JP2004067583A - 新規ペプチド誘導体 - Google Patents
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Abstract
【課題】セリンプロテアーゼ阻害活性を有し、前凝固、高血圧症、心不全、虚血性末梢循環障害、心筋虚血、静脈機能不全、心筋梗塞後の心不全進行、糖尿病性腎症、腎炎、動脈硬化症、高アルドステロン症、強皮症、糸球体硬化症、腎不全、アルツハイマー病、記憶欠乏症、うつ病、知覚機能障害、不安、緊張症状、不快精神状態、緑内障、高眼圧症、ＰＴＣＡ後再狭窄、喘息、鼻炎、またはアレルギー性疾患の治療剤として有用な化合物を提供する。
【解決手段】式（１）
【化１】
（式中、Ｒは式：−ＣＨＯまたは−ＣＨ２ＯＨで表される基を表す）
で表される化合物またはその塩。
【選択図】 なし。
【解決手段】式（１）
【化１】
（式中、Ｒは式：−ＣＨＯまたは−ＣＨ２ＯＨで表される基を表す）
で表される化合物またはその塩。
【選択図】 なし。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、セリンプロテアーゼに対して阻害作用を有する新規なペプチド誘導体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
セリンプロテアーゼは活性部位にセリン残基を有するペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１群及びＥＣ３．４．１６群）の総称である。セリンプロテアーゼを阻害する物質として、天然物では血漿中に含まれるα１−アンチキモトリプシンや、放線菌の生産するキモスタチンなどが知られており、合成化合物としてはジイソプロピルフルオロホスホリドなどのクロロメチルケトン誘導体や、ジイソプロピルフルオロホスフェートなどが知られているが、医薬品として実用化はされていない。
【０００３】
セリンプロテアーゼは様々な疾患と密接に関係している。
【０００４】
例えば、セリンプロテアーゼの一種であるカテプシンＧは、多形核白血球（ＰＭＮ）の顆粒中に主に発現され、ＰＭＮ脱顆粒の間に放出され、血小板凝集を刺激し、血管壁のプロテオグリカン、糖タンパク質、及びコラーゲンを加水分解するセリンプロテアーゼであり、その阻害剤は、炎症及び前凝固（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）症状の治療及び予防に適すると考えられる。
【０００５】
また例えばキマーゼは、肥満細胞分泌顆粒中に見出されたセリンプロテアーゼであり、心臓、皮膚、肺、肝臓、腎皮質に多く分布している。ヒト心臓におけるアンジオテンシンＩＩの産生の８０％以上に関与している。また、エンドセリン生成過程、サブスタンスＰ、バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド（ＶＩＰ）、アポ蛋白Ｂ等の多くの生理活性物質を基質とし、コラゲナーゼ等の他の生体内プロテアーゼの活性化にも関与している。更にはＡｐｏＡ−Ｉを基質とすることにより、コレステロールの逆転相系の阻害作用や、タイプＩＶコラーゲンやフィブロネクチンの細胞外基質を切断し、ヒスタミン等とともに血管透過性を亢進し、ヒスタミン作用を増強し、血清アルブミンからヒスタミン遊離ペプチドを生成し、また、ＩｇＧを限定分解し、白血球遊走因子を形成し、炎症性サイトカインの一つであるインターロイキン−１βの前駆体を活性化する等の生体内作用をも有する。従って、キマーゼに対する阻害剤は、心血管障害治療剤、動脈硬化治療剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤等治療及び予防に適すると考えられる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
セリンプロテアーゼ阻害剤が上記のような疾患の治療薬として有効であると考えられるため、より効果の高く副作用の少ない化合物を求めて新規なセリンプロテアーゼ阻害剤の探索が行われている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはこのような背景のもと、セリンプロテアーゼを阻害する低分子化合物を、微生物代謝産物から探索した結果、フォーマ属カビの培養液中より、式（１）：
【化２】
（式中、Ｒは式：−ＣＨＯまたは−ＣＨ２ＯＨで表される基を表す）
で表される化合物を見いだし、さらに研究を重ねて本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は以下のものに関する。
〔１〕 式（１）
【化３】
（式中、Ｒは式：−ＣＨＯまたは−ＣＨ２ＯＨで表される基を表す）
で表される化合物またはその塩。
〔２〕 フォーマ属に属する、〔１〕記載の化合物またはその塩生産菌を培養して、その培養物から〔１〕記載の化合物またはその塩を採取する、〔１〕記載の化合物またはその塩の製造方法。
〔３〕 フォーマ属に属する、〔１〕記載の化合物またはその塩の生産菌がフォーマ・エスピー（Ｐｈｏｍａ ｓｐ．）ＳＰＦ−１８８４５株である、〔２〕記載の製造方法。
〔４〕 フォーマ・エスピー（Ｐｈｏｍａ ｓｐ．）ＳＰＦ−１８８４５株。
〔５〕 〔１〕記載の化合物またはその塩を有効成分として含有するセリンプロテアーゼ阻害剤。
〔６〕 セリンプロテアーゼが、カテプシンＧおよびキマーゼからなる群から選ばれる酵素である、〔５〕記載のセリンプロテアーゼ阻害剤。
〔７〕 〔１〕記載の化合物またはその塩を含有する、前凝固、高血圧症、心不全、虚血性末梢循環障害、心筋虚血、静脈機能不全、心筋梗塞後の心不全進行、糖尿病性腎症、腎炎、動脈硬化症、高アルドステロン症、強皮症、糸球体硬化症、腎不全、アルツハイマー病、記憶欠乏症、うつ病、知覚機能障害、不安、緊張症状、不快精神状態、緑内障、高眼圧症、ＰＴＣＡ後再狭窄、喘息、鼻炎、またはアレルギー性疾患の治療剤。
【０００９】
式（１）で表される化合物は、本発明者らが兵庫県内の畑の用水路に浸水していた葉より分離したカビＳＰＦ−１８８４５株を培養することにより、得ることができる。
【００１０】
ＳＰＦ−１８８４５株は次のような菌学的性質を有する。
【００１１】
麦芽エキス寒天培地上で、コロニーの生育は早く、２７℃、８日間で直径５．２ｃｍ、若干の盛り上がりがあり、ビロード状を呈する。コロニー表面の色は中央が薄い茶褐色で、周縁に向かって更に薄くなり、周縁部は灰色である。コロニー裏面の色は薄い茶褐色である。子嚢果の形成、分生子果の形成が認められず、胞子形成が認められない。可溶性色素の産生も認められない。１ヶ月間の培養で、分生子殻の形成が少し認められる。コーンミール寒天培地上では、コロニーの生育は早く、２７℃、８日間で直径５．３ｃｍ、盛り上がりは少なく、平坦である。コロニーの表面はほぼ無色で、コロニー裏面もほぼ無色である。コロニー中央部に褐色の分生子殻が認められ、一部、寒天培地中に埋没している。子嚢果の形成や可溶性色素の産生は認められない。
【００１２】
オートミール寒天培地（日本製薬社製放線菌培地Ｎｏ．３「ダイゴ」）上では、コロニーの生育は比較的早く、２７℃、８日間で直径５．４ｃｍ、盛り上がりは少なく、平坦で、ビロード状ある。コロニーの表面は薄い灰色で、コロニー裏面も薄い灰色である。コロニー中央部に黒褐色の分生子殻が認められるが、子嚢果の形成や可溶性色素の産生は認められない。３０日間の培養で、コロニー表面の全体に分生子殻の形成が認められ、一部は寒天培地中に埋没している。多くの分生子殻からは、粘液性の分生子塊の漏出が認められる。
【００１３】
オートミール寒天培地（日本製薬製放線菌培地Ｎｏ．３「ダイゴ」）上で２７℃、３０日間培養した時の形態は次の通りである。分生子殻は長径２００〜３００μｍ、短径１００〜１５０μｍ、亜球形から洋梨型で褐色または茶褐色である。開口部は観察されなかったが、頂上付近より薄い茶褐色の粘液性分生子塊を漏出する。分生子の形状は、円筒状であり、４．５〜６．０μｍ×１．２〜１．５μｍで、単細胞性で、無色である。菌糸はしばしば束状になり、隔壁が認められる。
【００１４】
本菌株の特徴を「ＣＯＭＰＥＮＤＩＵＭ ＯＦ ＳＯＩＬ ＦＵＮＧＩ Ｖｏｌｕｍｅ １ ， ２」（Ｋ．Ｈ．ＤＯＭＳＣＨら著、ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＲＥＳＳ刊行（１９８０年））、「菌類図鑑」（椿啓介、宇田川俊一ら著、株式会社講談社発行（１９７８年初版））、「カビの分離・培養と同定」（宇田川俊一、室井哲夫 訳、医歯薬出版株式会社発行（１９８３年初版））などを参照に検索したところ、不完全菌亜門の分生子果不完全菌綱（Ｃｏｅｌｏｍｙｃｅｔｅｓ）に分類されるフォーマ属（Ｐｈｏｍａ属）の形態学的特徴によく合致した。従って、本発明者らは、本菌株をフォーマ・エスピー（Ｐｈｏｍａ ｓｐ．）ＳＰＦ−１８８４５と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した（受託日：平成１４年６月２５日；受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８９０７）。
【００１５】
上記カビの培養に使用される培地は液状でも固体でもよいが、通常は液体培地による振盪培養または通気撹拌培養が有利である。使用する培地は、特に限定されるものではないが、炭素源としては例えばグルコース、マンニトール、ショ糖、グリセリン、デンプン、デキストリン、糖蜜等が用いられ、また窒素源としては、例えばペプトン、カザミノ酸等の蛋白質加水分解物、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、綿実粉、コーンスティープリカー、アミノ酸類等の有機窒素源や、アンモニウム塩や硝酸塩等の無機窒素源が用いられる。その他、浸透圧調整、ｐＨ調整、微量成分の補給等のために、各種リン酸塩、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カルシウム等の無機塩類を添加することも可能である。さらに菌の生育を促進する目的で、各種ビタミン類、核酸関連化合物等を添加しても良い。なお、培養期間中に、シリコン油、ポリプロピレングリコール誘導体、大豆油等の消泡剤を添加することも可能である。
【００１６】
培養温度としては、好ましくは２０〜３５℃の範囲、さらに好ましくは２５〜３０℃の範囲の温度が挙げられる。培養期間としては例えば、５〜１０日間の範囲が挙げられる。培地のｐＨとして例えば、中性付近の範囲が挙げられる。
【００１７】
培養液から一般式（１）で表される化合物を単離するには、微生物の生産する二次代謝物の培養液から、通常使用される単離手段が使用できる。培養液上清中からの単離法としては、培養濾液からの通常の単離法、例えば溶媒抽出法、イオン交換樹脂法または吸着もしくは分配クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィー等が挙げられる。これらの単離法は単独または組み合わせて行うことができる。また高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）や薄層クロマトグラフィーなどにより単離精製できる。培養菌体から目的物を単離する場合は、濾過もしくは遠心分離等の手段で集めた菌体を、アセトン等の水溶性有機溶媒を用いて直接抽出することができる。抽出物は培養上清からの単離精製と同様の方法で、目的物を得ることができる。
【００１８】
前記式（１）で表される化合物またはその塩には水やエタノール等の医薬品として許容される溶媒との溶媒和物も含まれる。
【００１９】
前記式（１）で表される化合物は、常法に従いその薬学的に許容される塩とすることができる。このような塩としてはナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の無機塩基との塩、トリエチルアミン、ピペリジン、モルホリン、ピリジン、リジン等の有機塩基との塩を挙げることができる。
【００２０】
また、前記式（１）で表される化合物またはその塩は不斉炭素原子を含み立体異性体が存在するが、それらには各異性体の混合物や単離されたものを含む。
【００２１】
前記式（１）で表される化合物またはその塩は、経口的または非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば、その溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる。スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。前記の適当な投与剤型は、例えば、許容される通常の担体、賦型剤、結合剤、安定剤、希釈剤等に有効成分を配合することにより製造することができる。また、薬学的に許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。
【００２２】
投与量および投与回数は、投与法と患者の年齢、体重、病状等によって異なるが、経口投与の場合は、通常、成人の一日当たり投与量は０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜５００ｍｇの範囲で選択すればよい。
【００２３】
【実施例】
実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２４】
実施例１
式（１）で表される化合物の取得
マンニトール４％、大豆粉１．２５％、クエン酸三ナトリウム０．２５％、酵母エキス０．０５％を含み、ｐＨ７．０に調整した培地１０ｍｌずつを大型試験管３００本に分注しオートクレーブで滅菌した。これに斜面培養したフォーマ・エスピーＳＰＦ−１８８４５株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター；受託日：平成１４年６月２５日；受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８９０７）を１白金耳ずつ接種し、２７℃、２３０ｒｐｍにて８日間振盪培養した。培養終了後、各大型試験管内に１０ｍＬのアセトンを加え、攪拌し、内容物を回収した。３０分間振とう抽出後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上清液と沈殿物に分離した。
【００２５】
上清液を集め、減圧濃縮後、水溶液となったところで、ＤＩＡＩＯＮＴＭ ＨＰ−２０（三菱化学社製５．０φ×１５．０ｃｍ）を用いるカラムクロマトグラフィーに付し、５％アセトニトリル１Ｌ、３０％アセトニトリル１Ｌを用いて順次溶出した。３０％アセトニトリル溶出画分を減圧濃縮し、薄茶色の粗精製物１．５ｇを得た。これを０．０１４％のアンモニアを含む３０％アセトニトリル４０ｍＬに懸濁し、激しく攪拌した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上清液と沈殿物に分離した。上清液４０ｍＬをＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ ＬＨ−２０（アマシャムファルマシアバイオテク社）（３．６φ×５０ｃｍ）を用いるカラムクロマトグラフィーに付し、０．０１４％のアンモニアを含む３０％アセトニトリルで溶出した。１フラクションあたり４０ｍＬとなるように分取し、フラクション９および１０に活性が認められた。
【００２６】
沈殿物については０．０２８％のアンモニアを含む３０％アセトニトリル３０ｍＬに懸濁し、激しく攪拌した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、更に上清液と沈殿物に分離した。上清液３０ｍＬをＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ ＬＨ−２０（アマシャムファルマシアバイオテク社）（３．６φ×５０ｃｍ）を用いるカラムクロマトグラフィーに付し、０．０２８％のアンモニアを含む３０％アセトニトリルで溶出した。１フラクションあたり４０ｍＬとなるように分取し、フラクション９に活性が認められた。
【００２７】
以上の３フラクションを減圧濃縮し、４０５．６ｍｇの粗精製物を得た。これを０．０２８％のアンモニア水２０ｍＬに溶解し、ＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ ＬＨ−２０（アマシャムファルマシアバイオテク社）（３．６φ×５０ｃｍ）を用いるカラムクロマトグラフィーに付し、０．０２８％のアンモニア水で溶出した。１フラクションあたり２０ｍＬとなるように分取し、フラクション１５から１７を集め、減圧濃縮して２８２．９ｍｇの粗精製物を得た。これを１０ｍＬの０．０２８％アンモニア水に溶解し、１ｍＬを逆相ＨＰＬＣに付す操作を１０回行なった。逆相ＨＰＬＣの条件は、カラム：ＷａｋｏｐａｋＴＭ Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ ５Ｃ１８ＲＳ（２０φ×５０ｍｍと２０φ×２５０ｍｍを連結、和光純薬工業製）、溶出液Ａ：５ｍＭリン酸緩衝液（りん酸二水素アンモニウム：りん酸水素二アンモニウム＝１：１）、溶出液Ｂ：アセトニトリル、グラジエント：Ｂ液割合０％から１５％へ４５分間の直線的グラジエント、流速：５ｍＬ／分、検出：２１５ｎｍにおける吸光度、とした。保持時間１８から２２分、２４から２６分、２８から３５分の溶出画分をそれぞれ別に分取した。次いで、減圧下でアセトニトリルを留去した。
【００２８】
３フラクションの水溶液それぞれをＤＩＡＩＯＮＴＭ ＨＰ−２０（三菱化学社製１．６φ×５．０ｃｍ）を用いるカラムクロマトグラフィーに付し、５０ｍＬの蒸留水で緩衝液成分を溶出した後、５０ｍＬの６０％アセトニトリルで活性成分を溶出した。それぞれの６０％アセトニトリル溶出画分から、減圧下でアセトニトリルを留去し、さらに凍結乾燥により水を除いた。保持時間１８から２２分の画分よりＳＰＦ−１８８４５−１を含む白色固体２９．６ｍｇを、２８から３５分の画分より白色固体ＳＰＦ−１８８４５−２（３７．５ｍｇ）を、２４から２６分の画分より白色固体ＳＰＦ−１８８４５−３（１３．５ｍｇ）を得た。
【００２９】
保持時間１８から２２分の画分より得た白色固体２９．６ｍｇを３ｍＬの０．０２８％アンモニア水に溶解し、１ｍＬを逆相ＨＰＬＣに付す操作を３回行なった。逆相ＨＰＬＣの条件は、カラム：ＷａｋｏｐａｋＴＭ Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ ５Ｃ１８ＲＳ（２０φ×５０ｍｍと２０φ×２５０ｍｍを連結、和光純薬工業製）、溶出液Ａ：５ｍＭリン酸緩衝液（りん酸二水素アンモニウム：りん酸水素二アンモニウム＝１：１）、溶出液Ｂ：アセトニトリル、グラジエント：Ｂ液割合０％から１５％へ４５分間の直線的グラジエント、流速：５ｍＬ／分、検出：２１５ｎｍにおける吸光度、とした。保持時間１７から２０分、溶出画分を分取した。減圧下でアセトニトリルを留去して得た水溶液を、ＤＩＡＩＯＮＴＭ ＨＰ−２０（三菱化学社製１．６φ×５．０ｃｍ）を用いるカラムクロマトグラフィーに付し、５０ｍＬの蒸留水で緩衝液成分を溶出した後、５０ｍＬの６０％アセトニトリルで活性成分を溶出した。６０％アセトニトリル溶出画分から、減圧下でアセトニトリルを留去し、さらに凍結乾燥により水を除き、白色固体ＳＰＦ−１８８４５−１（７．４ｍｇ）を得た。
【００３０】
化合物ＳＰＦ−１８８４５−１の物理化学的性状は以下のようであった。
【表１】
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
外観：白色粉末
分子量：５３２
分子式：Ｃ２７Ｈ４０Ｎ４Ｏ７
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５３３（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５３１（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：
実測値：５３３．３０４８
計算値：５３３．２９７５（Ｃ２７Ｈ４１Ｎ４Ｏ７）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
末端吸収
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
３２８５、２９６６、１７２６、１６３７、１５４８、１３９４、１２３１
１Ｈ―ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）中、５００ＭＨｚで測定したスペクトルを図１に示す。
１３Ｃ―ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）中、１２５ＭＨｚで測定したスペクトルを図２に示す。
エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量スペクトル（ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）で観測されたフラグメントイオンを図３に示す。
溶解性：ヘキサンに不溶、水、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
これらから化合物ＳＰＦ−１８８４５−１の構造式を：
【化４】
と決定した。
【００３１】
また、化合物ＳＰＦ−１８８４５−２の物理化学的性状は以下のようであった。
【表２】
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
外観：白色粉末
分子量：５３２
分子式：Ｃ２７Ｈ４０Ｎ４Ｏ７
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５３３（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５３１（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：
実測値：５３３．３０１０
計算値：５３３．２９７５（Ｃ２７Ｈ４１Ｎ４Ｏ７）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
末端吸収
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
３２８４、２９６６、１７２９、１６３１、１５４８、１３９２、１２３１
１Ｈ―ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）中、５００ＭＨｚで測定したスペクトルを図４に示す。
１３Ｃ―ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）中、１２５ＭＨｚで測定したスペクトルを図５に示す。
溶解性：ヘキサンに不溶、水、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
これらから化合物ＳＰＦ−１８８４５−２の構造式は、ＳＰＦ−１８８４５−１の立体異性体であると決定した。
【００３２】
また、化合物ＳＰＦ−１８８４５−３の物理化学的性状は以下のようであった。
【表３】
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
外観：白色粉末
分子量：５３４
分子式：Ｃ２７Ｈ４２Ｎ４Ｏ７
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５３５（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５３３（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：
実測値：５３５．３１２３
計算値：５３５．３１３２（Ｃ２７Ｈ４３Ｎ４Ｏ７）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
末端吸収
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
３２７８、２９６５、１６４４、１５４９、１３９４、１２３０
１Ｈ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
０．６２（３Ｈ，ｄ，７．０）、０．７６（３Ｈ，ｄ，６．４）、０．８０（３Ｈ，ｄ，６．７）、０．８３（３Ｈ，ｄ，６．７）、０．８６（３Ｈ，ｄ，７．０）、０．８８（３Ｈ，ｄ，７．０）、１．８１（１Ｈ，ｍ）、２．００（１Ｈ，ｍ）、２．１０（１Ｈ，ｍ）、２．６２（１Ｈ，ｄｄ，１３．６，８．２）、２．８２（１Ｈ，ｄｄ，１３．６，５．２）、２．９５（１Ｈ，ｄ，１５．０）、３．２２（１Ｈ，ｄｄ，１１．０，５．０）、３．２５（１Ｈ，ｄ，１５．０）、３．２９（１Ｈ，ｄｄ，１１．０，７．０）、３．７８（１Ｈ，ｔ，７．９）、３．８９（１Ｈ，ｍ）、３．９７（１Ｈ，ｄｄ，８．８，８．６）、４．１０（１Ｈ，ｄｄ，７．７，５．２）、４．７２（１Ｈ，ｂｒｓ）、７．２１（５Ｈ，ｂｒｓ）、７．４５（１Ｈ，ｄ，８．５）、７．９０（１Ｈ，ｄ，８．２）、８．３５（１Ｈ，ｄ，７．９）、８．６９（１Ｈ，ｂｒｓ）
１３Ｃ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
１７．４４、１８．７５、１９．０８、１９．２１、１９．２４、１９．２７、２９．３７、２９．７６、２９．８４、３６．２７、４４．９５、５２．３３、５８．５３、５９．４７、５９．５１、６２．７６、１２５．７０、１２７．９３（２Ｃ）、１２９．０７（２Ｃ）、１３９．３６、１６９．３６、１７０．２３、１７０．５２、１７１．００、１７１．２３
溶解性：ヘキサンに不溶、水、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
これらから化合物ＳＰＦ−１８８４５−３の構造式を：
【化５】
と決定した。
【００３３】
実施例２
カテプシンＧ阻害活性の測定
カテプシンＧ阻害活性の測定には、ヒト好中球由来カテプシンＧ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製、カタログ番号１９１３４４）を用いた。基質としては、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＭＣＡ（式中、Ｓｕｃはスクシニル基を、ＭＣＡは４−メチルクマリン−７−イルアミノ基を表す。以下同じ。）（ペプチド研究所社製、カタログ番号３１１４−ｖ）を用いた。即ち、１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１．６Ｍ塩化ナトリウム、１００μＭＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＭＣＡ、１μｇ／ｍＬ ヒト好中球由来カテプシンＧおよびジメチルスルホキシド１．０μＬまたは供試阻害剤を含むジメチルスルホキシド１．０μＬを添加した反応系１００μＬで３７℃、１２０分間反応をおこなった。ヒト好中球由来カテプシンＧにより切断を受けて基質から遊離される７−アミノ−４−メチルクマリンの量を、励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍにおける蛍光強度を測定することで阻害活性を測定し、酵素活性を５０％阻害するのに要する阻害剤の濃度（ＩＣ５０）を求めた。結果は次の通りであった。
【表４】
【００３４】
実施例３
ヒトキマーゼ阻害活性の測定
ヒトキマーゼ阻害活性の測定には、ヒト皮膚由来キマーゼ（Ｅｌａｓｔｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔ社製、カタログ番号ＨＳ２１４）を用いた。基質としては、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＭＣＡ（ペプチド研究所社製、カタログ番号３１１４−ｖ）を用いた。即ち、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、３Ｍ塩化ナトリウム、１００μＭＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＭＣＡ、１５０ｎｇ／ｍＬ ヒト皮膚由来キマーゼおよびジメチルスルホキシド０．５μＬまたは供試阻害剤を含むジメチルスルホキシド０．５μＬを添加した反応系５０μＬで室温、５時間反応をおこなった。ヒト皮膚由来キマーゼにより切断を受けて基質から遊離される７−アミノ−４−メチルクマリンの量を、励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍにおける蛍光強度を測定することで阻害活性を測定し、酵素活性を５０％阻害するのに要する阻害剤の濃度（ＩＣ５０）を求めた。結果は次の通りであった。
【表５】
【００３５】
【発明の効果】
前記式（１）で表される化合物またはその塩は、セリンプロテアーゼ阻害活性を有し、前凝固、高血圧症、心不全、虚血性末梢循環障害、心筋虚血、静脈機能不全、心筋梗塞後の心不全進行、糖尿病性腎症、腎炎、動脈硬化症、高アルドステロン症、強皮症、糸球体硬化症、腎不全、アルツハイマー病、記憶欠乏症、うつ病、知覚機能障害、不安、緊張症状、不快精神状態、緑内障、高眼圧症、ＰＴＣＡ後再狭窄、喘息、鼻炎、またはアレルギー性疾患の治療剤として有用である。
【００３６】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＳＰＦ−１８８４５−１の１Ｈ―ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す図である。
【図２】図２は、ＳＰＦ−１８８４５−１の１３Ｃ―ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す図である。
【図３】図３は、ＳＰＦ−１８８４５−１のエレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量スペクトル（ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）で観測されたフラグメントイオンを示す図である。
【図４】図４は、ＳＰＦ−１８８４５−２の１Ｈ―ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す図である。
【図５】図５は、ＳＰＦ−１８８４５−２の１３Ｃ―ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、セリンプロテアーゼに対して阻害作用を有する新規なペプチド誘導体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
セリンプロテアーゼは活性部位にセリン残基を有するペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１群及びＥＣ３．４．１６群）の総称である。セリンプロテアーゼを阻害する物質として、天然物では血漿中に含まれるα１−アンチキモトリプシンや、放線菌の生産するキモスタチンなどが知られており、合成化合物としてはジイソプロピルフルオロホスホリドなどのクロロメチルケトン誘導体や、ジイソプロピルフルオロホスフェートなどが知られているが、医薬品として実用化はされていない。
【０００３】
セリンプロテアーゼは様々な疾患と密接に関係している。
【０００４】
例えば、セリンプロテアーゼの一種であるカテプシンＧは、多形核白血球（ＰＭＮ）の顆粒中に主に発現され、ＰＭＮ脱顆粒の間に放出され、血小板凝集を刺激し、血管壁のプロテオグリカン、糖タンパク質、及びコラーゲンを加水分解するセリンプロテアーゼであり、その阻害剤は、炎症及び前凝固（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）症状の治療及び予防に適すると考えられる。
【０００５】
また例えばキマーゼは、肥満細胞分泌顆粒中に見出されたセリンプロテアーゼであり、心臓、皮膚、肺、肝臓、腎皮質に多く分布している。ヒト心臓におけるアンジオテンシンＩＩの産生の８０％以上に関与している。また、エンドセリン生成過程、サブスタンスＰ、バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド（ＶＩＰ）、アポ蛋白Ｂ等の多くの生理活性物質を基質とし、コラゲナーゼ等の他の生体内プロテアーゼの活性化にも関与している。更にはＡｐｏＡ−Ｉを基質とすることにより、コレステロールの逆転相系の阻害作用や、タイプＩＶコラーゲンやフィブロネクチンの細胞外基質を切断し、ヒスタミン等とともに血管透過性を亢進し、ヒスタミン作用を増強し、血清アルブミンからヒスタミン遊離ペプチドを生成し、また、ＩｇＧを限定分解し、白血球遊走因子を形成し、炎症性サイトカインの一つであるインターロイキン−１βの前駆体を活性化する等の生体内作用をも有する。従って、キマーゼに対する阻害剤は、心血管障害治療剤、動脈硬化治療剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤等治療及び予防に適すると考えられる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
セリンプロテアーゼ阻害剤が上記のような疾患の治療薬として有効であると考えられるため、より効果の高く副作用の少ない化合物を求めて新規なセリンプロテアーゼ阻害剤の探索が行われている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはこのような背景のもと、セリンプロテアーゼを阻害する低分子化合物を、微生物代謝産物から探索した結果、フォーマ属カビの培養液中より、式（１）：
【化２】
で表される化合物を見いだし、さらに研究を重ねて本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は以下のものに関する。
〔１〕 式（１）
【化３】
で表される化合物またはその塩。
〔２〕 フォーマ属に属する、〔１〕記載の化合物またはその塩生産菌を培養して、その培養物から〔１〕記載の化合物またはその塩を採取する、〔１〕記載の化合物またはその塩の製造方法。
〔３〕 フォーマ属に属する、〔１〕記載の化合物またはその塩の生産菌がフォーマ・エスピー（Ｐｈｏｍａ ｓｐ．）ＳＰＦ−１８８４５株である、〔２〕記載の製造方法。
〔４〕 フォーマ・エスピー（Ｐｈｏｍａ ｓｐ．）ＳＰＦ−１８８４５株。
〔５〕 〔１〕記載の化合物またはその塩を有効成分として含有するセリンプロテアーゼ阻害剤。
〔６〕 セリンプロテアーゼが、カテプシンＧおよびキマーゼからなる群から選ばれる酵素である、〔５〕記載のセリンプロテアーゼ阻害剤。
〔７〕 〔１〕記載の化合物またはその塩を含有する、前凝固、高血圧症、心不全、虚血性末梢循環障害、心筋虚血、静脈機能不全、心筋梗塞後の心不全進行、糖尿病性腎症、腎炎、動脈硬化症、高アルドステロン症、強皮症、糸球体硬化症、腎不全、アルツハイマー病、記憶欠乏症、うつ病、知覚機能障害、不安、緊張症状、不快精神状態、緑内障、高眼圧症、ＰＴＣＡ後再狭窄、喘息、鼻炎、またはアレルギー性疾患の治療剤。
【０００９】
式（１）で表される化合物は、本発明者らが兵庫県内の畑の用水路に浸水していた葉より分離したカビＳＰＦ−１８８４５株を培養することにより、得ることができる。
【００１０】
ＳＰＦ−１８８４５株は次のような菌学的性質を有する。
【００１１】
麦芽エキス寒天培地上で、コロニーの生育は早く、２７℃、８日間で直径５．２ｃｍ、若干の盛り上がりがあり、ビロード状を呈する。コロニー表面の色は中央が薄い茶褐色で、周縁に向かって更に薄くなり、周縁部は灰色である。コロニー裏面の色は薄い茶褐色である。子嚢果の形成、分生子果の形成が認められず、胞子形成が認められない。可溶性色素の産生も認められない。１ヶ月間の培養で、分生子殻の形成が少し認められる。コーンミール寒天培地上では、コロニーの生育は早く、２７℃、８日間で直径５．３ｃｍ、盛り上がりは少なく、平坦である。コロニーの表面はほぼ無色で、コロニー裏面もほぼ無色である。コロニー中央部に褐色の分生子殻が認められ、一部、寒天培地中に埋没している。子嚢果の形成や可溶性色素の産生は認められない。
【００１２】
オートミール寒天培地（日本製薬社製放線菌培地Ｎｏ．３「ダイゴ」）上では、コロニーの生育は比較的早く、２７℃、８日間で直径５．４ｃｍ、盛り上がりは少なく、平坦で、ビロード状ある。コロニーの表面は薄い灰色で、コロニー裏面も薄い灰色である。コロニー中央部に黒褐色の分生子殻が認められるが、子嚢果の形成や可溶性色素の産生は認められない。３０日間の培養で、コロニー表面の全体に分生子殻の形成が認められ、一部は寒天培地中に埋没している。多くの分生子殻からは、粘液性の分生子塊の漏出が認められる。
【００１３】
オートミール寒天培地（日本製薬製放線菌培地Ｎｏ．３「ダイゴ」）上で２７℃、３０日間培養した時の形態は次の通りである。分生子殻は長径２００〜３００μｍ、短径１００〜１５０μｍ、亜球形から洋梨型で褐色または茶褐色である。開口部は観察されなかったが、頂上付近より薄い茶褐色の粘液性分生子塊を漏出する。分生子の形状は、円筒状であり、４．５〜６．０μｍ×１．２〜１．５μｍで、単細胞性で、無色である。菌糸はしばしば束状になり、隔壁が認められる。
【００１４】
本菌株の特徴を「ＣＯＭＰＥＮＤＩＵＭ ＯＦ ＳＯＩＬ ＦＵＮＧＩ Ｖｏｌｕｍｅ １ ， ２」（Ｋ．Ｈ．ＤＯＭＳＣＨら著、ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＲＥＳＳ刊行（１９８０年））、「菌類図鑑」（椿啓介、宇田川俊一ら著、株式会社講談社発行（１９７８年初版））、「カビの分離・培養と同定」（宇田川俊一、室井哲夫 訳、医歯薬出版株式会社発行（１９８３年初版））などを参照に検索したところ、不完全菌亜門の分生子果不完全菌綱（Ｃｏｅｌｏｍｙｃｅｔｅｓ）に分類されるフォーマ属（Ｐｈｏｍａ属）の形態学的特徴によく合致した。従って、本発明者らは、本菌株をフォーマ・エスピー（Ｐｈｏｍａ ｓｐ．）ＳＰＦ−１８８４５と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した（受託日：平成１４年６月２５日；受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８９０７）。
【００１５】
上記カビの培養に使用される培地は液状でも固体でもよいが、通常は液体培地による振盪培養または通気撹拌培養が有利である。使用する培地は、特に限定されるものではないが、炭素源としては例えばグルコース、マンニトール、ショ糖、グリセリン、デンプン、デキストリン、糖蜜等が用いられ、また窒素源としては、例えばペプトン、カザミノ酸等の蛋白質加水分解物、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、綿実粉、コーンスティープリカー、アミノ酸類等の有機窒素源や、アンモニウム塩や硝酸塩等の無機窒素源が用いられる。その他、浸透圧調整、ｐＨ調整、微量成分の補給等のために、各種リン酸塩、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カルシウム等の無機塩類を添加することも可能である。さらに菌の生育を促進する目的で、各種ビタミン類、核酸関連化合物等を添加しても良い。なお、培養期間中に、シリコン油、ポリプロピレングリコール誘導体、大豆油等の消泡剤を添加することも可能である。
【００１６】
培養温度としては、好ましくは２０〜３５℃の範囲、さらに好ましくは２５〜３０℃の範囲の温度が挙げられる。培養期間としては例えば、５〜１０日間の範囲が挙げられる。培地のｐＨとして例えば、中性付近の範囲が挙げられる。
【００１７】
培養液から一般式（１）で表される化合物を単離するには、微生物の生産する二次代謝物の培養液から、通常使用される単離手段が使用できる。培養液上清中からの単離法としては、培養濾液からの通常の単離法、例えば溶媒抽出法、イオン交換樹脂法または吸着もしくは分配クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィー等が挙げられる。これらの単離法は単独または組み合わせて行うことができる。また高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）や薄層クロマトグラフィーなどにより単離精製できる。培養菌体から目的物を単離する場合は、濾過もしくは遠心分離等の手段で集めた菌体を、アセトン等の水溶性有機溶媒を用いて直接抽出することができる。抽出物は培養上清からの単離精製と同様の方法で、目的物を得ることができる。
【００１８】
前記式（１）で表される化合物またはその塩には水やエタノール等の医薬品として許容される溶媒との溶媒和物も含まれる。
【００１９】
前記式（１）で表される化合物は、常法に従いその薬学的に許容される塩とすることができる。このような塩としてはナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の無機塩基との塩、トリエチルアミン、ピペリジン、モルホリン、ピリジン、リジン等の有機塩基との塩を挙げることができる。
【００２０】
また、前記式（１）で表される化合物またはその塩は不斉炭素原子を含み立体異性体が存在するが、それらには各異性体の混合物や単離されたものを含む。
【００２１】
前記式（１）で表される化合物またはその塩は、経口的または非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば、その溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる。スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。前記の適当な投与剤型は、例えば、許容される通常の担体、賦型剤、結合剤、安定剤、希釈剤等に有効成分を配合することにより製造することができる。また、薬学的に許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。
【００２２】
投与量および投与回数は、投与法と患者の年齢、体重、病状等によって異なるが、経口投与の場合は、通常、成人の一日当たり投与量は０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜５００ｍｇの範囲で選択すればよい。
【００２３】
【実施例】
実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２４】
実施例１
式（１）で表される化合物の取得
マンニトール４％、大豆粉１．２５％、クエン酸三ナトリウム０．２５％、酵母エキス０．０５％を含み、ｐＨ７．０に調整した培地１０ｍｌずつを大型試験管３００本に分注しオートクレーブで滅菌した。これに斜面培養したフォーマ・エスピーＳＰＦ−１８８４５株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター；受託日：平成１４年６月２５日；受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８９０７）を１白金耳ずつ接種し、２７℃、２３０ｒｐｍにて８日間振盪培養した。培養終了後、各大型試験管内に１０ｍＬのアセトンを加え、攪拌し、内容物を回収した。３０分間振とう抽出後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上清液と沈殿物に分離した。
【００２５】
上清液を集め、減圧濃縮後、水溶液となったところで、ＤＩＡＩＯＮＴＭ ＨＰ−２０（三菱化学社製５．０φ×１５．０ｃｍ）を用いるカラムクロマトグラフィーに付し、５％アセトニトリル１Ｌ、３０％アセトニトリル１Ｌを用いて順次溶出した。３０％アセトニトリル溶出画分を減圧濃縮し、薄茶色の粗精製物１．５ｇを得た。これを０．０１４％のアンモニアを含む３０％アセトニトリル４０ｍＬに懸濁し、激しく攪拌した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上清液と沈殿物に分離した。上清液４０ｍＬをＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ ＬＨ−２０（アマシャムファルマシアバイオテク社）（３．６φ×５０ｃｍ）を用いるカラムクロマトグラフィーに付し、０．０１４％のアンモニアを含む３０％アセトニトリルで溶出した。１フラクションあたり４０ｍＬとなるように分取し、フラクション９および１０に活性が認められた。
【００２６】
沈殿物については０．０２８％のアンモニアを含む３０％アセトニトリル３０ｍＬに懸濁し、激しく攪拌した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、更に上清液と沈殿物に分離した。上清液３０ｍＬをＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ ＬＨ−２０（アマシャムファルマシアバイオテク社）（３．６φ×５０ｃｍ）を用いるカラムクロマトグラフィーに付し、０．０２８％のアンモニアを含む３０％アセトニトリルで溶出した。１フラクションあたり４０ｍＬとなるように分取し、フラクション９に活性が認められた。
【００２７】
以上の３フラクションを減圧濃縮し、４０５．６ｍｇの粗精製物を得た。これを０．０２８％のアンモニア水２０ｍＬに溶解し、ＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ ＬＨ−２０（アマシャムファルマシアバイオテク社）（３．６φ×５０ｃｍ）を用いるカラムクロマトグラフィーに付し、０．０２８％のアンモニア水で溶出した。１フラクションあたり２０ｍＬとなるように分取し、フラクション１５から１７を集め、減圧濃縮して２８２．９ｍｇの粗精製物を得た。これを１０ｍＬの０．０２８％アンモニア水に溶解し、１ｍＬを逆相ＨＰＬＣに付す操作を１０回行なった。逆相ＨＰＬＣの条件は、カラム：ＷａｋｏｐａｋＴＭ Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ ５Ｃ１８ＲＳ（２０φ×５０ｍｍと２０φ×２５０ｍｍを連結、和光純薬工業製）、溶出液Ａ：５ｍＭリン酸緩衝液（りん酸二水素アンモニウム：りん酸水素二アンモニウム＝１：１）、溶出液Ｂ：アセトニトリル、グラジエント：Ｂ液割合０％から１５％へ４５分間の直線的グラジエント、流速：５ｍＬ／分、検出：２１５ｎｍにおける吸光度、とした。保持時間１８から２２分、２４から２６分、２８から３５分の溶出画分をそれぞれ別に分取した。次いで、減圧下でアセトニトリルを留去した。
【００２８】
３フラクションの水溶液それぞれをＤＩＡＩＯＮＴＭ ＨＰ−２０（三菱化学社製１．６φ×５．０ｃｍ）を用いるカラムクロマトグラフィーに付し、５０ｍＬの蒸留水で緩衝液成分を溶出した後、５０ｍＬの６０％アセトニトリルで活性成分を溶出した。それぞれの６０％アセトニトリル溶出画分から、減圧下でアセトニトリルを留去し、さらに凍結乾燥により水を除いた。保持時間１８から２２分の画分よりＳＰＦ−１８８４５−１を含む白色固体２９．６ｍｇを、２８から３５分の画分より白色固体ＳＰＦ−１８８４５−２（３７．５ｍｇ）を、２４から２６分の画分より白色固体ＳＰＦ−１８８４５−３（１３．５ｍｇ）を得た。
【００２９】
保持時間１８から２２分の画分より得た白色固体２９．６ｍｇを３ｍＬの０．０２８％アンモニア水に溶解し、１ｍＬを逆相ＨＰＬＣに付す操作を３回行なった。逆相ＨＰＬＣの条件は、カラム：ＷａｋｏｐａｋＴＭ Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ ５Ｃ１８ＲＳ（２０φ×５０ｍｍと２０φ×２５０ｍｍを連結、和光純薬工業製）、溶出液Ａ：５ｍＭリン酸緩衝液（りん酸二水素アンモニウム：りん酸水素二アンモニウム＝１：１）、溶出液Ｂ：アセトニトリル、グラジエント：Ｂ液割合０％から１５％へ４５分間の直線的グラジエント、流速：５ｍＬ／分、検出：２１５ｎｍにおける吸光度、とした。保持時間１７から２０分、溶出画分を分取した。減圧下でアセトニトリルを留去して得た水溶液を、ＤＩＡＩＯＮＴＭ ＨＰ−２０（三菱化学社製１．６φ×５．０ｃｍ）を用いるカラムクロマトグラフィーに付し、５０ｍＬの蒸留水で緩衝液成分を溶出した後、５０ｍＬの６０％アセトニトリルで活性成分を溶出した。６０％アセトニトリル溶出画分から、減圧下でアセトニトリルを留去し、さらに凍結乾燥により水を除き、白色固体ＳＰＦ−１８８４５−１（７．４ｍｇ）を得た。
【００３０】
化合物ＳＰＦ−１８８４５−１の物理化学的性状は以下のようであった。
【表１】
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
外観：白色粉末
分子量：５３２
分子式：Ｃ２７Ｈ４０Ｎ４Ｏ７
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５３３（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５３１（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：
実測値：５３３．３０４８
計算値：５３３．２９７５（Ｃ２７Ｈ４１Ｎ４Ｏ７）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
末端吸収
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
３２８５、２９６６、１７２６、１６３７、１５４８、１３９４、１２３１
１Ｈ―ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）中、５００ＭＨｚで測定したスペクトルを図１に示す。
１３Ｃ―ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）中、１２５ＭＨｚで測定したスペクトルを図２に示す。
エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量スペクトル（ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）で観測されたフラグメントイオンを図３に示す。
溶解性：ヘキサンに不溶、水、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
これらから化合物ＳＰＦ−１８８４５−１の構造式を：
【化４】
【００３１】
また、化合物ＳＰＦ−１８８４５−２の物理化学的性状は以下のようであった。
【表２】
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
外観：白色粉末
分子量：５３２
分子式：Ｃ２７Ｈ４０Ｎ４Ｏ７
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５３３（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５３１（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：
実測値：５３３．３０１０
計算値：５３３．２９７５（Ｃ２７Ｈ４１Ｎ４Ｏ７）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
末端吸収
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
３２８４、２９６６、１７２９、１６３１、１５４８、１３９２、１２３１
１Ｈ―ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）中、５００ＭＨｚで測定したスペクトルを図４に示す。
１３Ｃ―ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）中、１２５ＭＨｚで測定したスペクトルを図５に示す。
溶解性：ヘキサンに不溶、水、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
これらから化合物ＳＰＦ−１８８４５−２の構造式は、ＳＰＦ−１８８４５−１の立体異性体であると決定した。
【００３２】
また、化合物ＳＰＦ−１８８４５−３の物理化学的性状は以下のようであった。
【表３】
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
外観：白色粉末
分子量：５３４
分子式：Ｃ２７Ｈ４２Ｎ４Ｏ７
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：５３５（Ｍ＋Ｈ）＋
高速電子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：５３３（Ｍ−Ｈ）−
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：
実測値：５３５．３１２３
計算値：５３５．３１３２（Ｃ２７Ｈ４３Ｎ４Ｏ７）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
末端吸収
赤外吸収スペクトルνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：
３２７８、２９６５、１６４４、１５４９、１３９４、１２３０
１Ｈ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
０．６２（３Ｈ，ｄ，７．０）、０．７６（３Ｈ，ｄ，６．４）、０．８０（３Ｈ，ｄ，６．７）、０．８３（３Ｈ，ｄ，６．７）、０．８６（３Ｈ，ｄ，７．０）、０．８８（３Ｈ，ｄ，７．０）、１．８１（１Ｈ，ｍ）、２．００（１Ｈ，ｍ）、２．１０（１Ｈ，ｍ）、２．６２（１Ｈ，ｄｄ，１３．６，８．２）、２．８２（１Ｈ，ｄｄ，１３．６，５．２）、２．９５（１Ｈ，ｄ，１５．０）、３．２２（１Ｈ，ｄｄ，１１．０，５．０）、３．２５（１Ｈ，ｄ，１５．０）、３．２９（１Ｈ，ｄｄ，１１．０，７．０）、３．７８（１Ｈ，ｔ，７．９）、３．８９（１Ｈ，ｍ）、３．９７（１Ｈ，ｄｄ，８．８，８．６）、４．１０（１Ｈ，ｄｄ，７．７，５．２）、４．７２（１Ｈ，ｂｒｓ）、７．２１（５Ｈ，ｂｒｓ）、７．４５（１Ｈ，ｄ，８．５）、７．９０（１Ｈ，ｄ，８．２）、８．３５（１Ｈ，ｄ，７．９）、８．６９（１Ｈ，ｂｒｓ）
１３Ｃ―ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：
１７．４４、１８．７５、１９．０８、１９．２１、１９．２４、１９．２７、２９．３７、２９．７６、２９．８４、３６．２７、４４．９５、５２．３３、５８．５３、５９．４７、５９．５１、６２．７６、１２５．７０、１２７．９３（２Ｃ）、１２９．０７（２Ｃ）、１３９．３６、１６９．３６、１７０．２３、１７０．５２、１７１．００、１７１．２３
溶解性：ヘキサンに不溶、水、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
これらから化合物ＳＰＦ−１８８４５−３の構造式を：
【化５】
【００３３】
実施例２
カテプシンＧ阻害活性の測定
カテプシンＧ阻害活性の測定には、ヒト好中球由来カテプシンＧ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製、カタログ番号１９１３４４）を用いた。基質としては、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＭＣＡ（式中、Ｓｕｃはスクシニル基を、ＭＣＡは４−メチルクマリン−７−イルアミノ基を表す。以下同じ。）（ペプチド研究所社製、カタログ番号３１１４−ｖ）を用いた。即ち、１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１．６Ｍ塩化ナトリウム、１００μＭＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＭＣＡ、１μｇ／ｍＬ ヒト好中球由来カテプシンＧおよびジメチルスルホキシド１．０μＬまたは供試阻害剤を含むジメチルスルホキシド１．０μＬを添加した反応系１００μＬで３７℃、１２０分間反応をおこなった。ヒト好中球由来カテプシンＧにより切断を受けて基質から遊離される７−アミノ−４−メチルクマリンの量を、励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍにおける蛍光強度を測定することで阻害活性を測定し、酵素活性を５０％阻害するのに要する阻害剤の濃度（ＩＣ５０）を求めた。結果は次の通りであった。
【表４】
実施例３
ヒトキマーゼ阻害活性の測定
ヒトキマーゼ阻害活性の測定には、ヒト皮膚由来キマーゼ（Ｅｌａｓｔｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔ社製、カタログ番号ＨＳ２１４）を用いた。基質としては、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＭＣＡ（ペプチド研究所社製、カタログ番号３１１４−ｖ）を用いた。即ち、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、３Ｍ塩化ナトリウム、１００μＭＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＭＣＡ、１５０ｎｇ／ｍＬ ヒト皮膚由来キマーゼおよびジメチルスルホキシド０．５μＬまたは供試阻害剤を含むジメチルスルホキシド０．５μＬを添加した反応系５０μＬで室温、５時間反応をおこなった。ヒト皮膚由来キマーゼにより切断を受けて基質から遊離される７−アミノ−４−メチルクマリンの量を、励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍにおける蛍光強度を測定することで阻害活性を測定し、酵素活性を５０％阻害するのに要する阻害剤の濃度（ＩＣ５０）を求めた。結果は次の通りであった。
【表５】
【発明の効果】
前記式（１）で表される化合物またはその塩は、セリンプロテアーゼ阻害活性を有し、前凝固、高血圧症、心不全、虚血性末梢循環障害、心筋虚血、静脈機能不全、心筋梗塞後の心不全進行、糖尿病性腎症、腎炎、動脈硬化症、高アルドステロン症、強皮症、糸球体硬化症、腎不全、アルツハイマー病、記憶欠乏症、うつ病、知覚機能障害、不安、緊張症状、不快精神状態、緑内障、高眼圧症、ＰＴＣＡ後再狭窄、喘息、鼻炎、またはアレルギー性疾患の治療剤として有用である。
【００３６】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＳＰＦ−１８８４５−１の１Ｈ―ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す図である。
【図２】図２は、ＳＰＦ−１８８４５−１の１３Ｃ―ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す図である。
【図３】図３は、ＳＰＦ−１８８４５−１のエレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量スペクトル（ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）で観測されたフラグメントイオンを示す図である。
【図４】図４は、ＳＰＦ−１８８４５−２の１Ｈ―ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す図である。
【図５】図５は、ＳＰＦ−１８８４５−２の１３Ｃ―ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す図である。
Claims (7)
- 式（１）
で表される化合物またはその塩。 - フォーマ属に属する、請求項１記載の化合物またはその塩生産菌を培養して、その培養物から請求項１記載の化合物またはその塩を採取する、請求項１記載の化合物またはその塩の製造方法。
- フォーマ属に属する、請求項１記載の化合物またはその塩の生産菌がフォーマ・エスピー（Ｐｈｏｍａ ｓｐ．）ＳＰＦ−１８８４５株である、請求項２記載の製造方法。
- フォーマ・エスピー（Ｐｈｏｍａ ｓｐ．）ＳＰＦ−１８８４５株。
- 請求項１記載の化合物またはその塩を有効成分として含有するセリンプロテアーゼ阻害剤。
- セリンプロテアーゼが、カテプシンＧおよびキマーゼからなる群から選ばれる酵素である、請求項５記載のセリンプロテアーゼ阻害剤。
- 請求項１記載の化合物またはその塩を含有する、前凝固、高血圧症、心不全、虚血性末梢循環障害、心筋虚血、静脈機能不全、心筋梗塞後の心不全進行、糖尿病性腎症、腎炎、動脈硬化症、高アルドステロン症、強皮症、糸球体硬化症、腎不全、アルツハイマー病、記憶欠乏症、うつ病、知覚機能障害、不安、緊張症状、不快精神状態、緑内障、高眼圧症、ＰＴＣＡ後再狭窄、喘息、鼻炎、またはアレルギー性疾患の治療剤。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA012440B1 (ru) * | 2005-04-29 | 2009-10-30 | Зе Риджентс Оф Зи Юнивесити Оф Кэлифонье | Пептид, композиция на его основе для лечения патологий, связанных c воспалительными процессами |
-
2002
- 2002-08-06 JP JP2002228810A patent/JP2004067583A/ja active Pending
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| EA012440B1 (ru) * | 2005-04-29 | 2009-10-30 | Зе Риджентс Оф Зи Юнивесити Оф Кэлифонье | Пептид, композиция на его основе для лечения патологий, связанных c воспалительными процессами |
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