JP2004194670A - 直接型ビリルビンの測定方法および測定用試薬 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、試料にビリルビンオキシダーゼを作用させ、該試料の光学的変化により試料中の直接型ビリルビンを測定する方法において、100mM〜800mMのカリウムイオンを共存させておくことを特徴とする直接型ビリルビンの測定方法を提供する。
【選択図】なし
Description
これらの抱合型(直接型)および遊離型(間接型)の各ビリルビン濃度を分別定量することにより各種肝疾患、溶血性疾患などによる黄だんの鑑別および診断を行うことができるため、ビリルビンの測定は臨床検査における重要な項目となっている。
ジアゾ試薬による方法は、ビリルビンがジアゾ試薬と反応してアゾビリルビンを生成し、その結果、ビリルビン本来の可視部極大吸収波長より長波長域にアゾビリルビンの極大吸収が発生するため、この波長における吸光度変化によりビリルビンを定量するものである。これらは、間接型ビリルビンの反応促進剤の種類、反応停止条件、アゾビリルビンの検出条件の違いにより種々のものが報告されている(非特許文献1、非特許文献2および非特許文献3)。
ビリルビンオキシダーゼによる方法は、ビリルビンを含む検体にビリルビンオキシダーゼを作用させて、ビリルビンをビリベルジンに酸化させ、この際、ビリルビンの極大吸収波長域の吸光度が消失するので、この吸光度の減少量により定量するものである。この測定法では、間接ビリルビンの反応抑制の方法に種々の工夫がなされており、下記のごとく多数の方法が報告されている。
B2)陰イオン界面活性剤を含有するpH5〜6の酸性緩衝液中で、ビリルビンオキシダーゼを作用させることを特徴とする直接型ビリルビンの測定方法(非特許文献4および特許文献2)。
B3)pH9〜10の緩衝液中でビリルビンオキシダーゼを作用させ生じた吸光度の変化を測定することを特徴とする抱合型ビリルビンの定量方法(特許文献3)。
B4)pH2.0〜3.3のフェロシアン化カリウムおよび/またはフェリシアン化カリウムを含む緩衝液中でビリルビンオキシダーゼを作用させ、生じた吸光度変化を測定することを特徴とする直接型ビリルビンの定量方法(特許文献4)。
B5)ビリルビンオキシダーゼとともに、フッ素化合物または還元剤を共存させることを特徴とする直接型ビリルビンの定量方法(特許文献5)ビリルビンオキシダーゼとともに、テトラピロール環化合物を共存させることを特徴とする直接型ビリルビンの定量方法(特許文献6)。
HPLCによる直接型ビリルビンの測定法は、逆相カラムに有機溶剤の濃度勾配をかけビリルビンの画分を親水性/疎水性の序列により分画するものである。HPLCによると血清中のビリルビンは主にα、β、γ、δの4画分に分離され、それぞれ、α画分は遊離型ビリルビン、β画分は1分子中に2つある側鎖のプロピオン酸基の1つのみがグルクロン酸とエステル結合をしているビリルビン(ビリルビンモノグルクロナイド)、γ画分はプロピオン酸基が2つともグルクロン酸とエステル結合をしているビリルビン(ビリルビンジグルクロナイド)、δ画分はアルブミンとビリルビンが共有結合をしているものと同定されている。また、δ画分はγ画分とアルブミンが非酵素的に反応した結果、生成したものと推定されている(非特許文献5)。なお、HPLCでのα画分は上記A)のジアゾ試薬による方法では間接型ビリルビンに相当し、一方、βとγおよびδ画分は直接型ビリルビンに相当するとされる(非特許文献6)。HPLC法は、煩雑な検体前処理工程を極力省略した形で改良が進められており、種々の報告がなされている(非特許文献7、非特許文献8および非特許文献9)。
化学的酸化剤によるものは、ビリルビンオキシダーゼの代わりに、低分子量の酸化剤を作用させて、ビリルビンをビリベルジンに酸化し、この際のビリルビンに基づく吸光度減少量により定量するものである。これらも、間接型ビリルビンの反応抑制の方法に種々の工夫がなされており、下記のごとく報告されている。
D1)銅イオンおよびチオ尿素もしくはその誘導体を被検液に作用させることを特徴とする直接型ビリルビンの定量方法(特許文献7)。
D2)バナジン酸イオンまたは3価のマンガンイオンを酸化剤として作用させ、試料の光学的変化を測定することを特徴とするビリルビンの定量方法(特許文献8)。この方法で直接型ビリルビンを測定するためには、間接型ビリルビンの反応抑制剤として、ヒドラジン類、ヒドロキシルアミン類、オキシム類、脂肪族多価アミン類、フェノール類、水溶性高分子およびHLBが15以上の非イオン型界面活性剤からなる群より選ばれた1種以上の化合物を使用する。
D3)亜硝酸を酸化剤として作用させ、試料の光学的変化を測定することを特徴とするビリルビンの定量方法(特許文献9)。この方法で直接型ビリルビンを測定するためには、間接型ビリルビンの反応抑制剤として、HLBが12〜15のポリオキシエチレン(n−アルキルあるいはiso−アルキル)エーテル、チオ尿素、ヒドラジン、ポリビニルピロリドン等を使用する。
更に本発明は、必須構成成分として、i)ビリルビンオキシダーゼとii)チオシアン酸イオン、ヒドラジド類、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸及び100mM〜800mMのカリウムイオンから選ばれる間接型ビリルビン反応抑制剤の1種以上とを含むことを特徴とする直接型ビリルビン測定用試薬である。
本発明の方法においては、間接型ビリルビン反応抑制剤として用いるチオシアン酸イオンとしては、特に限定されないが、チオシアン酸アルカリ金属、チオシアン酸アルカリ土類金属、チオシアン酸アンモニウム等が挙げられるが、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム等が好ましい。
NADHまたはNADPHを用いる場合には、0.1mM〜10mM、好ましくは0.2mM〜5mMの濃度範囲である。
間接型ビリルビンオキシダーゼの反応抑制剤としてカリウムイオンを単独で用いる場合、ビリルビンオキシダーゼを含む第2試薬液のpHは、7〜11がビリルビンオキシダーゼの安定性から好ましい。
緩衝液の組成としては、前記したように、フタル酸水素カリウム/水酸化ナトリウム緩衝液、クエン酸ナトリウム/水酸化ナトリウム緩衝液、リンゴ酸/水酸化ナトリウム緩衝液等を含むものを例示できる。
第1試薬液には、さらにカリウムイオンを含むことが好ましい。
間接型ビリルビンの抑制効果
ビリルビンオキシダーゼを作用させる際、100mM〜800mMのカリウムイオン(実施例1)、チオシアン酸イオン(実施例2)、ヒドラジド類(実施例3及び実施例4)、NADH(実施例5)、NADPH(実施例6)を共存させると、間接型ビリルビンの酸化反応が抑制されるかどうかを観察するため以下の実験を行った。なお、比較例1では、これらチオシアン酸イオン等を含まない条件で行った。それらの試薬、試料、測定、結果を以下に示す。
比較例1に用いた第1試薬液
:フタル酸 150 mM
トリトンX−100 0.05%
pH5.50(NaOHで調整)
実施例1に用いた第1試薬液
:フタル酸 150 mM
塩化カリウム 200 mM
トリトンX−100 0.05%
pH5.50(NaOHで調整)
実施例2に用いた第1試薬液
:フタル酸水素カリウム 150 mM
チオシアン酸ナトリウム 10 mM
トリトンX−100 0.05%
pH5.50(NaOHで調整)
実施例3に用いた第1試薬液
:フタル酸水素カリウム 150 mM
ベンゼンスルフォニルヒドラジド 10 mM
トリトンX−100 0.05%
pH5.50(NaOHで調整)
実施例4に用いた第1試薬液
:フタル酸水素カリウム 150 mM
イソフタロイルジヒドラジド 10 mM
トリトンX−100 0.05%
pH5.50(NaOHで調整)
実施例5および実施例6に用いた第1試薬液
:フタル酸水素カリウム 150 mM
トリトンX−100 0.05%
pH5.50
比較例1及び実施例1〜4に用いた第2試薬液
:トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン
10 mM
ビリルビンオキシダーゼ 0.24U/ml
(Pleurotus属由来)
pH10.2
実施例5に用いた第2試薬液
:トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン
10 mM
NADH 5 mM
ビリルビンオキシダーゼ 0.24U/ml
pH10.2
実施例6に用いた第2試薬液
:トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン
10 mM
NADPH 5 mM
ビリルビンオキシダーゼ 0.24U/ml
pH10.2
試料は、間接型ビリルビン濃度50mg/dlでありかつヒト血清アルブミン濃度6.0g/lのものを用いた。その試料は、以下のようにして調整した。
間接型ビリルビン5mgを秤量し0.4mlのジメチルスルホキシドに分散させる。この分散した液に、0.4mlの100mM炭酸ナトリウム溶液を加え間接型ビリルビンを溶解させた直後、ヒト血清アルブミンを含む100mM Tris緩衝液(pH7.00)9.2mlにて希釈して試料を調製した。
日立7070型自動分析装置において、試料10μl、第1試薬液300μl、第2試薬液75μlの条件で、主波長450nm、副波長546nmにおける吸光度変化を2Point End法にて求めた。
即ち、自動分析装置上で第1試薬液と試料とを混合し、37℃で5分間インキュベーションした後、この溶液中のビリルビンに基づく吸光度を主波長450nm、副波長546nmにて測定する(吸光度1)。ついで、得られる溶液に、ビリルビンオキシダーゼを含む第2試薬液を添加して37℃で、5分間ビリルビンの酸化反応を行った後、再度、溶液中のビリルビンに基づく吸光度を前記の波長で測定する(吸光度2)。得られた吸光度1及び吸光度2の値に液量補正等を処した後、酸化反応前後での吸光度減少量を求める。これらの測定及び計算は、自動分析装置で自動的に行われる。
比較例1及び実施例1〜6における間接型ビリルビンでの吸光度減少量の結果を表1に示す。また、比較例1及び実施例1〜6における自動分析装置上における反応経過過程(反応タイムコース)を図1〜6に示す。
これにより、チオシアン酸イオン、ヒドラジド類、100mM〜800mMのカリウムイオン、NADH、NADPH共存下では、いずれも、ビリルビンオキシダーゼによる間接型ビリルビンの反応が抑制されることが明らかにされた。
直接型及び間接型ビリルビンとを含む試料中の直接型ビリルビンの測定
(1)試料の調製
100mM Tris緩衝液(pH7.00)中に合成抱合型ビリルビンであるジタウロビリルビンを5mg/dl(ビリルビン相当濃度)とヒト血清アルブミンを6.0g/l含む溶液を直接型ビリルビン溶液として調整した。また、それとは別に、100mM Tris緩衝液(pH7.00)中に非抱合型ビリルビンを5mg/dlとヒト血清アルブミンを6.0g/l含む溶液を間接型ビリルビン溶液として調製した。次いで、直接型ビリルビン溶液を間接型ビリルビン溶液にて希釈し、総ビリルビン濃度が同一(5mg/dl)でかつ直接型ビリルビン濃度が異なる種々の試料を調整した。なお、試料は、総ビリルビンに対する直接型ビリルビンの比が0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0の6種のものを調製した。
この試料を用いた以外は、実施例1〜6記載の測定試薬、測定条件で、吸光度減少量を測定し、それぞれ、実施例7(カリウムイオン使用)、実施例8(チオシアン酸イオン使用)、実施例9(ヒドラジド類使用)、実施例10(ヒドラジド類使用)、実施例11(NADH)、実施例12(NADPH)とした。
結果を図7〜12に示す。図7〜12では、横軸に総ビリルビンに対する直接ビリルビンの比、縦軸に吸光度減少量を表わしている。本発明の方法(実施例7〜12)では、直接型ビリルビンの量に比例して吸光度が大きくなり、原点回帰の良好な希釈直線性が得られた。これは、実施例7〜12では、間接型ビリルビンの干渉なく、直接型ビリルビンを選択的に測定していることを示している。
従来法による直接型ビリルビンと間接型ビリルビンとを含む試料中の直接型ビリルビンの測定
一方、実施例7〜12に用いた試料を用いて、従来法で直接型ビリルビンを測定した。従来法は、pH3.5〜4.5の条件でビリルビンオキシダーゼを作用させる測定法(特開昭59−125899;Shogo otsuji,Clin.Biochem.,21,33〜38(1988))で行った。即ち、以下の組成の試薬条件によるものである。
従来法の第1試薬液
クエン酸三ナトリウム・三水和物 17.65 g/l
乳酸 30.0 g/l
トリトンX−100 1.0 g/l
EDTA・2Na・2H2 O 18.6 mg/l
pH3.70
従来法の第2試薬液
クエン酸三ナトリウム・三水和物 3.05 g/l
乳酸 160 mg/l
トリトンX−100 1.0 g/l
CuSO4 ・5H2 O 1.25 g/l
ビリルビンオキシダーゼ 0.2 U/ml
pH6.50
従来法の測定条件は、試薬液以外は、実施例1記載の測定条件と同一とした。
結果を図7〜12に示す。従来法(比較例2)では、試料中の直接型ビリルビン濃度と測定された吸光度との間に直線性が得られないことが判明した。従来法では、試料中の間接型ビリルビンの干渉を大きく受け、試料中の直接型ビリルビンを正確に測定していないことを示す。
本発明の測定方法条件下でビリルビン高値患者検体中の間接型ビリルビンが反応しないことをHPLCで確認した例
(1)試料
試料としてビリルビン高値の患者プール血清検体を用いた。血清検体に対しては、硫酸ナトリウムによる塩析を行わず、未処理のまま分析に処した。試料中のグロブリンがカラムに吸着し劣化を早める結果となるが、ビリルビン画分の変性を防止することを目的とした為である。
実施例13(カリウムイオン使用)、実施例14(チオシアン酸イオン使用)、実施例15(ヒドラジド類使用)、実施例16(ヒドラジド類使用)、実施例17(NADH使用)、実施例18(NADPH使用)では、それぞれ、実施例1〜6で用いた試薬を使用した。比較例3では、比較例2で用いた試薬を使用した。
試料16μlに対して第1試薬液480μlを添加し、37℃で5分間加温した。さらに、得られる液に、120μlの第2試薬液を添加し、37℃で5分間加温後、120μlの2%アスコルビン酸水溶液を添加してビリルビンオキシダーゼの反応を停止させた。
HPLCの分析は、文献(John J. Lauff,Clin.Chem,28(4),629〜637(1982))記載の方法により行い、反応前後における間接型ビリルビンに基づくピーク面積の変化を調べた。反応前のデータは、第2試薬液として生理食塩水を用いた以外は、上記した酸化反応と同様の操作を行い、間接型ビリルビンに基づくピーク面積を求めた。
HPLCは、日立HPLCシステム(Column Oven L−7300、UV Detector L−7400、Pump L−7100、Integrator D−7500)に関東化学(株)製の逆相系カラムLichrspher 100 RP−18(10μm)を接続して使用した。
すなわち、上記の酸化反応で得られる液を、0.45μmのメンブランフィルターにてろ過し、ろ液150μlをHPLCのカラムに注入して反応後の間接ビリルビンに基づくピーク面積を求めた。溶出は、ビリルビン画分を、A液:(精製水950容/2−メトキシエタノール50容/りん酸にてpH2.1に調製)とB液:(イソプロパノール950容/2−メトキシエタノール50容/りん酸2.5容)の2液間におけるイソプロパノールの直線勾配により行い、450nmの波長により検出した。
反応前のデータを100とし、そのデータと反応後の間接型ビリルビンに基づくピーク面積のデータとの比較により、間接型ビリルビンの残存比率を求めた。結果を表2に示す。反応前後で間接型ビリルビンに基づくピーク面積がほとんど変わらず、本発明の測定条件下では、間接型ビリルビンが反応しないことが確認された。一方、比較例3(従来法)では、間接型ビリルビンが16.5%減少していた。従来法の条件下では、間接型ビリルビンの一部が反応したことを示している。
Claims (3)
- ビリルビンを含む試料にビリルビンオキシダーゼを作用させ、該試料の光学的変化により試料中の直接型ビリルビンを測定する方法において、100mM〜800mMのカリウムイオンである間接型ビリルビン反応抑制剤を共存させてビリルビンオキシダーゼを作用させることを特徴とする直接型ビリルビンの測定方法。
- ビリルビンオキシダーゼを作用させるときのpHが5.0〜6.0である請求項1の直接型ビリルビンの測定方法。
- 必須成分として、i)ビリルビンオキシダーゼとii)100mM〜800mMのカリウムイオンである間接型ビリルビン反応抑制剤とを含むことを特徴とする直接型ビリルビン測定用試薬。
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