JP2004301637A - ベンゼン系化合物の測定方法および測定キット - Google Patents
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Abstract
【課題】安価で簡便かつ迅速なベンゼン系化合物の測定方法、およびその測定キットを提供する。
【解決手段】（１）ベンゼン系化合物とキシレンレセプタータンパク質を溶液中で反応させ、（２）該反応により生じたベンゼン化合物とキシレンレセプタータンパク質の複合体と、該複合体と特異的に結合するＤＮＡをさらに反応させ、（３）該複合体と該ＤＮＡの結合に起因する物理的あるいは化学的変化を検出することにより、（４）キシレンレセプタータンパク質と結合したベンゼン系化合物を定量化することを特徴とする測定方法、およびキシレンレセプタータンパク質と、該タンパク質とベンゼン系化合物の複合体と特異的に結合するＤＮＡを含むことを特徴とする測定キット。
【選択図】 図１
【解決手段】（１）ベンゼン系化合物とキシレンレセプタータンパク質を溶液中で反応させ、（２）該反応により生じたベンゼン化合物とキシレンレセプタータンパク質の複合体と、該複合体と特異的に結合するＤＮＡをさらに反応させ、（３）該複合体と該ＤＮＡの結合に起因する物理的あるいは化学的変化を検出することにより、（４）キシレンレセプタータンパク質と結合したベンゼン系化合物を定量化することを特徴とする測定方法、およびキシレンレセプタータンパク質と、該タンパク質とベンゼン系化合物の複合体と特異的に結合するＤＮＡを含むことを特徴とする測定キット。
【選択図】 図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体試料、海水、河川水、地下水などの水系試料中のベンゼン系化合物を測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、一般的なベンゼン系化合物の測定は、ガスクロマトグラフ法、またはガスクロマトグラフ質量分析法を利用して行われている（例えば、非特許文献１参照）。ガスクロマトグラフ法は、試料をある担体に固定された固定相（吸着剤、溶媒）に気体キャリアガスとともに導入し、分析対象成分の蒸気圧及び親和性の差で分離・分析をする方法である。この方法は、大部分の無機、有機化合物の同定や構造の推定に有効で、品質管理から各種科学分野の研究に至るまで広く利用されている。また、ガスクロマトグラフ質量分析法は、ガスクロマトグラフで分離された成分や加熱によって生成した成分をさらにイオン化し、質量スペクトルで示される各フラグメントの質量数から、成分の同定や構造を推定する方法であり、主に有機混合物成分の同定やガス組成の分析に用いられている。
【０００３】
しかしながら、これらの方法では大型で高価な装置が必要であり、かつ排気設備等を必要とするため特定の施設でしか行うことができない。しかも、非常に煩雑な作業が必要であり測定に長時間を要する場合が多い。一方、石油化学工業の発達に伴い、石油化学製品の廃棄物、工場排水等による環境汚染が問題となっており、生態系や人体に対する影響が危惧されている。また、近年は家庭、学校、または職場などの身近な市民生活の場における環境汚染に関心が集まっている。特に、水系におけるベンゼン系化合物等の有害汚染物質の測定は上述したように需要が多いにもかかわらず、従来法では煩雑な操作に要する時間とコストがかさむため、簡便で安価な測定方法の開発が望まれている。
【０００４】
【非特許文献１】
日本工業規格 ＪＩＳ Ｋ０１２５、「用水・排水中の揮発性有機化合物試験方法」平成７年改定版
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した従来の技術における問題を解決するためになされたもので、その課題は大型装置、特殊施設、および煩雑な操作を必要としない、安価で簡便かつ迅速なベンゼン系化合物の測定方法、およびその測定キットを提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行い、（１）生物由来のキシレンレセプタータンパク質がベンゼン系化合物と特異的に結合すること、（２）この複合体と特異的に結合するＤＮＡが存在すること、（３）これらの間の相互作用が検出可能であること、（４）さらに検出された結果から結合したベンゼン化合物を定量できることを見い出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明の測定方法は、（１）ベンゼン系化合物とキシレンレセプタータンパク質を溶液中で反応させ、（２）該反応により生じたベンゼン化合物とキシレンレセプタータンパク質の複合体と、該複合体と特異的に結合するＤＮＡをさらに反応させ、（３）該複合体と該ＤＮＡの結合に起因する物理的あるいは化学的変化を検出することにより、（４）キシレンレセプタータンパク質と結合したベンゼン系化合物を定量化することを特徴とする。また、前記測定方法を利用した本発明の測定キットは、キシレンレセプタータンパク質と、該タンパク質とベンゼン系化合物の複合体と特異的に結合するＤＮＡを含むことを特徴としている。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明で利用するキシレンレセプタータンパク質とは、例えばシュードモナス属細菌のＴＯＬプラスミドにコードされている一連のベンゼン系化合物代謝に関わる、複数の酵素遺伝子の転写活性を調節しているレセプタータンパク質である。キシレンレセプタータンパク質はベンゼン系化合物と結合すると、これら酵素遺伝子のプロモーター領域の特定配列と特異的に結合することで、上記の酵素遺伝子の転写を活性化する。本発明はこの生物反応を利用するものである。
【０００９】
本発明で用いるキシレンレセプタータンパク質（以下、ＸｙｌＲと表記する）の由来や構造は、ベンゼン系化合物、ならびに前記特定ＤＮＡ配列（以下、ｐｓプロモーターＤＮＡと表記する）に対する結合能を有してさえいれば特に限定されない。例えば、アミノ酸配列の改変や修飾などにより、ベンゼン系化合物や前記ＤＮＡに対する親和性が高く、検出に好適なタンパク質を作製し利用することができる。また、本発明におけるｐｓプロモーターＤＮＡの由来や構造は、ＸｙｌＲとベンゼン系化合物の複合体に結合することができるのであれば特に限定されない。例えば、配列の改変や修飾などにより、検出に好適なＤＮＡを作製し利用することができる。具体的には、ベンゼン系化合物と結合したＸｙｌＲ（以下、Ｂｚ−ＸｙｌＲ複合体と表記する）が特異的に結合する配列を複数個連続させた人工オリゴヌクレオチドを作製し利用することができる。本発明において測定されるベンゼン系化合物は、ＸｙｌＲにより特異的に結合されるものであれば特に限定されないが、例えばｍ−キシレン、ｏ−キシレン、ｐ−キシレン、３−メチルベンジルアルコール、ｍ−クロロトルエン、ｏ−クロロトルエン、ｐ−クロロトルエン、トルエン、ベンゼン、エチルベンゼン、アニリン、２−４−Ｄなどが挙げられる。
【００１０】
本発明の測定方法においては、ベンゼン系化合物とＸｙｌＲの反応と、Ｂｚ−ＸｙｌＲ複合体とｐｓプロモーターＤＮＡの反応は必ずしも別々に行われる必要はなく、ベンゼン系化合物、ＸｙｌＲ、ｐｓプロモーターＤＮＡを同一溶液中へ同時に導入することも可能である。
【００１１】
本発明の測定方法は、前記ＸｙｌＲが、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素、酵素タンパク質、または蛍光タンパク質のいずれかで標識されていることを特徴とする。これにより、ｐｓプロモーターＤＮＡに結合した標識ＸｙｌＲを検出したり、標識ＸｙｌＲにｐｓプロモーターＤＮＡが結合することによって、例えば標識した酵素による反応が阻害されるのを観察することが可能となる。すなわち、本発明の測定方法の応用範囲を拡大することができる。導入する標識物質と標識方法は、公知の物質または方法から好適なものを選択すればよく、ＸｙｌＲの生物活性、すなわちベンゼン系化合物とｐｓプロモーターＤＮＡに対する結合能を損なうものでなければ特に限定されない。通常の場合、検出の簡便さや生物活性に対する影響度を考慮すると、分子量の小さい蛍光物質または発光物質がより好適である。蛍光物質としては、種々の発蛍光団を有する色素が使用可能であるが、例えばフルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、テキサスレッド誘導体、アクリジン誘導体、マラカイトグリーン誘導体、ピレン誘導体、ルシファーイエロー誘導体、リボフラビン誘導体、フィコエリトリン誘導体、フィコシアニン誘導体、アロフィコシアニン誘導体などが挙げられる。発光物質としては、ルミノール誘導体、Ｎ−メチルアクリジニウム誘導体、ルシフェリン誘導体などが挙げられる。一方、蛍光タンパク質としては緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）やその変異体、必要であれば紫外線により緑から赤に蛍光が変色するカエデなどを使用することが可能である。酵素タンパク質としては、基質と特異的に結合しても反応を触媒する能力を有するタンパク質であれば特に制限されないが、例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトキシダーゼ、ルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などが使用可能である。これらタンパク質の標識方法としては、タンパク質のアミノ酸残基を利用する方法が好適に利用できる。具体的には、システイン残基のチオール基、リジン残基やＮ末端のアミノ基、グルタミン酸残基およびアスパラギン酸残基やＣ末端のカルボキシル基、セリン残基やスレオニン残基の水酸基などを利用し、標識物質の反応基と共有結合を生成させる。とりわけ、システイン残基は特殊なタンパク質を除いてその含量が少なく、アミノ酸の中で最も化学反応性が高いことから好適である。また、タンパク質の機能に関与していないアミノ酸残基を、遺伝子工学的手法により好適な残基に置換してから標識することも可能である。さらに、あらかじめアビジンまたはビオチンを導入し、これらの結合を介して標識することもできる。また、酵素タンパク質や蛍光性タンパク質の場合、ＸｙｌＲとの融合タンパク質として得ることもできる。具体的には、標識タンパク質を発現するベクターの、標識タンパク質をコードする遺伝子の下流にＸｙｌＲをコードする遺伝子を連結し、融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を構築する。これを適当な宿主に導入して形質転換し、得られた形質転換株を培養することにより作製することができる。
【００１２】
本発明の測定方法は、前記ＤＮＡが、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素、酵素タンパク質、または蛍光性タンパク質のいずれかで標識されていることを特徴とする。これにより、ＸｙｌＲに結合した標識ｐｓプロモーターＤＮＡを検出したり、標識ｐｓプロモーターＤＮＡにＢｚ−ＸｙｌＲ複合体が結合することによって、例えば標識した酵素による反応が阻害されるのを観察することが可能となる。導入する標識物質と標識方法は、公知の物質または方法から好適なものを選択すればよく、Ｂｚ−ＸｙｌＲ複合体がｐｓプロモーターＤＮＡに結合するのを妨げなければ特に限定されない。通常の場合、検出の簡便さや生物活性に対する影響度を考慮すると、分子量の小さい蛍光物質または発光物質がより好適である。標識される蛍光物質、発光物質、酵素タンパク質、または蛍光タンパク質としては、前記ＸｙｌＲの標識に例示した種々の物質が同様に使用可能である。標識方法としては、５’末端を好適な標的物質で標識したプライマーを用い、ポリメラーゼ チェイン リアクション（以下、ＰＣＲと表記する）を行うことで末端標識したＤＮＡを得ることができる。さらに、あらかじめアビジンまたはビオチンを導入しておき、これらの結合を介して標識することも可能である。
【００１３】
本発明の測定方法は、前記ＸｙｌＲが固相に固定されていることを特徴とする。これは、Ｂｚ−ＸｙｌＲ複合体と結合したｐｓプロモーターＤＮＡと、未結合のｐｓプロモーターＤＮＡを分離する手段として非常に有効である。ＸｙｌＲを固相に固定する方法は、公知の方法から好適なものを選択すればよく、ＸｙｌＲの生物活性、すなわちベンゼン系化合物とｐｓプロモーターＤＮＡに対する結合能を損なうものでなければ特に限定されない。例えば、ＸｙｌＲのアミノ酸残基と固相上の物質との結合を利用する方法、あるいはタグをつけたＸｙｌＲを作製してそのタグと固相上の物質との吸着や結合を利用する方法などが挙げられる。具体的には、システイン残基のチオール基、リジン残基やＮ末端のアミノ基、グルタミン酸残基およびアスパラギン酸残基やＣ末端にあるカルボキシル基、セリン残基やスレオニン残基の水酸基などを利用して固相上の反応基と共有結合を生成させる方法、固相上のアビジンとビオチン化ＸｙｌＲを結合させる方法、固相上のＮＴＡ等のキレート剤でヒスチジンタグ融合ＸｙｌＲを捕捉する方法、固相上の抗体で抗原融合ＸｙｌＲを捕捉する方法などが挙げられる。
【００１４】
本発明の測定方法は、前記ＤＮＡが、固相に固定されていることを特徴とする。これは、ｐｓプロモーターＤＮＡと結合したＢｚ−ＸｙｌＲ複合体と、未結合のＸｙｌＲを分離する手段として非常に有効である。ｐｓプロモーターＤＮＡを固相に固定する方法は、公知の方法から好適なものを選択すればよく、ＸｙｌＲがｐｓプロモーターＤＮＡに結合するのを妨げなければ特に限定されない。例えば、固相上のアビジンとビオチン化ｐｓプロモーターＤＮＡの結合により固定する方法などが挙げられる。
【００１５】
本発明の検出方法は、表面プラズモン共鳴を利用することを特徴とする。表面プラズモン共鳴法（以下、ＳＰＲと表記する）は、プリズム表面の金属薄膜上の質量変化に伴う屈折率変化を検出する方法であり、物質の相互作用を標識なしで検出することが可能である。具体的には、物質Ｌ（以下、リガンドと表記する）を金属薄膜表面に固定し、これに作用する物質Ａ（以下、アナライトと表記する）を含む試料を展開することにより、Ｌ−Ａの結合に伴う金属薄膜表面での微量な質量変化による屈折率変化を検出する。本発明においては、ＸｙｌＲをリガンド、ｐｓプロモーターＤＮＡをアナライトとする方法、またはｐｓプロモーターＤＮＡをリガンド、ＸｙｌＲをアナライトとする方法のいずれも利用可能である。リガンドを固相表面に固定する方法は公知の方法から好適なものを選択すればよく、ＸｙｌＲとベンゼン系化合物、Ｂｚ−ＸｙｌＲ複合体とｐｓプロモーターＤＮＡとの結合を妨げるものでなければ特に限定されない。具体的には、あらかじめ金属表面に結合可能な官能基を有する物質を導入してリガンドが有する反応基と化学的に結合させるか、金属表面をリガンドと化学的に結合または吸着可能な物質で修飾した後、リガンドを反応させることにより固定することができる。
【００１６】
また本発明の検出方法は、水晶振動子を利用することを特徴とする。水晶振動子法の原理は前記ＳＰＲ法と類似している。具体的には、振動子の表面に物質が吸着すると振動子を組み込んだ発振回路の発振周波数が変化することに基づいており、物質の相互作用を標識なしで検出することができる。すなわち、物質Ｌを振動子の表面に固定し、これに作用する物質Ａを含む試料を展開することにより、Ｌ−Ａの結合に伴う振動子表面での微量な質量変化を発振周波数の変化として検出する。本発明においては、ＸｙｌＲをリガンド、ｐｓプロモーターＤＮＡをアナライトとする方法、またはｐｓプロモーターＤＮＡをリガンド、ＸｙｌＲをアナライトとする方法のいずれも利用可能である。リガンドを固相表面に固定する方法は、前記ＳＰＲの場合と全く同様に公知の方法から好適なものを選択することができる。
【００１７】
本発明の検出方法は、蛍光物質間で生じる蛍光共鳴エネルギー移動を利用することを特徴とする。蛍光共鳴エネルギー移動（以下、ＦＲＥＴと表記する）とは、１つの発蛍光団（以下、供与体と表記する）の蛍光スペクトルが他の発色団（以下、受容体と表記する）の励起スペクトルと重なり、かつ供与体と受容体が充分に接近する位置にある場合、供与体の励起が受容体からの蛍光を誘導し、更に供与体自身からの蛍光強度は減少するという現象である。本発明で使用される供与体及び受容体となる蛍光物質は、ＸｙｌＲまたはｐｓプロモーターＤＮＡに標識された状態でＦＲＥＴを生起することが可能な組み合わせであれば、特に制限されない。種々の発蛍光団を有する色素が使用可能であるが、例えばフルオレセイン系、ローダミン系の色素等が好適に使用することができる。フルオレセインは４９２ ｎｍで励起した場合に５１８ ｎｍに蛍光のピークを示し、ローダミンは５７０ ｎｍで励起した場合に５９０ ｎｍに蛍光ピークを示す。この２種類の発色光団がＦＲＥＴを生じるに充分に近い位置にある場合には、供与体であるフルオレセインから受容体であるローダミンへの蛍光エネルギー移動が起こり、フルオレセインに由来する蛍光強度は減少し、ローダミンに由来する蛍光強度が増加することになる。
【００１８】
本発明の測定キットは、ＸｙｌＲと、Ｂｚ−ＸｙｌＲ複合体と特異的に結合するＤＮＡからなることを特徴とする。本測定キットにおいて、ＸｙｌＲとｐｓプロモーターＤＮＡが（１）各々一定の濃度で含まれる溶液、あるいは（２）乾燥状態、または固定化された状態の各々一定量の固体とそれを溶解可能な溶媒の組み合わせ、のいずれかの形態で供給される。溶媒となる溶液としては測定に好適な溶液、例えば緩衝液が好適に利用される。
【００１９】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、以下の実施例により本発明は何ら限定されない。
【００２０】（実施例１）
測定キット（１）の作製
ＸｙｌＲをコードする遺伝子をシュードモナス属菌のＴＯＬプラスミドからＰＣＲにより増幅した。これをプロモーター、ターミネーター等を有するベクターの中の発現可能な位置に挿入し、得られた発現ベクターで大腸菌を形質転換した。得られた形質転換大腸菌を培養した後、菌体を遠心分離で集菌し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０、以下の全実施例に共通の緩衝液）に懸濁した。超音波処理により菌体を破砕し、遠心分離して上清画分を回収することによりＸｙｌＲを含む細胞抽出液を得た。次いで、この抽出液をイオン交換クロマトグラフィーとゲルろ過クロマドグラフィーに供することによりＸｙｌＲを精製した。得られたＸｙｌＲをビオチン化試薬（同仁化学研究所製）を用いてビオチン標識し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させて５００μｇ／ｍｌのビオチン化ＸｙｌＲ溶液を調製した。さらに、ストレプトアビジンをコートした９６穴プレート（ナルゲン社製）にビオチン化ＸｙｌＲ溶液を５０μｌ加え、室温で１０分間回転振とうした後、同一のＰＢＳ緩衝液で洗浄した。次に、シュードモナス属菌のＴＯＬプラスミドを鋳型として、一方のプライマーとして５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅ＤＮＡをＰＢＳ緩衝液（ｐＨ ７．０）に溶解させ、５００μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識ｐｓプロモーターＤＮＡ溶液を調製した。この測定系を測定キット（１）とした。
【００２１】（実施例２）
測定キット（１）によるｍ−キシレンの測定
ベンゼン系化合物としてｍ−キシレン（和光純薬製）をＤＭＳＯ（和光純薬製）に溶解させた後、さらにＰＢＳ緩衝液に溶解させ、最終的に０．０１〜５０μｇ／ｍｌの濃度のｍ−キシレンと、０．２％（ｖ／ｖ）の濃度のＤＭＳＯを含むキシレン溶液を調製した。各濃度のキシレン溶液５０ μｌを測定キット（１）のＸｙｌＲを固定したウェルに加え、室温で５分間回転振とうし、５０μｌのＦＩＴＣ標識ｐｓプロモーターＤＮＡ溶液を加え、室温で１０分間回転振とうした後ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。蛍光光度計を用いて波長４９４ｎｍで励起し、波長５１８ｎｍの蛍光を測定した。その結果を図１に示した。図１の結果から、測定キット（１）では０．０１〜５μｇ／ｍｌの濃度のｍ−キシレンが測定可能であった。
【００２２】（実施例３）
測定キット（２）の作製
実施例１で作製したＸｙｌＲを、ビオチン化試薬（同仁化学研究所製）を用いてビオチン標識し、ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジンと反応させた後にＰＢＳ緩衝液に溶解させ、５００μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識ＸｙｌＲ溶液を調製した。次いで、シュードモナス属菌のＴＯＬプラスミドを鋳型として、一方のプライマーとして５’末端ビオチン化オリゴヌクレオチド用いてＰＣＲを行い、得られた増幅ＤＮＡをＰＢＳ緩衝液に溶解させ、５００μｇ／ｍｌの末端ビオチン化ｐｓプロモーターＤＮＡ溶液とした。ストレプトアビジンをコートした９６穴プレート（ナルゲン社製）に前記ビオチン化ｐｓプロモーターＤＮＡ溶液を５０μｌ加え、室温で１０分間回転振とうした後ＰＢＳ緩衝液洗浄した。この測定系を測定キット（２）とした。
【００２３】（実施例４）
測定キット（２）によるｍ−キシレンの測定
実施例２で作製した各濃度のキシレン溶液とＦＩＴＣ標識ＸｙｌＲ溶液の各５０μｌを、室温で約５分間混合した。混合液をｐｓプロモーターＤＮＡ固定ウェルに加え、室温で１０分間回転振とうした後、ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。蛍光光度計を用いて波長４９４ｎｍで励起し、波長５１８ｎｍの蛍光を測定した。その結果を図２に示した。図２の結果から、測定キット（２）では０．０１〜１．０μｇ／ｍｌの濃度のｍ−キシレンが測定可能であった。
【００２４】（実施例５）
測定キット（３）の作製
実施例１で作製したＸｙｌＲをＰＢＳ緩衝液に溶解させ、５００μｇ／ｍｌのＸｙｌＲ溶液を調製した。次いで、シュードモナス属菌のＴＯＬプラシミドを鋳型とし、プライマーとして５’末端ビオチン化オリゴヌクレオチドと、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド用いてＰＣＲを行い、得られた増幅ＤＮＡをＰＢＳ緩衝液に溶解させて、５００μｇ／ｍｌのビオチン化ＦＩＴＣ標識ｐｓプロモーターＤＮＡ溶液を調製した。ストレプトアビジンをコートした９６穴プレート（ナルゲン社製）に前記ビオチン化ＦＩＴＣ標識ｐｓプロモーターＤＮＡ溶液を５０μｌ加え、室温で１０分間回転振とうした後ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。この測定系を測定キット（３）とした。
【００２５】（実施例６）
測定キット（３）によるｍ−キシレンの測定
実施例２で作製した各濃度のキシレン溶液とＸｙｌＲ溶液の各５０μｌを、室温で約５分間混合した。混合液をＦＩＴＣ標識ｐｓプロモーターＤＮＡ固定ウェルに加え、室温で１０分間回転振とうした後ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。蛍光光度計を用いて波長４９４ｎｍで励起し、波長５１８ｎｍの蛍光を測定した。その結果を図３に示した。図３の結果から、測定キット（３）では０．１〜５０μｇ／ｍｌの濃度のｍ−キシレンが測定可能であった。
【００２６】（実施例７）
測定キット（４）の作製
実施例１で作製したＸｙｌＲをビオチン化試薬（同仁化学研究所製）を用いてビオチン標識し、ＰＢＳ緩衝液に溶解させ５００μｇ／ｍｌのビオチン化ＸｙｌＲ溶液を調製した。次いで、シュードモナス属菌のＴＯＬプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡをＰＢＳ緩衝液に溶解させ、１００μｇ／ｍｌのｐｓプロモーターＤＮＡ溶液を調製した。ビオチン化ＸｙｌＲ溶液を、あらかじめストレプトアビジンが固定されているセンサーチップＳＡ（ビアコア社製）に流速１５μｌ／ｍｉｎで１０分間展開し、ストレプトアビジンとビオチンの結合を介してＸｙｌＲをチップ上に固定した。この測定系を測定キット（４）とした。
【００２７】（実施例８）
測定キット（４）によるｍ−キシレンの測定
ｐｓプロモーターＤＮＡ溶液１０μｌと実施例２で作製したキシレン溶液５０μｌを混合後、ＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００、ビアコア社製）に供した。すなわち、ＸｙｌＲを固定したセンサーチップにこの混合溶液を流速２０μｌ／ｍｉｎで２分間展開した後、ＰＢＳ緩衝液で４０秒間洗浄した。混合溶液展開開始点における共振シグナルを０とした時の、洗浄後の共振シグナルをレスポンスとした。測定結果を図４に示した。表面プラズモン共鳴による検出を利用した測定キット（４）では、０．５〜５０μｇ／ｍｌの濃度のｍ−キシレンが測定可能であった。
【００２８】（実施例９）
測定キット（５）の作製
実施例１で作製したＸｙｌＲをＰＢＳ緩衝液に溶解させ、５００μｇ／ｍｌのＸｙｌＲ溶液を調製した。次いで、シュードモナス属菌のＴＯＬプラスミドを鋳型とし、一方のプライマーとして５’末端ビオチン化オリゴヌクレオチド用いてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡをＰＢＳ緩衝液に溶解させ、１００μｇ／ｍｌの末端ビオチン化ｐｓプロモーターＤＮＡ溶液を調製した。ビオチン化プロモーターＤＮＡ溶液をあらかじめストレプトアビジンが固定されているセンサーチップＳＡ（ビアコア社製）に流速１５μｇ／ｍｉｎで１０分間展開し、ストレプトアビジンとビオチンの結合を介してｐｓプロモーターＤＮＡをチップ上に固定した。この測定系を測定キット（５）とした。
【００２９】（実施例１０）
測定キット（５）によるｍ−キシレンの測定
ＸｙｌＲ溶液１０μｌと実施例２で作製したキシレン溶液５０μ１を混合後、実施例８と同様にＳＰＲに供した。すなわち、ｐｓプロモーターＤＮＡを固定したセンサーチップにこの混合溶液を流速２０μｌ／ｍｉｎで２分間展開した後ＰＢＳ緩衝液で４０秒間洗浄した。混合溶液展開開始点における共振シグナルを０とした時の、洗浄後の共振シグナルをレスポンスとした。測定結果を図５に示した。図５の結果から、表面プラズモン共鳴による検出を利用した測定キット（５）では、０．５〜５０μｇ／ｍｌの濃度のｍ−キシレンが測定可能であった。
【００３０】（実施例１１）
測定キット（６）の作製
実施例１で作製したＸｙｌＲを、ビオチン化試薬（同仁化学研究所製）を用いてビオチン標識し、ＰＢＳ緩衝液に溶解させ５００μｇ／ｍｌのビオチン化ＸｙｌＲ溶液を調製した。次いで、シュードモナス属菌のＴＯＬプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡをＰＢＳ緩衝液に溶解させ、１００μｇ／ｍｌのｐｓプロモーターＤＮＡ溶液を調製した。さらに、水晶振動子の金表面を、５ｍＭ １０−カルボキシ−１−デカンチオール（同人化学研究所製）の８０％エタノール溶液で４０℃で２０分間反応させ、カルボキシル基を導入した。アミンカップリングによりストレプトアビジンを固定し、溶液セルにビオチン化ＸｙｌＲ溶液を１００μｌ注入し、ストレプトアビジンとビオチンの結合を介して水晶振動子上にＸｙｌＲを固定した。この測定系を測定キット（６）とした。
【００３１】（実施例１２）
測定キット（６）によるｍ−キシレンの測定
溶液セルに２０μｌのＸｙｌＲ溶液を注入後、実施例２で作製したキシレン溶液１００μｌを加えた。キシレン溶液を加える前の周波数を０としたとき時の、周波数変化量の絶対値をレスポンスとした。測定結果を図６に示した。図６の結果から、水晶振動子による検出を利用した測定キット（６）では、０．５〜１０μｇ／ｍｌの濃度のｍ−キシレンが測定可能であった。
【００３２】（実施例１３）
測定キット（７）の作製
実施例１で作製したＸｙｌＲをＰＢＳ緩衝液ＰＢＳに溶解させ５００μｇ／ｍｌのＸｙｌＲ溶液を調製した。次いで、シュードモナス属菌のＴＯＬプラスミドを鋳型として、一方のプライマーとして５’末端ビオチン化オリゴヌクレオチド用いてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡをＰＢＳ緩衝液に溶解させ、１００μｇ／ｍｌの末端ビオチン化ｐｓプロモーターＤＮＡ溶液を調整した。水晶振動子の金表面を、５ｍＭ １０−カルボキシ−１−デカンチオール（同人化学研究所製）の８０％エタノール溶液で４０℃で２０分間反応させ、カルボキシル基を導入した。アミンカップリングによりストレプトアビジンを固定し、溶液セルにビオチン化ｐｓプロモーターＤＮＡ溶液を１００μｌ注入し、ストレプトアビジンとビオチンの結合を介してｐｓプロモーターＤＮＡを水晶振動子上に固定した。この測定系を測定キット（７）とした。
【００３３】（実施例１４）
測定キット（７）によるｍ−キシレンの測定
溶液セルに２０μｌのｐｓプロモーターＤＮＡ溶液を注入後、実施例２で作製したキシレン溶液１００μｌを加えた。キシレン溶液を加える前の周波数を０とした時の、周波数変化量の絶対値をレスポンスとした。測定結果を図７に示した。図７の結果から、水晶振動子による検出を利用した測定キット（７）では、０．５〜１０μｇ／ｍｌの濃度のｍ−キシレンが測定可能であった。
【００３４】（実施例１５）
測定キット（８）の作製
実施例１で作製したＸｙｌＲを、ビオチン化試薬（同仁化学研究所製）を用いてビオチン標識し、ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジンと反応させＰＢＳ緩衝液に溶解させ、１．０ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識ＸｙｌＲ溶液を調製した。次いで、シュードモナス属菌のＴＯＬプラスミドを鋳型として、一方のプライマーとして５’末端ローダミン標識オリゴヌクレオチド用いてＰＣＲを行い、ＰＢＳ緩衝液に溶解させ、５００μｇ／ｍｌのローダミン標識ｐｓプロモーターＤＮＡ溶液を調製した。あらかじめストレプトアビジンがコートされた９６穴プレート（ナルゲン社製）に前記ビオチン化ＦＩＴＣ標識ＸｙｌＲ溶液を５０μｌ加え、室温で２０分間回転振とうした後ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。この測定系を測定キット（８）とした。
【００３５】（実施例１６）
測定キット（８）によるｍ−キシレンの測定
実施例２で作製した各濃度のキシレン溶液とローダミン標識ｐｓプロモーターＤＮＡ溶液の各５０μｌを、室温で約５分間混合した。混合液をＦＩＴＣ標識ＸｙｌＲ固定ウェルに加え、室温で１０分間回転振とうした後ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。蛍光光度計を用いて波長４９４ｎｍで励起し、波長５１８ｎｍの蛍光を測定した。その結果を図８に示した。図８の結果から、蛍光共鳴エネルギー移動による検出を利用した測定キット（８）では、０．１〜１０μｇ／ｍｌの濃度のｍ−キシレンが測定可能であった。
【００３６】（実施例１７）
測定キット（９）の作製
実施例１で作製したＸｙｌＲを、ビオチン化試薬（同仁化学研究所製）を用いてビオチン標識し、ローダミン標識ストレプトアビジンと反応させ、ＰＢＳ緩衝液に溶解させて５００μｇ／ｍｌのローダミン標識ＸｙｌＲ溶液を調製した。次いで、シュードモナス属菌のＴＯＬプラスミドを鋳型とし、プライマーとして５’末端ビオチン化オリゴヌクレオチドと、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド用いてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡをＰＢＳ緩衝液に溶解させて、５００μｇ／ｍｌのビオチン化ＦＩＴＣ標識ｐｓプロモーターＤＮＡ溶液を調製した。あらかじめストレプトアビジンがコートされた９６穴プレート（ナルゲン社製）に前記ビオチン化ＦＩＴＣ標識ｐｓプロモーターＤＮＡ溶液を５０μｌ加え、室温で１０分間回転振とうした後ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。この測定系を測定キット（９）とした。
【００３７】（実施例１８）
測定キット（９）によるｍ−キシレンの測定
実施例２で作製した各濃度のキシレン溶液とローダミン標識ＸｙｌＲ溶液の各５０μｌを、室温で約５分間混合した。混合液をＦＩＴＣ標識ｐｓプロモーターＤＮＡ固定ウェルに加え、室温で１０分間回転振とうした後ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。蛍光光度計を用いて波長４９４ｎｍで励起し、波長５１８ｎｍの蛍光を測定した。その結果を図９に示した。図９の結果から、蛍光共鳴エネルギー移動による検出を利用した測定キット（９）では、０．１〜５μｇ／ｍｌの濃度のｍ−キシレンが測定可能であった。
【００３８】
【図面の簡単な説明】
【図１】固相に固定したＸｙｌＲと結合した蛍光標識ｐｓプロモーターＤＮＡの検出を利用した、ｍ−キシレンの測定結果を示す図である。実施例２の測定結果を示している。
【図２】固相に固定したｐｓプロモーターＤＮＡと結合した蛍光標識ＸｙｌＲの検出を利用した、ｍ−キシレンの測定結果を示す図である。実施例４の測定結果を示している。
【図３】固相に固定した蛍光標識ｐｓプロモーターＤＮＡとＸｙｌＲとの結合による蛍光強度の減少を利用した、ｍ−キシレンの測定結果を示す図である。実施例６の測定結果を示している。
【図４】ＸｙｌＲをリガンド、ｐｓプロモーターＤＮＡをアナライトとした表面プラズモン共鳴による検出を利用した、ｍ−キシレンの測定結果を示す図である。実施例８の測定結果を示している。
【図５】ｐｓプロモーターＤＮＡをリガンド、ＸｙｌＲをアナライトとした表面プラズモン共鳴を利用した、ｍ−キシレンの測定結果を示す図である。実施例１０の測定結果を示している。
【図６】ＸｙｌＲをリガンド、ｐｓプロモーターＤＮＡをアナライトとした水晶振動子による検出を利用した、ｍ−キシレンの測定結果を示す図である。実施例１２の測定結果を示している。
【図７】ｐｓプロモーターＤＮＡをリガンド、ＸｙｌＲをアナライトとした水晶振動子による検出を利用した、ｍ−キシレンの測定結果を示す図である。実施例１４の測定結果を示している。
【図８】固相に固定した蛍光標識ＸｙｌＲと、結合した蛍光標識ｐｓプロモーターＤＮＡとの蛍光共鳴エネルギー移動による検出を利用した、ｍ−キシレンの測定結果を示す図である。実施例１６の測定結果を示している。
【図９】固相に固定した蛍光標識ｐｓプロモーターＤＮＡと、結合した蛍光標識ＸｙｌＲとの蛍光共鳴エネルギー移動による検出を利用した、ｍ−キシレンの測定結果を示す図である。実施例１８の測定結果を示している。
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体試料、海水、河川水、地下水などの水系試料中のベンゼン系化合物を測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、一般的なベンゼン系化合物の測定は、ガスクロマトグラフ法、またはガスクロマトグラフ質量分析法を利用して行われている（例えば、非特許文献１参照）。ガスクロマトグラフ法は、試料をある担体に固定された固定相（吸着剤、溶媒）に気体キャリアガスとともに導入し、分析対象成分の蒸気圧及び親和性の差で分離・分析をする方法である。この方法は、大部分の無機、有機化合物の同定や構造の推定に有効で、品質管理から各種科学分野の研究に至るまで広く利用されている。また、ガスクロマトグラフ質量分析法は、ガスクロマトグラフで分離された成分や加熱によって生成した成分をさらにイオン化し、質量スペクトルで示される各フラグメントの質量数から、成分の同定や構造を推定する方法であり、主に有機混合物成分の同定やガス組成の分析に用いられている。
【０００３】
しかしながら、これらの方法では大型で高価な装置が必要であり、かつ排気設備等を必要とするため特定の施設でしか行うことができない。しかも、非常に煩雑な作業が必要であり測定に長時間を要する場合が多い。一方、石油化学工業の発達に伴い、石油化学製品の廃棄物、工場排水等による環境汚染が問題となっており、生態系や人体に対する影響が危惧されている。また、近年は家庭、学校、または職場などの身近な市民生活の場における環境汚染に関心が集まっている。特に、水系におけるベンゼン系化合物等の有害汚染物質の測定は上述したように需要が多いにもかかわらず、従来法では煩雑な操作に要する時間とコストがかさむため、簡便で安価な測定方法の開発が望まれている。
【０００４】
【非特許文献１】
日本工業規格 ＪＩＳ Ｋ０１２５、「用水・排水中の揮発性有機化合物試験方法」平成７年改定版
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した従来の技術における問題を解決するためになされたもので、その課題は大型装置、特殊施設、および煩雑な操作を必要としない、安価で簡便かつ迅速なベンゼン系化合物の測定方法、およびその測定キットを提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行い、（１）生物由来のキシレンレセプタータンパク質がベンゼン系化合物と特異的に結合すること、（２）この複合体と特異的に結合するＤＮＡが存在すること、（３）これらの間の相互作用が検出可能であること、（４）さらに検出された結果から結合したベンゼン化合物を定量できることを見い出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明の測定方法は、（１）ベンゼン系化合物とキシレンレセプタータンパク質を溶液中で反応させ、（２）該反応により生じたベンゼン化合物とキシレンレセプタータンパク質の複合体と、該複合体と特異的に結合するＤＮＡをさらに反応させ、（３）該複合体と該ＤＮＡの結合に起因する物理的あるいは化学的変化を検出することにより、（４）キシレンレセプタータンパク質と結合したベンゼン系化合物を定量化することを特徴とする。また、前記測定方法を利用した本発明の測定キットは、キシレンレセプタータンパク質と、該タンパク質とベンゼン系化合物の複合体と特異的に結合するＤＮＡを含むことを特徴としている。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明で利用するキシレンレセプタータンパク質とは、例えばシュードモナス属細菌のＴＯＬプラスミドにコードされている一連のベンゼン系化合物代謝に関わる、複数の酵素遺伝子の転写活性を調節しているレセプタータンパク質である。キシレンレセプタータンパク質はベンゼン系化合物と結合すると、これら酵素遺伝子のプロモーター領域の特定配列と特異的に結合することで、上記の酵素遺伝子の転写を活性化する。本発明はこの生物反応を利用するものである。
【０００９】
本発明で用いるキシレンレセプタータンパク質（以下、ＸｙｌＲと表記する）の由来や構造は、ベンゼン系化合物、ならびに前記特定ＤＮＡ配列（以下、ｐｓプロモーターＤＮＡと表記する）に対する結合能を有してさえいれば特に限定されない。例えば、アミノ酸配列の改変や修飾などにより、ベンゼン系化合物や前記ＤＮＡに対する親和性が高く、検出に好適なタンパク質を作製し利用することができる。また、本発明におけるｐｓプロモーターＤＮＡの由来や構造は、ＸｙｌＲとベンゼン系化合物の複合体に結合することができるのであれば特に限定されない。例えば、配列の改変や修飾などにより、検出に好適なＤＮＡを作製し利用することができる。具体的には、ベンゼン系化合物と結合したＸｙｌＲ（以下、Ｂｚ−ＸｙｌＲ複合体と表記する）が特異的に結合する配列を複数個連続させた人工オリゴヌクレオチドを作製し利用することができる。本発明において測定されるベンゼン系化合物は、ＸｙｌＲにより特異的に結合されるものであれば特に限定されないが、例えばｍ−キシレン、ｏ−キシレン、ｐ−キシレン、３−メチルベンジルアルコール、ｍ−クロロトルエン、ｏ−クロロトルエン、ｐ−クロロトルエン、トルエン、ベンゼン、エチルベンゼン、アニリン、２−４−Ｄなどが挙げられる。
【００１０】
本発明の測定方法においては、ベンゼン系化合物とＸｙｌＲの反応と、Ｂｚ−ＸｙｌＲ複合体とｐｓプロモーターＤＮＡの反応は必ずしも別々に行われる必要はなく、ベンゼン系化合物、ＸｙｌＲ、ｐｓプロモーターＤＮＡを同一溶液中へ同時に導入することも可能である。
【００１１】
本発明の測定方法は、前記ＸｙｌＲが、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素、酵素タンパク質、または蛍光タンパク質のいずれかで標識されていることを特徴とする。これにより、ｐｓプロモーターＤＮＡに結合した標識ＸｙｌＲを検出したり、標識ＸｙｌＲにｐｓプロモーターＤＮＡが結合することによって、例えば標識した酵素による反応が阻害されるのを観察することが可能となる。すなわち、本発明の測定方法の応用範囲を拡大することができる。導入する標識物質と標識方法は、公知の物質または方法から好適なものを選択すればよく、ＸｙｌＲの生物活性、すなわちベンゼン系化合物とｐｓプロモーターＤＮＡに対する結合能を損なうものでなければ特に限定されない。通常の場合、検出の簡便さや生物活性に対する影響度を考慮すると、分子量の小さい蛍光物質または発光物質がより好適である。蛍光物質としては、種々の発蛍光団を有する色素が使用可能であるが、例えばフルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、テキサスレッド誘導体、アクリジン誘導体、マラカイトグリーン誘導体、ピレン誘導体、ルシファーイエロー誘導体、リボフラビン誘導体、フィコエリトリン誘導体、フィコシアニン誘導体、アロフィコシアニン誘導体などが挙げられる。発光物質としては、ルミノール誘導体、Ｎ−メチルアクリジニウム誘導体、ルシフェリン誘導体などが挙げられる。一方、蛍光タンパク質としては緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）やその変異体、必要であれば紫外線により緑から赤に蛍光が変色するカエデなどを使用することが可能である。酵素タンパク質としては、基質と特異的に結合しても反応を触媒する能力を有するタンパク質であれば特に制限されないが、例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトキシダーゼ、ルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などが使用可能である。これらタンパク質の標識方法としては、タンパク質のアミノ酸残基を利用する方法が好適に利用できる。具体的には、システイン残基のチオール基、リジン残基やＮ末端のアミノ基、グルタミン酸残基およびアスパラギン酸残基やＣ末端のカルボキシル基、セリン残基やスレオニン残基の水酸基などを利用し、標識物質の反応基と共有結合を生成させる。とりわけ、システイン残基は特殊なタンパク質を除いてその含量が少なく、アミノ酸の中で最も化学反応性が高いことから好適である。また、タンパク質の機能に関与していないアミノ酸残基を、遺伝子工学的手法により好適な残基に置換してから標識することも可能である。さらに、あらかじめアビジンまたはビオチンを導入し、これらの結合を介して標識することもできる。また、酵素タンパク質や蛍光性タンパク質の場合、ＸｙｌＲとの融合タンパク質として得ることもできる。具体的には、標識タンパク質を発現するベクターの、標識タンパク質をコードする遺伝子の下流にＸｙｌＲをコードする遺伝子を連結し、融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を構築する。これを適当な宿主に導入して形質転換し、得られた形質転換株を培養することにより作製することができる。
【００１２】
本発明の測定方法は、前記ＤＮＡが、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素、酵素タンパク質、または蛍光性タンパク質のいずれかで標識されていることを特徴とする。これにより、ＸｙｌＲに結合した標識ｐｓプロモーターＤＮＡを検出したり、標識ｐｓプロモーターＤＮＡにＢｚ−ＸｙｌＲ複合体が結合することによって、例えば標識した酵素による反応が阻害されるのを観察することが可能となる。導入する標識物質と標識方法は、公知の物質または方法から好適なものを選択すればよく、Ｂｚ−ＸｙｌＲ複合体がｐｓプロモーターＤＮＡに結合するのを妨げなければ特に限定されない。通常の場合、検出の簡便さや生物活性に対する影響度を考慮すると、分子量の小さい蛍光物質または発光物質がより好適である。標識される蛍光物質、発光物質、酵素タンパク質、または蛍光タンパク質としては、前記ＸｙｌＲの標識に例示した種々の物質が同様に使用可能である。標識方法としては、５’末端を好適な標的物質で標識したプライマーを用い、ポリメラーゼ チェイン リアクション（以下、ＰＣＲと表記する）を行うことで末端標識したＤＮＡを得ることができる。さらに、あらかじめアビジンまたはビオチンを導入しておき、これらの結合を介して標識することも可能である。
【００１３】
本発明の測定方法は、前記ＸｙｌＲが固相に固定されていることを特徴とする。これは、Ｂｚ−ＸｙｌＲ複合体と結合したｐｓプロモーターＤＮＡと、未結合のｐｓプロモーターＤＮＡを分離する手段として非常に有効である。ＸｙｌＲを固相に固定する方法は、公知の方法から好適なものを選択すればよく、ＸｙｌＲの生物活性、すなわちベンゼン系化合物とｐｓプロモーターＤＮＡに対する結合能を損なうものでなければ特に限定されない。例えば、ＸｙｌＲのアミノ酸残基と固相上の物質との結合を利用する方法、あるいはタグをつけたＸｙｌＲを作製してそのタグと固相上の物質との吸着や結合を利用する方法などが挙げられる。具体的には、システイン残基のチオール基、リジン残基やＮ末端のアミノ基、グルタミン酸残基およびアスパラギン酸残基やＣ末端にあるカルボキシル基、セリン残基やスレオニン残基の水酸基などを利用して固相上の反応基と共有結合を生成させる方法、固相上のアビジンとビオチン化ＸｙｌＲを結合させる方法、固相上のＮＴＡ等のキレート剤でヒスチジンタグ融合ＸｙｌＲを捕捉する方法、固相上の抗体で抗原融合ＸｙｌＲを捕捉する方法などが挙げられる。
【００１４】
本発明の測定方法は、前記ＤＮＡが、固相に固定されていることを特徴とする。これは、ｐｓプロモーターＤＮＡと結合したＢｚ−ＸｙｌＲ複合体と、未結合のＸｙｌＲを分離する手段として非常に有効である。ｐｓプロモーターＤＮＡを固相に固定する方法は、公知の方法から好適なものを選択すればよく、ＸｙｌＲがｐｓプロモーターＤＮＡに結合するのを妨げなければ特に限定されない。例えば、固相上のアビジンとビオチン化ｐｓプロモーターＤＮＡの結合により固定する方法などが挙げられる。
【００１５】
本発明の検出方法は、表面プラズモン共鳴を利用することを特徴とする。表面プラズモン共鳴法（以下、ＳＰＲと表記する）は、プリズム表面の金属薄膜上の質量変化に伴う屈折率変化を検出する方法であり、物質の相互作用を標識なしで検出することが可能である。具体的には、物質Ｌ（以下、リガンドと表記する）を金属薄膜表面に固定し、これに作用する物質Ａ（以下、アナライトと表記する）を含む試料を展開することにより、Ｌ−Ａの結合に伴う金属薄膜表面での微量な質量変化による屈折率変化を検出する。本発明においては、ＸｙｌＲをリガンド、ｐｓプロモーターＤＮＡをアナライトとする方法、またはｐｓプロモーターＤＮＡをリガンド、ＸｙｌＲをアナライトとする方法のいずれも利用可能である。リガンドを固相表面に固定する方法は公知の方法から好適なものを選択すればよく、ＸｙｌＲとベンゼン系化合物、Ｂｚ−ＸｙｌＲ複合体とｐｓプロモーターＤＮＡとの結合を妨げるものでなければ特に限定されない。具体的には、あらかじめ金属表面に結合可能な官能基を有する物質を導入してリガンドが有する反応基と化学的に結合させるか、金属表面をリガンドと化学的に結合または吸着可能な物質で修飾した後、リガンドを反応させることにより固定することができる。
【００１６】
また本発明の検出方法は、水晶振動子を利用することを特徴とする。水晶振動子法の原理は前記ＳＰＲ法と類似している。具体的には、振動子の表面に物質が吸着すると振動子を組み込んだ発振回路の発振周波数が変化することに基づいており、物質の相互作用を標識なしで検出することができる。すなわち、物質Ｌを振動子の表面に固定し、これに作用する物質Ａを含む試料を展開することにより、Ｌ−Ａの結合に伴う振動子表面での微量な質量変化を発振周波数の変化として検出する。本発明においては、ＸｙｌＲをリガンド、ｐｓプロモーターＤＮＡをアナライトとする方法、またはｐｓプロモーターＤＮＡをリガンド、ＸｙｌＲをアナライトとする方法のいずれも利用可能である。リガンドを固相表面に固定する方法は、前記ＳＰＲの場合と全く同様に公知の方法から好適なものを選択することができる。
【００１７】
本発明の検出方法は、蛍光物質間で生じる蛍光共鳴エネルギー移動を利用することを特徴とする。蛍光共鳴エネルギー移動（以下、ＦＲＥＴと表記する）とは、１つの発蛍光団（以下、供与体と表記する）の蛍光スペクトルが他の発色団（以下、受容体と表記する）の励起スペクトルと重なり、かつ供与体と受容体が充分に接近する位置にある場合、供与体の励起が受容体からの蛍光を誘導し、更に供与体自身からの蛍光強度は減少するという現象である。本発明で使用される供与体及び受容体となる蛍光物質は、ＸｙｌＲまたはｐｓプロモーターＤＮＡに標識された状態でＦＲＥＴを生起することが可能な組み合わせであれば、特に制限されない。種々の発蛍光団を有する色素が使用可能であるが、例えばフルオレセイン系、ローダミン系の色素等が好適に使用することができる。フルオレセインは４９２ ｎｍで励起した場合に５１８ ｎｍに蛍光のピークを示し、ローダミンは５７０ ｎｍで励起した場合に５９０ ｎｍに蛍光ピークを示す。この２種類の発色光団がＦＲＥＴを生じるに充分に近い位置にある場合には、供与体であるフルオレセインから受容体であるローダミンへの蛍光エネルギー移動が起こり、フルオレセインに由来する蛍光強度は減少し、ローダミンに由来する蛍光強度が増加することになる。
【００１８】
本発明の測定キットは、ＸｙｌＲと、Ｂｚ−ＸｙｌＲ複合体と特異的に結合するＤＮＡからなることを特徴とする。本測定キットにおいて、ＸｙｌＲとｐｓプロモーターＤＮＡが（１）各々一定の濃度で含まれる溶液、あるいは（２）乾燥状態、または固定化された状態の各々一定量の固体とそれを溶解可能な溶媒の組み合わせ、のいずれかの形態で供給される。溶媒となる溶液としては測定に好適な溶液、例えば緩衝液が好適に利用される。
【００１９】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、以下の実施例により本発明は何ら限定されない。
【００２０】（実施例１）
測定キット（１）の作製
ＸｙｌＲをコードする遺伝子をシュードモナス属菌のＴＯＬプラスミドからＰＣＲにより増幅した。これをプロモーター、ターミネーター等を有するベクターの中の発現可能な位置に挿入し、得られた発現ベクターで大腸菌を形質転換した。得られた形質転換大腸菌を培養した後、菌体を遠心分離で集菌し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０、以下の全実施例に共通の緩衝液）に懸濁した。超音波処理により菌体を破砕し、遠心分離して上清画分を回収することによりＸｙｌＲを含む細胞抽出液を得た。次いで、この抽出液をイオン交換クロマトグラフィーとゲルろ過クロマドグラフィーに供することによりＸｙｌＲを精製した。得られたＸｙｌＲをビオチン化試薬（同仁化学研究所製）を用いてビオチン標識し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させて５００μｇ／ｍｌのビオチン化ＸｙｌＲ溶液を調製した。さらに、ストレプトアビジンをコートした９６穴プレート（ナルゲン社製）にビオチン化ＸｙｌＲ溶液を５０μｌ加え、室温で１０分間回転振とうした後、同一のＰＢＳ緩衝液で洗浄した。次に、シュードモナス属菌のＴＯＬプラスミドを鋳型として、一方のプライマーとして５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅ＤＮＡをＰＢＳ緩衝液（ｐＨ ７．０）に溶解させ、５００μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識ｐｓプロモーターＤＮＡ溶液を調製した。この測定系を測定キット（１）とした。
【００２１】（実施例２）
測定キット（１）によるｍ−キシレンの測定
ベンゼン系化合物としてｍ−キシレン（和光純薬製）をＤＭＳＯ（和光純薬製）に溶解させた後、さらにＰＢＳ緩衝液に溶解させ、最終的に０．０１〜５０μｇ／ｍｌの濃度のｍ−キシレンと、０．２％（ｖ／ｖ）の濃度のＤＭＳＯを含むキシレン溶液を調製した。各濃度のキシレン溶液５０ μｌを測定キット（１）のＸｙｌＲを固定したウェルに加え、室温で５分間回転振とうし、５０μｌのＦＩＴＣ標識ｐｓプロモーターＤＮＡ溶液を加え、室温で１０分間回転振とうした後ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。蛍光光度計を用いて波長４９４ｎｍで励起し、波長５１８ｎｍの蛍光を測定した。その結果を図１に示した。図１の結果から、測定キット（１）では０．０１〜５μｇ／ｍｌの濃度のｍ−キシレンが測定可能であった。
【００２２】（実施例３）
測定キット（２）の作製
実施例１で作製したＸｙｌＲを、ビオチン化試薬（同仁化学研究所製）を用いてビオチン標識し、ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジンと反応させた後にＰＢＳ緩衝液に溶解させ、５００μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識ＸｙｌＲ溶液を調製した。次いで、シュードモナス属菌のＴＯＬプラスミドを鋳型として、一方のプライマーとして５’末端ビオチン化オリゴヌクレオチド用いてＰＣＲを行い、得られた増幅ＤＮＡをＰＢＳ緩衝液に溶解させ、５００μｇ／ｍｌの末端ビオチン化ｐｓプロモーターＤＮＡ溶液とした。ストレプトアビジンをコートした９６穴プレート（ナルゲン社製）に前記ビオチン化ｐｓプロモーターＤＮＡ溶液を５０μｌ加え、室温で１０分間回転振とうした後ＰＢＳ緩衝液洗浄した。この測定系を測定キット（２）とした。
【００２３】（実施例４）
測定キット（２）によるｍ−キシレンの測定
実施例２で作製した各濃度のキシレン溶液とＦＩＴＣ標識ＸｙｌＲ溶液の各５０μｌを、室温で約５分間混合した。混合液をｐｓプロモーターＤＮＡ固定ウェルに加え、室温で１０分間回転振とうした後、ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。蛍光光度計を用いて波長４９４ｎｍで励起し、波長５１８ｎｍの蛍光を測定した。その結果を図２に示した。図２の結果から、測定キット（２）では０．０１〜１．０μｇ／ｍｌの濃度のｍ−キシレンが測定可能であった。
【００２４】（実施例５）
測定キット（３）の作製
実施例１で作製したＸｙｌＲをＰＢＳ緩衝液に溶解させ、５００μｇ／ｍｌのＸｙｌＲ溶液を調製した。次いで、シュードモナス属菌のＴＯＬプラシミドを鋳型とし、プライマーとして５’末端ビオチン化オリゴヌクレオチドと、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド用いてＰＣＲを行い、得られた増幅ＤＮＡをＰＢＳ緩衝液に溶解させて、５００μｇ／ｍｌのビオチン化ＦＩＴＣ標識ｐｓプロモーターＤＮＡ溶液を調製した。ストレプトアビジンをコートした９６穴プレート（ナルゲン社製）に前記ビオチン化ＦＩＴＣ標識ｐｓプロモーターＤＮＡ溶液を５０μｌ加え、室温で１０分間回転振とうした後ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。この測定系を測定キット（３）とした。
【００２５】（実施例６）
測定キット（３）によるｍ−キシレンの測定
実施例２で作製した各濃度のキシレン溶液とＸｙｌＲ溶液の各５０μｌを、室温で約５分間混合した。混合液をＦＩＴＣ標識ｐｓプロモーターＤＮＡ固定ウェルに加え、室温で１０分間回転振とうした後ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。蛍光光度計を用いて波長４９４ｎｍで励起し、波長５１８ｎｍの蛍光を測定した。その結果を図３に示した。図３の結果から、測定キット（３）では０．１〜５０μｇ／ｍｌの濃度のｍ−キシレンが測定可能であった。
【００２６】（実施例７）
測定キット（４）の作製
実施例１で作製したＸｙｌＲをビオチン化試薬（同仁化学研究所製）を用いてビオチン標識し、ＰＢＳ緩衝液に溶解させ５００μｇ／ｍｌのビオチン化ＸｙｌＲ溶液を調製した。次いで、シュードモナス属菌のＴＯＬプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡをＰＢＳ緩衝液に溶解させ、１００μｇ／ｍｌのｐｓプロモーターＤＮＡ溶液を調製した。ビオチン化ＸｙｌＲ溶液を、あらかじめストレプトアビジンが固定されているセンサーチップＳＡ（ビアコア社製）に流速１５μｌ／ｍｉｎで１０分間展開し、ストレプトアビジンとビオチンの結合を介してＸｙｌＲをチップ上に固定した。この測定系を測定キット（４）とした。
【００２７】（実施例８）
測定キット（４）によるｍ−キシレンの測定
ｐｓプロモーターＤＮＡ溶液１０μｌと実施例２で作製したキシレン溶液５０μｌを混合後、ＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００、ビアコア社製）に供した。すなわち、ＸｙｌＲを固定したセンサーチップにこの混合溶液を流速２０μｌ／ｍｉｎで２分間展開した後、ＰＢＳ緩衝液で４０秒間洗浄した。混合溶液展開開始点における共振シグナルを０とした時の、洗浄後の共振シグナルをレスポンスとした。測定結果を図４に示した。表面プラズモン共鳴による検出を利用した測定キット（４）では、０．５〜５０μｇ／ｍｌの濃度のｍ−キシレンが測定可能であった。
【００２８】（実施例９）
測定キット（５）の作製
実施例１で作製したＸｙｌＲをＰＢＳ緩衝液に溶解させ、５００μｇ／ｍｌのＸｙｌＲ溶液を調製した。次いで、シュードモナス属菌のＴＯＬプラスミドを鋳型とし、一方のプライマーとして５’末端ビオチン化オリゴヌクレオチド用いてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡをＰＢＳ緩衝液に溶解させ、１００μｇ／ｍｌの末端ビオチン化ｐｓプロモーターＤＮＡ溶液を調製した。ビオチン化プロモーターＤＮＡ溶液をあらかじめストレプトアビジンが固定されているセンサーチップＳＡ（ビアコア社製）に流速１５μｇ／ｍｉｎで１０分間展開し、ストレプトアビジンとビオチンの結合を介してｐｓプロモーターＤＮＡをチップ上に固定した。この測定系を測定キット（５）とした。
【００２９】（実施例１０）
測定キット（５）によるｍ−キシレンの測定
ＸｙｌＲ溶液１０μｌと実施例２で作製したキシレン溶液５０μ１を混合後、実施例８と同様にＳＰＲに供した。すなわち、ｐｓプロモーターＤＮＡを固定したセンサーチップにこの混合溶液を流速２０μｌ／ｍｉｎで２分間展開した後ＰＢＳ緩衝液で４０秒間洗浄した。混合溶液展開開始点における共振シグナルを０とした時の、洗浄後の共振シグナルをレスポンスとした。測定結果を図５に示した。図５の結果から、表面プラズモン共鳴による検出を利用した測定キット（５）では、０．５〜５０μｇ／ｍｌの濃度のｍ−キシレンが測定可能であった。
【００３０】（実施例１１）
測定キット（６）の作製
実施例１で作製したＸｙｌＲを、ビオチン化試薬（同仁化学研究所製）を用いてビオチン標識し、ＰＢＳ緩衝液に溶解させ５００μｇ／ｍｌのビオチン化ＸｙｌＲ溶液を調製した。次いで、シュードモナス属菌のＴＯＬプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡをＰＢＳ緩衝液に溶解させ、１００μｇ／ｍｌのｐｓプロモーターＤＮＡ溶液を調製した。さらに、水晶振動子の金表面を、５ｍＭ １０−カルボキシ−１−デカンチオール（同人化学研究所製）の８０％エタノール溶液で４０℃で２０分間反応させ、カルボキシル基を導入した。アミンカップリングによりストレプトアビジンを固定し、溶液セルにビオチン化ＸｙｌＲ溶液を１００μｌ注入し、ストレプトアビジンとビオチンの結合を介して水晶振動子上にＸｙｌＲを固定した。この測定系を測定キット（６）とした。
【００３１】（実施例１２）
測定キット（６）によるｍ−キシレンの測定
溶液セルに２０μｌのＸｙｌＲ溶液を注入後、実施例２で作製したキシレン溶液１００μｌを加えた。キシレン溶液を加える前の周波数を０としたとき時の、周波数変化量の絶対値をレスポンスとした。測定結果を図６に示した。図６の結果から、水晶振動子による検出を利用した測定キット（６）では、０．５〜１０μｇ／ｍｌの濃度のｍ−キシレンが測定可能であった。
【００３２】（実施例１３）
測定キット（７）の作製
実施例１で作製したＸｙｌＲをＰＢＳ緩衝液ＰＢＳに溶解させ５００μｇ／ｍｌのＸｙｌＲ溶液を調製した。次いで、シュードモナス属菌のＴＯＬプラスミドを鋳型として、一方のプライマーとして５’末端ビオチン化オリゴヌクレオチド用いてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡをＰＢＳ緩衝液に溶解させ、１００μｇ／ｍｌの末端ビオチン化ｐｓプロモーターＤＮＡ溶液を調整した。水晶振動子の金表面を、５ｍＭ １０−カルボキシ−１−デカンチオール（同人化学研究所製）の８０％エタノール溶液で４０℃で２０分間反応させ、カルボキシル基を導入した。アミンカップリングによりストレプトアビジンを固定し、溶液セルにビオチン化ｐｓプロモーターＤＮＡ溶液を１００μｌ注入し、ストレプトアビジンとビオチンの結合を介してｐｓプロモーターＤＮＡを水晶振動子上に固定した。この測定系を測定キット（７）とした。
【００３３】（実施例１４）
測定キット（７）によるｍ−キシレンの測定
溶液セルに２０μｌのｐｓプロモーターＤＮＡ溶液を注入後、実施例２で作製したキシレン溶液１００μｌを加えた。キシレン溶液を加える前の周波数を０とした時の、周波数変化量の絶対値をレスポンスとした。測定結果を図７に示した。図７の結果から、水晶振動子による検出を利用した測定キット（７）では、０．５〜１０μｇ／ｍｌの濃度のｍ−キシレンが測定可能であった。
【００３４】（実施例１５）
測定キット（８）の作製
実施例１で作製したＸｙｌＲを、ビオチン化試薬（同仁化学研究所製）を用いてビオチン標識し、ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジンと反応させＰＢＳ緩衝液に溶解させ、１．０ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識ＸｙｌＲ溶液を調製した。次いで、シュードモナス属菌のＴＯＬプラスミドを鋳型として、一方のプライマーとして５’末端ローダミン標識オリゴヌクレオチド用いてＰＣＲを行い、ＰＢＳ緩衝液に溶解させ、５００μｇ／ｍｌのローダミン標識ｐｓプロモーターＤＮＡ溶液を調製した。あらかじめストレプトアビジンがコートされた９６穴プレート（ナルゲン社製）に前記ビオチン化ＦＩＴＣ標識ＸｙｌＲ溶液を５０μｌ加え、室温で２０分間回転振とうした後ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。この測定系を測定キット（８）とした。
【００３５】（実施例１６）
測定キット（８）によるｍ−キシレンの測定
実施例２で作製した各濃度のキシレン溶液とローダミン標識ｐｓプロモーターＤＮＡ溶液の各５０μｌを、室温で約５分間混合した。混合液をＦＩＴＣ標識ＸｙｌＲ固定ウェルに加え、室温で１０分間回転振とうした後ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。蛍光光度計を用いて波長４９４ｎｍで励起し、波長５１８ｎｍの蛍光を測定した。その結果を図８に示した。図８の結果から、蛍光共鳴エネルギー移動による検出を利用した測定キット（８）では、０．１〜１０μｇ／ｍｌの濃度のｍ−キシレンが測定可能であった。
【００３６】（実施例１７）
測定キット（９）の作製
実施例１で作製したＸｙｌＲを、ビオチン化試薬（同仁化学研究所製）を用いてビオチン標識し、ローダミン標識ストレプトアビジンと反応させ、ＰＢＳ緩衝液に溶解させて５００μｇ／ｍｌのローダミン標識ＸｙｌＲ溶液を調製した。次いで、シュードモナス属菌のＴＯＬプラスミドを鋳型とし、プライマーとして５’末端ビオチン化オリゴヌクレオチドと、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド用いてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡをＰＢＳ緩衝液に溶解させて、５００μｇ／ｍｌのビオチン化ＦＩＴＣ標識ｐｓプロモーターＤＮＡ溶液を調製した。あらかじめストレプトアビジンがコートされた９６穴プレート（ナルゲン社製）に前記ビオチン化ＦＩＴＣ標識ｐｓプロモーターＤＮＡ溶液を５０μｌ加え、室温で１０分間回転振とうした後ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。この測定系を測定キット（９）とした。
【００３７】（実施例１８）
測定キット（９）によるｍ−キシレンの測定
実施例２で作製した各濃度のキシレン溶液とローダミン標識ＸｙｌＲ溶液の各５０μｌを、室温で約５分間混合した。混合液をＦＩＴＣ標識ｐｓプロモーターＤＮＡ固定ウェルに加え、室温で１０分間回転振とうした後ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。蛍光光度計を用いて波長４９４ｎｍで励起し、波長５１８ｎｍの蛍光を測定した。その結果を図９に示した。図９の結果から、蛍光共鳴エネルギー移動による検出を利用した測定キット（９）では、０．１〜５μｇ／ｍｌの濃度のｍ−キシレンが測定可能であった。
【００３８】
【図面の簡単な説明】
【図１】固相に固定したＸｙｌＲと結合した蛍光標識ｐｓプロモーターＤＮＡの検出を利用した、ｍ−キシレンの測定結果を示す図である。実施例２の測定結果を示している。
【図２】固相に固定したｐｓプロモーターＤＮＡと結合した蛍光標識ＸｙｌＲの検出を利用した、ｍ−キシレンの測定結果を示す図である。実施例４の測定結果を示している。
【図３】固相に固定した蛍光標識ｐｓプロモーターＤＮＡとＸｙｌＲとの結合による蛍光強度の減少を利用した、ｍ−キシレンの測定結果を示す図である。実施例６の測定結果を示している。
【図４】ＸｙｌＲをリガンド、ｐｓプロモーターＤＮＡをアナライトとした表面プラズモン共鳴による検出を利用した、ｍ−キシレンの測定結果を示す図である。実施例８の測定結果を示している。
【図５】ｐｓプロモーターＤＮＡをリガンド、ＸｙｌＲをアナライトとした表面プラズモン共鳴を利用した、ｍ−キシレンの測定結果を示す図である。実施例１０の測定結果を示している。
【図６】ＸｙｌＲをリガンド、ｐｓプロモーターＤＮＡをアナライトとした水晶振動子による検出を利用した、ｍ−キシレンの測定結果を示す図である。実施例１２の測定結果を示している。
【図７】ｐｓプロモーターＤＮＡをリガンド、ＸｙｌＲをアナライトとした水晶振動子による検出を利用した、ｍ−キシレンの測定結果を示す図である。実施例１４の測定結果を示している。
【図８】固相に固定した蛍光標識ＸｙｌＲと、結合した蛍光標識ｐｓプロモーターＤＮＡとの蛍光共鳴エネルギー移動による検出を利用した、ｍ−キシレンの測定結果を示す図である。実施例１６の測定結果を示している。
【図９】固相に固定した蛍光標識ｐｓプロモーターＤＮＡと、結合した蛍光標識ＸｙｌＲとの蛍光共鳴エネルギー移動による検出を利用した、ｍ−キシレンの測定結果を示す図である。実施例１８の測定結果を示している。
Claims (9)
- （１）ベンゼン系化合物とキシレンレセプタータンパク質を溶液中で反応させ、（２）該反応により生じたベンゼン化合物とキシレンレセプタータンパク質との複合体と、該複合体と特異的に結合するＤＮＡをさらに反応させ、（３）該複合体と該ＤＮＡの結合に起因する物理的あるいは化学的変化を検出することにより、（４）キシレンレセプタータンパク質と結合したベンゼン系化合物を定量化することを特徴とする、ベンゼン系化合物の測定方法
- 前記（１）キシレンレセプタータンパク質が、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素、酵素タンパク質、または蛍光タンパク質のいずれかで標識されていることを特徴とする請求項１に記載の測定方法
- 前記（２）ＤＮＡが、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素、酵素タンパク質、または蛍光タンパク質のいずれかで標識されていることを特徴とする請求項１に記載の測定方法
- 前記（１）キシレンレセプタータンパク質が、固相に固定されていることを特徴とする請求項１〜３に記載の測定方法
- 前記（２）ＤＮＡが、固相に固定されていることを特徴とする請求項１〜３に記載された測定方法
- 前記（３）検出が、表面プラズモン共鳴法を利用することを特徴とする請求項１、４、５いずれかに記載の測定方法
- 前記（３）検出が、水晶振動子を利用することを特徴とする請求項１、４、５いずれかに記載の測定方法
- 前記（３）検出が、蛍光物質間で生じる蛍光共鳴エネルギー移動を利用することを特徴とする請求項１〜５に記載の測定方法
- 前記キシレンレセプタータンパク質と、該タンパク質とベンゼン系化合物との複合体に特異的に結合するＤＮＡを含むことを特徴とする、請求項１〜８に記載の測定方法を利用した測定キット
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003094431A JP2004301637A (ja) | 2003-03-31 | 2003-03-31 | ベンゼン系化合物の測定方法および測定キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003094431A JP2004301637A (ja) | 2003-03-31 | 2003-03-31 | ベンゼン系化合物の測定方法および測定キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004301637A true JP2004301637A (ja) | 2004-10-28 |
Family
ID=33406999
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003094431A Pending JP2004301637A (ja) | 2003-03-31 | 2003-03-31 | ベンゼン系化合物の測定方法および測定キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2004301637A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010004736A1 (ja) * | 2008-07-10 | 2010-01-14 | 国立大学法人宇都宮大学 | Ｄｎａを素子としたバイオセンサー |
-
2003
- 2003-03-31 JP JP2003094431A patent/JP2004301637A/ja active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010004736A1 (ja) * | 2008-07-10 | 2010-01-14 | 国立大学法人宇都宮大学 | Ｄｎａを素子としたバイオセンサー |
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