JP2004321015A - 老化促進および免疫不全症のモデル動物 - Google Patents
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Abstract
【課題】広く老化促進や免疫不全症などの病態のモデルとして有用な遺伝子変異動物を提供する。
【解決手段】ＡＰエンドヌクレアーゼであるＡＰＥＸ２酵素をコードする遺伝子が欠損している非ヒト哺乳動物、特にマウス。ＡＰＥＸ２酵素をコードする遺伝子がその機能欠損型遺伝子に置換されているＥＳ細胞を用いて作製される。自然ＤＮＡ損傷に起因する発育遅延を呈し、且つ、該損傷に因る障害に感受性が高く免疫担当の細胞の減少が顕著であるので、老化促進や免疫不全などに関与する多くの病態のモデルとして有用である。
【選択図】 図２
【解決手段】ＡＰエンドヌクレアーゼであるＡＰＥＸ２酵素をコードする遺伝子が欠損している非ヒト哺乳動物、特にマウス。ＡＰＥＸ２酵素をコードする遺伝子がその機能欠損型遺伝子に置換されているＥＳ細胞を用いて作製される。自然ＤＮＡ損傷に起因する発育遅延を呈し、且つ、該損傷に因る障害に感受性が高く免疫担当の細胞の減少が顕著であるので、老化促進や免疫不全などに関与する多くの病態のモデルとして有用である。
【選択図】 図２
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子変異動物を作製する技術分野に属し、特に、特定の酵素をコードする遺伝子が欠損しており老化促進や免疫不全症などのモデルとして有用な新規な非ヒト哺乳動物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トランスジェニックマウスおよびノックアウトマウスに代表される遺伝子変異動物は、特定の遺伝子を人為的に導入したり欠損（破壊）させることによりその遺伝子の関与する表現型の変化を直接観察することができ、その解析を通して新しい薬剤や治療法の開発に資するものとして各種のモデルマウス等が提案されている。
【０００３】
老化や免疫不全は新規な薬剤や治療法の開発にきわめて重要な表現型と考えられるが、特定の遺伝子との関連においてこれらの表現型を直接の対象として案出されたモデル動物は意外に少ない。例えば、特表２００１−５１３９９１号公報（特許文献１）には、腫瘍サプレッサーであるＢＲＣＡ２が減損した非ヒトトランスジェニック動物が早期複製老化のモデルとして有用であることが開示され、また、特許第３３２６７７０号公報（特許文献２）にはＲＡＧ２をコードする遺伝子を欠損している非ヒト哺乳動物が自己免疫疾患のモデル動物として有用であることが開示されている程度である。この他に、特定の病態を対象とするモデルマウス等は多数提案されているが、老化促進および免疫不全症の研究一般に適用でき、それらの対する薬剤や治療法の開発に有用性が期待されるようなマウス等のモデル動物は殆ど見当らない。
【特許文献１】特表２００１−５１３９９１号
【特許文献２】特許第３３２６７７０号
【非特許文献１】Ｂ． Ｄｅｍｐｌｅ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８ （１９９１） １１４５０−１１４５４
【非特許文献２】Ｃ． Ｎ． Ｒｏｂｓｏｎ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９ （１９９１） ５５１９−５５２３
【非特許文献３】Ｓ． Ｓｅｋｉ他、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｓｃ． Ａｃｔａ １１３１ （１９９２） ２８７−２９９
【非特許文献４】Ｓ． Ｘａｎｔｈｏｕｄａｋｉｓ他、ＥＭＢＯ Ｊ． １１ （１９９２） ６５３−６６５
【非特許文献５】Ｄ． Ｔｓｕｃｈｉｍｏｔｏ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２９ （２００１） ２３４９−２３６０
【非特許文献６】Ｍ． Ｚ． Ｈａｄｉ他、Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｏｌ． Ｍｕｔａｇｅｎ． ３６ （２０００） ３１２−３２４
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、広く老化促進や免疫不全症などの多くの病態のモデルとして有用な新しいタイプの遺伝子変異動物を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、研究を重ねた結果、ＡＰエンドヌクレアーゼの１種である酵素が欠損（破壊）した哺乳動物が老化促進や免疫不全症のモデルとして好適な表現型を呈することを見出し、本発明を導き出したものである。
【０００６】
かくして、本発明に従えば、ＡＰエンドヌクレアーゼであるＡＰＥＸ２酵素をコードする遺伝子が欠損していることを特徴とする非ヒト哺乳動物が提供される。本発明の特に好ましい態様においては非ヒト哺乳動物はマウスであり、ＡＰエンドヌクレアーゼであるマウスＡＰＥＸ２酵素をコードする遺伝子が欠損していることを特徴とするマウスが提供される。
【０００７】
本発明に従えば、さらに、上記の非ヒト哺乳動物の作製に使用されるものとして、ＡＰエンドヌクレアーゼであるＡＰＥＸ２酵素をコードする遺伝子がその機能欠損型変異遺伝子に置換されていることを特徴とする非ヒト哺乳動物由来のＥＳ細胞が提供され、特に好ましい態様としてマウス由来の当該ＥＳ細胞が提供される。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明に従うモデル動物として主としてノックアウトマウスの場合に沿ってその作製法や材料等に関して本発明の実施の形態を説明する。
ＡＰＥＸ２酵素 本発明において遺伝子欠損（破壊）の対象となるＡＰＥＸ２とは、塩基除去修復（ＢＥＲ： Ｂａｓｅ Ｅｘｃｉｓｉｏｎ Ｒｅｐａｉｒ）に関与するＡＰエンドヌクレアーゼに属する酵素の１種である。
【０００９】
ＤＮＡ中に生じた損傷塩基や一部の誤対合塩基は特異的なＤＮＡグリコシラーゼにより除去され、生じた脱塩基部位の５’側で脱塩基部位特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（ＡＰエンドヌクレアーゼ）によりリン酸ジエステル結合が切断されることにより塩基除去修復（ＢＥＲ）が進行する。従来より、哺乳動物では主要なＡＰエンドヌクレアーゼとしてＡＰＥＸ１（ＡＰＥ１、ＨＡＰ１、またはＲＥＦ−１と記されることもある）が知られていた〔Ｂ． Ｄｅｍｐｌｅ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８ （１９９１） １１４５０−１１４５４（非特許文献１）；Ｃ． Ｎ． Ｒｏｂｓｏｎ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９ （１９９１） ５５１９−５５２３（非特許文献２）；Ｓ． Ｓｅｋｉ他、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｓｃ． Ａｃｔａ １１３１ （１９９２） ２８７−２９９（非特許文献３）；Ｓ． Ｘａｎｔｈｏｕｄａｋｉｓ他、ＥＭＢＯ Ｊ． １１ （１９９２） ６５３−６６５（非特許文献４）〕。これに対して、本発明者らは、先に、第２のＡＰエンドヌクレアーゼ（ＡＰＥＸ２）をコードするヒトの遺伝子のクローニングに成功している〔Ｄ． Ｔｓｕｃｈｉｍｏｔｏ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２９ （２００１） ２３４９−２３６０（非特許文献５）；Ｍ． Ｚ． Ｈａｄｉ他、Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｏｌ． Ｍｕｔａｇｅｎ． ３６ （２０００） ３１２−３２４（非特許文献６）〕。
【００１０】
ＡＰＥＸ２（ＡＰＥ２）をコードする遺伝子（Ａｐｅｘ２）は、Ｘ染色体上にマップされ、ＡＰＥＸ２はＡＰＥＸ１とホモロジーの高いＮ末端側のＡＰエンドヌクレアーゼドメインに続いてＡＰＥＸ２に特有のＣ末端領域を有している。すなわち、ＡＰＥＸ２のＣ末端領域には、ＤＮＡ合成の足場タンパク質となるＰＣＮＡへの結合モチーフとＤＮＡ複製停止の解除に関わるトポイソメラーゼＩＩＩのＣ末端領域の繰り返し配列にホモロジーを持つ配列が保存されている。大部分のＡＰＥＸ２は細胞の核に局在し、一部がミトコンドリアに局在する。ＰＣＮＡへの結合モチーフを有するので、ＡＰＥＸ２は、ＰＣＮＡ依存性である複製後ＢＥＲに関与するものと考えられるが、その機能の詳細については未だ不明な点も残されている。
【００１１】
Ａｐｅｘ ２遺伝子のｃＤＮＡ 本発明に従いＡＰＥＸ２酵素をコードする遺伝子（Ａｐｅｘ２）が欠損している非ヒト哺乳動物を作製するには、先ず、当該遺伝子のｃＤＮＡを単離することが必要である。マウスの場合、このｃＤＮＡの単離は、例えば次のようにして行なうことができる。
【００１２】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスから作製したマウスの脾臓ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ法によりＡｐｅｘ２遺伝子のｃＤＮＡをクローニングした。ＰＣＲのプライマーとしてヒトのＡＰＥＸ２をコードするｃＤＮＡにホモロジーのあるＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＡ０３２６０８）を用い、また、ベクターとしてはＬａｍｂｄａ ＺＡＰ ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）を用いた。得られるマウスのＡｐｅｘ２遺伝子のｃＤＮＡは、ポリ（Ａ）テールを含めると１９０３個の塩基から成る。そのオープンリーディングフレームは５１６個のアミノ酸残基をコードする１５４８個の塩基から成り、これはヒトのＡＰＥＸ２をコードするｃＤＮＡに比べて６塩基分短い。このマウスのＡｐｅｘ２遺伝子のｃＤＮＡは、配列番号１として末尾の配列表に記しており、また、本発明者によりＧｅｎＢａｎｋのデータライブラリーにアクセションＮｏ． ＡＢ０７２４９８として登録している。
他の動物についても同様の操作によりそれぞれのＡＰＥＸ２酵素をコードするｃＤＮＡを入手することができる。
【００１３】
Ａｐｅｘ ２遺伝子のゲノムＤＮＡ 本発明に従うノックアウト非ヒト哺乳動物を作製するには、欠損対象となるＡｐｅｘ２遺伝子のゲノムＤＮＡを単離することが必要である。これは、一般に、Ａｐｅｘ２遺伝子のｃＤＮＡ配列に基づくプローブを用いてそれぞれのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより行なわれ、例えば、本発明者が実施した方法によれば、マウスの場合、次のように行なわれる。
【００１４】
既述のようにして得られたマウスのＡｐｅｘ２遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号１）から調製したプローブを用いて、１２９ｖＪマウスのλファージゲノムＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）から３種類のクローン（λｍＡＰＥＸ２Ｍ１−１、Ｏ１−１、Ｑ１−１）を単離した（図１参照）。次に、ＰＣＲ法により、ＣＣＥ ＥＳ細胞のゲノムＤＮＡから、クローンＱ１−１の３’端およびクローンＭ１−１の５’端をカバーするゲノムＤＮＡを増幅しクローニングした（ｐＴ７：ｍＡＰＥＸ２ＥＸ３−６）。この際、用いるプライマーは、既述のマウスＡｐｅｘ２遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号１）にハイブリダイズするものであり、また、ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造製）を用い、ベクターとしては、例えば、ｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ製）を用いる。
【００１５】
得られるマウスＡｐｅｘ２遺伝子のゲノムＤＮＡは、Ｘ染色体６３．０にあるＡｌａｓ２遺伝子に３’端が接しており、長さ１６．５ｋｂで、６つのエキソンから成る。また、このＡｐｅｘ２遺伝子の５’端には、１０６ｂｐの遺伝子間配列から成る新規な遺伝子が接していることも見出されている。マウスＡｐｅｘ２遺伝子の最長のエキソンはエキソン６であり、１１７５ｂｐから成りｃＤＮＡの６２％をカバーし、また、イントロン５は１１．５ｋｂの長さを有し、対応するヒトＡｐｅｘ２遺伝子のもの（２．６５ｋｂ）より長い（図１参照）。このマウスＡｐｅｘ２遺伝子のゲノムＤＮＡは、本発明者により、アクセションＮｏ．ＡＢ０８５２３４およびＮｏ．０８５２３５としてＧｅｎＢａｎｋのデータライブラリーに登録されている。
他の動物についても同様の操作によりそれぞれのＡｐｅｘ２遺伝子のゲノムＤＮＡを単離することができる。既述のマウスＡｐｅｘ２遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号１）は、そのような単離操作におけるプローブとしてきわめて有用である。
【００１６】
Ａｐｅｘ ２遺伝子欠損動物 上記のようにしてＡｐｅｘ２遺伝子のゲノムＤＮＡが得られれば、よく知られたように、その遺伝子の機能を欠損（破壊）するとともに、薬剤で選別し得るように構築したベクターをＥＳ細胞に導入し、もとの遺伝子と相同組換えで置き換えることによって遺伝子が破壊されたＥＳ細胞（Ａｐｅｘ２遺伝子がその機能欠損型変異遺伝子に置換されているＥＳ細胞）を樹立し、このＥＳ細胞を用いて動物個体を作製する。すなわち、ＥＳ細胞が確立されている系に公知の遺伝子ターゲッティング法を適用することによって所望のＡｐｅｘ２遺伝子欠損非ヒト哺乳動物を得ることができる。ＥＳ細胞は、マウスについては古くから確立されており、この他に、ラット（Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １６３（１）： ２８８−２９２， １９９４）、サル（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２（１７）： ７８４４−７８４８， １９９５）、ウサギ（Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ４５（４）： ４３９−４４３， １９９８）などにおいても確立している。したがって、本発明のＡｐｅｘ２遺伝子欠損非ヒト哺乳動物は、これらの動物種を対象に作製することができるが、特に、遺伝子ノックアウト動物の作製に関して技術の蓄積の多いマウスに適用されるのが好ましい。Ａｐｅｘ２遺伝子欠損マウスを作製する具体的方法は、後の実施例に詳述している。
【００１７】
Ａｐｅｘ ２遺伝子欠損の表現型 Ａｐｅｘ２遺伝子欠損マウスに代表される本発明のＡｐｅｘ２遺伝子欠損非ヒト哺乳動物は、老化促進と免疫不全症に関与する表現型を呈することが見出されている。すなわち、Ａｐｅｘ２遺伝子が破壊されたマウスは、当該遺伝子が正常に機能する野生型のものに比べて、顕著な体重増加の遅延を伴なう全身性の発育遅延を示す。また、このＡｐｅｘ２欠損マウスは、野生株に比べて胸腺等の免疫担当臓器の発達不全が著しく、さらに、Ｔ細胞およびＢ細胞（リンパ球）の分化成熟が不全であり、免疫応答時のＴ細胞およびＢ細胞の増殖の活性化が著しく低下している（後述の実施例参照）。これは、Ａｐｅｘ２欠損マウスは、ＤＮＡ中の自然損傷（塩基の酸化、脱塩基等）を修復できず、成長・老化の過程で蓄積したＤＮＡ中の損傷が全身性に発達障害を引き起こし、さらに細胞増殖の最も盛んな免疫担当細胞の分化成熟不全を引き起こすためと考えられる。
【００１８】
【実施例】
以下に、本発明の実施の形態をさらに具体的に示すため実施例を記す。実施例１は、本発明に従うＡｐｅｘ２遺伝子欠損マウスの作製法を例示し、また、実施例２〜５は本発明のＡｐｅｘ２遺伝子欠損マウスに現われる表現型を調べるための実験例である。
実施例１： Ａｐｅｘ ２遺伝子欠損マウスの作製
まずＡｐｅｘ２遺伝子のイントロン５とエキソン６を含むマウスゲノムＤＮＡ断片をプラスミドに挿入、更にイントロン５の一部とエキソン６の一部をネオマイシン耐性遺伝子カセットと置き換え、さらに、単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼのウィルス（ＨＳＶ−ｔｋ）をつないだターゲティングベクターを作成した。このターゲティングベクターをエレクトロポレーションによりマウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）株ＣＣＥに導入、Ｇ４１８抵抗性を指標に相同組換え株を単離した（図２参照）。なお、このＣＣＥ細胞株は研究目的であれば無償配布されており（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， Ｅ． Ｊ． Ｔｅｔｒａｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｉｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ （１９８７）参照）、同等のＥＳ細胞は、例えば、ＡＴＣＣよりＣＲＬ−１１６３２としても入手することができる。単離株はサザンブロット法およびノザンブロット法により標的組換えを確認し、Ａｐｅｘ２遺伝子欠損ＥＳ細胞（ＡＰＥＸ２酵素をコードする遺伝子がその機能欠損型遺伝子に置換されているマウスＥＳ細胞）とした（図３Ａ、Ｂ）。
樹立したＥＳ株は常法に従い、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの胚盤胞に注入し、仮親であるＩＣＲマウスの子宮へ移入した。生まれてきたマウスの中でオスのキメラマウスを選択しメスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配させた。生まれてきたマウスの中で変異Ａｐｅｘ２対立遺伝子を有するアグーチのメスマウスをＦ１世代（Ａｐｅｘ２＋ ／−）とした。
これ以降はＡｐｅｘ２＋ ／−メスマウスとＣ５７ＢＬ／６Ｊオスマウスを交配させることにより戻し交配を続けた。この交配により生まれてくるマウスは、Ａｐｅｘ２遺伝子がＸ染色体上に位置することから，伴性遺伝の法則に従いＡｐｅｘ２＋ ／ ＋メスマウス、Ａｐｅｘ２＋ ／−メスマウス、Ａｐｅｘ２＋オスマウス、Ａｐｅｘ２−オスマウスが各々１：１：１：１の比で生まれてくることが期待される。実際に出生率を調べたところ、４タイプのマウスがほぼ同率の割合で生まれてくることが確認された（図４）。こうして生まれてきたＡｐｅｘ２−オスマウス（Ａｐｅｘ２遺伝子欠損マウス）とＡｐｅｘ２＋オスマウス（野生型マウス）について、以下の実施例２〜５に示すように、その表現型を次のように比較した。
【００１９】
実施例２：マウス表現型１（発育不全）
新生児マウスの体重を測定したところ、Ａｐｅｘ２遺伝子欠損マウス（ＫＯ）の体重は同腹の野生型マウス（ＷＴ）の平均値に対して８２％と低い値を示し、胎生期において既に発育遅延が起きていることが示された（図５Ａ）。
４週齢のＡｐｅｘ２遺伝子欠損マウス１３匹の体重の平均値は同腹野生型マウス１１匹の平均値の約８３％であった（図５Ｂ）。更に８腹由来のＡｐｅｘ２遺伝子欠損マウス７匹と野生型マウス１２匹について２歳齢までの体重変化を調べたところ一貫してＡｐｅｘ２遺伝子欠損マウスの発育遅延を認めた（図５Ｃ）。
４週齢のマウスについて各臓器重量を測定し、体重比の値を比較したところ脾臓、精巣、腎臓、心臓、肺、肝臓、脳の各臓器ではＡｐｅｘ２遺伝子欠損マウスと野生型マウスの間で有意な差を認めなかったが、調べた中では唯一Ａｐｅｘ２遺伝子欠損マウス（ＫＯ）の胸腺重量の体重比の値が野生型マウス（ＷＴ）の値の約５０％と有意に減少していた（図６）。
【００２０】
実施例３：マウス表現型２（胸腺細胞の異常）
Ａｐｅｘ２遺伝子欠損マウス（ＫＯ）の胸腺の組織切片をヘマトキシリン／エオシン（ＨＥ）染色して観察したところ、野生型（ＷＴ）に比べて大型細胞の割合が増加していた（図７）。胸腺より回収した胸腺細胞を顕微鏡下で計数したところ、Ａｐｅｘ２遺伝子欠損マウスでは胸腺細胞数が野生型マウス約２０％と著しく減少していた。更にこの胸腺細胞をヨウ化プロピジウム染色してフローサイトメトリーで解析したところ、Ａｐｅｘ２遺伝子欠損マウスでは小型胸腺細胞の減少が顕著であった（８０．７％→４４．９％）（図８）。更に蛍光強度の比較から細胞周期のＳ期およびＧ２／Ｍ期の細胞集団の比率が各々８．２％から１２．２％へ、９．７％から１９．０％へとＡｐｅｘ２遺伝子欠損マウスにおいて上昇していた（図９）。
次に個体における胸腺細胞のＸ線感受性を調べた。マウスをＸ線照射し、２１時間後に胸腺細胞を回収、生細胞数を計数したところ、Ａｐｅｘ２遺伝子欠損マウスの胸腺細胞の顕著な減少を認め、Ａｐｅｘ２欠損胸腺細胞が野生型に比してＸ線高感受性を示すことが明らかになった（図１０）。
胸腺細胞の分化マーカーをフローサイトメトリーで解析したところ、ＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８−細胞、ＣＤ４−ＣＤ８＋細胞の数は各々野生型の３１％、１７９％、４０％、５０％であった（各２匹の１３週齢マウスのデータ）。さらに、ＣＤ３、４、８トリプルネガティブ細胞に関して調べたところ、トリプルネガティブ細胞数は野生型マウスと同等であったが、そのうちのＣＤ４４＋ＣＤ２５−細胞数が３６．３％に減少していた。一方、ＣＤ４４＋ＣＤ２５＋細胞とＣＤ４４−ＣＤ２５＋細胞は減少しておらず、むしろ若干増加していた。ＣＤ４４−ＣＤ２５−細胞は野生型マウスの２７．８％に減少していた（各２匹の１０週齢マウスのデータ）。
【００２１】
実施例４：マウス表現型３（末梢血リンパ球異常）
末梢血中の白血球数を動物用血球計算装置により計数したところ白血球数の減少を認めた（野生型の５５％）。更に白血球中の各分画をフローサイトメトリーにより解析したところ、Ｔ細胞は野生型の３７％、Ｂ細胞は野生型の４７％まで減少していた。一方ＮＫ細胞数は１７７％に増大していた（各２匹の１５週齢マウスのデータ）。Ｔ細胞中のＣＤ４＋ＣＤ８−／ＣＤ４−ＣＤ８＋比は正常値であった。
【００２２】
実施例５：マウス表現型４（脾臓リンパ球の異常）
Ａｐｅｘ２遺伝子欠損マウスの脾臓細胞数は野生型マウスの６３．２％に減少していた。脾臓細胞の表面マーカーをフローサイトメトリーで解析したところ、脾臓細胞中でのＴ細胞（ＣＤ３＋）とＢ細胞（Ｂ２２０＋）の比率は，野生型マウスでは各々２６．０％、７５．７％であったのに対し、Ａｐｅｘ２遺伝子欠損マウスでも２８．７％、７３．８％と変化は認められなかった。
次に脾臓細胞をＬＰＳまたはコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を添加した培地中で増殖させ、トリパンブルー染色した後に顕微鏡下で観察して計数したところ、Ａｐｅｘ２遺伝子欠損マウス由来脾臓細胞はいずれのマイトジェンの刺激下においても野生型マウス由来脾臓細胞に比べて細胞数が低下していた。この際に死細胞数にはほとんど差が無かった。またＬＰＳ刺激４８時間後、あるいはＣｏｎＡ刺激６０時間後の脾臓細胞の細胞周期をフローサイトメトリーで解析したところいずれもＧ２／Ｍ期の細胞の比率の増加を認めた（図１１）。
【００２３】
【発明の効果】
ＡＰＥＸ２酵素欠損マウスに代表される本発明のＡＰＥＸ２酵素欠損非ヒト哺乳動物は、自然ＤＮＡ損傷に起因すると考えられる発生・発育遅延の表現型を呈し、この全身性の自然ＤＮＡ損傷の修復欠損がもたらす表現型は、胎児の発生遅延、新生児の発育遅延、また老化の促進など多くの病態と関連しており、本発明のＡＰＥＸ２欠損動物は、これらの病態のモデルとしてその治療法や薬剤の開発に有用である。
【００２４】
さらに、ＡＰＥＸ２欠損マウス等の本発明のＡＰＥＸ２欠損非ヒト哺乳動物においては、全身の組織細胞に比較して免疫担当細胞が特に自然ＤＮＡ損傷に起因する障害に感受性が高く、通常から免疫担当細胞の減少が顕著である。このことから、ＡＰＥＸ２欠損マウスに代表される本発明のＡＰＥＸ２欠損動物は、自然ＤＮＡ損傷の修復欠損の結果として特発性の免疫不全症や易感染性のモデルとして有用であり、それらの疾患の治療法や薬剤の開発に資することもできる。
【００２５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に従い欠損対象となるＡｐｅｘ２遺伝子のゲノム上の位置関係（Ａ）およびイントロン／エキソン境界のヌクレオチド配列（Ｂ）を示す。
【図２】本発明に従うＡｐｅｘ２遺伝子欠損ＥＳ細胞を作製するために用いられたターゲティングベクターを正常および変異後の対立遺伝子の位置と対比して示す。
【図３】本発明に従うＡｐｅｘ２遺伝子欠損ＥＳ細胞が樹立されたことを示すデータである。
【図４】本発明に従いＡｐｅｘ２遺伝子欠損マウスが作製されたことを示すデータである。
【図５】本発明に従うＡｐｅｘ２遺伝子欠損マウスが発育不全を呈することを示すデータである。
【図６】本発明に従うＡｐｅｘ２遺伝子欠損マウスにおいては、胸腺が萎縮していることを示すデータである。
【図７】本発明に従うＡｐｅｘ２遺伝子欠損マウスにおいては、通常の細胞が少なく大型細胞の割合が増加することを示すデータである。
【図８】本発明に従うＡｐｅｘ２遺伝子欠損マウスにおける胸腺細胞のサイズを解析して野性型のものと対比して示すデータである。
【図９】本発明に従うＡｐｅｘ２遺伝子欠損マウスにおける胸腺細胞の細胞周期分布を解析して野性型のものと対比して示すデータである。
【図１０】本発明に従うＡｐｅｘ２遺伝子欠損マウスが野性型のものに比べてＸ線照射に対して感受性が高いことを示すデータである。
【図１１】本発明に従うＡｐｅｘ２遺伝子欠損マウスの脾臓細胞のマイトジェンによる活性化の様子を野性型のものと対比して示すデータである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子変異動物を作製する技術分野に属し、特に、特定の酵素をコードする遺伝子が欠損しており老化促進や免疫不全症などのモデルとして有用な新規な非ヒト哺乳動物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トランスジェニックマウスおよびノックアウトマウスに代表される遺伝子変異動物は、特定の遺伝子を人為的に導入したり欠損（破壊）させることによりその遺伝子の関与する表現型の変化を直接観察することができ、その解析を通して新しい薬剤や治療法の開発に資するものとして各種のモデルマウス等が提案されている。
【０００３】
老化や免疫不全は新規な薬剤や治療法の開発にきわめて重要な表現型と考えられるが、特定の遺伝子との関連においてこれらの表現型を直接の対象として案出されたモデル動物は意外に少ない。例えば、特表２００１−５１３９９１号公報（特許文献１）には、腫瘍サプレッサーであるＢＲＣＡ２が減損した非ヒトトランスジェニック動物が早期複製老化のモデルとして有用であることが開示され、また、特許第３３２６７７０号公報（特許文献２）にはＲＡＧ２をコードする遺伝子を欠損している非ヒト哺乳動物が自己免疫疾患のモデル動物として有用であることが開示されている程度である。この他に、特定の病態を対象とするモデルマウス等は多数提案されているが、老化促進および免疫不全症の研究一般に適用でき、それらの対する薬剤や治療法の開発に有用性が期待されるようなマウス等のモデル動物は殆ど見当らない。
【特許文献１】特表２００１−５１３９９１号
【特許文献２】特許第３３２６７７０号
【非特許文献１】Ｂ． Ｄｅｍｐｌｅ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８ （１９９１） １１４５０−１１４５４
【非特許文献２】Ｃ． Ｎ． Ｒｏｂｓｏｎ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９ （１９９１） ５５１９−５５２３
【非特許文献３】Ｓ． Ｓｅｋｉ他、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｓｃ． Ａｃｔａ １１３１ （１９９２） ２８７−２９９
【非特許文献４】Ｓ． Ｘａｎｔｈｏｕｄａｋｉｓ他、ＥＭＢＯ Ｊ． １１ （１９９２） ６５３−６６５
【非特許文献５】Ｄ． Ｔｓｕｃｈｉｍｏｔｏ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２９ （２００１） ２３４９−２３６０
【非特許文献６】Ｍ． Ｚ． Ｈａｄｉ他、Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｏｌ． Ｍｕｔａｇｅｎ． ３６ （２０００） ３１２−３２４
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、広く老化促進や免疫不全症などの多くの病態のモデルとして有用な新しいタイプの遺伝子変異動物を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、研究を重ねた結果、ＡＰエンドヌクレアーゼの１種である酵素が欠損（破壊）した哺乳動物が老化促進や免疫不全症のモデルとして好適な表現型を呈することを見出し、本発明を導き出したものである。
【０００６】
かくして、本発明に従えば、ＡＰエンドヌクレアーゼであるＡＰＥＸ２酵素をコードする遺伝子が欠損していることを特徴とする非ヒト哺乳動物が提供される。本発明の特に好ましい態様においては非ヒト哺乳動物はマウスであり、ＡＰエンドヌクレアーゼであるマウスＡＰＥＸ２酵素をコードする遺伝子が欠損していることを特徴とするマウスが提供される。
【０００７】
本発明に従えば、さらに、上記の非ヒト哺乳動物の作製に使用されるものとして、ＡＰエンドヌクレアーゼであるＡＰＥＸ２酵素をコードする遺伝子がその機能欠損型変異遺伝子に置換されていることを特徴とする非ヒト哺乳動物由来のＥＳ細胞が提供され、特に好ましい態様としてマウス由来の当該ＥＳ細胞が提供される。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明に従うモデル動物として主としてノックアウトマウスの場合に沿ってその作製法や材料等に関して本発明の実施の形態を説明する。
ＡＰＥＸ２酵素 本発明において遺伝子欠損（破壊）の対象となるＡＰＥＸ２とは、塩基除去修復（ＢＥＲ： Ｂａｓｅ Ｅｘｃｉｓｉｏｎ Ｒｅｐａｉｒ）に関与するＡＰエンドヌクレアーゼに属する酵素の１種である。
【０００９】
ＤＮＡ中に生じた損傷塩基や一部の誤対合塩基は特異的なＤＮＡグリコシラーゼにより除去され、生じた脱塩基部位の５’側で脱塩基部位特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（ＡＰエンドヌクレアーゼ）によりリン酸ジエステル結合が切断されることにより塩基除去修復（ＢＥＲ）が進行する。従来より、哺乳動物では主要なＡＰエンドヌクレアーゼとしてＡＰＥＸ１（ＡＰＥ１、ＨＡＰ１、またはＲＥＦ−１と記されることもある）が知られていた〔Ｂ． Ｄｅｍｐｌｅ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８ （１９９１） １１４５０−１１４５４（非特許文献１）；Ｃ． Ｎ． Ｒｏｂｓｏｎ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９ （１９９１） ５５１９−５５２３（非特許文献２）；Ｓ． Ｓｅｋｉ他、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｓｃ． Ａｃｔａ １１３１ （１９９２） ２８７−２９９（非特許文献３）；Ｓ． Ｘａｎｔｈｏｕｄａｋｉｓ他、ＥＭＢＯ Ｊ． １１ （１９９２） ６５３−６６５（非特許文献４）〕。これに対して、本発明者らは、先に、第２のＡＰエンドヌクレアーゼ（ＡＰＥＸ２）をコードするヒトの遺伝子のクローニングに成功している〔Ｄ． Ｔｓｕｃｈｉｍｏｔｏ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２９ （２００１） ２３４９−２３６０（非特許文献５）；Ｍ． Ｚ． Ｈａｄｉ他、Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｏｌ． Ｍｕｔａｇｅｎ． ３６ （２０００） ３１２−３２４（非特許文献６）〕。
【００１０】
ＡＰＥＸ２（ＡＰＥ２）をコードする遺伝子（Ａｐｅｘ２）は、Ｘ染色体上にマップされ、ＡＰＥＸ２はＡＰＥＸ１とホモロジーの高いＮ末端側のＡＰエンドヌクレアーゼドメインに続いてＡＰＥＸ２に特有のＣ末端領域を有している。すなわち、ＡＰＥＸ２のＣ末端領域には、ＤＮＡ合成の足場タンパク質となるＰＣＮＡへの結合モチーフとＤＮＡ複製停止の解除に関わるトポイソメラーゼＩＩＩのＣ末端領域の繰り返し配列にホモロジーを持つ配列が保存されている。大部分のＡＰＥＸ２は細胞の核に局在し、一部がミトコンドリアに局在する。ＰＣＮＡへの結合モチーフを有するので、ＡＰＥＸ２は、ＰＣＮＡ依存性である複製後ＢＥＲに関与するものと考えられるが、その機能の詳細については未だ不明な点も残されている。
【００１１】
Ａｐｅｘ ２遺伝子のｃＤＮＡ 本発明に従いＡＰＥＸ２酵素をコードする遺伝子（Ａｐｅｘ２）が欠損している非ヒト哺乳動物を作製するには、先ず、当該遺伝子のｃＤＮＡを単離することが必要である。マウスの場合、このｃＤＮＡの単離は、例えば次のようにして行なうことができる。
【００１２】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスから作製したマウスの脾臓ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ法によりＡｐｅｘ２遺伝子のｃＤＮＡをクローニングした。ＰＣＲのプライマーとしてヒトのＡＰＥＸ２をコードするｃＤＮＡにホモロジーのあるＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＡ０３２６０８）を用い、また、ベクターとしてはＬａｍｂｄａ ＺＡＰ ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）を用いた。得られるマウスのＡｐｅｘ２遺伝子のｃＤＮＡは、ポリ（Ａ）テールを含めると１９０３個の塩基から成る。そのオープンリーディングフレームは５１６個のアミノ酸残基をコードする１５４８個の塩基から成り、これはヒトのＡＰＥＸ２をコードするｃＤＮＡに比べて６塩基分短い。このマウスのＡｐｅｘ２遺伝子のｃＤＮＡは、配列番号１として末尾の配列表に記しており、また、本発明者によりＧｅｎＢａｎｋのデータライブラリーにアクセションＮｏ． ＡＢ０７２４９８として登録している。
他の動物についても同様の操作によりそれぞれのＡＰＥＸ２酵素をコードするｃＤＮＡを入手することができる。
【００１３】
Ａｐｅｘ ２遺伝子のゲノムＤＮＡ 本発明に従うノックアウト非ヒト哺乳動物を作製するには、欠損対象となるＡｐｅｘ２遺伝子のゲノムＤＮＡを単離することが必要である。これは、一般に、Ａｐｅｘ２遺伝子のｃＤＮＡ配列に基づくプローブを用いてそれぞれのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより行なわれ、例えば、本発明者が実施した方法によれば、マウスの場合、次のように行なわれる。
【００１４】
既述のようにして得られたマウスのＡｐｅｘ２遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号１）から調製したプローブを用いて、１２９ｖＪマウスのλファージゲノムＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）から３種類のクローン（λｍＡＰＥＸ２Ｍ１−１、Ｏ１−１、Ｑ１−１）を単離した（図１参照）。次に、ＰＣＲ法により、ＣＣＥ ＥＳ細胞のゲノムＤＮＡから、クローンＱ１−１の３’端およびクローンＭ１−１の５’端をカバーするゲノムＤＮＡを増幅しクローニングした（ｐＴ７：ｍＡＰＥＸ２ＥＸ３−６）。この際、用いるプライマーは、既述のマウスＡｐｅｘ２遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号１）にハイブリダイズするものであり、また、ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造製）を用い、ベクターとしては、例えば、ｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ製）を用いる。
【００１５】
得られるマウスＡｐｅｘ２遺伝子のゲノムＤＮＡは、Ｘ染色体６３．０にあるＡｌａｓ２遺伝子に３’端が接しており、長さ１６．５ｋｂで、６つのエキソンから成る。また、このＡｐｅｘ２遺伝子の５’端には、１０６ｂｐの遺伝子間配列から成る新規な遺伝子が接していることも見出されている。マウスＡｐｅｘ２遺伝子の最長のエキソンはエキソン６であり、１１７５ｂｐから成りｃＤＮＡの６２％をカバーし、また、イントロン５は１１．５ｋｂの長さを有し、対応するヒトＡｐｅｘ２遺伝子のもの（２．６５ｋｂ）より長い（図１参照）。このマウスＡｐｅｘ２遺伝子のゲノムＤＮＡは、本発明者により、アクセションＮｏ．ＡＢ０８５２３４およびＮｏ．０８５２３５としてＧｅｎＢａｎｋのデータライブラリーに登録されている。
他の動物についても同様の操作によりそれぞれのＡｐｅｘ２遺伝子のゲノムＤＮＡを単離することができる。既述のマウスＡｐｅｘ２遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号１）は、そのような単離操作におけるプローブとしてきわめて有用である。
【００１６】
Ａｐｅｘ ２遺伝子欠損動物 上記のようにしてＡｐｅｘ２遺伝子のゲノムＤＮＡが得られれば、よく知られたように、その遺伝子の機能を欠損（破壊）するとともに、薬剤で選別し得るように構築したベクターをＥＳ細胞に導入し、もとの遺伝子と相同組換えで置き換えることによって遺伝子が破壊されたＥＳ細胞（Ａｐｅｘ２遺伝子がその機能欠損型変異遺伝子に置換されているＥＳ細胞）を樹立し、このＥＳ細胞を用いて動物個体を作製する。すなわち、ＥＳ細胞が確立されている系に公知の遺伝子ターゲッティング法を適用することによって所望のＡｐｅｘ２遺伝子欠損非ヒト哺乳動物を得ることができる。ＥＳ細胞は、マウスについては古くから確立されており、この他に、ラット（Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １６３（１）： ２８８−２９２， １９９４）、サル（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２（１７）： ７８４４−７８４８， １９９５）、ウサギ（Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ４５（４）： ４３９−４４３， １９９８）などにおいても確立している。したがって、本発明のＡｐｅｘ２遺伝子欠損非ヒト哺乳動物は、これらの動物種を対象に作製することができるが、特に、遺伝子ノックアウト動物の作製に関して技術の蓄積の多いマウスに適用されるのが好ましい。Ａｐｅｘ２遺伝子欠損マウスを作製する具体的方法は、後の実施例に詳述している。
【００１７】
Ａｐｅｘ ２遺伝子欠損の表現型 Ａｐｅｘ２遺伝子欠損マウスに代表される本発明のＡｐｅｘ２遺伝子欠損非ヒト哺乳動物は、老化促進と免疫不全症に関与する表現型を呈することが見出されている。すなわち、Ａｐｅｘ２遺伝子が破壊されたマウスは、当該遺伝子が正常に機能する野生型のものに比べて、顕著な体重増加の遅延を伴なう全身性の発育遅延を示す。また、このＡｐｅｘ２欠損マウスは、野生株に比べて胸腺等の免疫担当臓器の発達不全が著しく、さらに、Ｔ細胞およびＢ細胞（リンパ球）の分化成熟が不全であり、免疫応答時のＴ細胞およびＢ細胞の増殖の活性化が著しく低下している（後述の実施例参照）。これは、Ａｐｅｘ２欠損マウスは、ＤＮＡ中の自然損傷（塩基の酸化、脱塩基等）を修復できず、成長・老化の過程で蓄積したＤＮＡ中の損傷が全身性に発達障害を引き起こし、さらに細胞増殖の最も盛んな免疫担当細胞の分化成熟不全を引き起こすためと考えられる。
【００１８】
【実施例】
以下に、本発明の実施の形態をさらに具体的に示すため実施例を記す。実施例１は、本発明に従うＡｐｅｘ２遺伝子欠損マウスの作製法を例示し、また、実施例２〜５は本発明のＡｐｅｘ２遺伝子欠損マウスに現われる表現型を調べるための実験例である。
実施例１： Ａｐｅｘ ２遺伝子欠損マウスの作製
まずＡｐｅｘ２遺伝子のイントロン５とエキソン６を含むマウスゲノムＤＮＡ断片をプラスミドに挿入、更にイントロン５の一部とエキソン６の一部をネオマイシン耐性遺伝子カセットと置き換え、さらに、単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼのウィルス（ＨＳＶ−ｔｋ）をつないだターゲティングベクターを作成した。このターゲティングベクターをエレクトロポレーションによりマウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）株ＣＣＥに導入、Ｇ４１８抵抗性を指標に相同組換え株を単離した（図２参照）。なお、このＣＣＥ細胞株は研究目的であれば無償配布されており（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， Ｅ． Ｊ． Ｔｅｔｒａｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｉｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ （１９８７）参照）、同等のＥＳ細胞は、例えば、ＡＴＣＣよりＣＲＬ−１１６３２としても入手することができる。単離株はサザンブロット法およびノザンブロット法により標的組換えを確認し、Ａｐｅｘ２遺伝子欠損ＥＳ細胞（ＡＰＥＸ２酵素をコードする遺伝子がその機能欠損型遺伝子に置換されているマウスＥＳ細胞）とした（図３Ａ、Ｂ）。
樹立したＥＳ株は常法に従い、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの胚盤胞に注入し、仮親であるＩＣＲマウスの子宮へ移入した。生まれてきたマウスの中でオスのキメラマウスを選択しメスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配させた。生まれてきたマウスの中で変異Ａｐｅｘ２対立遺伝子を有するアグーチのメスマウスをＦ１世代（Ａｐｅｘ２＋ ／−）とした。
これ以降はＡｐｅｘ２＋ ／−メスマウスとＣ５７ＢＬ／６Ｊオスマウスを交配させることにより戻し交配を続けた。この交配により生まれてくるマウスは、Ａｐｅｘ２遺伝子がＸ染色体上に位置することから，伴性遺伝の法則に従いＡｐｅｘ２＋ ／ ＋メスマウス、Ａｐｅｘ２＋ ／−メスマウス、Ａｐｅｘ２＋オスマウス、Ａｐｅｘ２−オスマウスが各々１：１：１：１の比で生まれてくることが期待される。実際に出生率を調べたところ、４タイプのマウスがほぼ同率の割合で生まれてくることが確認された（図４）。こうして生まれてきたＡｐｅｘ２−オスマウス（Ａｐｅｘ２遺伝子欠損マウス）とＡｐｅｘ２＋オスマウス（野生型マウス）について、以下の実施例２〜５に示すように、その表現型を次のように比較した。
【００１９】
実施例２：マウス表現型１（発育不全）
新生児マウスの体重を測定したところ、Ａｐｅｘ２遺伝子欠損マウス（ＫＯ）の体重は同腹の野生型マウス（ＷＴ）の平均値に対して８２％と低い値を示し、胎生期において既に発育遅延が起きていることが示された（図５Ａ）。
４週齢のＡｐｅｘ２遺伝子欠損マウス１３匹の体重の平均値は同腹野生型マウス１１匹の平均値の約８３％であった（図５Ｂ）。更に８腹由来のＡｐｅｘ２遺伝子欠損マウス７匹と野生型マウス１２匹について２歳齢までの体重変化を調べたところ一貫してＡｐｅｘ２遺伝子欠損マウスの発育遅延を認めた（図５Ｃ）。
４週齢のマウスについて各臓器重量を測定し、体重比の値を比較したところ脾臓、精巣、腎臓、心臓、肺、肝臓、脳の各臓器ではＡｐｅｘ２遺伝子欠損マウスと野生型マウスの間で有意な差を認めなかったが、調べた中では唯一Ａｐｅｘ２遺伝子欠損マウス（ＫＯ）の胸腺重量の体重比の値が野生型マウス（ＷＴ）の値の約５０％と有意に減少していた（図６）。
【００２０】
実施例３：マウス表現型２（胸腺細胞の異常）
Ａｐｅｘ２遺伝子欠損マウス（ＫＯ）の胸腺の組織切片をヘマトキシリン／エオシン（ＨＥ）染色して観察したところ、野生型（ＷＴ）に比べて大型細胞の割合が増加していた（図７）。胸腺より回収した胸腺細胞を顕微鏡下で計数したところ、Ａｐｅｘ２遺伝子欠損マウスでは胸腺細胞数が野生型マウス約２０％と著しく減少していた。更にこの胸腺細胞をヨウ化プロピジウム染色してフローサイトメトリーで解析したところ、Ａｐｅｘ２遺伝子欠損マウスでは小型胸腺細胞の減少が顕著であった（８０．７％→４４．９％）（図８）。更に蛍光強度の比較から細胞周期のＳ期およびＧ２／Ｍ期の細胞集団の比率が各々８．２％から１２．２％へ、９．７％から１９．０％へとＡｐｅｘ２遺伝子欠損マウスにおいて上昇していた（図９）。
次に個体における胸腺細胞のＸ線感受性を調べた。マウスをＸ線照射し、２１時間後に胸腺細胞を回収、生細胞数を計数したところ、Ａｐｅｘ２遺伝子欠損マウスの胸腺細胞の顕著な減少を認め、Ａｐｅｘ２欠損胸腺細胞が野生型に比してＸ線高感受性を示すことが明らかになった（図１０）。
胸腺細胞の分化マーカーをフローサイトメトリーで解析したところ、ＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８−細胞、ＣＤ４−ＣＤ８＋細胞の数は各々野生型の３１％、１７９％、４０％、５０％であった（各２匹の１３週齢マウスのデータ）。さらに、ＣＤ３、４、８トリプルネガティブ細胞に関して調べたところ、トリプルネガティブ細胞数は野生型マウスと同等であったが、そのうちのＣＤ４４＋ＣＤ２５−細胞数が３６．３％に減少していた。一方、ＣＤ４４＋ＣＤ２５＋細胞とＣＤ４４−ＣＤ２５＋細胞は減少しておらず、むしろ若干増加していた。ＣＤ４４−ＣＤ２５−細胞は野生型マウスの２７．８％に減少していた（各２匹の１０週齢マウスのデータ）。
【００２１】
実施例４：マウス表現型３（末梢血リンパ球異常）
末梢血中の白血球数を動物用血球計算装置により計数したところ白血球数の減少を認めた（野生型の５５％）。更に白血球中の各分画をフローサイトメトリーにより解析したところ、Ｔ細胞は野生型の３７％、Ｂ細胞は野生型の４７％まで減少していた。一方ＮＫ細胞数は１７７％に増大していた（各２匹の１５週齢マウスのデータ）。Ｔ細胞中のＣＤ４＋ＣＤ８−／ＣＤ４−ＣＤ８＋比は正常値であった。
【００２２】
実施例５：マウス表現型４（脾臓リンパ球の異常）
Ａｐｅｘ２遺伝子欠損マウスの脾臓細胞数は野生型マウスの６３．２％に減少していた。脾臓細胞の表面マーカーをフローサイトメトリーで解析したところ、脾臓細胞中でのＴ細胞（ＣＤ３＋）とＢ細胞（Ｂ２２０＋）の比率は，野生型マウスでは各々２６．０％、７５．７％であったのに対し、Ａｐｅｘ２遺伝子欠損マウスでも２８．７％、７３．８％と変化は認められなかった。
次に脾臓細胞をＬＰＳまたはコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を添加した培地中で増殖させ、トリパンブルー染色した後に顕微鏡下で観察して計数したところ、Ａｐｅｘ２遺伝子欠損マウス由来脾臓細胞はいずれのマイトジェンの刺激下においても野生型マウス由来脾臓細胞に比べて細胞数が低下していた。この際に死細胞数にはほとんど差が無かった。またＬＰＳ刺激４８時間後、あるいはＣｏｎＡ刺激６０時間後の脾臓細胞の細胞周期をフローサイトメトリーで解析したところいずれもＧ２／Ｍ期の細胞の比率の増加を認めた（図１１）。
【００２３】
【発明の効果】
ＡＰＥＸ２酵素欠損マウスに代表される本発明のＡＰＥＸ２酵素欠損非ヒト哺乳動物は、自然ＤＮＡ損傷に起因すると考えられる発生・発育遅延の表現型を呈し、この全身性の自然ＤＮＡ損傷の修復欠損がもたらす表現型は、胎児の発生遅延、新生児の発育遅延、また老化の促進など多くの病態と関連しており、本発明のＡＰＥＸ２欠損動物は、これらの病態のモデルとしてその治療法や薬剤の開発に有用である。
【００２４】
さらに、ＡＰＥＸ２欠損マウス等の本発明のＡＰＥＸ２欠損非ヒト哺乳動物においては、全身の組織細胞に比較して免疫担当細胞が特に自然ＤＮＡ損傷に起因する障害に感受性が高く、通常から免疫担当細胞の減少が顕著である。このことから、ＡＰＥＸ２欠損マウスに代表される本発明のＡＰＥＸ２欠損動物は、自然ＤＮＡ損傷の修復欠損の結果として特発性の免疫不全症や易感染性のモデルとして有用であり、それらの疾患の治療法や薬剤の開発に資することもできる。
【００２５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に従い欠損対象となるＡｐｅｘ２遺伝子のゲノム上の位置関係（Ａ）およびイントロン／エキソン境界のヌクレオチド配列（Ｂ）を示す。
【図２】本発明に従うＡｐｅｘ２遺伝子欠損ＥＳ細胞を作製するために用いられたターゲティングベクターを正常および変異後の対立遺伝子の位置と対比して示す。
【図３】本発明に従うＡｐｅｘ２遺伝子欠損ＥＳ細胞が樹立されたことを示すデータである。
【図４】本発明に従いＡｐｅｘ２遺伝子欠損マウスが作製されたことを示すデータである。
【図５】本発明に従うＡｐｅｘ２遺伝子欠損マウスが発育不全を呈することを示すデータである。
【図６】本発明に従うＡｐｅｘ２遺伝子欠損マウスにおいては、胸腺が萎縮していることを示すデータである。
【図７】本発明に従うＡｐｅｘ２遺伝子欠損マウスにおいては、通常の細胞が少なく大型細胞の割合が増加することを示すデータである。
【図８】本発明に従うＡｐｅｘ２遺伝子欠損マウスにおける胸腺細胞のサイズを解析して野性型のものと対比して示すデータである。
【図９】本発明に従うＡｐｅｘ２遺伝子欠損マウスにおける胸腺細胞の細胞周期分布を解析して野性型のものと対比して示すデータである。
【図１０】本発明に従うＡｐｅｘ２遺伝子欠損マウスが野性型のものに比べてＸ線照射に対して感受性が高いことを示すデータである。
【図１１】本発明に従うＡｐｅｘ２遺伝子欠損マウスの脾臓細胞のマイトジェンによる活性化の様子を野性型のものと対比して示すデータである。
Claims (4)
- ＡＰエンドヌクレアーゼであるＡＰＥＸ２酵素をコードする遺伝子が欠損していることを特徴とする非ヒト哺乳動物。
- ＡＰエンドヌクレアーゼであるマウスＡＰＥＸ２酵素をコードする遺伝子が欠損していることを特徴とするマウス。
- ＡＰエンドヌクレアーゼであるＡＰＥＸ２酵素をコードする遺伝子がその機能欠損型遺伝子に置換されていることを特徴とする非ヒト哺乳動物由来のＥＳ細胞。
- マウス由来であることを特徴とする請求項３のＥＳ細胞。
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