JP2004187686A - Hiv−グループの免疫不全ウイルスのrnaに対して相補的なdna - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 European Collection of Animal Cell Cultures(ECACC)にNo.V 920 92 318の番号で寄託されたMVP−5180/91なる呼称を有するレトロウイルスの本質的な形態学的および免疫学的性質を示すHIVグループの免疫不全ウイルスまたはこのウイルスの変異株のRNAまたはその部分に対し相補的であるDNA。
【選択図】 なし
Description
第2のヒト免疫不全ウイルス群は1985年に西アフリカで同定され(Clavel, F. et al., Science 233, 343-346〔1986〕)、そしてヒト免疫不全ウイルス・タイプ2(HIV−2)と名付けられている(EP−A−0 239 425)。HIV−2レトロウイルスは、明らかにHIV−1とは区別されるが、なおもサル免疫不全ウイルス(SIV−2)と近縁関係をも示す。HIV−1と同様、HIV−2もエイズ症状を生じる。
免疫不全レトロウイルスのもう一つの変異株がEP−A−0 345 375に記載されており、そこではHIV−3レトロウイルスと名付けられている(ANT 70)。
高い変異性を示すことがヒト免疫不全ウイルスの一特徴であり、これが様々な単離物の比較の可能性を明らかにめんどうにしている。様々なHIV−1−単離物を比較すると、他のゲノム領域は比較的保存されたままであるのに、いくつかのゲノム領域では高い変異性が認められる(Benn, S. et al. Science 230, 949-951〔1985〕)。本質的により大きい多形態性はHIV−2についても観察することができた(Clavel, F. et al., Nature 324, 691-695〔1986〕)。構造的および酵素的に不可欠なタンパク質をコードしているgagおよびpol遺伝子は大きな遺伝安定性を有し;env遺伝子および調節タンパク質をコードする遺伝子(vif、vpr、tat、rev、nef)は高い変異度を示す。さらにHIV−1に対する抗血清がほんのわずかな配列相同性しかなくても、HIV−2のgagおよびpol遺伝子産生物とも交叉反応することも示すことができた。同様に、あまり厳しくない条件を用いなければ両ウイルス間のハイブリダイゼーションはほとんど有意でなかった(Clavel, F. et al., Nature 324, 691-695〔1986〕)。
さらに、本発明ウイルスはマグネシウム依存性ではあるがマンガン依存性ではない逆転写酵素を有する。このことは、ウイルスHIV−1およびHIV−2とのもう一つの一致点である。
UNI−1:GTGCT TCCAC AGGGA TGGAA
UNI−2:ATCAT CCATG TATTG ATA
(Donehower L.A. et al.(1990)J. Virol. Methods 28, 33-46)
との組合せを用い、そしてネステッド・プライマー(nested primer)を用いたPCRを行うとMVP−5180/91−DNAの弱い増幅物が得られることがわかった。
gag d:AGTCC CTGAC ATGCT GTCAT CA
env a:GTGGA GGGGA ATTTT TCTAC TG
env d:CCTGC TGCTC CCAAG AACCC AAGG
を用いるとHIV−1に比べ弱いが使用HIV−2単離物(MVP−11971/87)と同じ強さを示す増幅物が得られた。
これらの結果から、MVP−5180/91の逆転写酵素はHIV−1またはHIV−2の逆転写酵素よりも約3〜約7キロダルトン小さい分子量を有すると結論することができる。MVP−5180の逆転写酵素は従ってHIV−1またはHIV−2の逆転写酵素よりも約4,500〜約5,500ダルトン小さい分子量を示す。
前述の諸特徴が本発明によるMVP−5180/91に相当するようウイルス変異株を特徴付ける。従って、免疫不全徴候を示しそして好ましくはアフリカに由来する人々に由来するヘパリン加供血者血液から免疫不全ウイルスが単離されれば、この方法により本発明によるウイルスまたはその変異株を得ることができる。
様々なウイルス単離物の間の類似性を核酸またはタンパク質配列の相同度により絞り出すことができる。例えば50%相同性は配列中の100のヌクレオチド−またはアミノ酸−位のうち50が一致することを意味している。タンパク質の相同性は配列分析により決定される。相同DNA配列はハイブリダイゼーション法によっても調べることができる。
更に、gp41をコードする領域も配列決定された。この配列を第1表または第3表に示す。
更に本発明の主題は、少くとも50、好ましくは100、ヌクレオチド長の第3表に記載の核酸配列の部分配列に対して66%以上、好ましくは75%以上、そして特に好ましくは85%以上の相同性を示すようなウイルスである。これは、少くとも16、そして好ましくは33、のアミノ酸のアミノ酸長に相当する。
免疫酵素テスト(ELISA)においては、例えばMVP−5180/91またはその変異株に由来する抗原をミクロタイタープレートの壁面に結合することができる。その際に用いられる用量はテストシステムおよびミクロタイタープレートの操法に本質的に依存する。次いで検査すべき人に由来する血清または血清希釈液をそのミクロタイタープレートの穴に添加する。一定のインキュベーション時間の後、そのプレートを洗浄する。特異免疫複合体は、ヒト免疫グロブリンに特異的に結合しそして予め酵素例えば西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼなどに結合しておいた抗体により、あるいは酵素標識抗原を用いて検出される。この酵素は無色基質を強く発色した生成物に変えることができ、次いでその色の強さで特異抗−HIV−抗体の存在を読み取ることができる。テストシステムにおける本発明ウイルス利用のもう一つの可能性はウェスターンブロットへの利用である。
本発明による免疫不全ウイルスMVP−5180/91を免疫不全徴候を伴う女性患者の血液から単離した。そのために、HIVに感染していない供血者の血液からの末梢リンパ球(peripheral blood lymphocytes, PBL)および末梢単核細胞(末梢血リンパ球、PBL)を植物性血球凝集素(フィトヘマグルチニン)で刺激しそして培養液に保った。そのために、10%牛胎仔血清含有の普通培地RPMI 1640を用いた。培養条件はLanday A. et al., J. Inf. Dis., 161(1990)pp.706-710、に記載されている。次いで巨細胞(Reisenzellen)の形成を顕微鏡観察した。HIVウイルスの生産をAbbott社から購入できるテストを用いたp24−抗原の測定により測定した。ウイルス増殖測定のためのもう一つのテストは粒子結合逆転写酵素を用いたテストであった(Eberle J., Seibl R., J. Virol. Methods 40, 1992, pp. 347-356)。すなわち、ウイルス生産を監視するためにウイルス増殖を培養上清中の酵素活性に基づいて週1〜2回測定した。1週間に1回新たな供血者リンパ球を添加した。
HIV感染の検出には、現在のところいわゆるウェスターンブロットまたはイムノブロットが標準的方法である。J. Virol. Meth. 15 (1987) pp. 11-23にGuertlerらが記載している手順に従って様々な血清を検査した。その際に、ドイツの患者の血清をアフリカの患者から得られた血清と対比させた。その際に得られた結果は次のとおりであった。
ウイルス型:ドイツの患者から単離されたHIV−1ウイルス
ドイツの血清 強い反応
アフリカの血清 gp41と強い反応
ウイルス型:MVP−5180/91
ドイツの血清 gp41と無反応乃至弱い反応
アフリカの血清 強い反応
実施例2に記載の手順に従ってさらなるウェスターンブロットを行った。その結果を添付した図3に示す。このテストでは、本発明による免疫不全ウイルスMVP−5180/91のウイルスタンパク質、およびHIV−1型ウイルス(MVP−899)のウイルスタンパク質をそれぞれ、ゲル電気泳動分離した後セルロースフィルターに移した。これらフィルター片を様々な患者の血清と共にインキュベートした後特異抗体を呈色反応により視認できるようにした。MVP−5180の標題のある図の左半分は本発明による免疫不全ウイルスを示す。図の右半分は、HIV−1ウイルスに関係する、ドイツの供血者から単離されたウイルス(MVP−899)を示す。
それら個々のフィルター片を今度は様々な患者の血清と共にインキュベートした。図3からわかるように、それぞれ同じ(ドイツの患者の)血清を各々2つのフィルター片と反応させた。8と26;9と27;10と28;11と29;13と30;13と31;14と32;15と33および16と34の番号は同じ血清を表示している。17および18番のウェスターンブロットでは、アフリカの患者の血清を適用した。右側余白の数値は概ねの分子量を1000(KD)単位で記述したものである。
HIV−単離物MVP−5180/91のゲノム断片のDNA単離、増幅および構造的特徴評価
MVP−5180/91に感染させたHUT78細胞よりのゲノムDNAを標準的方法により単離した。
単離物MVP−5180/91のゲノム領域の特徴評価をするためにPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)実験を外被タンパク質領域gp41からのプライマー対を用いて行った。そのPCR実験の実施は次の改変を加えたSaikiら(Saiki et al., Science 239: 487-491, 1988)の方法により行った:HIV−特異的DNA領域を増幅するために、MVP−5180/91に感染させたHUT78細胞からの5μlのゲノムDNAを100μlの反応混合物(0.25mM dNTP、各1μMのプライマー1およびプライマー2、10mM Tris HCl pH8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.001%ゼラチン、2.5単位のTaqポリメラーゼ(Perkin Elmer社))にピペットで取り、そして次の温度プログラムに従って増幅した:1.初期変性:3分95℃、2.増幅:90秒94℃、60秒56℃、90秒72℃(30サイクル)。
プライマー1:AGC AGC AGG AAG CAC TAT GG
(HIV単離物H×B2からの座標(コーディネート):塩基7795−7814、プライマーsk68に相当)
プライマー2:GAG TTT TCC AGA GCA ACC CC
(HIV1単離物H×B2からの座標:塩基8003−8022、プライマー env bに相当)。
増幅されたDNA領域のヌクレオチド配列およびそれより導かれたアミノ酸配列を第1表に示す。
確認された第1表記載のヌクレオチド配列の相同配列をGENEBANKデータバンク(リリース72、1992年6月)でGCG−コンピュータープログラム(Genetic Computer Group, Inc.社、米国ウイスコンシン州、バージョン7.1、1992年3月)を用いて調べた。このデータバンクには1992年7月までに知られた、ヒト起源の免疫不全ウイルスのおよび霊長類からの単離物のヌクレオチド配列のほとんどが含まれている。
確認された第1表に記載のアミノ酸配列の相同配列をSWISSPROTタンパク質データバンク(リリース22、1992年6月)においてGCG−コンピュータープログラムを用いて調べた。このデータバンクには1992年6月までに知られた、ヒト起源の免疫不全ウイルスのおよび霊長類からの単離物のタンパク質配列のほとんどが含まれている。
HIV2およびSIVの外被タンパク質の対応するアミノ酸領域も同様に免疫診断的に保存されている(Gnann et al., Science, pp. 1346-1349, 1987)。従ってHIV1およびHIV2のこの外被タンパク質領域からのペプチドは多くの商業的に入手し得るHIV 1/2抗体スクリーニングテストに固相抗原として適用される。それによって約99%の抗HIV1および抗HIV2陽性血清を捕捉することができる。
(gp41をコードする)HIV単離物MVP−5180/91のゲノム診断のDNA単離、増幅および構造的特徴評価
MVP−5180/91に感染したHUT78細胞からのゲノムDNAを前述の如く単離した。
単離物MVP−5180/91のゲノム領域の特徴評価を行うために、外被タンパク質領域gp41からのプライマー対を用いてPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)実験を行った。PCR(Saiki et al., Science 239:487-491, 1988)および逆PCR(Triglia et al., Nucl. Asids, Res. 16:8186, 1988)は次の改変を加えて行われた:
HIV−特異的DNA領域を増幅するために、MVP−5180/91に感染させたHUT78細胞からの5μl(218μg/ml)のゲノムDNAを100μlの反応混合物(0.25mM dNTP、各1μMのプライマー163envおよびプライマーenvend、 10mM Tris HCl(pH8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.001%ゼラチン、2.5単位のTaqポリメラーゼ(Perkin Elmer社))にピペットでとりそして次の温度プログラムに従って増殖した:1.初期変性:3分間95℃、2.増幅:90秒間94℃、60秒間56℃、90秒間72℃(30サイクル)。
PCR/逆PCRおよびヌクレオチド配列決定に用いられたプライマーはBioresearch社のオリゴヌクレオチド合成装置8750で合成したところ、該プライマーは次の配列を示す:
プライマー163env: 5′CAG AAT CAG CAA CGC CTA AAC C 3′
プライマーenvend: 5′GCC CTG TCT TAT TCT TCT AGG 3′
(HIV1単離物BH10での位置:塩基8129−8109)
プライマー 168i: 5′GCC TGC AAG CCT TAG AAA CC 3′
プライマー169i: 5′GCA CTA TAC CCT TCA GTA CAC TG 3′
増幅されたDNA領域のヌクレオチド配列およびそれより導かれたアミノ酸配列を第3表に示す。
確認された第3表記載のヌクレオチド配列の相同配列をGENEBANK−データーバンク(リリース72、1992年6月)においてGCG−コンピュータープログラム(Genetic Computer Group, Inc.社、米国ウイスコンシン州、バージョン7.1、1992年3月)を用いて調べた。このデータバンクには1992年7月までに知られた、ヒト起源の免疫不全ウイルスのおよび霊長類からの単離物のヌクレオチド配列のほとんどが含まれている。
第3表記載のヌクレオチド配列はHIV1−単離物に対して最良の場合62%相同性を示す。HIV2単離物に対して第5表記載のDNAは50%相同である。
第3表のヌクレオチド配列から導かれるアミノ酸配列の相同配列をSWISSPROTタンパク質データバンク(リリース22、1992年6月)においてGCG−コンピュータープログラムを用いて調べた。このデータバンクには1992年6月までに知られた、ヒト起源の免疫不全ウイルスのおよび霊長類からの単離物のタンパク質配列のほとんどが含まれている。
それに対し、HIV1のgp41−アミノ酸配列をSWISSRPOT−データバンクに存在するHIV1 gp−41配列と比較すると期待されたとおり最良の場合ほぼ100%の相同性、そして最悪の場合に78%の相同性が得られる。
第3表記載の配列領域とHIV1およびHIV2の対応する断片との間にこのような明らかな構造的相違があることから、単離物MVP−5180/91の場合は、HIV1およびHIV2とは明らかに構造的に区別されるHIV変異株が関係していると思われる。おそらくMVP−5180/91はHIV1およびHIV2とは区別される特別なHIVウイルス群に帰属すると思われる。
MVP−5180/91外被タンパク質の相当するアミノ酸領域(第4表)およびこの単離物のgp41全体は、HIV感染患者の抗血清が商業的に入手される抗体スクリーニングテストにおいてほんの弱くしかあるいはそもそも全く反応しない場合に特に血清診断的に重要であり得る。これらの場合には、MVP−5180/91と密接な関係にあるウイルスによる感染が存在し得る。
従って本発明の主題は、組換えまたは合成により調製することかでき、そして前述の配列または、少くとも6個の連続するアミノ酸、好ましくは9個そして特に好ましくは12個の連続するアミノ酸を示す部分配列を示すペプチドである。
HIV単離物MVP5180の全ゲノムのクローニング
a) ゲノムライブラリーの調製
MVP5180感染HUT78細胞由来のゲノムDNAを前述の如く単離した。
300μgのこのDNAを770μlの容量として0.24Uの制限酵素Sau3Aと共に45分間インキュベートした。それによって部分的にのみ切断されたDNAを次いで0.7%アガロース(低融点アガロース、Nusieve)でサイズ分画し、そして10kbと21kbの間の断片を切り取った。そのアガロースを70℃で10分間溶融し、そして等容の緩衝液(1×TBE、0.2M NaCl)と混合した。次いでフェノールで2回、そしてクロロホルムで1回抽出した後、1/10容の3M酢酸ナトリウム溶液(pH5.9)および2.5容のエタノールの添加により−70℃で10分間DNAを沈殿させた。沈殿したDNAを遠心分離し、乾燥しそして1μg/μl濃度で水に溶解した。
標識にはBoehringer Mannheim社の“ラムダ・プライムド・DNA・ラベリング・キット(Random Primed DNA Labeling Kit)”(No.:713 023)を適用した。実施例3に記載の如くプライマー sk68およびenvbを用いて得られたPCR生成物を標識した。1μgのこのDNAを2×5分間煮沸した後氷水中で冷却することにより変性した。標識のために50mCi〔α−32P〕−dCTP(NEN,No.:NEX−053H)を添加した。その他の添加物質を製造元の指示に従ってピペットで添加した。37℃で30分間インキュベーションした後、放射性標識済みのDNAを沈殿させた。
200μlの30℃で一夜培養した培養液(10mM MgSO4のほか0.2%マルトースを含有するLB培地中のSRB(P2)株〔Stratagene, No.:247611〕)に、100μlのSM緩衝液(5.8gのNaCl、2gのMgSO4、50mlの1M Tris、pH7.5、および5mlの2%ゼラチン溶液を1リットルのH2Oに溶解)中の20000pfu(プラーク形成単位)のライブラリーを添加し、ファージを20分間37℃で細菌に吸着させ、7.5mlの55℃に冷却したTop−アガロースと混合しそして予め加温した直径14cmのLb−寒天プレートで分別した。約8時間後にプラークが全面に及んだ。そこでプレートにニトロセルロースフィルターを数分間重ねそして非対称的マーキングを設けた。注意深く取り除いた後そのフィルターを2分間変性し(0.5M NaOH、1.5M NaCl)そして次に5分間中和した(0.5M Tris、 pH8、1.5M NaCl)。そのフィルターを次に80℃で60分間ベーキング後プローブとハイブリダイズさせることができた。
あるシグナルを帰属させることができたプラークをSM緩衝液で溶出後さらなる希釈段階で分離した。
2×106プラークのスクリーニング後、下記のクローンを確認することができた。
SM緩衝液中のファージ溶出液10μlを用いて宿主株SRB(P2)の一夜培養物を、培養物の最初の濃密な増殖の後、約6〜8時間後に溶解(Lyse)が行われるように感染させた。その溶解培養物から、9000gで2回10分間遠心分離することにより細胞残渣を分離した。次にファージを遠心分離(35000g、1時間)によりペレット化し、700μlの10mM MgSO4にとり、そしてタンパク質中間相(インターフェーズ)がもはやみられなくなるまでフェノール処理した。そこでファージDNAを沈殿させ、制限酵素EcoRIで切断し、そしてそれによって得られたEcoRI断片をベクターBluescript KS-(Strategene,No.:212208)にサブクローン化した。全部で4つのクローンが得られた:
DNAの配列決定は実施例4に記載の如く行った。全ゲノムからその鎖のほかに対向鎖も配列決定した。すべてのEcoRI切断部位の場合に、クローンのファージDNAを鋳型として用いたPCRによって、サブクローン移行時点で各々単一のEcoRI切断部位が関係していることが確認された。
MvP5180/91の全配列の他のHIV1単離物からの区別
以下の配列比較の基礎は、遺伝子バンク・リリース75(1993年2月)、EMBL33(1992年12月)およびSwissprot 24(1993年1月)といったデータバンクであった。相同性比較はGCGソフトウエア(バージョン7.2、1992年10月、Genetics-Computer Group. ウイスコンシン)を用いて行われた。
HIV5180単離物のgag遺伝子のPCR増幅、クローニングおよび配列決定の概要説明
ウイルス増幅の過程で生じる自然突然変異を明示するためにウイルスゲノムの一部をPCR法によりクローン化しそしてそのように得られたDNA配列を第7表による配列と比較した。
gag配列をMvP5180ゲノムの左端のLTR(“ロング・ターミナル・リピート”、LTR1プライマー)からpol(ポリメラーゼ遺伝子、pol 13.5;プライマー)まで内部をオーバーラップさせながらクローン化した。クローニング手法は図4に概略図で示されている。
それらPCR反応は、HIV−1コンセンサス配列から導かれた配列を有する下記のDNAプライマーを用いて行われた。配列決定はジデオキシ連鎖中断法を用いて行われた。
MvP5180gag遺伝子をコードする配列は、ヌクレオチド817(ATG開始コドンのA)からヌクレオチド2300(最後のコドンのA)まで延びる。
gag3.5: 5′-AAT GAG GAA GCU GCA GAU TGG GA -3′ (U=A/T)
gag3.5i: 5′-TCC CAU TCT GCU GCT TCC TCA TT -3′(U=A/T)
gag5: 5′-CCA AGG GGA AGT GAC ATA GCA GGA AC -3′
gag959: 5′-CGT TGT TCA GAA TTC AAA CCC -3′
gag11i: 5′-TCC CTA AAA AAT TAG CCT GTC -3′
pol3.5i: 5′ -AAA CCT CCA ATT CCC CCT A -3′
更に、PCR法により調査されたタンパク質gagのアミノ酸配列を第7表から導かれる相当するタンパク質のアミノ酸配列と対比した。その際約2.2%のアミノ酸相違が認められた。その比較を図8に示すが、図において下列は各々PCR法により得られた配列から導かれたアミノ酸配列を表わす。
V3−ループ/V3−シュラウフェ(Schlaufe)
このシュラウフェはHIVにおける主に中和性の領域であり、そしてその領域の免疫特異性を示したものが図9に要約してある。これはPeter Nara(1990)の研究によるエイズからのコピーである。次にV3−シュラウフェをアミノ酸レベルで記述し、そしてIIIBウイルス(現在のLAI)および最初のHIV−2単離物(ROD)と比較した。シスチン架橋の個々のアミノ酸は保存されている。HIV−1のクローンはGPGRまたはGPGQであり、そしてHIV−2のクローンはGHVFであるのに対し、MvP5180/91のクローンはアミノ酸GPMRから形成されている。メチオニンを用いたモチーフはこれまで報告されてなく、MvP5180/91の個性を強めている。
MvP5180(クローン化):
CIREGIAEVQDIYTGPMRWRSMTLKRSNNTSPRSRVAYC
CIREGIAEVQDLHTGPLRWRSMTLKKSSNSHTQPRSKVAYC
本発明によるウイルスMvP5180またはそれにより導かれる抗原を用いれば、通常のHIV−1+2スクリーニングテストを用いたのでは把握できないような血清もHIV−1として陽性に検出できることを示すために、カメルーンからの患者の様々な血清を検査した。
カメルーンからの47の抗−HIV−1陽性血清を用いたもう一つの研究において二つの血清が特に目立った。そのうちの一つ(93−1000)はわずかに症候を示す患者、もう一つ(93−1001)はエイズ病患者に由来する。次の第13表において、両EIAテストの吸光度値を相互に比較する:
Claims (6)
- European Collection of Animal Cell Cultures(ECACC)にNo.V 920 92 318の番号で寄託されたMVP−5180/91なる呼称を有するHIVおよびその変異株であるHIVグループの免疫不全ウイルスであって、前記変異株が第1表または第3表に示すヌクレオチド配列と一致するまたは当該配列と相同性のある配列を有するものであり、前記相同性がヌクレオチド配列に基づき66%以上である免疫不全ウイルスのRNAに対し相補的であるDNA。
- 請求項1記載のDNAを含むことを特徴とする組換えDNA。
- 第1表または第3表に記載のアミノ酸配列をコードするDNA。
- 請求項1〜3のいずれかに記載のDNAを用いるペプチドの製造方法。
- 請求項1〜3のいずれかに記載のDNAを用いる免疫不全の原因となるレトロウイルスの検出方法。
- 請求項1〜3のいずれかに記載のDNAを用いる接種素の製造方法。
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