JP2004016014A - 特定微生物の数を自動判別する装置 - Google Patents
特定微生物の数を自動判別する装置 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004016014A JP2004016014A JP2002171629A JP2002171629A JP2004016014A JP 2004016014 A JP2004016014 A JP 2004016014A JP 2002171629 A JP2002171629 A JP 2002171629A JP 2002171629 A JP2002171629 A JP 2002171629A JP 2004016014 A JP2004016014 A JP 2004016014A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sample
- fluorescent
- labeled probe
- specific
- fluorescence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
【課題】特定微生物に特異的に結合する蛍光標識プローブと検査試料とのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより調製した検体に対し、その蛍光を自動で連続的に計測する事により、様々な種類の微生物を検出対象とすることができ、迅速簡便に特定微生物の数を判別する事。
【解決手段】蛍光標識プローブを特異的な核酸（ＲＮＡ）などにＦＩＳＨ法によって標識し、その蛍光物質に対応した励起光を各種バンドパスフィルターを用いて励起波長を選択したのち、レンズなどで集光し、光ファイバーなどを通すことによって、該検体に照射を行い、蛍光標識プローブ由来の検体からの蛍光強度をＸＹステージ上に配置した、光電子増倍管などの受光手段を走査させることにより、検体全体をセンシングすることで特定微生物の数などを演算し自動判別する装置。
【選択図】図１
【解決手段】蛍光標識プローブを特異的な核酸（ＲＮＡ）などにＦＩＳＨ法によって標識し、その蛍光物質に対応した励起光を各種バンドパスフィルターを用いて励起波長を選択したのち、レンズなどで集光し、光ファイバーなどを通すことによって、該検体に照射を行い、蛍光標識プローブ由来の検体からの蛍光強度をＸＹステージ上に配置した、光電子増倍管などの受光手段を走査させることにより、検体全体をセンシングすることで特定微生物の数などを演算し自動判別する装置。
【選択図】図１
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、食品や環境分野等での微生物検査において様々な種類の微生物を検出対象にでき、特定微生物の数を特異的に判断する計測装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、食品や環境分野等での微生物検査は、培養法により行われ、試料の一定量を寒天培地上で少なくとも１日以上培養し、形成されたコロニーを肉眼で計測するのが一般的である。また、培養の時に選択的な培地を使うことにより、各種の微生物をそれぞれ特異的にコロニー形成させることもできるが、結果判定は目視による検査が主流である。本出願人らは、目視の検査ではなく、自動でコロニー数を計測可能な装置として、特許第３０２６９０２号の様な方法を考案している。
しかし、この方法では、形成されたコロニー数は自動的に判別可能であるが、場合によっては、検出分解能までの培養が必要になり迅速な方法ではなく、また、検出する微生物を特定したコロニー数の判別は困難であった。
【０００３】
近年、蛍光標識プローブを用いるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより試料中の検出対象微生物を迅速に検出する方法が開発された（Ａｍａｎｎ， Ｒ．， Ｓｎａｉｄｒ， Ｊ．， Ｗａｇｎｅｒ， Ｍ．， Ｌｕｄｗｉｇ， Ｗ． ａｎｄ Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ， Ｋ．−Ｈ． （１９９６） Ｉｎ ｓｉｔｕ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ ｈｉｇｈ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ａ ｎａｔｕｒａｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７８， ３４９６−３５００． ）。この方法は試料懸濁液をスライドガラスに数μｌ載せ、固定化処理後スライドガラス上で、検出対象微生物中の核酸に存在する特定微生物に特異的塩基配列に対して相補的な配列からなる化学物質に蛍光物質を標識したプローブを用いるｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションを行って検体を調製する。次に蛍光顕微鏡を用いて検体を観察し、特定微生物を蛍光標識プローブ由来の蛍光シグナルを有する微生物として検出するもので、試料中の様々な微生物を検出対象にでき、培養せずに特定微生物の数を迅速に測定できる。一方、試料懸濁液をメンブレンフィルター（ポアサイズ：０．４５μｍ以下）で濾過して微生物をメンブレンフィルター上に捕捉し、次に、このメンブレンフィルターを寒天培地にのせ数時間培養して、これを固定化処理し、このメンブレンフィルター上で蛍光標識プローブを用いるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより試料中の特定微生物を検出する方法も報告されている（Ｂｏｈｎｅｒｔ， Ｊ．， Ｈｕｂｎｅｒ， Ｂ． ａｎｄ Ｂｏｔｚｅｎｈａｒｔ， Ｋ．． （２０００） Ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ２３Ｓ ｒＲＮＡ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｙｇｉｅｎｅ ａｎｄ
Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ ２０３， ７７−８２．）。この場合、培養によりメンブレンフィルター上に微生物のマイクロコロニーが形成されることから蛍光標識プローブ由来の蛍光シグナルがより明るくかつその面積が大きくなり特定微生物の検出感度が高くなる。
【０００４】
これまで、蛍光標識プローブは、ＤＮＡから合成されてきたが、最近、ＰＮＡからなる蛍光標識プローブを用いるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる迅速微生物検出手法も報告されている（Ｐｒｅｓｃｏｔｔ， Ａ．Ｍ． ａｎｄ Ｆｒｉｃｋｅｒ， Ｃ．Ｒ． （１９９９） Ｕｓｅ ｏｆ ＰＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｉｎ ｗａｔｅｒ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ １３， ２６１−２６８．）。従って、前記化学物質はＤＮＡまたはＰＮＡのいずれでもよい。
【０００５】
次に、プローブのターゲットとなる核酸をｒＲＮＡとした場合、各種の微生物に対しそれぞれ特異的に検出することのできる蛍光標識プローブを比較的簡単に設計することができ、これら蛍光標識プローブを用いることで各種の微生物をそれぞれ特異的に検出することが出来る。例えば、大腸菌の特異的塩基配列がｒＤＮＡ塩基配列から見出され、この塩基配列から蛍光標識プローブを設計し、これを用いるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより大腸菌をそれぞれ特異的に検出することができることが報告されている。また、本出願人らは、特開２００１−１３６９６９号において、腸内細菌のｒＤＮＡ中に腸内細菌のみに特異的な塩基配列を見出し、この塩基配列に対し相補的塩基配列を有するオリゴヌクレオチドに蛍光物質を標識した腸内細菌検出用プローブを発明し、腸内細菌の核酸と同プローブが腸内細菌の核酸とハイブリッドすることを特徴とする腸内細菌の迅速な検出方法を考案している。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従来の方法では、肉眼で計測するために少なくとも１日以上培養しなければならない場合や、コロニー数の自動計測装置を使っても各種の微生物の特異的検出まではできないという問題がある。一方、核酸またはＰＮＡに蛍光物質を標識して合成したプローブを用いるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより試料中の特定微生物を検出する方法を実施するためには従来、蛍光顕微鏡を利用するしか手段はなく、機械化が進んでいるとは言えない。また、蛍光顕微鏡の購入には高額な費用が発生し、さらに、この手法をルーチンで行うにあたり、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション後、検体の全面を蛍光顕微で観察する必要があるが、検査作業員が実施するにはその観察に極めて手間がかかり眼精疲労などを伴う労働負荷の大きい作業となる。従って、食品加工業での微生物検査にこの方法を導入することは難しく従来の培養法に頼っているのが現状である。しかしながら、近年、食品や環境分野などの衛生検査は極めて重要であり、より簡便に微生物数や微生物の種類を判別できる装置が望まれている。そこで、本発明は、特定微生物に特異的に結合する蛍光標識プローブと検査試料とのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより調製した検体に対し、その蛍光を自動で連続的に計測する事により、様々な種類の微生物を検出対象とすることができ、迅速簡便に特定微生物の数を判別する事を目的としたものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本出願人らは、前記の課題を解決するために、各種の研究、試作、調査を行い本発明を完成させた。
本発明の第１によれば、特定微生物の核酸の中に存在する特異的塩基配列に対して相補的塩基配列を有する化学物質に蛍光物質で標識したものを蛍光標識プローブとし、
該蛍光標識プローブと検査対象試料とをｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションして調製したものを検体とし、キセノンランプやハロゲンランプなどを用いた光源部からレンズを使って集光し、集光した光源を選択的なバントパスフィルターを通す構造とすることにより、該蛍光標識プローブに標識した蛍光物質に対応した励起光を作り出し、その励起光を検体に照射し、該検体からの反射光を含む蛍光を特定の波長の蛍光のみ通過させるバンドパスフィルターを通過させ、バンドパスフィルターを通過した蛍光を受光部でその強度を受光手段により検出することで特定微生物の数を自動判別するものである。該蛍光標識プローブに標識する蛍光物質は、例えばＦＩＴＣやＴＡＭＲＡなどを用いることができる。蛍光の強度によって、微生物の数を判断することができ、該蛍光標識プローブの塩基配列を、測定したい微生物に特異的な配列の相補的配列とすることにより様々な種類の微生物を検出対象とすることができ、迅速簡便に特定微生物の数を判別することができる。
【０００８】
また、本発明の第２によれば、特定微生物の核酸の中に存在する特異的塩基配列に対して相補的塩基配列を有する化学物質に蛍光物質で標識したものを蛍光標識プローブとし、該蛍光標識プローブと検査対象試料とをｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションして調製したものを検体とし、該蛍光標識プローブ由来の該検体からの蛍光を検出する装置において、該検体に照射する励起光の照射面積が、少なくとも微生物１細胞の面積以上の大きさを持つように構成し、励起光照射部、受光部及び検体積載部の少なくとも一つが、相対的に繰り返し移動することで検体全体の蛍光強度を計測するように構成したものである。このため、培養をしなくとも、検出対象全体の微生物の数や種類が判別できるものである。尚、必要に応じ、検査試料をメンブレンフィルター上で数時間程度の平板寒天培養を行い、形成されたマイクロコロニーとプローブとをｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションしたものを検体としても良く、この場合、さらに判別精度が向上する。
【０００９】
また、本発明の第３によれば、特定微生物の核酸の中に存在する特異的塩基配列に対して相補的塩基配列を有する化学物質に蛍光物質で標識したものを蛍光標識プローブとし、該蛍光標識プローブと検査対象試料とをｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションして調製したものを検体とし、該蛍光標識プローブ由来の検体からの蛍光を検出する装置において、受光部から得られた情報を、積算する積算装置もしくは、グルーピング後に２値化する２値化演算装置をもつことにより判別を行うものである。受光部から得られた情報を積算した場合、検出対象の全体の量が判断され、演算によって、微生物の数を判別する事が可能であり、受光部から得られた情報をグルーピング後の２値化を行い、それをカウンティングすることによっても、微生物の数を判別する事ができる。
【００１０】
また、化学物質としてＤＮＡを用いることで、特定の微生物を検出するための蛍光標識プローブを作製することができ、特定微生物の数を自動判別する装置が得られる。
【００１１】
また、化学物質としてＰｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＰＮＡ）を用いることで、特定の微生物を検出するための蛍光標識プローブを作製することができ、特定微生物の数を自動判別する装置が得られる。
【００１２】
また、核酸をＲＮＡとすることで蛍光標識プローブを特定微生物に結合させることができ、特定微生物の数を自動判別する装置が得られる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
第１図は、本発明の構成ブロック図である。１の光源部にから出された光は、１２の集光レンズによって集光される。集光された光は、２の光ファイバーによって伝達され、３の第１のバンドパスフィルターによって必要な波長に選択される。必要な波長とは、８の検体の調製に用いる蛍光標識プローブに標識されている蛍光物質によって決定され、例えば、蛍光物質がＦＩＴＣであれば、励起光波長は４９０ｎｍであり、蛍光標識がＴＡＭＲＡであれば、励起光波長は５６０ｎｍである。必要な波長に選択された励起光は、６のハーフミラーを経由し、７の対物レンズを通り、検体に照射される。この時の対物レンズの倍率は、３０〜８０倍程度が望ましい。８の検体は、９のＸＹステージ上にあり、検出対象全面に励起光が照射されるように、８の検体を移動させるものである。８の検体に励起光を照射することにより、その反射光と検体中の特定微生物の核酸と蛍光標識プローブとのハイブリッド形成体から蛍光標識プローブに標識した蛍光物質由来の蛍光が発せられる。この蛍光を６のハーフミラーを経由し、４の第２のバンドパスフィルターによって、必要な波長に選択する。蛍光物質がＦＩＴＣの場合は蛍光波長は５２０ｎｍ、蛍光物質がＴＡＭＲＡの場合は蛍光波長は５８３ｎｍである。４の第２のバントパスフィルターを通過した蛍光は、５の受光部にて受光され蛍光強度として、１０の制御演算部に電気信号が送られる。尚、５の受光部は、いかなる受光素子でも構わないが光電子増倍管を用いるのが望ましい。１０の制御演算部は、９のＸＹステージを制御するとともに、５の受光部から得られた電気信号をもとに演算を行い、その結果を１１の表示部へ表示する。尚、演算結果は、１１の表示部へ表示する以外に、磁気記憶媒体に記録したり、紙に印字したりなどいかなる方法を取っても構わない。
【００１４】
第２図は、本発明に用いる検体の調製法として供試試料中の特定微生物の核酸に、検出対象微生物を特異的に検出する蛍光標識プローブをハイブリダイズすることについて説明するための図である。核酸としてＲＮＡとＤＮＡの２つがあるが、そのうちＲＮＡは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）の４つの塩基配列からなるものであり、アデニン（Ａ）にはウラシル（Ｕ）が、グアニ（Ｇ）にはシトシン（Ｃ）が結合し塩基対を作るものである。ＲＮＡとして例えばｒＲＮＡは全細菌において保存性の高い塩基配列のある領域とそれぞれの微生物の種類によって、特異的な塩基配列を持つ領域とがある。特定微生物に特異的な塩基配列に対し相補的塩基配列を有する核酸あるいはＰＮＡに蛍光物質を標識したプローブ（蛍光標識プローブ）を設計し、蛍光標識プローブと検査試料中の微生物とのｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションにより、特定微生物に蛍光標識プローブを特異的にハイブリッドさせることができる。１３は核酸としてＲＮＡの塩基配列の一例を示したものであり、１４は、そのＲＮＡの特異的な部分に結合させるための塩基配列を有するＤＮＡまたはＰＮＡに蛍光物質を標識した蛍光標識プローブである。第２図の様に核酸と蛍光標識プローブをハイブリッドさせたものを検体として扱うものである。この検体を図１記載装置に供するより、迅速簡便に細菌数や細菌の種類を判別することができる。
【００１５】
【実施例】
実際にいくらを人為的に大腸菌で汚染させた試料から５’末端をＴＡＭＲＡで標識しＤＮＡからなる腸内細菌用検出用プローブ（５’−ＴＧＣＴＣＴＣＧＣＧＡＧＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＴＴ−３’：特開２００１−１３６９６９）を用いて調製した検体に対し本発明の装置で腸内細菌数の計測を行った。対照に同試料から平板培養法による大腸菌の計測菌数を行い、両者の結果を比較した。すなわち、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＩＡＭ １２１１９Ｔ）を接種したいくら（試料１〜試料３）１０ｇをストマッカー用袋に採取し、これに９０ｍｌの滅菌生理食塩を加え試料１０倍希釈懸濁液を調製した。試料１０倍希釈懸濁液１０ｍｌを遠心分離（２０００ｒｐｍ×１分）し、その上清１ｍｌをアイソポアメンブレンフィルター（直径１３ｍｍ、ポアサイズ０．４５μｍ、日本ミリポア社）で濾過した。このフィルターをソイトリプト寒天平板培地に置き、３７℃、５時間培養してフィルター上にマイクロコロニーを形成させた。このフィルターを、エタノールを染みこませた濾紙に５分置き、細菌を固定させた。次に、このフィルターにハイブリダイゼーション溶液（０．９Ｍ 塩化ナトリウム、０．０１％ ＳＤＳ、２０％フォルムアミド、２０ｍＭ ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ ７．４））１００μｌ載せ、６０℃、３０分プレハイブリダイゼーションを行った後、前記腸内細菌用検出用プローブを５０ｐｍｏｌ添加し、６０℃、５分ハイブリダーゼーションを行った。尚、プローブはＤＮＡの代わりに蛍光物質で標識したＰＮＡから合成したものを用いてもよい。また、標識する蛍光物質はＦＩＴＣやＣｙ５など任意に用いることができる。次に、このフィルターをハイブリダイゼーション洗浄液（１８０ｍＭ 塩化ナトリウム、０．０１％ ＳＤＳ、２０ｍＭ ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ ７．４））２５ｍｌに６０℃、１５分浸して洗浄後、さらに蒸留水で洗浄してこれを検体とした。検体を本発明の装置に供し、腸内細菌の計測を行った。一方、培養法による大腸菌数の計測は、同試料１０倍希釈懸濁液からクロモカルトコリフォーム寒天培地（メルク社）を用いて平板培養を行った。３７℃、２４時間培養後、青紫のコロニー数を計測した。 結果を表１に示す。
【００１６】
試料１の場合は、大腸菌の培養法による目視による生菌数は５．５×１０Ｅ３であった所、本発明の装置による計測菌数では、４．５×１０Ｅ３であり、培養法による結果と比較すると９５％の整合性が取れている。以下、試料２では、１１３％の整合性、試料３では１０４％の整合性が取れている。以上のように、本発明の装置による計測菌数は、
従来の培養法や蛍光顕微鏡での方法とほぼ同じ結果が得られ、整合性があると判断できる。尚、試料中の菌数の結果を得るに要する時間は、試料に対し培養してマイクロコロニーを形成させるのに５時間、次にプローブをハイブリダイゼーションさせて検体を調製するのに約１時間、さらに検体の本発明の装置による計測に１検体あたり２０分となり、
全工程で６時間２０分となる。
【００１７】
【発明の効果】
以上の事から本発明の装置は、食品や環境分野等での微生物検査において様々な種類の微生物を検出対象とすることができ、特定微生物の数を特異的に計測することが迅速に簡便に行える点に効果がある。また高価な蛍光顕微鏡などに頼ることなく精度の良い判別ができるため、検査コストや生産コストの低減にも、多大な効果がある。
【００１８】
検体１の場合は、生菌数が目視で５．５×１０Ｅ３であり、蛍光顕微鏡では、
４．７×１０Ｅ３であった所、本発明の装置では、４．５×１０Ｅ３であり、
目視の場合と比較すると９５％の整合性が取れている。
以下、検体２では、１１３％の整合性、検体３では１０４％の整合性が取れて
いる。以上のように、本発明の装置では、従来の目視や蛍光顕微鏡での方法と
ぼぼ同じ結果が得られ、整合性があると判断できる。
【００１９】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の構成ブロック図である。
【図２】本発明において、核酸に特異的な蛍光標識を取り付ける事を説明するための図である。
【００２０】
【符号の説明】
１ 光源部
２ 光ファイバー
３ 第１のバンドパスフィルター
４ 第２のバンドパスフィルター
５ 光電子増倍管
６ ハーフミラー
７ 対物レンズ
８ 検体
９ ＸＹステージ
１０ 制御演算部
１１ 表示部
１２ 集光レンズ
１３ 核酸（ＲＮＡ）
１４ 蛍光標識プローブ
【産業上の利用分野】
本発明は、食品や環境分野等での微生物検査において様々な種類の微生物を検出対象にでき、特定微生物の数を特異的に判断する計測装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、食品や環境分野等での微生物検査は、培養法により行われ、試料の一定量を寒天培地上で少なくとも１日以上培養し、形成されたコロニーを肉眼で計測するのが一般的である。また、培養の時に選択的な培地を使うことにより、各種の微生物をそれぞれ特異的にコロニー形成させることもできるが、結果判定は目視による検査が主流である。本出願人らは、目視の検査ではなく、自動でコロニー数を計測可能な装置として、特許第３０２６９０２号の様な方法を考案している。
しかし、この方法では、形成されたコロニー数は自動的に判別可能であるが、場合によっては、検出分解能までの培養が必要になり迅速な方法ではなく、また、検出する微生物を特定したコロニー数の判別は困難であった。
【０００３】
近年、蛍光標識プローブを用いるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより試料中の検出対象微生物を迅速に検出する方法が開発された（Ａｍａｎｎ， Ｒ．， Ｓｎａｉｄｒ， Ｊ．， Ｗａｇｎｅｒ， Ｍ．， Ｌｕｄｗｉｇ， Ｗ． ａｎｄ Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ， Ｋ．−Ｈ． （１９９６） Ｉｎ ｓｉｔｕ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ ｈｉｇｈ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ａ ｎａｔｕｒａｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７８， ３４９６−３５００． ）。この方法は試料懸濁液をスライドガラスに数μｌ載せ、固定化処理後スライドガラス上で、検出対象微生物中の核酸に存在する特定微生物に特異的塩基配列に対して相補的な配列からなる化学物質に蛍光物質を標識したプローブを用いるｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションを行って検体を調製する。次に蛍光顕微鏡を用いて検体を観察し、特定微生物を蛍光標識プローブ由来の蛍光シグナルを有する微生物として検出するもので、試料中の様々な微生物を検出対象にでき、培養せずに特定微生物の数を迅速に測定できる。一方、試料懸濁液をメンブレンフィルター（ポアサイズ：０．４５μｍ以下）で濾過して微生物をメンブレンフィルター上に捕捉し、次に、このメンブレンフィルターを寒天培地にのせ数時間培養して、これを固定化処理し、このメンブレンフィルター上で蛍光標識プローブを用いるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより試料中の特定微生物を検出する方法も報告されている（Ｂｏｈｎｅｒｔ， Ｊ．， Ｈｕｂｎｅｒ， Ｂ． ａｎｄ Ｂｏｔｚｅｎｈａｒｔ， Ｋ．． （２０００） Ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ２３Ｓ ｒＲＮＡ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｙｇｉｅｎｅ ａｎｄ
Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ ２０３， ７７−８２．）。この場合、培養によりメンブレンフィルター上に微生物のマイクロコロニーが形成されることから蛍光標識プローブ由来の蛍光シグナルがより明るくかつその面積が大きくなり特定微生物の検出感度が高くなる。
【０００４】
これまで、蛍光標識プローブは、ＤＮＡから合成されてきたが、最近、ＰＮＡからなる蛍光標識プローブを用いるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる迅速微生物検出手法も報告されている（Ｐｒｅｓｃｏｔｔ， Ａ．Ｍ． ａｎｄ Ｆｒｉｃｋｅｒ， Ｃ．Ｒ． （１９９９） Ｕｓｅ ｏｆ ＰＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｉｎ ｗａｔｅｒ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ １３， ２６１−２６８．）。従って、前記化学物質はＤＮＡまたはＰＮＡのいずれでもよい。
【０００５】
次に、プローブのターゲットとなる核酸をｒＲＮＡとした場合、各種の微生物に対しそれぞれ特異的に検出することのできる蛍光標識プローブを比較的簡単に設計することができ、これら蛍光標識プローブを用いることで各種の微生物をそれぞれ特異的に検出することが出来る。例えば、大腸菌の特異的塩基配列がｒＤＮＡ塩基配列から見出され、この塩基配列から蛍光標識プローブを設計し、これを用いるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより大腸菌をそれぞれ特異的に検出することができることが報告されている。また、本出願人らは、特開２００１−１３６９６９号において、腸内細菌のｒＤＮＡ中に腸内細菌のみに特異的な塩基配列を見出し、この塩基配列に対し相補的塩基配列を有するオリゴヌクレオチドに蛍光物質を標識した腸内細菌検出用プローブを発明し、腸内細菌の核酸と同プローブが腸内細菌の核酸とハイブリッドすることを特徴とする腸内細菌の迅速な検出方法を考案している。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従来の方法では、肉眼で計測するために少なくとも１日以上培養しなければならない場合や、コロニー数の自動計測装置を使っても各種の微生物の特異的検出まではできないという問題がある。一方、核酸またはＰＮＡに蛍光物質を標識して合成したプローブを用いるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより試料中の特定微生物を検出する方法を実施するためには従来、蛍光顕微鏡を利用するしか手段はなく、機械化が進んでいるとは言えない。また、蛍光顕微鏡の購入には高額な費用が発生し、さらに、この手法をルーチンで行うにあたり、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション後、検体の全面を蛍光顕微で観察する必要があるが、検査作業員が実施するにはその観察に極めて手間がかかり眼精疲労などを伴う労働負荷の大きい作業となる。従って、食品加工業での微生物検査にこの方法を導入することは難しく従来の培養法に頼っているのが現状である。しかしながら、近年、食品や環境分野などの衛生検査は極めて重要であり、より簡便に微生物数や微生物の種類を判別できる装置が望まれている。そこで、本発明は、特定微生物に特異的に結合する蛍光標識プローブと検査試料とのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより調製した検体に対し、その蛍光を自動で連続的に計測する事により、様々な種類の微生物を検出対象とすることができ、迅速簡便に特定微生物の数を判別する事を目的としたものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本出願人らは、前記の課題を解決するために、各種の研究、試作、調査を行い本発明を完成させた。
本発明の第１によれば、特定微生物の核酸の中に存在する特異的塩基配列に対して相補的塩基配列を有する化学物質に蛍光物質で標識したものを蛍光標識プローブとし、
該蛍光標識プローブと検査対象試料とをｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションして調製したものを検体とし、キセノンランプやハロゲンランプなどを用いた光源部からレンズを使って集光し、集光した光源を選択的なバントパスフィルターを通す構造とすることにより、該蛍光標識プローブに標識した蛍光物質に対応した励起光を作り出し、その励起光を検体に照射し、該検体からの反射光を含む蛍光を特定の波長の蛍光のみ通過させるバンドパスフィルターを通過させ、バンドパスフィルターを通過した蛍光を受光部でその強度を受光手段により検出することで特定微生物の数を自動判別するものである。該蛍光標識プローブに標識する蛍光物質は、例えばＦＩＴＣやＴＡＭＲＡなどを用いることができる。蛍光の強度によって、微生物の数を判断することができ、該蛍光標識プローブの塩基配列を、測定したい微生物に特異的な配列の相補的配列とすることにより様々な種類の微生物を検出対象とすることができ、迅速簡便に特定微生物の数を判別することができる。
【０００８】
また、本発明の第２によれば、特定微生物の核酸の中に存在する特異的塩基配列に対して相補的塩基配列を有する化学物質に蛍光物質で標識したものを蛍光標識プローブとし、該蛍光標識プローブと検査対象試料とをｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションして調製したものを検体とし、該蛍光標識プローブ由来の該検体からの蛍光を検出する装置において、該検体に照射する励起光の照射面積が、少なくとも微生物１細胞の面積以上の大きさを持つように構成し、励起光照射部、受光部及び検体積載部の少なくとも一つが、相対的に繰り返し移動することで検体全体の蛍光強度を計測するように構成したものである。このため、培養をしなくとも、検出対象全体の微生物の数や種類が判別できるものである。尚、必要に応じ、検査試料をメンブレンフィルター上で数時間程度の平板寒天培養を行い、形成されたマイクロコロニーとプローブとをｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションしたものを検体としても良く、この場合、さらに判別精度が向上する。
【０００９】
また、本発明の第３によれば、特定微生物の核酸の中に存在する特異的塩基配列に対して相補的塩基配列を有する化学物質に蛍光物質で標識したものを蛍光標識プローブとし、該蛍光標識プローブと検査対象試料とをｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションして調製したものを検体とし、該蛍光標識プローブ由来の検体からの蛍光を検出する装置において、受光部から得られた情報を、積算する積算装置もしくは、グルーピング後に２値化する２値化演算装置をもつことにより判別を行うものである。受光部から得られた情報を積算した場合、検出対象の全体の量が判断され、演算によって、微生物の数を判別する事が可能であり、受光部から得られた情報をグルーピング後の２値化を行い、それをカウンティングすることによっても、微生物の数を判別する事ができる。
【００１０】
また、化学物質としてＤＮＡを用いることで、特定の微生物を検出するための蛍光標識プローブを作製することができ、特定微生物の数を自動判別する装置が得られる。
【００１１】
また、化学物質としてＰｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＰＮＡ）を用いることで、特定の微生物を検出するための蛍光標識プローブを作製することができ、特定微生物の数を自動判別する装置が得られる。
【００１２】
また、核酸をＲＮＡとすることで蛍光標識プローブを特定微生物に結合させることができ、特定微生物の数を自動判別する装置が得られる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
第１図は、本発明の構成ブロック図である。１の光源部にから出された光は、１２の集光レンズによって集光される。集光された光は、２の光ファイバーによって伝達され、３の第１のバンドパスフィルターによって必要な波長に選択される。必要な波長とは、８の検体の調製に用いる蛍光標識プローブに標識されている蛍光物質によって決定され、例えば、蛍光物質がＦＩＴＣであれば、励起光波長は４９０ｎｍであり、蛍光標識がＴＡＭＲＡであれば、励起光波長は５６０ｎｍである。必要な波長に選択された励起光は、６のハーフミラーを経由し、７の対物レンズを通り、検体に照射される。この時の対物レンズの倍率は、３０〜８０倍程度が望ましい。８の検体は、９のＸＹステージ上にあり、検出対象全面に励起光が照射されるように、８の検体を移動させるものである。８の検体に励起光を照射することにより、その反射光と検体中の特定微生物の核酸と蛍光標識プローブとのハイブリッド形成体から蛍光標識プローブに標識した蛍光物質由来の蛍光が発せられる。この蛍光を６のハーフミラーを経由し、４の第２のバンドパスフィルターによって、必要な波長に選択する。蛍光物質がＦＩＴＣの場合は蛍光波長は５２０ｎｍ、蛍光物質がＴＡＭＲＡの場合は蛍光波長は５８３ｎｍである。４の第２のバントパスフィルターを通過した蛍光は、５の受光部にて受光され蛍光強度として、１０の制御演算部に電気信号が送られる。尚、５の受光部は、いかなる受光素子でも構わないが光電子増倍管を用いるのが望ましい。１０の制御演算部は、９のＸＹステージを制御するとともに、５の受光部から得られた電気信号をもとに演算を行い、その結果を１１の表示部へ表示する。尚、演算結果は、１１の表示部へ表示する以外に、磁気記憶媒体に記録したり、紙に印字したりなどいかなる方法を取っても構わない。
【００１４】
第２図は、本発明に用いる検体の調製法として供試試料中の特定微生物の核酸に、検出対象微生物を特異的に検出する蛍光標識プローブをハイブリダイズすることについて説明するための図である。核酸としてＲＮＡとＤＮＡの２つがあるが、そのうちＲＮＡは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）の４つの塩基配列からなるものであり、アデニン（Ａ）にはウラシル（Ｕ）が、グアニ（Ｇ）にはシトシン（Ｃ）が結合し塩基対を作るものである。ＲＮＡとして例えばｒＲＮＡは全細菌において保存性の高い塩基配列のある領域とそれぞれの微生物の種類によって、特異的な塩基配列を持つ領域とがある。特定微生物に特異的な塩基配列に対し相補的塩基配列を有する核酸あるいはＰＮＡに蛍光物質を標識したプローブ（蛍光標識プローブ）を設計し、蛍光標識プローブと検査試料中の微生物とのｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションにより、特定微生物に蛍光標識プローブを特異的にハイブリッドさせることができる。１３は核酸としてＲＮＡの塩基配列の一例を示したものであり、１４は、そのＲＮＡの特異的な部分に結合させるための塩基配列を有するＤＮＡまたはＰＮＡに蛍光物質を標識した蛍光標識プローブである。第２図の様に核酸と蛍光標識プローブをハイブリッドさせたものを検体として扱うものである。この検体を図１記載装置に供するより、迅速簡便に細菌数や細菌の種類を判別することができる。
【００１５】
【実施例】
実際にいくらを人為的に大腸菌で汚染させた試料から５’末端をＴＡＭＲＡで標識しＤＮＡからなる腸内細菌用検出用プローブ（５’−ＴＧＣＴＣＴＣＧＣＧＡＧＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＴＴ−３’：特開２００１−１３６９６９）を用いて調製した検体に対し本発明の装置で腸内細菌数の計測を行った。対照に同試料から平板培養法による大腸菌の計測菌数を行い、両者の結果を比較した。すなわち、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＩＡＭ １２１１９Ｔ）を接種したいくら（試料１〜試料３）１０ｇをストマッカー用袋に採取し、これに９０ｍｌの滅菌生理食塩を加え試料１０倍希釈懸濁液を調製した。試料１０倍希釈懸濁液１０ｍｌを遠心分離（２０００ｒｐｍ×１分）し、その上清１ｍｌをアイソポアメンブレンフィルター（直径１３ｍｍ、ポアサイズ０．４５μｍ、日本ミリポア社）で濾過した。このフィルターをソイトリプト寒天平板培地に置き、３７℃、５時間培養してフィルター上にマイクロコロニーを形成させた。このフィルターを、エタノールを染みこませた濾紙に５分置き、細菌を固定させた。次に、このフィルターにハイブリダイゼーション溶液（０．９Ｍ 塩化ナトリウム、０．０１％ ＳＤＳ、２０％フォルムアミド、２０ｍＭ ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ ７．４））１００μｌ載せ、６０℃、３０分プレハイブリダイゼーションを行った後、前記腸内細菌用検出用プローブを５０ｐｍｏｌ添加し、６０℃、５分ハイブリダーゼーションを行った。尚、プローブはＤＮＡの代わりに蛍光物質で標識したＰＮＡから合成したものを用いてもよい。また、標識する蛍光物質はＦＩＴＣやＣｙ５など任意に用いることができる。次に、このフィルターをハイブリダイゼーション洗浄液（１８０ｍＭ 塩化ナトリウム、０．０１％ ＳＤＳ、２０ｍＭ ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ ７．４））２５ｍｌに６０℃、１５分浸して洗浄後、さらに蒸留水で洗浄してこれを検体とした。検体を本発明の装置に供し、腸内細菌の計測を行った。一方、培養法による大腸菌数の計測は、同試料１０倍希釈懸濁液からクロモカルトコリフォーム寒天培地（メルク社）を用いて平板培養を行った。３７℃、２４時間培養後、青紫のコロニー数を計測した。 結果を表１に示す。
試料１の場合は、大腸菌の培養法による目視による生菌数は５．５×１０Ｅ３であった所、本発明の装置による計測菌数では、４．５×１０Ｅ３であり、培養法による結果と比較すると９５％の整合性が取れている。以下、試料２では、１１３％の整合性、試料３では１０４％の整合性が取れている。以上のように、本発明の装置による計測菌数は、
従来の培養法や蛍光顕微鏡での方法とほぼ同じ結果が得られ、整合性があると判断できる。尚、試料中の菌数の結果を得るに要する時間は、試料に対し培養してマイクロコロニーを形成させるのに５時間、次にプローブをハイブリダイゼーションさせて検体を調製するのに約１時間、さらに検体の本発明の装置による計測に１検体あたり２０分となり、
全工程で６時間２０分となる。
【００１７】
【発明の効果】
以上の事から本発明の装置は、食品や環境分野等での微生物検査において様々な種類の微生物を検出対象とすることができ、特定微生物の数を特異的に計測することが迅速に簡便に行える点に効果がある。また高価な蛍光顕微鏡などに頼ることなく精度の良い判別ができるため、検査コストや生産コストの低減にも、多大な効果がある。
【００１８】
検体１の場合は、生菌数が目視で５．５×１０Ｅ３であり、蛍光顕微鏡では、
４．７×１０Ｅ３であった所、本発明の装置では、４．５×１０Ｅ３であり、
目視の場合と比較すると９５％の整合性が取れている。
以下、検体２では、１１３％の整合性、検体３では１０４％の整合性が取れて
いる。以上のように、本発明の装置では、従来の目視や蛍光顕微鏡での方法と
ぼぼ同じ結果が得られ、整合性があると判断できる。
【００１９】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の構成ブロック図である。
【図２】本発明において、核酸に特異的な蛍光標識を取り付ける事を説明するための図である。
【００２０】
【符号の説明】
１ 光源部
２ 光ファイバー
３ 第１のバンドパスフィルター
４ 第２のバンドパスフィルター
５ 光電子増倍管
６ ハーフミラー
７ 対物レンズ
８ 検体
９ ＸＹステージ
１０ 制御演算部
１１ 表示部
１２ 集光レンズ
１３ 核酸（ＲＮＡ）
１４ 蛍光標識プローブ
Claims (6)
- 特定微生物の核酸の中に存在する特異的塩基配列に対して相補的塩基配列を有する化学物質に蛍光物質で標識したものを蛍光標識プローブとし、該蛍光標識プローブと検査対象試料とをｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションして調製したものを検体とし、該蛍光標識プローブに標識した蛍光物質に対応した励起光を該検体に照射し、蛍光標識プローブ由来の検体からの蛍光強度を受光手段により検出することで特定微生物の数を自動判別する装置。
- 特定微生物の核酸の中に存在する特異的塩基配列に対して相補的塩列を有する化学物質に蛍光物質で標識したものを蛍光標識プローブとし、該蛍光標識プローブと検査対象試料とをｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションして調製したものを検体とし、該蛍光標識プローブ由来の検体からの蛍光を検出する装置において、
該検体に照射する励起光の照射面積が、少なくとも微生物１細胞の面積以上の大きさを持つように構成し、励起光照射部、受光部及び検体積載部の少なくとも一つが、相対的に繰り返し移動することで、検体全体の蛍光強度を計測するように構成した特定微生物の数を自動判別する装置。 - 特定微生物の核酸の中に存在する特異的塩基配列に対して相補的塩基配列を有する化学物質に蛍光物質で標識したものを蛍光標識プローブとし、該蛍光標識プローブと検査対象試料とをｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションして調製したものを検体とし、該蛍光標識プローブ由来の検体からの蛍光を検出する装置において、受光部から得られた情報を、積算する積算装置もしくは、グルーピング後に２値化する２値化演算装置をもつことにより判別を行う、前記請求項１または２記載の装置。
- 前記化学物質をＤＮＡとした前記請求項１または２または３記載の装置。
- 前記化学物質をＰｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＰＮＡ）とした前記請求項１または２または３記載の装置。
- 前記核酸をＲＮＡとした前記請求項１または２または３記載の装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002171629A JP2004016014A (ja) | 2002-06-12 | 2002-06-12 | 特定微生物の数を自動判別する装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002171629A JP2004016014A (ja) | 2002-06-12 | 2002-06-12 | 特定微生物の数を自動判別する装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004016014A true JP2004016014A (ja) | 2004-01-22 |
| JP2004016014A5 JP2004016014A5 (ja) | 2005-10-13 |
Family
ID=31171433
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002171629A Pending JP2004016014A (ja) | 2002-06-12 | 2002-06-12 | 特定微生物の数を自動判別する装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2004016014A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007020528A (ja) * | 2005-07-21 | 2007-02-01 | Hakodate Chiiki Sangyo Shinko Zaidan | 培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法による食品の微生物検査法 |
| JP2014135935A (ja) * | 2013-01-17 | 2014-07-28 | Azbil Corp | 微生物検出システム及び微生物検出方法 |
-
2002
- 2002-06-12 JP JP2002171629A patent/JP2004016014A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007020528A (ja) * | 2005-07-21 | 2007-02-01 | Hakodate Chiiki Sangyo Shinko Zaidan | 培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法による食品の微生物検査法 |
| JP2014135935A (ja) * | 2013-01-17 | 2014-07-28 | Azbil Corp | 微生物検出システム及び微生物検出方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Samek et al. | The potential of Raman spectroscopy for the identification of biofilm formation by Staphylococcus epidermidis | |
| JP5588977B2 (ja) | サンプルにおける生物学的粒子の検出および／または特徴付けのための方法およびシステム | |
| US20070218459A1 (en) | Diagnostic System For Otolaryngologic Pathogens And Use Thereof | |
| CN108474029A (zh) | 通过扩展显微法的蛋白质和核酸的纳米级成像 | |
| US20110177549A1 (en) | Method, kit and system for culturable cell count | |
| CN113249499B (zh) | 一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒、其制备方法及其应用 | |
| JPWO2003100086A1 (ja) | 生細胞の計数方法および装置 | |
| CN106929510A (zh) | 一种特异性核酸适配体及应用 | |
| US20100075298A1 (en) | Method for rapid identification and quantification of microorganisms | |
| JP2004016014A (ja) | 特定微生物の数を自動判別する装置 | |
| KR20120081129A (ko) | 헬리코박터 피로리 및/또는 클래리스로마이신 내성 프로필을 검출하기 위한 펩티드 핵산 프로브, 키트 및 방법 및 적용 방법 | |
| JP4950433B2 (ja) | 簡易迅速培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法 | |
| Bera et al. | Estimating bacterial concentrations in fibrous substrates through a combination of scanning electron microscopy and ImageJ | |
| Grohmann et al. | Techniques in studying biofilms and their characterization: microscopy to advanced imaging system in vitro and in situ | |
| Awad et al. | Optical Fiber-based steady state and fluorescence lifetime spectroscopy for Rapid Identification and classification of bacterial pathogens directly from colonies on Agar Plates | |
| US20110269118A1 (en) | Methods for identifying cells by combinatorial fluorescence imaging | |
| Maurya et al. | Novel approaches for detecting water-associated pathogens | |
| JP4785449B2 (ja) | 培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法による食品の微生物検査法 | |
| Sharp | Section 2 Confocal laser scanning microscopy | |
| KR102432475B1 (ko) | 형광표지법 기반 병원균 신속 검출용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 검출방법 | |
| Esiobu | Use of peptide nucleic acid probes for rapid detection and enumeration of viable bacteria in recreational waters and beach sand | |
| Örmeci et al. | Development of a fluorescence in situ hybridization protocol for the identification of micro-organisms associated with wastewater particles and flocs | |
| JP4622478B2 (ja) | 微生物計測方法 | |
| JP2004290171A (ja) | 微生物の分子生物学的同定技術 | |
| RO134994A0 (ro) | Metodă rapidă de detecţie a bacteriilor patogene prin spec- troscopie sers |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050610 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Effective date: 20050610 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 |
|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20050610 |
|
| A521 | Written amendment |
Effective date: 20050610 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080527 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080728 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20090106 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
| A521 | Written amendment |
Effective date: 20090309 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090414 |