JP2004065242A - 生体関連物質マイクロアレイ及びそれを用いた植物の品種判別法 - Google Patents

Abstract

【課題】近縁の品種であっても判別可能であり、安全性も高く、かつ簡便に操作できる検出手段及び検出方法を提供する。
【解決手段】検出手段としては、植物の品種識別可能なオリゴヌクレオチドが保持されたマイクロアレイを使用する。特に、繊維に植物の品種識別可能なオリゴヌクレオチドが保持され、該繊維の複数本を集束固定された繊維集束固定物を、繊維の長手方向に交叉する方向で切断することで得られるマイクロアレイが好ましく、更に生体関連物質マイクロアレイを構成する繊維は、中空繊維であることが好ましい。また、オリゴヌクレオチドは、ゲルを介して保持されていることが好ましい。

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡの多型に基づく穀類の品種判別に利用できるマイクロアレイに関する。
【０００２】
【従来の技術】
食物原料となる植物の品種判別に関して、遺伝子レベルでの解析が行われつつある。特に小麦、とうもろこし、米などの穀類、大豆、小豆などの豆類、馬鈴薯、さつまいもなどの野菜等の品種判別に応用されてきている。遺伝子レベルでの品種判別の方法として、ＲＡＰＤ法（Ｒａｐｉｄ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ＤＮＡ　ｍｅｔｈｏｄ）と呼ばれる識別の対象となる遺伝子をランダムプライマー存在下、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅し、その電気泳動パターンにより遺伝子の塩基配列の相違を検出する方法が例示できる（特許文献１参照）。この方法は、馬鈴薯、大麦等で適用例が報告されているが、近縁の品種同士の判別は困難とされてきた。
【０００３】
近年、遺伝子組換え食品の流通、新食糧法の施行などから、近縁間の品種判別が求められている。特に、米の品種判別に関しては、新食糧法の施行に伴い、精米の品種、産地、産年の表示が義務づけられるようになった。また、社会の良食嗜好に伴い、さまざまな品種改良が行われ、近縁多種の精米が市場に流通するようになった。よって、近縁の品種間であっても、容易に品種の特定が可能な品種判別方法が求められている。
【０００４】
近縁品種でも判別可能な分析方法としては、例えば、品種間の遺伝子のわずかな相違を捉えることが可能なオリゴヌクレオチドを選定し、それらをプライマーとして、ＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅し、電気泳動パターンの比較により判別する方法が挙げられる（非特許文献１）。
【０００５】
しかし、この方法は、電気泳動パターンの比較により品種を判別するため、エチジウムブロマイド等の発ガン性の高い試薬を使用するという問題点があった。また、品種特異性のあるプライマーのセットの数だけＰＣＲ操作が必要となる。複数のプライマーのセットを一度にＰＣＲ反応にかけることも可能であるが、ＰＣＲ産物の分子量が近いプライマーセットを一度にＰＣＲすると、バンドの識別が難しくなるという問題点があった。
【０００６】
更に、米などでは、記載されている品種と異なる品種が故意に混入されてる場合があり、異なる品種の特定及び混入比の推定が簡便に行える技術が求められていた。
【０００７】
【特許文献１】
特開２０００−２８７６９１号公報
【０００８】
【非特許文献１】
日本食品化学工学会誌　４６（３）　１１７−１２２　（１９９９）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、近縁の品種であっても判別可能であり、安全性も高く、かつ簡便に操作できる技術及び異なる品種の混合比の推定が簡便に行える技術を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意検討を行った結果、植物の品種識別可能なオリゴヌクレオチドが保持された、マイクロアレイを使用することにより、従来の方法に比べ、安全性も高く、かつ簡便に品種の判別及び混合比の特定が可能となることを見出し本発明にいたった。
【００１１】
すなわち、本発明は、植物の品種識別可能なオリゴヌクレオチドが保持されたマイクロアレイおよび混合比の推定方法に関する。
【００１２】
マイクロアレイとしては、繊維の複数本を集束固定された繊維集束固定物を、繊維の長手方向に交叉する方向で切断することで得られるマイクロアレイが好ましく、更に生体関連物質マイクロアレイを構成する繊維は、中空繊維であることが好ましい。また、オリゴヌクレオチドは、ゲルを介して保持されていることが好ましい。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明は、本発明は、植物の品種識別可能なオリゴヌクレオチドが保持されたマイクロアレイである。
【００１４】
本発明において、「マイクロアレイ」とは、リソグラフィー技術を応用して区画化されたセル状にＤＮＡ合成を行ったもの（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１　７６７〜７７３）、ガラス等の固体表面を化学的又は物理的に修飾した基盤上にＤＮＡをスポッティング固定化したもの［Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７０，　４６７−４７０（１９９５）］，基盤上に溝又は穴で区画を形成し、該区画の内壁にプローブを固定化したもの、（特開平１１−１０８９２８号）、チップに固定化するＤＮＡの量を多くするために、アクリルアミド等のゲルにＤＮＡを固定化したものなどが例示できる。
【００１５】
特に、繊維に植物の品種識別可能なオリゴヌクレオチドが保持され、該繊維の複数本を集束固定された繊維集束固定物を、繊維の長手方向に交叉する方向で切断することで得られるマイクロアレイが、生産性の観点から好ましい。
【００１６】
以下、繊維を利用したマイクロアレイについて、詳細に説明する。
【００１７】
本発明において、繊維には、直接又は間接的に、植物の品種識別可能なオリゴヌクレオチドが保持される。繊維の材質としては、合成繊維、半合成繊維、再生繊維、及び無機繊維のごとき化学繊維等が挙げられる。
【００１８】
合成繊維の代表例としては、ナイロン６、ナイロン６６、芳香族ポリアミド等のポリアミド系の各種繊維、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等のポリエステル系の各種繊維、ポリアクリロニトリル等のアクリル系の各種繊維、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン系の各種繊維、ポリビニルアルコール系の各種繊維、ポリ塩化ビニリデン系の各種繊維、ポリ塩化ビニル系繊維、ポリウレタン系の各種繊維、フェノール系繊維、ポリフッ化ビニリデンやポリテトラフルオロエチレン等からなるフッ素系繊維、ポリアルキレンパラオキシベンゾエート系繊維、ポリメチルメタクリレートなどの（メタ）アクリル系樹脂を用いた繊維等が挙げられる。
【００１９】
半合成繊維の代表例としては、ジアセテート、トリアセテート、キチン、キトサン等を原料としたセルロース系誘導体系各種繊維、プロミックスと呼称される蛋白質系の各種繊維などが挙げられる。
【００２０】
再生繊維の代表例としては、ビスコース法や銅−アンモニア法、あるいは有機溶剤法により得られるセルロース系の各種再生繊維（レーヨン、キュプラ、ポリノジック等）などが挙げられる。無機繊維の代表例としては、ガラス繊維が挙げられる。
【００２１】
オリゴヌクレオチドの保持方法としては、繊維とオリゴヌクレオチドとの間における各種化学的又は物理的な相互作用、すなわち繊維が有している官能基と、オリゴヌクレオチドを構成する成分との間の化学的又は物理的な相互作用を利用することができる。
【００２２】
無修飾の核酸を繊維に固定化する場合には、オリゴヌクレオチドと繊維とを作用させた後、ベーキングや紫外線照射により固定できる。また、アミノ基で修飾されたオリゴヌクレオチドを繊維に固定化する場合には、グルタルアルデヒドや１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等の架橋剤を用いて繊維の官能基と結合させることができる。さらに、例えば熱処理、アルカリ処理、界面活性剤処理などを行うことにより、固定化されたオリゴヌクレオチドを変成させる、あるいは、細胞、菌体などの生材料から得られたオリゴヌクレオチドを使用する場合は、不要な細胞成分などを除去するといった処理を行うこともできる。
【００２３】
また、ゲルを介してオリゴヌクレオチドを保持することもできる。「ゲルを介して」とは、ゲル前駆体溶液にオリゴヌクレオチドを混合し、ゲル化反応を行うことにより、オリゴヌクレオチドがゲルに包括している状態、ゲル前駆体と化学修飾したオリゴヌクレオチドを共重合することにより、ゲルと共有結合により固定されている状態をいう。
【００２４】
「化学修飾したオリゴヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチドに反応性官能基が導入されたものをいう。例えばオリゴヌクレオチドの末端に活性エチレン基が導入されたものである。そのオリゴヌクレオチドは、アクリルアミド等のモノマーとの共重合することが可能である。
【００２５】
上記のゲルは、中実繊維であれば、その外周及び／又は多孔質部に保持される。中空繊維であれば、中空部及び／又は多孔質部に保持される。中空繊維を使用した場合、中実繊維と比較してゲルの保持体積を増加させることができる。また、ゲルの使用は、ゲルが３次構造である故、単位面積あたりのオリゴヌクレオチドの保持量が増加する。よって、オリゴヌクレオチドの保持はゲルを介して行うことが好ましい。
【００２６】
本発明において、「植物の品種識別可能なオリゴヌクレオチド」とは、品種間の遺伝子のわずかな相違を捉えることが可能なオリゴヌクレオチドをいう。具体的には、表１に示すオリゴヌクレオチドである。
【００２７】
ここでは、植物の品種判別が可能なオリゴヌクレオチドを例示する。
【００２８】
＜表１＞

これらのオリゴヌクレオチドの各々は、上述の方法に従い繊維に保持される。それら複数の繊維は、繊維の長手方向と平行に配置することにより集束物を作成することができる。集束密度は、選択するオリゴヌクレオチドの種類（数）により適宜選択される。好ましくは、２〜１０，０００本／ｃｍ^２である。この集束物は樹脂等で固定され繊維集束固定物となる。
【００２９】
繊維集束固定物は、繊維の長手方向と交叉する方向で切断を繰り返すことにより薄片が得られる。この薄片はオリゴヌクレオチドが保持された繊維断片が規則的に配列したシート状物であり、米の品種識別が可能なマイクロアレイとして使用することができる。薄片を作成する際の切断手段としては、ミクロトーム、鋸、レーザー等が使用できる。切断手段は、繊維に保持されているオリゴヌクレオチドの安定性等を考慮して選択される。また、薄片の厚みは０．１〜５ｍｍ、好ましくは、０．３〜１ｍｍである。
【００３０】
上記は、繊維にオリゴヌクレオチドを保持してから、繊維集束固定物を作成し、薄片（マイクロアレイ）を作成する方法を説明したが、本方法の他に、繊維にオリゴヌクレオチドを保持する前に、繊維集束物を作成し、各繊維にオリゴヌクレオチドを保持し、薄片を作成する方法も例示できる。
【００３１】
それらの方法のいずれを選択するかは、繊維の種類、保持の方法、オリゴヌクレオチドの安定性等を考慮し選択することができる。
【００３２】
以下に、その薄片（マイクロアレイ）を使用した植物の品種識別法について、米の品種判別を例に説明する。
【００３３】
１．精米からのＤＮＡの抽出
品種判別の際に使用される精米としては、米の最小単位である１粒からＤＮＡを抽出することが好ましい。しかし、精米には発芽能力がなく、酵素活性が高い糠層もない。そのため１粒の精米から効率良くＤＮＡを抽出する方法に関しては、詳細な検討がなされている〔日本食品化学工学会誌　４６（４）　２５０−２５４　（１９９９）〕。
【００３４】
本発明においても、ＩＳＯＰＬＡＮＴ法（ニッポンジーン）、ＦａｓｔＤＮＡ　Ｋｉｔ　Ｈ（ＢＩＯ　１０１）等を使用し、ＤＮＡの抽出を実施することができる。
【００３５】
２．マイクロアレイに保持するオリゴヌクレオチドの選択
プローブとして使用するオリゴヌクレオチドとしては、前記、表１に例示した品種特異性のあるオリゴヌクレオチドまたは相補な配列のものを選択する。
【００３６】
選択したオリゴヌクレオチドは前記方法に従い、繊維に保持されマイクロアレイが作成される。
【００３７】
３．抽出したＤＮＡの増幅
精米から抽出したＤＮＡを品種特異性のあるプライマーでＰＣＲを行う。この際、ＰＣＲ産物には蛍光色素を導入させる。蛍光色素としては、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＲＩＴＣ（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）等を使用することができる。蛍光色素の導入方法は、例えばプライマーの末端に蛍光色素を導入させたものを用いてＰＣＲする方法、ＰＣＲの際に蛍光色素をランダムに取り込む方法などである。
【００３８】
品種特異性のあるプライマーを用いているため、抽出したＤＮＡがプライマーの品種と合致していなければＤＮＡは増幅されず、品種が同じ場合のみＤＮＡが増幅される。
【００３９】
４．品種判別
ＰＣＲ産物をマイクロアレイに作用させ、ハイブリダイゼーションおよび洗浄を行う。検出は、蛍光顕微鏡などの蛍光が測定できる装置であれば特に限定されない。仮に品種Ａという米のＤＮＡを抽出し、ＰＣＲしたサンプルをハイブリダイゼーションさせた場合は、品種Ａに特異性のあるプライマー（またはそれと相補な配列の）オリゴヌクレオチドが保持されたスポットの蛍光強度が他のスポットよりも高くなる。
【００４０】
試料である精米中に異なる品種が混合している場合は、上述の方法に従い、その混合比を推定することができる。
【００４１】
【実施例】
以下、本発明の一形態を実施例に従って説明する。
【００４２】
＜実施例１＞
１．繊維配列体の調製
直径０．３２ｍｍの孔が５ｍｍ^２四方に０．５ｍｍピッチで縦横各１０列に合計１００個配列された、厚さ０．１ｍｍの多孔板２枚を用い、その多孔板の全ての孔に、カーボンブラックを２．０質量％含有したポリカーボネート中空繊維（外径０．２９ｍｍ、内径０．１８ｍｍ、長さ６００ｍｍ）１００本を通過させることにより中空繊維配列体を得る。
【００４３】
２枚の繊維ガイド多孔板の間隔を５０ｍｍとし、その間をポリウレタン樹脂（日本ポリウレタン工業社製）により固定化することにより、両端に樹脂で固定化されない部分を有する中空繊維配列ブロックを得る。
【００４４】
２．オリゴヌクレオチドのビニル化
表１記載のオリゴヌクレオチドに相補な配列のオリゴヌクレオチドを合成する。
【００４５】
オリゴヌクレオチドの合成は、ＰＥバイオシステムズ社のＤＮＡ自動合成機ＤＮＡ／ＲＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ｍｏｄｅｌ１３９４）を用いて行い、ＤＮＡ合成の最終ステップで、アミノリンクＩＩ（商標名）（アプライドバイオシステム社）を用いて、それぞれのオリゴヌクレオチドの５’末端にアミノ機を導入したオリゴヌクレオチドを合成する。無水メタクリル酸を溶解した炭酸ナトリウム水溶液とＤＭＳＯの混合液に合成したオリゴヌクレオチドを添加し、室温で２時間反応させ、ビニル基が導入されたオリゴヌクレオチドプローブを合成する。
【００４６】
３．マイクロアレイの製造
水溶液Ａを上記中空繊維配列ブロックを構成する各中空繊維内部に導入する。
【００４７】
水溶液Ａが各中空糸内部に導入された中空繊維配列ブロックを、内部が水蒸気で飽和された密閉ガラス容器に移し、７０℃で４時間放置することにより重合反応を行う。水溶液Ａで使用するオリゴヌクレオチドは、２．で合成した末端にビニル基が導入されたオリゴヌクレオチドである。
【００４８】
水溶液Ａ：
アクリルアミド　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４．５質量部
メチレンビスアクリルアミド　　　　　　　　　　　　　　０．５質量部
２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩　０．１質量部
オリゴヌクレオチド　　　　　　　　　　　　　　　　０．００５質量部
上記のごとく得られた中空繊維配列ブロックを、ミクロトームを使用し、薄片化する。得られる薄片は５００μｍ程度である。
【００４９】
次に、精米からＤＮＡを抽出する。抽出方法は、ＩＳＯＰＬＡＮＴ法（ニッポンジーン）又はＦａｓｔ　ＤＮＡ　Ｋｉｔ　Ｈ（ＢＩＯ　１０１）を使用する。、抽出したＤＮＡを鋳型とし、品種特異性のあるオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、ＰＣＲ反応を行う。
【００５０】
この時、ＰＣＲ産物に蛍光色素を標識する。
【００５１】
次に、薄片をハイブリダイゼーション用のバッグに入れ、以下の組成からなるハイブリダイゼーション溶液を注ぎ込み、５５℃で３０分間プレハイブリダイゼーションを行う。蛍光色素標識したＤＮＡを加え、５５℃で１５時間ハイブリダイゼーションを行う。その後、室温において一次洗浄用の溶液で３０分間、さらに、５５℃において二次洗浄用の溶液で３０分間洗浄を行う。
【００５２】
（溶液の組成）
プレハイブリダイゼーション溶液：５×ＳＳＣ　０．５％ＳＤＳ　（１ｍｌ）
ハイブリダイゼーション溶液：５×ＳＳＣ　０．５％ＳＤＳ　（１００μｌ）
一次洗浄用溶液：２×ＳＳＣ　０．１％ＳＤＳ　　（５ｍｌ）
二次洗浄用溶液：０．２×ＳＳＣ　０．１％ＳＤＳ　　　（５ｍｌ）
洗浄の後、蛍光顕微鏡にて観察を行う。
【００５３】
品種Ａに特異性のあるプライマーを用いてＰＣＲした鋳型ＤＮＡ（米から抽出したＤＮＡ）が品種Ａであれば、ＤＮＡは増幅される。検体と繊維配列体薄片をハイブリダイゼーションさせると、品種Ａに特異性のあるオリゴヌクレオチドが固定化されているスポットの蛍光強度が他のスポットよりも高くなる。
【００５４】
【配列表】

【００５５】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
【００５６】
【発明の効果】
マイクロアレイを用いた、植物の品種判別を行う事により、従来技術よりも安全にかつ簡便に判定を行う事が可能となった。

Claims (6)

1. 植物の品種識別可能なオリゴヌクレオチドが保持された、生体関連物質マイクロアレイ。
2. 植物が穀類である請求項１記載のマイクロアレイ。
3. マイクロアレイが複数本の繊維が集束固定された繊維集束固定物を繊維の長手方向に交叉する方向で切断することで得られるものである請求項１又は２記載のマイクロアレイ。
4. 繊維が中空繊維である請求項３記載のマイクロアレイ。
5. オリゴヌクレオチドがゲルを介して保持されている請求項１〜４のいずれかに記載のマイクロアレイ。
6. 以下の（１）〜（５）の工程を含む２種以上の品種が混合されているサンプルの混合比を推定する方法。
   （１）サンプルからＤＮＡを抽出する工程、
   （２）品種特異的な配列を含むＤＮＡを増幅する工程、
   （３）請求項１〜５のいずれかに記載のマイクロアレイに増幅産物を供する工程、
   （４）シグナルを検出する工程、
   （５）シグナルの強度から混合比を算出する工程。