PL223074B1 - Bis(2,2'-bitienylo)-(4-hydroksyfenylo)metanowy ester biotyny, sposób jego wytwarzania, warstwa rozpoznającego polimeru i jej zastosowanie w czujnikach chemicznych do wykrywania i/lub oznaczania oligonukleotydów - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest bis(2,2'-bitienylo)-(4-hydroksyfenylo)metanowy ester biotyny, sposób jego wytwarzania, warstwa rozpoznającego polimeru i jej zastosowanie w czujnikach chemicznych do wykrywania i/lub oznaczania oligonukleotydów.

Oddziaływanie biotyny z awidyną jest szeroko wykorzystywane do budowy bio- i chemosensorów [A. Dupont-Filliard, et al., Biotin/avidin system for the generation of fully renewable DNA sensor based on biotinylated polypyrrole film, Anal. Chim. Acta 2004, 171, 271-277; Liu, J., et al., Ultrasensitive DNA detection based on coulometric measurement of enzymatic silver deposition on gold nanoparticle-modified screen-printed carbon electrode, Sens. Actuators, B, 2012, 162, 384-390; Śipova, H., et al., Portable surface plasmon resonance biosensor for detection of nucleic acids, Procedia Eng.,

2011, 25, 148-151; Bergaoui, Y., et al., Antigen-antibody selective recognition using LiTaO₃ SH-SAW sensors: investigations on macromolecules effects on binding kinetic constants, Eur. Phys. J. Appl. Phys., 2011, 56, 13705-13710 oraz Kudo, T. and A. Nakajima, Biomolecule detection based on Si single-electron transistors for highly sensitive integrated sensors on a single chip, Appl. Phys. Lett.,

2012, 100, 023704]. Głównym tego powodem jest bardzo wysoka stała trwałości kompleksu biotyny z awidyną, rzędu 10 M^- [Wilchek, M. and Bayer E.A., The avidin-biotin complex in bioanalytical applications, Anal. Biochem., 1988, 171, 1-32]. Tak wysoka trwałość tego kompleksu sprawia, że kompleksy pomiędzy substancjami, z których jedna zmodyfikowana jest biotyną a druga awidyną, są ró wnież bardzo trwałe. To kompleksowanie ma szczególne znaczenie, gdy dostępne są jedynie małe ilości modyfikowanych substancji. Obecnie handlowo dostępne są biotynowane reagenty, takie jak enzymy, białka, przeciwciała i oligonukleotydy, a także zestawy do biotynowania wielu związków z wysoką wydajnością.

W badaniach prowadzących do wytworzenia polimerów przewodzących modyfikowanych biot yną stosowany był pirol [A. Dupont-Filliard, et al., Biotin/avidin system for the generation of fully renewable DNA sensor based on biotinylated polypyrrole film, Anal. Chim. Acta, 2004, 171, 271-277, Darmanin, T., et al., Structured biotinylated poly(3,4-ethylenedioxypyrrole) electrodes for biochemical applications, RSC Adv., 2012, 2, 1033-1039, Peng, H., et al., Conducting polymers for electrochemical DMA sensing, Biomaterials, 2009, 30, 2132-2148].

Co prawda w literaturze są wzmianki na temat syntezy tertiofenów modyfikowanych biotyną, ale nie wykorzystano ich do kompleksowania związków innych niż awidyna [Mouffouk, F., et al., Electrosynthesis and characterization of biotin-functionalized poly(terthiophene) copolymers, and their response to avidin, J. Mater. Chem., 2005, 15, 1186-1196 i Mouffouk, F., et al., A regioregular polyalkylthiophene bearing covalently-linked biotin, and its interaction with avidin in solution and in thin films, Chem. Commun., 2004, 20, 2314]. Co więcej, ich synteza była znacznie bardziej pracochłonna niż przedstawionego w niniejszym zgłoszeniu monomeru funkcyjnego.

Istnieje ogromne zapotrzebowanie na chemosensory do oznaczania DNA z uwagi na ich potencjalne zastosowanie w medycynie sądowej i diagnostyce medycznej oraz do wykrywania toksyn, bakterii i wirusów [Peng, H., et al., Conducting polymers for electrochemical DNA sensing, Biomaterials, 2009, 30, 2132-2148; Nowicka, A.M., et al., Nanogravimetric and voltammetric DNA-hybridization biosensors for studies of DNA damage by common toxicants and pollutants, Biophys. Chem., 2010, 146, 42-53; Hassen, W.M., et al., An impedimetric DNA sensor based on functionalized magnetic nanoparticles for HIV and HBV detection. Sens. Actuators, B, 2008, 134, 755-760; Ferguson, B.S., et al., Genetic analysis of H1N1 influenza virus from throat swab samples in a microfluidic system for point-of-care diagnostics, J. Am. Chem. Soc., 2011, 133, 9129-9135; Carey, L. and L. Mitnik, Trends in DNA forensic analysis, Electrophoresis, 2002, 23, 1386-1397 oraz Palchetti, I. and M. Mascini, Electroanalytical biosensors and their potential for food pathogen and toxin detection. Anal. Bioanal. Chem., 2008, 391,455-471].

W dotychczas stosowanych chemosensorach DNA sygnał rozpoznawania chemicznego jest przetwarzany na sygnał analityczny za pomocą metod optycznych [D. Holthausen, et al., Polymerization-amplified optical DNA detection on porous silicon templates. ACS Micro Lett., 2012, 1, 919-921], spekroskopii rezonansu plazmonów powierzchniowych [Śipova, H., et al., Portable surface plasmort resonance biosensor for detection of nucleic adds. Procedia Eng., 2011, 25, 148-151], spektroskopii flouorescencyjnej [Zhang, Z., et al., Fluorescence detection of DNA, adenosine-5'-triphosphate (ATP), and telomerase activity by zinc(ll)-protoporphyrin IX/G-Quadruplex labels, Anal. Chem., 2012, 84, 4789-4797 i Dubuisson, E., et al., Fluorescent molecular nanocrystals anchored in sol-gel thin films:

PL 223 074 B1 a label-free signalization function for biosensing applications, New J. Chem., 2011, 350, 2416-2421], a także detekcji, w której wykorzystywane są reakcje enzymatyczne [Liu, J., et al., Ultrasensitive DNA detection based on coulometric measurement of enzymatic silver deposition on gold nanoparticlemodified screen-printed carbon electrode, Sens. Actuators, B, 2012, 162, 384-390 i Hsieh, K., V. Xiao, and H.T. Soh, Electrochemical DNA detection via exonuclease and target-catalyzed transformation of surface-bound probes, Langmuir, 2010, 12, 10392-10396], reakcje redoks oligonukleotydów zmodyfikowanych ferrocenem [Yao, W., et al., An electrochemiluminescent DNA sensor based on nanogold enhancement and ferrocene quenching, Biosens. Bioelectron., 2012, 40, 356-361 i Yang, W. and R.Y. Lai, Integration of two different sensing modes in an electrochemical DNA sensor for approximation of target mismatch location. Electrochem. Commun. 2011, 13, 989-992] i wskaźników interkalujących DNA [Liu, M., C. Luo, and H. Peng, Electrochemical DNA sensor based on methylene blue functionalized polythiophene as a hybridization indicator, Talanta, 2012, 88, 216-221; Shiddiky, M.J.A., et al., Highly selective and sensitive DNA assay based on electrocatalytic oxidation of ferrocene bearing zinc(H)-cyclen complexes with diethylamine, J. Am. Chem. Soc., 2010, 132, 10053-10063; Yin, B.-C, Y.-M. Guan, and B.-C. Ye, An ultrasensitive electrochemical DNA sensor based on the ssDNAassisted cascade of hybridization reaction, Chem. Comm., 2012, 48, 4208-4210).

W innych sposobach przetwarzania tego sygnału wykorzystywana jest mikrograwimetria piezoelektryczna (ang. piezoelectric microgravimetry, PM) z zastosowaniem rezonatorów kwarcowych [A. Dupont-Filliard, et al., Biotin/avidin system for the generation of fully renewable DNA sensor based on biotinylated polypyrrole film, Anal. Chim. Acta, 2004, 171, 271-277; Nowicka, A.M., et al., Nanogravimetric and voltammetric DNA-hybridization biosensors for studies of DNA damage by common toxicants and pollutants, Biophys. Chem., 2010, 146, 42-53; oraz Liu, T., et al., A novel microgravimetric DNA sensor with high sensitivity, Biochem. Biophys, Res. Commun., 2003, 304, 98-100] i mikrodźwigni [Mukhopadhyay, R., et al., Nanomechanical sensing of DNA sequences using piezoresistive cantilevers, Langmuir, 2005, 21, 8400-8408], a także tranzystory efektu polowego (Kergoat, L., et al., DNA detection with a water-gated organic field-effect transistor, Org. Electron., 2012, 13, 1-6 i Demelas, M., et al., An organic, charge-modulated field effect molecular nanocrystals anchored in sol-gel thin films: a label-free serialization function for biosensing applications, New J. Chem., 2011, 350, 2416-2421], a także detekcji, w której wykorzystywane są reakcje enzymatyczne [Liu, J., et al., Ultrasensitive DNA detection based on coulometric measurement of enzymatic silver deposition on gold nanoparticle-modified screen-printed carbon electrode. Sens. Actuators, B, 2012, 162, 384-390 i Hsieh, K., V. Xiao, and H.T. Soh, Electrochemical DNA detection via exonuclease and targetcatalyzed transformation of surface-bound probes, Langmuir, 2010, 12, 10392-10396], reakcje redoks oligonukleotydów zmodyfikowanych ferrocenem [Yao, W., et al., An electrochemiluminescent DNA sensor based on nano-gold enhancement and ferrocene quenching, Biosens. Bioelectron., 2012, 40, 356-361 i Yang, W. and R.Y. Lai, Integration of two different sensing modes in an electrochemical DNA sensor for approximation of target mismatch location. Electrochem. Commun 2011, 13, 989-992] i wskaźników interkalujących DNA [Liu, M., C. Luo, and H. Peng, Electrochemical DNA sensor based on methylene blue functionalized polythiophene as a hybridization indicator, Talanta, 2012, 88, 216-221; Shiddiky, M.J.A., et al., Highly selective and sensitive DNA assay based on electrocatalytic oxidation of ferrocene bearing zinc(II)-cyclen complexes with diethylamine, J. Am. Chem. Soc., 2010, 132, 10053-10063; Yin, B.-C., Y.-M. Guan, and B.-C. Ye, An ultrasensitive electrochemical DNA sensor based on the ssDNA-assisted cascade of hybridization reaction, Chem. Comm., 2012, 48, 4208-4210).

W innych sposobach przetwarzania tego sygnału wykorzystywana jest mikrograwimetria piezoelektryczna (ang. piezoelectric microgravimetry, PM) z zastosowaniem rezonatorów kwarcowych [A. Dupont-Filliard, et al., Biotin/avidin system for the generation of fully renewable DNA sensor based on biotinylated polypyrrole film, Anal. Chim. Acta. 2004, 171, 271-277; Nowicka, A.M., et al., Nanogravimetric and voltammetric DNA-hybridization biosensors for studies of DNA damage by common toxicants and pollutants, Biophys. Chem., 2010, 146, 42-53; oraz Liu, T., et al., A novel microgravimetric DNA sensor with high sensitivity, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003, 304, 98-100] i mikrodźwigni [Mukhopadhyay, R., et al., Nanomechanical sensing of DNA sequences using piezoresistive cantilevers, Langmuir, 2005, 21, 8400-8408], a także tranzystory efektu polowego [Kergoat, L., et al., DNA detection with a water-gated organic field-effect transistor, Org. Electron., 2012, 13, 1-6 i Demelas, M., et al., An organic, charge-modulated field effect transistor for DNA detection, Sens. Actuators, B, 2012, 171, 198-20327, 28].

PL 223 074 B1

Chemosensory DNA wykorzystujące elektrochemiczną spektroskopię impedancyjną (ang. electrochemical impedance spectroscopy, EIS) jako metodę przetwarzania tego sygnału często odznaczają się wysoką wykrywalnością [Hassen, W.M., et al., An impedimetric DNA sensor based on functionalized magnetic nanoparticles for HIV and HBV detection, Sens. Actuators, B, 2008, 134, 755-760 oraz Lee, D.J., and I.W.E. Robinson, Preliminary mapping of a putative inhibitor-binding pocket for human immunodeficiency virus Type 1 integrase inhibitors, Antimicrob. Agents Chemother., 2006, 50, 134-142].

Dlatego też celem obecnego wynalazku jest zapewnienie nowego monomeru funkcyjnego, oraz zastosowanie tego zsyntetyzowanego zgodnie z niniejszym wynalazkiem monomeru funkcyjnego do wytwarzania elementów rozpoznających dwóch różnych czujników chemicznych (inaczej chemosensorów) do selektywnego oznaczania oligonukleotydów. W szczególności w niniejszym zgłoszeniu wykorzystano dwa sposoby przetwarzania sygnału rozpoznawania na sygnał analityczny, tj. piezom ikrograwimetryczny (PM) i elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej (EIS).

Przedmiotem obecnego wynalazku jest nowy bis(2,2'-bitienylo)-(4-hydroksyfenylo)metanowy ester biotyny o poniższym strukturalnym Wzorze 1:

^:o

Wzór 1

Obecny wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania bis(2,2'-bitienylo)-(4-hydroksyfenylo)metanowego estru biotyny, charakteryzującego się tym, że obejmuje następujące etapy:

(a) wyjściowy roztwór 2,2'-bisbitiofenu w protycznym rozpuszczalniku organicznym poddaje się reakcji z 4-hydroksybenzaldehydem i kwasem nadchlorowym z wytworzeniem bis(2,2'-bitienylo)-(4-hydroksyfenylo)metanu, a następnie (b) ten otrzymany bis(2,2'-bitienylo)-(4-hydroksyfenylo)metan poddaje się reakcji z D-biotyną i 1-etylo-3-(3-dimetoiloaminopropylo)karbodiimidem w aprotycznym rozpuszczalniku organicznym i otrzymuje się bis(2,2'-bitienylo)-(4-hydroksyfenylo)metanowy ester biotyny.

Korzystnie, etap (a) prowadzi się w atmosferze gazu obojętnego, w temperaturze w zakresie od 50 do 70°C, przez 12 do 18 godz., w protycznym rozpuszczalniku organicznym, korzystnie w glikolu etylenowym, przy stosunku molowym reagentów względem 4-hydroksybenzaldehydu w zakresie od 2 do 4 dla 2,2'-bisbitiofenu i od 20 do 60 dla kwasu nadchlorowego.

Jeszcze korzystniej, etap (a) prowadzi się w atmosferze gazu obojętnego, w temperaturze 60°C, przez 16 godz., w glikolu etylenowym, przy stosunku molowym reagentów względem

4-hydroksybenzaldehydu równym 3 dla 2,2'-bisbitiofenu i 45 dla kwasu nadchlorowego.

Korzystnie, etap (b) prowadzi się w atmosferze gazu obojętnego najpierw w temperaturze w zakresie od 0 do 10°C przez 0,5 do 2 godz., po czym w temperaturze pokojowej przez 24 do 72 godz., w aprotycznym rozpuszczalniku organicznym, korzystnie dimetyloformamidzie, przy stosunku molowym reagentów względem bis(2,2'-bitienylo)-(4-hydroksyfenylo)metanu w zakresie od 1 do 3 dla biotyny i od 1 do 3 dla EDCI.

Jeszcze korzystniej, etap (b) prowadzi się w atmosferze gazu obojętnego najpierw w temperaturze ~4°C, przez ~1 godz., po czym w temperaturze pokojowej przez 45 godz., w dimetyloformamidzie, przy stosunku molowym reagentów względem bis(2,2'-bitienylo)-(4-hydroksyfenylo)metanu równym 1 dla biotyny i 2 dla EDCI.

Wynalazek obejmuje ponadto warstwę rozpoznającego polimeru, otrzymaną drogą elektropolimeryzacji w warunkach potencjodynamicznych, charakteryzującą się tym, że stanowi ją polimer zawiePL 223 074 B1 rający bis(2,2'-bitienylo)-(4-hydroksyfenylo)metanowy ester biotyny albo unieruchomiony w polimerze bis(2,2'-bitienylo)-(4-hydroksyfenylo)metanowy ester biotyny, określony w zastrz. 1.

Wynalazek obejmuje także zastosowanie warstwy polimeru rozpoznającego według wynalazku, do selektywnego wykrywania oligonukleotydu komplementarnego względem unieruchomionego oligonukleotydu rozpoznającego, jako warstwy rozpoznającej czujnika chemicznego, korzystnie piezograwimetrycznego i impedymetrycznego czujnika chemicznego. Wynalazek obejmuje takie zastosowanie warstwy polimeru rozpoznającego według wynalazku, do selektywnego oznaczania oligonukleotydu komplementarnego względem unieruchomionego oligonukleotydu rozpoznającego, jako warstwy rozpoznającej czujnika chemicznego, korzystnie piezograwimetrycznego i impedymetrycznego czujnika chemicznego.

W niniejszym zgłoszeniu przedstawiamy nowy monomer funkcyjny, bis(2,2'-bitienylo)-(4-hydroksyfenylo)metanowy ester biotyny (Wzór 1), do selektywnego oznaczania oligonukleotydów. Z jednej strony monomer ten zawiera fragment polimeryzujący, bis(2,2'-bisbitienylo)metan, umożliwiający zastosowanie elektrochemicznej polimeryzacji do osadzenia na powierzchni elektrody polimeru przewodzącego, z drugiej zaś - fragment zawierający biotynę, wiążący białka, takie jak awidyna, streptawidyna lub neutrawidyna. Utworzenie połączenia biotyny z wymienionymi wyżej białkami eliminuje konieczność stosowania dodatkowych reagentów do ich unieruchomienia.

W niniejszym zgłoszeniu wykorzystano dwie techniki przetwarzania sygnału rozpoznawania na sygnał analityczny, tj. PM i EIS. Ich zaleta polega m.in. na tym, że w celu tego przetwarzania nie wymagają one stosowania znaczników detekcji.

W niniejszych badaniach oznaczono oligonukleotyd o sekwencji 5'-ACT GCT AGA GAT TTT CCA CAT-3', charakterystyczny dla DNA wirusa HIV-1 [Lee, D.J. and J. W. E. Robinson, Preliminary mapping of a putative inhibitor-binding pocket for human immunodeficiency virus Type 1 integrase inhibitors, Antimicrob. Agents Chemother., 2006, 50, 134-142].

W przypadku czujnika PM i EIS sygnał analityczny stanowiły, odpowiednio, zmiany częstotliwości rezonansowej QCR w warunkach wstrzykowej analizy przepływowej (ang. flow-injection analysis, FIA), i zmiany oporu elektrycznego warstwy, zmierzonego za pomocą EIS, w warunkach stacjonarnych. Zmiany te były wywołane hybrydyzacją biotynowanego oligonukleotydu rozpoznającego, unier uchomionego na powierzchni polimeru, z oznaczanym komplementarnym oligonukleotydem.

Wynalazek jest bliżej przedstawiony poniżej w korzystnych przykładach wykonania, z odniesi eniem do załączonych rysunków, na których:

fig. 1 przedstawia półlogarytmiczne wykresy kalibracyjne dla oznaczanego oligonukleotydu skonstruowane na podstawie pomiarów EIS, dla których opór przeniesienia ładunku wyznaczono za pomocą dopasowania parametrów obwodu zastępczego, przedstawionego na fig. 7, do danych eksperymentalnych; warstwę rozpoznającą polimeru osadzono za pomocą (1) 1, (2) 3 i (3) 5 cykli liniowych zmian potencjału; pomiary EIS wykonano przy stałym potencjale równym potencjałowi otwartego obwodu stosując roztwór solny buforu fosforanowego (ang. phosphate buffer saline, PBS) o pH=7,4, który był 0,1 M względem K₃Fe(CN)₆ i 0,1 M względem K₄Fe(CN)₆; elektroda Ag/AgCI służyła jako elektroda odniesienia a płytka platynowa jako elektroda pomocnicza; częstotliwość zmieniano w zakresie od 100 kHz do 500 mHz;

fig. 2 przedstawia wykresy Nyquista zarejestrowane dla elektrody z węgla szklistego (ang. glassy carbon electrode, GCE) (1) pokrytej warstwą polimeru osadzonego za pomocą elektropolimeryzacji bis(2,2'-bitienylo)-(4-hydroksyfenylo)metanowego estru biotyny i po zanurzeniu, kolejno, w roztworach (2) 1 mg/ml neutrawidyny przez 15 min, (3) 30 μM biotynowanego oligonukleotydu przez 15 min oraz (4) 0,5, (5) 1, (6) 5, (7) 10, (8) 50, (9) 100, (10) 500 pM, (11) 1, (12) 5, (13) 10, (14) 50, (15) 100, (16) 500 nM, (17) 1, (18) 5, (19) 10, (20) 30 pM oznaczanego oligonukleotydu przez 6 min; wstawka przedstawia półlogarytmiczny wykres kalibracyjny dla oznaczanego oligonukleotydu skonstruowany na podstawie danych eksperymentalnych opracowanych przy zastosowaniu obwodu zastępczego pokazanego na fig. 7; pomiary wykonano przy stałym potencjale, który odpowiadał potencjałowi otwartego obwodu dla roztworu PBS (pH=7,4), który był 0,1 M względem K₃Fe(CN)₆ i 0,1 M względem K₄Fe(CN)₆; elektroda Ag/AgCI służyła jako elektroda odniesienia a płytka platynowa jako elektroda pomocnicza; częstotliwość zmieniano w zakresie od 100 kHz do 500 mHz;

PL 223 074 B1 fig. 3 przedstawia półlogarytmiczne wykresy kalibracyjne, skonstruowane przez dopasowanie parametrów obwodu zastępczego pokazanego na fig. 7 do danych eksperymentalnych dla (1) oznaczanego oligonukleotydu, oligonukleotydu różniącego się (2) dwiema i (3) siedmioma zasadami nukleinowymi od oznaczanego oligonukleotydu; do oznaczania każdego z oligonukleotydów przygotowano nowy chemosensor, każdy w tych samych warunkach eksperymentalnych; pomiary wykonano przy stałym potencjale, który odpowiadał potencjałowi otwartego obwodu, dla roztworu PBS (pH=7,4), który był 0,1 M względem K₃Fe(CN)₆ i 0,1 M względem K₄Fe(CN)₆; elektroda Ag/AgCI służyła jako elektroda odniesienia a płytka platynowa jako elektroda pomocnicza; częstotliwość zmieniano w zakresie od 100 kHz do 500 mHz;

fig. 4 przedstawia zmiany częstotliwości rezonansowej w czasie, towarzyszące kolejnym zastrzykom w warunkach FIA (1) 1 mg/ml neutrawidyny, (2) 15 ąM biotynowanego oligonukleotydu rozpoznającego, (3) 15 ąM oznaczanego oligonukleotydu komplementarnego do oligonukleotydu rozpoznającego unieruchomionego na warstwie biotynowanego bis(2,2'-bitienylo)metanu osadzonego za pomocą elektropolimeryzacji; objętość zastrzykiwanych próbek w roztworze PBS (pH=7,4) wynosiła 100 ąL a szybkość przepływu roztworu nośnego PBS - 35 ąL/min;

fig. 5 przedstawia zmiany w czasie (1) częstotliwości rezonansowej i (2) oporności dynamicznej towarzyszące kolejnym zastrzykom (a) 600 nM roztworu oznaczanego oligonukloetydu, zaznaczone czarnymi strzałkami i (b) 0,1 M NaOH, zaznaczone czerwonymi strzałkami, w warunkach FIA, przy czym objętość zastrzykiwanych próbek w roztworze PBS (pH=7,4) wynosiła 100 ąL a szybkość przepływu roztworu nośnego PBS (pH=7,4) - 35 ąL/min;

fig. 6 przedstawia zmianę częstotliwości rezonansowej względem stężenia oznaczanego oligonukleotydu w warunkach FIA; po każdym zastrzyku roztworu oznaczanego oligonukleotydu zastrzykiwano roztwór 0,1 M NaOH; objętość zastrzykiwanych próbek w roztworze PBS (pH=7,4) wynosiła 100 ąL a szybkość przepływu roztworu nośnego PBS (pH=7,4) - 35 ąL/min;

fig. 7 przedstawia schemat zmodyfikowanego obwodu zastępczego Ershlera-Randlesa, którego elementy dopasowano do danych doświadczalnych. R_s - opór roztworu elektrolitu, R_ct - opór przeniesienia ładunku, CPE - element stałofazowy (ang. constant phase element), W - impedancja Warburga zaś fig. 8 przedstawia schemat obejmujący kolejne etapy przygotowania warstwy rozpoznającej, (inaczej warstwy rozpoznającej) na powierzchni elektrody i odpowiadające im zdjęcia AFM obrazujące powierzchnię otrzymanych warstw. (a, a') Polimer osadzony na elektrodzie za pomocą elektropolimeryzacji bis(2,2'-bitienylo)-(4-hydroksyfenylo)metanowego estru biotyny w warunkach potencjodynamicznych, (b, b') polimer z unieruchomioną neutrawidyną, (c, c') polimer z unieruchomioną neutrawidyną i biotynowanym oligonukleotydem rozpoznającym oraz (d, d') polimer z unieruchomioną neutrawidyną i oligonukleotydem rozpoznającym po zhybrydyzowaniu go za pomocą oligonukleotydu oznaczanego.

Korzystne przykłady wykonania wynalazku

Odczynniki

2,2'-Bisbitiofen, 4-hydroksybenzaldehyd, 70% kwas nadchlorowy, 1-etylo-3-(3-dimetoiloaminopropylo)karbodiimid (EDCI), KCI, Na2HPO4, KH2PO4 x 3H2O i K3Fe(CN)6 zakupiono w firmie Sigma Aldrich.

Etanol, neutrawidyna i D-biotyna pochodziły, odpowiednio, z firmy Pharmaco-Aapek, Thermo Scientific i ChemPep.

NaOH, NaCl, K4Fe(CN)6, acetonitryl i dimetyloformamid zakupiono w firmie Fisher.

Nadchloran tetra-n-butyloamoniowy, (TBA)CIO₄, oraz modyfikowany biotyną i niemodyfikowane biotyną oligonukleotydy zostały dostarczone przez, odpowiednio, Southwestern Analytical, Inc. i Alpha DNA.

Wszystkie odczynniki użyto bez dodatkowego oczyszczania.

Oligonukleotydy charakteryzowały się następującymi sekwencjami zasad nukleinowych: biotynowany oligonukleotyd rozpoznający: 5'-ATG TGG AAA ATC TCT AGC AGT-3'; oligonukleotyd oznaczany, w pełni komplementarny do rozpoznającego: 5'-ACT GCT AGA GAT TTT CCA CAT-3'; oligonukleotyd z siedmioma zasadami niekomplementarnymi z oligonukleotydem rozpoznającym: 5'-ACG

PL 223 074 B1

GCG TGA GAA TGT CTA CGT-3'; oligonukleotyd z dwiema zasadami niekomplementarnymi z oligonukleotydem rozpoznającym: 5'-ACA GCA AGA GAT TTT CCA CAT-3'.

Wszystkie roztwory oligonukleotydów były przygotowane bezpośrednio przed pomiarem w roztworze solnym buforu fosforanowego (ang. phosphate buffer saline, PBS) o pH=7,4.

P r z y k ł a d 1

Niniejszy przykład przedstawia procedurę syntezy bis(2,2'-bitienylo)-(4-hydroksyfenylo)metanowego estru biotyny według wynalazku zgodnie z poniższym Schematem 1.

Schemat 1. Dwuetapowa synteza bis(2,2'-bitienylo)-(4-hydroksyfenylo)metanowego estru biotyny.

Etap (a)

Bis(2,2'-bitienylo)-(4-hydroksyfenylo)metan 1. W 80 ml roztworu glikolu etylenowego rozpuszczono 2,2'-bitiofen (2,045 g, 12,3 mmoli) i 4-hydroksybenzaldehyd (500 mg, 4,1 mmola). Roztwór ten mieszano w atmosferze azotu przez 30 min. Następnie dodano do niego 70% HCIO₄ (12 ml, 184,5 mmoli) i mieszano w temperaturze 60°C przez 16 godz. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej, do mieszaniny reakcyjnej dodano nadmiar dichlorometanu w celu rozpuszczenia produktu reakcji, po czym mieszaninę przemyto wodnym roztworem nasyconego Na₂CO₃. Zebraną fazę organiczną przemyto wodą, a następnie wysuszono bezwodnym Na₂SO₄, po czym zatężono przez odparowanie rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem. Oleisty produkt oczyszczono za pomocą chromatografii cieczowej na kolumnie silikażelowej z zastosowaniem, jako eluent, roztworu heksanu i chloroformu zmieszanych w stosunku objętościowym jak 10:90. Otrzymano 1,13 g bis(2,2'-bitienylo)-(4-hydroksyfenylo)metanu (wydajność 63%). Widma spektroskopii H NMR dla roztworu d-CDCI₃ (δ ppm): 7,22-7,18 (d, 2H, bitiofen H), 7,16-7,13 (dd, 2H, bitiofen H), 7,08-7,06 (dd, 2H, bitiofen H), 7,00-6,97 (d, 2H, fenyl H), 6,96-6,93 (dd, 2H, fenyl H), 6,83-6,79 (d, 2H, bitiofen H), 6,77-6,75 (dd, 2H, bitiofen H), 5,68 (s, 1H, -CH-).

Etap (b)

Bis(2,2'-bitienylo)-(4-hydroksyfenylo)metanowy ester biotyny 2. W 40 ml dimetyloformamidu rozpuszczono D-biotynę (366 mg, 1,5 mmola) i mieszaninę ochłodzono do temperatury 0°C na łaźni lodowej. Następnie do mieszaniny tej dodano EDCI (466 mg, 3 mmole) i mieszano przez 30 min w atmosferze azotu, po czym wkroplono do niej bis(2,2'-bitienylo)-(4-hydroksyfenylo)metan 1 (655 mg,

PL 223 074 B1

1,5 mmola) rozpuszczony w 20 ml dimetyloformamidu. Mieszaninę reakcyjną mieszano jeszcze przez 1 godz. w temperaturze 0°C a następnie reakcję kontynuowano w temperaturze pokojowej przez 45 godz. W końcu odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem a oleistą pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii cieczowej na kolumnie silikażelowej z zastosowaniem, jako eluent, roztworu chloroformu i etanolu zmieszanych w stosunku objętościowym jak 90:10. Otrzymano 110 mg bis(2,2'-bitienylo)-(4-hydroksyfenylo)-metanowego estru biotyny, związek o Wzorze 1, (wydajność 11%). Widma spektroskopii ¹H NMR dla roztworu d-CDCl₃: δ ppm; 7,36-7,32 (d, 2H, bitiofen H), 7,16-7,14 (dd, 2H, bitiofen H), 7,08-7,02 (m, 4H, nakładające się bitiofenu i fenylu H), 7,00-6,97 (d, 2H, fenyl H), 6,96-6,92 (dd, 2H, bitiofen H), 6,74-6,70 (dd, 2H, bitiofen H), 6,24 (s, 1H, biotyna -NH-), 5,74 (s, 1H, -CH-), 5,62 (s, 1H, biotyna -NH-), 4,42-4,38 (m, 1H, biotyna), 4,25-4,21 (m, 1H, biotyna), 3,123,08 (q, 1H, biotyna), 2,84-2,80 (dd, 1H, biotyna), 2,68-2,64 (d, 1H, biotyna H), 2,58-2,52 (t, 2H, biotyna H), 1,80-1,60 (m, 4H, biotyna H), 1,52-1,45 (m, 2H, biotyna H).

P r z y k ł a d 2

Niniejszy przykład przedstawia sposób przygotowania warstwy rozpoznającej polimeru według wynalazku zgodnie z Fig. 8.

Pierwszy etap przygotowania warstwy rozpoznającej (fig. 8) naszych chemosensorów PM i EIS polegał na spolimeryzowaniu elektrochemicznym, zsyntetyzowanego po raz pierwszy w tym celu, monomeru funkcyjnego i równoczesnym osadzeniu w ten sposób wytworzonej cienkiej warstwy polimeru na powierzchni, odpowiednio, elektrody rezonatora kwarcowego (QCR) i elektrody z węgla szklistego (GCE). Następnie polimer ten byt nieodwracalnie zmodyfikowany neutrawidyną, po czym na warstwie neutrawidyny unieruchomiony został biotynowany oligonuk leotyd rozpoznający. Przygotowaną w ten sposób warstwę rozpoznającą wykorzystano z kolei do oznaczania oligonukleotydu o sekwencji zasad komplementarnej do sekwencji oligonukleotydu rozpoznającego.

P r z y k ł a d 3

Przygotowanie chemosensora.

Warstwa rozpoznająca biosensora była zbudowana z trzech kolejno nałożonych warstw. Na fig. 8 przedstawiono kolejne etapy przygotowania tej warstwy wraz ze zdjęciami AFM obrazującymi topografię kolejnych pojedynczych warstw. Aby osadzić warstwę polimeru na złotej elektrodzie QCR lub na GCE najpierw przeprowadzono elektropolimeryzację potencjodynamiczną monomeru funkcyjnego z roztworu acetonitrylu i etanolu, zmieszanych w stosunku objętościowym jak 1:1, który był 1 mM względem monomeru funkcyjnego i 0,1 M względem (TBA)ClO₄. Do osadzania zastosowano cykliczne zmiany potencjału, w zakresie od 0,5 do 1,5 V względem chlorosrebrowej elektrody pseudoreferencyjnej (Ag|AgCI), liniowo przemiatanego z szybkością 50 mV/s. Wzrost grubości warstwy kontrolowano za pomocą liczby cykli potencjałowych. Po osadzeniu, polimer opłukano acetonem w celu usunięcia elektrolitu podstawowego. Otrzymana warstwa o grubości 57±4 nm zbudowana była z ziaren polimeru o średnicy 12±2 nm (a' na fig. 8). Następne etapy przygotowania warstwy rozpoznającej, opisane poniżej, były różne dla chemosensora PM i EIS.

P r z y k ł a d 4

Przygotowanie chemosensora impedancyjnego (EIS)

Po osadzeniu polimeru na platynowej elektrodzie dyskowej, elektrodę poddano cyklicznym zmianom potencjału liniowo przemiatanego w zakresie od -0,20 do 0,60 V vs Ag|AgCl w celu podwyższenia powtarzalności pomiarów impedancyjnych [Kowalczyk, A., et al., Construction of DNA biosensor at glassy carbon surface modified with 4-aminoethylbenzenediazonium salt. Biosens. Bioelectron., 2011. 26: p. 2506-2512]. Następnie elektrodę zanurzono na 15 min w roztworze neutrawidyny o stężeniu 1 mg/ml, po czym opłukano ją roztworem PBS (pH=7,4), aby usunąć niezwiązaną neutrawidyną, i w końcu zarejestrowano widmo EIS. Obrazowanie za pomocą AFM wykazało (b' na fig. 8), że zarówno topografia jak i szorstkość warstwy uległy zmianie na skutek adsorpcji neutrawidyny na powierzchni polimeru. Po unieruchomieniu neutrawidyny, na powierzchni polimeru powstały większe obiekty o średnicy 25±1 nm. Tworzenie kompleksu neutrawidyny z biotyną prawdopodobnie prowadzi do agregowania małych ziaren polimeru, charakterystycznych dla polimeru niemodyfikowanego. Następnie elektrodę zanurzono w roztworze biotynowanego oligonukleotydu rozpoznającego na 15 min, p onownie opłukano PBS (pH=7,4) i zarejestrowano widmo impedancyjne. Temu etapowi przygotowania chemosensora również towarzyszyła zmiana topografii warstwy (c' na fig. 8). Unieruchomienie oligonukleotydu spowodowało zespolenie warstwy i powstanie widocznych porów o średnicy 17±4 nm. Ponadto powstały płaskie obszary, prawdopodobnie wskutek zespolenia łańcuchów oligonukleotydowych. Na każdym etapie modyfikowania warstwy elektrodę poddawano cyk licznym zmianom potencjaPL 223 074 B1 łu, liniowo przemiatanego w zakresie od -0,20 do 0,60 V vs Ag|AgCl, aż do uzyskania powtarzalnego widma impedancyjnego.

P r z y k ł a d 5

Przygotowanie chemosensora piezomikrogrowimetrycznego (PM)

Po osadzeniu polimeru na QCR, rezonator ten zamontowano w oprawce przepływowej mikrowagi EQCM 5610. Roztwór nośny PBS (pH=7,4) przepuszczono nad QCR, aż do ustabilizowania się częstotliwości rezonansowej. Wówczas zastrzyknięto roztwór neutrawidyny o stężeniu 1 mg/m l i objętości 100 gl. Po ustabilizowaniu się częstotliwości, tj. po związaniu neutrawidyny, zastrzyknięto roztwór 30 μΜ biotynowanego oligonukleotydu rozpoznającego o objętości 100 gl. Szybkość przepływu roztworu nośnego w trakcie obu tych etapów unieruchomienia, jak i następnie w trakcie oznaczania, wynosiła 35 gl/min. Masę unieruchomionej neutrawidyny i biotynowanego oligonukleotydu wyznaczono ze zmian częstotliwości rezonansowej posługując się zależnością Sauerbrey'a, Równanie (1), (Buck, R.P., et al., Piezoelectric chemical sensor, Pure Appl. Chem., 2004, 76, 1339-1160].

gdzie f0 to podstawowa częstotliwość rezonansowa QCR (10 MHz), Aac to aktywna akustycznie powierzchnia rezonatora (1,96x10^-5 m²), μ to moduł ścinający kwarcu (2,95x10¹⁰ Pa) a p_q to gęstość kwarcu (2648 kg m^-3).

Optymalizacja przygotowania warstwy rozpoznającej sensora EIS

W celu wykonania chemosensora o wysokiej wykrywalności zoptymalizowano kilka parametrów jego przygotowania.

Najpierw zoptymalizowano grubość warstwy polimeru. Kontrolowano ją za pomocą liczby wyk onanych cykli zmian potencjału w trakcie elektropolimeryzacji potencjodynamicznej monomeru funkcyjnego. [Pietrzyk, A., et al., Melamine acoustic chemosensor based on molecularly imprinted polymer film. Anal. Chem., 2009, 81, 10061-10070]. Elektroda powinna być całkowicie pokryta warstwą polimeru. Dlatego, korzystnie, osadzono grubsze jego warstwy. Jednakże transport ładunku pomiędzy elektrodą i substancjami elektroaktywnymi w roztworze mógłby ulec znacznemu spowolnieniu w przypadku zbyt grubej warstwy. Spowolnienie to objawiłoby się wysokimi wartościami oporu przeniesienia ładunku, R_ct nawet dla niemodyfikowanej neutrawidyną warstwy polimeru. Wówczas zmiana R_ct, po unieruchomieniu neutrawidyny, a następnie biotynowanego oligonukleotydu rozpoznającego, byłaby niedostrzegalnie mała. Takie zachowanie potwierdziliśmy eksperymentalnie. To znaczy unieruchomienie neutrawidyny i wyżej wymienionego oligonukleotydu powodowało jedynie nieznaczne zmiany R_ct, jeżeli liczba cykli zmian potencjału przy osadzaniu polimeru przekraczała 7. W rezultacie wykrywalność oznaczanego oligonukleotydu była niska. Krzywe kalibracyjne dla warstw rozpoznających przygotowanych za pomocą różnej liczby cykli zmian potencjału są przedstawione na fig. 1. Okazało się, że warstwa osadzona za pomocą trzech cykli potencjałowych wykazuje zachowanie optymalne. Warunki przygotowania krzywej kalibracyjnej podane są poniżej w części, w której przedstawione są parametry analityczne wykonanego chemosensora.

Inne optymalizowane parametry decydujące o właściwościach analitycznych chemosensora to czas zanurzenia elektrody w roztworze neutrawidyny a następnie w roztworze biotynowanego oligonukleotydu rozpoznającego. Początkowo wydawało się, że im więcej neutrawidyny będzie unieruchomione na powierzchni polimeru tym więcej można będzie związać oligonukleotydu rozpoznającego, a przez to wyższa będzie wykrywalność oznaczanego oligonukleotydu. Dlatego zbadano zależność oporu przeniesienia ładunku od czasu zanurzenia elektrody w roztworach modyfikujących. W tym celu elektrodę pokrytą polimerem zanurzono w roztworze neutrawidyny o stężeniu 1 mg/ml na 2, 5, 7, 10, 15 lub 20 min. Okazało się, że opór przeniesienia ładunku rósł wraz z czasem zanurzenia aż do 10 min, po czym nie zmieniał się. Podobnie wyznaczono optymalny czas zanurzenia elektrody w roztworze biotynowanego oligonukleotydu rozpoznającego. W tym przypadku opór przeniesienia ładunku osiągał wartość maksymalną po 10 min zanurzenia elektrody w roztworze 30 gM biotynowanego oligonukleotydu.

Parametry analityczne chemosensora impedancyjnego

Po osadzeniu kompletnej warstwy rozpoznającej, elektrodę zanurzono w roztworach oznaczanego oligonukleotydu o różnych stężeniach na 6 min, po czym opłukano za pomocą 0,1 M PBS (pH=7,4) oraz poddano cyklicznym zmianom potencjału liniowo przemiatanego w zakresie od 0,20 do 0,60 V vs Ag|AgCI, aby uzyskać powtarzalne widma EIS. Następnie do danych eksperymentalnych

PL 223 074 B1 (fig. 2) dopasowano elementy obwodu zastępczego przedstawionego na fig. 7 a otrzymane wartości R_ct zastosowano do skonstruowania wykresów kalibracyjnych (wstawka na fig. 2). Odpowiedź chemosensora, w postaci zmiany oporności przeniesienia ładunku, była liniowa względem logarytmu stężenia oznaczanego oligonukleotydu w szerokim zakresie stężeń, tj. od 0,5 ąM do 30 μΜ. Równanie regresji liniowej dopasowane do punktów doświadczalnych i współczynnik korelacji były, odpowiednio, następujące: (R_ct,_f - R_c )/Ω = 19,91(±0,59) + 81,18(±1,48) log(c_target/nM) i 0,99, gdzie c_target to stężenie oznaczanego oligonukleotydu, R_ct,_i i R_ct,_f to oporność przeniesienia ładunku przez warstwę rozpoznającą, odpowiednio, przed i po zanurzeniu w roztworze oznaczanego oligonukleotydu. Warstwy rozp oznające przygotowane w tych samych warunkach wykorzystano do porównania selektywności chem osensorów względem oligonukleotydów zawierających w swojej sekwencji dwie i siedem zasad innych niż oznaczany oligonukleotyd (krzywe oznaczone numerami, odpowiednio, 2 i 3 na fig. 3). Wykrywalność oznaczanego oligonukleotydu, 19,91(±0,59) Ω, była niemal dwa razy wyższa od wykrywalności oligonukleotydu zawierającego 2 „błędy” w sekwencji, 10,87(±0,56) Ω, i siedem razy wyższa od wykrywalności oligonukleotydu zawierającego 7 „błędów” w sekwencji, 2,83(±1,47) Ω.

Fig. 8, d przedstawia warstwę rozpoznającą po zanurzeniu jej do roztworu nukleotydu oznaczanego, co doprowadziło do zhybrydyzowania tego oligomeru z unieruchomionym oligomerem rozpoznającym. Morfologia warstwy po tej hybrydyzacji nie uległa znaczącej zmianie (d' na fig. 8). Parametry analityczne chemosensora piezomikrograwimetrycznego

Zależność zmian częstotliwości rezonansowej QCR od czasu, zarejestrowana podczas przyg otowania warstwy rozpoznającej, jest przedstawiona na fig. 4. Kolejnym zastrzykom roztworu neutrawidyny a następnie roztworu oligonukleotydów towarzyszył spadek częstotliwości rezonansowej wynikający z unieruchomienia neutrawidyny, a następnie oligonukleotydów rozpoznającego i oznaczanego. Na podstawie tych zmian częstotliwości, Δί. obliczono za pomocą zależności Sauerbrey'a, Równanie (1), zmiany masy QCR, Διη, w wyniku unieruchomienia ww. substancji.

Wyznaczona ze zmian częstotliwości masa neutrawidyny unieruchomionej na powierzchni warstwy polimeru (zastrzyk 1 na fig. 4) wynosiła 276 ng, co odpowiada jej 4,6 fmola. Masa osadzonego biotynowanego oligonukleotydu rozpoznającego (zastrzyk 2 na fig. 4) wynosiła 87 ng, co odpowiada jego 13,5 fmola i stanowi 2,9 krotność liczby moli unieruchomionej neutrawidyny. Jest to stosunek molowy bliski oczekiwanej wartości 3 charakterystycznej dla całkowitego wysycenia trzech z czterech dostępnych miejsc wiążących neutrawidyny [Seo, M.-H., et al., Controlled and oriented immobilization of protein by sitespecific incorporation of unnatural amino acid, Anal. Chem., 2011, 83, 2841-2845], ponieważ przynajmniej jedno miejsce jest zajęte przez cząsteczkę biotyny unieruchomionej w polimerze. Wynik ten wskazuje, że warstwa rozpoznająca jest całkowicie zmodyfikowana biotynowym oligonukleotydem rozpoznającym. Zastrzyknięcie roztworu oznaczanego oligonukleotydu (zastrzyk 3 na fig. 4) podwyższyło masę QCR o kolejne 63 ng, co odpowiada 9,8 fmola tego nukleotydu. Najwyraźniej hybrydyzacja oznaczanego oligonukleotydu była niepełna po pierwszym zastrzyku, najprawdopodobniej z powodu znacząco niższej stałej trwałości shybrydyzowanego, dwuniciowego oligomeru (obliczonej poniżej) od stałej trwałości kompleksu biotyny z neutrawidyną.

Po przygotowaniu warstwy rozpoznającej skonstruowano wykres kalibracyjny na podstawie zastrzyków roztworów, w warunkach FIA, o różnych stężeniach oznaczanego oligonukleotydu w pełni komplementarnego do oligonukleotydu rozpoznającego. Po zastrzyknięciu każdego takiego roztworu, zastrzykiwano 0,1 M NaOH, aby zregenerować warstwę rozpoznającą chemosensora poprzez dehybrydyzację oligonukleotydów. Fig. 5 przedstawia 5 powtórzonych w takich samych warunkach zastrzyków roztworu oznaczanego oligonukleotydu o stężeniu 600 nM (kolejne zastrzyki oligonukleotydu oznaczone są pionowymi strzałkami opisanymi jako (a). Po każdym z nich, zgodnie z oczekiwaniem, częstotliwość rezonansowa obniżała się aż do osiągnięcia stałej wartości. Najprawdopodobniej ozn aczany oligonukleotyd był trwale wiązany przez warstwę rozpoznającą w warunkach FIA. Natomiast po każdym następnym zastrzyku 0,1 M NaOH (kolejne zastrzyki NaOH oznaczone są strzałkami opisanymi jako (b) częstotliwość gwałtownie spadała wskazując na podwyższenie lepkości warstwy (krzywa 1 na fig. 5). Lustrzanym tego odbiciem był wzrost oporności dynamicznej (krzywa 2 na fig. 5). Kiedy roztwór nośny PBS (pH=7,4) docierał, wraz z zastrzykniętą próbką oznaczanego oligonukleotydu, do naczynka przepływowego, tj. po ~3 min od początkowego spadku częstotliwości, zarówno częstotliwość jak i rezystancja dynamiczna wzrastały prawie do swojej pierwotnej wartości. Zachowanie to wskazuje na całkowite wymycie oznaczanego oligonukleotydu z warstwy rozpoznającej przez 0,1 M NaOH. Nagły spadek częstotliwości i następujący po nim wzrost do poziomu tła po zastrzyknięciu 0,1 M NaOH można przypisać pęcznieniu, a następnie kurczeniu polimeru, które towarzyszy zmianie

PL 223 074 B1 roztworu nośnego PBS (pH=7,4) na 0,1 M NaOH (pH=13,0). Wzrost a następnie spadek rezystancji dynamicznej także wskazuje na pęcznienie (podwyższenie lepkości) polimeru a następnie kurczenie (usztywnienie) warstwy (krzywa 2 na fig. 5). Powtarzalność sygnału zmiany częstotliwości oceniono na podstawie danych przedstawionych na fig. 5. Wyznaczone z pięciu powtórzonych cykli zastrzyków roztworu oznaczanego oligonukleotydu i NaOH odchylenie standardowe zmiany częstotliwości wynosiło 13%. Na podstawie zmian częstotliwości rezonansowej po kolejnych zastrzykach roztworów ozn aczanego oligonukleotydu o różnych stężeniach i następujących po każdym z nich zastrzyku 0,1 M NaOH skonstruowano wykres kalibracyjny (fig. 6). Odpowiedź chemosensora na oznaczany oligonukłeotyd była liniowa względem jego stężenia w roztworze w zakresie od 50 do 600 nM. Równanie regresji liniowej, dopasowanej do punktów pomiarowych, oraz współczynnik korelacji były równe, odpowiednio, Af/Hz = 0,028(±0,003) + 4,74(±0,66) c_target/nM oraz 0,94, gdzie Af to zmiana częstotliwości rezonansowej po zastrzyknięciu oznaczanego oligonukleotydu.

Ponadto, według opisanej w literaturze procedury [Skladal, P., Piezoelectric quartz crystal sensors applied for bioanalytical assays and characterization of affinity interactions, J. Braz. Chem. Soc., 2003, 14, 491-502], wyznaczono stałą trwałości kompleksu, K_s, warstwy rozpoznającej i oznaczanego oligonukleotydu. Schemat hybrydyzacji biotynowanego oligonukleotydu rozpoznającego (RO) z oligonukleotydem oznaczanym (TO) można zaproponować w sposób następujący (Równanie 2)

RO + TO + RO-TO (2) kd gdzie RO-TO to shybrydyzowany dinukleotyd.

Zmiana częstotliwości rezonansowej opisana jest Równaniem (3) . c _ ka^ctargetAfmax /n\ &ka^ctarget⁺kd gdzie Af_max oznacza maksymalną zmianę częstotliwości osiąganą po nasyceniu warstwy rozpoznającej oznaczanym oligonukleotydem a k_a i k_d to stała szybkości, odpowiednio, hybrydyzacji jednoniciowego oligonukleotydu rozpoznającego z jednoniciowym oligonukleotydem oznaczanym i dysocjacji utworzonego w ten sposób shybrydyzowanego oligonukleotydu dwuniciowego. Równanie (3) można przekształcić do następującej postaci opisanej Równaniem (4) feq = fmax( 1 - (4) gdzie, Af_eq to równowagowa zmiana częstotliwości osiągana po upływie 350 s od momentu dokonania zastrzyku roztworu oznaczanego oligonukleotydu, a k_obs wyraża się za pomocą Równania (5) bs ka^ta-rg et + ^kd ⁽⁵⁾

Parametry Równania (3) dopasowano do danych eksperymentalnych, dzięki czemu wyznaczono wartości k_obs dla każdego z dokonanych zastrzyków. Następnie wykreślono zależność k_obs od c_target stąd wyznaczono wartości k_a i k_d. Wiedząc, że ^Ks = ^kf_d ⁽⁶⁾ wyznaczono stałą trwałości kompleksu oligonukleotydu rozpoznającego z oznaczanym, która wyniosła, K_S - 4,56 x 10³ M^-1.

Nową biotynowaną pochodną bis(2,2'-bitienylo)metanu, bis(2,2'-bitienylo)-(4-hydroksyfenylo)metanowy ester biotyny, poddano efektropolimeryzacji potencjodynamicznej. Elektropolimeryzacja ta doprowadziła do osadzenia na powierzchni dwóch różnych przetworników cienkich warstw przewodzącego polimeru z unieruchomioną biotyną. Nieodwracalnie unieruchomienie neutrawidyny na tej powierzchni umożliwiło z kolei nieodwracalne związanie biotynowanego oligomeru rozpoznającego i przygotowanie w ten sposób warstwy rozpoznającej. Scalenie tej warstwy z odpowiednimi przetwornikami doprowadziło do wytworzenia chemosensorów zdolnych do wykrywania i oznaczania oligonukleotydu o sekwencji zasad nukleinowych komplementarnej do sekwencji unieruchomionego oligonukleotydu rozpoznającego. Przygotowany chemosensor piezomikrograwimetryczny charakteryzował się wyższą (50 nM) wykrywalnością niż chemosensor impedancyjny (0,5 pM), ale działał on w warunkach FIA i odwracalnie wiązał oznaczany oligonukleotyd.

Claims (9)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Nowy bis(2,2'-bitienylo)-(4-hydroksyfenylo)metanowy ester biotyny o Wzorze 1:

   H o

   Wzór 1
2. 2. Sposób wytwarzania bis(2,2'-bitienylo)-(4-hydroksyfenylo)metanowego estru biotyny, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

   (a) wyjściowy roztwór 2,2'-bisbitiofenu w protycznym rozpuszczalniku organicznym poddaje się reakcji z 4-hydroksybenzaldehydem i kwasem nadchlorowym z wytworzeniem bis(2,2'-bitienylo)-(4-hydroksyfenylo)metanu, a następnie (b) ten otrzymany bis(2,2'-bitienylo)-(4-hydroksyfenylo)metan poddaje się reakcji z D-biotyną i 1-etylo-3-(3-dimetoiloaminopropylo)karbodiimidem i otrzymuje się bis(2,2'-bitienylo)-(4-hydroksyfenylo)metanowy ester biotyny.
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że etap (a) prowadzi się w atmosferze gazu obojętnego, w temperaturze w zakresie od 50 do 70°C, przez 12 do 13 godz., w protycznym rozpuszczalniku organicznym, korzystnie w glikolu etylenowym, przy stosunku molowym reagentów względem 4-hydroksybenzaldehydu w zakresie od 2 do 4 dla 2,2'-bisbitiofenu i od 20 do 60 dla kwasu nadchlorowego.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że etap (a) prowadzi się w atmosferze gazu obojętnego, w temperaturze 60 przez 16 godz., w glikolu etylenowym, przy stosunku reagentów względem 4-hydroksybenzaldehydu równym 3 dla 2,2'-bisbitiofenu i 45 dla kwasu nadchlorowego.
5. 5. Sposób według zastrz. 2 albo 3, albo 4, znamienny tym, że etap (b) prowadzi się w atmosferze gazu obojętnego najpierw w temperaturze w zakresie od 0 do 10°C przez 0,5 do 2 godz., po czym w temperaturze pokojowej przez 24 do 72 godz., w aprotycznym rozpuszczalniku organicznym, korzystnie dimetyloformamidzie, przy stosunku molowym reagentów względem bis(2,2'-bitienylo)-(4-hydroksyfenylo)metanu w zakresie od 1 do 3 dla biotyny i od 1 do 3 dla EDCI.
6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że etap (b) prowadzi się w atmosferze gazu obojętnego najpierw w temperaturze ~4°C, przez ~1 godz., po czym w temperaturze pokojowej przez 45 godz., w dimetyloformamidzie, przy stosunku molowym reagentów względem bis(2,2'-bitien-5-ylo)-(4-hydroksyfenylo)metanu równym 1 dla biotyny i 2 dla EDCI.
7. 7. Warstwa rozpoznającego polimeru, otrzymana za pomocą elektropolimeryzacji w warunkach potencjodynamicznych, znamienna tym, że stanowi ją polimer zawierający, określony w zastrz. 1, bis(2,2'-bitienylo)-(4-hydroksyfenylo)metanowy ester biotyny albo unieruchomiony w polimerze bis(2,2'-bitienylo)-(4-bydroksyfenylo)metanowy ester biotyny.
8. 8. Zastosowanie warstwy polimeru rozpoznającego, określonej w zastrz. 7, do selektywnego wykrywania oligonukleotydu komplementarnego względem unieruchomionego oligonukleotydu rozpoznającego, jako warstwy rozpoznającej czujnika chemicznego, korzystnie piezograwimetrycznego i impedymetrycznego czujnika chemicznego.
9. 9. Zastosowanie warstwy polimeru rozpoznającego, określonej w zastrz. 7, do selektywnego oznaczania oligonukleotydu komplementarnego względem unieruchomionego oligonukleotydu rozpoznającego, jako warstwy rozpoznającej czujnika chemicznego, korzystnie piezograwimetrycznego i impedymetrycznego czujnika chemicznego.