JP2004269532A - 導電性化合物、これを含む電極及びセンサー、並びに前記センサーを利用した標的分子の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】導電性化合物、これを含む電極及びセンサー、前記センサーを利用した標的分子の検出方法を提供する。
【解決手段】一般式（Ｉ）を有する導電性化合物である。

センサーは、プローブ８が共有結合した導電性化合物６が塗布された作用極４、対極１２、静電電圧計１２等で構成される。
【選択図】図１

Description

本発明は、導電性を有する新規な化合物、前記化合物が塗布された電極及び前記電極を含むセンサー、並びに前記センサーを利用した標的分子の検出方法に関する。

現在、電気化学の原理を利用した生体物質検知用センサーを開発すべく、多くの研究が進行している。電気化学の原理を使用すれば、小型化しやすいという利点があるため、イオンセンサー、ガスセンサー及びバイオセンサーについての多くの研究が進展している。生体物質のうちでもＤＮＡハイブリダイゼーションの有無に関する情報または蛋白質の３次構造の変化をモニターすることは、ゲノミクスおよびプロテオミクスの分野において非常に重要である。このため、電気化学的活性を有する有機物を利用したセンサー及び導電性高分子を利用したセンサーが開発されている。特に、インターカレータを利用したセンサーについては、現在市販を控えている程度に多くの研究が進行している。

一方、導電性高分子の場合、電極において重合されうる代表的な単量体は限られているため、重合された高分子の物性を制御することは困難であり、その結果、研究の進行は比較的遅かった。導電性高分子センサーの材料として利用される代表的な物質としては、ピロール、チオフェン、アニリンなどが挙げられる。このうち、アニリンは酸性条件下でのみ用いられうるため、ピロールおよびチオフェンが主な研究対象とされてきた。

しかしながら、ピロールは、酸化還元電位が低いため、長時間使用することが困難である（特許文献１参照）。チオフェンは、ピロールよりは高い酸化還元電位を有するが、ピロールよりも疎水性であるため、水を基本的な溶媒として使用する生体分子システムに適していないという問題点がある（非特許文献１参照）。

また、前記のような導電性高分子を利用する場合には、ポリピロールまたはポリチオフェンの鎖の長さを制御できないため、ポリマー薄膜の厚さが不均一になるという問題点もあった。このような問題点によって、前記高分子を含むセンサーを用いて、本来的に分散しているＤＮＡのような極微量の標的分子を検出することは困難である。また、鎖の長さの制御が困難であるため、標的分子との反応によって発生する信号の再現性も低かった。
米国特許第６，２０１，０８６号明細書 Ｂａｕｅｒｌｅ Ｐ．及びＥｍｇｅ，Ａ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒｉ．，３：３２４（１９９８）

これにより、薄膜の厚さを均一に制御できる自己組織化単分子膜（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ：ＳＡＭ）を形成しようとする研究が進行し、本発明者らは、ＳＡＭを形成する新規な導電性化合物を初めて合成することに成功した。

本発明の目的は、導電性を有する新規な化合物を提供することである。

また、本発明の目的は、前記導電性化合物を含む電極及びこの電極を含むセンサーを提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記センサーを利用して標的分子を検出する方法を提供することである。

前記目的を達成するために本発明は、下記一般式（Ｉ）の導電性化合物を提供する。

また、前記目的を達成するために本発明は、下記一般式（ＩＶ）の化合物をチオウレアと反応させることを特徴とする、前記一般式（Ｉ）の導電性化合物を製造する方法を提供する。

また、前記目的を達成するために本発明は、下記一般式（Ｖ）の化合物と下記一般式（ＶＩ）の化合物とを反応させる段階を含む、前記一般式（Ｉ）の導電性化合物を製造する方法を提供する。

前記目的を達成するために本発明は、前記一般式（Ｉ）の導電性化合物が塗布された金電極及び前記金電極を含むセンサーを提供する。

前記目的を達成するために本発明は、下記段階を含む標的分子の検出方法を提供する：
（ａ）下記一般式（Ｉ）の導電性化合物を金基板上に固定化して自己組織化単分子膜を形成する段階；

（ｂ）前記自己組織化単分子膜の表面にプローブを反応させる段階；
（ｃ）前記プローブと特異的に反応する標的分子を前記プローブに接触させて、標的分子−プローブ複合体を形成させる段階；
（ｄ）前記標的分子−プローブ複合体からの電気的信号を測定する段階。

前記目的を達成するために本発明は、下記段階を含む標的分子の検出方法を提供する：
（ａ）下記一般式（Ｉ）の導電性化合物を金基板上に固定化して自己組織化単分子膜を形成する段階；

（ｂ）前記自己組織化単分子膜の前記プローブ基と特異的に反応する標的分子を前記プローブ基と接触させて、標的分子−プローブ複合体を形成させる段階； （ｃ）前記標的分子−プローブ複合体からの電気的信号を測定する段階。

本発明の導電性化合物は、電極またはセンサーを製造するのに使用されると、高い反応性及び安定性が提供される。

本発明の電極及びセンサーは感度および再現性が高い。

本発明の標的分子の検出方法によれば、試料中の標的分子を効率的に検出できる。

本発明は、下記一般式（Ｉ）を有する導電性化合物を提供する。

本発明において「脱離基」とは、一般的に求核体による置換反応過程において脱離する傾向を有し、脱離することにより通常負電荷を帯びる官能基である。前記脱離基には、例えば、ヒドロキシスクシンイミジル基、ヒドロキシフタルイミジル基、ペンタフルオロフェノーリル基、４−クロロベンジルアルコール基、ＴｓＯ⁻基、Ｉ⁻基、Ｂｒ⁻基、Ｃｌ⁻基等が含まれる。

本発明において、「プローブ」とは、特定化合物に特異的に結合しうる化合物である。前記プローブには核酸または蛋白質が含まれる。具体的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、抗体、抗原、酵素、基質または補因子が含まれる。

本発明の前記一般式（Ｉ）の化合物は、導電性であり、金のような電極にコーディングされることができ、センサーにも使用されうる。前記電極またはセンサーは、標的分子−プローブ複合体から発生する電気的信号を利用して特定な化合物を検出するのに使用されうる。また、前記一般式（Ｉ）の導電性化合物は、前記電極またはセンサーを使用する標的分子の検出方法にも使用されうる。

前記一般式（Ｉ）の導電性化合物において、好ましくは、Ｙはカルボニル基であり、ＲはＯＨであり、ｌは５であり、ｍは１であり、ｎは１である（下記一般式（ＩＩ）の化合物を参照）。または、前記一般式（Ｉ）の導電性化合物において、好ましくは、前記Ｙはカルボニル基であり、Ｒはヒドロキシフタルイミジル基であり、ｌは５であり、ｍは３であり、ｎは１である（下記一般式（ＩＩＩ）の化合物を参照）。

前記一般式（ＩＩ）の化合物は、好ましくは、次の過程によって合成されうる。

また、前記一般式（ＩＩＩ）の化合物は、好ましくは、次の過程によって合成されうる。

本発明はまた、下記一般式（ＩＶ）の化合物をチオウレアと反応させて、前記一般式（Ｉ）の導電性化合物を製造する方法を提供する。

前記脱離基は、好ましくは、ヒドロキシスクシンイミジル基、ヒドロキシフタルイミジル基、ペンタフルオロフェノーリル基、または４−クロロベンジルアルコール基である。前記方法は、塩基性条件下で反応させ、中和させる段階を含むものであってもよい。

本発明はまた、下記一般式（Ｖ）の化合物と下記一般式（ＶＩ）の化合物とを反応させる段階を含む前記一般式（Ｉ）の導電性化合物を製造する方法を提供する。

前記脱離基は、好ましくは、ヒドロキシスクシンイミジル基、ヒドロキシフタルイミジル基、ペンタフルオロフェノーリル基、または４−クロロベンジルアルコール基である。

本発明はまた、前記一般式（Ｉ）を有する導電性化合物が塗布された電極を提供する。電極材料としては、金のような通常用いられる材質が使用されうる。

また、本発明は、前記導電性化合物が塗布された電極を含むセンサーを提供する。

前記センサーは、前記導電性化合物が塗布された電極を含むことを除いては、通常のセンサーの構成成分で構成される。前記センサーには通常用いられる作用極（ＷＥ：Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）、対極及び参照電極が含まれうる。

図１は、本発明の導電性化合物が塗布された電極を含むセンサーの一例を示す構成図である。図１に示すように、前記センサーは、プローブ８が共有結合した本発明の導電性化合物６が塗布されたＷＥ４、対極１２及び参照電極１４を含む電極、並びに、電圧を測定できる静電電圧計２で構成される。前記センサーのうちプローブが共有結合した本発明の導電性化合物６が塗布されたＷＥ４は、次の過程によって製造されうる。ＲがＨ、ＯＨ、ヒドロキシスクシンイミジル基、ヒドロキシフタルイミジル基、ペンタフルオロフェノーリル基、または４−クロロベンジルアルコール基である一般式（Ｉ）の導電性化合物を基板上に固定化してＳＡＭを形成し、プローブ、例えばＤＮＡをここにカップリングしてプローブが共有結合した本発明の導電性化合物が塗布された電極が製造されうる。また、Ｒがプローブである一般式（Ｉ）の導電性化合物を先に合成した後、基板上に固定化してＳＡＭを形成することによって、プローブが共有結合した本発明の導電性化合物が塗布された電極を製造してもよい。このように製造された電極は、センサーのＷＥ４として使用されうる。

本発明の前記センサーを利用して試料中の標的分子１０を検出できる。センサーのＷＥ４に結合したプローブ８と試料とを接触させれば、試料に存在する標的分子１０がプローブ８とハイブリダイズし、このハイブリダイゼーション反応によって電圧または電流の変化が発生する。このような電圧または電流の変化を測定することによって試料中の標的分子１０を検出できる（図１参照）。

前記電圧または電流の変化は、次のような機構によって発生すると考えられるが、この機構に限定されない。特定の酸化還元電位で測定される電流の量は、基板上の導電性化合物の非局在化の程度に依存する。本発明の導電性化合物に共有結合したプローブが標的分子とハイブリダイズする場合、ハイブリダイズしていない場合より非局在化の程度が低い。したがって、プローブと標的分子とがハイブリダイズすると、電流量は減少する。例えば、ＤＮＡプローブが標的ＤＮＡとハイブリダイズして二本鎖ＤＮＡを形成すれば、電流量が減少する。したがって、プローブと標的分子とのハイブリダイゼーションによる酸化還元電位の減少、またはハイブリダイズしないことによる酸化還元電位の増加を測定することによって、標的分子が検出されうる。

図２は、本発明の導電性化合物が塗布された電極を含むセンサーの他の一例を示す構成図である。前記センサーは、ＷＥ４、対極１２、参照電極１４で構成される。前記ＷＥ４には、本発明の導電性化合物が塗布されている。

また、本発明は、下記段階を含む標的分子の検出方法を提供する。

（ａ）下記一般式（Ｉ）の導電性化合物を金基板上に固定化してＳＡＭを形成する段階；

（ｂ）前記ＳＡＭの表面にプローブを反応させる段階；
（ｃ）前記プローブと特異的に反応する標的分子を前記プローブに接触させて、標的分子−プローブ複合体を形成させる段階；
（ｄ）前記標的分子−プローブ複合体からの電気的信号を測定する段階。

前記脱離基は、好ましくは、ヒドロキシスクシンイミジル基、ヒドロキシフタルイミジル基、ペンタフルオロフェノーリル基、または４−クロロベンジルアルコール基である。

前記（ｄ）段階において、前記標的分子−プローブ複合体は、標的分子と電極上に固定化されているプローブ分子との間の特異的相互作用によって形成されうる。前記特異的相互作用には、共有結合だけでなく、疎水性結合、水素結合、ファンデルワールス結合、及びイオン結合のような非共有結合が含まれるが、これらの例に限定されない。例えば、標的分子が特定のヌクレオチド配列を有するＤＮＡの場合、プローブＤＮＡと標的ＤＮＡとの間の特異的相互作用は、２本の一本鎖ＤＮＡ間のハイブリダイゼーション反応であってもよい。この場合、前記２本の一本鎖ＤＮＡは、一般に、完全にまたは部分的に二本鎖を形成しうる相補的なヌクレオチド配列を有する。前記２本の一本鎖ＤＮＡが部分的に相補的な配列を有する場合には、配列に応じて、塩濃度及び温度のようなハイブリダイゼーション条件を調整することによって、ハイブリダイゼーション反応が誘導されうる。

また、本発明は、下記段階を含む標的分子の検出方法を提供する：
（ａ）下記一般式（Ｉ）の導電性化合物を金基板上に固定化してＳＡＭを形成する段階；

（ｂ）前記ＳＡＭのプローブ基と特異的に反応する標的分子を前記プローブ基と接触させて、標的分子−プローブ複合体を形成させる段階；
（ｃ）前記標的分子−プローブ複合体からの電気的信号を測定する段階。

前記（ｃ）段階において、前記標的分子−プローブ複合体は、標的分子と電極上に固定化されているプローブ分子との間の特異的相互作用によって形成されうる。前記特異的相互作用には、共有結合だけでなく、疎水性結合、水素結合、ファンデルワールス結合、及びイオン結合のような非共有結合が含まれるが、これらの例に限定されない。例えば、標的分子が特定のヌクレオチド配列を有するＤＮＡである場合、プローブＤＮＡと標的ＤＮＡとの間の特異的相互作用は、２本の一本鎖ＤＮＡ間のハイブリダイゼーション反応であってもよい。この場合、前記２本の一本鎖ＤＮＡは、一般に、完全にまたは部分的に二本鎖を形成しうる相補的なヌクレオチド配列を有する。前記２本の一本鎖ＤＮＡが部分的に相補的な配列を有する場合には、配列に応じて、塩濃度及び温度のようなハイブリダイゼーション条件を調整することによって、ハイブリダイゼーション反応が誘導されうる。

前記電気的信号としては、電圧または電流が含まれるが、これらに限定されない。前記プローブとしては、例えば、核酸または蛋白質が含まれ、具体的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、抗体、抗原、酵素、基質または補因子が挙げられる。また、前記標的分子としては、核酸または蛋白質が挙げられる。

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。しかし、これら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の技術的範囲がこれらの実施例に制限されることはない。

実施例１
一般式（ＩＩ）の化合物の合成
本実施例では、一般式（ＩＩ）の化合物を合成した。一般式（ＩＩ）の化合物は、本発明の製造方法による下記フローチャートによって合成した。

１．中間体（１）の合成
２口の３０ｍｌ丸底フラスコ中で、Ａｒ雰囲気下でＡｌＣｌ_３（３１２ｍｇ，２．３４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン６ｍｌ及びＣＳ_２ ６ｍｌの混合溶媒中に添加し、攪拌した。水浴を用いて急な発熱を防止しつつ、２−チオフェン酢酸（２７７ｍｇ，１．９５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン２ｍｌ及びＣＳ_２ ２ｍｌの混合溶媒に溶かした溶液を５分間滴下した。室温で２０分間攪拌した後、３時間還流させた。

クロロホルム：メタノール＝４：１の混合溶媒を用いたカラムクロマトグラフィにより、得られた生成物を精製して、白い固体である中間体（１）を４１０ｍｇ（収率５２．７％）得た。得られた中間体（１）のＮＭＲ及びＦＴ−ＩＲ確認結果は、次の通りである。

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）：
δ７．５１（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ），３．８２（ｓ，２Ｈ），３．３３（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．８１（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），１．８０（ｍ，２Ｈ），１．６６（ｍ，２Ｈ），１．４３（ｍ，２Ｈ）
ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒ）：
３４３０（ＣＯ_２Ｈ），２９５０，２８４５（Ｃ−Ｈ），１６５０（Ｃ＝Ｏ），１５９０，１４５０ｃｍ^−１。

２．化合物（ＩＩ）の合成
２口の３０ｍｌ丸底フラスコ中で、中間体（１）（２０４ｍｇ，０．５１１ｍｍｏｌ）をチオウレア（７８ｍｇ，１．０２ｍｍｏｌ）と共にＤＭＳＯ２．０ｍｌ中に添加し、Ａｒ雰囲気下において室温で１２時間攪拌した。その後、１０％のＮａＯＨ３．２ｍｌを投入し、１時間さらに攪拌し、１Ｍ ＨＣｌ溶液でｐＨ＝２〜３に調節（約８ｍｌの１Ｍ ＨＣｌ溶液が所要）して酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）で抽出した。これをカラムクロマトグラフィにより精製して、目的化合物（ＩＩ）［５−（６−メルカプト−ヘキサノイル）−チオフェン−２−イル］−酢酸（ＭＴＰＡＡ）を１０５ｍｇ（収率７５．４％）得た。得られた化合物（ＩＩ）のＮＭＲ及びＦＴ−ＩＲ確認結果は、次の通りである。

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）：
δ７．３５（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ），６．９２（ｓ，１Ｈ），３．６０（ｓ，２Ｈ），２．７０（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），２．４２（ｍ，２Ｈ），１．２５−１．６５（ｍ，６Ｈ）
ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒ）：
３４３０（ＣＯ_２Ｈ），２９５０，２８４０（Ｃ−Ｈ），１６５０（Ｃ＝Ｏ），１５８０，１４５０ｃｍ^−１。

実施例２
一般式（ＩＩＩ）の化合物の合成
本実施例では、一般式（ＩＩＩ）の化合物を合成した。一般式（ＩＩＩ）の化合物は、本発明の製造方法による下記フローチャートによって合成した。

１．中間体（１）の合成
２口の２５０ｍｌ丸底フラスコに２，２’−ビチオフェン（３ｇ，１８ｍｍｏｌ）を入れてＤＭＦ５０ｍｌを加えて攪拌した。氷浴内でＮＢＳ（Ｎ−ブロモスクシンイミド）（３．２ｇ，１８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ１０ｍｌに溶かしてゆっくり滴下した。

反応終結後、塩化メチレンで抽出し、メタノール（ＭｅＯＨ）で再結晶して薄い黄色の固体化合物２．５ｇ（収率５６％）を得た。得られた中間体（１）のＮＭＲ分析結果は、次の通りである。

^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）：
δ＝６．９１（１Ｈ，ｄ），６．９６（１Ｈ，ｄ），７．００（１Ｈ，ｄｄ），７．２２（１Ｈ）。

２．中間体（２）の合成
化合物（１）（３ｇ，１２ｍｍｏｌ）にテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４）を入れて精製トルエン５０ｍｌに溶かして攪拌した。ここにトリブチル錫クロライド（４．７６ｇ，１２ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した後、８０℃で４時間反応させた。反応終結後、ヘキサンを用いたカラムクロマトグラフィにより精製して淡緑色の固体化合物４．２ｇ（収率７８％）を得た。得られた中間体（２）のＮＭＲ及びＦＲ−ＩＲ分析結果は、次の通りである。

^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）：
δ＝７．１９（１Ｈ，ｄ），７．１０（１Ｈ，ｄ），６．９８（１Ｈ，ｄ），６．８５（１Ｈ，ｄ），６．８２（１Ｈ，ｄ），１．６０（６Ｈ，ｍ），１．３０（１２Ｈ，ｍ），０．９０（９Ｈ，ｔ）
ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒ）：
２９５０，２８５０（Ｃ−Ｈ），１５９０（Ｃ＝Ｃ），１４５０（Ｃ−Ｈ），１３７５（Ｃ−Ｈ）ｃｍ^−１。

３．中間体（３）の合成
２−チオフェン酢酸（３ｇ，２１．１ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシフタルイミド（３．４４ｇ，２１．１ｍｍｏｌ）をクロロホルム５０ｍｌ中に添加し、攪拌した。ここに１，３−ジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（４．３５ｇ，２１．１ｍｍｏｌ）を添加し、３時間攪拌した。反応終結後、ヘキサンを用いて粉砕して白色の固体化合物５．８ｇ（収率９１％）を得た。得られた化合物のＮＭＲ及びＦＴ−ＩＲ分析結果は、次の通りである。

^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）：
δ＝７．８０（４Ｈ，ｄｄ），７．２５（１Ｈ，ｄ），７．１０（１Ｈ，ｄ），７．００（１Ｈ，ｄ），４．２０（２Ｈ，ｓ）
ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒ）：
１７４１，１３５９，１１３９ｃｍ^−１。

４．中間体（４）の合成
化合物（３）（５．４ｇ，１７．８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ５０ｍｌ中に添加し、攪拌した後、ここにＮＢＳ（３．１７ｇ，１７．８ｍｍｏｌ）を添加して３時間攪拌した。反応終結後、塩化メチレンを用いて抽出し、さらに塩化メチレンを用いたカラムクロマトグラフィにより精製して、黄色を帯びる白色の固体化合物３．５７ｇ（収率５２％）を得た。得られた化合物のＮＭＲ及びＦＴ−ＩＲ分析結果は、次の通りである。

^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）：
δ＝７．８０（４Ｈ，ｄｄ），６．９０（１Ｈ，ｄ），６．８０（１Ｈ，ｄ），４．１０（２Ｈ，ｓ）
ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒ）：
１７４３，１３６３，１０７４ｃｍ^−１。

５．中間体（５）の合成
ＡｌＣｌ_３（０．７ｇ，５．３ｍｍｏｌ）をＣＳ_２ １０ｍｌと塩化メチレン１０ｍｌとの混合液中に溶かし、攪拌した。ここに化合物（２）（２ｇ，５．５５ｍｍｏｌ）をＣＳ_２ ３ｍｌとメチレンクロライド３ｍｌとの混合物に溶かして滴下した。再び、ここに６−ブロモヘキサノイルクロライド０．６７ｍｌを滴下し、一晩中還流した。反応終結後、塩化メチレンを用いたカラムクロマトグラフィにより精製して、黄色の固体化合物を１．７ｇ（収率７０％）得た。得られた化合物のＮＭＲ及びＦＴ−ＩＲ分析結果は、次の通りである。

^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）：
δ＝８．０（１Ｈ，ｓ），７．５（１Ｈ，ｄ），７．１５−６．９５（２Ｈ，ｔ），３．４０（２Ｈ，ｔ），１．９（２Ｈ，ｔ），１．８−１．２５（２６Ｈ，ｍ），０．９（９Ｈ，ｔ）
ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒ）：
２９５０，２８５０（Ｃ−Ｈ），１６５０（Ｃ＝Ｏ），１５９０（Ｃ＝Ｏ），１４５０（Ｃ−Ｈ），１３７５（Ｃ−Ｈ）ｃｍ^−１。

６．中間体（６）の合成
化合物（５）（１．７ｇ，３．１６ｍｍｏｌ）をチオウレア（０．４８ｇ，６．３２ｍｍｏｌ）と共にＤＭＳＯ３０ｍｌに溶かした後、室温で１２時間攪拌した。ここに１０％のＮａＯＨ １０ｍｌを投入して１時間さらに攪拌し、１Ｍ ＨＣｌ溶液でｐＨ２〜３に調節した。酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）で抽出した後、ヘキサンで再結晶して黄色の固体化合物０．９ｇ（収率５８％）を得た。

^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）：
δ＝７．５（１Ｈ，ｓ），７．３（１Ｈ，ｄ），７．１５−６．９５（２Ｈ，ｔ），２．８５（２Ｈ，ｔ），２，７（２Ｈ，ｔ），２．５（１Ｈ，ｔ），１．８−１．１（２４Ｈ，ｍ），０．９（９Ｈ，ｔ）
ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒ）：
２９５０，２８５０（Ｃ−Ｈ），１６４５（Ｃ＝Ｏ），１５８８（Ｃ＝Ｏ），１４５０（Ｃ−Ｈ），１３７５（Ｃ−Ｈ）ｃｍ^−１。

実施例３
一般式（Ｉ）の導電性化合物（ＭＴＰＡＡ）のＳＡＭの形成及びプローブの固定化
１．一般式（Ｉ）の導電性化合物（ＭＴＰＡＡ）のＳＡＭの形成
本実施例では、次のように一般式（Ｉ）の導電性化合物（ＭＴＰＡＡ）を金薄膜に固定化して、ＳＡＭを形成した。まず、金薄膜を０．０５、０．３及び０．５μｍの粒径を有するアルミナスラリーを用いて研磨した後、１．０Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４溶液中で電気化学的な表面活性化処理（−０．１〜＋１．５Ｖ，２００ｍＶ／ｓ，８０回）を行った。次いで、前記金薄膜を１ｍＭのＭＴＰＡＡを溶かしたＤＭＳＯ溶液に１５時間浸漬させてＳＡＭを形成した。前記反応に使用したＤＭＳＯは、屈折率が大きく（ｎＤ２０＝１．４７９）共鳴角を測定できないため、金薄膜にＭＴＰＡＡ ＳＡＭが形成される段階を確認できなかった。しかし、ＭＴＰＡＡが金薄膜上にＳＡＭを形成したか否かは、電気化学的方法とＦＴＩＲ−ＲＡＳとで確認した。

このうち、入射角８０゜でのＦＴＩＲ−ＲＡＳスペクトル分析結果は、次の通りである。ＦＴＩＲ−ＲＡＳスペクトル分析においてスペクトル上にあらわれたピークの位置をＫＢｒペレットの結果と比較した結果、ＳＡＭでは低周波数側に移動したことを確認した。そして、スペクトル上の２８５０〜２９６０ｃｍ^−１付近にＣＨ伸縮モードが鮮明にあらわれていることから、金（Ａｕ）表面上にＭＴＰＡＡ ＳＡＭが非常に規則的な形態で配列して存在していることが確認された。この際、ＣＨ伸縮モードのうち対称モードと非対称モードとの相対的なバンド強度から、製造されたＳＡＭが規則的に整列していることが分かった（図３参照）。

２．プローブの固定化
前記ＭＴＰＡＡ ＳＡＭにプローブとして一本鎖ＤＮＡ（５’−ＮＨ_２−ＧＴＴＣＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣ−３’：配列番号１）を固定化し、その特性を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）により分析した。

固定化反応は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、および１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロライド（ＥＤＣ）を使用してＭＴＰＡＡのカルボキシル基を優れた脱離基であるＮＨＳに置換した後、アミド結合を形成した。ＮＨＳ、ＥＤＣおよび一本鎖ＤＮＡを同時に使用するこの一段階反応は公知である（Ｌａｎｇｍｕｉｒ １６，３２７２，２０００）。

図４は、ＳＡＭ形成、プローブ固定化、標的ＤＮＡのハイブリダイゼーションに至るまでの共鳴角の変化を経時的に表す図である。図４において、（１）はＭＴＰＡＡ ＳＡＭ形成後の純粋なＰＢＳ緩衝液中の金薄膜の共鳴角を示し、（２）はＮＢＳとＥＤＣとを含むＰＢＳ緩衝液中のＳＡＭを有する金薄膜の共鳴角を示し、（３）は固定化用のプローブ一本鎖ＤＮＡを含むＰＢＳ緩衝液中の金薄膜の共鳴角を示し、（４）はプローブ一本鎖ＤＮＡの固定化後にＰＢＳ緩衝液で洗浄された金薄膜の共鳴角を示し、（５）は純粋なＴＥ緩衝液が注入された金薄膜の共鳴角を示し、（６）は標的一本鎖ＤＮＡを含むＴＥ緩衝液が注入された金薄膜の共鳴角を示し、（７）はハイブリダイゼーション後の洗浄のためにＴＥ緩衝液が注入された金薄膜の共鳴角を示し、（８）はＴＥ緩衝液がＰＢＳ緩衝液により置換された金薄膜の共鳴角を示す。

図４に示すように、ＭＴＰＡＡ ＳＡＭの形成された金薄膜を安定化させるために純粋なＰＢＳ緩衝液が注入された場合の共鳴角は５１．５６０であり（（１）を参照）、ＮＨＳ／ＥＤＣを含むＰＢＳ緩衝液が注入された場合の共鳴角は５１．６２０であった（（２）を参照）。プローブ一本鎖ＤＮＡを含有するＰＢＳ緩衝液を注入すると、共鳴角は５１．７３２に増加することが分かる（（３）の初期を参照）。プローブ一本鎖ＤＮＡと反応後、共鳴角はゆっくりと減少し、時間とともに徐々に増加して、５１．７６２°で飽和した（（３）の終期を参照）。これは、ＭＴＰＡＡ ＳＡＭに物理的に吸着された一本鎖ＤＮＡが、化学的な吸着によってより安定化されるためであると推測される。

プローブ一本鎖ＤＮＡ固定化後の共鳴角は、ＭＴＰＡＡ ＳＡＭ形成後の５１．５６０°（（１）を参照）から、プローブ一本鎖ＤＮＡの固定化およびＰＢＳ緩衝液による洗浄後の５１．７０１°（（４）を参照）まで、０．１４１°移動した。この共鳴角の移動は、ＭＴＰＡＡ ＳＡＭの屈折率及び膜の厚さの変化が原因であり、これにより、プローブ一本鎖ＤＮＡがＭＴＰＡＡ ＳＡＭ上に固定化されたということが分かる。

ＴＥ緩衝液が注入されると、共鳴角は５２．０１７に増加し（（５）を参照）、標的一本鎖ＤＮＡが注入されると５２．２６９に増加した（（６）の初期を参照）。ハイブリダイゼーションにより、共鳴角は徐々に増加し、５２．２８５で飽和した（（６）の終期を参照）。非特異的結合を除去するためにＴＥ緩衝液で洗浄すると、共鳴角は５２．２２１に低下した（（７）を参照）。また、標的一本鎖ＤＮＡハイブリダイゼーション後の共鳴角を、プローブ一本鎖ＤＮＡ固定化後の共鳴角と比較するために、ＴＥ緩衝液をＰＢＳ緩衝液で置換した。その結果、プローブＤＮＡに対する標的一本鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーション後のＰＢＳ緩衝液中の金薄膜の共鳴角は、５１．８０２である（（８）を参照）。共鳴角が、ＰＢＳ緩衝液中におけるプローブＤＮＡの固定化後の５１．７０１（（４）を参照）から、ハイブリダイゼーション後のＰＢＳ緩衝液中における５１．８０２（（８）を参照）まで移動したことから、プローブＤＮＡと標的一本鎖ＤＮＡとの間に相補的な結合が形成されたことが確認される。

実施例４
一般式（Ｉ）の導電性化合物（ＭＴＰＡＡ）のＳＡＭの形成、プローブの固定化、標的ＤＮＡのハイブリダイゼーション、及び電気化学的特性の測定
１．一般式（Ｉ）の導電性化合物のＳＡＭの形成
金薄膜上に、一般式（Ｉ）の導電性化合物（ＭＴＰＡＡ）を固定化し、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を形成した。まず、金薄膜を０．０５、０．３及び０．５μｍの粒径を有するアルミナスラリーを用いて研磨した後、１．０Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４溶液中で電気化学的な表面活性化処理（−０．１〜＋１．５Ｖ，２００ｍＶ／ｓ，８０回）を行った。次いで、金薄膜を１ｍＭのＭＴＰＡＡを溶かしたＤＭＳＯ溶液に１５時間浸漬させ、ＳＡＭを形成した。

２．一本鎖ＤＮＡの固定化
次のように一本鎖ＤＮＡを固定化した。

（ａ）前記金電極上のＳＡＭを、２ｍＭ ＥＤＣおよび５ｍＭ ＮＨＳを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４０）と１時間反応させてリンカーを形成させた。

（ｂ）前記金電極を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４０）で洗浄した。

（ｃ）リンカーを有する前記ＳＡＭの表面上に、１００ｐｐｍのプローブ一本鎖ＤＮＡを含む０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）を２０μｌ滴下した。

（ｄ）得られた構造体を空気中で一晩乾燥した後、蒸溜水に２時間浸漬させ、さらに蒸溜水で洗浄した。

３．標的ＤＮＡのハイブリダイゼーション
（ａ）プローブ一本鎖ＤＮＡが固定化された金電極の表面に、１００ｐｐｍの標的ＤＮＡを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．００）を２０μｌ滴下した。

（ｂ）得られた金電極を、空気中で３０分間乾燥した。

４．サイクリックボルタンメトリー
各工程の反応後に、金電極をリン酸緩衝液およびメタノールで洗浄した。導電性高分子とともに通常用いられるドーパントを用いずに、Ｎ_２ガスで電極を乾燥させ、ジクロロメタン（ＣＨ_２Ｃｌ_２）で洗浄した。

０．１Ｍ Ｅｔ_４ＮＢＦ_４／ＣＨ_２Ｃｌ_２の電解液中で、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を参照電極として使用し、白金（Ｐｔ）ワイヤ電極を対極として使用して、１００〜１２００ｍＶの電位範囲で、２００ｍＶ／ｓのスキャン速度で、サイクリックボルタンメトリーを行った。各測定後、次の工程前に、金電極をＣＨ_２Ｃｌ_２で３回洗浄し、乾燥し、リン酸緩衝液で再度洗浄した。この際、有機溶媒としてＣＨ_２Ｃｌ_２を用い、電解液としてＥｔ_４ＮＢＦ_４／ＣＨ_２Ｃｌ_２を用いると、水を用いた場合に１Ｖ以上の電位で起こる酸化還元反応のような、−０．１〜１．２Ｖの測定電位範囲における好ましくない反応が防止される。

図５は、１３回の測定により得られたＭＴＰＡＡ ＳＡＭのサイクリックボルタモグラムである。最初に測定されたサイクリックボルタモグラムにおいては、９８０ｍＶの酸化ピーク、および４２０ｍＶの還元ピークが観察された。測定を重ねるたびに、９８０ｍＶの酸化ピークは減少し、４２０ｍＶの還元ピークは増加した。１３回測定後に、安定した、定常のサイクリックボルタモグラムが得られた。

図６は、電気化学的に安定化され、ＨＮＳ／ＥＤＣで処理されたＭＴＰＡＡ ＳＡＭ上に、プローブ一本鎖ＤＮＡを固定化した後に、上記と同様の方法により測定したサイクリックボルタモグラムである。図６において「ＡｕＥ／ＭＴＰＡＡ」はＭＴＰＡＡ ＳＡＭが形成された金薄膜を示し、「ＡｕＥ／ＭＴＰＡＡ／ＳＤ」は、前記ＳＡＭにプローブ一本鎖ＤＮＡが固定化された金薄膜を示し、「ＡｕＥ／ＭＴＰＡＡ／ＳＤ−ＳＤ」は、前記プローブ一本鎖ＤＮＡに標的ＤＮＡがハイブリダイズした金薄膜を示す。

図６より、プローブ一本鎖ＤＮＡの固定化後のＭＴＰＡＡ ＳＡＭのサイクリックボルタモグラム（ＡｕＥ／ＭＴＰＡＡ／ＳＤ）を、固定化前のもの（ＡｕＥ／ＭＴＰＡＡ）と比較すると、酸化ピークａ１については、電流値および電位値がそれぞれ減少し、酸化ピークａ２については、電流値および電位値がそれぞれ増加した。一方、還元ピークｃ１については、電流値および電位値がそれぞれ減少した。

また、図６より、標的ＤＮＡのプローブ一本鎖ＤＮＡに対するハイブリダイゼーション後のサイクリックボルタモグラム（ＡｕＥ／ＭＴＰＡＡ／ＳＤ−ＳＤ）を、ハイブリダイゼーション前のもの（ＡｕＥ／ＭＴＰＡＡ／ＳＤ）と比較すると、酸化ピークａ１については、電流値および電位値がそれぞれ増加し、ハイブリダイゼーション前にはみられた酸化ピークａ２は、ハイブリダイゼーション後には消失した。さらに、新たな還元ピークｃ２が１５５ｍＶに出現し、還元ピークｃ２については変化が認められなかった。

なお、上記の測定においては、３つの電極の各セットにつき４回の測定を行うことによって、サイクリックボルタンメトリーの再現性を確認した。

前述したように、プローブ一本鎖ＤＮＡが、本発明の導電性化合物の単分子膜上に固定化されると、酸化ピークおよび還元ピークは次のように変化する：固定化前の値に対して、酸化ピークａ１の電流値及び電圧値は減少し、還元ピークａ２の電流値及び電圧値は増加し、還元ピークｃ１の電流値及び電圧値は減少する。これらの変化はプローブ一本鎖ＤＮＡの固定化により引き起こされる。また、標的一本鎖ＤＮＡがプローブ一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズすると、酸化ピークおよび還元ピークは次のように変化する：酸化ピークａ１の電流値及び電圧値は増加し、プローブ一本鎖ＤＮＡの固定化によりみられた酸化ピークａ２は消失し、還元ピークｃ１の電流値及び電圧値は変化せず、新たな還元ピークｃ２が現れる。これらの変化は、標的ＤＮＡのプローブＤＮＡに対するハイブリダイゼーションにより引き起こされる。

以上、本発明を添付の図面に示す一実施例を参照して説明したが、これは例示的なものに過ぎず、当業者は、それらから多様な変形及び均等な他の実施例が可能であることが分かる。したがって、本願発明の真の保護範囲は、特許請求の範囲の記載のみによって定められるべきである。

本発明の導電性化合物は、反応性及び安全性の高い電極及びセンサーを製造するのに使用されうる。

本発明の電極及びセンサーによれば、高い感度及び再現性で、標的分子を検出するのに使用されうる。

本発明の標的分子の検出方法によれば、試料中の標的分子が効率的に検出されうる。

本発明の導電性化合物が塗布された電極を含むセンサーの一例を示す構成図である。 本発明の導電性化合物が塗布された電極を含むセンサーの他の一例を示す構成図である。 金薄膜上のＭＴＰＡＡ ＳＡＭをＦＴ−ＩＲ分析した結果を示すグラフである。 ＳＡＭ形成、プローブ固定化、ＤＮＡハイブリダイゼーションに至るまでの共鳴角の変化を経時的に表したセンソグラムである。 ＭＴＰＡＡ ＳＡＭのサイクリックボルタモグラムである。 電気化学的に安定化されたＭＴＰＡＡ ＳＡＭをＨＮＳ／ＥＤＣで処理し、プローブ一本鎖ＤＮＡを固定化した後に測定されたサイクリックボルタモグラムである。

符号の説明

２ 静電電圧計、
４ 作用極、
６ 導電性化合物、
８ プローブ、
１０ 標的分子、
１２ 対極、
１４ 参照電極。

Claims (12)

1. 下記一般式（Ｉ）の導電性化合物。
   

   
2. 前記プローブ基が、核酸または蛋白質であることを特徴とする請求項１に記載の導電性化合物。
3. 前記プローブ基は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、抗体、抗原、酵素、基質または補因子であることを特徴とする請求項２に記載の導電性化合物。
4. 下記一般式（ＩＶ）の化合物をチオウレアと反応させることを特徴とする、下記一般式（Ｉ）の導電性化合物を製造する方法。
   

   

   
5. 下記一般式（Ｖ）の化合物と下記一般式（ＶＩ）の化合物とを反応させる段階を含む、下記一般式（Ｉ）の導電性化合物を製造する方法。
   

   

   
6. 請求項１に記載の導電性化合物が塗布された金電極。
7. 請求項１に記載の導電性化合物が塗布された金電極を含むセンサー。
8. 下記段階を含む標的分子の検出方法：
   （ａ）下記一般式（Ｉ）の導電性化合物を金基板上に固定化して自己組織化単分子膜を形成する段階；
   

   

   （ｂ）前記自己組織化単分子膜の表面にプローブを反応させる段階；
   （ｃ）前記プローブと特異的に反応する標的分子を前記プローブに接触させて標的分子−プローブ複合体を形成させる段階；
   （ｄ）前記標的分子−プローブ複合体からの電気的信号を測定する段階。
9. 下記段階を含む標的分子の検出方法：
   （ａ）下記一般式（Ｉ）の導電性化合物を金基板上に固定化して自己組織化単分子膜を形成する段階；
   

   

   （ｂ）前記自己組織化単分子膜の前記プローブ基と特異的に反応する標的分子を前記プローブ基と接触させて、標的分子−プローブ複合体を形成させる段階；
   （ｃ）前記標的分子−プローブ複合体からの電気的信号を測定する段階。
10. 前記電気的信号は、電圧または電流の変化であることを特徴とする請求項８または９に記載の方法。
11. 前記プローブまたは前記プローブ基は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、抗体、抗原、酵素、基質または補因子であることを特徴とする請求項８または９に記載の方法。
12. 前記標的分子は、核酸または蛋白質であることを特徴とする請求項８または９に記載の方法。

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