JP2004070371A - 走査型光学顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】多重染色時の各蛍光波長に対して、共焦点効果を落とすことなく、かつ蛍光を損失することなく光検出器に導くことができる走査型光学顕微鏡を提供すること。
【解決手段】レーザー光で標本を走査する走査型光学顕微鏡において、標本からの蛍光を分光するスペクトル分解手段（１１ａ，１１ｂ）と、前記スペクトル分解手段で分光された蛍光を複数の波長域に分割する波長域分割手段（１２ａ〜１２ｃ）と、前記複数の波長域に分割された各光路にそれぞれ設けられ標本からの蛍光を結像する複数の結像光学系（１４ａ〜１４ｄ）と、前記各光路にそれぞれ設けられ前記結像光学系の焦点位置に配置された複数の共焦点絞り（１５ａ〜１５ｄ）と、前記各光路にそれぞれ設けられ前記共焦点絞りを通過した標本からの蛍光を検出する複数の光検出器（１６ａ〜１６ｄ）と、を具備。
【選択図】　　　　　図１

Description

　本発明は、標本からの蛍光を複数の波長域に分光し、各波長域の蛍光を検出する走査型光学顕微鏡に関する。

　特開平８−４３７３９号公報には、レーザー光を対物レンズにより集光して標本上にスポット光を結ばせ、光走査手段によりそのスポット光を標本上で２次元に走査し、標本からの蛍光をグレーティングにより分光し、分光された光の幅を可変可能なスリットを通して検出する共焦点走査型レーザー顕微鏡が開示されている。

　図６は、上記共焦点走査型レーザー顕微鏡の構成を示す図である。図６に示すように、レーザー光源１０１から出射されたレーザー光は、ビームエクスパンダ１０２、ダイクロイックミラー１０４、Ｘ−Ｙ走査光学系１０５、瞳投影レンズ１０６、顕微鏡１０７を順次介して標本１０９に導かれる。また測光分離手段は、標本１０９からの蛍光を分離するダイクロイックミラー１０４、共焦点光学系１０８、グレーティング１１９、光の幅を変更可能なスリット１１０，１１１，１１２、集光レンズ１１６，１１７，１１８、光検出器１１３，１１４，１１５からなる。

　このような構成において、標本１０９からの蛍光は、顕微鏡１０７、瞳投影レンズ１０６、Ｘ−Ｙ走査光学系１０５、ダイクロイックミラー１０４、共焦点光学系１０８を順次通過した後、グレーティング１１９に至り、その波長に合わせ分光される。分光された各蛍光には、それぞれスリット１１０，１１１，１１２、及び光検出器１１３，１１４，１１５が対応しており、各スリット１１０，１１１，１１２の幅を変化させることで、検出する各蛍光波長範囲を選択することができる。

　また特開平９−５０２２６９号公報には、蛍光光束をプリズム等のスペクトル分解手段により分光し、一方では第一スペクトル範囲を絞り込み、他方では絞りを通過しないスペクトル範囲の少なくとも一部分を反射して第二スペクトル範囲をなす二つの光路を構成し、それぞれの光路に対して光検出器を設けた共焦点走査型レーザー顕微鏡が開示されている。

　図７は、上記共焦点走査型レーザー顕微鏡の構成を示す図である。図７に示すように、レーザー光源２０２から出射されたレーザー光束２０３は、方向変更ミラー２０４、レーザーラインフィルタ２０５、レンズ２０６、絞り２０７を介してダイクロイックミラー２０８で反射され、レンズ２０９、Ｘ−Ｙ走査光学系２１０、瞳投影レンズ２１１、対物レンズ２１２を経て標本２１３に達する。標本２１３からの反射光及び蛍光からなる光束２１４は、対物レンズ２１２、瞳投影レンズ２１１、Ｘ−Ｙ走査光学系２１０、レンズ２０９を経てダイクロイックミラー２０８に戻る。そして、光束２１４はダイクロイックミラー２０８を透過し、共焦点絞り２１５を介して分光器２１６に入る。

　図８は、分光器２１６の構成を示す図である。選択装置２２５は、光束２１４を分解するスペクトル分解手段２２７と、一方では第一スペクトル範囲２２９を絞り込み他方では絞りを通過しないスペクトル範囲の少なくとも一部分２３０を反射する手段２２８とを有している。光検出装置２２６は、絞り込まれた第一スペクトル範囲２２９の光路に配置された第一光検出器２３１と、反射されたスペクトル範囲の光路に設置された第二光検出器２３２とを有している。さらに選択装置２２５は、反射されたスペクトル範囲２３０の光路に設置され、第二スペクトル範囲２３４を絞り込む手段２３３を有する。第二光検出器２３２は、絞り込まれた第二スペクトル範囲２３４の光路に設置されている。

　一方、近年蛍光観察においては、単染色のみならず、多重染色が多用されている。もとより、蛍光染色は細胞、組織内の特定対象を視認可能にするために行なわれる。このため多重染色観察では、各染色部位が明確な色の差、即ち蛍光波長の違いとして検出されなければならない。しかも、蛍光波長の部分的な重なり（クロスオーバー部分）を効率良く除去して検出する必要がある。さらに蛍光観察においては、高いコントラストと高い光学分解能が要求される。走査型共焦点レーザー顕微鏡はこれらの要求を満たすものであり、近年、生物分野の研究目的で広く利用されるようになっている。

　上記特開平８−４３７３９号公報及び特開平９−５０２２６９号公報では、いずれも走査型共焦点レーザー顕微鏡をベースに、多重染色の蛍光分離手段として、プリズムや回折格子のようなスペクトル分解手段と、蛍光波長域を制限するためのスリットで構成することにより、共焦点顕微鏡のもつ高コントラストと高分解能を実現しつつ、多重染色標本からの蛍光をクロスオーバーさせることなく、高い効率で検出することを可能にしている。
特許文献１は、特開平８−４３７３９号公報である。 特許文献２は、特開平９−５０２２６９号公報である。

　一般的に標本からの蛍光は、光検出器にフォトマルチプライヤーを必要とするほど微弱である。また、蛍光標本は励起光（レーザー光）を強く当てるほど退色が激しくなるので、通常観察者は、標本の退色と得られる画像ノイズのバランスを見て、許容できる範囲内で可能な限り励起光量を下げようとする。したがってこの種の装置では、蛍光の損失を極力抑えることが極めて重要なポイントになる。

　ここで例として、二つの蛍光色素（ＤＡＰＩ，ＣＹ５）で標識された標本をとりあげる。ＤＡＰＩはＵＶ域（３４０〜３６５ｎｍ）に吸収波長域を有し、放出される蛍光波長は、そのピークがほぼ４５０ｎｍに現れる。一方、ＣＹ５は赤色域（６３０〜６５０ｎｍ）に吸収波長域を有し、蛍光波長は、そのピークがほぼ６７０ｎｍに現れる。

　以下、これらの蛍光が結像位置で形成されるスポットについて、図７を基に述べる。対物レンズ２１２で標本２１３上にレーザースポットを形成し、標本から放射される蛍光は、対物レンズ２１２、瞳投影レンズ２１１、Ｘ−Ｙ走査光学系２１０を経て、レンズ２０９に入射する。さらに光束２１４はダイクロイックミラー２０８を透過し、共焦点絞り２１５が配置されている位置、すなわちレンズ２０９による結像位置にそのスポットを結ぶ。なお、そのスポット径（回折径）は次式で表わされる。

　φ＝１．２２×λ／ＮＡここでＮＡはレンズ２０９を出射する出射ＮＡであり、λは波長である。この式から、ＤＡＰＩ（蛍光波長４５０ｎｍ）とＣＹ５（蛍光波長６７０ｎｍ）のスポット径を比べると、ＣＹ５の方が約１．５倍ほど大きい。

　したがって上述した従来の技術では、共焦点効果を確保するためにＤＡＰＩのスポット径に合わせて共焦点絞り２１５の径を設定することになる。これはＤＡＰＩに対しては最適に設定されていることになるが、ＣＹ５に対しては、不必要に共焦点絞り２１５により絞られてしまい、貴重な蛍光を失ってしまう。逆に、共焦点絞り２１５の径をＣＹ５に合わせると、ＤＡＰＩは十分な共焦点効果が得られないという欠点がある。

　また、図８に示した特開平９−５０２２６９号公報の構成では、光束２１４がスペクトル分解手段２２７でスペクトル分解され、一方では第一スペクトル範囲２２９を絞り込み、他方では絞りを通過しないスペクトル範囲の少なくとも一部分２３０を反射する手段２２８（可変スリット）で、各蛍光の波長域に分割している。しかし、スペクトル分解手段として図８に示すようなプリズムを用いている場合は、光束２１４の光束径が大きいと、十分な精度で各検出光路に分割されないという欠点がある。

　本発明の第一の目的は、多重染色時の各蛍光波長に対して、共焦点効果を落とすことなく、かつ蛍光を損失することなく光検出器に導くことができる走査型光学顕微鏡を提供することにある。本発明の第二の目的は、多重染色時の各蛍光波長に対して、精度良く各検出光路に分割することができる走査型光学顕微鏡を提供することにある。

　上記課題を解決し目的を達成するために、本発明の走査型光学顕微鏡は以下の如く構成されている。（１）本発明の走査型光学顕微鏡は、レーザー光源からのレーザー光で標本を走査する走査型光学顕微鏡において、前記標本からの蛍光を分光するスペクトル分解手段と、前記スペクトル分解手段で分光された蛍光を複数の波長域に分割する波長域分割手段と、前記複数の波長域に分割された各光路にそれぞれ設けられ、前記標本からの蛍光を結像する複数の結像光学系と、前記各光路にそれぞれ設けられ、前記結像光学系の焦点位置に配置された複数の共焦点絞りと、前記各光路にそれぞれ設けられ、前記共焦点絞りを通過した前記標本からの蛍光を検出する複数の光検出器と、から構成されている。

　（２）本発明の走査型光学顕微鏡は上記（１）に記載の顕微鏡であり、かつ前記スペクトル分解手段は、スペクトル分解された光束を平行に出射する光学手段を有する。

　（３）本発明の走査型光学顕微鏡は上記（１）または（２）に記載の顕微鏡であり、かつ前記スペクトル分解手段はプリズムであり、前記標本からの蛍光を分離するためのビームスプリッタと前記スペクトル分解手段との間に、光束を縮小する縮小光学系を設けている。

　上記手段を講じた結果、それぞれ以下のような作用を奏する。（１）本発明の走査型光学顕微鏡によれば、多重染色された標本からの各蛍光は、各蛍光が有する波長域に光路を分割されるが、各光路にはそれぞれ前記標本からの蛍光を結像する結像光学系と共焦点絞りが設けられているので、各共焦点絞りを各波長域に最適な絞り径に設定することができる。これにより、蛍光を損失することなく完全な共焦点効果が得られる。

　（２）本発明の走査型光学顕微鏡によれば、スペクトル分解され、各検出光路に波長分解された光束が平行に出射するので、これらの光束は全て共焦点位置に集光する。したがって、この位置に共焦点絞りを配置するだけで上記（１）の走査型光学顕微鏡を構成できる。また各検出光路において、光束を分離した後の光路に共焦点絞り及び光検出器を配置するだけで、独立した共焦点光学系を設けることができるので、装置を簡易かつ安価に構成できる。

　（３）本発明の走査型光学顕微鏡によれば、前記スペクトル分解手段はプリズムであり、標本からの各蛍光の光束が前記プリズムに入射する前に縮小されるので、蛍光を精度良く各検出光路に分割することができる。

　本発明によれば、多重染色時の各蛍光波長に対して、共焦点効果を落とすことなく、かつ蛍光を損失することなく光検出器に導くことができる走査型光学顕微鏡を提供できる。また本発明によれば、多重染色時の各蛍光波長に対して、精度良く各検出光路に分割することができる走査型光学顕微鏡を提供できる。

　（第１の実施の形態）図１及び図２は、本発明の第１の実施の形態に係る走査型光学顕微鏡の構成を示す図である。図１に示すように、レーザー光源１は、アルゴン、クリプトン混合ガスレーザーの光源である。このレーザー光源１から出射されたレーザー光は、ビームエクスパンダ２、波長選択フィルタ３、ビームスプリッタ４、Ｘ−Ｙ走査光学系５、瞳投影レンズ６、結像レンズ７、対物レンズ８を順次介して、標本９に導かれる。

　レーザー光源１により、主に３５１ｎｍ，４８８ｎｍのアルゴン線、及び５６８ｎｍ，６４７ｎｍのクリプトン線が放射される。ビームエクスパンダ２はレーザー光の光径が対物レンズ８の瞳径をほぼ満たすように設定されている。またビームスプリッタ４は、到達した光の２０％程度を反射し、８０％程度を透過する。

　波長選択フィルタ３は、３５１ｎｍ，４８８ｎｍ，５６８ｎｍ，６４７ｎｍの波長を選択的に透過する。標本９は、色素ＤＡＰＩ，ＦＩＴＣ，Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ，ＣＹ５で四重染色されており、ＤＡＰＩはアルゴン線３５１ｎｍで、ＦＩＴＣはアルゴン線４８８ｎｍで、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄはクリプトン線５６８ｎｍで、ＣＹ５はクリプトン線６４７ｎｍで、それぞれ励起される。

　上記励起によって、ＤＡＰＩはほぼ４５０ｎｍにピークをもつ蛍光を放出する。同様にＦＩＴＣは５３０ｎｍに、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄは６１０ｎｍに、ＣＹ５は６７０ｎｍにピークをもつ蛍光を放出する。これらの蛍光は対物レンズ８、結像レンズ７、瞳投影レンズ６、Ｘ−Ｙ走査光学系５を経て、ビームスプリッタ４を通過する。

　ビームスプリッタ４を通過した光束２０は、光束を縮小する縮小光学系１０を通過して縮小され、光束２１が形成される。光束２１はプリズム１１ａを通過してそのスペクトルが分解され、プリズム１１ａと光学的に同一のプリズム１１ｂによりスペクトルが分解された光束が平行光束２２として形成され、三角ミラー１２ａに入射する。三角ミラー１２ａは入射軸に対して垂直な方向に移動可能に構成されており、ここでは約５７０ｎｍを境に左右の光路に蛍光光束が分離されるように設定されている。この結果、ＤＡＰＩとＦＩＴＣの蛍光は光束２３ａとして、またＴｅｘａｓ ＲｅｄとＣＹ５の蛍光は光束２３ｂとして分離される。

　光束２３ａは、さらに三角ミラー１２ｂに入射する。三角ミラー１２ｂも入射軸に対して垂直な方向に移動可能に構成されており、ここでは約４９０ｎｍを境に左右の光路に蛍光光束が分離されるように設定されている。この結果、ＤＡＰＩの蛍光は光束２４ｂとして、またＦＩＴＣの蛍光は光束２４ａとして分離される。

　もう一方の光束２３ｂは、同様に三角ミラー１２ｃに入射する。三角ミラー１２ｃも入射軸に対して垂直な方向に移動可能に構成されており、ここでは約６５０ｎｍを境に左右の光路に光束が分離されるように設定されている。この結果、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄの蛍光は光束２４ｃとして、またＣＹ５の蛍光は光束２４ｄとして分離される。

　各光束２４ａ，２４ｂ，２４ｃ，２４ｄは、それぞれ幅が可変であり光軸に垂直な方向に移動可能なスリット１３ａ，１３ｂ，１３ｃ，１３ｄにより、標本からの励起光の戻り光と、蛍光波長の部分的な重なり部分（蛍光のクロスオーバー部分）が制限される。スリット１３ａ，１３ｂ，１３ｃ，１３ｄを通過した各蛍光光束はそれぞれ共焦点レンズ１４ａ，１４ｂ，１４ｃ，１４ｄに入射する。各光束２４ａ，２４ｂ，２４ｃ，２４ｄは平行光束で出射しているので、その焦点位置に配置された共焦点絞り１５ａ，１５ｂ，１５ｃ，１５ｄの位置に集光し、これら共焦点絞りを通過して、フォトマルチプライヤー１６ａ，１６ｂ，１６ｃ，１６ｄで検出される。

　ここで、共焦点絞りはそれぞれ下式で計算された絞り径に設定されている。φ＝１．２２×λ／ＮＡここで、ＮＡは共焦点レンズ１４ａ，１４ｂ，１４ｃ，１４ｄを出射する出射ＮＡであり、λは蛍光波長である。

　したがって、ＤＡＰＩ，ＦＩＴＣ，Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ，ＣＹ５の各蛍光に対して、蛍光を損失することなく、最高の共焦点効果を得ることができる。また、フォトマルチプライヤー１６ａ，１６ｂ，１６ｃ，１６ｄは、サイドオン型であって、その軸心はプリズム１１ａによりスペクトル分解される面内に略一致するように構成されている。サイドオン型のフォトマルチプライヤーは、一般的に高感度でありながらヘッドオン型のフォトマルチプライヤーより安価であり、走査型の共焦点レーザー顕微鏡によく用いられる。しかしながら、サイドオン型のフォトマルチプライヤーは軸方向の感度分布に大きな差は見られないが、軸方向と垂直な方向には感度に大きな差があり、この点がヘッドオン型のフォトマルチプライヤーより劣る点である。なお参考として、図３にサイドオン型のフォトマルチプライヤーの感度分布のデータを示す。

　本実施の形態では、サイドオン型フォトマルチプライヤーの軸心を、プリズム１１ａによりスペクトル分解される面内に略一致するように構成しているので、サイドオン型のフォトマルチプライヤーの感度分布がほとんど問題にならない。

　以上、標本９が四重染色標本である場合に各蛍光を各検出光路に導く方法について示したが、標本９が単染色であっても何ら問題なく対応できる。また、標本９がＦＩＴＣで単染色されている場合、他の蛍光とのクロスオーバーは考慮しなくてもよいので、得られる蛍光を全て一つの光検出器で導けばよい。

　この場合、図２に示すように三角ミラー１２ａ，１２ｂの位置を調整してＦＩＴＣを完全に取り込めるように設定する。なお、図２において図１と同一な部分には同一符号を付してある。また、図２において、縮小光学系１０以下の構成は図１と同様であるので図示を省略する。

　例えば、６００ｎｍ以下の光を完全に取り込めるようにすれば、完全にＦＩＴＣの蛍光を取り込めるので、三角ミラー１２ａ，１２ｂの位置を６００ｎｍ以下の光を取り込めるように設定する。また、スリット１３ｂは４８８ｎｍの励起光をカットし、６００ｎｍ以下の光を取り込めるように設定すればよい。また、二重染色、三重染色の場合も同様に簡単に対応できる。

　なお第１の実施の形態では、スペクトル分解手段として光学的に同一な一対のプリズム１１ａ，１１ｂを使用しているが、光学的に同一な一対の回折格子、あるいはホログラムを使用してもよい。また、スペクトル分解された光束が平行光束として出射すればよいので、プリズムと回折光子のように異なる光学素子を組合せてもよい。

　上述した第１の実施の形態によれば、三角ミラーにより蛍光を複数の波長域に分割できるので、蛍光検出光路数を自由に設定できる。この例では４チャンネル構成として示したが、目的に応じて、２チャンネル構成、３チャンネル構成、あるいは５チャンネル以上の構成に簡単に実施できる。また、サイドオン型フォトマルチプライヤーの軸心を、プリズム１１ａによりスペクトル分解される面内に略一致するように構成しているので、感度分布がほとんど問題にならない。このように安価なサイドオン型フォトマルチプライヤーを使用できるので、装置を安価に構成することができる。

　（第２の実施の形態）図４及び図５は、本発明の第２の実施の形態に係る走査型光学顕微鏡の構成を示す図である。図４，図５において同一な部分には同一符号を付してある。また、図４，図５において、縮小光学系１０以下の構成は図１と同様であるので図示を省略する。

　図１に示したレーザー光源１は、アルゴン、クリプトン混合ガスレーザーの光源である。このレーザー光源１から出射されたレーザー光は、第１の実施の形態と同様に、ビームエクスパンダ２、波長選択フィルタ３、ビームスプリッタ４、Ｘ−Ｙ走査光学系５、瞳投影レンズ６、結像レンズ７、対物レンズ８を順次介して、標本９に導かれる。

　レーザー光源１により、主に４８８ｎｍのアルゴン線、及び５６８ｎｍ、６４７ｎｍのクリプトン線が放射される。ビームエクスパンダ２はレーザー光の光径が対物レンズ８の瞳径をほぼ満たすように設定されている。またビームスプリッタ４は、到達した光の２０％程度を反射し、８０％程度を透過する。

　波長選択フィルタ３は、４８８ｎｍ，５６８ｎｍ，６４７ｎｍの波長を選択的に透過する。標本９は、色素ＦＩＴＣ，Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ，ＣＹ５で三重染色されており、ＦＩＴＣはアルゴン線４８８ｎｍで、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄはクリプトン線５６８ｎｍで、ＣＹ５はクリプトン線６４７ｎｍで、それぞれ励起される。

　上記励起によって、ＦＩＴＣはほぼ５３０ｎｍにピークをもつ蛍光を放出する。同様にＴｅｘａｓ Ｒｅｄは６１０ｎｍに、ＣＹ５は６７０ｎｍにピークをもつ蛍光を放出する。これらの蛍光は対物レンズ８、結像レンズ７、瞳投影レンズ６、Ｘ−Ｙ走査光学系５を経て、ビームスプリッタ４を透過する。

　ビームスプリッタ４を透過した光束２０は、光束を縮小する縮小光学系１０を透過して縮小され、光束２１が形成される。光束２１はプリズム１１を透過してそのスペクトルが分解され、レンズ３０に入射する。レンズ３０はその焦点位置がプリズム１１への光束の入射点１１ｘに一致するように配置されている。したがって、レンズ３０から射出するスペクトル分解された光束はスペクトル分解された面内においては平行光束となって射出される。このスペクトル分解された光束はミラー３１ａ，３１ｂ，３１ｃにより各検出光路に分離される。なおミラー３１ｂと３１ｃは入射光軸に対し４５°方向に移動可能である。

　ミラー３１ｃの端面３１ｃｘは、ほぼ６４７ｎｍの励起光が当たる位置に設定され、ミラー３１ｂの端面３１ｂｘは、ほぼ５６８ｎｍの励起光が当たる位置に設定される。このような構成により、ＦＩＴＣの蛍光は光束３３ａとして、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄの蛍光は光束３３ｂとして、ＣＹ５の蛍光は光束３３ｃとして分離される。なおミラー３１ａ，３１ｂ，３１ｃの位置はレンズ３０の焦点位置から少しずれているが、縮小光学系１０により光束系が縮小されているので、各検出光路への分離を十分に精度良く行なうことができる。

　各光束３３ａ，３３ｂ，３３ｃは、それぞれ幅が可変であり光軸に垂直な方向に移動可能なスリット１３ａ，１３ｂ，１３ｃにより、標本からの励起光の戻り光と、蛍光波長の部分的な重なり部分（蛍光のクロスオーバー部分）が制限される。スリット１３ａ，１３ｂ，１３ｃは、レンズ３０の焦点位置に置かれている。したがって、スペクトル分解された各光束はスリット位置でスポットを結ぶので、スリットにより極めて高精度に波長域を制限することができる。なおスリット１３ａ，１３ｂ，１３ｃとミラー３１ａ，３１ｂ，３１ｃの位置は、それらの中間的な位置にレンズ３０の焦点位置がくるように設定してもよい。

　スリットを通過した各蛍光光束はそれぞれレンズ３４ａ，３４ｂ，３４ｃ及びプリズム３５ａ，３５ｂ，３５ｃを透過する。レンズ３４ａ，３４ｂ，３４ｃ及びプリズム３５ａ，３５ｂ，３５ｃは、それぞれレンズ３０、プリズム１１と同一のものである。これにより、スペクトル分解された光束は各光路で合成され、それぞれ光束４０ａ，４０ｂ，４０ｃとなって共焦点レンズ１４ａ，１４ｂ，１４ｃに入射し、その焦点位置に配置された共焦点絞り１５ａ，１５ｂ，１５ｃを通過し、紙面に対して垂直に軸がなすように配置されたフォトマルチプライヤー１６ａ，１６ｂ，１６ｃで検出される。

　光束４０ａ，４０ｂ，４０ｃはスペクトルが完全に合成されているので、第１の実施の形態とは異なり、共焦点絞り１５ａ，１５ｂ，１５ｃを通過した後にスペクトル分解された方向へ広がることはない。したがって、フォトマルチプライヤー１６ａ，１６ｂ，１６ｃを紙面に対して垂直に軸がなすように配置しても何ら問題はない。

　ここで、共焦点絞りはそれぞれ下式で計算された絞り径に設定されている。φ＝１．２２λ／ＮＡここで、ＮＡは共焦点レンズ１４ａ，１４ｂ，１４ｃを出射する出射ＮＡであり、λは蛍光波長である。

　したがって、ＦＩＴＣ，Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ，ＣＹ５の各蛍光に対して、蛍光を損失することなく、最高の共焦点効果を得ることができる。なお、この例では３チャンネル構成で示したが、３チャンネルに限らず目的に応じてチャンネル数を設定できる。

　以上、標本９が三重染色標本である場合に各蛍光を各検出光路に導く方法について示したが、標本９が単染色であっても何ら問題なく対応できる。標本９がＦＩＴＣで単染色されている場合、他の蛍光とのクロスオーバーは考慮しなくてもよいので、得られる蛍光を全て一つの光検出器に導けばよい。

　この場合、図５に示すようにミラー３１ｃの位置を調整してＦＩＴＣを完全に取り込めるように設定する。例えば６００ｎｍ以下の光を完全に取り込めるようにすれば、完全にＦＩＴＣの蛍光を取り込めるので、ミラー３１ｃの位置を６００ｎｍ以下の光を取り込めるように設定する。また、スリット１３ｃは４８８ｎｍの励起光をカットし、６００ｎｍ以下の光を取り込めるように設定すればよい。また、二重染色、三重染色の場合も同様に簡単に対応できる。

　なお第２の実施の形態では、スペクトル分解手段としてプリズムを使用しているが、回折格子、あるいはホログラムを使用してもよい。上述した第２の実施の形態によれば、スペクトル分解された光束を結像レンズ３０によりスポットとして形成しているので、この位置に置かれたスリットにより、極めて精度良く蛍光の波長域を制限することができる。また、光束２１のプリズム１１への入射位置１１ｘにレンズ３０の焦点が一致するように構成しているので、レンズ３０を出射するスペクトル分解された光束はスペクトル分離された面内においては平行になる。したがって、レンズ３０、プリズム１１と同一のものをレンズ３４ａ，３４ｂ，３４ｃ、プリズム３５ａ，３５ｂ，３５ｃとして使用できるので、装置を簡易にかつ安価に構成できる。本発明は上記各実施の形態のみに限定されず、要旨を変更しない範囲で適時変形して実施できる。

本発明の第１の実施の形態に係る走査型光学顕微鏡の構成を示す図。 本発明の第１の実施の形態に係る走査型光学顕微鏡の構成を示す図。 本発明の第１の実施の形態に係るサイドオン型のフォトマルチプライヤーの感度分布のデータを示す図。 本発明の第２の実施の形態に係る走査型光学顕微鏡の構成を示す図。 本発明の第２の実施の形態に係る走査型光学顕微鏡の構成を示す図。 従来例に係る共焦点走査型レーザー顕微鏡の構成を示す図。 従来例に係る共焦点走査型レーザー顕微鏡の構成を示す図。 従来例に係る分光器の構成を示す図。

符号の説明

　１　レーザー光源
　２　ビームエクスパンダ
　３　波長選択フィルタ
　４　ビームスプリッタ
　５　Ｘ−Ｙ走査光学系
　６　瞳投影レンズ
　７　結像レンズ
　８　対物レンズ
　９　標本
　１０　縮小光学系
　１１，１１ａ，１１ｂ　プリズム
　１２ａ，１２ｂ，１２ｃ　三角ミラー
　１３ａ，１３ｂ，１３ｃ，１３ｄ　スリット
　１４ａ，１４ｂ，１４ｃ，１４ｄ　共焦点レンズ
　１５ａ，１５ｂ，１５ｃ，１５ｄ　共焦点絞り
　１６ａ，１６ｂ，１６ｃ，１６ｄ　光検出器
　２０　レーザー光源
　２１　光束
　３０　レンズ
　３１ａ，３１ｂ，３１ｃ　ミラー
　３３ａ，３３ｂ，３３ｃ　光束
　３４ａ，３４ｂ，３４ｃ　レンズ
　３５ａ，３５ｂ，３５ｃ　プリズム
　４０ａ，４０ｂ，４０ｃ　光束

　上記課題を解決し目的を達成するために、本発明の走査型光学顕微鏡は以下の如く構成されている。
　（１）本発明の走査型光学顕微鏡は、レーザー光源からのレーザー光で標本を走査する走査型光学顕微鏡において、前記標本からの蛍光を分光するスペクトル分解手段と、前記スペクトル分解手段で分光された蛍光を複数の波長域に分割する波長域分割手段と、前記複数の波長域に分割された各光路にそれぞれ設けられ、前記標本からの蛍光を検出する複数のサイドオン型フォトマルチプライヤと、を具備し、前記サイドオン型フォトマルチプライヤの軸心方向を、前記スペクトル分解手段によりスペクトル分解される面内に略一致するようにした。

　（２）本発明の走査型光学顕微鏡は上記（１）に記載の顕微鏡であり、かつ前記複数の波長域に分割された各光路における前記サイドオン型フォトマルチプライヤの手前に、前記標本からの蛍光を結像する結像光学系と、前記結像光学系の焦点位置に配置された共焦点絞りとをそれぞれ設けている。

　（３）本発明の走査型光学顕微鏡は上記（２）に記載の顕微鏡であり、かつ前記スペクトル分解手段はスペクトル分解された光束を平行に出射する光学手段を有する。
　（４）本発明の走査型光学顕微鏡は上記（１）に記載の顕微鏡であり、かつ前記標本からの蛍光を分離するためのビームスプリッタと前記スペクトル分解手段との間に、光束を縮小する縮小光学系を設けている。

上記手段を講じた結果、それぞれ以下のような作用を奏する。（１）本発明の走査型光学顕微鏡によれば、多重染色された標本からの各蛍光は、スペクトル分解されて各蛍光が有する波長域に光路を分割される。これらの光を光検出器としてのサイドオン型フォトマルチプライヤに導くにあたり、その軸心方向が、前記スペクトル分解手段によりスペクトル分解される面内、すなわちスペクトル分解された光の分散方向にほぼ一致するようにした。これにより、サイドオン型フォトマルチプライヤの感度分布が広がる軸方向に検出光の広がり方向が一致するので、蛍光を損失することなく光検出器に導くことができる。

　（２）本発明の走査型光学顕微鏡によれば、各蛍光が有する波長域に分割された光路のそれぞれに、標本からの蛍光を結像する結像光学系と、結像光学系の焦点位置に配置された共焦点絞りとが設けられているので、各共焦点絞りを各波長域に最適な絞り径に設定することができる。これにより、蛍光を損失することなく完全な共焦点効果を得ることができる。

　（３）本発明の走査型光学顕微鏡によれば、スペクトル分解され、各検出光路に波長分解された光束が平行に出射するので、これらの光束は全て共焦点位置に集光する。したがって、この位置に共焦点絞りを配置するだけで上記（２）の走査型光学顕微鏡を構成できる。また各検出光路において、光束を分離した後の光路に共焦点絞り及び光検出器を配置するだけで、独立した共焦点光学系を設けることができるので、装置を簡易かつ安価に構成できる。
　（４）本発明の走査型光学顕微鏡によれば、前記スペクトル分解手段はプリズムであり、標本からの各蛍光の光束がスペクトル分解手段に入射する前に縮小されるので、蛍光を精度良く各検出光路に分割することができる。

　上記課題を解決し目的を達成するために、本発明の走査型光学顕微鏡は以下の如く構成されている。
　（１）本発明の走査型光学顕微鏡は、レーザー光源からのレーザー光で標本を走査する走査型光学顕微鏡において、前記標本からの蛍光を前記レーザ光源と前記標本を結ぶ光路から分岐させるビームスプリッタと、前記ビームスプリッタで分岐された光路上に配置され蛍光を分光するスペクトル分解手段と、前記スペクトル分解手段で分光された蛍光を複数の波長域に分割する波長域分割手段と、前記複数の波長域に分割された各光路にそれぞれ設けられ、前記標本からの蛍光を検出する複数のサイドオン型フォトマルチプライヤと、を具備し、前記サイドオン型フォトマルチプライヤの軸心方向が、前記スペクトル分解手段によりスペクトル分解される面にほぼ平行であるようにした。

上記手段を講じた結果、それぞれ以下のような作用を奏する。（１）本発明の走査型光学顕微鏡によれば、多重染色された標本からの各蛍光は、スペクトル分解されて各蛍光が有する波長域に光路を分割される。これらの光を光検出器としてのサイドオン型フォトマルチプライヤに導くにあたり、その軸心方向が、前記スペクトル分解手段によりスペクトル分解される面、すなわちスペクトル分解された光の分散方向にほぼ平行であるようにした。これにより、サイドオン型フォトマルチプライヤの感度分布が広がる軸方向に検出光の広がり方向が一致するので、蛍光を損失することなく光検出器に導くことができる。

したがって、ＤＡＰＩ，ＦＩＴＣ，Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ，ＣＹ５の各蛍光に対して、蛍光を損失することなく、最高の共焦点効果を得ることができる。また、フォトマルチプライヤー１６ａ，１６ｂ，１６ｃ，１６ｄは、サイドオン型であって、その軸心方向はプリズム１１ａによりスペクトル分解される面とほぼ平行になるように構成されている。サイドオン型のフォトマルチプライヤーは、一般的に高感度でありながらヘッドオン型のフォトマルチプライヤーより安価であり、走査型の共焦点レーザー顕微鏡によく用いられる。しかしながら、サイドオン型のフォトマルチプライヤーは軸方向の感度分布に大きな差は見られないが、軸方向と垂直な方向には感度に大きな差があり、この点がヘッドオン型のフォトマルチプライヤーより劣る点である。なお参考として、図３にサイドオン型のフォトマルチプライヤーの感度分布のデータを示す。

本実施の形態では、サイドオン型フォトマルチプライヤーの軸心方向が、プリズム１１ａによりスペクトル分解される面とほぼ平行になるように構成しているので、サイドオン型のフォトマルチプライヤーの感度分布がほとんど問題にならない。

上述した第１の実施の形態によれば、三角ミラーにより蛍光を複数の波長域に分割できるので、蛍光検出光路数を自由に設定できる。この例では４チャンネル構成として示したが、目的に応じて、２チャンネル構成、３チャンネル構成、あるいは５チャンネル以上の構成に簡単に実施できる。また、サイドオン型フォトマルチプライヤーの軸心方向が、プリズム１１ａによりスペクトル分解される面とほぼ平行になるように構成しているので、感度分布がほとんど問題にならない。このように安価なサイドオン型フォトマルチプライヤーを使用できるので、装置を安価に構成することができる。

Claims (3)

1. レーザー光源からのレーザー光で標本を走査する走査型光学顕微鏡において、
   　前記標本からの蛍光を分光するスペクトル分解手段と、
   　前記スペクトル分解手段で分光された蛍光を複数の波長域に分割する波長域分割手段と、
   　前記複数の波長域に分割された各光路にそれぞれ設けられ、前記標本からの蛍光を結像する複数の結像光学系と、
   　前記各光路にそれぞれ設けられ、前記結像光学系の焦点位置に配置された複数の共焦点絞りと、
   　前記各光路にそれぞれ設けられ、前記共焦点絞りを通過した前記標本からの蛍光を検出する複数の光検出器と、を具備したことを特徴とする走査型光学顕微鏡。
2. 前記スペクトル分解手段は、スペクトル分解された光束を平行に出射する光学手段を有することを特徴とする請求項１に記載の走査型光学顕微鏡。
3. 前記スペクトル分解手段はプリズムであり、前記標本からの蛍光を分離するためのビームスプリッタと前記スペクトル分解手段との間に、光束を縮小する縮小光学系を設けたことを特徴とする請求項１または２に記載の走査型光学顕微鏡。
   

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