JP2004002256A - 光学活性オキサジン誘導体 - Google Patents
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Abstract
【課題】優れたＰＤＥＩＶ阻害作用を有する化合物の提供。
【解決手段】本発明は、（−）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オンまたはその水和物若しくは溶媒和物に関する。また本発明は、該化合物を含有してなる医薬組成物、好ましくはホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）ＩＶ阻害薬、更に好ましくは炎症性疾患、特に喘息若しくは慢性閉塞性肺疾患の予防および治療薬に関する。
【選択図】 なし
【解決手段】本発明は、（−）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オンまたはその水和物若しくは溶媒和物に関する。また本発明は、該化合物を含有してなる医薬組成物、好ましくはホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）ＩＶ阻害薬、更に好ましくは炎症性疾患、特に喘息若しくは慢性閉塞性肺疾患の予防および治療薬に関する。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ホスホジエステラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ、ＰＤＥ）ＩＶ阻害作用を有する新規な化合物及びそれを含む医薬組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
（±）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オン（ＷＯ９８／０４５３４号公報参照）は、強いホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）ＩＶ阻害作用を有し、気管支拡張作用及び抗炎症作用を発現することが知られており、喘息、皮膚炎などの炎症性疾患、リウマチ、多発性硬化症などの自己免疫疾患等に有効と考えられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
（±）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オンは、ラセミ体（比旋光度０°）で６位に不斉炭素を有し、（＋）−体と（−）−体の二種類の異性体の存在が予想はされていたが、３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オン骨格を有する化合物の異性体の分離方法は一般化されておらず、ラセミ体から異性体を分離することは達成し得なかった。特に上記の（±）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オンは酸性若しくは塩基性を示す官能基を有しておらず、その分離に光学活性な有機塩基や有機酸を利用したジアステレオマー光学分割法などの手法は利用できなかった。従って、そのホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）ＩＶ阻害作用および副作用の違いについては知られておらず、検討することもできなかった。
【０００４】
本発明者は、各々の異性体を純粋に取得するために研究を重ねた結果、（±）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オンを高速液体クロマトグラフィーで純粋な各異性体に分離する方法を見出した。そして、得られた各異性体のホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）ＩＶ阻害作用及び抗喘息作用、並びに毒性及び水に対する溶解性を検討し、特定の異性体が医薬として優れた性質を有していることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
【０００６】
すなわち、本発明は、（−）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オン又はその水和物若しくはその溶媒和物に関する。
また本発明は、（−）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オン並びにその水和物及びその溶媒和物からなる群から選ばれる物質を有効成分として含む医薬に関する。
本発明の化合物はホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）ＩＶ阻害作用を示し、これに基づき、本発明の医薬は、喘息、皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患等の炎症性疾患；多発性硬化症；リウマチ等の自己免疫疾患の治療及び／又は予防のための医薬として有用である。
【０００７】
別の観点からは、本発明により、上記の医薬の製造のための（−）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オン並びにその水和物及びその溶媒和物からなる群から選ばれる物質の使用；上記物質を含むホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）ＩＶ阻害剤が提供される。
また、さらに別の観点からは、ヒトを含む哺乳類動物においてホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）ＩＶを阻害する方法であって、（−）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オン並びにその水和物及びその溶媒和物からなる群から選ばれる物質の有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法が提供される。
【０００８】
本発明の光学活性的に純粋な化合物は、例えば国際公開ＷＯ９８／０４５３４号に記載の方法により製造されるラセミ体を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて下記の実施例に記載の如く特定の条件で処理することにより、二種類の光学活性体［即ち（−）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オン及び（＋）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オン］に分割することにより得られる。また、得られた光学活性体を必要に応じて各種溶媒により再結晶を行うことにより、更に高純度の光学活性体を得ることができる。
【０００９】
光学活性体の再結晶は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン等の単一溶媒又は２種若しくはそれ以上の溶媒を組み合わせた混合溶媒により行うことができる。
【００１０】
上記の方法により得られる光学活性体の（−）−体［（−）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オンの略］および（＋）−体［（＋）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オンの略］のＰＤＥ ＩＶ阻害活性および抗喘息作用をラセミ体［（±）−体］と比較して下記の表１に示す。表１は後記の試験例１及び試験例２の結果をまとめたものである。
【００１１】
【表１】
【００１２】
上記表に示した様に、（−）−体はラセミ体の約２倍のＰＤＥ ＩＶ阻害作用及び抗喘息作用を有すのに対し、（＋）−体はラセミ体の約１／３のＰＤＥ ＩＶ阻害作用および約１／４以下の抗喘息作用しか有さず、薬理活性は相当弱いがラセミ体と同程度の毒性を示す。さらに、（−）−体はラセミ体に比べ水に対する溶解性が著しく高く、各種液剤としての利用の可能性が高くなるとともに、消化管などにおける吸収性も改善される可能性があり好ましい。以上の通り、（−）−体はラセミ体に比べてＰＤＥ ＩＶ阻害薬および抗喘息薬などの医薬として極めて有用であることが確認された。
【００１３】
また、（−）−体がアレルギー性結膜炎に対する改善作用、ＴＮＦ−α産生抑制作用、及びＮＫ１受容体拮抗作用を有することも新たに確認された。ラセミ体がＰＤＥ ＩＶ阻害薬および抗喘息薬として有用であることは国際公開ＷＯ９８／０４５３４号に開示されているが、（−）−体がアレルギー性眼疾患治療薬、ＴＮＦ−α産生阻害薬、及びＮＫ１受容体拮抗薬として有用であることは示唆ないし教示されておらず、（−）−体は医薬の有効成分として極めて優れている。
【００１４】
本発明の化合物を有効成分として含む医薬としては、上記の方法により得られる光学活性な化合物並びにその水和物及びその溶媒和物からなる群から選ばれる物質を単独で用いてもよいが、又は上記物質を薬学的に許容される担体と混合し、適当な形態の医薬組成物として調製することもできる。
【００１５】
全身投与に適する医薬組成物としては、例えば、顆粒剤、散剤、錠剤、丸剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、又は液剤等の経口投与に適する医薬組成物、あるいは注射剤（静脈内、筋肉内、皮下）、点滴剤、軟膏剤、坐剤、エアゾール剤、吸入剤等の非経口投与に適する医薬組成物を例示することができる。局所投与に適する医薬組成物としては、点眼剤、眼軟膏剤、軟膏剤、坐剤、エアゾール剤、吸入剤等を挙げることができる。
【００１６】
なお、上記の医薬組成物の製造のためには、必要により１種又は２種以上の製剤用添加物、例えば、結合剤、潤滑剤、崩壊剤、保存剤、緩衝剤、増粘剤、溶解補助剤、キレート剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、等張化剤のような通常用いられる各種製剤用添加剤を用いてもよい。
【００１７】
例えば、経口投与のための医薬組成物は、乳糖、結晶セルロース、ブドウ糖、コーンスターチ、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、エリスリトールなどの賦形剤、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルセルロースなどの崩壊剤、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、硬化油などの滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ゼラチン、アラビアゴムなどの湿潤剤、その他必要に応じて界面活性剤、矯味剤などを使用して所望の投与剤型に調製することができる。
【００１８】
また、非経口投与のための医薬組成物の製造には、水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、寒天、トラガントガムなどの希釈剤を用いて、必要に応じて溶解補助剤（ポリビニルピロリドン、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレンモノステアレート等）、保存剤（クロロブタノール、デヒドロ酢酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルピリジニウム、フェネチルアルコール、パラオキシ安息香酸エステル類、塩化ベゼトニウム等）、緩衝剤（ホウ酸緩衝剤、リン酸塩緩衝剤、炭酸塩緩衝剤、酢酸塩緩衝剤、クエン酸緩衝剤等）、安定化剤（エデト酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等）、ｐＨ調整剤（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸、クエン酸、リン酸等）、等張化剤（塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、多価アルコール、ソルビトール、マンニトール、グルコース等）、無痛化剤などを使用することができる。
眼軟膏剤の場合には、通常使用されている基剤（眼科用白色ワセリン、プラスチベース、プロペト等）を使用でき、添加剤としては、流動パラフィンなどが挙げられる。
【００１９】
本発明の医薬の投与量は、全身投与用の製剤として経口投与する場合、通常、成人に対し本発明の化合物の重量として１日あたり０．０１〜１０００ｍｇであり、好ましくは０．０１〜１００ｍｇである。投与量は、年齢、病状、症状のほか、同時投与の医薬の有無等により適宜増減することが好ましい。前記１日投与量を１日１回、又は適当間隔をおいて１日に２〜３回に分けて投与してもよいし、数日ごとに間欠投与してもよい。全身投与用の注射剤として用いる場合には、本発明の化合物の重量として、成人に対し１回量０．００１〜１００ｍｇを連続投与又は間欠投与することが好ましい。
【００２０】
本発明の医薬を局所投与する場合の投与量は、吸入剤の場合、通常、成人に対し１日量０．００１〜３００ｍｇであり、好ましくは０．００１〜３０ｍｇである。点眼剤の場合には、通常０．０１〜３．０ｗ／ｖ％の濃度で使用され、眼軟膏剤の場合には、通常０．０１〜１０．０ｗ／ｖ％の濃度で使用される。投与量は、年齢、病状、症状のほか、同時投与の医薬の有無等により適宜増減することが好ましい。注射剤の場合、１日に１〜数回に分けて投与することができる。点眼剤の場合、通常１日に１〜６回、１回に１〜２滴を点眼することができ、眼軟膏の場合、通常１日に１〜２回、結膜嚢内に適量を塗布することができる。
【００２１】
【実施例】
以下、本発明を実施例及び試験例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例および試験例に限定されるものではない。
【００２２】
＜実施例１＞
（±）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オン ７０ｇを変性エタノール７．０Ｌに溶解した後、一度に約３．０ｇのサンプル溶液をカラムに注入し、下記の条件でＨＰＬＣを行った。
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＳ（１０ｃｍφ×５０ｃｍ）
溶媒：変性エタノール
流量：１００ｍＬ／分
第１ピーク及び第２ピークそれぞれの分画液を減圧濃縮し、得られた油状の残渣にエタノール及びｎ−ヘキサンを添加後、再び減圧濃縮し、粉末状の光学活性体を得た。以上のような操作を繰り返すことにより（±）−体 ７０ｇより二種類の光学活性体、（−）−体 ３１．５ｇ、（＋）−体 ２９．６ｇを得た。尚、構造については、光学分割前のラセミ体のＮＭＲと比較することにより確認した。
【００２３】
（−）−体：保持時間５０〜６２分、カラム温度４０℃
［α］２０ Ｄ −６８°（ｃ＝１．００， ＭｅＯＨ）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）
１．６８（３Ｈ， ｓ）、２．１４（１Ｈ， ｄｄｄ， Ｊ＝１４．０， １０．６， ５．６ Ｈｚ）、２．３０（１Ｈ， ｄｄｄ， Ｊ＝１４．０， ３．９， ３．９ Ｈｚ）、３．０６（１Ｈ， ｄｄｄ， Ｊ＝１０．６， １０．６， ４．８ Ｈｚ）、３．２０（１Ｈ， ｄｄ，Ｊ＝１６．７， ３．９ Ｈｚ）、３．２２（１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１６．７， ３．９ Ｈｚ）、３．２５−３．３０（１Ｈ， ｍ）、３．３６（１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１６．７， ６．６ Ｈｚ）、３．３７（１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１６．７， ６．６ Ｈｚ）、３．８１（３Ｈ，ｓ）、５．２１（１Ｈ， ｄｄｄｄ， Ｊ＝６．６， ６．６， ３．９， ３．９Ｈｚ）、６．１３（１Ｈ， ｂｒｏａｄ）、６．８６（１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．３Ｈｚ）、６．９０（１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝８．３， ２．２Ｈｚ）、６．９５（１Ｈ， ｄ， Ｊ＝２．２Ｈｚ）、７．１５−７．１９（２Ｈ， ｍ）、７．２１−７．２３（２Ｈ， ｍ）
（＋）−体：保持時間６９〜８８分、カラム温度４０℃
［α］２０ Ｄ ＋６８°（ｃ＝１．００， ＭｅＯＨ）
【００２４】
（±）−体の １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）
１．６６（３Ｈ， ｓ）、２．１１（１Ｈ， ｄｄｄ， Ｊ＝１３．９， １０．３， ５．４Ｈｚ）、２．２７（１Ｈ， ｄｄｄ， Ｊ＝１３．９， ４．２， ４．２Ｈｚ）、３．００−３．０７（１Ｈ， ｍ）、３．２０（１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１６．６， ３．７Ｈｚ）、３．２２（１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１６．６， ３．７Ｈｚ）、３．２２−３．２９（１Ｈ， ｍ）、３．３６（２Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１６．６， ６．６Ｈｚ）、３．８０（３Ｈ， ｓ）、５．２１（１Ｈ， ｄｄｄｄ， Ｊ＝６．６， ６．６， ３．７， ３．７Ｈｚ）、６．１３（１Ｈ， ｂｒｏａｄ）、６．８６（１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．３Ｈｚ）、６．９０（１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝８．３， ２．２Ｈｚ）、６．９５（１Ｈ， ｄ， Ｊ＝２．２Ｈｚ）、７．１４−７．１８（２Ｈ， ｍ）、７．１９−７．２３（２Ｈ， ｍ）
【００２５】
＜実施例２＞
錠剤の製造
３０ｇの（−）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オン、乳糖２５３ｇ、トウモロコシデンプン６３ｇ、低置換ヒドロキシプロピルセルロース４０ｇ、ステアリン酸カルシウム４ｇを混和し、通常の方法で圧縮して前記化合物１０ｍｇを含む錠剤を製造した。
【００２６】
＜実施例３＞
カプセル剤の製造
３０ｇの（−）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オン、乳糖２６０ｇ、トウモロコシデンプン６６ｇ、ステアリン酸カルシウム４ｇを混和した後、通常の方法でゼラチンカプセルに充填し、前記化合物１０ｍｇを含むカプセル剤を製造した。
【００２７】
＜実施例４＞
吸入剤の製造
（−）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オンをよく粉砕し、粒子径を１〜５μｍとしたもの０．１５ｇと乳糖（３２５メッシュ、ディー．エム．ブイ．社製）６０ｇを混和する。通常の方法でカプセルに充填し、各カプセルが前記化合物５０μｇを含むようにする。吸入は粉末吸入容器にカプセルを装填して行う。
【００２８】
＜試験例１＞
ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）の分離及びＰＤＥ阻害活性の測定
化合物のＰＤＥ阻害活性および選択性を調べるためにＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型及びＶ型の、４種類のＰＤＥアイソザイムを準備した［Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１２，１９−２７（１９９２）］。Ｉ型ＰＤＥはシグマ社より購入したものを用いた。また、ＩＩＩ型、ＩＶ型及びＶ型のＰＤＥアイソザイムはラットより採取した血小板（ＩＩＩ型およびＶ型）又は好中球（ＩＶ型）から部分精製した。各酵素源を２０ｍＭビストリス、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸）２ｍＭ、ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルフォニルフルオライド）０．１ｍＭ、２−メルカプトエタノール５ｍＭ、ペプスタチン０．００１ｍＭ、ロイペプチン０．０１ｍＭを含む緩衝液（ｐＨ６．５）中でホモジナイズし、３００００×Ｇで３０分間遠心して得られた遠心上清をイオン交換カラム（Ｑセファロースファーストフロー、ファルマシア社製）にかけ、０〜１Ｍの酢酸ナトリウムで溶離した。部分精製したアイソザイムは各々既知の選択的阻害剤の効果を調べることによって同定した。
【００２９】
被検物質はＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）中に溶解し、５ｍＭの塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液中に添加した。この反応液に上記のＰＤＥアイソザイムおよび３Ｈ−ｃＡＭＰ（ＩＩＩ型、ＩＶ型ＰＤＥのとき）又は３Ｈ−ｃＧＭＰ（Ｉ型、Ｖ型ＰＤＥのとき）を基質として加え、３０℃で３０分間反応させた。反応後１００度の沸騰液中に５分間つけることによって反応を停止した。ＰＤＥによって生成したヌクレオチドは５’−ヌクレオチダーゼで３Ｈ−アデノシンまたは３Ｈ−グアノシンに分解し、未反応の基質と反応生成物はイオン交換カラム（ＱＡＥセファデックス、ファルマシア社製）を通して分離した。溶出した３Ｈ−ヌクレオシドの放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。各被検物質の阻害活性はＩＣ５０値（μＭ）で表し、ＩＶ型に対する阻害活性を表２に示した。また、各被検物質のＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型に対する阻害活性はＩＶ型に対する阻害活性の１０分の１以下であった。
【００３０】
【表２】
【００３１】
＜試験例２＞
抗原誘発気道収縮抑制作用（抗喘息作用）
ハートレイ系雄性モルモットに卵白アルブミン（ＯＡ）を３５ｍｇ筋肉内投与して感作し、４日後に同様に追加感作を行った。初回感作から２５〜２９日後、ペントバルビタール麻酔したモルモットに気管カニューレを挿入して人工呼吸を施した。Ｋｏｎｚｅｔｔ−Ｒｏｅｓｓｌｅｒ法により気道抵抗をモニターし、ＯＡ０．０５ｍｇ／ｋｇ静脈内投与で惹起される気道抵抗の増加を調べた。被検物質は０．５％カルボキシメチルセルロースに懸濁して抗原投与の４５分前に十二指腸内投与した。本発明の化合物の効果をＥＤ５０値で表し、表３に示す。
【００３２】
【表３】
【００３３】
＜試験例３＞
アレルギー性結膜炎モデルに対する改善作用
実験にはウイスター系のラット（日本クレア）を使用した。ラットに卵白アルブミン（ＯＡ、シグマ社製）１００μｇと１０ｍｇ水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ、ＰＩＥＲＣＥ社製）を１ｍＬの生理食塩液に懸濁し、腹腔内投与することによって感作した。アレルギー性結膜炎は、感作日から３週目以降のラットを用い、生理食塩液で３０ｍｇ／ｍＬの濃度に調製したＯＡを１０μＬ点眼することによって惹起した。薬物は、１．０％（ｗ／ｖ）の濃度で生理食塩液に懸濁し、ＯＡで結膜炎を惹起する１０分前に点眼した（陽性対照薬としてジフェンヒドラミンを０．３％（ｗ／ｖ）の濃度で生理食塩液に懸濁し、ＯＡで結膜炎を惹起する１０分前に点眼した）。
薬物の効果は、ＯＡ点眼後から２０分間に観察された、後肢で眼瞼を引っ掻く仕草（Ｉｔｃｈ−Ｓｃｒａｔｃｈ ｒｅｓｐｏｎｓｅ：痒みの指標と考えられる）の回数を測定し、下記式より痒みの抑制率を求めた。
【００３４】
コントロール群：予め感作したラットにＯＡで結膜炎を惹起する１０分前に生理食塩水を点眼した。
無処置群：感作していないラットに生理食塩水を点眼した。
計算式：
【数１】
その結果、（−）−体は例数５で７１．４％の抑制率を示した。
【００３５】
＜試験例４＞
ＴＮＦ−α産生抑制作用
ラットをペントバルビタール麻酔下にてヘパリン処置した試験管に採血を行った。採血した血液と等量のＲＰＭＩ−１６４０培地を加え、２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに分注し、溶媒（ＤＭＳＯ）、または、溶媒に溶かした被験薬を添加し、３０分間、３７℃、５％ＣＯ２でプレインキュベーションを行った。反応はＬＰＳ（リポポリサッカライド）を添加して開始し、４時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションを行い、氷浴にて反応を停止した。反応停止後、３０００ｒｐｍ、４℃、１５分間遠心分離し、上清中のＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡ法にて測定した。被験薬の活性は溶媒対照群に対する産生抑制率を求め、ＴＮＦ−α産生を５０％抑制する被験薬濃度を求め評価した。
その結果、（−）−体のＩＣ５０（μＭ）は０．１１であった。
【００３６】
＜試験例５＞
ＮＫ１受容体拮抗作用
ヒト型ＮＫ１受容体を発現させたＣＨＯ細胞を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、６ｍＭ ＭｎＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０μＭ ＰＭＳＦを含むｐＨ７．４の緩衝液中でホモジナイズし、８００×ｇで１０分間遠心した。上清を１０００００×ｇで１．０時間遠心し、得られた沈渣を上記緩衝液中に再度懸濁した。タンパク量を測定後、０．０２ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬになるように、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．０ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．０１％ＢＳＡを含むｐＨ７．４の緩衝液で希釈し、ＮＫ１受容体標本として使用した。
ＮＫ１受容体への親和性は、［３Ｈ］ＳＲ１４０３３３のｂｉｎｄｉｎｇの阻害を測定することによって求めた。前述したＮＫ１受容体標本にＤＭＳＯ中に溶解した被験物質及び［３Ｈ］ＳＲ１４０３３３（最終濃度０．２５ｎＭ）を加え、２５℃で９０分間インキュベートした後、グラスフィルターで吸引濾過し、１ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．４で３回洗浄後、フィルター上の放射能活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。尚、被験物質は最終濃度で１０μＭ添加し、［３Ｈ］ＳＲ１４０３３３のバインディング阻害活性を測定した。
その結果、（−）−体はほぼ１００％の抑制率を示した。
【００３７】
＜試験例５＞
モルモット摘出気管支のサブスタンスＰ（ＮＫ１）収縮に対する抑制作用
体重３３０〜４９６ｇのハートレイ系雄性モルモットを脱血屠殺後に気管を摘出し、鎖状標本を作製した。これを９５％ Ｏ２ ＋ ５％ ＣＯ２の混合ガスを通気した３μＭインドメタシンを含むＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ液を満たしたｏｒｇａｎ ｂａｔｈ中に１ｇの負荷で懸垂した。標本の収縮反応はＦＤピックアップ及びひずみ圧力アンプを介してペンレコーダーで記録した。標本が安定した後、サブスタンスＰを１０−９〜１０−５Ｍの濃度となるよう低濃度から累積添加して収縮反応を確認した。標本をＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ液で数回洗浄した後、本発明化合物を添加して２０分間作用させた。その後、サブスタンスＰを累積添加して収縮を惹起した。
その結果、（−）−体はモルモットの摘出気管支におけるサブスタンスＰ誘発収縮のグラフを用量依存的に右側にシフトさせ、拮抗的な阻害作用を示した。
【００３８】
【発明の効果】
本発明の化合物はラセミ体に比べて約２倍のホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）ＩＶ阻害作用及び抗喘息作用を有しており、またラセミ体に比べて水に対する溶解性が著しく高いことから、喘息、慢性閉塞性肺疾患等の炎症性疾患などの治療及び／又は予防のための医薬の有効成分として極めて有用である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ホスホジエステラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ、ＰＤＥ）ＩＶ阻害作用を有する新規な化合物及びそれを含む医薬組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
（±）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オン（ＷＯ９８／０４５３４号公報参照）は、強いホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）ＩＶ阻害作用を有し、気管支拡張作用及び抗炎症作用を発現することが知られており、喘息、皮膚炎などの炎症性疾患、リウマチ、多発性硬化症などの自己免疫疾患等に有効と考えられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
（±）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オンは、ラセミ体（比旋光度０°）で６位に不斉炭素を有し、（＋）−体と（−）−体の二種類の異性体の存在が予想はされていたが、３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オン骨格を有する化合物の異性体の分離方法は一般化されておらず、ラセミ体から異性体を分離することは達成し得なかった。特に上記の（±）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オンは酸性若しくは塩基性を示す官能基を有しておらず、その分離に光学活性な有機塩基や有機酸を利用したジアステレオマー光学分割法などの手法は利用できなかった。従って、そのホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）ＩＶ阻害作用および副作用の違いについては知られておらず、検討することもできなかった。
【０００４】
本発明者は、各々の異性体を純粋に取得するために研究を重ねた結果、（±）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オンを高速液体クロマトグラフィーで純粋な各異性体に分離する方法を見出した。そして、得られた各異性体のホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）ＩＶ阻害作用及び抗喘息作用、並びに毒性及び水に対する溶解性を検討し、特定の異性体が医薬として優れた性質を有していることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
【０００６】
すなわち、本発明は、（−）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オン又はその水和物若しくはその溶媒和物に関する。
また本発明は、（−）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オン並びにその水和物及びその溶媒和物からなる群から選ばれる物質を有効成分として含む医薬に関する。
本発明の化合物はホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）ＩＶ阻害作用を示し、これに基づき、本発明の医薬は、喘息、皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患等の炎症性疾患；多発性硬化症；リウマチ等の自己免疫疾患の治療及び／又は予防のための医薬として有用である。
【０００７】
別の観点からは、本発明により、上記の医薬の製造のための（−）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オン並びにその水和物及びその溶媒和物からなる群から選ばれる物質の使用；上記物質を含むホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）ＩＶ阻害剤が提供される。
また、さらに別の観点からは、ヒトを含む哺乳類動物においてホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）ＩＶを阻害する方法であって、（−）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オン並びにその水和物及びその溶媒和物からなる群から選ばれる物質の有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法が提供される。
【０００８】
本発明の光学活性的に純粋な化合物は、例えば国際公開ＷＯ９８／０４５３４号に記載の方法により製造されるラセミ体を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて下記の実施例に記載の如く特定の条件で処理することにより、二種類の光学活性体［即ち（−）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オン及び（＋）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オン］に分割することにより得られる。また、得られた光学活性体を必要に応じて各種溶媒により再結晶を行うことにより、更に高純度の光学活性体を得ることができる。
【０００９】
光学活性体の再結晶は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン等の単一溶媒又は２種若しくはそれ以上の溶媒を組み合わせた混合溶媒により行うことができる。
【００１０】
上記の方法により得られる光学活性体の（−）−体［（−）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オンの略］および（＋）−体［（＋）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オンの略］のＰＤＥ ＩＶ阻害活性および抗喘息作用をラセミ体［（±）−体］と比較して下記の表１に示す。表１は後記の試験例１及び試験例２の結果をまとめたものである。
【００１１】
【表１】
上記表に示した様に、（−）−体はラセミ体の約２倍のＰＤＥ ＩＶ阻害作用及び抗喘息作用を有すのに対し、（＋）−体はラセミ体の約１／３のＰＤＥ ＩＶ阻害作用および約１／４以下の抗喘息作用しか有さず、薬理活性は相当弱いがラセミ体と同程度の毒性を示す。さらに、（−）−体はラセミ体に比べ水に対する溶解性が著しく高く、各種液剤としての利用の可能性が高くなるとともに、消化管などにおける吸収性も改善される可能性があり好ましい。以上の通り、（−）−体はラセミ体に比べてＰＤＥ ＩＶ阻害薬および抗喘息薬などの医薬として極めて有用であることが確認された。
【００１３】
また、（−）−体がアレルギー性結膜炎に対する改善作用、ＴＮＦ−α産生抑制作用、及びＮＫ１受容体拮抗作用を有することも新たに確認された。ラセミ体がＰＤＥ ＩＶ阻害薬および抗喘息薬として有用であることは国際公開ＷＯ９８／０４５３４号に開示されているが、（−）−体がアレルギー性眼疾患治療薬、ＴＮＦ−α産生阻害薬、及びＮＫ１受容体拮抗薬として有用であることは示唆ないし教示されておらず、（−）−体は医薬の有効成分として極めて優れている。
【００１４】
本発明の化合物を有効成分として含む医薬としては、上記の方法により得られる光学活性な化合物並びにその水和物及びその溶媒和物からなる群から選ばれる物質を単独で用いてもよいが、又は上記物質を薬学的に許容される担体と混合し、適当な形態の医薬組成物として調製することもできる。
【００１５】
全身投与に適する医薬組成物としては、例えば、顆粒剤、散剤、錠剤、丸剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、又は液剤等の経口投与に適する医薬組成物、あるいは注射剤（静脈内、筋肉内、皮下）、点滴剤、軟膏剤、坐剤、エアゾール剤、吸入剤等の非経口投与に適する医薬組成物を例示することができる。局所投与に適する医薬組成物としては、点眼剤、眼軟膏剤、軟膏剤、坐剤、エアゾール剤、吸入剤等を挙げることができる。
【００１６】
なお、上記の医薬組成物の製造のためには、必要により１種又は２種以上の製剤用添加物、例えば、結合剤、潤滑剤、崩壊剤、保存剤、緩衝剤、増粘剤、溶解補助剤、キレート剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、等張化剤のような通常用いられる各種製剤用添加剤を用いてもよい。
【００１７】
例えば、経口投与のための医薬組成物は、乳糖、結晶セルロース、ブドウ糖、コーンスターチ、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、エリスリトールなどの賦形剤、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルセルロースなどの崩壊剤、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、硬化油などの滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ゼラチン、アラビアゴムなどの湿潤剤、その他必要に応じて界面活性剤、矯味剤などを使用して所望の投与剤型に調製することができる。
【００１８】
また、非経口投与のための医薬組成物の製造には、水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、寒天、トラガントガムなどの希釈剤を用いて、必要に応じて溶解補助剤（ポリビニルピロリドン、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレンモノステアレート等）、保存剤（クロロブタノール、デヒドロ酢酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルピリジニウム、フェネチルアルコール、パラオキシ安息香酸エステル類、塩化ベゼトニウム等）、緩衝剤（ホウ酸緩衝剤、リン酸塩緩衝剤、炭酸塩緩衝剤、酢酸塩緩衝剤、クエン酸緩衝剤等）、安定化剤（エデト酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等）、ｐＨ調整剤（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸、クエン酸、リン酸等）、等張化剤（塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、多価アルコール、ソルビトール、マンニトール、グルコース等）、無痛化剤などを使用することができる。
眼軟膏剤の場合には、通常使用されている基剤（眼科用白色ワセリン、プラスチベース、プロペト等）を使用でき、添加剤としては、流動パラフィンなどが挙げられる。
【００１９】
本発明の医薬の投与量は、全身投与用の製剤として経口投与する場合、通常、成人に対し本発明の化合物の重量として１日あたり０．０１〜１０００ｍｇであり、好ましくは０．０１〜１００ｍｇである。投与量は、年齢、病状、症状のほか、同時投与の医薬の有無等により適宜増減することが好ましい。前記１日投与量を１日１回、又は適当間隔をおいて１日に２〜３回に分けて投与してもよいし、数日ごとに間欠投与してもよい。全身投与用の注射剤として用いる場合には、本発明の化合物の重量として、成人に対し１回量０．００１〜１００ｍｇを連続投与又は間欠投与することが好ましい。
【００２０】
本発明の医薬を局所投与する場合の投与量は、吸入剤の場合、通常、成人に対し１日量０．００１〜３００ｍｇであり、好ましくは０．００１〜３０ｍｇである。点眼剤の場合には、通常０．０１〜３．０ｗ／ｖ％の濃度で使用され、眼軟膏剤の場合には、通常０．０１〜１０．０ｗ／ｖ％の濃度で使用される。投与量は、年齢、病状、症状のほか、同時投与の医薬の有無等により適宜増減することが好ましい。注射剤の場合、１日に１〜数回に分けて投与することができる。点眼剤の場合、通常１日に１〜６回、１回に１〜２滴を点眼することができ、眼軟膏の場合、通常１日に１〜２回、結膜嚢内に適量を塗布することができる。
【００２１】
【実施例】
以下、本発明を実施例及び試験例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例および試験例に限定されるものではない。
【００２２】
＜実施例１＞
（±）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オン ７０ｇを変性エタノール７．０Ｌに溶解した後、一度に約３．０ｇのサンプル溶液をカラムに注入し、下記の条件でＨＰＬＣを行った。
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＳ（１０ｃｍφ×５０ｃｍ）
溶媒：変性エタノール
流量：１００ｍＬ／分
第１ピーク及び第２ピークそれぞれの分画液を減圧濃縮し、得られた油状の残渣にエタノール及びｎ−ヘキサンを添加後、再び減圧濃縮し、粉末状の光学活性体を得た。以上のような操作を繰り返すことにより（±）−体 ７０ｇより二種類の光学活性体、（−）−体 ３１．５ｇ、（＋）−体 ２９．６ｇを得た。尚、構造については、光学分割前のラセミ体のＮＭＲと比較することにより確認した。
【００２３】
（−）−体：保持時間５０〜６２分、カラム温度４０℃
［α］２０ Ｄ −６８°（ｃ＝１．００， ＭｅＯＨ）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）
１．６８（３Ｈ， ｓ）、２．１４（１Ｈ， ｄｄｄ， Ｊ＝１４．０， １０．６， ５．６ Ｈｚ）、２．３０（１Ｈ， ｄｄｄ， Ｊ＝１４．０， ３．９， ３．９ Ｈｚ）、３．０６（１Ｈ， ｄｄｄ， Ｊ＝１０．６， １０．６， ４．８ Ｈｚ）、３．２０（１Ｈ， ｄｄ，Ｊ＝１６．７， ３．９ Ｈｚ）、３．２２（１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１６．７， ３．９ Ｈｚ）、３．２５−３．３０（１Ｈ， ｍ）、３．３６（１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１６．７， ６．６ Ｈｚ）、３．３７（１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１６．７， ６．６ Ｈｚ）、３．８１（３Ｈ，ｓ）、５．２１（１Ｈ， ｄｄｄｄ， Ｊ＝６．６， ６．６， ３．９， ３．９Ｈｚ）、６．１３（１Ｈ， ｂｒｏａｄ）、６．８６（１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．３Ｈｚ）、６．９０（１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝８．３， ２．２Ｈｚ）、６．９５（１Ｈ， ｄ， Ｊ＝２．２Ｈｚ）、７．１５−７．１９（２Ｈ， ｍ）、７．２１−７．２３（２Ｈ， ｍ）
（＋）−体：保持時間６９〜８８分、カラム温度４０℃
［α］２０ Ｄ ＋６８°（ｃ＝１．００， ＭｅＯＨ）
【００２４】
（±）−体の １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）
１．６６（３Ｈ， ｓ）、２．１１（１Ｈ， ｄｄｄ， Ｊ＝１３．９， １０．３， ５．４Ｈｚ）、２．２７（１Ｈ， ｄｄｄ， Ｊ＝１３．９， ４．２， ４．２Ｈｚ）、３．００−３．０７（１Ｈ， ｍ）、３．２０（１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１６．６， ３．７Ｈｚ）、３．２２（１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１６．６， ３．７Ｈｚ）、３．２２−３．２９（１Ｈ， ｍ）、３．３６（２Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１６．６， ６．６Ｈｚ）、３．８０（３Ｈ， ｓ）、５．２１（１Ｈ， ｄｄｄｄ， Ｊ＝６．６， ６．６， ３．７， ３．７Ｈｚ）、６．１３（１Ｈ， ｂｒｏａｄ）、６．８６（１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．３Ｈｚ）、６．９０（１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝８．３， ２．２Ｈｚ）、６．９５（１Ｈ， ｄ， Ｊ＝２．２Ｈｚ）、７．１４−７．１８（２Ｈ， ｍ）、７．１９−７．２３（２Ｈ， ｍ）
【００２５】
＜実施例２＞
錠剤の製造
３０ｇの（−）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オン、乳糖２５３ｇ、トウモロコシデンプン６３ｇ、低置換ヒドロキシプロピルセルロース４０ｇ、ステアリン酸カルシウム４ｇを混和し、通常の方法で圧縮して前記化合物１０ｍｇを含む錠剤を製造した。
【００２６】
＜実施例３＞
カプセル剤の製造
３０ｇの（−）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オン、乳糖２６０ｇ、トウモロコシデンプン６６ｇ、ステアリン酸カルシウム４ｇを混和した後、通常の方法でゼラチンカプセルに充填し、前記化合物１０ｍｇを含むカプセル剤を製造した。
【００２７】
＜実施例４＞
吸入剤の製造
（−）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オンをよく粉砕し、粒子径を１〜５μｍとしたもの０．１５ｇと乳糖（３２５メッシュ、ディー．エム．ブイ．社製）６０ｇを混和する。通常の方法でカプセルに充填し、各カプセルが前記化合物５０μｇを含むようにする。吸入は粉末吸入容器にカプセルを装填して行う。
【００２８】
＜試験例１＞
ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）の分離及びＰＤＥ阻害活性の測定
化合物のＰＤＥ阻害活性および選択性を調べるためにＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型及びＶ型の、４種類のＰＤＥアイソザイムを準備した［Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１２，１９−２７（１９９２）］。Ｉ型ＰＤＥはシグマ社より購入したものを用いた。また、ＩＩＩ型、ＩＶ型及びＶ型のＰＤＥアイソザイムはラットより採取した血小板（ＩＩＩ型およびＶ型）又は好中球（ＩＶ型）から部分精製した。各酵素源を２０ｍＭビストリス、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸）２ｍＭ、ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルフォニルフルオライド）０．１ｍＭ、２−メルカプトエタノール５ｍＭ、ペプスタチン０．００１ｍＭ、ロイペプチン０．０１ｍＭを含む緩衝液（ｐＨ６．５）中でホモジナイズし、３００００×Ｇで３０分間遠心して得られた遠心上清をイオン交換カラム（Ｑセファロースファーストフロー、ファルマシア社製）にかけ、０〜１Ｍの酢酸ナトリウムで溶離した。部分精製したアイソザイムは各々既知の選択的阻害剤の効果を調べることによって同定した。
【００２９】
被検物質はＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）中に溶解し、５ｍＭの塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液中に添加した。この反応液に上記のＰＤＥアイソザイムおよび３Ｈ−ｃＡＭＰ（ＩＩＩ型、ＩＶ型ＰＤＥのとき）又は３Ｈ−ｃＧＭＰ（Ｉ型、Ｖ型ＰＤＥのとき）を基質として加え、３０℃で３０分間反応させた。反応後１００度の沸騰液中に５分間つけることによって反応を停止した。ＰＤＥによって生成したヌクレオチドは５’−ヌクレオチダーゼで３Ｈ−アデノシンまたは３Ｈ−グアノシンに分解し、未反応の基質と反応生成物はイオン交換カラム（ＱＡＥセファデックス、ファルマシア社製）を通して分離した。溶出した３Ｈ−ヌクレオシドの放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。各被検物質の阻害活性はＩＣ５０値（μＭ）で表し、ＩＶ型に対する阻害活性を表２に示した。また、各被検物質のＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型に対する阻害活性はＩＶ型に対する阻害活性の１０分の１以下であった。
【００３０】
【表２】
＜試験例２＞
抗原誘発気道収縮抑制作用（抗喘息作用）
ハートレイ系雄性モルモットに卵白アルブミン（ＯＡ）を３５ｍｇ筋肉内投与して感作し、４日後に同様に追加感作を行った。初回感作から２５〜２９日後、ペントバルビタール麻酔したモルモットに気管カニューレを挿入して人工呼吸を施した。Ｋｏｎｚｅｔｔ−Ｒｏｅｓｓｌｅｒ法により気道抵抗をモニターし、ＯＡ０．０５ｍｇ／ｋｇ静脈内投与で惹起される気道抵抗の増加を調べた。被検物質は０．５％カルボキシメチルセルロースに懸濁して抗原投与の４５分前に十二指腸内投与した。本発明の化合物の効果をＥＤ５０値で表し、表３に示す。
【００３２】
【表３】
＜試験例３＞
アレルギー性結膜炎モデルに対する改善作用
実験にはウイスター系のラット（日本クレア）を使用した。ラットに卵白アルブミン（ＯＡ、シグマ社製）１００μｇと１０ｍｇ水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ、ＰＩＥＲＣＥ社製）を１ｍＬの生理食塩液に懸濁し、腹腔内投与することによって感作した。アレルギー性結膜炎は、感作日から３週目以降のラットを用い、生理食塩液で３０ｍｇ／ｍＬの濃度に調製したＯＡを１０μＬ点眼することによって惹起した。薬物は、１．０％（ｗ／ｖ）の濃度で生理食塩液に懸濁し、ＯＡで結膜炎を惹起する１０分前に点眼した（陽性対照薬としてジフェンヒドラミンを０．３％（ｗ／ｖ）の濃度で生理食塩液に懸濁し、ＯＡで結膜炎を惹起する１０分前に点眼した）。
薬物の効果は、ＯＡ点眼後から２０分間に観察された、後肢で眼瞼を引っ掻く仕草（Ｉｔｃｈ−Ｓｃｒａｔｃｈ ｒｅｓｐｏｎｓｅ：痒みの指標と考えられる）の回数を測定し、下記式より痒みの抑制率を求めた。
【００３４】
コントロール群：予め感作したラットにＯＡで結膜炎を惹起する１０分前に生理食塩水を点眼した。
無処置群：感作していないラットに生理食塩水を点眼した。
計算式：
【数１】
【００３５】
＜試験例４＞
ＴＮＦ−α産生抑制作用
ラットをペントバルビタール麻酔下にてヘパリン処置した試験管に採血を行った。採血した血液と等量のＲＰＭＩ−１６４０培地を加え、２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに分注し、溶媒（ＤＭＳＯ）、または、溶媒に溶かした被験薬を添加し、３０分間、３７℃、５％ＣＯ２でプレインキュベーションを行った。反応はＬＰＳ（リポポリサッカライド）を添加して開始し、４時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションを行い、氷浴にて反応を停止した。反応停止後、３０００ｒｐｍ、４℃、１５分間遠心分離し、上清中のＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡ法にて測定した。被験薬の活性は溶媒対照群に対する産生抑制率を求め、ＴＮＦ−α産生を５０％抑制する被験薬濃度を求め評価した。
その結果、（−）−体のＩＣ５０（μＭ）は０．１１であった。
【００３６】
＜試験例５＞
ＮＫ１受容体拮抗作用
ヒト型ＮＫ１受容体を発現させたＣＨＯ細胞を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、６ｍＭ ＭｎＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０μＭ ＰＭＳＦを含むｐＨ７．４の緩衝液中でホモジナイズし、８００×ｇで１０分間遠心した。上清を１０００００×ｇで１．０時間遠心し、得られた沈渣を上記緩衝液中に再度懸濁した。タンパク量を測定後、０．０２ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬになるように、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．０ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．０１％ＢＳＡを含むｐＨ７．４の緩衝液で希釈し、ＮＫ１受容体標本として使用した。
ＮＫ１受容体への親和性は、［３Ｈ］ＳＲ１４０３３３のｂｉｎｄｉｎｇの阻害を測定することによって求めた。前述したＮＫ１受容体標本にＤＭＳＯ中に溶解した被験物質及び［３Ｈ］ＳＲ１４０３３３（最終濃度０．２５ｎＭ）を加え、２５℃で９０分間インキュベートした後、グラスフィルターで吸引濾過し、１ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．４で３回洗浄後、フィルター上の放射能活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。尚、被験物質は最終濃度で１０μＭ添加し、［３Ｈ］ＳＲ１４０３３３のバインディング阻害活性を測定した。
その結果、（−）−体はほぼ１００％の抑制率を示した。
【００３７】
＜試験例５＞
モルモット摘出気管支のサブスタンスＰ（ＮＫ１）収縮に対する抑制作用
体重３３０〜４９６ｇのハートレイ系雄性モルモットを脱血屠殺後に気管を摘出し、鎖状標本を作製した。これを９５％ Ｏ２ ＋ ５％ ＣＯ２の混合ガスを通気した３μＭインドメタシンを含むＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ液を満たしたｏｒｇａｎ ｂａｔｈ中に１ｇの負荷で懸垂した。標本の収縮反応はＦＤピックアップ及びひずみ圧力アンプを介してペンレコーダーで記録した。標本が安定した後、サブスタンスＰを１０−９〜１０−５Ｍの濃度となるよう低濃度から累積添加して収縮反応を確認した。標本をＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ液で数回洗浄した後、本発明化合物を添加して２０分間作用させた。その後、サブスタンスＰを累積添加して収縮を惹起した。
その結果、（−）−体はモルモットの摘出気管支におけるサブスタンスＰ誘発収縮のグラフを用量依存的に右側にシフトさせ、拮抗的な阻害作用を示した。
【００３８】
【発明の効果】
本発明の化合物はラセミ体に比べて約２倍のホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）ＩＶ阻害作用及び抗喘息作用を有しており、またラセミ体に比べて水に対する溶解性が著しく高いことから、喘息、慢性閉塞性肺疾患等の炎症性疾患などの治療及び／又は予防のための医薬の有効成分として極めて有用である。
Claims (7)
- （−）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オン又はその水和物若しくはその溶媒和物。
- （−）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オン並びにその水和物及びその溶媒和物からなる群から選ばれる物質を有効成分として含む医薬。
- 有効成分である上記の物質と製剤用添加物とを含む医薬組成物の形態の請求項２に記載の医薬。
- 炎症性疾患の治療及び／又は予防のための請求項２又は請求項３に記載の医薬。
- 喘息の治療及び／又は予防のための請求項２又は請求項３に記載の医薬。
- 慢性閉塞性肺疾患の治療及び／又は予防のための請求項２又は請求項３に記載の医薬。
- （−）−６−［３−（２−インダニルオキシ）−４−メトキシフェニル］−６−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−１，３−オキサジン−２−オン並びにその水和物及びその溶媒和物からなる群から選ばれる物質を含むホスホジエステラーゼＩＶ阻害薬。
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-
2002
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