスクリーニングにおいて観察された活性に責任がある単一の化合物が単離されるまで行われる。
しかし、分析技術は、コンビナトリアル努力において生成される混合物種を適切に処理する能力が制限される。コンビナトリアル混合物またはプールのメンバーの類似性、およびこうした混合物の複雑さは、混合物が単一の化合物に分割される、または少なくとも少数の構成要素のみのプールに分割されるまで、効果的な分析評価を妨げる。再合成、再スクリーニングおよび分析を伴う、分割の本過程は、非常に扱いにくくそして時間がかかる一方、また、非常に費用がかかる。迅速に活性混合物を明らかにし、そしてこうした混合物の活性構成要素を同定することにより、これらの問題を軽減する一般的な方法は、明らかに、薬剤発見過程における時間およびお金を節約するため、必要である。
本発明は、生体分子標的に対するコンビナトリアル混合物の活性を迅速に評価し、そしてまた、こうした混合物の活性構成要素の構造を同定する方法に対する必要性を解決する。これは、以下のように、核酸標的に対する結合に関しコンビナトリアル混合物をスクリーニングすることにより、例証される。既知の配列のキメラＲＮＡ／ＤＮＡ標的を、生物学的妥当性に基づくスクリーニング標的として選択する。このキメラ核酸標的を、自動化合成を介し調製する。核酸のアリコットを１０μＭの濃度で用い、そして例えば１５０ｎＭの濃度でパロモマイシンアセテートで処理する。混合物の試料を、本発明の方法により分析し、パロモマイシン・核酸複合体イオンの観察により、パロモマイシンの結合を立証する。次に、本混合物のアリコットを、混合物の各構成要素の最終濃度が〜１５０ｎＭになるように、化合物のコンビナトリアル混合物のＤＭＳＯ溶液で処理する。この試料をその後、ＥＳＩ−ＭＳに供し、そしてコンビナトリアルライブラリーの構成要素で形成される新規核酸・リガンド非共有複合体に対応する、新規シグナルの出現に関し、質量スペクトルをモニターする。
これらの新規複合体の相対解離定数は、これらの新規イオンの存在量を、標的に関する結合親和性が先験的に知られているパロモマイシン・核酸複合体イオンの存在量と比較することにより、決定される。観察される新規複合体イオンのアルゴリズム的分割は、標的およびコンビナトリアルライブラリーの構成要素の質量を考慮しつつ、観察される非共有複合体に存在する結合リガンドの分子量を提供する。あるいは、結合リガンドの同一性もまた、最初に、三重四重極イオントラップまたはイオンサイクロトロン共鳴装置（ＩＣＲ）を用い、新たに観察された複合体イオンを単離した後、質量分析フラグメント分析により慣用的に同定することにより、決定することが可能である。例えば、単離の際、非共有複合体イオンを「加熱」し、または構成要素リガンドおよび生体分子イオンに解離させる。このＭＳ／ＭＳ実験はその後、リガンドのフラグメンテーションを研究するため調整してもよい。本情報は、結合リガンドの構造の直接的な証拠を提供する。本発明の本方法は、したがって、核酸標的に結合する化合物のコンビナトリアルまたは他の混合物のメンバーの同一性および相対結合親和性両方を提供する。
本発明は、化合物のコンビナトリアルまたは他の混合物の結合構成要素の分子量並びに絶対および相対結合親和性を決定するための方法を提供するだけでなく、生体分子標的上の結合部位に関する有益な情報も提供する。こうした情報は、特定の生物学的活性を有する化合物の同定を可能にし、そして有用な薬剤、獣医学的薬剤、農業的化学薬品、産業的化学薬品、診断薬および他の有用な化合物を生じさせる。これはまた、三重四重極イオントラップまたはイオンサイクロトロン共鳴装置（ＩＣＲ）を用い、新たに観察された複合体イオンを単離することにより、同一の質量分析的方法の一部として達成することも可能である。例えば、単離の際、非共有複合体イオンを衝突活性化し、曝露されるデオキシヌクレオチド部位でキメラ核酸標的を切断する。このＭＳ／ＭＳ法をその後、生体分子標的のフラグメンテーションを研究するため調整してもよい。
非共有複合体の核酸構成要素に関しこうして得られた切断およびフラグメントパターンを、天然キメラ核酸のみに関し得られたパターンと比較することにより、リガンドの結合により保護される核酸上の位置が明らかになる。これは、核酸上のリガンドに対する結合部位を示す。切断パターンを、標準・核酸複合体イオンのＣＩＤから観察されるものと比較することにより、新規リガンドおよび標準の結合部位の間の相関関係が提供される。本方式において、核酸標的に結合するリガンドは、標準が結合するのと同一の、核酸上の結合部位に関し競合するように、または核酸上の完全に異なるそして新規の部位で結合するように、同定される可能性がある。これらの種類の観察はどちらも、薬剤発見の観点から有益である。
本発明の方法を用い、本明細書に記載されるいかなる生体分子上の金属イオン結合部位を同定してもよい。好ましくは、金属イオン結合部位は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属に結合する。より好ましくは、金属イオンは、Ｎａ+ 、Ｍｇ++、およびＭｎ++である。
薬剤発見は、生体分子標的のいくつかの異なる種類のいかなる１つを用いても、特定の標的に対する結合活性に関し、多くの化合物のコンビナトリアルライブラリーおよび混合物を迅速にスクリーニングすることが可能な本発明の使用を伴う。
スクリーニングに使用される化合物のコンビナトリアルライブラリーおよび混合物は、基本的な組成が同様であるが、構造が異なるため、質量が同様である、あるいは少なくとも同位体性または鏡像異性体性である構成要素を含む可能性がある。こうした場合、同一の分子質量の多数の構成要素が存在する可能性があるため、結合リガンドの分子量の単純なアルゴリズム計算は、リガンドの同一性を提供するのに不充分であろう。本発明の方法はまた、リガンド同定のこうした問題に取り組みそして解決することが可能である。非共有複合体からリガンドイオンを選択的にイオン集積した後、結合リガンドをさらにフラグメント化するのにＭＳ／ＭＳ実験を使用することは、結合リガンドの構造的な詳細を提供する単純な技術である。本発明の方法により提供される、この質量および構造の情報は、多くの化合物のコンビナトリアルライブラリーおよび混合物のスクリーニングに関連した質量重複問題の大多数を解決すると期待される。
好ましい態様において、本発明はまた、化合物のコンビナトリアルライブラリーおよび混合物またはコレクションに対し、多数の生体分子標的を同時にスクリーニングするための方法も提供する。これは、こうした結合に関する化合物のスクリーニングにおいて、現在の最新技術に対する本発明の重大な利点である。多数の標的の同時および迅速なスクリーニングを可能にする一方、同時に標的および結合リガンドに関する構造的な詳細を提供する先行技術はないと考えられる。多数の生体分子標的の迅速なおよび同時スクリーニングのための方法を提供するのに加え、本発明はまた、標的および結合リガンド両方の構造および結合の性質を決定するための方法も提供する。
上述のように、本発明の質量分析法は、溶液中で標的生体分子に結合するコンビナトリアル混合物の構成要素をスクリーニングし、そして同定するための直接的な手段を提供する。効率を高めるため、化合物のコンビナトリアルライブラリーまたは混合物に対する結合活性に関し、多数の標的を同時にスクリーニングすることにより、スクリーニング過程を多重にすることが好ましい。本戦略は、通常、こうしたスクリーニングアッセイ中形成される可能性がある、すべての可能な非共有生体分子・リガンド複合体から生じるであろう、荷電状態の分布および望ましくない質量／電荷重複により制限される。質量スペクトルの重複ピークのこの問題は、スクリーニングされる生体分子標的が同様の配列、組成、または分子量である場合、さらに悪化する。こうした場合、研究される生体分子のプールに存在する、そしてスクリーニングされるコンビナトリアルライブラリーに存在する可能性がある、広範囲に渡る質量重複のため、迅速でそして単純な作業で、生体分子・リガンド複合体の組成を確かめることは可能ではないであろう。
本発明の方法は、特別な質量修飾分子量タグの使用を通じ、生体分子標的質量重複の問題を軽減する。これらの質量修飾タグは、典型的には、限定されるわけではないが、アルキルおよびテトラアルキルアンモニウム基などの非荷電または陽性荷電基、および限定されるわけではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレン、ポリスチレン、セルロース、セファデックス、デキストラン類、シクロデキストリン類、ペプチド、およびポリアクリルアミド類などのポリマーである。これらの質量修飾タグは、その分子量寄与およびイオン的な性質に基づき選択してもよい。これらの質量修飾タグは、限定されるわけではないが、核酸標的の２' −Ｏ、３' −末端、５' −末端または糖・ホスフェート骨格沿いを含む、１つまたはそれ以上の部位で、生体高分子標的に結合させてもよい。合成オリゴヌクレオチドの５' 末端への質量修飾タグの付加は、慣用的なホスホロアミダイト化学反応、他の慣用的な化学反応を用い、あるいは生化学的または酵素的手段により達成してもよい。核酸のこうした質量修飾は、慣用的、手動または自動化技術を用い、行ってもよい。あるいは、質量修飾タグの付加は、核酸の固相合成のための、適切に修飾されたポリマーまたはＣＰＧ支持体の使用により、３' −末端で行ってもよい。３' 末端での質量修飾はまた、生化学的または酵素的手段により行ってもよい。質量修飾タグを核酸のヌクレオチド内結合に結合させることもまた可能である。これは、適切に修飾されたホスホロアミダイト、または他のヌクレオシド構築ブロックを、核酸合成中に用いることを介し、あるいはヌクレオチド内結合の合成後修飾を介し、行ってもよい。さらに、核酸標的への質量修飾タグの結合はまた、核酸上のいかなる官能部位での二官能性リンカーの使用を介し、達成してもよい。同様に、生体分子標的の他の種類を用い作業する場合、これらの質量修飾タグは、同様に、生体分子上の１つまたはそれ以上の位置に取り込ませてもよい。明白になるであろうように、標的またはリガンドいずれかに同位体性質量標識を含むこともまた、有用である可能性がある。
このように、同様の核酸および他の生物学的標的は、本発明の方法による、迅速な質量分析的スクリーニングのため、示差的に標識してもよい。非共有複合体が、小分子量コンビナトリアルライブラリーの混合物を用いた多重核酸標的のこの多重スクリーニングで観察される場合、構成要素リガンドおよび生体分子は、慣用的な質量分析装置、例えば四重極、イオントラップ、ＩＣＲ、磁気セクター、またはＴＯＦおよびその後、ＭＳ／ＭＳを用い、容易に同定される。これは、質量修飾タグが、同様の電荷で、質量スペクトルが異なる、各標的生体分子・リガンド複合体イオンから生じるシグナルのｍ／ｚ（質量対電荷比）を作成し、そしてこれがきれいに分離したイオンピークを生じるからである。質量重複およびピーク重複はどちらも、質量修飾タグの使用により避けられる。
本発明はまた、ＲＮＡおよび他の核酸上の分子相互作用部位と相互作用するリガンドの同定のための他の技術の組み合わせにおいても非常に有用である。分子相互作用部位はＲＮＡに付随し、そしてこうしたＲＮＡが機能するのに非常に重要であると考えられる。分子相互作用部位のヌクレオチド配列は、分類学的に多様な種の間であっても、非常に保存されている。さらに、こうした分子相互作用部位は、リガンド結合の機会を提供する特定の構造を有する。どのリガンドがこうした部位に結合するか確かめると共に、各リガンドの結合に関する相対親和性および特異性を決定することにより、薬剤発見、治療薬、農業化学、産業化学およびその他のもののリード化合物が提供される。
本質量分析的技術、特にＭＡＳＳ技術並びに同様の分析上の強靭さ並びに力を持つものは、分子相互作用部位に対するリガンド結合を決定するプログラムなど、薬剤並びに他の発見および同定プログラムと協同するのに、理想的に適している。ＲＮＡおよび他の核酸における分子相互作用部位の同定およびこうした分子相互作用部位に結合する可能性がある分子リガンドの階層の決定は、本技術を通じ、評価することが可能である。したがって、本発明の好ましい態様に一致し、ＲＮＡの分子相互作用部位に結合する、期待されるまたは計算される可能性と一致して段階付けられる階層のリガンドが実際に合成される。こうした合成は、好ましくは、段階付けられる階層のリガンドに付随して提供される一連の指示から、好ましくは、自動化またはロボット化方式で達成される。本質量分析的方法は、複数の化合物およびＲＮＡとのそれらの複合体を同時に評価することが可能であるため、化合物は、ライブラリーまたは混合物で調製されてもよい。
リガンドを、好ましくはライブラリー形式で合成した後、目的の分子相互作用部位を有するＲＮＡと接触させる。複合体化または結合（慣用的には、非共有結合）を起こさせる。複合体化ＲＮＡ・リガンドライブラリーをその後、質量分析により分析する。分析の主な目的は、好ましくは、どのリガンドがＲＮＡ分子相互作用部位に結合するか、そしてその中で、どれが特異性および親和性に関し、より高く階層付けられるか決定することである。したがって、化合物の混合物またはライブラリーから、どれが特定の分子相互作用部位と最も相互作用する可能性があるか同定し、該化合物を調節することが可能である。こうした化合物は、それ自体を用いてもよく、またはより可能性が高いのは、薬剤、農業的化学薬品、環境的化学薬品、産業および食品化学薬品およびその他に修飾するためのリード化合物として用いることである。
上述のように、分子相互作用部位を有するＲＮＡを、すでに該相互作用部位と相互作用する可能性があると予測されるあるいは計算されている化合物のライブラリーで試験することが非常に望ましい。標的ＲＮＡの非常に強力な調節剤を見出す可能性を最大にするため、こうした分子が段階付けられた階層に属することが好ましい。
ＲＮＡおよび他の生物学的分子の分子相互作用部位と相互作用する可能性がある化合物を同定するいくつかの方法があるが、好ましい方法論は、本明細書と同じ日付で提出された米国特許出願に記載されており、そして本発明の譲受人に譲渡されている。これらの出願は、米国特許出願第（未知）を持ち、そして弁理士事件整理番号ＩＢＩＳ−０００２、ＩＢＩＳ−０００３、ＩＢＩＳ−０００４、ＩＢＩＳ−０００６およびＩＢＩＳ−０００７を割り当てられている。前述の出願はすべて、全体として、本明細書に援用される。
共同で所有される前述の発明の技術と組み合わせると特に有用な１つの質量分析的方法は、ＲＮＡ標的に対するリガンドの特異性および親和性の決定を提供する。ＭＡＳＳ（多標的親和性／特異性スクリーニング）技術は、核酸、特にＲＮＡの分子相互作用部位に対するリガンドの特異性および親和性を分析するため、高処理スクリーニング法を提供することが可能である。ＭＡＳＳは高性能電子スプレーイオン化フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（ＥＳＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ）を使用し、ａ）コンビナトリアルライブラリーから生じる親和性選択リガンドの正確な化学組成を決定し、ｂ）標的と複合体化しているリガンドの相対解離定数（Ｋｄ）を決定し、そしてｃ）リガンド結合の位置を決定する。この情報は、１５分未満の単一のアッセイで、各標的またはライブラリーの組から集めることが可能である。この計画は、ＥＳＩ−ＦＴＩＣＲの組み合わせの２つの独自の側面から利益を得る。電子スプレーイオン化法の「穏やかな」性質により、特定の非共有複合体をイオン化し、そして損なわれることなくガス相へ移送し、ここで引き続き質量分析による性質決定に供しやすくすることを可能にする。ＦＴＩＣＲプラットホームにより提供される高解像力は、ＦＴＩＣＲに固有の質量の高い正確さと組み合わせると、単数または複数の標的の単数または複数の分子相互作用部位と複合体化しているリガンドの明白な同定を提供する、複合体混合物の性質決定を容易にする。
結合部位情報は、遊離および複合体化標的のガス相フラグメンテーションパターンおよび絶対結合親和性を比較することにより得ることが可能であるが、相対結合定数は、内部標準として、既知のＫｄを持つ複合体を用いた、複合体の相対存在量から得られる。標的ＲＮＡの分子相互作用部位に対するリガンドの特異性および親和性の知識があれば、ＲＮＡの調節のための望ましいリードまたは最終的な化合物を決定することが可能である。治療薬、農業的化学薬品、産業的化学薬品およびこうしたＲＮＡの調節から利益を得る他の製品がこの結果に付随する。
質量７００−７５０の分子のコンビナトリアルライブラリーの、同一の分子量を持つが、異なる配列を有する、２つの核酸標的に対する同時スクリーニングが、質量修飾タグの使用により、例示される。研究される核酸標的がどちらも、質量８９２７の２７量体ＲＮＡであれば、質量７００−７５０の分子のライブラリーをスクリーニングすることは、２つの核酸およびライブラリーの混合物の質量スペクトルにおいて、非共有複合体イオンの当惑するような混乱をもたらす可能性がある。しかし、例えば、標的の５' 末端に結合する質量３５７５のＰＥＧ鎖の使用により、２つの標的の１つが質量修飾されていれば、質量スペクトルは、非常に単純化されるであろう。２７量体は、電子スプレーイオン化後、（Ｍ−６Ｈ）6-、（Ｍ−５Ｈ）5-、および（Ｍ−４Ｈ）4-荷電状態に関し、質量／電荷値１４８６．８、１７８４．４、および２２３０．８の、多荷電イオンシグナルを生じるであろうことが知られている。質量７００−７５０の小分子への結合に際し、未修飾ＲＮＡ・リガンド複合体は、１６０３．２−１６１１．６、１９２４．４−１９３４．４、および２４０５．８−２４１８．３のｍ／ｚ範囲に発生すると期待される。第二の核酸標的がいかなる方法でも修飾されていなければ、その複合体から生じるシグナルは、同じ領域に発生しているであろう。しかし、質量３５７５のＰＥＧ鎖を持つ質量修飾ＲＮＡを使用することにより、２１９９−２２０７．４、２６３９−２６４９および３２９９−３３１１のｍ／ｚ範囲に発生する対応する質量修飾ＲＮＡ・リガンド複合体が観察される。したがって、第二の質量修飾核酸由来のすべてのシグナルは、第一のＲＮＡのものとはきれいに分離されるであろう。上に論じられてきたように、これらの非共有複合体イオンは、例えば、三重、四重極、イオントラップまたはＩＣＲ技術により選択してもよく、そしてＭＳ／ＭＳによりさらに研究し、リガンド・ＲＮＡ相互作用の部位、およびこれらの相互作用の性質の詳細な理解をもたらしてもよい。
さらなる態様において、本発明の方法は、リガンドおよび生体分子標的の間の結合相互作用の特異性の決定に適用可能である。多数の生体分子標的を１つまたはそれ以上の化合物を用い、同時にスクリーニングすることにより、リガンドが１つの標的生体分子のみに特異的に結合するのか、または標的で観察される結合が、コントロール生体分子でも再現され、そしてしたがって非特異的なのかを確かめることが可能である。これは、生体分子標的に対する結合に関し、多くの化合物のライブラリーおよびコレクションをスクリーニングする際、行うべき重要な区別である。目的の生体分子標的に選択的または特異的なリガンドを、非特異的でそしていかなる標的にも結合するものから、迅速に区別することが望ましい。薬剤発見の観点からは、望ましくない生物学的活性が、関連しない生体分子に対する分子の無差別、非特異的結合から生じることが最もしばしばある。本発明は、リガンドおよび一団の標的の間の相互作用の特異性を評価するための、有益なそして直接的な方法を提供する。
多数の生体分子標的を同時にスクリーニングするための質量修飾タグの使用は、リガンドの結合特異性の決定にも適用できる。質量修飾タグは、具体的な生体分子標的に対する個々の化合物のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするためのコントロールパネルとして役立ついくつかの生体分子標的を区別するのに使用することができる。本発明の質量分析計による方法を用いて多数の生体分子標的を同時にスクリーニングする際、各標的及びそれと結合性のリガンドとの複合体から生ずるそれらイオンの良好な分離が確実に行われることが必要である。このピークの重なりは、検討される異なる生体分子標的上への異なる質量修飾タグの手軽な導入により容易に排除される。その生体分子標的及びそのコントロールパネルの混合物を、評価されるリガンドと混ぜる。次いで、この溶液をＥＳＩ−ＭＳによりイオン化すると、観測される非共有結合形複合体イオンが、そのリガンドの、その混合物中に存在するいくつかの生体分子標的のうちの具体的な標的への結合から生じたものとして直接同定され得る。こうすると、望まれる標的についての結合のコントロール生体分子に対する特異性又は選択性の質的提示を得ることができる。また、この選択性は、既知の結合親和性の適切な標準の使用と、そのリガンド−生体分子複合体イオン存在量に対する標準−生体分子存在量の存在量の比較とを通じて、定量することができる。更に、また、異なる生体分子とのそのリガンドの特異的又は非特異的相互作用の性質についての詳細は、これまでに説明したように、イオン選択及びその後のＭＳ／ＭＳ実験に従って得ることができる。
同様に、本発明の方法を用いて、２又はそれより多い生体分子標的へのリガンドの結合比（proportional binding）を決定することも可能である。従って、異なる生体分子標的への適切な質量修飾タグの使用により、そのリガンドの差のある結合性により経て形成される異なる非共有結合複合体を、質量分析計で容易に区別することが可能である。その結合性の定量は、これらのイオンの存在量を測定することにより可能である。これらのイオンの相対的な存在量を比較することは、そのリガンドの異なる生体分子標的への結合比を決定するための手段を提供する。
本発明の方法の更に別の用途は、異なる起源の生体分子標的へのリガンドの有差結合性を決定することである。小さい分子リガンドのＲＮＡ標的への結合を検討する場合、２つの異なるＲＮＡ標的への結合から生ずる非共有結合形リガンド−ＲＮＡ複合体の間を識別することは、たとえ両方を同じアッセイにおいて混合物として同時にスクリーニングしたとしても簡単である。更に、他のＲＮＡに対する一のＲＮＡについてのそのリガンドの特異性及び選択性を決定すること、及び各ＲＮＡ標的への相対的結合親和性を決定することも可能である。
本発明の方法は、ペプチド、タンパク質、受容体、抗体、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、核酸、修飾されたオリゴヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）、オリゴ糖、炭水化物、及び糖ペプチドを含むがこれらに限定されない多種多様な生体分子標的の検討に適用できる。更に、これらの生体分子標的は、合成されたか又は天然源から単離されたものであってもよい。天然起源の生体分子標的には、微生物、植物、動物、ウイルス、又は細胞、細胞抽出物、体液、組織、及び臓器のような（これらに限定されるない）ヒト材料から得られたものが含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明の方法を用いることによりスクリーニングすることができる分子には、有機又は無機の小さい分子量から大きい分子量の個々の化合物、及び、リガンド、阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト、基質、及び、ペプチド又はオリゴヌクレオチドのような生体ポリマーのコンビナトリアル混合物又はライブラリーが含まれるが、これらに限定されるものではない。
コンビナトリアル混合物には、諸化合物のコレクション及び諸化合物のライブラリーが含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの混合物は、混合物のコンビナトリアル合成を経るか又は個々の化合物の混合を経て生じ得る。諸化合物のコレクションには、個々の化合物のセット又は混合物のセット又は化合物のプールが含まれるが、これらに限定されるものではない。これらのコンビナトリアルライブラリーは、合成からか、又は例えば、微生物、植物、海産物、ウイルス及び動物材料のような天然源から得ることができる。コンビナトリアルライブラリーには、少なくとも約２０の化合物及び数千ほどの個々の化合物及び潜在的にはいっそう多くのものが含まれる。コンビナトリアルライブラリーが諸化合物の混合物である場合、これらの混合物は、典型的には２０〜５０００、好ましくは、５０〜１０００、より好ましくは５０〜１００の化合物を含有する。１００〜５００の組合せは有用であり、５００〜１０００の個々の種を有する混合物も有用である。典型的に、コンビナトリアルライブラリーのメンバーは約５０００Ｄａ未満の分子量を有する。
本発明の方法において使用することができる質量分析法の技術には、本明細書中に説明されるか又はその後開発される技術及びシステムの全てが含まれる。前述のもの及びＬＣ／ＭＳの全ての組合せを含むタンデム技術も有用である。本発明の方法において使用される質量分析計は、一重四重極、三重四重極、磁気セクター、四重極イオントラップ、飛行時間装置、及びＦＴＩＣＲであり得る。質量分析法への将来の変更は、本発明にも有用であり得る改良された技術を生じさせることが期待される。
本発明の別の態様において、アミノグリコシドの混合物の結合は、同一の長さ及び類似の（又は同一の）分子量の多数のＲＮＡ標的に対して同時に測定されることができる。それらＲＮＡ標的のうちの一への中性質量タグの添加は、小さい分子を有する複合体を明瞭に同定することができるより高い質量／電荷比にそれらをシフトさせる。適切に配置された中性質量タグは、ＲＮＡ−リガンド結合性を変化させない。好ましくは、この方法は、原核性及び真核性の小さいサブユニットｒＲＮＡの解読領域に相当するモデルＲＮＡと、例えば、５のアミノグリコシドのような化合物の混合物とを用いて証明される。以下に示す実施例では、複合体は、アミノグリコシドライブラリー及び原核性ｒＲＮＡモデルの間に観察されるが、質量タグが付された真核性ｒＲＮＡモデルに結合するアミノグリコシドは全く観察されない。この有差結合データは、ネオマイシンクラスのアミノグリコシドの侵入及び結合を妨げる原核性Ａ部位と比べて異なるコンフォメーションを有する真核性Ａ部位のｒＲＮＡと一致する。中性質量タグが付された高分子標的の質量分析は、小さい分子のコレクションに対する多数の標的の相互作用を並行して評価することができる新規な高処理量スクリーニングパラダイムに相当する。
本明細書中で使用される好ましいモデル系は、原核性及び真核性リボソームＲＮＡの解読部位についての〜２８ｎＭから〜１．５ｍＭにわたる結合親和性を有する、５の２−デオキシストレプタミンアミノグリコシド系抗生物質から構成されるライブラリーを含む。図２４は、１６Ｓ及び１８ＳｒＲＮＡ解読部位の２７−ヌクレオチドモデルについての二次構造を例示する。これら構築物は、非正準的（non-canonical ）Ｕ−Ｕを含有する７塩基対ステム構造と、ＵＵＣＧテトラループにより閉鎖された湾曲アデノシン残基に隣接したプリン−アデノシンミスマッチ塩基対とからなる。１６Ｓ及びパロモマイシンの間の複合体のＮＭＲ検討は、ＲＮＡはアミノグリコシドとの主要な水素結合、静電接触、及び積み重ね接触（stacking contact）をつくること（Fourmyら，Science ，1996，274 ，1367-1371 ）と、パロモマイシンはＡ−Ａ塩基対及び単一の湾曲アデニンにより造られるポケット内のモデルＡ部位ＲＮＡの主要な溝（major groove）中に結合することとを示す。その２のＲＮＡモデルについての質量はわずか１５．０１１Ｄａだけ異なり、そしてこれらの構築物の（Ｍ−５Ｈ+ ）5-種はわずか３ｍ／ｚユニットだけ異なる。高分解能のＦＴＩＣＲ質量分析計はこれら種を容易に分解できるが、両方のＲＮＡを含有する溶液からの質量スペクトルは、フリーのＲＮＡイオンとそれらのナトリウム及びカリウム付加種とからのシグナルの間の重なりにより複雑になる。
ＲＮＡ１６Ｓ及び１８Ｓからのシグナルの間の重なりのため連合した質量スペクトル中のシグナルの間の分離を増加させる方法を、本明細書中に説明されている。それらの５' 末端に結合した付加的な未荷電官能基で修飾されたＲＮＡ標的を合成した。そのような合成修飾を本明細書中では中性質量タグ（neutral mass tag）と言う。質量タグが付された高分子の質量のシフト及び相伴うｍ／ｚは、そのタグが付されたＲＮＡにより生ずるシグナルのファミリーを質量スペクトルの分解領域へと移動させる。
タグが付されていない１６Ｓ及びタグが付されていない１８Ｓを小さい分子のコンビナトリアルライブラリーに対して同時にスクリーニングする際、１６Ｓより５１５．０１１Ｄａ高く複合体が観察されるなら、その複合体が、１６Ｓ標的に複合化された５１５．０１１Ｄａの重さであるリガンドに相当するか又は１８Ｓに複合化された５００．０００ダルトンの重さであるリガンドに相当するかを（タンデムＭＳ法なしで）直接決定することは可能でないだろう。そのうえ、プラスに荷電されたリガンドはＲＮＡオリゴマーとの非特異的相互作用を有し得ることから、２又はそれより多いＲＮＡ標的（例えば、構造設定された標的配列及び構造設定されていないコントロール配列）に対して単一のＥＳＩ−ＭＳ実験において同時にスクリーニングすることにより、特異的及び非特異的結合についてのライブラリーをアッセイすることは多くの場合望ましい。この多様な利点は、ライブラリーが類似な又は同一の質量の多数のＲＮＡに対してアッセイされるべきＲＮＡ薬物発見分野において更に活用することができる。５のＲＮＡ標的を２００の成分のコンビナトリアルライブラリーに対してスクリーニングする単一の分析は、単一の質量スペクトルの取得からの１０００のＲＮＡ−リガンド相互作用の直接評価を容易にする。
密接に関連している高分子のｍ／ｚ範囲をシフトさせる能力は、これまで説明したように極めて望ましいが、質量タグが、標的の重要な物理的性質又はリガンド結合特性を変化させないことが望ましい。好ましくは、ＲＮＡオリゴマーの５' −末端にホスホジエステル連結により結合した１８原子質量タグ（Ｃ12Ｈ25Ｏ9 ）を使用することができる。この質量タグは、オリゴヌクレオチド溶解性、イオン化効率、又はＵＶ吸収に対し認め得る影響を及ぼさず、ＲＮＡ−リガンド結合を変化させない。この後者の属性は、パロモマイシンとの競合結合条件下での微生物の解読部位のタグが付されていない及びタグが付されたＲＮＡモデルについてのフリー：結合されたＲＮＡの保存比（conserved ratio ）を例示する、図２５におけるデータにより明示される。
アミノグリコシド系抗生物質は、本質的な原核性ＲＮＡ−タンパク質及びＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用を崩壊させることにより微生物の増殖を阻害する。In vivo において、パロモマイシンは、（１６ＳＡ部位に高い親和性で結合することにより）原核生物における本質的なＲＮＡ相互作用を変化させるが、（１８ＳＡ部位についてのパロモマイシンの低い親和性のため）真核性ＲＮＡ複合体の機能を認め得るほどには崩壊させないので、治療効果を実現する。１６Ｓ及び１８ＳＡ部位に類似の親和性で結合する化合物は、微生物の増殖を阻害する可能性があるだろうが、真核細胞における有害性の細胞毒性効果も有し、適する治療薬を作らないであろう。従って、１６Ｓ／１８ＳモデルＲＮＡ系は、新世代抗生物質についての興味深い標的としてだけではなく、ＲＮＡ−リガンド親和性アッセイに基づく本発明の質量分析法についての十分に特性決定されたコントロールとしても役立ち得る。
図２６に示すＥＳＩ−ＦＴＩＣＲ質量スペクトルが、５のアミノグリコシドの等モル混合物の存在下においてタグが付されていない１６Ｓ及びタグが付された１８Ｓの１０ｍＭ混合物から得られた。他の生体分子をそれらアミノグリコシドの代わりに使用してもよいことは理解されるべきである。それらアミノグリコシドは、２−デオキシストレプタミンの２クラス、つまり各々５００ｎＭで存在する４，５−２置換（パロモマイシン、及びリビドマイシン）、及び４，６−２置換（トブラマイシン、シソマイシン、及びベカナマイシン）から選択された。個々のアミノグリコシドの１：１結合に相当する複合体が、実質的に異なるそれぞれの複合体の存在量から見積もられた見かけの親和性で、１６Ｓとそのアミノグリコシド混合物の全てのメンバーとの間に観察された。パロモマイシン（ｍ／ｚ１９２５．５７２）及びリビドマイシン（ｍ／ｚ１９５４．７９０）との複合体からのシグナル強度は、それぞれ、１１０ｎＭ及び２８ｎＭのＭＳ測定された解離定数と一致する。トブラマイシン（ｍ／ｚ１８９５．９６０）、ベカナマイシン（ｍ／ｚ１８９９．１７１）、及びシソマイシン（ｍ／ｚ１８９１．９７２）との１６Ｓ複合体の強度は減少され、〜１．５ｍＭの溶液解離定数と一致した。Wangら，Biochemistry，1997，36，768-779 。これゆえ、これらのアッセイ条件下で、ＭＳ観察されたイオン存在量は溶液解離定数を反映する。図２６における挿入図は、各複合体についての同位体エンベロープ（envelope）を分解する能力を証明し、ホモ同位体種から質量差を計算することを可能とするので、ＲＮＡ標的及びＲＮＡ−リガンド複合体の間のｍ／ｚにおける差を測定することは、そのリガンドの正確な質量決定を可能とする。そのスペクトルは、フリーなＲＮＡの（Ｍ−５Ｈ+ ）5-及び（Ｍ−４Ｈ+ ）4-荷電状態の多数の同位体ピークを、複合体が観察されるｍ／ｚ範囲を一括する内部質量標準として用いて、較正される。図２６における複合体について得られる平均質量測定誤差は、ｍ／ｚ差が１６Ｓの最も豊富な（４13Ｃ）同位体ピークと各複合体の間に測定されるとき、２．１ｐｐｍである。この後較正スキームは容易に自動化され、多数の標的に対して親和性選択されたリガンドの高処理量様式における迅速な高精度質量測定を可能にする。
１６Ｓについてのパロモマイシンの親和性に比較して１６Ｓについてのリビドマイシンの高められた親和性は興味深い。リビドマイシンは１６Ｓリボソームサブユニットに結合すると考えられるが、一方、相互作用の正確な部位は確立されていない。リビドマイシンは、パロモマイシンとの２の有意な構造上の違いを有する。第１に、付加的なマンノピラノシル環は、ＲＮＡとの新しい高分子の接触を生ずることができた。しかし、パロモマイシン環IVの方向は、１６Ｓとの複合体についてのＮＭＲ由来の構造において不規則である。加えて、Ａ１４９２と接触する環Ｉ上のヒドロキシル基は見つからない。１６Ｓ−リビドマイシン複合体の相対的に高い存在量は、リビドマイシンが１６ＳＡ部位においてか又はその近くに結合し、その結合親和性をほぼ４倍に高める付加的な接触を生ずることを示唆している。おそらく、図２６中のスペクトルの最も印象的な特徴は、１８Ｓと、パロモマイシン又はリビドマイシンとの間の複合体がないことである。この結果は、４，５−２置換２−ＤＯＳクラスのアミノグリコシドと、真核性リボソーム解読部位の保存された構造との間に形状及び静電的相補性が乏しいに違いないことを示唆している。
こうして、本発明に従って、同様な（又は同一の）分子質量を有するＲＮＡ標的を小さい中性分子で標識して、それら標的とリガンドの間の結合を質量分析計を用いて測定することができる。多数の標的をリガンド混合物に対して同時にスクリーニングすることにより、そのアッセイの情報内容は高められ、必要とされる分析の数において劇的な減少をもたらす。多数の基質／リガンド混合物の複雑さが増すと質量分析器に高い要求がかかるが、本明細書中に記載した方法は、同一の溶液条件及びリガンド濃度下での非常に多くの標的の同時分析を容易にし、更にそのスクリーニング戦略の高処理性を高めて、密接に関連する標的についての結合親和性の直接比較を可能とする。この“合理的" 標的デザインの概念は、アミノ酸配列の異なるタンパク質の検討にも適用可能な筈である。
実施例１：１６ＳｒＲＮＡ Ａ部位に相当する２７量体ＲＮＡの構造決定
配列５' −ＧＧＣ−ＧＵＣ−ＡＣＡ−ＣＣＵ−ＵＣＧ−ＧＧＵ−ＧＡＡ−ＧＵＣ−ＧＣＣ−３' （ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１）の１６ＳｒＲＮＡ Ａ部位に相当する２７量体ＲＮＡの構造を検討するために、３つのデオキシアデノシン（ｄＡ）残基を位置７、２０、及び２１に取り込むキメラＲＮＡ／ＤＮＡ分子を、標準的な核酸合成プロトコルを用いて自動合成装置で調製した。配列５' −ＧＧＣ−ＧＵＣ−ｄＡＣＡ−ＣＣＵ−ＵＣＧ−ＧＧＵ−ＧｄＡｄＡ−ＧＵＣ−ＧＣＣ−３' （ＳＥＱＩＤ ＮＯ：２）のこのキメラ核酸を、水中の溶液として電子スプレー質量分析計に注入した。そのキメラの電子スプレーイオン化は、一組の多重に荷電されたイオンを与え、それを衝突誘発解離（ＣＩＤ）かけることにより、その核酸の（Ｍ−５Ｈ）5-形態に相当するイオンが更に検討される。そのイオンは、ＣＩＤにより開裂されてｍ／ｚ１００６．１、１１６２．８及び１０６６．２の３つのフラグメントを与えることが分かった。これらのフラグメントは、それぞれＷ7 (2-)、Ｗ8 (2-)、及びａ7 −Ｂ(2-)フラグメントに相当し、それらは取り込まれたｄＡ残基の各々に隣接したキメラ核酸の開裂により形成される。
キメラＲＮＡ／ＤＮＡの開裂及びフラグメンテーションが３つのｄＡ部位全てに隣接して起こったという知見は、その試験ＲＮＡが、ｄＡ残基が取り込まれた位置の周囲に配されていないことを示す。従って、その試験ＲＮＡは、それら７、２０及び２１位置に組まれてはいない。
キメラＲＮＡ／ＤＮＡ分子の体系的シリーズは、種々の分子各々がＲＮＡ中の異なる部位にデオキシ残基を取り込むように合成される。全てのそのようなＲＮＡ／ＤＮＡメンバーは、一つの溶液中に共混合（comixed ）される。これまで記載したようなＭＳ分析が、その共混合物（comixture ）に関して、二次又は三次構造に包含される残基と、いかなる構造にも包含されない残基とを示す完全な地図又は‘フットプリント' を提供するための行われる。図１を参照のこと。
実施例２：１６ＳｒＲＮＡ Ａ部位に相当する２７量体ＲＮＡ上のパロモマイシンについての結合部位の決定
実施例１のＲＮＡへのパロモマイシンの結合を検討するために、実施例１のキメラＲＮＡ／ＤＮＡ分子を、標準的な自動核酸合成プロトコルを用いて自動合成装置で合成した。次いで、この核酸のサンプルを、実施例１に記載したように、質量分析計でＥＳＩに続きＣＩＤにかけると、ｄＡ取り込みの部位における構造の欠如を示すフラグメンテーションパターンを与えた。このことは、そのキメラ核酸の構造中のこれらのｄＡ部位の接近容易性（accesibility）を示した。
次に、そのキメラ核酸の別のサンプルをパロモマイシンの溶液で処理し、得られる混合液を質量分析計を用いてＥＳＩに続いてＣＩＤにより分析した。電子スプレーイオン化で、その核酸のみについて観察されたものとは異なる一組の多重に荷電されたイオンをもたらすことが分かった。このことは、観察されたイオン複合体の高い質量の故に、そのキメラ核酸へのパロモマイシンの結合も示すものであった。更に、そのパロモマイシン−核酸複合体中の核酸のコンフォメーションにおけるより密な構造への変化を反映する、多重荷電イオン複合体の分布におけるシフトも観察された。
ＣＩＤによる複合体の開裂及びフラグメンテーションは、そのキメラ核酸へのパロモマイシンの結合の位置に関する情報を与えた。ＣＩＤはその核酸中のｄＡ部位においてフラグメンテーションをもたらさないことが分かった。それゆえ、パロモマイシンは、３つのｄＡ残基全てにおいてか又はその近くで結合するに違いない。従って、パロモマイシンは、このＲＮＡ／ＤＮＡキメラ標的中のｄＡ湾曲部に結合すると考えられ、そして３つのｄＡ残基全てを、質量分析法の間に開裂されることから保護するコンフォメーションの変化を誘発する。図２ａ及び２ｂを参照のこと。
実施例３：生体分子標的に結合するコンビナトリアルライブラリーのメンバーの正体の確認
（実施例１からの）３つのｄＡ残基を含有する２７量体ＲＮＡの１ｍＬ（０．６Ｏ．Ｄ．）の溶液を５００μＬの１：１のイソプロパノール：水の中に希釈して調整し、酢酸アンモニウム中１５０ｍＭでｐＨ７．４である溶液を提供した。そのＲＮＡ濃度は１０ｍＭであった。この溶液に酢酸パロモマイシンの溶液のアリコートを１５０ｎＭの濃度まで添加した。次いで、この混合液をＥＳＩ−ＭＳにかけ、その核酸及びそれの複合体のイオン化を質量スペクトルでモニターした。パロモマイシン−２７量体複合体の（Ｍ−５Ｈ）5-イオンに相当するピークは、１９０７．６のｍ／ｚ値において観察される。予測されるように、２７量体を超える多量体も、約１７８４においてそれの（Ｍ−５Ｈ）5-ピークとしてその質量スペクトル中に観察される。その質量スペクトルで、１９０７．６における１：１複合体のみの形成（２７量体及びパロモマイシンの質量の付加からそう考えられる）が確認され、そして２０３６．５のｍ／ｚにおいて現れると考えられるいずれのビス複合体も存在しないことが確認される。
次に、２７量体ＲＮＡ／ＤＮＡキメラ及びパロモマイシンの混合液に、２７量体標的を含むこの混合液中のコンビナトリアルライブラリーの各メンバーの最終濃度が１５０ｎＭまでであるように、そのコンビナトリアルライブラリーの０．７ｍＬの１０μＭ原液を添加した。次に、２７量体、パロモマイシン及び組み合せ化合物のこの混合液を５ｍＬ／分の速度でＥＳＩ−ＭＳに注入し、合計５０スキャン（４つのマイクロスキャン各々）を２分のシグナル平均化で行って、その混合液の質量スペクトルを得た。
そのように得られた、図３ａ及び３ｂに示すＥＳＩ質量スペクトルは、１８９７．８、１８９１．３及び１８８４．４のｍ／ｚ値において（Ｍ−５Ｈ)5-イオンについての新たなシグナルの存在を証明した。これらの新たなシグナルを２７量体のみについてのイオンピークと比較して、その標的に結合しているコンビナトリアルライブラリーのメンバーの観察されるｍ／ｚの値を計算することができる。そのライブラリーの結合しているメンバーの質量は、それぞれ、５６６．５、５３４．５及び４８２．５であった。その基本骨格及びこのライブラリーの作製において使用される置換基の構造を知ると、どの置換パターン（置換基の組合せ）がその結合している分子中に存在するかを決定することが可能であった。
ｍ／ｚ４８２．５、５３４．５及び５６６．５の種は、それぞれ、酢酸＋ＭＰＡＣグループ、芳香族＋ピペリジルグアニジングループ及びＭＰＡＣ＋グアニジルエチルアミドグループをもつライブラリーメンバーであろうことが分かった。このやり方において、そのコンビナトリアルライブラリーの組成物が先験的に（a priori）知られている場合、その結合している成分の正体は直接解明される。
そのような手順におけるＦＴＭＳ装置の使用は、本法の感度及び精度の両方を高める。ＦＴＭＳでは、この方法は、これらのサンプルの電子スプレー質量分析法の間に観察される化学的ノイズを有意に減少させることが可能であり、それによって、それらの結合親和性においてずっと弱いより多くの結合性物質（binder）の検出を容易にする。更に、ＦＴＭＳを用いて、その装置の高分解能はコンビナトリアルライブラリーの結合成分の質量の正確な評価を提供するので、そのライブラリーの構造的特質が既知である場合は、これらの成分の正体を直接確認できる。
実施例４：生体分子標的に結合するコンビナトリアルライブラリーのメンバーについての結合の部位の決定
標的としての２７量体ＲＮＡ／ＤＮＡキメラ核酸のパロモマイシン及び実施例３からの諸化合物のコンビナトリアルライブラリーとの混合物を、実施例３に記載したのと同じＥＳＩ−ＭＳ法にかけた。実施例２からのＥＳＩスペクトルは、ライブラリーメンバーのその標的への結合から形成される複合体から生ずる新たなシグナルを１８９７．８、１８９１．３及び１８８４．４のｍ／ｚ値において示した。パロモマイシン−２７量体複合体イオンが１９０７．３のｍ／ｚにおいて観察された。
２つの複合体イオンを更なる分解のためにこのスペクトルから選択して、２７量体ＲＮＡ／ＤＮＡキメラ上のそれらの成分リガンドの結合の部位を決定した。まず、パロモマイシン−２７量体複合体に相当する１９０７．３におけるイオンをイオン単離手順を経て単離してからＣＩＤにかけた。開裂は起こらないことが分かり、フラグメンテーションはその質量スペクトルにおいて観察されなかった。このことは、パロモマイシンが、この核酸の湾曲領域中の３つのｄＡ残基が存在するところにおいてか又はその近くで結合することを示す。従って、パロモマイシンはその複合体中のｄＡ残基をＣＩＤによるフラグメンテーションから保護する。
同様に、２７量体標的とのライブラリーメンバーの複合体に相当するｍ／ｚ１８９７．８におけるイオンをイオン単離手順により単離してから、先の複合体について使用されたのと同じ条件を用いてＣＩＤにかけて、そのデータを３分間で平均化した。得られる質量スペクトル（図４）は、１００５．８、１０６５．６、１１６２．８、２３４１．１、２４０６．３及び２４４６．０のｍ／ｚ値の６つの主要なフラグメントイオンを現した。ｍ／ｚ１００５．８、１０６５．６及び１１６２．８の３つのフラグメントは、その核酸標的からのＷ6 (2-)、ａ7 −Ｂ(2-)及びＷ7 (2-)イオンに相当する。２３４１．１、２４０６．３及び２４４６．０という高い質量のこれら３つのイオンは、ａ20−Ｂ(3-)イオン＋５６６Ｄａ、Ｗ21 (3-)イオン＋５６６Ｄａ及びａ21−Ｂ(3-)イオン＋５６６Ｄａに相当する。そのデータは少なくとも２つの発見を実証する：第１に、このＥＳＩ−ＣＩＤ実験において、その核酸だけが活性化されてフラグメントイオンを与えることから、新たなフラグメントイオンの観察は、１８９７．８イオンピークはその核酸標的に結合されたライブラリーメンバーから生ずることを示す。第２に、そのライブラリーメンバーは５６６の分子量を有する。このライブラリーメンバーは、その核酸標的（１６ＳｒＲＮＡ Ａ部位に相当するＲＮＡ／ＤＮＡキメラ）のステム構造におけるＧＣＵＵテトラループ又は４塩基対に結合し、湾曲Ａ部位にもその核酸標的のＵ＊Ｕミスマッチ対を含有する６塩基対ステムにも結合しない。
そのライブラリーメンバーの結合部位に関する更なる詳細は、デオキシヌクレオチド取り込みの位置が異なる標的核酸分子のフラグメンテーションとのその相互作用及びそれへの影響を検討することにより得ることができる。
実施例５：生体分子標的に結合するコンビナトリアルライブラリーのメンバーの正体及びその標的への結合の位置の確認
３つのｄＡ残基を含有する１６ＳｒＲＮＡ Ａ部位に相当する（実施例１からの）２７量体ＲＮＡ標的のｐＨ７．４の１００ｍＭ酢酸アンモニウム中の１０ｍＭ溶液を、酢酸パロモマイシンの溶液及びスクリーニングされるべき第２のコンビナトリアルライブラリーのＤＭＳＯ溶液のアリコートで処理した。添加するパロモマイシンの量を１５０ｎＭの最終濃度を与えるように調整した。同様に、添加するライブラリーのＤＭＳＯ溶液の量を、そのライブラリーの２１６メンバー成分の各々の最終濃度が１５０ｎＭまでであるように調整した。その溶液を、Finnigan ＬＣＱイオントラップ質量分析計中に注入し、電子スプレーによりイオン化した。１０００〜３０００ｍ／ｚの範囲を、その核酸標的及びそれとパロモマイシンやコンビナトリアルライブラリーのメンバーとの結合から生ずる複合体のイオンについてスキャンした。典型的には、２００スキャンが５分間で平均化された。その核酸標的からのイオンは、（Ｍ−５Ｈ）5-イオンについてｍ／ｚ１７８４．４及び（Ｍ−４Ｈ）4-イオンについて２２３０．８と観察された。パロモマイシン−核酸複合体は、ｍ／ｚ１９０７．１における（Ｍ−５Ｈ）5-イオン及びｍ／ｚ２３８４．４ｕにおける（Ｍ−４Ｈ）4-イオンのシグナルとしても観察された。
コンビナトリアルライブラリーのメンバーと核酸標的との複合体についてのスペクトルを分析して、そのライブラリーのメンバーのその核酸標的との非共有結合形結合から生ずるいくつかの新たなシグナルが明らかになった。そのような非共有結合型複合体についての少なくとも６つのシグナルがその質量スペクトル中に観察された。これらのうち、最も低いｍ／ｚ値におけるシグナルは、その核酸標的への非常に強い結合性物質であることが分かった。このリガンド−核酸複合体イオンの存在量をパロモマイシン−核酸複合体から誘導されるイオンの存在量と比較して、パロモマイシンについてのものと類似する相対的結合親和性（見かけのＫD ）が明らかになった。
また、６分までのシグナル平均化を伴うＭＳ／ＭＳ実験をこの複合体に関しても行って、更に、結合したリガンドの分子量を確認した。装置性能は±１．５Ｄａまで正確であるので７３０．０±２Ｄａの質量と確認された。結合したリガンドのこの観察された質量と、そのコンビナトリアルライブラリーの作製に使用された基本骨格及び置換基の既知の構造とに基づいて、そのリガンドの構造は、ＰＡＰ５基本骨格上に３つの可能な置換基の組合せのいずれかをもつことが分かった。この複合体のＭＳ／ＭＳ分析で、ハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡのｄＡ残基のＣＩＤ開裂からの保護が弱いことも分かった。７３０Ｄａの質量増加を伴うフラグメントが観察されたことで、その分子がｒＲＮＡ標的の上流ステムループ領域に結合することが分かった。
実施例６：生体分子標的に結合するコンビナトリアルライブラリーのメンバーの正体及びその標的への結合の位置の確認
３つのｄＡ残基を含有する１６ＳｒＲＮＡ Ａ部位に相当する（実施例１からの）２７量体ＲＮＡ標的のｐＨ７．４の１００ｍＭ酢酸アンモニウム中の１０ｍＭ溶液を、酢酸パロモマイシンの溶液及びスクリーニングされるべき第３のコンビナトリアルライブラリーのＤＭＳＯ溶液のアリコートで処理した。添加されるパロモマイシンの量を１５０ｎＭの最終濃度を与えるように調整した。同様に、添加されるライブラリーのＤＭＳＯ溶液の量を、そのライブラリーの２１６メンバー成分の各々の最終濃度が１５０ｎＭまでであるように調整した。その溶液を、FinniganＬＣＱイオントラップ質量分析計に注入し、電子スプレーによりイオン化した。１０００〜３０００ｍ／ｚの範囲を、その核酸標的及びそれとパロモマイシンやコンビナトリアルライブラリーのメンバーとの結合から生ずる複合体のイオンについてスキャンした。典型的には、２００スキャンが５分間で平均化された。その核酸標的からのイオンは、（Ｍ−５Ｈ）5-イオンについてｍ／ｚ１７８４．４及び（Ｍ−４Ｈ）4-イオンについて２２３０．８と観察された。パロモマイシン−核酸複合体は、ｍ／ｚ１９０７．１において（Ｍ−５Ｈ）5-イオン及びｍ／ｚ２３８４．４ｕにおける（Ｍ−４Ｈ）4-イオンのシグナルとしても観察された。
そのコンビナトリアルライブラリーのメンバーとその核酸標的との複合体についてのスペクトルの分析では、そのライブラリーのメンバーのその核酸標的との非共有結合型結合から生ずるいくつかの新たなシグナルが明らかになった。そのような非共有結合型複合体についての少なくとも２つの主要なシグナルがその質量スペクトル中に観察された。６分までのシグナル平均化を伴うＭＳ／ＭＳ実験をこれら２つの複合体についても行って、更にそれら結合したリガンドの分子量を確認した。
第１の複合体は、その標的への質量７２０．２±２Ｄａの分子の結合から生じたことが分かった。そのライブラリーを作製するために使用された基本骨格及び置換基の構造に基づくそのコンビナトリアルライブラリーのこのメンバーについて２つの可能な構造を導き出した。これらには、質量７２０．４の構造と質量７２１．１の構造が含まれる。このリガンド−標的複合体イオンに関するＣＩＤを用いたＭＳ／ＭＳ実験で、その標的の湾曲構造中のＡ残基の強い保護が証明された。従って、このリガンドはそのＲＮＡ／ＤＮＡ標的の湾曲ｄＡ残基に強く結合しているに違いない。
このライブラリーのスクリーニングから観察された第２の主要な複合体は、その標的への質量６６５．２±２Ｄａの分子の結合から生じたことが分かった。そのライブラリーを作製するために使用された基本骨格及び置換基の構造に基づくそのライブラリーのこのメンバーについての２つの可能な構造を導き出した。このリガンド−標的複合体イオンに関するＣＩＤを用いたＭＳ／ＭＳ実験で、その標的の強いフラグメンテーションが証明された。従って、このリガンドはそのＲＮＡ／ＤＮＡ標的の湾曲ｄＡ残基に強く結合してはいない。その代わり、フラグメンテーションパターン並びにその標的のループ部分からのフラグメントに結合した付加質量が観察されたことは、このリガンドはそのＲＮＡ／ＤＮＡ標的のループ領域中の残基に結合するに違いないことを示唆している。図６を参照のこと。
実施例７：諸化合物のコンビナトリアルライブラリーの、２つの核酸標的に対する同時スクリーニング
スクリーニングされるべき２つのＲＮＡ標的を、自動核酸合成装置を用いて合成する。第１標的（Ａ）は、実施例１におけるように、１６ＳｒＲＮＡ Ａ部位に相当する２７量体ＲＮＡであり、３つのｄＡ残基を含有する。第２標的（Ｂ）は、３つのｄＡ残基をもつ２７量体ＲＮＡであり、標的（Ａ）と比較して同一の塩基組成であるが完全に並べ替えられた配列である。自動合成の最後の工程において、質量修飾タグであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ホスホロアミダイトを標的（Ｂ）の５' 末端に付加することにより、標的（Ｂ）を修飾する。このことは、質量修飾タグをもつ標的（Ｂ）において、標的（Ａ）と比べて３５７５の質量増加をもたらす。
１０ｍＭの標的（Ａ）及び１０ｍＭの質量修飾された標的（Ｂ）を含有する溶液を、適切な量の両方の標的をｐＨ７．４の１００ｍＭ酢酸アンモニウム中に溶解することにより調製する。この溶液を、酢酸パロモマイシンの溶液及びスクリーニングされるべきコンビナトリアルライブラリーのＤＭＳＯ溶液のアリコートで処理する。添加されるパロモマイシンの量を、１５０ｎＭの最終濃度を与えるように調整する。同様に、添加されるライブラリーのＤＭＳＯ溶液の量を、そのライブラリーの２１６メンバー成分の各々の最終濃度が１５０ｎＭまでであるように調整する。それらライブラリーメンバーは７００〜７５０Ｄａの質量を有する分子である。その溶液を、FinniganＬＣＱイオントラップ質量分析計に注入し、電子スプレーによりイオン化する。１０００〜３０００ｍ／ｚの範囲を、その核酸標的及びそれとパロモマイシンやそのコンビナトリアルライブラリーのメンバーとの結合から生ずる複合体のイオンについてスキャンする。典型的には、２００スキャンが５分間で平均化される。
核酸標的（Ａ）からのイオンが、（Ｍ−６Ｈ）6-イオンについてｍ／ｚ１４８６．８、（Ｍ−５Ｈ）5-イオンについて１７８４．４、及び（Ｍ−４Ｈ）4-イオンについて２２３０．８で観察される。標的（Ａ）とライブラリーのメンバーとの複合体からのシグナルは、１６０３．２〜１６１１．６、１９２４．４〜１９３４．４及び２４０５．８〜２４１８．３におけるｍ／ｚ値で生じると考えられる。
質量修飾ＰＥＧタグをもつ核酸標的（Ｂ）のコンビナトリアルライブラリーのメンバーとの複合体からのシグナルは、２１９９〜２２０７．４、２６３９〜２６４９、及び３２９９〜３３１１におけるｍ／ｚ値で観察される。従って、標的（Ｂ）との非共有結合型複合体のシグナルは、第１標的（Ａ）から生ずる複合体のシグナルから明瞭に分かれる。従って、その質量スペクトル中で観察される新たなシグナルは、標的（Ａ）又は標的（Ｂ）のいずれかへのライブラリーメンバーの結合から生ずるものとして容易に割り当てられる。
独特で高分子量の中性及び陽イオンポリマーの使用によるこの質量修飾技術をより大きな数の標的へ拡張すると、個々の化合物又は組み合せライブラリーに対する２より多い標的の同時スクリーニングが可能になる。
実施例８：諸化合物のコンビナトリアルライブラリーの、２つのペプチド標的に対する同時スクリーニング
スクリーニングされるべき２つのペプチドを自動ペプチド合成装置を用いて合成する。第１標的（Ａ）は既知の配列の２７量体ポリペプチドである。第２標的（Ｂ）も標的（Ａ）と比べて同一のアミノ酸組成であるが、完全に並べ替えられた配列である２７量体ポリペプチドである。自動合成の最後の工程において、質量修飾タグであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）クロロホーメートを標的（Ｂ）のアミノ末端に付加することにより、標的（Ｂ）を修飾する。このことは、質量修飾タグをもつ標的（Ｂ）において、標的（Ａ）と比べて３６００までの質量増加をもたらす。
１０ｍＭの標的（Ａ）及び１０ｍＭの質量修飾された標的（Ｂ）を含有する溶液を、適切な量の両方の標的をｐＨ７．４の１００ｍＭ酢酸アンモニウム中に溶解することにより調製する。この溶液を、スクリーニングされるべきコンビナトリアルライブラリーのＤＭＳＯ溶液のアリコートで処理する。添加されるライブラリーのＤＭＳＯ溶液の量を、そのライブラリーの２１６メンバー成分の各々の最終濃度が１５０ｎＭまでであるように調整する。それらライブラリーメンバーは７００〜７５０Ｄａの質量を有する分子である。その溶液を、FinniganＬＣＱイオントラップ質量分析計に注入し、電子スプレーによりイオン化する。１０００〜３０００ｍ／ｚの範囲を、そのポリペプチド標的及びそれとそのコンビナトリアルライブラリーのメンバーとの結合から生ずる複合体のイオンについてスキャンする。典型的には、２００スキャンが５分間で平均化される。
ポリペプチド標的（Ａ）及び標的（Ａ）とそのライブラリーのメンバーとの複合体からのイオンは、質量修飾ＰＥＧタグをもつポリペプチド標的（Ｂ）及びそれとそのコンビナトリアルライブラリーのメンバーとの複合体からのシグナルよりずっと低いｍ／ｚ値で生ずると考えられる。それゆえ、標的（Ｂ）との非共有結合型複合体のシグナルは、第１標的（Ａ）から生ずる複合体のシグナルから明瞭に分かれる。従って、その質量スペクトル中に観察される新たなシグナルは、標的（Ａ）又は標的（Ｂ）のいずれかへのライブラリーメンバーの結合から生ずるものとして容易に割り当てられる。このようにして、２又はそれより多いペプチド標的を、個々の化合物又はコンビナトリアルライブラリーに対する結合について容易にスクリーニングすることができる。
実施例９：構造の決定のための核酸の気相解離
電子スプレーイオン化を用いて核酸二重鎖を無傷の二重鎖として溶液から気相に変換させ、フーリエ変換、イオントラップ、四重極、飛行時間、又は磁気セクター質量分析計を用いて検出することができる。単一荷電状態の二重鎖に相当するイオンは、共鳴排出（resonance ejection）、オフ共鳴励起（off-resonance excitation）、又は質量分析法の技術分野に通じている者に知られている同様な方法により単離することができる。単離すると、これらのイオンは、黒体放射、赤外多光子解離、又は衝突活性化を経て強力に活性化されることができる。この活性化は、グリコシド結合及びホスフェート骨格の解離をもたらし、ｗ−シリーズ（無傷の３' −末端と内部開裂後の５' −ホスフェートを有する）及びａ−塩基シリーズ（無傷の５' −末端と３' −フランを有する）と呼ばれる２つのシリーズのフラグメントイオンをもたらす。これらの生成物イオンは、ＭＳ／ＭＳ実験におけるそれらの質量／電荷比の測定により同定することができる。
この方法の能力の一例を図８ａ、８ｂ及び９に示す。図８ａには、Ｇ−Ｇミスマッチ塩基対を含有するＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖からの（Ｍ−５Ｈ)5-イオンの衝突活性化から生じるｗ及びａ−塩基イオンの存在量が図示されている。ｗシリーズイオンは黒で強調されて二重鎖に向いているが、ａ−塩基シリーズイオンは灰色で強調されて二重鎖から離れるように向いている。フラグメントイオンが豊富であればあるほど、それぞれの矢印はより長くかつより太くなる。実質的なフラグメンテーションは、そのミスマッチ塩基対に隣接した両方の鎖において観察される。コントロールＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖イオンの衝突活性化後に得られる結果を図８ｂに示す。いくつかの生成物イオンは共通であるが、フラグメンテーションのパターンはそのミスマッチ塩基対を含有する二重鎖とは有意に異なる。それらフラグメントイオン及びそのフラグメンテーションのパターンの分析で、そのミスマッチ塩基対の位置を明瞭に同定することが可能になる。加えて、それら結果は、二重鎖ＤＮＡイオンの気相構造が、そのミスマッチ塩基対の存在により、活性化後のフラグメンテーションを容易にするようなやり方で変化されることを示唆している。
３つのＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖での第２のシリーズの実験を図９に示す。上段の図において、Ａ−Ｃミスマッチ対がその二重鎖中に取り込まれた。ｗ及びａ−塩基イオンを生ずる広範囲なフラグメンテーションがそのミスマッチ対に隣接して観察された。しかし、ＲＮＡ中の増加した強度のグリコシド結合は、そのＲＮＡ鎖のフラグメンテーションを限定する。これゆえ、フラグメンテーションは、ＤＮＡ鎖上に集中される。中段の図においてＣ−Ｃミスマッチ対がその二重鎖中に取り込まれ、高められたフラグメンテーションがそのミスマッチ塩基対の部位で観察される。上記のように、ＲＮＡ鎖のフラグメンテーションは、そのＤＮＡ鎖に比較して減少される。下段の図は、全ての相補性塩基対を含有するコントロールＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖について観察されるフラグメンテーションを含有する。３つ全ての場合において、Ｇ５−Ｔ４塩基間に共通のフラグメンテーションパターンが認められる。しかし、フラグメンテーションの程度は、塩基対ミスマッチを含有する二重鎖に比較して相補性二重鎖において低下している。
実施例１０：リガンドの分子相互作用部位への結合を確認するためのＲＮＡ−リガンド複合体の質量分析
提案されたリガンドがＲＮＡの分子相互作用部位に結合するか否かを質量分光学を通じて識別する能力を示すことができる。図１０及び図１１は、リガンドとのステムループ構造を有するＲＮＡセグメントの質量スペクトルであり、未知の官能基の付いた分子により図で例示される。そのリガンドをＲＮＡフラグメントと、結合を容易にするために選択される条件下で混合し、得られる複合体を多標的親和性／特異性スクリーニング（ＭＡＳＳ）プロトコルにより分析する。これは、好ましくは、これまでに記載しかつ本明細書中で引用した文献に記載されているような、電子スプレーイオン化フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析法を使用する。上記の“質量クロマトグラフィー" は、一つの生体分子複合体に焦点を当てること、及びその一つの複合体の特性イオンへのフラグメンテーションを検討することを可能にする。かくして、ＲＮＡへのリガンドの結合の位置は、そのようなフラグメントの評価を介して決定され得る、つまり、分子相互作用部位とリガンドに相当するフラグメントの存在が、その分子相互作用部位へのそのリガンドの結合を示すのである。
図１０は、非Ａ部位結合分子についての結合位置の質量分析の図である。（Ｍ−５Ｈ）５−複合体の“質量クロマトグラフィー" を通じた単離及びその後の解離が、ｍ／ｚ１９１９．８において観察される。フリーのＲＮＡについて観察されるフラグメンテーションに比較して選択フラグメントにおいて観察される質量シフトは、そのリガンドがどこで結合しているかについての情報を提供する。ｍ／ｚ１２００以下に観察される（２−）フラグメントはそのＲＮＡのステム構造に相当するが、それらのフラグメントは複合化すると質量シフトされない。これは、リガンドがステム構造に結合しないことに一致する。
図１１は、非Ａ部位結合分子についての結合位置の質量分析を示す。ｍ／ｚ１９２９．４において観察される（Ｍ−５Ｈ）５−複合体の単離（すなわち“質量クロマトグラフィー" ）及びその後の分離は、そのＡ部位の付近のフラグメンテーションからの有意な保護を提供する。このことは、２３００〜２５００ｍ／ｚにおけるｗ及びａ−塩基フラグメントイオンの低い存在量により証明される。フリーのＲＮＡについて観察されるフラグメンテーションに比較して選択フラグメントにおいて観察される質量シフトは、そのリガンドがどこで結合しているかの情報を提供する。そのＲＮＡの正確な分子の質量は、そのＲＮＡに結合した分子の同定についての内部又は固有質量ラベルとして作用することができる。ｍ／ｚ１２００以下に観察される（２−）フラグメントは、そのＲＮＡのステム構造に相当する。これらフラグメントは複合化で質量シフトされず、リガンドがステム構造に結合しないことに一致する。従って、リガンドのＲＮＡへの結合の位置を決定することができる。
実施例１１：リガンドライブラリーのＲＮＡ標的への特異性と親和性の決定
質量スクリーニングの好ましい第１工程は、ＲＮＡ標的（又は複数の標的）を、その標的分子上の特異的部位に結合するようにデザインされたリガンドのコンビナトリアルライブラリーと混ぜることを包含する。その標的及びあらゆるライブラリーメンバーの間で溶液中で形成される具体的な非共有結合型複合体をＥＳＩにより気相に変換させてイオン化する。本明細書中に記載したように、複合体とそのフリーの標的の間の測定された質量差から、その結合リガンドの正体を確認することができる。複合体の解離定数は２種類のやり方で決定することができる。標的についての既知の結合親和性を有するリガンドを利用できる場合は、その既知のリガンドを内部コントロールとして用いて未知の複合体の存在量をそのコントロールの存在量に対して測定することにより相対Ｋｄを測定することができ、また、内部コントロールを利用できない場合は、異なるリガンド濃度における一連の測定値を作製してその“滴定" 曲線からＫｄ値を誘導することによりＫｄを測定することができる。
好ましくは、スクリーニングは非常に多くの数の類似の、好ましくは組合わせて誘導された化合物を使用するので、そのライブラリーからの何かがその標的に結合するかどうかを確認できることに加えて、どの化合物がその標的に結合するかも確認することが好ましい。高度に精密な質量測定を用いて、未知のリガンドの質量の正体を独特な元素組成に絞り込む(constrain) ことができる。この独特な質量は、化合物の“固有質量ラベル" と言われる。例えば、約６１５Ｄａの分子量をもたらす元素組成は非常に多いが、６１５．２９６３０１２Ｄａの単一同位体分子量と一致する元素組成（Ｃ23Ｈ45Ｎ5 Ｏ14）はただ１つである。例えば、１６ＳＡ部位に非共有結合で結合したリガンド（このサンプル中のパロモマイシン）の質量は、フリーのＲＮＡを内部質量標準として用いると、６１５．２９６９＋０．０００６（１ｐｐｍの質量測定誤差）であると決定された。１００ｐｐｍの質量測定誤差では明瞭な化合物の割り当てができないので、Ｃ、Ｈ、Ｎ、及びＯの原子のみを含有するほぼ４００の元素組成と一致するに過ぎない。拡大図に示す同位体の分布は主として１３Ｃ原子の自然の取り込みの結果であり；高性能ＦＴＩＣＲは１２Ｃ〜１３Ｃの質量の違いを容易に分解することができることから、その同位体クラスターの各成分を内部質量標準として使用することができる。加えて、フリーのＲＮＡの理論的同位体分布は正確にシミュレートすることができるので、“ホモ同位体" 種の間の質量差を測定することができる（この実験では、４つの１３Ｃ原子を含有する種の間で質量差が測定される）。
結合リガンドの正体を確認したら、その複合体を気相に単離（すなわち“質量クロマトグラフィー" ）して分離する。フリーの標的のフラグメンテーションパターンをリガンドと複合化した標的のものと比較することによって、そのリガンド結合部位を確認することができる。その複合体の解離は、フラグメンテーションが中立子 (neutrals) での高エネルギー衝突により成される衝突活性化解離（ＣＡＤ）、又は高電力ＩＲレーザーからの光子が複合体のフラグメンテーションを引き起こす赤外多光子解離（ＩＲＭＰＤ）のいずれかにより行われる。
１６ＳｒＲＮＡのＡ部位を含有する２７量体ＲＮＡを確認実験のための標的として選択した。図１２を参照のこと。アミノグリコシドパロモマイシンは、不対アデノシン残基と２００ｎＭのＫｄで結合することが知られているので、内部標準として使用した。その標的は１０ｍＭの初期濃度であったが、パロモマイシン及び２１６ライブラリーメンバーの各々は１５０ｎＭの初期濃度であった。この実施例は、高い分解又は高い質量精度のＦＴＩＣＲを与えない四重極イオントラップで行ったが、ＭＡＳＳ概念を説明するのに役立つ。フリーのＲＮＡに相当する分子イオンは、ｍ／ｚ１７８４．４（Ｍ−５Ｈ+ ）5-及び２２３０．８４（Ｍ−４Ｈ+ ）4-で観察される。ＲＮＡ−パロモマイシン内部コントロールからのシグナルは、ｍ／ｚ１９０７．１４（Ｍ−５Ｈ+ ）5-及び２３８４．４４（Ｍ−４Ｈ+ ）4-において観察される。考えられるパロモマイシン複合体に加え、その標的へのライブラリーメンバーの結合に対応して多くの複合体が観察される。図１３を参照のこと。
このライブラリーの一つのメンバー（ＭＷ＝６７５．８＋１．５）は、その標的との強い複合体を形成するが、ＭＳ／ＭＳ検討を行うと、そのリガンドはＡ部位フラグメンテーションを保護しないので、そのループ領域に結合することが分かる。７４３．８＋１．５のおよその質量を有するＩｓｉｓ１１３０６９の別のメンバーは、その標的への強い結合を示して、ＭＳ／ＭＳ実験により明示されるように、Ａ部位における結合と矛盾せずに不対Ａ残基を保護する。
このＭＡＳＳアプローチの迅速かつ並行的性質は、非常に多くの化合物を多数の標的に対して同時にスクリーニングすることを可能とし、大きく高められたサンプル処理量及び情報の内容をもたらす。１５分未満しか要しない１回のアッセイで、ＭＡＳＳは、１０の標的を５００を超える成分を含有するライブラリーに対してスクリーニングすることができ、どの化合物がどの標的に結合するか、どこにそれらは結合するか、及びどんな結合親和性であるかを知らせる。
実施例１２：１６Ｓ Ａ部位ＲＮＡ／パロモマイシン複合体の高精度ＥＳＩ−ＦＴＩＣＲ質量測定
５ｍＭ１６ＳＲＮＡ（図２４に示す２７量体構築物）及び５００ｎＭパロモマイシンを含有する溶液で行った電子スプレーイオン化フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析法を図１３に示す。Ａ部位での特異的アミノグリコシド結合と一致する、パロモマイシン及びＲＮＡの間の１：１の複合体が観察された。挿入図は、フリーのＲＮＡ及びＲＮＡ−パロモマイシン複合体の（Ｍ−５Ｈ+ ）5-種の実測及び計算同位体エンベロープを示す。フリーのＲＮＡの（Ｍ−５Ｈ+ ）5-及び（Ｍ−４Ｈ+ ）4-荷電状態の同位体ピークを内部質量標準として用いかつフリー及び結合したＲＮＡのｍ／ｚ差を測定して、高精度質量測定値が得られた。
実施例１３：６０メンバーライブラリーの１６ＳＡ部位ＲＮＡに対する質量
ＦＴＭＳスペクトルを１６ＳＲＮＡモデル（１０ｍＭ）及び６０メンバーコンビナトリアルライブラリーの混合物から得た。複合体からのシグナルを挿入図に強調する。６０メンバーを含有するコンビナトリアルライブラリーの１６ＳＲＮＡモデルへの結合を、各ライブラリーメンバーがＲＮＡの５倍過剰で存在する条件下で調べた。図１４に示すように、１６ＳＲＮＡ及びそのライブラリー中の５までのリガンドの間の複合体が観察された。
図１４からの１８６３複合体の拡大図を図１５に示す。そのライブラリー中の２化合物は、３９８．１Ｄａの表示質量を有した。分子式に基づいたそれらの計算分子量は、それらの質量が４６ｍＤａだけ異なることを示す。その複合体（ｍ／ｚ１８６３．７４８）及びフリーのＲＮＡ（ｍ／ｚ１７８４．１２６）のそれぞれの単一同位体（monoisotopic）（12Ｃ、14Ｎ、及び16Ｏの全て）［Ｍ−５Ｈ］5-種についての分子質量の正確な測定値で、そのリガンドの質量を３９８．１１０±．００９Ｄａと計算することができた。
図１６は、図１４及び１５において使用されたライブラリーの高分解ＥＳＩ−ＦＴＩＣＲスペクトルを示す。これは、３９８．１の表示分子量を有する両方のライブラリーメンバーがその合成されたライブラリー中に存在することを証明した。
実施例１４：６０メンバーコンビナトリアルライブラリーからのＭＡＳＳを用いた化合物同定
複合体の高精度質量測定値に基づいて、その結合リガンドの質量がＣ15Ｈ16Ｎ4 Ｏ2 Ｆ6 の化学式及び３９８．１１７Ｄａの分子量を有するライブラリーメンバーと一致することを確認した（図１７）。かくして、結合リガンドの正体が明瞭に確認された。
実施例１５：元素組成の絞り込み (constraint)
正確な質量測定値及び元素的絞り込みを“未知の" 結合リガンドの元素組成を決定するために使用することができる。未知の分子中の原子のタイプ及び数に関する一般的な結びつけを行うことで、高精度質量測定値と相まって、測定された質量と一致する分子式の限定されたリストの作成が可能となる。図１８を見ると、元素組成はＣ、Ｈ、Ｎ、及びＯの原子に限定されており、更にその分子の“既知" 部分の元素組成により絞り込まれる。これら絞り込みに基づいて、６１５．２９６９±０．０００６の分子量になる莫大な数の原子の組合せが２つの可能性に減少される。意図されるライブラリーメンバーの明瞭な同定に加えて、この技術は、分子標的に結合する意図されていない合成副生成物を当業者が同定することも可能にする。
実施例１６：１６Ｓ−パロモマイシンについてのＭＡＳＳＫd の決定
質量分析法による溶液相解離定数（Ｋｄ）の直接決定の結果を図１９に示す。異なる濃度のリガンドにおける固定濃度のＲＮＡを含有する溶液のＥＳＩ−ＭＳ測定値を得た。変動するリガンド濃度における結合されたＲＮＡ：結合されていないＲＮＡの比を測定することにより、Ｋｄをその“適定曲線" の１／傾きにより決定した。ＭＳ由来の１１０ｎＭの値は、以前に報告された２００ｎＭの文献値によく一致している。
実施例１７：多標的親和性／特異性スクリーニング
タンデム質量分析法によるリガンド結合部位の決定のための概略を図２０に示す。１又は複数の分子標的を含有する溶液をリガンドのライブラリーと混合し、溶液中で非共有結合型複合体を形成する機会を与える。これら非共有結合型複合体を質量分析する。その後、それら非共有結合型複合体を気相中でＩＲＭＰＤ又はＣＡＤによって解離させる。その複合体の解離から形成されるフラグメントイオンとフリーのＲＮＡの解離から形成されるフラグメントイオンとの比較で、リガンド結合部位が明らかになる。
実施例１８：２７メンバーライブラリーの１６ＳＡ部位ＲＮＡとのＭＡＳＳ分析 図２１は、２７メンバーライブラリーの、原核性１６ＳＡ部位に相当する２７量体ＲＮＡ構築体に対するＭＡＳＳスクリーニングを示す。挿入図は、幾つかの化合物がその１６ＳＡ部位との複合体を形成したことを明らかにしている。
実施例１９：ＭＡＳＳ保護アッセイ
デオキシアデノシン残基をパロモマイシン結合部位に含有する原核性１６ＳＡ部位に相当する２７量体ＲＮＡ構築物のＭＳ／ＭＳを図２２ａ及び２２ｂに示す。図２２ａのスペクトルは、複合化されていないＲＮＡからの［Ｍ−５Ｈ］5-イオン（ｍ／ｚ１７８３．６）のＣＡＤにより得られたもので、デオキシアデノシン残基で有意なフラグメンテーションを示す。図２２ｂのスペクトルは、図２２ａのスペクトルにおいて使用したのと同一の活性化エネルギー下で、１６Ｓ−パロモマイシン複合体（ｍ／ｚ１９０７．５）の［Ｍ−５Ｈ］5-イオン（ｍ／ｚ１９０７．５）のＣＡＤにより得られたものである。リガンドによる結合部位の保護に一致して、有意なフラグメントイオンは図２２ｂのスペクトルでは観察されない。
ＤＭＳＯ中に溶解された２１６のテトラアザシクロファンを含有する２のコンビナトリアルライブラリーを、各ライブラリーメンバーが１００ｎＭで存在するように、１０ｍＭの１６ＳＲＮＡ含有する緩衝化溶液と混ぜた（図２４を参照のこと）。図２３ａ及び２３ｂに示すように、得られる質量スペクトルは、１６ＳＲＮＡとライブラリーメンバーの間に同じ表示質量を有する１０より多い複合体を明示している。パロモマイシン結合位置でデオキシアデノシン残基を含有する原核性１６ＳＡ部位に相当する２７量体ＲＮＡ構築物と２１６メンバーコンビナトリアルライブラリーとの混合物からＭＳ−ＭＳスペクトルを得た。図２３ａのスペクトルでは、第１ライブラリーからの最も豊富な複合体からのイオン（［Ｍ−５Ｈ］5-；ｍ／ｚ１９１９．０）が単離され、そして解離された。この複合体の解離で、各ｄＡ残基での開裂から生ずるｍ／ｚ１００６．１、１０６５．６、及び１１６２．４における３つのフラグメントイオンが発生する。より強いシグナルが、ｍ／ｚ２３７８．９、２４４３．１、及び２４８３．１において観察される。ｗ21 (3-)、ａ20−Ｂ(3-)、及びａ21−Ｂ(3-)フラグメントに相当するこれらのイオンは、６７６．０±０．６Ｄａの質量を有するライブラリーメンバーに結合した。それらフラグメントイオンの相対的な存在量は、複合化されていないＲＮＡについて観察されるパターンと類似しているが、より低いステム及びテトラループからのイオンの質量は、リガンドとの複合化によりシフトされる。このリガンドは、デオキシアデノシン残基の保護を殆ど提供せず、より低いステム−ループに結合するに違いない。そのライブラリーは微生物の増殖を阻害しなかった。図２３ｂのスペクトルでは、１６ＳＲＮＡと、同じ衝突エネルギーを有するｍ／ｚ１９３４．３を有する第２ライブラリーとの混合物からの最も豊富な複合体の解離は、ごく僅かなフラグメントイオン、無傷の複合体から生じる優勢なシグナル、及び中立(neutral) アデニンの損失をもたらす。この複合体についてのアデニンの開裂及び損失のレベルが低下したことは、パロモマイシンがそうであるように、モデルＡ部位領域におけるリガンドの結合と一致している。この第２ライブラリーは、５ｍＭで転写／翻訳を阻害し、Ｅ．ｃｏｌｉ（ｉｍｐ−）及びＳ．ピオゲンに対して２〜２０ｍＭのＭＩＣを有する。
実施例２０：真核性及び原核性Ａ部位の中性質量タグ
図２４は、本研究に使用される１８Ｓ（真核性）及び１６Ｓ（原核性）Ａ部位に相当する２７塩基ＲＮＡモデルの二次構造を示す。その塩基配列は、７つの位置（太字）で異なり、それら２つの構築物間の正味の質量差はわずか１５．０１１Ｄａである。質量タグを、伝統的なホスホロアミダイトカップリング化学手段を用いてそのＲＮＡ構築物の５' 末端に共有結合で付加させた。
その質量スペクトル中の会合したシグナル間の分離を増すための方法を、ＲＮＡ１６Ｓ及び１８Ｓからのシグナル間の重なりを考慮して開発した。それらの５' −末端に結合した付加的な未荷電官能基で修飾されたＲＮＡ標的を合成した。そのような合成修飾を本明細書中で中性質量修飾と言う。質量タグが付された高分子の質量シフト及びそれに伴うｍ／ｚは、タグが付されたＲＮＡにより生ずるシグナルのファミリーをその質量スペクトルにおける分解された領域に移動させる。５００ｎＭのパロモマイシンの存在下で、５' −末端に付けられた１８原子中性質量タグを伴う１６ＳＡ部位（７ｍＭ）及び伴わない１６ＳＡ部位（１ｍＭ）の１６ＳＡ部位の２７−塩基相当物の混合物のＥＳＩ−ＦＴＩＣＲスペクトルを図２５に示す。結合されていないＲＮＡとＲＮＡ−パロモマイシン複合体の比率は１６Ｓと１６Ｓ＋タグＲＮＡについて等しい。これは、中性質量タグはＲＮＡ−リガンド結合に目に見えるほどの効果を与えないことを証明している。
実施例２１：１６Ｓ Ａ部位及び１８Ｓ Ａ部位モデルＲＮＡのアミノグリコシド混合物に対する同時スクリーニング
パロモマイシン、リビドマイシン（ＭＷ＝７６１．３５４Ｄａ）、シソマイシン（ＭＷ＝４４７．２６９Ｄａ）、トブラマイシン（ＭＷ＝４６７．２５９１Ｄａ）、及びベカナマイシン（ＭＷ＝４８３．２５４Ｄａ）をSigma （セントルイス，ＭＯ）及びICN （コスタメーサ，ＣＡ）から得て、溶解して１０ｍＭ原液を作った。原核性（１６Ｓ）ｒＲＮＡ及び真核性（１８Ｓ）ｒＲＮＡ Ａ部位に相当するＲＮＡ構築物の２' メトキシ類似体（図２４）を自家合成し、１Ｍ酢酸アンモニウムから２回沈殿させ、続いてアンモニア（ｐＨ８．５）で脱保護した。それら質量タグが付された構築物は、そのＲＮＡオリゴマーの５' −末端にホスホジエステル連結を通じて付けられた１８−原子質量タグ（Ｃ12Ｈ25Ｏ9 ）を含有した。
全ての質量分析実験は、活性であるように遮蔽された７テスラ超伝導磁石を使用するApex II 70e 電子スプレーイオン化フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（Bruker Daltonics，ビルリカ）を用いて行った。ＲＮＡ溶液を５０ｍＭＮＨ4 ＯＡｃ（ｐＨ７）中で調製し、脱溶媒を促進するためにイソプロパノールと１：１ｖ：ｖで混ぜ、そしてシリンジポンプを用いて１．５ｍＬ／ｍｉｎの速度で注入した。５０００Ｖでバイアスをかけたガラス製脱溶媒キャピラリーの金属化末端からおよそ１．５ｃｍに位置する、傾いて（off axis）接地された電子スプレープローブを用いる、手を加えられた電子スプレー供給源（Analytica ，ブランフォード）でイオンを形成した。２２５℃まで熱せられた向流の乾燥酸素ガスのを用いてその脱溶媒プロセスを支援した。イオンをＲＦのみのヘキサポール（RF-only hexapole）、スキマーコーン（skimmer cone）及び１０００ｍｓのための補助電極から構成される外部イオンレシーバー内に蓄積してから、その捕捉されたイオンを質量分析のためのセル内に移動させた。各スペクトルは、７００ｍｓの検出間隔をもたらす９０，９０９ｋＨｚのバンド幅にわたって得られれた２５６のデータポイントから構成される１６過渡電流の同時添加（coaddition）の結果であった。パルス配列コントロール、データ取得、及び後取得プロセシングの全ての側面は、Silicon Graphics（サンホゼ，ＣＡ）R5000 コンピューター上でＸＭＡＳＳバージョン４．０を作動させる Bruker Daltonics データステーションを用いて行った。
質量スペクトル法実験は、５のアミノグリコシド（シソマイシン（Ｓｉｓ）、トブラマイシン（Ｔｏｂ）、ベカナマイシン（Ｂｅｋ）、パロモマイシン（ＰＭ）、及びリビドマイシン（ＬＶ））を含有するライブラリー及び２のＲＮＡ標的間の複合体形成を同時に検出するために行った。フリーの１６Ｓ及び１８ＳＲＮＡの（Ｍ−５Ｈ+ ）5-荷電状態からのシグナルは、それぞれｍ／ｚ１８０１．５１５及び１８６８．３３８において検出される。図２６に示すように、その質量スペクトルアッセイは、中性質量リンカー（neutral mass linker ）を伴う１６ＳＡ部位モデル及び１８ＳＡ部位モデルへのアミノグリコシドの既知の溶液結合特性を再度もたらす。１８ＳＡ部位に比較した１６ＳＡ部位についてのこれらアミノグリコシドのより高い結合親和性と矛盾することなく、アミノグリコシド複合体は、１６ＳｒＲＮＡ標的でのみ観察される。矢印で示されるｍ／ｚにおいて観察されるであろう１８Ｓ−パロモマイシン及び１８Ｓ−リビドマイシン複合体の不存在に注目のこと。そこでの挿入図は、それら複合体の同位体分解能を証明するものである。フリーＲＮＡの（Ｍ−５Ｈ+ ）5-及び（Ｍ−４Ｈ+ ）4-荷電状態の多数の同位体ピークを内部質量標準として用いると、それら複合体の平均質量測定誤差は２．１ｐｐｍである。高親和性複合体は、１６ＳＡ部位２７量体ＲＮＡ及びパロモマイシン及びリビドマイシンの間にそれぞれ検出された。弱い複合体は、シソマイシン、トブラマイシン、及びベカナマイシンで観察された。いずれのアミノグリコシドと１８ＳＡ部位モデルとの間にも複合体は観察されなかった。従って、この結果は、それら標的ＲＮＡに特異的に結合する化合物を同定するための質量スペクトルによるアッセイを有効なものにする。ある化合物について２つのＲＮＡ標的への結合の特異性に関する情報を同時に提供できる他のタイプの高処理量アッセイはない。リビドマイシンの１６ＳＡ部位への結合は、以前の生化学的実験から推論されてきた。本明細書では、質量分析計を使用して、１６ＳＡ部位２７量体へのリビドマイシンについての２８ｎＭ及びパロモマイシンについての１１０ｎＭのＫD を測定してきた。パロモマイシンについての溶液ＫD は１８０ｎＭ及び３００ｎＭの間であると見積もられた。
実施例２２：オリゴリボヌクレオチドの標的部位特異的気相開裂−質量分析法に基づいたリガンド結合部位の同定における適用
オリゴヌクレオチドのフラグメンテーションは複雑な過程であるが、それはグリコシド結合の相対的強さに関連していると考えられる。この観察は、デオキシ−ヌクレオチドを選択的に微生物ｒＲＮＡ Ａ部位領域のキメラ２' −Ｏ−メチルリボヌクレオチドモデルに取り込むことにより活かされる。Miyaguchi ら，Nucl. Acids Res.，1996，24，3700-3706 ；Fourmyら，Science ，1996，274 ，1367-1371 ；及び Fourmy ら，J. Mol. Biol. ，1988，277 ，333-345 。ＣＡＤの間に、フラグメンテーションは、より不安定なデオキシヌクレオチド部位に向けられる。得られるＣＡＤ質量スペクトルは、容易に割り当てられる相補的なフラグメントイオンの小さいサブセットを含有する。デオキシアデノシン残基付近でのリガンドの結合はこのＣＡＤ過程を阻害する一方、遠く離れた部位における複合化は解離に影響を及ぼさず、単に特異的なフラグメントイオンの質量をシフトさせるに過ぎない。これらの方法は、Ａ部位領域のＲＮＡモデルに優先的に結合するコンビナトリアルライブラリーからの化合物を同定するために使用される。
微生物Ａ部位領域のセグメントの２７量体モデルを、完全リボヌクレオチド（図２７参照のこと、化合物Ｒ）として、及び３つのデオキシアデノシン残基を含有するキメラ２' −Ｏ−メチルリボヌクレオチド（図２７参照のこと、化合物Ｃ）として調製した。ＲＮＡであるＲ及びＣは、固体支持体上での慣用的なホスホルアミダイト化学を用いて調製した。ホスホルアミダイトは、Glen Research から購入し、アセトニトリル中０．１Ｍ溶液として使用した。ＲＮＡであるＲは、その開示が参照により本明細書中にその全体が組み込まれる、Wincott ら，Nucl. Acids Res.，1995，23，2677-2684 に与えられた手順に従って調製した。ＲＮＡであるＣは、標準カップリングサイクルを用いて調製し、脱保護して、１０ＭＮＨ4 ＯＡｃから沈殿させた。そのアミノグリコシドパロモマイシンは、Ｒ及びＣの両方にそれぞれ０．２５及び０．４５マイクロモルのｋＤ値で結合する。報告されたｋＤ値は、０．２μＭ付近である。Recht ら，J. Mol. Biol. ，1996，262 ，421-436 、Wongら，Chem. Biol. ，1998，5 ，397-406 、及び Wang ら，Biochemistry，1997，36，768-779 。パロモマイシンは、２７量体モデルＲＮＡの主要な溝において結合し、Ａ１４０８、Ｇ１４９４、及びＧ１４９１への接触でコンフォメーションの変化を誘発することが以前に示されている。Miyaguchi ら，Nucl. Acids Res.，1996，24，3700-3706 ；Fourmyら，Science ，1996，274 ，1367-1371 ；及びFourmyら，J. Mol. Biol. ，1988，277 ，333-345 。
１２５ｎＭのパロモマイシンと混ぜられたＣの５μＭ溶液から得られる質量スペクトル（図２８Ａ）は、ｍ／ｚ１７８３．６におけるフリーのＣからの［Ｍ−５Ｈ］5-イオン及びｍ／ｚ１９０７．３におけるパロモマイシン−Ｃ複合体の［Ｍ−５Ｈ］5-イオンを含有する。質量分析法実験は、陰イオン化様式で作動するＬＣＱ四重極イオントラップ質量分析計（Finnigan；サンホゼ，ＣＡ）で行った。ＲＮＡ及びリガンドを、脱保護過程を補助するために添加されたイソプロピルアルコール（１：１ｖ：ｖ）を伴うｐＨ７．０の１５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液中に溶解させた。ペアレントイオンを１．５ｍ／ｚ窓（window）で単離し、そのエンドキャップ（end cap ）に適用されたＡＣ電圧を、そのペアレントイオンの約７０％が解離するまで増加させた。電子スプレーニードル電圧を３．５ｋＶまでに調整し、スプレーを５０ｐｓｉのガス圧（６０：４０Ｎ2 ：Ｏ2 ）で安定させた。キャピラリーインターフェースを１８０℃の温度まで熱した。イオントラップ中のＨｅガス圧は１ｍＴｏｒｒであった。ＭＳ−ＭＳ実験において、望ましいｍ／ｚを有する１．５Ｄａ窓内のイオンを、共鳴排出を経て選択し、ｑ）０．２で蓄積した。励起ＲＦ電圧をそのエンドキャップに３０ｍｓ適用し、マニュアルで１．１Ｖｐｐまで増加させて、ペアレントイオンの強度を最小化して最も高い存在量のフラグメントイオンを生じさせた。合計１２８スキャンをｍ／ｚ７００〜２７００にわたって行い、続いて１００ｍｓトラッピングした。Ｃ及びその複合体の［Ｍ−４Ｈ］4-イオンからのシグナルは、それぞれｍ／ｚ２２２９．８及び２３８４．４において検出される。トリプロピルアミンで変性されたサンプルから観察されるような、より高度に荷電されたイオンからのシグナルは観察されない。天然の及び変性されたタンパク質の検討との類推において、このことは、Ｃ及びそのパロモマイシン複合体についてのより密な構造と合致する。Ｃの［Ｍ−５Ｈ］5-イオンから得られたＣＡＤ質量スペクトルを図２８Ｂに示す。フラグメントイオンは、ｍ／ｚ１００５．６（ｗ6 ）2-、１０６５．８（ａ7 −Ｂ）2-、１１６２．６（ｗ7 ）2-、１７５６．５（Ｍ−Ａｄ）５−、２１０８．９（ｗ21−Ａｄ）3-、２１５３．４（ａ20−Ｂ）3-、２２１７．８（ｗ21）3-、及び２２５８．３（ａ21−Ｂ）3-において検出される。McLuckeyら，J. Am. Soc. Mass Spectrum.，1992，3 ，60-70 及びMcLuckeyら，J. Am. Chem. Soc. ，1993，115 ，12085-12095 。これらのフラグメントイオンは全て、３つのデオキシアデノシン残基からのアデノシンの喪失とそれに続く３' −Ｃ−Ｏ糖結合の開裂の結果生じたものである。同じ活性化エネルギーで得られるＣとパロモマイシンの間の複合体の［Ｍ−５Ｈ］5-イオンについてのＣＡＤ質量スペクトルを図２８Ｃに示す。フラグメントイオンは、図２８Ｂの同一の解離条件を用いたデオキシアデノシン部位における鎖開裂からは検出されない。パロモマイシンの結合によって観察されるフラグメンテーションパターンにおける変化は、そのヌクレオチドの衝突活性化及び解離を妨げるＡ１４９２、Ａ１４９３、及びＡ１４０８の局部電荷分布、コンフォメーション、又は移動度における変化と一致する。
ＤＭＳＯ中に溶解された２１６のテトラアザシクロファンを含有する２のコンビナトリアルライブラリーを１０μＭのＣを含有する緩衝化液と混ぜて、各ライブラリーメンバーが１００ｎＭで存在するようにした。得られる質量スペクトルは、Ｃとライブラリーメンバーとの間の同じ理論質量を有する複合体を１０より多く現す。第１ライブラリーからの最も豊富な複合体からのイオン（［Ｍ−５Ｈ］5-；ｍ／ｚ１９１９．０）を単離して解離させた。図２９Ａに示すように、この複合体の解離は、各ｄＡ残基における開裂から生ずるｍ／ｚ１００６．１、１０６５．６、及び１１６２．４における３つのフラグメントイオンを発生させる。より強いシグナルがｍ／ｚ２３７８．９、２４４３．１、及び２４８３．１において観察される。これらイオンは、６７６．０＝０．６Ｄａの質量を有するライブラリーメンバーに結合した、ｗ21 (3-)、ａ20−Ｂ(3-)、及びａ21−Ｂ(3-)フラグメントに相当する。それらフラグメントイオンの相対的な存在量は、複合化されていないＣについて観察されるパターンと類似しているが、より低いステム及びテトラループからのイオンの質量は、そのリガンドとの複合化によりシフトされる。このリガンドは、そのデオキシアデノシン残基の保護を殆ど提供しないので、より低いステム−ループに結合するに違いない。それらライブラリーは、荷電された芳香族官能基の混合物から合成され、ライブラリー２５及び２３として記載される：Anら，Bioorg. Med. Chem. Lett.，1998，印刷中。同じ衝突エネルギーを有する、Ｃと、ｍ／ｚ１９３４．３を有する第２ライブラリーとの混合物からの最も豊富な複合体の解離（図２９Ｂ）は、殆どフラグメントイオンをもたらさず、有力なシグナルは無傷の複合体と中性アデノシンの喪失から生まれる。そのリガンドの質量（７５３．５Ｄａ）は、官能基の２つの組合せを有するライブラリー中の６の可能な化合物と矛盾がない。この複合体からのアデノシンの開裂及び喪失の低下レベルは、パロモマイシンがそうであるように、そのリガンドのモデルＡ部位領域における結合と矛盾がない。第２ライブラリーは、５μＭにおける転写／翻訳を阻害し、Ｅ．ｃｏｌｉ（ｉｍｐ−）及びＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに対して２〜２０μＭのＭＩＣを有する。
質量スペクトルに基づいたアッセイは、ＲＮＡ及び小分子の間の複合体の同定に多くの利点を提供する。アッセイ混合物中の全ての構成要素は固有質量タグを持っているので、放射性又は蛍光性タグでの追加の修飾は、複合体の形成を検出するのに必要ではない。リガンドの化学組成は、その複合体の測定された分子質量から突きとめることができ、ライブラリーの迅速なデコンボリューション（deconvolution ）がＲＮＡ標的に対するリード（lead）を同定するのを可能にする。キメラオリゴリボヌクレオチドへのデオキシヌクレオチドの取り込みは、衝突活性化解離が起こり易い一連の不安定な部位を生ずる。それら不安定な部位におけるリガンドの結合は、ＭＳ−ＭＳ実験において観察されるＣＡＤからの保護を与える。本発明のこの質量分析法に基づいた保護法は、追加の化学試薬又はＲＮＡの放射性識別についての必要無しに小分子リガンドについての結合部位を確立するために使用することができる。その方法論は、ＤＮＡ配列決定及びゲノム欠陥の同定においても使用することができる。
本発明の好ましい態様に従えば、標的生体分子及び推定リガンドの間の結合の高い精度の確定が望まれる。一定の質量分析法の技術がそのような向上を生じさせることが分かった。理解されであろうが、標的生体分子は、スペクトルで分析されるべきサンプル中に常に過剰に存在するであろう。同様に、そのような標的の正確な組成は知られているであろう。従って、その標的に由来するペアレント（又は他の）イオンの同位体存在量は正確に知られるであろう。
好ましい態様に従えば、質量スペクトルのデータを、推定又は試験用リガンドの１又はそれより多い混合物と、好ましくは１の混合物と接触される標的生体分子（又は複数の生体分子）を含んでなるサンプルから収集する。そのような化合物の混合物は、本明細書中の他のところに記載したようにかなり複雑であり得る。得られる質量スペクトルも複雑であろうが、その標的生体分子のシグナルの典型は、容易に同定されるであろう。そのようなピークについてのＭ／ｅは正確に知られているので、その標的分子についての同位体ピークを同定し、そのように収集された質量スペクトルのデータを内部較正するために使用することが好ましい。その結果、その標的とそれに結合したリガンドとの間の複合体を表わすピークの正確な質量シフト（その標的シグナルに関する）を決定することが可能となる。正確な質量シフト（通常、正確な数点）が与えられると、前記リガンドの正確な分子量を決定することができる。正確な分子量を使用して、その標的に実際に結合したリガンドの正体を確認することが好ましい。
他の好ましい態様に従えば、収集された情報を関連するか又は他のデータベースに載せることができ、そのデータベースから、その標的生体分子に結合しているリガンドに関する更なる情報を抽出することができる。このことは、その標的に結合することが見出された化合物の結合親和性が決定されて、そのデータベースに含められるときに特に当てはまる。相対的に高い結合親和性を有する化合物を、そのデータベースに含有されるそのような情報に基づいて選択することができる。
そのようなデータコレクション及びデータベース操作は一般的用途のデジタルコンピューターを通じて達成されることが好ましい。例示的なソフトウェアプログラムが造られ、ＲＮＡ標的に結合した小さい分子を同定し、その結合定数を算定し、そしてそれら結果を相関データベースに記録するために使用されている。そのプログラムは、検討される混合物中に存在するＲＮＡ及び小分子の元素式及びその溶液中のそれらの濃度をリストするファイルを入力するときに使用する。まず、そのプログラムは、各可能性のある複合体の最も豊富な荷電状態についての予測される同位体ピーク分布を算定し、次いで、生のＦＴＭＳ結果のファイルを開く。そのプログラムはその生データの速いフーリエ変換を行い、質量軸を較正し、そして図３０に示す例示的なスペクトルのような得られるスペクトルにおけるシグナルを集積する。そのスペクトル中のピークは、好ましくは、図３１に示すように面心化（centroiding ）を経て同定され、積分され、そして好ましくは、データベースに蓄積される。例示的なデータファイルを図３２に示す。予測されるピーク及び観察されるピークは相関しており、それら積分は、内部標準の強度に基づいた結合定数に転換される。化合物の正体及び結合定数データは相関データベースに記録される。このアプローチは、質量分析計によりもたらされる多量のデータを人の介入無しに分析することを可能とし、有意な時間の節約をもたらす。
図３０は、１６ＳＲＮＡ（Ｉｂｉｓ１６６２８）が５ｍＭ及びリガンドＩｂｉｓ１００１９が５００ｎＭの溶液の電子スプレーイオン化フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析を描いたものである。未処理の時間変域データセットを、フーリエ変換の前に、２回自動でアポダイズして（apodize ）ゼロ挿（zerofill）する。そのスペクトルを、そのフリーのＲＮＡの（Ｍ−５Ｈ+ ）5-及び（Ｍ−４Ｈ+ ）4-荷電状態の多数の同位体ピークを内部質量標準として用い、フリーの及び結合されたＲＮＡの間のｍ／ｚ差を測定して、自動で後較正する。そのフリーのＲＮＡの同位体分布を仮定で算定し、測定された分布を算定された分布に適合させて、ｍ／ｚの差が、均一同位体種の間に測定されること（例えば、一同位体ピーク又は４Ｃ13原子を含有する同位体ピーク）を保証する。
図３１は、ＲＮＡ−リガンド複合体が予測されるｍ／ｚ範囲において観察される同位体クラスターを示し、ピーク面心化及び積分により更に分析される。図３２は、相関データベースにおいて表にされ蓄積されたデータの図である。ＲＮＡ標的及びリガンドの間の複合体に相当するピークをぞのデータベースに割り当て記録する。内部親和性標準を使用する場合、比Ｋｄは、標準複合体及び未知の複合体の相対的存在量から自動で算定され、データベースに記録される。図３３は、本発明の一定の側面を実現するための一つのコンピュータープログラムについてのフローチャートの図である。
前述の情報のコンピューター制御されたコレクションが提供され、相関データベースのコンピューター制御が使用される場合、本発明は、質量スペクトル法による結合情報の非常に高い処理量の分析が可能である。そのような制御は、標的生体分子についての高い結合親和性を有するリガンドの同定を容易にする。こうして、自動化は、特にその標的の質量が内部較正の目的のために使用される際に、結合リガンド又は複数のリガンドの質量の自動計算を可能とする。結合リガンドの正確な質量から、それらの正体を自動化されたやり方で確認することができる。また、そのリガンド−標的相互作用についての解離定数を、参照となる複合体か、又は異なる標的／リガンド比における多数の測定での適定によるかの何れかの既知のＫｄ及び存在量を用いて突きとめることができる。更に、タンデム質量分析法による分析は、標的との小さい分子、リガンド、相互作用の部位をフラグメンテーション分析を通じて突きとめることができるように、自動化された仕方で行うことができる。コンピューター入力及び相関データベースからの出力は、もちろん好ましい。
図１は、１６Ｓ ｒＲＮＡ Ａ部位に相当する２７量体ＲＮＡ標的の配列および構造を示す。 図２ａは、パロモマイシンの存在下での２７量体ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＥＳＩ−ＣＩＤ−ＭＳを示す。 図２ｂは、パロモマイシンの不存在下での２７量体ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＥＳＩ−ＣＩＤ−ＭＳを示す。 図３ａは、パロモマイシン単独の存在下での２７量体ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド標的のＥＳＩ−ＭＳを示す。 図３ｂは、パロモマイシンおよびコンビナトリアルライブラリー両方の存在下での２７量体ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド標的のＥＳＩ−ＭＳを示す。 図４は、ｍ／ｚ１９１９．０のコンビナトリアルライブラリーメンバー・２７量体ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド非共有複合体のＥＳＩ−ＣＩＤ−ＭＳスペクトルを示す。 図５は、２７量体ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに対しスクリーニングしたコンビナトリアルライブラリーのＥＳＩ−ＭＳを示す。 図６は、別のコンビナトリアルライブラリー由来の質量６６５のメンバーの結合から生じた、ｍ／ｚ１９１７．８ｕのシグナルのＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳ分析を示す。 図７は、ライブラリー由来の質量７２０のメンバーの結合から生じた、ｍ／ｚ１９３４．３ｕのシグナルのＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳ分析を示す。 図８ａは、ＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖由来のイオンの（ＣＩＤ）から生じたｗおよびａ−塩基イオンの存在量をグラフで示す。 図８ｂは、ＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖由来のイオンの（ＣＩＤ）から生じたｗおよびａ−塩基イオンの存在量をグラフで示す。 図９は、ＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖由来のイオンの（ＣＩＤ）から生じたｗおよびａ−塩基イオンの存在量をグラフで示す。 図１０は、分子相互作用部位に対するリガンドの結合を測定するＭＡＳＳ分析を示す。 図１１は、分子相互作用部位に対するリガンドの結合を測定するＭＡＳＳ分析を示す。 図１２は、分子相互作用部位に対するリガンドの結合を測定するＭＡＳＳ分析を示す。 図１３は、パロモマイシンと複合体を形成しているＲＮＡの１６Ｓ Ａ部位の相互作用の非常に正確なＥＳＩ−ＦＴＩＣＲ質量測定を示す。 図１４は、１６Ｓ ＲＮＡモデル（１０μＭ）および６０メンバーのコンビナトリアルライブラリーの混合物から得られるＦＴＭＳスペクトルを示す。 図１５は、図１５由来の１８６３複合体の拡大した図を示す。 図１６は、化合物の出発ライブラリーから測定された結合リガンドの質量を示す。 図１７は、図１５および１６で用いられたライブラリーの高分解度ＥＳＩ−ＦＴＩＣＲスペクトルを示す。 図１８は、例示的な「未知の」結合リガンドの基本的な組成を決定するための、正確な質量測定の使用および基本的な制約を示す。 図１９は、異なる濃度のリガンドで、一定の濃度のＲＮＡを含む溶液のＥＳＩ−ＭＳ測定を示す。 図２０は、タンデム質量分析によるリガンド結合部位の決定のための、好ましい図式を示す。 図２１は、原核１６Ｓ Ａ部位に相当する２７量体ＲＮＡ構築物に対する２７メンバーのライブラリーのＭＡＳＳスクリーニングを示す。 図２２ａは、パロモマイシン結合部位でデオキシアデノシン残基を含む原核１６Ｓ Ａ部位に相当する２７量体ＲＮＡ構築物のＭＳ／ＭＳを示す。 図２２ｂは、パロモマイシン結合部位でデオキシアデノシン残基を含む原核１６Ｓ Ａ部位に相当する２７量体ＲＮＡ構築物のＭＳ／ＭＳを示す。 図２３ａは、パロモマイシン結合部位でデオキシアデノシン残基を含む原核１６Ｓ Ａ部位に相当する２７量体ＲＮＡ構築物および２１６メンバーのコンビナトリアルライブラリーの混合物から得られるＭＳ−ＭＳスペクトルを示す。 図２３ｂは、パロモマイシン結合部位でデオキシアデノシン残基を含む原核１６Ｓ Ａ部位に相当する２７量体ＲＮＡ構築物および２１６メンバーのコンビナトリアルライブラリーの混合物から得られるＭＳ−ＭＳスペクトルを示す。 図２４は、本研究に用いられた、１８Ｓ（真核）および１６Ｓ（原核）Ａ部位に相当する２７塩基ＲＮＡモデルの二次構造を示す。 図２５は、５００ｎＭパロモマイシンの存在下で５末端に結合させた１８原子中性質量タグの存在下（７μＭ）および不存在下（１μＭ）の１６Ｓ Ａ部位の２７塩基相当物の混合物のＥＳＩ−ＦＴＩＣＲスペクトルを示す。 図２６は、アミノグリコシドの混合物に対する１６Ｓ Ａ部位および１８Ｓ Ａ部位モデルＲＮＡの同時スクリーニング由来の質量スペクトルを示す。 図２７は、オリゴヌクレオチドＲおよびＣの配列および構造を示す。 図２８ａは、５μＭのＣおよび１２５ｎＭのパロモマイシンの混合物から得られた質量スペクトルを示す。 図２８ｂは、複合体化されていないＣ由来の[ Ｍ−５Ｈ]5- イオン（ｍ／ｚ１７８３．６）の単離後に得られるＭＳ−ＭＳスペクトルを示す。 図２８ｃは、パロモマイシンと複合体を形成しているＣ由来の[ Ｍ−５Ｈ]5- イオン（ｍ／ｚ１９０７．５）の単離後に得られるＭＳ−ＭＳスペクトルを示す。 図２９ａは、質量６７６．０±０．６のリガンドと複合体を形成しているＣ由来の[ Ｍ−５Ｈ]5- イオン（ｍ／ｚ１９１９．０）の単離後に１０μＭのＣおよび２１６メンバーのコンビナトリアルライブラリーの混合物から得られるＭＳ−ＭＳスペクトルを示す。 図２９ｂは、質量７５３．５±０．６のリガンドと複合体を形成しているＣ由来の[ Ｍ−５Ｈ]5- イオン（ｍ／ｚ１９３４．３）の単離後、１０μＭのＣおよび２１６メンバーのコンビナトリアルライブラリーの混合物から得られるＭＳ−ＭＳスペクトルを示す。 図３０は、標的／推定上のリガンド混合物の電子スプレーイオン化フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析を示す。 図３１は、図３０のスペクトル由来の同位体クラスターを示す。 図３２は、表にまとめられ、そして関連データベースに保存されたデータを示す。 図３３は、本発明に一致した特定の方法を達成するためのコンピュータープログラムのための典型的なフローチャートを示す。

Claims (33)

  1. リガンドについての生体分子標的上の結合部位を同定するための方法であって：
    （ａ）前記生体分子標的のキメラ体であって、前もって選択された位置に１若しくはそれより多いデオキシヌクレオチド又は１若しくはそれより多い修飾核酸残基を含んでなるキメラ体についての質量スペクトルのフラグメンテーションデータを収集すること；
    （ｂ）前記生体分子標的のキメラ体及び前記リガンドの複合体を提供すること；
    （ｃ）前記複合体を質量分析計でイオン化して、前記複合体の１又はそれより多いイオンを提供すること；
    （ｄ）該複合体から誘導される前記イオンの少なくとも１をフラグメント化すること；
    （ｅ）該複合体からの該イオンの前記フラグメンテーションからフラグメンテーションデータを収集して、前記フラグメンテーションデータが改変された切断パターンを提供すること；及び
    （ｆ）該複合体の該イオンの該フラグメンテーションデータを該生体分子標的のキメラ体からの該フラグメンテーションデータと関連させて、前記結合の部位を決定すること
    を含んでなる方法。
  2. 生体分子標的が核酸である、請求項１記載の方法。
  3. 生体分子標的がＲＮＡである、請求項１記載の方法。
  4. ＲＮＡが１６ＳｒＲＮＡ Ａ部位に相当する、請求項３記載の方法。
  5. 生体分子標的が核酸部分である、請求項１記載の方法。
  6. 生体分子標的のキメラ体についての質量スペクトルのフラグメンテーションデータが、
    （ｉ）前記生体分子標的のキメラ体を質量分析計でイオン化して、前記生体分子標的の１又はそれより多いイオンを提供すること；及び
    （ｉｉ）前記イオンの少なくとも１を質量分析計でフラグメント化すること
    により提供される、請求項１記載の方法。
  7. 複合体のイオン化が、電子スプレーイオン化、大気圧イオン化又はマトリックス介助デソープションレーザーイオン化を通じて達成される、請求項１記載の方法。
  8. イオンフラグメンテーションが、四重極、三重四重極、磁気セクター、イオントラップ、イオンサイクロトロン共鳴又は飛行時間質量分析法を行うことが可能な質量分析計内で起こる、請求項１記載の方法。
  9. イオンフラグメンテーションが衝突誘発解離を包含する、請求項１記載の方法。
  10. イオンフラグメンテーションが赤外多光子解離を包含する、請求項１記載の方法。
  11. 複合体が、生体分子標的及びリガンドを一緒に組合せることにより提供される、請求項１記載の方法。
  12. 生体分子標的のキメラ体であって、前もって選択された位置に１若しくはそれより多いデオキシヌクレオチド又は１若しくはそれより多い修飾核酸残基を含んでなるキメラ体についての結合物質の相対的結合親和性を決定するための方法であって：
    （ａ）前記生体分子標的のキメラ体についての質量スペクトルのフラグメンテーションデータを収集すること；
    （ｂ）前記生体分子標的及び前記結合物質の第１複合体を提供すること；
    （ｃ）前記第１複合体を質量分析計でイオン化して、前記第１複合体の少なくとも１又はそれより多いイオンを提供すること；
    （ｄ）工程（ｃ）の該イオン化からの質量スペクトルのフラグメンテーションデータを収集し、そこから前記第１複合体の該イオン存在量を同定すること；
    （ｅ）前記生体分子標的と、前記生体分子標的に結合する標準結合化合物との第２複合体を提供すること
    （ｆ）前記第２複合体を質量分析計でイオン化して、前記第２複合体の１又はそれより多いイオンを提供すること；
    （ｇ）工程（ｆ）の該イオン化からの質量スペクトルのフラグメンテーションデータを収集し、そこから前記第２複合体の該イオン存在量を同定すること
    を含んでなり、前記フラグメンテーションデータが改変された切断パターンを提供し、そして前記第１及び第２複合体の相対的な該イオン存在量が前記相対的結合親和性の尺度を与える方法。
  13. 第１及び第２複合体のイオン存在量を比較して、相対的結合親和性を同定する、請求項１２記載の方法。
  14. 生体分子標的が核酸である、請求項１２記載の方法。
  15. 核酸がＲＮＡである、請求項１４記載の方法。
  16. ＲＮＡが１６ＳｒＲＮＡＡ部位に相当する、請求項１５記載の方法。
  17. 生体分子標的が核酸部分である、請求項１２記載の方法。
  18. イオン化が、電子スプレーイオン化、大気圧イオン化又はマトリックス介助レーザーデソープションイオン化を通じて達成される、請求項１２記載の方法。
  19. コンビナトリアルライブラリーからの諸化合物についての生体分子標的の結合部位を同定するための方法であって：
    （ａ）前記生体分子標的についての質量スペクトルのフラグメンテーションデータを提供すること；
    （ｂ）前記生体分子標的と、前記標的に結合する標準結合化合物との第１複合体を提供すること；
    （ｃ）諸化合物のコンビナトリアル混合物を前記第１複合体と組合せること；
    （ｄ）工程（ｃ）からの前記組合せ体を質量分析計でイオン化して、前記組合せ体についての複数のイオンを提供すること；
    （ｅ）前記イオンの少なくとも１を質量分析計でフラグメント化して、改変されたフラグメンテーションパターンデータを生ずること；
    （ｆ）前記生体分子標的について収集された該フラグメンテーションデータ及び工程（ｄ）からの該イオン化された組合せ体を関連させて、前記同定を与えること
    を含んでなる方法。
  20. 生体分子標的及び組合せ体についての質量スペクトルのデータを比較して結合部位を同定する、請求項１９記載の方法。
  21. 生体分子標的が核酸である、請求項１９記載の方法。
  22. 核酸がＲＮＡである、請求項２１記載の方法。
  23. 生体分子標的についてのコンビナトリアル混合物中の諸化合物の相対的結合親和性を決定するための方法であって：
    （ａ）前記生体分子標的のキメラ体であって、前もって選択された位置に１若しくはそれより多いデオキシヌクレオチド又は１若しくはそれより多い修飾核酸残基を含んでなるキメラ体についての質量スペクトルのフラグメンテーションデータを収集すること；
    （ｂ）前記生体分子標的のキメラ体と、前記標的に結合する標準結合化合物との第１複合体を提供すること；
    （ｃ）諸化合物のコンビナトリアル混合物を前記第１複合体と組合せ、その際、前記コンビナトリアル混合物からの前記諸化合物の１又はそれより多くが前記生体分子標的と優先的に結合して、第２複合体が提供されること；
    （ｄ）工程（ｃ）の前記組合せ体を質量分析計でイオン化して、複数のイオンを提供すること；
    （ｅ）工程（ｄ）の該イオン化からの質量スペクトルのフラグメンテーションデータを収集し、その中の前記第１及び第２複合体についてのイオン存在量を同定すること
    を含んでなり、前記フラグメンテーションデータが改変された切断パターンを提供し、そして前記第１及び付加的な複合体の該イオン存在量が前記相対的結合親和性を同定するための情報を与える方法。
  24. 第１及び付加的な複合体のイオン存在量を比較して、相対的結合親和性を同定する、請求項２３記載の方法。
  25. 生体分子標的が核酸である、請求項２３記載の方法。
  26. 結合部位が金属イオン結合部位である、請求項１記載の方法。
  27. 金属イオンがアルカリ金属又はアルカリ土類金属である、請求項２６記載の方法。
  28. 金属イオンが、Ｎａ+、Ｍｇ+2、及びＭｎ+2からなる群から選択される、請求項２７記載の方法。
  29. 結合部位が金属イオン結合部位である、請求項１９記載の方法。
  30. 金属イオンがアルカリ金属又はアルカリ土類金属である、請求項２９記載の方法。
  31. 金属イオンが、Ｎａ+、Ｍｇ+2、及びＭｎ+2からなる群から選択される、請求項３０記載の方法。
  32. 少なくとも１の結合物質及び生体分子標的の絶対的結合親和性を決定することを更に含んでなる、請求項１記載の方法。
  33. 少なくとも１の結合物質及び生体分子標的の絶対的結合親和性を決定することを更に含んでなる、請求項１９記載の方法。
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