JP2003532387A - 低アレルゲン性トランスジェニックダイズ - Google Patents

低アレルゲン性トランスジェニックダイズ

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ジヤング，ルドルフ
キニー，アンソニー・ジエイ
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イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー
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Abstract

(57)【要約】 一般にＰ３４として知られるダイズ空胞タンパク質ならびに他のアレルゲンを低下させるための低アレルゲン性トランスジェニックダイズおよび組換え発現構築物を開示する。これらの低アレルゲン性ダイズから製造されたダイズタンパク質産物は、主要なダイズアレルゲンであるＰ３４、およびさらに、他のマイナーなダイズアレルゲン、例えばＧｌｙ ｍ Ｂｄ ２８Ｋ、ベータ−コングリシニンのアルファ−サブユニット、ＫＳＴＩ、Ｇｌｙ ｍ２、Ｇｌｙ ｍ ＩＡ、Ｇｌｙ ｍ ＩＢ、ｒＧｌｙ ｍ３およびグリシニンＧ１を本質的に含んではならない。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 ［発明の分野］ 本発明は、低アレルゲン性トランスジェニックダイズに関し、そして具体的に
は、一般にＰ３４として知られるダイズ液胞タンパク質、ならびに他のアレルゲ
ン、例えばＧｌｙ ｍ ＩＡ、Ｇｌｙ ｍ ＩＢ、ｒＧｌｙ ｍ３およびグリシ
ニンＧ１（Ａ１ａＢ１ｂ）を低下させるための組換え発現構築物の調製に関する
。かかる構築物は、各種の食品および飼料用途に使用できる低アレルゲン性ダイ
ズ産物を製造するためにも使用できる低アレルゲン性トランスジェニックダイズ
植物を作製するために使用できる。
【０００２】 ［発明の背景］ 食品アレルギーは、小児および成人における重大な栄養学的問題である。基本
的には、タンパク質を含むあらゆる食品がヒト集団のある割合の中でアレルギー
反応を誘発する可能性を有する。大部分の食品アレルギー反応は、牛乳、卵、魚
、甲殻類、ラッカセイ、ダイズ、木の実およびコムギに起因する。時に「８大要
因」とも呼ばれるこれらの食品または食品グループは、米国内のすべての食品ア
レルギーの９０％以上を占めると推定される(Taylor et al., (1999) Nutrition
Today 34:15-22)。
【０００３】 食品中のアレルゲンは、殆ど天然に存在するタンパク質である。食品は数百万
の個別タンパク質を含むが、比較的少数の食品だけがアレルゲンとして報告され
ている。ある種の食品は、複数のアレルゲン性タンパク質を含むことが知られ、
それらにはダイズ、ラッカセイ、牛乳および卵が含まれる(Burks et al., (1988
)J. Allergy Clin. Immunol. 81:1135-42; Thanh et al., (1976) J. Agr. Food
Chem. 24:1117-21)。
【０００４】 より良い風味および高い機能性をもたらす改善された単離技術は、ダイズに感
受性の個体内でアレルギー反応を誘発し得る量の各種の食品製品におけるダイズ
タンパク質単離物および濃縮物の広範な使用をもたらす。ダイズタンパク質が多
数の加工食品の一般的成分なので、ダイズタンパク質アレルギーは、多くの人々
に著しい問題をもたらす。感受性の個体にとって、ダイズ製品の回避は困難であ
り、加工およびインスタント食品の選択に著しい制限をもたらす。ダイズ関連食
品アレルギーの発生は米国を含む多くの国で増加しているので(Taylor et al.,
Chemistry of Food Allergens in Food Allergy, Chandra R.K.(編集): Food Al
lergy, Nutrition Research Education Foundation, 1987, 21-44 ページ) 、こ
の問題に対応するために低アレルゲン性ダイズ製品を開発するという絶えず増加
する要求がある。
【０００５】 ダイズ種子の主要なヒトアレルゲンは、Ｇｌｙ ｍ Ｂｄ ３０Ｋと呼ばれる
タンパク質であり、これはＰ３４とも呼ばれ、それはこのタンパク質がダイズ種
子３４ｋＤａ種子液胞タンパク質、Ｐ３４のものと一致するＮ−末端アミノ酸配
列およびアミノ酸組成を有することが示されたからである。Ｇｌｙ ｍ Ｂｄ ３０Ｋは、(Ogawa et al., (1991) J. Nutr. Sci. Vitaminol. 37:555-565)によ
り７Ｓグロブリン画分のマイナーな成分である分子量３０ｋＤａのタンパク質と
して記載された。Ｇｌｙ ｍ Ｂｄ ３０Ｋは、システイン−プロテアーゼのパ
パイン−スーパーファミリーの遠位のメンバーでありそしてダイズタンパク質を
含む加工食品製品中に存在する(Yaklich et al, (1999)Crop Science 39:1444)
。結果は、改善された生殖細胞質ベースを用いて繁殖させて食品供給からＰ３４
を排除することは不可能であろうことを示している(Yaklich et al, (1999)Crop
Science 39:1444) 。従って、組換え技術を用いるダイズ種子からのＰ３４、な
らびに他のアレルゲン、例えばＧｌｙ ｍ ＩＡ、Ｇｌｙ ｍ ＩＢ、ｒＧｌｙ
ｍ３およびグリシニンＧ１（Ａ１ａＢ１ｂ）の排除は、食品安全を改善するだ
けでなく、感受性の個体にも利用できるダイズ製品を使用させるであろう。
【０００６】 ［発明の要約］ 本発明は、配列番号１中に記載のヌクレオチド配列に本質的に一致する単離さ
れたＧｌｙ ｍ Ｂｄ ３０Ｋ核酸フラグメントまたはその機能的等価サブフラ
グメントに操作可能に連結するプロモーターを含んでなる、ダイズのＧｌｙ ｍ
Ｂｄ ３０Ｋ（ダイズ液胞タンパク質Ｐ３４）含有量を低下させるための組換え
発現構築物に関する。
【０００７】 第２の態様では、本発明は配列番号３記載のヌクレオチド配列に本質的に一致
する単離されたＧｌｙ ｍ Ｂｄ ２８Ｋ核酸フラグメントまたはその機能的等
価サブフラグメントに操作可能に連結する、配列番号２中に記載のヌクレオチド
配列に本質的に一致する単離されたＫＳＴＩ核酸フラグメントまたはその機能的
等価サブフラグメントを含んでなる、低アレルゲン性ダイズを産生するための組
換え発現構築物に関する。
【０００８】 第３の態様では、本発明は、特許請求した組換え発現構築物の少なくとも１個
をそのゲノム内に含んでなる低アレルゲン性ダイズ植物に関する。また重要なの
は、かかる植物から得た種子、これらの種子から得た油およびかかる植物の種子
から得た油の水素化、分別、エステル交換または加水分解により製造した産物で
ある。
【０００９】 第４の態様では、本発明は、低アレルゲン性ダイズ産物、およびこのダイズ産
物または油を組み込んだあらゆる食品およびあらゆる飼料に関する。
【００１０】 第５の態様では、本発明は、 （ａ）本発明のトランスジェニック低アレルゲン性ダイズより得た種子を割って
皮より果肉を取り出し、そして （ｂ）工程（ａ）で得た果肉をフレーク化して所望のフレーク厚さを得る ことを含んでなる、低アレルゲン性ダイズ種子から低アレルゲン性ダイズ産物を
製造する方法に関する。
【００１１】 第６の態様では、本発明は、 （ａ）配列番号１中に記載のヌクレオチド配列に本質的に一致する単離されたＧ
ｌｙ ｍ Ｂｄ ３０Ｋ核酸フラグメントまたはその機能的等価サブフラグメン
トに操作可能に連結するベータ−コングリシニン(conglycinin) プロモーターを
含んでなる、ダイズのＧｌｙ ｍ Ｂｄ ３０Ｋ（ダイズ液胞タンパク質Ｐ３４
）含有量を低下するための組換え発現構築物をそのゲノム内に含んでなるダイズ
植物である第一親ダイズを、Ｇｌｙ ｍ Ｂｄ ２８Ｋ、ベータ−コングリシニ
ンのアルファ−サブユニット、ＫＳＴＩ、Ｇｌｙ ｍ２、Ｇｌｙ ｍ ＩＡ、Ｇ
ｌｙ ｍ ＩＢ、ｒＧＬＹ ｍ３およびグリシニン Ｇ１よりなる群より選ばれ
る１種またはそれ以上のダイズアレルゲンを本質的に含まない第二ダイズ親と交
雑し、そして （ｂ）低アレルゲン性である工程（ａ）の交雑物の後代植物（progeny plants）
を選別する ことを含んでなる低アレルゲン性ダイズ植物を作製するための方法に関する。
【００１２】 第７の態様では、本発明は、 （ａ）配列番号１中に記載のヌクレオチド配列に本質的に一致する単離されたＧ
ｌｙ ｍ Ｂｄ ３０Ｋ核酸フラグメントまたはその機能的等価サブフラグメン
トに操作可能に連結するベータ−コングリシニンプロモーターを含んでなるダイ
ズのＧｌｙ ｍ Ｂｄ ３０Ｋ（ダイズ液胞タンパク質Ｐ３４）含有量を低下す
るための組換え発現構築物をそのゲノム内に含んでなるダイズ植物である第一親
ダイズを、Ｇｌｙ ｍ Ｂｄ ２８Ｋを本質的に含まず、そしてベータコングリ
シニンのアルファ−サブユニットを本質的に含まない、天然に存在するダイズ変
異体である第二ダイズ親と交雑し、そして （ｂ）低アレルゲン性である工程（ａ）の交雑物の後代植物を選別する ことを含んでなる低アレルゲン性ダイズ植物を作製するための方法に関する。
【００１３】 第８の態様では、本発明は、 （ａ）特許請求した組換え構築物のいずれかをそのゲノム内に含んでなるダイズ
植物である第一親ダイズを、第二親がベータコングリシニンのアルファ−サブユ
ニットまたはその天然に存在する変種のさらに低いレベルを産生する組換え発現
構築物をそのゲノム内に含んでなるダイズ植物からなる群より選ばれる第二親と
交雑し、そして （ｂ）低アレルゲン性である工程（ａ）の交雑物の後代植物を選別する ことを含んでなる低アレルゲン性ダイズ植物を作製するための方法に関する。
【００１４】 第９の態様では、本発明は、 （ａ）特許請求した組換え構築物のいずれかをそのゲノム内に含んでなるダイズ
植物である第一親ダイズを、第二親がＫＳＴＩアレルゲンを本質的に含まない天
然に存在する変異ダイズ植物を含んでなる第二ダイズ親と交雑し、そして （ｂ）低アレルゲン性である工程（ａ）の交雑物の後代植物を選別する ことを含んでなる低アレルゲン性ダイズ植物を作製するための方法に関する。
【００１５】 また重要なのは、これらの方法により作製された植物より得た種子、これらの
種子から得た油、かかる植物の種子から得た油の水素化、分別、エステル交換ま
たは加水分解から作製した産物、低アレルゲン性ダイズ産物、および低アレルゲ
ン性ダイズ産物または油のいずれかを組み込んだ食品、幼児用調合物（infant f
ormula）および動物飼料（animal feed）である。
【００１６】 第１０の態様では、本発明は、ダイズＧｌｙ ｍ Ｂｄ ２８Ｋタンパク質を
コードする核酸配列を含んでなる単離された核酸フラグメントに関する。コード
されるタンパク質は、配列番号４によりコードされるポリペプチドまたはその機
能的等価サブフラグメントに４９％またはそれを越えるアミノ酸同一性を有する
ことができる。別の局面では、この単離された核酸は、配列番号３に記載の配列
に４８％またはそれを越える核酸同一性を有することができる。また重要なのは
、配列番号４中に記載のポリペプチド配列に４９％またはそれを越えるアミノ酸
同一性を有するあらゆる植物Ｇｌｙ ｍ Ｂｄ ２８Ｋタンパク質である。調節
配列に操作可能であるかかる核酸フラグメントまたはその逆相補体を含んでなる
キメラ遺伝子、ならびにかかるキメラ遺伝子を含んでなる低アレルゲン性ダイズ
植物、かかる植物から得た種子、かかる種子から得た油、およびかかる植物の種
子から得た油の水素化、分別、エステル交換または加水分解から製造した産物も
重要である。さらに別の局面では、本発明は、低アレルゲン性ダイズ産物、およ
びこのダイズ産物または油を組み込んだあらゆる食品またはあらゆる飼料に関す
る。
【００１７】 第１１の態様では、本発明は、ダイズＧｌｙ ｍ ２タンパク質をコードする
核酸配列を含んでなる単離された核酸フラグメントに関する。コードされるタン
パク質は、配列番号６に記載されるポリペプチドまたはその機能的等価サブフラ
グメントと９５％またはそれを越えるアミノ酸同一性を有することができる。ま
た重要なのは、配列番号４中に記載のポリペプチド配列に９５％またはそれを越
えるアミノ酸同一性を有する有するあらゆる植物Ｇｌｙ ｍ ２タンパク質であ
る。調節配列に操作可能であるかかる核酸フラグメントまたはその逆相補体を含
んでなるキメラ遺伝子、ならびにかかるキメラ遺伝子を含んでなる低アレルゲン
性ダイズ植物、これらの植物から得た種子、かかる種子から得た油、およびかか
る植物の種子から得た油の水素化、分別、エステル交換または加水分解から製造
した産物も重要である。さらに別の局面では、本発明は、低アレルゲン性ダイズ
産物、およびこのダイズ産物または油を組み込んだあらゆる食品またはあらゆる
飼料に関する。
【００１８】 第１２の態様では、本発明は、配列番号９中に記載のヌクレオチド配列に本質
的に一致する単離されたＧｌｙ ｍ ＩＢ核酸フラグメントまたはその機能的等
価サブフラグメントに操作可能に連結するプロモーターを含んでなる、ダイズの
Ｇｌｙ ｍ ＩＢ含有量を低下させるための組換え発現構築物に関する。
【００１９】 第１３の態様では、本発明は、配列番号９中に記載のヌクレオチド配列に本質
的に一致する単離されたＧｌｙ ｍ ＩＢ核酸フラグメントまたはその機能的等
価サブフラグメントに操作可能に連結するプロモーターを含んでなる、ダイズの
Ｇｌｙ ｍ ＩＢ含有量を低下させるための組換え発現構築物に関する。
【００２０】 第１４の態様では、本発明は、配列番号１１および１３中に記載のヌクレオチ
ド配列に本質的に一致する単離されたｒＧｌｙ ｍ３核酸フラグメントまたはそ
の機能的等価サブフラグメントに操作可能に連結するプロモーターを含んでなる
、ダイズのｒＧｌｙ ｍ３含有量を低下させるための組換え発現構築物に関する
。
【００２１】 第１５の態様では、本発明は、配列番号１５中に記載の核酸配列に本質的に一
致する単離されたグリシニンＧ１（Ａ１ａＢ１ｂ）核酸フラグメントまたはその
機能的等価サブフラグメントに操作可能に連結するプロモーターを含んでなる、
ダイズのグリシニンＧ１含有量を低下させるための組換え発現構築物に関する。
【００２２】 また重要なのは、特許請求した組換え発現構築物の少なくとも１個をそのゲノ
ム内に含んでなる低アレルゲン性ダイズ植物である。また重要なのは、かかる植
物から得た種子、これらの種子から得た油およびかかる植物の種子から得た油の
水素化、分別、エステル交換または加水分解から製造した産物である。さらに別
の局面では、本発明は、低アレルゲン性ダイズ産物、およびこのダイズ産物また
は油を組み込んだあらゆる食品またはあらゆる飼料に関する。
【００２３】 [発明の詳細な説明] 本開示の範囲内で、多数の用語を使用する。
【００２４】 「Ｐ３４（ダイズ液胞タンパク質）」および「Ｇｌｙ ｍ Ｂｄ ３０Ｋ」お
よび「Ｇｌｙ ｍ１」〔配列番号１〕の用語は、本明細書中では互換可能に使用
される。これらはすべて、主要な(major) ダイズ種子アレルゲンを呼ぶ。主要な
アレルゲンは、研究されたアレルギー患者の５０％またはそれ以上が特異性Ｉｇ
Ｅを有するタンパク質として一般に定義される。
【００２５】 「ＫＳＴ１」および「ＫＴｉ３」〔配列番号２〕の用語は、本明細書中では互
換可能に使用される。これらは、マイナー(minor) なダイズ種子アレルゲンであ
るクニッツ(Kunitz)ダイズトリプシンインヒビターまたはクニッツ型ダイズトリ
プシンインヒビターを呼ぶ。Ｓ−ＩＩは、β−コングリシニンのα−サブユニッ
トである６８−ｋＤａを伴う別のマイナーなダイズ種子アレルゲンである。
【００２６】 「Ｇｌｙ ｍ Ｂｄ ２８Ｋ」および「２８Ｋタンパク質」〔配列番号３およ
び４〕の用語は、本明細書中では互換可能に使用される。これらはマイナーなダ
イズ種子アレルゲンである２８キロドルトンタンパク質を呼ぶ。
【００２７】 「Ｇｌｙ ｍ２」〔配列番号５および６〕の用語とは、マイナーなダイズ種子
アレルゲンである小さい７５アミノ酸タンパク質を呼ぶ。
【００２８】 「Ｇｌｙ ｍ ＩＡ」〔配列番号９および１０〕およびＧｌｙ ｍ ＩＢの用
語とは、脂質転移タンパク質に類似性を有する疎水性ダイズ種子タンパク質を呼
ぶ。Ｇｌｙ ｍ ＩＡは１１９アミノ酸タンパク質でありそしてＧｌｙ ｍ Ｉ
Ｂはポリペプチドの最初の３個のアミノ酸残基が欠けていることを除いて一致す
る。両方共にマイナーなダイズ種子アレルゲンと考えられる。
【００２９】 「ｒＧｌｙ Ｍ３」〔配列番号１１、１２、１３、および１４〕の用語とは、
ヒトＩｇＥ抗体を結合する１３１アミノ酸のダイズプロリフィン様タンパク質を
呼ぶ。植物プロフィリンは、花粉中のパンアレルゲン(pan-allergen)であると報
告されている(Valenta et al.(1991) Science 253:557-560)。
【００３０】 グリシニンＧ１〔配列番号１５および１６〕の用語とは、４９５アミノ酸のダ
イズグリシニンタンパク質を呼ぶ。このタンパク質は、ＩｇＥ抗体に結合する酸
ドメインを含む。これより短い（２０アミノ酸）酸鎖を含むグリシニンＧ２は、
ＩｇＥを結合しない[Zeece et al. (1999) Food and Agric Immunol 11:83-90]
。ｒＧｌｙ ｍ３について以上に記載したように、ＩｇＥ結合タンパク質は潜在
的なアレルゲンと考えられる。
【００３１】 「低アレルゲン性（hypoallergenic）」の用語は、あらゆるアレルゲンを本質
的に含まないことを意味し、すなわち、免疫学的反応、例えばアレルギー反応が
誘発されてはならない。
【００３２】 本明細書中に使用される「単離された核酸フラグメント」とは、一本鎖または
二本鎖であって、場合により合成、非−天然または改変されたヌクレオチド塩基
を含むＲＮＡまたはＤＮＡポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形の単離された
核酸フラグメントは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１種またはそ
れ以上のセグメントを含んでなってもよい。ヌクレオチドは、下記のこれらの一
文字表示により呼ばれる：「Ａ」はアデノシン、「Ｃ」はシチジン、「Ｇ」はグ
アノシン、「Ｔ」はチミジン、「Ｒ」はプリン類（ＡまたはＧ）、「Ｙ」はピリ
ミジン類（ＣまたはＴ）、「Ｋ」はＧまたはＴ、「Ｈ」はＡまたはＣまたはＴ、
「Ｉ」はイノシン、そして「Ｎ」はあらゆるヌクレオチド。
【００３３】 「機能的に等価であるサブフラグメント」および「機能的等価サブフラグメン
ト」の用語は、本明細書中では互換可能に使用される。これらの用語とは、フラ
グメントまたはサブフラグメントが活性酵素をコードするかどうかにはかかわら
ず、遺伝子発現を改変するかまたはある種の表現型を産生する能力が保持されて
いる単離された核酸フラグメントの一部分またはサブ配列を呼ぶ。例えば、フラ
グメントまたはサブフラグメントは、形質転換した植物内に所望の表現型を産生
するためのキメラ遺伝子の設計の設計に使用できる。キメラ遺伝子は、活性酵素
をコードするかどうかにはかかわらず、核酸フラグメントまたはそのサブフラグ
メントを植物プロモーター配列に関して適当な方向に連結することにより、同時
抑制またはアンチセンスに使用するために設計できる。
【００３４】 本明細書中に使用する「本質的に類似（substantially similar）」および「
本質的に一致する（corresponding substantially）」の用語とは、１個または
それ以上のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現を媒介しまたは一定の表現型
を発現する核酸フラグメントの能力に影響しない核酸フラグメントを呼ぶ。これ
らの用語とは、本発明の核酸フラグメントの修飾、例えば得られた核酸フラグメ
ントの機能的性質を、最初の非修飾フラグメントと比較して本質的に改変されて
いない１種またはそれ以上のヌクレオチドの欠失または挿入も呼ぶ。従って、当
該技術分野の熟練者は、本発明が特定の例示配列以上のものを包含すること認め
ると理解される。
【００３５】 さらに、熟練者は、本発明により包含される本質的に類似する核酸配列が、適
度にストリンジェントな条件下で（例えば、０．５Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ
、６０℃）、本明細書中に例示した配列、または本明細書中に報告しそして本発
明のプロモーターに機能的に等価であるヌクレオチド配列のいかなる部分でも使
用してハイブリダイズするこれらの能力によっても定義されることを認める。本
発明により包含される好ましい本質的に類似する核酸配列は、本明細書中に報告
された核酸フラグメントに４５％同一であるかまたは本明細書中に報告されたヌ
クレオチド配列のいかなる部分にでも４５％同一であるこれらの配列である。さ
らに好ましくは、本明細書中に報告された核酸配列に５０％同一であるかまたは
本明細書中に報告されたヌクレオチド配列のいかなる部分にでも５０％同一であ
る核酸フラグメントである。最も好ましくは、本明細書中に報告された核酸配列
に６０％同一であるかまたは本明細書中に報告されたヌクレオチド配列のいかな
る部分にでも６０％同一である核酸フラグメントである。配列整列および同一パ
ーセントの算出は、相同配列を検出するために設計された種々の比較方法を用い
て決定してもよく、これには、これに限定されるものではないが、ＬＡＳＡＲＧ
ＥＮＥバイオインフォーマティックス コンピューティングスイート(bioinform
atics computing suite)(DNASTAR Inc., Madison, WI) のメガライン(Megalign)
が含まれる。配列の多重整列は、整列のクラスタル(Clustal) 法(Higgins and S
harp (1989) CABIOS.5:151-153) を使用し、デフォールトパラメーター（GAP PE
NALTY=10、GAP LENGTH PENALTY=10)を用いて実行される。クラスタル法を使用す
るタンパク質配列の対整列および一致割合の算出のためのデフォールトパラメー
ターは、KTUPLE=1、GAP PENALTY=3 、WINDOW=5およびDIAGONALS SAVED=5 であっ
た。核酸に対してこれらのパラメーターは、KTUPLE=2、GAP PENALTY=5 、WINDOW
=4およびDIAGONALS SAVED=4 であった。
【００３６】 アミノ酸またはヌクレオチド配列の「本質的部分」は、当該技術分野の熟練者
による配列の手作業配列によってでも、またはアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ
(Altschul, S.F., et al., (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410)およびキャップ
ドブラスト(Gapped Blast, Altschul, S.F., et al., (1997) Nucleic Acids Re
s. 25:3389-3402)を用いる計算機自動化配列比較および同定のいずれによってで
も、そのポリペプチドまたは遺伝子の推定同定を与えるために十分なポリペプチ
ドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなる。www.ncbi.nlm
.nih.gov/BLAST/ も参照のこと。
【００３７】 「遺伝子」とは、コーディング配列の前（５’非−コーディング配列）および
後（３’非−コーディング配列）の調節配列を含む、特定のタンパク質を発現す
る核酸フラグメントを呼ぶ。「本来の遺伝子（native gene）」とは、それ自体
の調節配列を伴って天然に見出される遺伝子を呼ぶ。「キメラ遺伝子」とは、天
然には一緒に見出されない調節およびコーディング配列を含んでなる、本来の遺
伝子ではないあらゆる遺伝子を呼ぶ。従って、キメラ遺伝子は、種々の起源に由
来する調節配列およびコーディング配列、または同じ起源に由来するがしかし天
然に見出されるものとは異なる様式で配列された調節配列およびコーディング配
列を含んでなってもよい。「内因性遺伝子（endogenous gene）」とは、生物体
のゲノム内のその天然の位置にある本来の遺伝子を呼ぶ。「外来」遺伝子とは、
宿主生物体内には通常は見出されないが、しかし遺伝子導入により宿主生物体内
に導入された遺伝子を呼ぶ。外来遺伝子は、本来ではない生物体内に挿入された
本来の遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」
は、形質転換操作によりゲノム内に導入された遺伝子である。
【００３８】 「コーディング配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を呼
ぶ。「調節配列」とは、コーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、
その中、または下流（３’非コーディング配列）に位置するヌクレオチド配列を
呼び、そしてこれは転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または関連するコ
ーディング配列の翻訳に影響する。調節配列は、プロモーター、転写リーダー配
列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列を含んでもよく、しかしこれに
限定はされない。
【００３９】 「プロモーター」とは、コーディング配列または機能性ＲＮＡの発現を制御で
きるＤＮＡ配列を呼ぶ。プロモーター配列は、近位およびさらに遠位の上流要素
からなり、後者の要素はしばしばエンハンサーと呼ばれる。従って、「エンハン
サー」は、プロモーター活性を刺激できそしてプロモーターのレベルまたは組織
特異性を増強するために挿入されたプロモーターの先天性要素または異種要素で
あってもよいＤＮＡ配列である。プロモーターは、本来の遺伝子からその全体を
誘導されても、または天然に見いだされる異なるプロモーターから誘導された異
なる要素からなっても、または合成ＤＮＡセグメントを含んでなってもよい。当
該技術分野の熟練者により、異なるプロモーターは、異なる組織または細胞タイ
プ内で、または発生の異なる段階で、または異なる環境条件に応答して遺伝子の
発現を導いてもよいと理解されている。ほとんどの時点で大部分の細胞タイプ内
で発現されるべき遺伝子を発生させるプロモーターは、通常「構成的プロモータ
ー」と呼ばれる。植物細胞内で有用な種々のタイプの新しいプロモーターは、次
々と発見されている。多数の例は、オカモトおよびゴールドベルグの収集(Okamo
to and Goldberg, (1989) Biochemistry of Plants 15:1-82) で見出してもよい
。多くの場合に、調節配列の正確な境界は完全には決定されていないので、一部
変種のＤＮＡフラグメントは同様のプロモーター活性を有してもよいことがさら
に認められている。
【００４０】 「イントロン」は、タンパク質配列の一部分をコードしない遺伝子内の介在配
列である、従って、かかる配列はＲＮＡ内に転写はされるがしかしその後切除さ
れて翻訳されない。この用語は、切除されたＲＮＡ配列のためにも使用される。
「エキソン」は、転写された遺伝子の配列の一部分であってそして遺伝子から誘
導された成熟メッセンジャーＲＮＡ内に見いだされるが、最終遺伝子産物をコー
ドする配列の一部分である必要は必ずしもない。
【００４１】 「翻訳リーダー配列」とは、遺伝子のプロモーター配列とコーディング配列と
の間に位置するＤＮＡ配列を呼ぶ。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列の上流の
完全にプロセシングされたｍＲＮＡ内に存在する。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮ
Ａへの一次転写物のプロセシング、ｍＲＮＡ安定性または翻訳効率に影響を与え
てもよい。翻訳リーダー配列の例は、文献にある(Turner, R. and Foster, G.D.
(1995) Molecular Biotechnology 3:225)。
【００４２】 「３’非コーディング配列」とは、コーディング配列の下流に位置するＤＮＡ
配列を呼び、そしてポリアデニル化認識配列およびその他のｍＲＮＡプロセシン
グまたは遺伝子発現に影響が可能なその他の配列コード化調節シグナルを含む。
ポリアデニル化シグナルは、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラ
クトの付加に影響することで通常は特徴付けられる。種々の３’非コーディング
配列の使用は、インゲルブレヒトら(Ingelbrecht et al., (1989) Plant Cell 1
:671-680) に例示されている。
【００４３】 「ＲＮＡ転写物」とは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ−触媒転写からもた
らされる産物を呼ぶ。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全に相補性コピーである場
合には、これは一次転写物と呼ばれまたはこれは一次転写物の転写後プロセシン
グから誘導された配列であってもよくそして成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセン
ジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、イントロンを含まずそして細胞によりタンパ
ク質内に翻訳できるＲＮＡを呼ぶ。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡ鋳型に相補性で
ありそして酵素逆転写酵素を用いてこれから合成されるＤＮＡを呼ぶ。ｃＤＮＡ
は、一本鎖であってもよくまたはＤＮＡポリメラーゼＡＩのクレノウフラグメン
トを用いて二本鎖形に変換できる。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含みそし
て細胞内または生体外でタンパク質に翻訳できるＲＮＡ転写物を呼ぶ。「アンチ
センスＲＮＡ」とは、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全体または一部分に相補
性でありそして標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を呼ぶ（米国特許
（ＵＳ）第５，１０７，０６５号）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺
伝子転写物のいかなる部分、例えば５’非コーディング配列、３’非コーディン
グ配列、イントロン、またはコーディング配列を伴ってもよい。「機能性ＲＮＡ
」とは、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または翻訳はされないがしか
しまだ細胞プロセスに影響を有するＲＮＡを呼ぶ。「相補」または「逆相補」の
用語は、ｍＲＮＡ転写物に関して互換可能に本明細書中では使用され、そしてメ
ッセージのアンチセンスＲＮＡを規定することを意図する。
【００４４】 「操作可能に連結」の用語とは、一方の機能が他方により影響を受ける単一核
酸フラグメントに対する核酸配列の関連を呼ぶ。例えば、プロモーターは、これ
がそのコーディング配列の発現に影響を及ぼし得る場合に、コーディング配列と
操作可能に連結している（すなわち、コーディング配列は、プロモーターの転写
制御下にある）。コーディング配列はセンスまたはアンチセンス方向で調節配列
に操作可能に連結していることができる。
【００４５】 本明細書中に使用される「発現」の用語とは、機能性最終産物の産生を呼ぶ。
遺伝子の発現または過剰発現は、遺伝子の転写および前駆体または成熟タンパク
質へのｍＲＮＡの翻訳を含む。「アンチセンス阻害」とは、標的タンパク質の発
現を抑制する能力があるアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を呼ぶ。「過剰発現」
とは、正常または非形質転換生物体内の産生のレベルを越えたトランスジェニッ
ク生物体内の遺伝子産物の産生を呼ぶ。「同時抑制（Co-suppression）」とは、
同一または本質的に類似する外来または内因性遺伝子の発現を抑制する能力があ
るセンスＲＮＡ転写物の産生を呼ぶ（米国特許（ＵＳ）第５，２３１，０２０号
）。
【００４６】 ある種の適用のために植物内の該当ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を
低下または排除することも望ましいであろう。これを達成するために、該当ポリ
ペプチドの同時抑制のために設計されたキメラ遺伝子を、そのポリペプチドをコ
ードする遺伝子または遺伝子フラグメントを植物プロモーター配列に連結して構
築できる。あるいは、該当核酸フラグメントの全体または部分のためのアンチセ
ンスＲＮＡを発現するように設計されたキメラ遺伝子は、逆方向の遺伝子または
遺伝子フラグメントを植物プロモーター配列に連結して構築できる、同時抑制ま
たはアンチセンスキメラ遺伝子遺伝子のどちらも、形質転換を介して植物内に導
入でき、ここで相当する内因性遺伝子の発現は低下または排除される。
【００４７】 改変された遺伝子発現を有する植物の生成のための分子遺伝子的解決は、さら
に伝統的な植物育成方法よりも決定的な長所を有する。植物表現型の変化は、ア
ンチセンス阻害または同時抑制により１種またはそれ以上の遺伝子の発現を特異
的に阻害して生成できる（米国特許（ＵＳ）第５，１９０，９３１号、第５，１
０７，０６５号および第５，２８３，３２３号）。アンチセンスまたは同時抑制
構築物は遺伝子活性の優性の負の調節体として行動する。通常の変異は、遺伝子
活性の負の調節を生成できるが、これらの効果は多くの場合に劣性である。トラ
ンスジェニック法で利用できる優性の負調節は、育種の見通しのために有利であ
ろう。その上、組織特異性プロモーターの使用による植物の再生性組織への特異
性表現型の発現を制限する能力は、変異体遺伝子が通常発現されるすべての組織
内で効果を有するであろう通常の変異と比較して農学的な利益を与えるであろう
。
【００４８】 当該技術分野の熟練者は、特別の考慮が特定の遺伝子の発現を低下させるため
のアンチセンスまたは同時抑制技術の使用と関連することを知っているであろう
。例えば、センスまたはアンチセンス遺伝子の発現の適当なレベルは、熟練者に
は公知の異なる調節要素を使用する異なるキメラ遺伝子の使用を要するであろう
。上記の方法の一つによりトランスジェニック植物が得られると、所望の表現型
を最も効率的に示すものに関して個々のトランスジェニック体をスクリーニング
することが必要であろう。従って、熟練者は、多数の形質転換体をスクリーニン
グするための方法を開発しようと考える。これらのスクリーニングの性質は、一
般に実際的な基礎に基づいて選定され、そして本発明の固有の部分ではない。例
えば、抑制されている遺伝子によりコード化されるタンパク質に特異性の抗体を
用いて遺伝子発現における変化を観察してスクリーニングでき、または酵素活性
を特異的に測定するアッセイを確立できる。多数の形質転換体が所望の表現型に
対して陰性であると予想されるので、好ましい方法は、多数の試料を迅速に処理
できるものである。
【００４９】 「改変された発現」とは、野生型生物体からの同様の組織（器官および発生中
のタイプ）内のその活性から著しく異なる量または比率でのトランスジェニック
生物体中の遺伝子産物の産生を呼ぶ。
【００５０】 「成熟」タンパク質とは、翻訳後にプロセシングされたポリペプチドを呼び、
すなわちこれから一次翻訳産物中に存在するあらゆるプレペプチドまたはプロペ
プチドが除去されたものである。「前駆体」タンパク質とは、ｍＲＮＡの翻訳の
一次産物を呼び、すなわちプレペプチドまたはプロペプチドはまだ存在する。プ
レペプチドまたはプロペプチドは細胞内局在シグナルであってもよく、これに限
定はされない。
【００５１】 「葉緑体遷移(transit) ペプチド」とは、タンパク質と関連して翻訳されそし
てその中でタンパク質が作製される細胞内に存在する葉緑体またはその他のプラ
スチドタイプにタンパク質を導くアミノ酸配列である。「葉緑体遷移配列」とは
、葉緑体遷移ペプチドをコードするヌクレオチド配列を呼ぶ。「シグナルペプチ
ド」とは、タンパク質と関連して翻訳されそしてタンパク質を分泌系に導くアミ
ノ酸配列である(Chrispeels, J.J.,(1991) Ann.Rev.Plant Phys.Plant Mol.Biol
.42:21-53)。タンパク質が液胞に導かれる場合に、液胞標的シグナル（上記）を
さらに加えるか、または内因性小胞体に導かれる場合には、小胞体保持シグナル
（上記）を加えてもよい。タンパク質が核に導かれる場合には、存在するあらゆ
るシグナルペプチドを排除しそしてその代わりに核局在化シグナルを含めなけれ
ばならない(Raikhel(1992) Plant Phys.100:1627-1632)。
【００５２】 「形質転換」とは、宿主生物体のゲノム内への核酸フラグメントの転移を呼び
、遺伝子的に安定な遺伝をもたらす。形質転換された核酸フラグメントを含む宿
主生物体は、「トランスジェニック」生物体と呼ばれる。コメ、トウモロコシお
よびその他の単子葉植物の細胞形質転換の好ましい方法は、粒子加速または「遺
伝子ガン」形質転換技術(Klein et al., (1987) Nature(London)327:70-73:米国
特許(US)第4,945,050 号) または導入遺伝子を含む適当なＴｉプラスミドを用い
るアグロバクテリウム(Agrobacterium) 媒介法(Ishida Y. et al., 1996, Natur
e Biotech. 14:745-750)の使用である。
【００５３】 本明細書中に使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該
技術分野では周知でありそしてサンブルックら「分子クローニング：実験マニュ
アル」(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Lab
oratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor,
1989)（以後「サンブルック」と呼ぶ）にさらに詳細に記載されている。
【００５４】 「組換え」という用語は、例えば化学合成によりまたは遺伝子操作技術による
核酸の単離されたセグメントの操作による２個のさもなければ分離している配列
のセグメントの人口的な組合せを呼ぶ。
【００５５】 「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」とは、大量の特定のＤＮＡセグメ
ントの合成のための技術であって、一連の反復サイクルからなる(Perkin-Elmer
Cetus Instruments, Norwalk, CT) 。典型的には、二本鎖ＤＮＡを熱変性し、標
的セグメントの３’境界に相補的な２個のプライマーを低温でアニールし、次い
で中間温度で延伸する。これらの３段の連続段階の１組をサイクルと呼ぶ。
【００５６】 「発現構築物」および「組換え発現構築物」という用語は、本明細書中で互換
可能に使用される。本明細書中に使用するこれらの用語は、本明細書中で考察す
るように単独またはたがいに組み合わせて使用する本発明のあらゆる単離された
核酸フラグメントまたはそのサブフラグメントを含んでなる。これらは宿主細胞
内への導入およびその中での複製が可能な組換え核酸構築物、典型的にはＤＮＡ
構築物内に組み込むことができる。かかる構築物は、それ自体でもまたはベクタ
ーと関連して使用してもよい。ベクターを使用する場合には、ベクターの選定は
、宿主植物を形質転換するために使用される方法に依存し、これは当該技術分野
の熟練者には周知である。例えば、プラスミドベクターが使用できる。熟練者は
、本発明の単離された核酸フラグメントのいずれかを含んでなる宿主細胞を形質
転換、選定および繁殖することに成功するためにベクター上に存在しなければな
らない遺伝要素を良く知っている。熟練者は、異なる独立した形質転換事象が発
現の異なるレベルおよびパターンをもたらし(Jones et al., (1985) EMBO J.4:2
411-2418; De Almeida et al.,(1989) Mol. Gen. Genetics 218:78-86)、従って
所望の発現レベルおよびパターンを示す系統を得るために多重事象をスクリーニ
ングしなければならないことも認めるであろう。かかるスクリーニングは、ＤＮ
Ａのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のウエスタン分
析または表現型分析により行ってもよい。
【００５７】 上記のようにＰ３４はダイズ内の主要アレルゲンを構成し、そしてダイズタン
パク質を含む加工食品中に存在する。ダイズ感受性個体からの免疫グロブリンを
用いるＩｇＥ結合のアッセイは、全アレルゲン性反応の６５％はＰ３４に帰する
ことができることを示す。エピトープマッピングによるＰ３４のアレルゲン性の
詳細な免疫学的解析は、タンパク質上に少なくとも１２の明確なエピトープが存
在することを示した。
【００５８】 Ｐ３４は、翻訳後に処理される大きい前駆体ドメインを含むシステインプロテ
アーゼの保存された特性の大部分を有する。一次配列は、パパインスーパーファ
ミリーの保存された三次コンフォーメーション内で重要である整列および保存さ
れたアミノ酸を含む。Ｐ３４は、パパインスーパーファミリーの他のメンバーか
らこれを分けるいくつかの独特の特徴を示す。これらの中では、すべての他のパ
パインファミリータンパク質に見いだされる活性部位中の保存されたシステイン
のグリシンによる置換があり、タンパク質が酵素的に不活性であることを示唆す
る。システインプロテアーゼは、酸−還元条件下で典型的には自己プロセシング
され、大きい前駆体ドメインの開裂をもたらす。しかし、Ｐ３４はアスパラギン
残基の後で一段階でプロセシングされ、これは恐らく１１Ｓ貯蔵(storage) タン
パク質をプロセシングすると同じ酵素による。配列比較および整列は、Ｐ３４が
パパインスーパーファミリーのメンバーではあるけれども、これはダイズ中で同
定されたものを含み酵素的活性システインプロテアーゼとも大きく異なることを
示す。
【００５９】 Ｐ３４は、細菌が分泌するシリンゴライド誘発体(syringolide elicitor)を結
合することによりシュードモナス(Pseudomonas) 感染に対する防御の機能を有す
ることができる。Ｐ３４は種子中に多数存在するが、しかし細菌感染を受ける植
物細胞内にも見いだされる。
【００６０】 Ｐ３４アレルゲンは、組換え技術、例えばＰ３４タンパク質をコードする単離
された核酸フラグメントのセンス抑制を用いて、胚に致死的となることなく、ダ
イズ胚から本質的に除去できることが見いだされた。
【００６１】 従って、一つの態様では、本発明は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列に
本質的に一致する単離されたＧｌｙ ｍ Ｂｄ ３０Ｋ核酸フラグメントまたは
その機能的等価サブフラグメントに操作可能に連結するプロモーターを含んでな
る、ダイズのＧｌｙ ｍ Ｂｄ ３０Ｋ（ダイズ液胞タンパク質Ｐ３４）含有量
を低下させるための組換え発現構築物に関する。そのゲノム内に上記の組換え発
現構築物を含んでなるトランスジェニックダイズ植物は、Ｐ３４に関して低アレ
ルゲン性でなければならない。
【００６２】 本発明を実施するためにいかなるプロモーターでも使用できる。ベータ−コン
グリシニンプロモーター、クニッツトリプシンインヒビター（ＫＳＴＩ）プロモ
ーター、Ｇｌｙ ｍ Ｂｄ ２８Ｋプロモーター、Ｔ７プロモーター、３５Ｓプ
ロモーターおよびベータ−ファセオリンプロモーターを挙げることができる。好
ましいプロモーターは、ベータ−コングリシニンのα’−サブユニットのもので
ある（本明細書中ではベータ−コングリシニンプロモーターと呼ぶ）。ベータ−
コングリシニンのα’−サブユニットのプロモーターを有する組換え発現構築物
を含む同時抑制植物は、ベータ−コングリシニンのαおよびα’サブユニット両
者の抑制をしばしば示す（１９９７年１２月１８日付け公開のＰＣＴ公開番号Ｗ
Ｏ９７／４７７３１中に記載され、その公開内容は引用することによって編入さ
れる）。特に好ましいプロモーターは、種子−特異性発現を許容するものである
。種子は摂取可能なタンパク質および油の一次資源であり、そして種子特異性発
現は種子以外の組織内のあらゆる潜在的な有害な作用を避けるので、これは特に
有用であることができる。これは、このタンパク質を欠いた植物にとって有害な
作用を意味する天然に起きるかまたは誘導される突然変異がこの遺伝子内で回復
されるので、Ｐ３４の低いかまたは検出不能レベルを有する植物にとって特に重
要である。
【００６３】 種子特異性プロモーターの例は、これらに限定はされないが、種子貯蔵タンパ
ク質のプロモーターを含み、これは多くの植物内の全種子タンパク質の９０％ま
でを占めることができる。種子貯蔵タンパク質は厳密に調節され、高度に組織特
異性および段階特異性の様式で殆ど独占的に種子内で発現される(Higgins et al
.,(1984) Ann.Rev.Plant Physiol.35:191-221; Goldberg et al.,(1989) Cell 5
6:149-160)。その上、異なる種子貯蔵タンパク質は種子発生の異なる段階で発現
されてもよい。
【００６４】 種子特異性遺伝子の発現は非常に詳細に研究されている(Goldberg et al.,(19
89) Cell 56:149-160 およびHiggins et al.,(1984) Ann.Rev.Plant Phsiol.35:
191-221 の総説参照) 。トランスジェニック双子葉植物内の種子貯蔵タンパク質
遺伝子の種子特異性発現の多数の例が現在ではある。これらは、インゲンマメ(b
ean)β−ファセオリン(Sengupta-Gopalan et al.,(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 82:3320-3324;Hoffman et al.,(1988)Plant Mol.Biol.11:717-729)、インゲン
マメレクチン(Voelker et al.,(1987)EMBO J 6:3571-3577) 、ダイズレクチン(O
kamuro et al.,(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8240-8244)、ダイズクニッツ
トリプシンインヒビター(Perez-Grau et al.,(1989)Plant Cell 1:095-1109) 、
ダイズb-コングリシニン(Beachy et al.,(1985)EMBO J.4:3047-3053)、エンドウ
マメ(pea) ビシリン(vicilin)(Higgins et al.,(1988)Plant Mol.Biol.1:683-69
5)、エンドウマメコンビシリン(convicilin)(Newbigin et al.,(1990)Planta 18
0:461-470)、エンドウマメレグミン(legumin)(Shirsat et al.,(1989)Mol.Gen.G
enetics 215:326-331)、ナタネナピン(napin)(Radke et al.,(1988)Theor.Appl.
Genet. 75:685-694)のための双子葉植物からの遺伝子ならびに単子葉植物からの
遺伝子、例えばメイズ１５ｋＤゼイン(Hoffman et al.,(1987)EMBO J. 6:3213-3
221)、メイズ１８ｋＤオレオシン(Lee et al.,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
8:6181-6185)、オオムギβ−ホルデイン(Marris et al.,(1988)Plant Mol.Biol.
10:359-366) およびコムギグルテニン(Colot et al.,(1987)EMBO J. 6:3559-356
4)を含む。さらに、キメラ遺伝子構築物内の異種コーディング配列に操作可能に
連結する種子特異性遺伝子のプロモーターは、トランスジェニック植物内でのこ
れらの一時的および空間的発現パターンも維持する。かかる例は、シロヌイナズ
ナ属(Arabidopsis) およびアブラナ(Brassica napus)種子中のエンケファリンペ
プチドを発現するシロヌイナズナ(Arabidopsis thaliana)２Ｓ種子貯蔵タンパク
質遺伝子プロモーター(Vandekerckhove et al.,(1989)Bio/Technology 7:929-93
2)、 ルシフェラーゼを発現するインゲンマメレクチンおよびインゲンマメβ−フ
ァセオリンプロモーター(Riggs et al.,(1989)Plant Sci. 63:47-57)、およびク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを発現するコムギグルテニンプ
ロモーター(Colot et al.,(1987) EMBO J. 6:3559-3564) の使用を含む。
【００６５】 本発明の核酸フラグメントの発現において特に有用なのは、ベータコングリシ
ニンからの異種ダイズ種子貯蔵タンパク質遺伝子プロモーターであろう(Harada
et al.,(1989) Plant Cell 1:415-425) 。このプロモーターは、トランスジェニ
ック植物内の種子発生の中期および後期における子葉内の同時抑制のために特に
有用である(Beachy et al.,(1985) EMBO J. 4:3047-3053)。これは、トランスジ
ェニック種子中のその発現に対してほとんど位置効果がないためである。このプ
ロモーターの付加的な利益は、トランスジェニックプロモーターとしてのその使
用が内因性ベータコングリシニンタンパク質の高頻度の同時抑制を起こすことが
知られていることで理解される。このタンパク質は、ダイズ内のマイナーなアレ
ルゲンであることが知られている(Bush and Hefle(1996)Critical Rev in Food
Science and Nutrition 36:S119-S163) 。
【００６６】 第２の態様では、本発明は、配列番号３記載のヌクレオチド配列に本質的に一
致する単離されたＧｌｙ ｍ Ｂｄ ２８Ｋ核酸フラグメントまたはその機能的
等価サブフラグメントに操作可能に連結する、配列番号２中に記載のヌクレオチ
ド配列に本質的に一致する単離されたＫＳＴＩ核酸フラグメントまたはその機能
的等価サブフラグメントを含んでなる、低アレルゲン性ダイズを産生するための
組換え発現構築物に関する。本明細書中に記載する組換え発現構築物の少なくと
も１個をそのゲノム中に含んでなるトランスジェニックダイズ植物は、下記のア
レルゲン：Ｐ３４、ＫＳＴＩ、およびＳＩＩの１種またはそれ以上のに関して低
アレルゲン性でなければならない。
【００６７】 第３の態様では、本発明は、本発明の発現構築物の少なくとも１個をそのゲノ
ム中に含んでなる低アレルゲン性ダイズ植物、これらの植物から得た種子、かか
る植物の種子から得た油、かかる植物の種子から得た油の水素化、分別、エステ
ル交換または加水分解より製造した製品、低アレルゲン性ダイズ製品、および本
明細書中に記載したあらゆる低アレルゲン性ダイズ製品または油を組み込んだあ
らゆる食品またはあらゆる飼料に関する。
【００６８】 かかるトランスジェニックダイズ植物は、以上に考察したように当該技術分野
の熟練者には周知の慣用の技術を用いて作製できる。導入遺伝子の植物中への導
入、すなわち形質転換は、当該技術分野の熟練者には周知である。植物細胞形質
転換の好ましい方法は、粒子加速または「遺伝子ガン」形質転換技術(Klein et
al.,(1978)Nature(London)327:70-73;米国特許(US)第4,945,050 号) の使用であ
る。
【００６９】 第４の態様では、本発明は、少なくとも１個の本発明の組換え発現構築物をそ
のゲノム中に含んでなるトランスジェニックダイズ植物から得た低アレルゲン性
ダイズ産物に関する。
【００７０】 「ダイズタンパク質産物」とは、ダイズ種子より製造されるこれらの品目とし
て定義され次いであらゆる食品およびあらゆる飼料の製造における構成成分、例
えば朝食用シリアル、製パン用（例えばパン、ロールなど）、乳製品または食肉
に基づく食品製品、例えば幼児用調合物、栄養飲料、代用乳、ダイズ増量ボロー
ニャソーセージ、模造加工チーズスプレッド、塩水注入ハム、ヨーグルトおよび
冷凍デザートなどとして使用される。表１に、ダイズ種子から誘導される各種の
ダイズタンパク質産物を表で示す。「ダイズタンパク質産物（製品）」および「
ダイズ産物（製品）」の用語は、本明細書中で互換可能に使用される。ダイズタ
ンパク質加工を図１に記載する。
【００７１】 表１ ダイズ種子より誘導されるダイズタンパク質製品a 全ダイズ製品 加工したダイズタンパク質製品 炒ダイズ ダイズ粗びき粉 焼ダイズ ダイズグリット ダイズもやし 全脂肪および脱脂肪粉 ダイズ乳 ダイズタンパク質単離物 ダイズタンパク質濃縮物 特殊ダイズ食品／構成成分 ダイズ代用肉 ダイズ乳 組織化粉および濃縮物 トーフ 構造化濃縮物(Structured Concentrates) テンペ(Tempeh) 構造化単離物(Structured Isolates) ミソ ショウユ 加水分解した植物性タンパク質ホイッピングタンパク質 a 「ダイズタンパク質製品：特性、栄養面および利用」(Soy Protein Product
s:Characteristics, Nutritional Aspects and Utilization(1987). Soy Protei
n Counsil)参照 「プロセシング（加工）」とは、表１に示した製品を得るために使用されるあ
らゆる物理的および化学的方法を呼び、そして熱処理、フレーキングおよび粉砕
、押出し、溶剤抽出、または水浸漬および全種子または種子の一部の押出しを含
み、これに限定はされない。さらに、「プロセシング（加工）」は、全種子また
は種子の一部からダイズタンパク質を濃縮および単離するために使用される方法
、ならびに発酵ダイズ食品製品を調製するための種々の伝統的な東洋的方法を含
む。商業用標準および規格が多数のこれらの製品について確立している（Nation
al Oilseed Processors Association Yearbook and Trading Rules 1991-1992参
照）。「高タンパク質」または「低タンパク質」であると呼ばれる製品とは、こ
れらの標準規格に記載のものである。「ＮＳＩ」とは、American Oil Chemist's
Society Method Ac4 41により定義された窒素溶解度指数(Nitrogen Solubility
Index) を呼ぶ。「ＫＯＨ窒素溶解度」とは、ダイズ粗びき粉品質の指標であり
そしてアラバら(Araba and Dale(1990) Poultry Science 69:76-83) に記載の条
件下で０．０３６Ｍ ＫＯＨ中に可溶性の窒素の量を呼ぶ。
【００７２】 「白色」フレークとは、約８５〜９０のＮＳＩを有する水分調整加熱で脱脂お
よび処理したフレーク化、皮むき子葉を呼ぶ。この用語は、Ｕ．Ｓ．標準ふるい
サイズ１００番を通して磨砕した同様のＮＳＩを有する粉も呼ぶことができる。
「調理した」とは、約２０〜６０のＮＳＩを有するダイズタンパク質製品、典型
的には粉を呼ぶ。「トーストした」は、２０以下のＮＳＩを有するダイズタンパ
ク質製品、典型的には粉を呼ぶ。
【００７３】 「グリット」とは、Ｕ．Ｓ．標準ふるいサイズ１０〜８０番を有する脱脂、皮
むき子葉を呼ぶ。ダイズ粉およびグリットは、ダイズフレークを油除去の前また
はその後のいずれかで粉砕およびふるい分けして製造される。これらのタンパク
質含有量は４０％〜５４％の範囲内である。ダイズ粉およびグリットはヒトの摂
取のために用いられるダイズタンパク質製品の最も粗製の形でありそして脂肪含
有量、粒径、および熱処理の程度が変化してもよい。これらはレシチン化または
再脂肪化した形で製造してもよい。熱処理の程度は種々のレベルの水分散性、す
なわち多数の食品用途で目的に適合した機能性に有用であり得る品質である。
【００７４】 「ダイスタンパク質濃縮物」とは、皮むき、脱脂したダイズから３種の基本プ
ロセス：酸浸出（ｐＨ約４．５）、アルコール（約５５〜８０％）を用いる抽出
、および水を用いる抽出の前に湿潤加熱を用いるタンパク質の変性より製造され
るこれらの製品を呼ぶ。ダイスタンパク質濃縮物を製造するために代表的に使用
される条件は、パス(Pass (1975)米国特許(US)第3,897,574 号);キャンベルら(C
ampbell et al., (1985) in New Protein Foods, ed. by Altschul and Wilcke,
Academic Press, Vol.5, Chapter 10,Seed Storage Proteins, 302-338 ページ
) により記載されている。従って、本明細書中に使用する「ダイズタンパク質濃
縮物」の用語は、高品質、健全で清浄な皮むきしたダイズ種子より大部分の油お
よび水溶性のタンパク質以外の成分を除去して製造されそして無水物基準で６５
％以上のタンパク質を含まなければないこれらの製品を呼び、これは[(1966)Off
icial Publication of the Association of American Feed Control Officials,
Inc.]に記載されている。酸浸出により製造された中和濃縮物は、アルコール浸
出または熱変性技術のいずれかにより製造されたものよりも高いタンパク質含有
量を有する。他のプロセスでは、低水溶性ダイズタンパク質濃縮物（アルコール
水溶液抽出）は、水蒸気注入またはジャケット煮沸による滅処理を受けて溶解度
および機能性を上昇させる。機能性は、追加の処理によりさらに改善してもよい
。濃縮物はエマルション化剤およびエマルション安定剤として機能し、これらは
脂肪と水とを結合し、そしてこれらはこれらの単離物に同様の特殊な接着性を与
える。
【００７５】 本明細書中に子葉される「ダイズタンパク質単離物」とは、タンパク質以外の
化合物の大部分を除去して皮むきしたダイズから調製されたダイズの主要なタン
パク質画分であるこれらの製品を呼び、そして無水物基準でタンパク質９０％以
上を含まなければならず、これは[(1966)Official Publication of the Associa
tion of American Feed Control Officials, Inc.]に記載されている。単離物は
、分散性を改善しそしてダスト発生を低下するためにレクチン化してもよい。ゲ
ル化および非ゲル化変種の両者、ならびに種々の粘度のグレードも入手可能であ
る。
【００７６】 「押出」とは、材料（グリット、粉または濃縮物）を、材料の組織を改変する
手段として高い圧力および温度を用いてジャケット付オーガを通すプロセスを呼
ぶ。「組織化」および「構造化」とは、材料の物理的特性を変性するために使用
する押出プロセスを呼ぶ。熱可塑性押出を含むこれらのプロセスの特性は、以前
に記載されている[Atkinson,(1970)米国特許(US)第3,488,770 号、Horan(1985)
New Protein Foods 中、Altshcul and Wilcke 編集、Academic Press, 1A巻、第
8 章、367-414 ページ] 。さらに、ダイズタンパク質製品を含む複雑な食品混合
物の押出処理の間に使用する条件は、以前に記載されている[Rocky(1983) Feed
Manufacturing Technology III,222-237;McCulloch米国特許(US)第4,454,804 号
] 。
【００７７】 本発明の低アレルゲン性ダイズ植物から得た種子より製造した油は、種々の用
途に使用できる。これらの油は、食品の調整に使用できる。その例には、これら
に限定はされないが、構成成分として、コーティングとして、サラダ油として、
スプレイ油として、炒め油として、およびフライ油としての使用が含まれる。そ
の中に油を使用してもよい食品には、これらに限定はされないが、クラッカーお
よびスナック食品、キャンディー製品、シロップおよびトッピング、ソースおよ
び肉汁、スープ、バターおよびパン(breading)ミックス、パン焼きミックスおよ
びパン生地が含まれる。
【００７８】 これらの油は、ブレンドした油製品を製造するためのブレンド原料(blending
source) としても使用できる。ブレンド原料とは、本発明の油を他の植物油と混
合して他の油の特性、例えば脂肪酸組成、風味、および酸化安定性を改善できる
ことを意味する。使用できる本発明の油の量は、得られる最終ブレンド油製品内
で到達すべき所望の特性に依存する。ブレンド油製品の例には、これらに限定は
されないが、マーガリン、ショートニング、フライ油、サラダ油などが含まれる
。
【００７９】 別の局面では、本発明の油はさらなる処理、例えば水素化、分別、エステル交
換または脂肪分割（加水分解）を受けることができる。
【００８０】 さらに別の局面では、本発明は、本発明の油の製造の間に生成する副製品に関
する。
【００８１】 ダイズ油および粗びき粉を製造するためのダイズ種子の抽出および加工のため
の方法は、ダイズ加工産業界では周知である。一般に、ダイズ油は、油を含む種
子から食用油製品の抽出および精製を達成する一連の工程を用いて製造される。
ダイズ油およびダイズ副製品は、下記の図に記載の一般化工程を用いて製造され
る。
【００８２】 ダイズ種子を洗浄、熱処置、皮むき、およびフレーク化し、これらは油抽出の
効率を上昇する。油抽出は、通常は溶剤（ヘキサン）抽出により行われるがしか
し物理的圧力および／または溶剤抽出の組合せにより行うこともできる。得られ
る油を粗油と呼ぶ。リン脂質およびその他の極性および中性脂質複合体を加水分
解して粗油を脱ガムしてもよく、この工程は未加水分解のトリグリセリド画分（
ダイズ油）からのそれらの分離を容易にする。得られたレシチンガムはさらに処
理されて、種々の食品および工業的製品内で乳化および剥離（抗粘着）剤として
使用される、商業的に重要なレシチン製品を製造してもよい。
【００８３】 レシチンは、リン脂質、ホスホグリセリドまたはグリセロールホスファチドと
呼ばれる複雑な脂質類の一員を構成する。これらは細胞膜の特性的主要成分であ
る。高級植物および動物中で最も豊富なリン脂質はホスファチジルコリンおよび
ホスファチジルエタノールアミンであり、これらは頭基(head group)としてそれ
ぞれアミノアルコール、エタノールアミンおよびコリンを含む。（これらのホス
ホグリセリドに推奨される新しい名称は、ホスファチジルコリンおよびホスファ
チジルエタノールアミンである。以前の慣用の名称はそれぞれレシチンおよびセ
ファリンである）。これら２種のホスホグリセリドは、大部分の動物細胞膜の主
要成分である。上記のいわゆるレシチン製品は、実際には主としてホスファチジ
ルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンであるリン脂質の混合物である
。
【００８４】 脱ガムした油は、不純物：主として遊離脂肪酸、色素、および残留ガムを除去
するためにさらに精製してもよい。精製は、粗油中の脂肪酸と反応して石鹸を形
成しそしてホスファチドおよびタンパク質を水和するカセイアルカリを加えて行
う。精製の間に形成された痕跡量の石鹸を洗浄するために水を使用する。石鹸原
料の副産物を動物飼料中に直接使用してもまたは遊離脂肪酸を回収するために軽
く酸性化してもよい。色素は、漂白土を用いる吸着により除去し、これは大部分
の葉緑素およびカロテノイド化合物を除去する。精製した油は水素化ができ、種
々の溶融性および組織を有する油脂となる。脱ろう（分別）は、注意して制御し
た冷却条件下での晶出を通じて水素化油からステアリンを除去するために使用し
てもよい。主として減圧下での水蒸気蒸留である脱臭は最終工程でありそして油
に臭気または風味を与える化合物を除去するために設計される。その他の価値あ
る副産物、例えばトコフェロールおよびステロールは、脱臭工程の間に除去して
もよい。これらの副製品を含む脱臭した蒸留物は、天然ビタミンＥおよびその他
の高価値薬剤製品の製造のために販売してもよい。精製、漂白、（水素化、分別
）および脱臭した油および脂肪を包装しそして直接販売するかまたはさらに特殊
化した製品にさらに加工してもよい。ダイズ種子処理、ダイズ油製造および副産
物利用のさらに詳細な参考文献は、エリクソン「ダイズ加工および利用の実用ハ
ンドブック」(Erickdon,(1995)Practical Handbook of Soybean Processing and
Utilization, The American Oil Chemists' Society and United Soybean Boar
d)中に見い出すことができる。
【００８５】 水素化は、触媒、例えばニッケルの助けをかりて不飽和脂肪酸二重結合に水素
を付加する化学反応である。高オレイン酸ダイズ油は、不飽和のオレイン酸、リ
ノール酸およびリノレン酸の脂肪酸を含みそしてこれらそれぞれは水素化できる
。水素化は２種の主要な効果を有する。第一は、不飽和脂肪酸含有量の低下の結
果、油の酸化安定性が上昇する。第二に、脂肪酸変性が融点が上昇して、室温に
おける半固体または固体油脂をもたらして油の物理的性質が変化する。
【００８６】 一方では最終製品の組成を変化させる水素化反応に影響する多数の変数がある
。圧力、温度、触媒タイプおよび濃度、攪拌および反応器設計を含む設計条件が
、なかでも制御できる最も重要なパラメーターである。選択的水素化条件は、不
飽和度が低いものよりも、不飽和度が高い脂肪酸を水素化するために好んで使用
できる。非常に軽いすなわちブラシ水素化は、液状油の安定性を増すためにしば
しば利用される。さらなる水素化は液状油を物理的に固体油脂に変換する。水素
化の程度は、特定の最終製品について設計される所望の性能および溶融特性に依
存する。パン焼き製品の製造に使用される液状ショートニング、固体油脂および
商業用フライおよび炒め物に使用されるショートニング、およびマーガリン製造
のためのベースストックは、水素化を介して達成される可能な多数の油脂製品の
一例である。水素化および水素化製品のさらに詳細な説明は、パッターソン「油
脂の水素化：理論と実際」(Patterson,H.B.W.,(1994)Hydrogenation of Fats an
d Oils: Theory and Practice. The American Oil Chemists' Society)中に見出
すことができる。
【００８７】 エステル交換(interesterification) とは、エステルと酸との間（酸分解）、
エステルとアルコールとの間（アルコール分解）またはエステルとエステルとの
間（エステル相互変換(transesterification) ）の脂肪族アシル部分の交換を呼
ぶ。エステル交換反応は、化学または酵素的プロセスを用いて達成される。ラン
ダムまたは直接エステル相互変換プロセスは、脂肪酸組成を変化させることなく
トリグリセリド分子上の脂肪酸を転位する。変性されたトリグリセリド構造は改
変された物理的性質を有する油脂をもたらしてもよい。リパーゼを用いて誘導さ
れたエステル相互変換反応は、ココアバター代替品のような高価値特殊製品への
興味を増加させる。エステル交換反応を用いて商業的に製造される製品には、こ
れらに限定はされないが、ショートニング、マーガリン、ココアバター代替品お
よび中程度の長鎖脂肪酸およびポリ不飽和脂肪酸を含む構造化脂質が含まれる。
エステル交換は、さらにフイ(Hui, Y.H.,(1996) Bailey's Industrial Oil and
Fat Products, 第４巻、John Wiley & Sons)中で考察されている。
【００８８】 脂肪酸および脂肪酸メチルエステルは、植物油から誘導される２種の重要な油
化学製品である。脂肪酸は、多数の製品、例えば石鹸、中位鎖長トリグリセリド
、ポリオールエステル、アルカノルアミドなどの製造に使用される。植物油は、
これらの相当する脂肪酸およびグリセリンに加水分解すなわち分裂できる。種々
の脂肪分裂プロセスで製造された脂肪酸製品は、粗製品のまままたはしばしば蒸
留および分別により画分または個別の脂肪酸に精製して使用してもよい。精製さ
れた脂肪酸およびその画分は、各種の油化学製品、例えばダイマーおよびトリマ
ー酸、ジ酸、アルコール、アミン、アミド、およびエステルに変換される。脂肪
酸メチルエステルは、多数の油化学製品、例えば脂肪アルコール、アルカノール
アミド、α−スルホン化メチルエステル、ディーゼル油成分などのための出発材
料として脂肪酸に次々と置換している。グリセリンは、植物油の分裂または加水
分解を用いるトリグセリドの分裂によっても得られる。脂肪酸および油化学製品
の商業的使用に関するその他の参考文献は、エリクソン「ダイズ加工および利用
の実用ハンドブック」(Erickdon,D.R.(1995)Practical Handbook of Soybean Pr
ocessing and Utilization, The American Oil Chemists' Society and United
Soybean Board)、プライド「脂肪酸」(Pryde, E.H. (1979)Fatty Acids, The Am
erican Oil Chemists' Society);およびフイ(Hui, Y.H.,(1996) Bailey's Indus
trial Oil and Fat Products, 第４巻、John Wiley & Sons)中に見いだすことが
できる。
【００８９】 第５の態様では、本発明は、 （ａ）少なくとも１種の本発明の組換え構築物をそのゲノム中に含んでなる低ア
レルゲン性ダイズ植物から得た種子を割って皮より果肉を取り出し、そして （ｂ）工程（ａ）で得た果肉をフレーク化して所望のフレーク厚さを得る ことを含んでなる低アレルゲン性ダイズ種子から低アレルゲン性ダイズ産物を製
造する方法に関する。
【００９０】 第６の態様では、本発明は、 （ａ）配列番号１中に記載のヌクレオチド配列に本質的に一致する単離されたＧ
ｌｙ ｍ Ｂｄ ３０Ｋ核酸フラグメントまたはその機能的等価サブフラグメン
トに操作可能に連結するベータ−コングリシニンプロモーターを含んでなるダイ
ズのＧｌｙ ｍ Ｂｄ ３０Ｋ（ダイズ液胞タンパク質Ｐ３４）含有量を低下す
るための組換え発現構築物をそのゲノム中に含んでなるダイズ植物である第一親
ダイズを、Ｇｌｙ ｍ Ｂｄ ２８Ｋ、ベータ−コングリシニンのアルファ−サ
ブユニット、ＫＳＴＩ、Ｇｌｙ ｍ２、Ｇｌｙ ｍ ＩＡ、Ｇｌｙ ｍ ＩＢ、
ｒＧＬＹ ｍ３およびグリシニン Ｇ１よりなる群より選ばれる１種またはそれ
以上のアレルゲンを本質的に含まない第二ダイズ親と交雑し、そして （ｂ）低アレルゲン性である工程（ａ）の交雑物の後代植物を選別する ことを含んでなる低アレルゲン性ダイズ植物を作製するための方法に関する。
【００９１】 本方法で製造された低アレルゲン性ダイズ植物、それより得た種子、種子より
得た油、かかる種子より得たダイズタンパク質製品およびかかるダイズタンパク
質製品または油を組み込んだあらゆる食品または飼料は、下記：主要ダイズアレ
ルゲンであるＰ３４、およびマイナーダイズタンパク質アレルゲンであるＧｌｙ
ｍ Ｂｄ ２８Ｋ、ベータ−コングリシニンのアルファ−サブユニット、ＫＳ
ＴＩ、Ｇｌｙ ｍ２、Ｇｌｙ ｍ ＩＡ、Ｇｌｙ ｍ ＩＢ、ｒＧＬＹ ｍ３お
よびグリシニン Ｇ１の１種またはそれ以上に関して低アレルゲン性でなければ
ならない。
【００９２】 第７の態様では、本発明は、 （ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列に本質的に一致する単離されたＧｌ
ｙ ｍ Ｂｄ ３０Ｋ核酸フラグメントまたはその機能的等価サブフラグメント
に操作可能に連結するベータ−コングリシニンプロモーターを含んでなるダイズ
のＧｌｙ ｍ Ｂｄ ３０Ｋ（ダイズ液胞タンパク質Ｐ３４）含有量を低下する
ための組換え発現構築物をそのゲノム内に含んでなるダイズ植物である第一親ダ
イズを、Ｇｌｙ ｍ Ｂｄ ２８Ｋを本質的に含まず、そしてベータコングリシ
ニンのアルファ−サブユニットを本質的に含まない、天然に存在するダイズ突然
変異体である第二ダイズ親と交雑し、そして （ｂ）低アレルゲン性である工程（ａ）の交雑物の後代植物を選別する ことを含んでなる低アレルゲン性ダイズ植物を作製するための方法に関する。
【００９３】 本方法で製造された低アレルゲン性ダイズ植物、それより得た種子、種子より
得た油、かかる種子より得たダイズタンパク質製品およびかかるダイズタンパク
質製品または油を組み込んだあらゆる食品または飼料は、下記：主要ダイズアレ
ルゲンであるＰ３４、およびマイナーダイズタンパク質アレルゲンであるＧｌｙ
ｍ Ｂｄ ２８Ｋおよびベータ−コングリシニンのアルファ−サブユニットの
１種またはそれ以上に関して低アレルゲン性でなければならない。
【００９４】 第８の態様では、本発明は、 （ａ）本発明の組換え構築物の少なくとも１種をそのゲノム中に含んでなるダイ
ズ植物である第一親ダイズを、第二親がベータコングリシニンのアルファ−サブ
ユニットまたはその天然に存在する変種のさらに低いレベルを産生する組換え発
現構築物をそのゲノム中に含んでなるダイズ植物からなる群より選ばれる第二ダ
イズ親と交雑し、そして （ｂ）低アレルゲン性である工程（ａ）の交雑物の後代植物を選別する ことを含んでなる低アレルゲン性ダイズ植物を作製するための方法に関する。
【００９５】 本方法で製造された低アレルゲン性ダイズ植物、それより得た種子、種子より
得た油、かかる種子より得たダイズタンパク質製品およびかかるダイズタンパク
質製品または油を組み込んだあらゆる食品または飼料は、主要ダイズアレルゲン
であるＰ３４、およびマイナーダイズタンパク質アレルゲンである６８−Ｋ（ｂ
−コングリシニンのａサブユニット）、ＫＳＴＩ（ＫＴｉ３）、Ｇｌｙ ｍ２、
Ｇｌｙ ｍ ＩＡ、Ｇｌｙ ｍ ＩＢ、ｒＧＬＹ ｍ３およびグリシニン Ｇ１
に関して低アレルゲン性でなければならない。
【００９６】 第９の態様では、本発明は、 （ａ）少なくとも１種の本発明の組換え構築物の少なくとも１種をそのゲノム内
に含んでなるダイズ植物である第一親ダイズを、第二親がＫＳＴＩアレルゲンを
本質的に含まない天然に存在する変異ダイズ植物を含んでなる第二ダイズ親と交
雑し、そして （ｂ）低アレルゲン性である工程（ａ）の交雑物の後代植物を選別する ことを含んでなる低アレルゲン性ダイズ植物を作製するための方法に関する。
【００９７】 本方法で製造された低アレルゲン性ダイズ植物、それより得た種子、種子より
得た油、かかる種子より得たダイズタンパク質製品およびかかるダイズタンパク
質製品または油を組み込んだあらゆる食品または飼料は、主要ダイズアレルゲン
であるＰ３４、およびマイナーダイズタンパク質アレルゲンである６８−Ｋ（β
−コングリシニンのａサブユニット）、ＫＳＴＩ（ＫＴｉ３）、Ｇｌｙ ｍ２、
Ｇｌｙ ｍ ＩＡ、Ｇｌｙ ｍ ＩＢ、ｒＧＬＹ ｍ３およびグリシニン Ｇ１
に関して低アレルゲン性でなければならない。
【００９８】 また重要なものは、かかる植物より得た種子、これらの種子より得た油、かか
る種子より得たダイズタンパク質製品およびかかるダイズタンパク質製品または
油を組み込んだあらゆる食品または飼料ならびにかかる植物の種子より得た油の
水素化、分別、エステル交換または加水分解より製造されたあらゆる製品である
。
【００９９】 第１０の態様では、本発明は、ダイズＧｌｙ ｍ Ｂｄ ２８Ｋタンパク質を
コードする核酸配列を含んでなる単離された核酸フラグメントに関する。核酸フ
ラグメントによりコードされるタンパク質は、配列番号４に記載のポリペプチド
配列またはその機能的等価サブフラグメントに４９％またはそれを越えるアミノ
酸同一性を有することができる。
【０１００】 別の局面では、この単離された核酸フラグメントは、配列番号３に記載の配列
に４８％またはそれを越える核酸一致を有することができる。
【０１０１】 また重要なのは、配列番号４によりコードされるポリペプチド配列に４９％ま
たはそれを越えるアミノ酸同一性を有するＧｌｙ ｍ Ｂｄ ２８Ｋタンパク質
に類似のあらゆる植物タンパク質である。重要な植物タンパク質は、種子貯蔵タ
ンパク質、修飾、例えばグリコシル化を示すタンパク質、またはアレルゲン性タ
ンパク質を含み、これらに限定はされない。
【０１０２】 調節配列に操作可能であるかかる核酸フラグメントまたはその逆相補体を含ん
でなるキメラ遺伝子、ならびにかかるキメラ遺伝子を含んでなる低アレルゲン性
ダイズ植物、かかる植物から得た種子、かかる種子から得た油、およびかかる植
物の種子から得た油の水素化、分別、エステル交換または加水分解から製造した
製品も重要である。さらに別の局面では、本発明は、低アレルゲン性ダイズ産物
、およびそのダイズ産物または油を組み込んだあらゆる食品またはあらゆる飼料
に関する。
【０１０３】 低アレルゲン性ダイズ産物は以上に考察する。かかる産物は、単離物、濃縮物
、粗びき粉（meal）、グリット（grits）、全脂肪および脱脂肪した粉、代用肉
（textured protein）、組織化粉（textured flour）、組織化濃縮物（textured
concentrate）および組織化単離物（textured isolate）を含み、これらに限定
はされない。
【０１０４】 第１１の態様では、本発明は、ダイズＧｌｙ ｍ ２タンパク質をコードする
核酸配列を含んでなる単離された核酸フラグメントに関する。コードされるタン
パク質は、配列番号６記載のポリペプチド配列またはその機能的等価サブフラグ
メントと９５％またはそれを越えるアミノ酸同一性を有することができる。
【０１０５】 別の局面では、この単離された核酸フラグメントは、配列番号５記載の配列に
７０％またはそれを越える核酸同一性を有することができる。また重要なのは、
配列番号４中に記載のポリペプチド配列に９５％またはそれを越えるアミノ酸同
一性を有するあらゆる植物Ｇｌｙ ｍ２タンパク質である。調節配列に操作可能
のかかる核酸フラグメントまたはその逆相補体を含んでなるキメラ遺伝子、なら
びにかかるキメラ遺伝子を含んでなる低アレルゲン性ダイズ植物、かかる植物か
ら得た種子、かかる種子から得た油、およびかかる植物の種子から得た油の水素
化、分別、エステル交換または加水分解から製造した製品も重要である。さらに
別の局面では、本発明は、以上に考察した低アレルゲン性ダイズ産物、およびそ
のダイズ産物または油を組み込んだあらゆる食品またはあらゆる飼料に関する。
【０１０６】 第１２の態様では、本発明は、配列番号９中に記載のヌクレオチド配列に本質
的に一致する単離されたＧｌｙ ｍ ＩＢ核酸フラグメントまたはその機能的等
価サブフラグメントに操作可能に連結するプロモーターを含んでなる、ダイズの
Ｇｌｙ ｍ ＩＢ含有量を低下させるための組換え発現構築物に関する。
【０１０７】 第１３の態様では、本発明は、配列番号９中に記載のヌクレオチド配列に本質
的に一致する単離されたＧｌｙ ｍ ＩＢ核酸フラグメントまたはその機能的等
価サブフラグメントに操作可能に連結するプロモーターを含んでなる、ダイズの
Ｇｌｙ ｍ ＩＢ含有量を低下させるための組換え発現構築物に関する。
【０１０８】 第１４の態様では、本発明は、配列番号１１および１３中に記載のヌクレオチ
ド配列に本質的に一致する単離されたｒＧｌｙ ｍ３核酸フラグメントまたはそ
の機能的等価サブフラグメントに操作可能に連結するプロモーターを含んでなる
、ダイズのｒＧｌｙ ｍ３含有量を低下させるための組換え発現構築物に関する
。
【０１０９】 第１５の態様では、本発明は、配列番号１５中に記載のヌクレオチド配列に本
質的に一致する単離されたグリシニンＧ１核酸フラグメントまたはその機能的等
価サブフラグメントに操作可能に連結するプロモーターを含んでなる、ダイズの
グリシニンＧ１（Ａ１ａＢ１ｂ）含有量を低下させるための組換え発現構築物に
関する。
【０１１０】 また重要なのは、特許請求した組換え発現構築物の少なくとも１個をそのゲノ
ム内に含んでなる低アレルゲン性ダイズ植物である。また重要なのは、かかる植
物から得た種子、これらの種子から得た油およびかかる植物の種子から得た油の
水素化、分別、エステル交換または加水分解から製造し製品である。さらに別の
局面では、本発明は、低アレルゲン性ダイズ産物、およびこのダイズ産物または
油を組み込んだあらゆる食品またはあらゆる飼料に関する。
【０１１１】 実施例 本発明は、下記の実施例でさらに特定され、ここで特に断らない限りすべての
部および百分率は重量基準でありそして温度は摂氏である。これらの実施例は本
発明の好ましい態様を示すけれども、説明のためのみに提示されることと理解さ
れるべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当該技術分野の熟練者
は本発明の本質的な特性を確認でき、そしてその精神および範囲から離れること
なく、種々の用途および条件に適合させるために本発明の種々の変化および改変
を行うことができる。本明細書中に使用した引用文献内に含まれる開示は、引用
することによって本明細書に編入される。
【０１１２】 実施例１ ダイズ体細胞不定胚(somatic embryo)のＧｌｙ ｍ１含有量の改変 遺伝子抑制によるダイズ胚のＧｌｙ ｍ１含有量を変化する能力を、トランス
ジェニックダイズ体細胞不定胚を調製しそしてイソフラボンレベルをアッセイし
て試験した。ジーンバンク(Genebank)クローンＪ０５５６０からの全挿入物を、
Perkin Elmer Applied Biosystems GeneAmp PCR Systemにおいて、Ｐｆｕポリメ
ラーゼ(Stratagene)を用い、配列番号７および配列番号８に示すプライマーを用
いて標準ＰＣＲ反応で増幅した。
【０１１３】 ５’−ＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＧＧＴＴＴＣＣＴＴＧＴＧＴ− ３’ 〔配列番号７〕 ５’−ＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＧＡ− ３’ 〔配列番号８〕 得られたフラグメントはプライマー配列（上記に下線）内のＮｏｔ Ｉ部位によ
り結合されそして５’リーダー配列、Ｇｌｙ ｍ１のためのコーディング領域、
配列番号からの非翻訳３’領域および３’末端における１８Ａ残基の部分を含む
。このフラグメントをＮｏｔ Ｉを用いて消化しそしてＮｏｔ Ｉ消化およびホ
スファターゼ処理ｐＫＳ６７に連結した。プラスミドｐＫＳ６７は、ｐＲＢ２０
（米国特許（ＵＳ）第５，８４６，７８４）より８００ｂｐノパリン(nopalin)
合成酵素３’非翻訳領域（Ｎｏｓ３’）をこれより短い２８５ｂｐ Ｎｏｓ３’
フラグメントで置換して調製した。両方のＮｏｓ３’フラグメントもポリアデニ
ル化シグナル配列を含む(Depicker A. et al.,(1982)J.Mol.Appl.Genet.1:561-5
73) 。クローンを、Ｂａｍ ＨＩを用いる消化によりＧｌｙ ｍ１挿入物フラグ
メントのセンス方向についてスクリーニングした。図４に示した得られたプラス
ミドｐＫＳ７３は、Ｇｌｙ ｍ１をコードするフラグメントに操作可能に連結す
るベータ−コングリシニンプロモーター、次いでＮｏｓ３’末端を有する。プラ
スミドｐＫＳ７３は大腸菌のある種の系統、例えばラムダＤＥ３（これはｌａｃ
Ｖ５制御下でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する）に溶原性であるＮｏｖ
ａＢｌｕｅ（ＤＥ３）(Novagenより) 中のＨＰＴ酵素の発現のためのＴ７プロモ
ーター／ＨＰＴ／Ｔ７ターミネーターカセットを含む。プラスミドｐＫＳ７３は
、植物中のＨＰＴ酵素の構成的発現のための３５Ｓ／ＨＰＴ／ＮＯＳ３’カセッ
トも含む。これらの２種の発現系は、細菌および植物の両者中においてプラスミ
ドＤＮＡ配列を含む細胞を同定するための手段として使用されるハイグロマイシ
ンの存在における増殖のための選択を許容する。
【０１１４】 実施例２ ダイズ体細胞不定胚カルチャーの形質転換 ダイズ胚形成性懸濁カルチャーを、回転シェーカー上の３５ｍｌ液体培地（Ｓ
Ｂ５５またはＳＢＰ６）中、毎分１５０回転、２８℃で、蛍光および白熱灯混合
照明下、１６：８時間の昼／夜スケジュールで維持した。液体培地３５ｍｌ中に
組織約３５ｍｇを接種して、カルチャーを４週間毎にサブカルチャーした。
【０１１５】 表２ ストック溶液(g/L): SB55 (リットルあたり、ｐＨ5.7) 硫酸MS 100X ストック 10mL 各MSストック MgSO4 7H2O 37.0 1 mL B5ビタミンストック MnSO4 H2O 1.69 0.8g NH4NO3 ZnSO4 7H2O 0.86 3.033g KNO3 CuSO4 5H2O 0.0025 1 mL 2,4-D(10mg/mL ストック)ハロゲン化MS 100X ストック 60 G スクロース CaCl2 2H2O 44.0 0.667gアルパラギン KI 0.083 SBP6 CoCl2 6H2O 0.00125 0.5 mL 2,4-D以外はSB55と同様 KH2PO4 17.0 SB103(リットルあたり、ｐＨ5.7) H3BO3 0.62 1X MS 塩 Na2MoO4 2H2O 0.025 6% マルトースMS FeEDTA 100X ストック 750mg MgCl2 Na2EDTA 3.724 0.2% ゲルライト(Gelrite) FeSO4 7H2O 2.784 SB71-1 (リットルあたり、ｐＨ5.7) B5ビタミンストック 1X B5塩 10g ｍ−イノシトール 1ml B5ビタミンストック 100mg ニコチン酸 3% スクロース 100mg ピリドキシンＨＣｌ 750mg MgCl2 1g チアミン 0.2% ゲルライト ダイズ胚形成性懸濁カルチャーを粒子ガン打込法によりｐＴＣ３を用いて形質
転換した(Klein et al.(1987)Nature 327:70) 。デュポン バイオリスティック
(DuPont Biolistic)ＰＤＳ１０００／ＨＥ装置（ヘリウム改装）をこの形質転換
のために使用した。
【０１１６】 ６０ｍｇ／ｍｌの１ｍｍ金粒子懸濁液の５０ｍｌに下記を加えた（順番に）；
５μｌ ＤＮＡ（１μｇ／μｌ）、２０μｌスペルミジン（０．１Ｍ）、および
５０μｌ ＣａＣｌ2 （２．５Ｍ）。粒子調製液を３分間攪拌し、マイクロ遠心
分離機で１０秒間回転しそして上清を取り去った。次いでＤＮＡ被覆粒子を４０
０μｌの７０％エタノール中で１回洗浄しそして無水エタノール４０μｌ中に再
懸濁した。ＤＮＡ／粒子懸濁液を３回、それぞれ１秒間超音波処理した。次いで
ＤＮＡ被覆金粒子５μｌをそれぞれのマクロキャリヤーディスク上に加えた。
【０１１７】 ４週間経過した懸濁カルチャーの約３００〜４００ｍｇを空の６０ｘ１５ｍｍ
ペトリ皿中に置きそして残留液体をピペットを用いて組織から取り去った。それ
ぞれの形質転換実験について、組織の約５〜１０プレートに通常打込(bombard)
した。膜破裂発力は１０００ｐｓｉに設定しそしてチャンバーを水銀柱２８イン
チの真空に減圧した。組織は、保持スクリーンから約３．５インチ離して置き、
そして３回打込した。打込の後、組織を液体中に戻して置きそして上記のように
して培養した。
【０１１８】 打込の１１日後、液体培地を５０ｍｇ／ｍｌハイグロマイシンを含む新しいＳ
Ｂ５５と交換した。選択培地は一週間毎に更新した。打込の７週間後に、緑色の
形質転換組織が非形質転換、壊死性胚形成性クラスターから成長することが観察
された。単離された緑色組織を取り出しそして個別のフラスコ中に接種して新し
いクローン的に増殖する形質転換した胚形成性懸濁液カルチャーを生成させた。
このように、それぞれの新しい系統は、独立した形質転換事象として取り扱った
。次いでこれらの懸濁液は、サブカルチャーを通じる未成熟発生段階でクラスタ
ー化した胚の懸濁液として維持、または個別の体細胞不定胚の成熟および発芽に
より全植物に再生できた。
【０１１９】 形質転換した胚形成性クラスターの３系統（３／１、６／１、および７／１）
を液体カルチャーから取り出し、ホルモンまたは抗生物質を含まない固体カンテ
ン培地（ＳＢ１０３）上に置いた。胚を４週間、２６℃で蛍光、白熱灯混合照明
を１６：８時間の昼夜スケジュールで用いて培養した。この期間中、個別の胚を
クラスターから取り出しそしてタンパク質ブロット分析によりこれらのアレルゲ
ン性タンパク質の欠損に関してスクリーニングした（実施例４）。
【０１２０】 実施例３ トランスジェニックダイズ体細胞不定胚の表現型は得られた再生植物からの種子 表現型の予測である 成熟ダイズ体細胞不定胚は、接合胚の良いモデルである。液体カルチャー内の
球状胚状態にある間は、ダイズ体細胞不定胚は成熟した接合ダイズ胚の典型であ
るトリアシルグリセロールまたは貯蔵タンパク質の非常に低い量を含む。この発
生段階において、全トリアシルグリセリドの全極性脂質（リン脂質および糖脂質
）に対する比は約１：４であり、これは体細胞不定胚カルチャーが開始される発
生段階にある接合ダイズ胚の典型である。球状段階でも同様に、優勢な種子タン
パク質、β−コングリシニンのα’−サブユニット、クニッツトリプシンインヒ
ビター３、および種子レクチンのためのｍＲＮＡは、本質的に存在しない。成熟
した体細胞不定胚状態への分化を許容するホルモンを含まない培地に移すと、ト
リアシルグリセロールは最も豊富な脂質の種類となる。同様に、β−コングリシ
ニンのα’−サブユニット、クニッツトリプシンインヒビター３、および種子レ
クチンのためのｍＲＮＡは、全ｍＲＮＡ集団中で非常に豊富なメッセージとなる
。これに基づいて、ダイズ体細胞不定胚系は、成熟している生体内接合ダイズ胚
と著しく類似して挙動し、従って脂肪酸生合成経路内の遺伝子の発現を変性する
表現型効果を解析するための良好で迅速なモデル系である。
【０１２１】 最も重要なのは、このモデル系が、トランスジェニック胚より誘導された植物
からの種子の脂肪酸組成の予測でもあることである。これは、ＰＣＴ公開番号Ｗ
Ｏ９３／１１２４５号およびＷＯ９４／１１５１６号中に記載のプロトコールに
従って構築された２種の異なる実験タイプにおける２種の異なるアンチセンス構
築物で説明される。液体カルチャー球状胚は、その開示を引用することによって
本明細書中に編入する１９９３年６月１０日付けで公開されたＰＣＴ公開番号Ｗ
Ｏ９３／１１２４５号中に記載のようにダイズミクロソームΔ15デサチュラーゼ
（実験１）、またはその開示を引用することによって本明細書中に編入する１９
９４年５月２６日付けで公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１１５１６号中に
記載のようにダイズミクロソームΔ12デサチュラーゼ（実験２）、を含んでなる
キメラ遺伝子を用いて形質転換された。両方の遺伝子構築物は、種子特異性プロ
モーター（β−コングリシニンプロモーター）の制御下でアンチセンス方向に導
入されそして成熟胚を発生させた。ベクターのみ（対照）およびアンチセンスキ
メラ遺伝子を含むベクターを用いて形質転換した系統からの成熟体細胞不定胚な
らびにこれらから再生された植物の種子の脂肪酸含有量を決定した。
【０１２２】 実験１では、それぞれの系統からの胚１組を脂肪酸含有量に関して分析しそし
て同じ系統からの胚の別の組を植物に再生させた。
【０１２３】 実験２では、同じアンチセンス構築物を含む異なる系統を体細胞不定胚中の脂
肪酸分析のためおよび植物への再生のために使用した。実験１では、対照と比較
してトランスジェニック胚系統中に低下した１８：３含有量が見られたすべての
場合に、対照と比較して、低下した１８：３含有量がその系統から誘導された植
物の分離された種子中にも観察された（表３）。
【０１２４】 実験２では、形質転換胚系統の約５５％が、対照と比較して増加した１８：１
含有量を示した（表４）。同じアンチセンス構築物を含む異なる体細胞不定胚系
統から再生された植物のダイズ種子は、体細胞不定胚と同様の高オレイン酸形質
転換体の頻度（５３％）を有していた（表４）。時には、胚系統はキメラ性であ
ってもよい。すなわち、系統中の胚の１０〜７０％は導入遺伝子を含んでいなく
てもよい。導入遺伝子を含む残った胚は、すべの場合にクローン性であることが
見いだされた。かかる場合に、野生型おおびトランスジェニック表現型の両方の
植物は、その系統から分析された大部分の胚がトランスジェニック表現型を有し
ていても、単一のトランスジェニック系統から再生されてもよい。この一例を表
５に示し、ここで、５種の植物は単一胚系統から再生され、３種は高オレイン酸
表現型を有し、そして２種は野生型であった。多くの場合に、単一トランスジェ
ニック系統から再生されたすべての植物は、導入遺伝子を含む種子を有するであ
ろう。従って、トランスジェニック成熟体細胞不定胚内に観察される改変された
脂肪酸表現型は、その系統から誘導された植物の種子の改変された脂肪酸組成の
予測であると結論された。
【０１２５】 表３ 対照およびΔ15アンチセンス構築物トランスジェニックダイズ系統の胚および種 子の１８：３含有率 胚平均 種子平均形質転換系統 （ＳＤ、ｎ＝１０） （ＳＤ、ｎ＝１０） 対照 １２．１（２．６） ８．９（０．８） Δ15アンチセンス、系統１ ５．６（１．２） ４．３（１．６） Δ15アンチセンス、系統２ ８．９（２．２） ２．５（１．８） Δ15アンチセンス、系統３ ７．３（１．１） ４．９（１．９） Δ15アンチセンス、系統４ ７．０（１．９） ２．４（１．７） Δ15アンチセンス、系統５ ８．５（１．９） ４．５（２．２）Δ15アンチセンス、系統６ ７．６（１．２） ４．６（１．６） *〔野生型表現型を有しそして導入遺伝子のコピーを持たないで分離された種子
は、これらの平均には含まれていない〕 表４ Δ12デサチュラーゼアンチセンス構築物を用いるかまたは用いないで形質転換さ れた再生ダイズの体細胞不定胚および種子中のオレイン酸レベル ベクター系統の＃ 高１８：１を １８：１％ 有する系統の＃ の平均 * 体細胞不定胚 ： 対照 １９ ０ １２．０ Δ12アンチセンス ２０ １１ ３５．３再生された植物の種子 ： 対照 ６ ０ １８．２ Δ12アンチセンス １７ ９ ４４．４ *トランスジェニック体の平均１８：１は、その系統からの少なくとも１個の胚
または種子が、対照値（胚中で１２．０、種子中で１８．２）より標準偏差の２
倍より大きい１８：１含有量を有していた、Δ12アンチセンス構築物を用いて形
質転換された全胚または種子の平均である。対照平均は、いかなるトランスジェ
ニックＤＮＡも含まないがトランスジェニック体と同様の様式で処理された胚ま
たは種子の平均である。 表５ 植物系統４から分離された５種の独立した植物からの種子の分析 植物＃ 平均種子１８：１％ 最高種子１８：１％ １ １８．０ ２６．３ ２ ３３．６ ７２．１ ７ １３．６ ２１．２ ９ ３２．９ ５７．３ １１ ２４．５ ４１．７ 単一胚系統から再生された５種の異なる植物からの種子１５〜２０個の平均。植
物＃２，９，１１のみが高い１８：１表現型を有する種子を有する。 実施例４ 形質転換した胚のＧｌｙ １ｍ含有量のアッセイ Ｇｌｙ １ｍへの抗体は、ヘルマンら(Herman, E.M., Melroy, D.L., Buckhou
t, T.J.,(1990)Plant Physiol. 94:341-349)に記載されたものでああり、その開
示はここに引用することによって編入される。
【０１２６】 実施例２中に記載したトランスジェニックした胚を、液体窒素中で、試料緩衝
液（０．４％ＳＤＳを含む０．１２５Ｍトリス−ＨＣｌ、Ｐｈ６．８、２０％グ
リセロール、４％ＳＤＳ、０．２％２−メルカプトエタノール）で比１：５（Ｗ
／Ｖ）を用いて乳鉢内で冷凍磨砕した。可溶化したタンパク質を７０℃に加熱し
そして標準ＳＤＳポリアクリルアミドゲル(Sambrook et al.(1989)"Molecular C
loning"Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) 上を
流した。溶解したタンパク質を標準エレクトロトランスファーによりニトロセル
ロース膜に移した。膜を３％ゼラチン溶液を用いて処理して非−特異性結合をブ
ロックした。次いでフィルターを９０分間、１％ゼラチンを含むＴＢＳ（トリス
ＨＣｌ、２．４２ｇ／ｌ、ｐＨ７．５、ＮａＣｌ２９．２ｇ／ｌ）中の抗体含有
の透明化腹水液体(ascite fluid)（上記に引用したヘルマンの文献中に記載）の
１：５０００希釈物を用いてインキュベーションした。膜をＴＢＳを用いて洗浄
し、次いで抗−マウスＩｇＧアルカリホスファターゼ(Sigma) の１：５０００希
釈物を用いてインキュベーションした。膜をＴＢＳを用いて洗浄し、そしてオー
スベルら(Ausubel et al(1999) Current Protocols in Molecular Biology,第2
巻,10.8.13〜10.8.16 ページ) に記載のようにして１，２−ジオキセタン−リン
酸発光検出を用いて最終的に可視化した。
【０１２７】 アッセイの結果を図２に示す。上記の実施例２に記載した３種の独立して形質
転換したダイズ胚（３／１、６／１、および７／１）をＧｌｙ １ｍタンパク質
の存在について試験した。左の図は、各レーンに加えた全タンパク質を示し、そ
して右の図は抗体結合の結果を示す。他の２種の胚とは異なって、７／１胚は検
出可能なＧｌｙ １ｍタンパク質を有していない。Ｇｌｙ １ｍタンパク質のた
めの対照を右レーンに示す。
【０１２８】 実施例５ ｃＤＮＡライブラリーの組成：ｃＤＮＡクローンの単離および配列決定 種々のダイズ組織からのｍＲＮＡを表すｃＤＮＡライブラリーを調製した。ラ
イブラリーの特性を以下に記載する。
【０１２９】 表６ ダイズからのｃＤＮＡライブラリー ライブラリー 組織 クローン se6 ダイズ胚、開花の26日後 se6.pk0050.c3 sls1c スクレロチニア・スクレロチオルム sls1c.pk027.al1 (Sclerotinia sclerotiorum)菌系 で感染したダイズ ｃＤＮＡライブラリーは、利用できる多数の方法のいずれか一つにより調製し
てもよい。例えば、ｃＤＮＡは、製造者のプロトコール(Stratagene Cloning Sy
stems, LaJolla, CA) に従ってＵｎｉ−ＺＡＰTMＸＲベクター中のｃＤＮＡライ
ブラリーを最初に調製してプラスミドベクター中に導入してもよい。Ｕｎｉ−Ｚ
ＡＰTMＸＲライブラリーは、Stratageneにより提供されるプロトコールに従って
プラスミドライブラリー中に変換される。転換されると、ｃＤＮＡ挿入物は、プ
ラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内に含まれる。さらに、ｃＤＮＡは、
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ(New England Biolabs) を用いてプレカットされたＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）ベクター(Stratagene)中に直接導入され、次い
で製造者のプロトコール(GIBCO BRL Products)に従ってＤＨ１０Ｂ中へトランス
フェクションされてもよい。一旦ｃＤＮＡ挿入物がプラスミドベクター中に入る
と、プラスミドＤＮＡは組換えｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドを含むランダ
ムに取り上げられた細菌コロニーから調製されるか、または挿入ｃＤＮＡ配列は
、挿入されたｃＤＮＡ配列に近接するベクター配列に特異性のプライマーを用い
るポリメラーゼ連鎖反応を介して増幅される。増幅された挿入ＤＮＡまたはプラ
スミドＤＮＡは、色素−プライマー配列反応により配列決定され、部分ｃＤＮＡ
配列を生成する（発現された配列タグまたは「ＥＳＴ」、Adams et al.,(1991)
Science 252:1651-1656 参照) 。得られたＥＳＴは、Perkin-Elmerモデル３７７
蛍光配列決定装置を用いて分析される。
【０１３０】 実施例６ ｃＤＮＡクローンの同定 ダイズアレルギンをコードするｃＤＮＡクローンは、ＢＬＡＳＴ”ｎｒ”デー
タベース（すべての非重複ジーンバンクＣＤＳ翻訳、三次元構造Brookhavenタン
パク質データバンクから由来した配列、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列デ
ータベースの最近の主要な公開、ＥＭＢＬ、およびＤＤＢＪデータベースを含ん
でなる）内に含まれる配列への類似性に関するＢＬＡＳＴ(Basic Local Alignme
nt Search Tool; Altschul et al.(1993)J. Mol. Biol. 215:403-410;www.ncbi.
nlm.gov/BLAST/も参照) サーチを行って同定された。実施例１で得たｃＤＮＡ配
列を、National Center for Biotechnology Information(NCBI) により提供され
たＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを用いて”ｎｒ”データベース中に含まれるすべて
の公開されて利用できるＤＮＡ配列への類似性について解析した。ＤＮＡ配列は
、すべての読取フレームで翻訳しそしてＮＣＢＩより提供されるＢＬＡＳＴＸア
ルゴリズム(Gish and States(1993) Nat.Genet. 3:266-272)を用いて”ｎｒ”デ
ータベース中に含まれるすべての公開されて利用できるタンパク質配列との類似
性について比較した。便宜上、ＢＬＡＳＴにより単に偶然に算出されるサーチし
たデータベース中に含まれる配列へのｃＤＮＡ配列の一致を観察するＰ−値（確
率）を本明細書中で「ｐＬｏｇ」値として報告し、これは報告されたＰ−値の対
数の負数を示す。従って、ｐＬｏｇが大きくなると、ｃＤＮＡ配列およびＢＬＡ
ＳＴ「ヒット」が同種タンパク質を表す可能性が大きくなる。
【０１３１】 実施例７ Ｇｌｙ ｍ Ｂｄ ２８ＫおよびＧｌｙ ｍ２をコードするｃＤＮＡクローンの 特性検討 表６に表示したクローンからのＥＳＴ配列を用いるＢＬＡＳＴＸサーチは、ｃ
ＤＮＡによりコードされるポリペプチドが、Ｇｌｙ ｍ Ｂｄ ２８Ｋに対する
アラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)(se6.pk0050.c3、配列番号４
）およびＧｌｙ ｍ２に対するカウピー(cowpea 、Vigna unguiculata)(sls1c.p
k027.al1、配列番号６）からのダイズアレルゲン（それぞれＮＣＢＩ受託番号ｇ
ｉ４５１０３９７およびｇｉ１１２６７１）への類似性を明らかにした。図７に
は、ｃＤＮＡ配列に関するＢＬＡＳＴ結果を示す。
【０１３２】 表７ ダイズアレルゲンに対して相同のポリペプチドをコードする配列に関するＢＬＡ
ＳＴ結果 ＢＬＡＳＴ ｐＬｏｇスコア ＢＬＡＳＴ ｐＬｏｇスコアクローン ｇｉ４５１０３９７ ｇｉ１１２６７１ se6.pk0050.c3 １１５．００ − sls1c.pk027.al1 − ３８．７０ 表８のデータは、配列番号４および６に記載のアミノ酸配列とアラビドプシス
およびカウピータンパク質とのそれぞれの一致割合の計算を示す。
【０１３３】 表８ ダイズアレルゲンに相同のポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンのヌクレ
オチド配列から導出したアミノ酸配列の一致割合 ｇｉ４５１０３９７ ｇｉ１１２６７１配列番号番号 への一致割合 への一致割合 ４ ４６．７ − ６ − ９３．３ 配列整列および一致割合の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォーマテ
ィックス計算スイ−ト(DNSTAR Inc., Madison, WI)のメガラインプログラムを用
いて行った。配列の多重整列は、整列のクラスタル法(Higgins and Sharp(1989)
CABIOS.5:151-153）を用い、デフォールトパラメーター（GAP PENALTY=10、GAP
LENGTH PENALTY=10)で行った。クラスタル法を用いる対整列のためのデフォール
トパラメーターは、KTUPLE 1、GAP PENALTY=3 、WINDOW=5およびDIAGONALS SAVE
D=5 であった。配列整列およびＢＬＡＳＴスコアおよび確率は、本ｃＤＮＡクロ
ーンを含んでなる核酸フラグメントがダイズアレルゲンの本質的な部分をコード
することを明らかにした。
【０１３４】 実施例８ 同時抑制トランスジェニック植物内のベータ−コングリシニンのα−およびα’ −両方の協調的欠損 ベータ−コングリシニンのα’−サブユニットのためのプロモーターを含む組
換え発現構築物の使用は、ベータ−コングリシニンのα−およびα’−サブユニ
ット両者のためのポリペプチドをコードする遺伝子の同時抑制をもたらすことが
できると考えられる（上記に引用したＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／４７７３１号）
。デルタ−１２デサチュラーゼ（Ｆａｄ２）遺伝子コーディング領域を有する構
築物ｐＫＳ６８（図５）（詳細にはOkuley et al.(1994)Plant Cell6:147-158お
よび以上に引用したＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１１５１６号に記載される）は、
実施例１で使用したと同じベータコングリシニプロモーターの制御下にある。ｐ
ＫＳ６８は、実施例２で説明したプロトコールに従って、Ｆａｄ２座を同時抑制
するダイズ系統を生成するために使用した。Ｆａｄ２、およびその遺伝子産物は
、ダイズ油中に見いだされるポリ不飽和脂肪酸の合成に役立つ（上記に引用した
Okuley,およびＷＯ９４／１１５１６参照）。Ｆａｄ２およびダイズ油組成物の
改変におけるその使用に関するこれ以上の説明は、１９９７年１１月１１日付け
で公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／４０６９８中に見出すことができ、その
開示はここに引用することによって編入される。
【０１３５】 タンパク質試料は、Ｆａｄ２に関して同時抑制表現型を示す形質転換植物の種
子より標準方法に従って調製される（すなわち改変されたダイズ油組成物を有す
るトランスジェニック植物）。タンパク質試料調製物およびＳＤＳポリアクリル
アミドゲルプロトコールは、上記に引用したＷＯ９７／４０６９８中に使用した
ものと同様であった。種子試料のタンパク質ゲルを図３中に示す。α−またはα
’−サブユニットポリペプチドの低下したレベルを有する種子タンパク質プロフ
ィール（レーン３〜７および９）は、常に協調的欠損を示す。α’−サブユニッ
トの欠損は、ベータ−コングリシニンのα’−サブユニットのためのプロモータ
ーの使用のために予想されなかったことではない。しかし、このプロモーターは
、α’−サブユニットと同様の効率でα−サブユニットポリペプチドの蓄積も抑
制すると考えられる。全部ではないが改変された油系統は、すべてがベータ−コ
ングリシニンプロモーターを含むにもかかわらず、αまたはα’−サブユニット
の低下したレベルを示した（レーン８）。レーン１および２は、それぞれ陽性お
よび陰性対照である。従って、ベータ−コングリシニンのα’−サブユニットの
ためのプロモーターの使用は、組換え発現構築物中に使用された場合に、ダイズ
植物中のベータ−コングリシニンのα−およびα’−サブユニット両者を協調的
に抑制するために十分であると考えられる。
【０１３６】 配列番号１は、ダイズＰ３４タンパク質をコードするクローンｐＫＳ７３中の
ｃＤＮＡ挿入物の核酸配列である。配列は、挿入物の構築に使用されたプライマ
ー配列の一部であるＮｏｔＩ部位で開始および終止する（実施例１参照）。ｐＫ
Ｓ７３中のＰ３４の合成を導くプロモーターは、ベータ−コングリシニン遺伝子
由来であり、３’−非翻訳領域はファセオリン遺伝子由来である。
【０１３７】 配列番号２は、内因性タンパク質の同時抑制のために植物内に導入されたクニ
ッツダイズトリプシンインヒビター（ＫＳＴＩ）のヌクレオチド配列である。
【０１３８】 配列番号３は、ダイズＧｌｙ ｍ Ｂｄ ２８Ｋタンパク質の本質的部分をコ
ードするクローンｓｅ６．ｐｋ００５０．ｃ３内のｃＤＮＡ挿入物のヌクレオチ
ド配列部分である。
【０１３９】 配列番号４は、配列番号３のヌクレオチド配列から誘導されるダイズＧｌｙ ｍ Ｂｄ ２８Ｋタンパク質の本質的部分の導出アミノ酸配列である。
【０１４０】 配列番号５は、ダイズＧｌｙ ｍ２タンパク質の本質的部分をコードするクロ
ーンｓｌｓ１ｃ．ｐｋ０２７．ａｌ１内のｃＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列部
分である。
【０１４１】 配列番号６は、配列番号５のヌクレオチド配列から誘導されるダイズＧｌｙ ｍ２タンパク質の本質的部分の導出アミノ酸配列である。
【０１４２】 配列番号７は、配列番号１の構築物内に組み込まれたＰ３４コーディング領域
を増幅するために使用された合成オリゴヌクレオチドの配列である。
【０１４３】 配列番号８は、配列番号１の構築物内に組み込まれたＰ３４コーディング領域
を増幅するために使用された合成オリゴヌクレオチドの配列である。
【０１４４】 配列番号９は、ジーンバンク受託番号ＡＦ１００１６０(Odani et al.(1987)E
ur. J. Biochem.162:485-491) からのｃＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列部分で
あり、グリシンマックス(Glycine max) （ダイズ）Ｇｌｙ ｍ ＩＡ、「ダイズ
からの疎水性タンパク質」の本質的部分をコードする。Ｇｌｙ ｍ ＩＢは、ア
ミノ末端から３個のアミノ酸を欠失することを除いてＧｌｙ ｍ ＩＡと同様で
ある。両方のタンパク質共にマイナーなヒトアレルゲンであると考えられる。
【０１４５】 配列番号１０は、配列番号９のヌクレオチド配列から由来したダイズＧｌｙ ｍ ＩＡタンパク質の本質的部分の導出アミノ酸配列である。
【０１４６】 配列番号１１は、ジーンバンク受託番号ＡＪ２２３９８１(Rihs et al.(1999)
J. Allergy CLin. Immunol. 104:1293-1301)からのｃＤＮＡ挿入物のヌクレオチ
ド配列部分であり、グリシンマックス(Glycine max) （ダイズ）ｒＧｌｙ ｍ３
、「ダイズプロフィリン同族体」の本質的部分をコードする。本タンパク質はＩ
ｇＧ抗体を結合し、そして仮にダイズアレルゲンとして同定されている。
【０１４７】 配列番号１２は、配列番号１１のヌクレオチド配列から誘導されたダイズｒＧ
ｌｙ ｍ３タンパク質の本質的部分の導出アミノ酸配列である。
【０１４８】 配列番号１３は、ジーンバンク受託番号ＡＪ２２３９８２(Rihs et al.(1999)
J. Allergy CLin. Immunol. 104:1293-1301)からのｃＤＮＡ挿入物のヌクレオチ
ド配列部分であり、グリシンマックス(Glycine max) （ダイズ）ｒＧｌｙ ｍ３
、「ダイズプロフィリン同族体」の本質的部分をコードする。本タンパク質はＩ
ｇＧ抗体を結合し、そして仮にダイズアレルゲンとして同定されている。
【０１４９】 配列番号１４は、配列番号１３のヌクレオチド配列から誘導されたダイズｒＧ
ｌｙ ｍ３タンパク質の本質的部分の導出アミノ酸配列である。
【０１５０】 配列番号１５は、ジーンバンク受託番号Ｘ０２９８５(Zeece et al.(1999)Foo
d and Agric Immunol 11:83-90) からのｃＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列部分
であり、グリシンマックス(Glycine max) （ダイズ）グリシニンＧ１（またはＡ
１ａＢ１ｂ）の本質的部分をコードする。ダイズグリシニンＧ１はその酸性ドメ
イン内にＩｇＧ抗体を結合し、そして仮にダイズアレルゲンとして同定されてい
る。
【０１５１】 配列番号１６は、配列番号１５のヌクレオチド配列から誘導されたダイズグリ
シニンＧ１（またはＡ１ａＢ１ｂ）タンパク質の本質的部分の導出アミノ酸配列
である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ダイズタンパク質加工を示す。
【図２】 染色したタンパク質ゲルおよび引き続くニトロセルロースフィルターブロット
上のＧｌｙ １ｍタンパク質の抗体検出を示す。タンパク質はＧｌｙ １ｍの同
時抑制を示す（７−１）または示さない（３−１おび６−１）トランスジェニッ
ク体細胞不定胚から得た。陽性対照をブロットの最後のレーンに含めた。
【図３】 ｐＫＳ６８を用いて形質転換したデルタ−１２デサチュラーゼ（Ｆａｄ２）同
時抑制ダイズ植物の独立した単離体から得た種子タンパク質のＳＤＳアクリルア
ミドゲルを示す（実施例８参照）。ベータ−コングリシニンのα’サブユニット
が低下または欠損しているそれぞれのレーン中では、α−サブユニットも欠損し
ていることに注意すること（レーン１、３、４、５、６、７、および９）。レー
ン１および２は、陽性および陰性対照である（それぞれ）。
【図４】 ベータ−コングリシニンのα’サブユニットからのプロモーターにセンス方向
にあるＧｌｙ １ｍ遺伝子および引き続いてファセオリン３’非翻訳領域を含む
プラスミドｐＫＳ７３のマップである。このプラスミドは、実施例１に概説した
同時抑制実験に使用した。
【図５】 ベータ−コングリシニンのα’サブユニットからのプロモーターにセンス方向
にあるＦａｄ２遺伝子および引き続いてファセオリン３’非翻訳領域を含むプラ
スミドｐＫＳ６８のマップである。このプラスミドは、実施例８に説明した同時
抑制実験に使用した。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/415 Ａ２３Ｄ 9/00 ５１６ ４Ｈ０４５ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ジヤング，ルドルフ アメリカ合衆国アイオワ州50311デスモイ ネス・ガーマニアドライブ1549 (72)発明者 キニー，アンソニー・ジエイ アメリカ合衆国デラウエア州19809ウイル ミントン・ロアアベニユー609 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 4B018 LB01 LB04 LB08 LB09 LB10 LE03 LE04 LE05 MD58 ME07 MF01 MF03 MF04 MF07 4B020 LB24 LC05 LG01 LP08 4B024 AA05 AA08 BA79 CA04 CA07 DA01 EA04 FA02 GA11 GA17 HA01 4B026 DC05 DG05 DX01 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA30 EA01 EA07 FA74

Claims (90)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号１中に記載のヌクレオチド配列に本質的に一致する
    単離されたＧｌｙ ｍ Ｂｄ ３０Ｋ核酸フラグメントまたはその機能的等価サ
    ブフラグメントに操作可能に連結するプロモーターを含んでなる、ダイズのＧｌ
    ｙ ｍ Ｂｄ ３０Ｋ（ダイズ液胞タンパク質Ｐ３４）含有量を低下させるため
    の組換え発現構築物。
  2. 【請求項２】 プロモーターが、α’−サブユニット ベータ−コングリシ
    ニンプロモーター、クニッツトリプシンインヒビター（ＫＳＴＩ）プロモーター
    、Ｇｌｙ ｍ Ｂｄ ２８Ｋプロモーター、Ｔ７プロモーター、３５Ｓプロモー
    ターおよびベータ−ファセオリンプロモーターからなる群より選ばれる、請求項
    １記載の組換え発現構築物。
  3. 【請求項３】 配列番号１中に記載のヌクレオチド配列に本質的に一致する
    単離されたＧｌｙ ｍ Ｂｄ ３０Ｋ核酸フラグメントまたはその機能的等価サ
    ブフラグメントに操作可能に連結するベータ−コングリシニンプロモーターを含
    んでなる、ダイズのＧｌｙ ｍ Ｂｄ ３０Ｋ（ダイズ液胞タンパク質Ｐ３４）
    含有量を低下させるための組換え発現構築物。
  4. 【請求項４】 配列番号３記載のヌクレオチド配列に本質的に一致する単離
    されたＧｌｙ ｍ Ｂｄ ２８Ｋ核酸フラグメントまたはその機能的等価サブフ
    ラグメントに操作可能に連結する、配列番号２中に記載のヌクレオチド配列に本
    質的に一致する単離されたＫＳＴＩ核酸フラグメントまたはその機能的等価サブ
    フラグメントを含んでなる、低アレルゲン性ダイズを産生するための組換え発現
    構築物。
  5. 【請求項５】 請求項１、２、３、または４のいずれかの発現構築物の少な
    くとも１個をそのゲノム内に含んでなる低アレルゲン性ダイズ植物。
  6. 【請求項６】 該植物が請求項３または４記載の発現構築物をそのゲノム内
    に含んでなる、請求項５記載の植物。
  7. 【請求項７】 請求項５または６記載の植物の種子。
  8. 【請求項８】 請求項７記載の種子より得た油。
  9. 【請求項９】 請求項５または６記載の植物より得た低アレルゲン性ダイズ
    産物。
  10. 【請求項１０】 該ダイズ産物が単離物、濃縮物、粗びき粉、グリット、全
    脂肪および脱脂肪粉、代用肉、組織化粉、組織化濃縮物および組織化単離物より
    なる群より選ばれる、請求項９記載の産物。
  11. 【請求項１１】 請求項９または１０記載の産物をその中に組み込んだ食品
    。
  12. 【請求項１２】 請求項８記載の油をその中に組み込んだ食品。
  13. 【請求項１３】 請求項８記載の油の水素化、分別、エステル交換または加
    水分解より製造された産物。
  14. 【請求項１４】 請求項８記載の油を用いて製造された混合油産物。
  15. 【請求項１５】 請求項８記載の油の製造の間に生成した副産物。
  16. 【請求項１６】 （ａ）請求項７記載の種子を割って皮より果肉を取り出し
    、そして （ｂ）工程（ａ）で得た果肉をフレーク化して所望のフレーク厚さを得る ことを含んでなる、低アレルゲン性ダイズ種子から低アレルゲン性ダイズ産物を
    製造する方法。
  17. 【請求項１７】 （ａ）請求項３記載のダイズ植物である第一親ダイズを、
    請求項４記載の組換え発現構築物をそのゲノム内に含んでなるダイズ植物よりな
    る群から選ばれる第二の親ダイズと交雑し、そして （ｂ）低アレルゲン性である工程（ａ）の交雑物の後代植物を選別する ことを含んでなる低アレルゲン性ダイズ植物を作製するための方法。
  18. 【請求項１８】 （ａ）請求項３記載の組換え発現構築物をそのゲノム内に
    含んでなるダイズ植物である第一親ダイズを、ハイブッド、変異またはトランス
    ジェニック第二ダイズ親と交雑し、ここで該第二親はＧｌｙ ｍ Ｂｄ ２８Ｋ
    、ベータ−コングリシニンのアルファ−サブユニット、ＫＳＴＩ、Ｇｌｙ ｍ２
    、Ｇｌｙ ｍ ＩＡ、Ｇｌｙ ｍ ＩＢ、ｒＧＬＹ ｍ３およびグリシニン Ｇ
    １よりなる群より選ばれる１種またはそれ以上のアレルゲンを本質的に含まず、
    そして （ｂ）低アレルゲン性である工程（ａ）の交雑物の後代植物を選別する ことを含んでなる低アレルゲン性ダイズ植物を作製するための方法。
  19. 【請求項１９】 （ａ）請求項５記載のダイズ植物である第一親ダイズを、
    ハイブッド、変異またはトランスジェニック第二親ダイズと交雑し、ここで該第
    二親はベータ−コングリシニンのアルファ−サブユニットを本質的に含まないダ
    イズ植物よりなる群より選ばれ、そして （ｂ）低アレルゲン性である工程（ａ）の交雑物の後代植物を選別する ことを含んでなる低アレルゲン性ダイズ植物を作製するための方法。
  20. 【請求項２０】 （ａ）請求項５記載のダイズ植物である第一親ダイズを、
    ハイブッド、変異またはトランスジェニック第二親ダイズと交雑し、ここで該第
    二親はＫＳＴＩアレルゲンを本質的に含まず、そして （ｂ）低アレルゲン性である工程（ａ）の交雑物の後代植物を選別する ことを含んでなる低アレルゲン性ダイズ植物を作製するための方法。
  21. 【請求項２１】 （ａ）請求項５記載のダイズ植物である第一親ダイズを、
    Ｇｌｙ ｍ Ｂｄ ２８Ｋ、ベータ−コングリシニンのアルファ−サブユニット
    、ＫＳＴＩ、Ｇｌｙ ｍ２、Ｇｌｙ ｍ ＩＡ、Ｇｌｙ ｍ ＩＢ、ｒＧＬＹ ｍ３およびグリシニン Ｇ１よりなる群より選ばれるダイズアレルゲンを本質的
    に含まないハイブッド、変異またはトランスジェニック第二親ダイズと交雑し、
    そして （ｂ）低アレルゲン性である工程（ａ）の交雑物の後代植物を選別する ことを含んでなる低アレルゲン性ダイズ植物を作製するための方法。
  22. 【請求項２２】 請求項９または１０記載の産物をその中に組み込んだ動物
    飼料。
  23. 【請求項２３】 請求項８記載の油をその中に組み込んだ動物飼料。
  24. 【請求項２４】 請求項１７、１８、１９、２０または２１のいずれか記載
    の方法により作製された植物から得た種子。
  25. 【請求項２５】 請求項２４記載の種子から得た油。
  26. 【請求項２６】 請求項１７、１８、１９、２０または２１のいずれか記載
    の方法により作製された植物から得た低アレルゲン性ダイズ産物。
  27. 【請求項２７】 該ダイズ産物が、単離物、濃縮物、粗びき粉、グリット、
    全脂肪および脱脂肪粉、代用肉、組織化粉、組織化濃縮物および組織化単離物よ
    りなる群より選ばれる、請求項２６記載の産物。
  28. 【請求項２８】 請求項２６記載の産物をその中に組み込んだ食品、
  29. 【請求項２９】 請求項２７記載の産物をその中に組み込んだ食品。
  30. 【請求項３０】 請求項２５記載の油をその中に組み込んだ食品。
  31. 【請求項３１】 請求項２５記載の油の水素化、分別、エステル交換または
    加水分解より製造した産物。
  32. 【請求項３２】 請求項２５記載の油を用いて製造した混合油産物。
  33. 【請求項３３】 請求項２５記載の油の製造の間に生成した副産物。
  34. 【請求項３４】 （ａ）請求項２４記載の種子を割って皮より果肉を取り出
    し、そして （ｂ）工程（ａ）で得た果肉をフレーク化して所望のフレーク厚さを得る ことを含んでなる、低アレルゲン性ダイズ産物を製造する方法。
  35. 【請求項３５】 請求項９、１０、２６または２７記載の産物をその中に組
    み込んだ幼児用調合物。
  36. 【請求項３６】 ダイズＧｌｙ ｍ Ｂｄ ２８Ｋタンパク質をコードする
    核酸配列を含んでなる単離された核酸フラグメント。
  37. 【請求項３７】 配列番号４中に記載のポリペプチド配列と４９％またはそ
    れを越えるアミノ酸同一性を有するダイズＧｌｙ ｍ Ｂｄ ２８Ｋタンパク質
    またはその機能的等価サブフラグメントをコードする核酸配列を含んでなる、単
    離された核酸フラグメント。
  38. 【請求項３８】 アミノ酸同一性が配列番号４中に記載のポリペプチド配列
    と４９％またはそれを越える、請求項３７記載の単離された核酸フラグメント。
  39. 【請求項３９】 配列番号４中に記載のポリペプチド配列と４９％またはそ
    れを越えるアミノ酸同一性を有する植物Ｇｌｙ ｍ Ｂｄ ２８Ｋタンパク質。
  40. 【請求項４０】 調節配列に操作可能に連結する請求項３６、３７、３８ま
    たは３９記載の核酸フラグメントまたはその逆相補体を含んでなるキメラ遺伝子
    。
  41. 【請求項４１】 請求項４０記載のキメラ遺伝子をそのゲノム中に含んでな
    る、低アレルゲン性ダイズ植物。
  42. 【請求項４２】 請求項４１記載の植物の種子。
  43. 【請求項４３】 請求項４２記載の種子から得た油。
  44. 【請求項４４】 請求項４１記載の植物から得た低アレルゲン性ダイズ産物
    。
  45. 【請求項４５】 該ダイズ産物が、単離物、濃縮物、粗びき粉、グリット、
    全脂肪および脱脂肪粉、代用肉、組織化粉、組織化濃縮物および組織化単離物よ
    りなる群より選ばれる、請求項４４記載の産物。
  46. 【請求項４６】 請求項４４または４５記載の産物をその中に組み込んだ食
    品。
  47. 【請求項４７】 請求項４３記載の油をその中に組み込んだ食品。
  48. 【請求項４８】 請求項４３記載の油の水素化、分別、エステル交換または
    加水分解より製造された産物。
  49. 【請求項４９】 請求項４３記載の油の産物を用いて製造された混合油産物
    。
  50. 【請求項５０】 請求項４３記載の油の製造の間に生成した副産物。
  51. 【請求項５１】 請求項４４または４５記載の産物をその中に組み込んだ動
    物飼料。
  52. 【請求項５２】 請求項４３記載の油をその中に組み込んだ動物飼料。
  53. 【請求項５３】 請求項４４または４５記載の産物をその中に組み込んだ幼
    児用調合物。
  54. 【請求項５４】 （ａ）請求項４２記載の種子を割って皮より果肉を取り出
    し、そして （ｂ）工程（ａ）で得た果肉をフレーク化して所望のフレーク厚さを得る ことを含んでなる、低アレルゲン性ダイズ種子から低アレルゲン性ダイズ産物を
    製造する方法。
  55. 【請求項５５】 ダイズＧｌｙ ｍ ２タンパク質をコードする核酸配列を
    含んでなる単離された核酸フラグメント。
  56. 【請求項５６】 配列番号６中に記載のポリペプチド配列と９５％またはそ
    れを越えるアミノ酸同一性を有するダイズＧｌｙ ｍ ２タンパク質またはその
    機能的等価サブフラグメントをコードする核酸配列を含んでなる、単離された核
    酸フラグメント。
  57. 【請求項５７】 アミノ酸同一性が配列番号６中に記載のポリペプチド配列
    と９５％であるかまたはそれを越える、請求項５６記載の単離された核酸フラグ
    メント。
  58. 【請求項５８】 配列番号６中に記載のポリペプチド配列と９５％またはそ
    れを越えるアミノ酸同一性を有する植物Ｇｌｙ ｍ ２タンパク質。
  59. 【請求項５９】 調節配列に操作可能に連結する請求項５５、５６、５７ま
    たは５８記載の核酸フラグメントまたはその逆相補体を含んでなるキメラ遺伝子
    。
  60. 【請求項６０】 請求項５９記載のキメラ遺伝子をそのゲノム中に含んでな
    る、低アレルゲン性ダイズ植物。
  61. 【請求項６１】 請求項６０記載の植物の種子。
  62. 【請求項６２】 請求項６１記載の種子から得た油。
  63. 【請求項６３】 請求項６０記載の植物から得た低アレルゲン性ダイズ産物
    。
  64. 【請求項６４】 該ダイズ産物が、単離物、濃縮物、粗びき粉、グリット、
    全脂肪および脱脂肪粉、代用肉、組織化粉、組織化濃縮物および組織化単離物よ
    りなる群より選ばれる、請求項６３記載の産物。
  65. 【請求項６５】 請求項６３または６４記載の産物をその中に組み込んだ食
    品。
  66. 【請求項６６】 請求項６２記載の油をその中に組み込んだ食品。
  67. 【請求項６７】 請求項６２記載の油の水素化、分別、エステル交換または
    加水分解より製造された産物。
  68. 【請求項６８】 請求項６２記載の油の産物を用いて製造された混合油産物
    。
  69. 【請求項６９】 請求項４３記載の油の製造の間に生成した副産物。
  70. 【請求項７０】 請求項６３または６４記載の産物をその中に組み込んだ動
    物飼料。
  71. 【請求項７１】 請求項６２記載の油をその中に組み込んだ動物飼料。
  72. 【請求項７２】 請求項４４または４５記載の産物をその中に組み込んだ幼
    児用調合物。
  73. 【請求項７３】 （ａ）請求項６１記載の種子を割って皮より果肉を取り出
    し、そして （ｂ）工程（ａ）で得た果肉をフレーク化して所望のフレーク厚さを得る ことを含んでなる、低アレルゲン性ダイズ種子から低アレルゲン性ダイズ産物を
    製造する方法。
  74. 【請求項７４】 配列番号９中に記載のヌクレオチド配列に本質的に一致す
    る単離されたＧｌｙ ｍ ＩＡ核酸フラグメントまたはその機能的等価サブフラ
    グメントに操作可能に連結するプロモーターを含んでなる、ダイズのＧｌｙ ｍ
    ＩＡ含有量を低下させるための組換え発現構築物。
  75. 【請求項７５】 配列番号９中に記載のヌクレオチド配列に本質的に一致す
    る単離されたＧｌｙ ｍ ＩＢ核酸フラグメントまたはその機能的等価サブフラ
    グメントに操作可能に連結するプロモーターを含んでなる、ダイズのＧｌｙ ｍ
    ＩＢ含有量を低下させるための組換え発現構築物。
  76. 【請求項７６】 配列番号１１中に記載のヌクレオチド配列に本質的に一致
    する単離されたｒＧｌｙ ｍ３核酸フラグメントまたはその機能的等価サブフラ
    グメントに操作可能に連結するプロモーターを含んでなる、ダイズのｒＧｌｙ
    ｍ３含有量を低下させるための組換え発現構築物。
  77. 【請求項７７】 配列番号１５中に記載のヌクレオチド配列に本質的に一致
    する単離されたグリシニンＧ１核酸フラグメントまたはその機能的等価サブフラ
    グメントに操作可能に連結するプロモーターを含んでなる、ダイズのグリシニン
    Ｇ１（Ａ１ａＢ１ｂ）含有量を低下させるための組換え発現構築物。
  78. 【請求項７８】 請求項７０、７５、７６および７７のいずれか記載の発現
    構築物の少なくとも１個をそのゲノム内に含んでなる、低アレルゲン性ダイズ植
    物。
  79. 【請求項７９】 請求項７８記載の植物の種子。
  80. 【請求項８０】 請求項７９記載の種子から得た油。
  81. 【請求項８１】 請求項７８記載の植物から得た低アレルゲン性ダイズ産物
    。
  82. 【請求項８２】 該ダイズ産物が、単離物、濃縮物、粗びき粉、グリット、
    全脂肪および脱脂肪粉、代用肉、組織化粉、組織化濃縮物および組織化単離物よ
    りなる群より選ばれる、請求項８１記載の産物。
  83. 【請求項８３】 請求項８１または８２記載の産物をその中に組み込んだ食
    品。
  84. 【請求項８４】 請求項８０記載の油をその中に組み込んだ食品。
  85. 【請求項８５】 請求項８０記載の油の水素化、分別、エステル交換または
    加水分解より製造された産物。
  86. 【請求項８６】 請求項８０記載の油の産物を用いて製造された混合油産物
    。
  87. 【請求項８７】 請求項８０記載の油の製造の間に生成した副産物。
  88. 【請求項８８】 （ａ）請求項７９記載の種子を割って皮より果肉を取り出
    し、そして （ｂ）工程（ａ）で得た果肉をフレーク化して所望のフレーク厚さを得る ことを含んでなる、低アレルゲン性ダイズ種子から低アレルゲン性ダイズ産物を
    製造する方法。
  89. 【請求項８９】 請求項８１または８２記載の産物をその中に組み込んだ幼
    児用調合物。
  90. 【請求項９０】 副産物がレシチンである、請求項１５、３３、５０、６９
    および８７記載の副産物。
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