JP2003526371A

JP2003526371A - ヒトｃｄ１５４に対する抗体

Info

Publication number: JP2003526371A
Application number: JP2001567344A
Authority: JP
Inventors: フランコ・エ・ディ・パドバ; バルター・シューラー
Original assignee: ノバルティスアクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 2000-03-16
Filing date: 2001-03-14
Publication date: 2003-09-09
Also published as: WO2001068860A1; AR027976A1; AU4835001A; US20040038293A1; CO5280086A1; US7169389B2; PE20030104A1; EP1263959A1; CA2400106A1; AU2001248350B2; GB0006398D0

Abstract

(57)【要約】重鎖および軽鎖のＣＤＲが定義の通りのアミノ酸配列を有する、ＣＤ１５４調節および／またはＣＤ１５４：ＣＤ４０相互作用の妨害または阻害が治療的に有利である疾患または疾病の処置および/または予防に使用するための、ＣＤ１５４結合分子、特にヒトＣＤ１５４に対する抗体、特ににヒトＣＤ１５４に対するヒト抗体を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明はヒトＣＤ１５４(ＣＤ１５４はｇｐ３９またはＣＤ４０−Ｌとしても
既知)に対する抗体、および、例えば、ＣＤ１５４：ＣＤ４０相互作用のＣＤ１
５４妨害、調節および／または阻害が治療的に有利である疾患または疾病の処置
および／または予防、例えば、細胞、組織または臓器移植拒絶反応の予防、自己
免疫または炎症性疾患、アテローム性動脈硬化またはアルツハイマー病の予防ま
たは処置における、ＣＤ１５４陽性細胞とＣＤ４０陽性細胞との相互作用により
介在される免疫応答を阻害するためのこのような抗体の使用に関する。

【０００２】Ｔ細胞の接触依存性ヘルパー−エフェクター機能を介在する細胞表面分子は、
Ｔ細胞補助を必要とする免疫応答の誘導に重要である。例えば、Ｔ細胞上のＣＤ
１５４のＢ細胞上のＣＤ４０との相互作用は、抗原に対するＢ細胞応答の活性化
に中心的役割を担う。ＣＤ１５４およびそのレセプターＣＤ４０の間の相互作用
の阻害がＴ細胞活性化を予防し、抗原特異的Ｔ細胞またはＢ細胞耐容性を誘導し
得る。しかし、ＣＤ１５４／ＣＤ４０相互作用はＴおよびＢ細胞または抗原提示
細胞(ＡＰＣ)に限定されない。

【０００３】ＣＤ１５４に対する抗体は、ＣＤ１５４／ＣＤ４０相互作用を遮断する薬剤と
して提案されている：マウス抗ヒトＣＤ１５４モノクローナル抗体(ＭＡｂ)５ｃ
８および２４−３１由来の二つのヒト化ＣＤ１５４モノクローナル抗体が既知で
ある。しかし、例えば、本明細書に示すように疾病および疾患を予防または処置
するための、理想的には、共刺激性シグナルを遮断し、同時に、抗原認識および
Ｔ細胞レセプターシグナル伝達を可能にしながら、例えば、異物移植における特
異的態耐容性を誘導するための、ＣＤ１５４／ＣＤ４０相互作用を調節または遮
断するための有効な方法の必要性がまだ存在する。

【０００４】我々は、本明細書により、以後に記載するような疾病、疾患または状態の予防
または処置に使用するためのＣＤ１５４に対する改善された抗体を製造した。

【０００５】したがって、本発明は、連続して超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ
３を含む(ここで、該ＣＤＲ１はアミノ酸配列Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｈｅ
−Ａｓｎ(配列番号５)を有し、該ＣＤＲ２はアミノ酸配列Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｅ
ｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ(配列番号６)を
有し、そして該ＣＤＲ３はアミノ酸配列Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ(配列番号７)を有する)、少なくとも一つの免疫グロブリン
重鎖可変ドメイン(Ｖ_Ｈ)を含む抗原結合部位を含む、ＣＤ１５４結合分子；およ
びその直接相同物を提供する。

【０００６】第１の態様において、本発明は、上記で定義のような重鎖可変領域(Ｖ_Ｈ)を含
む、単離免疫グロブリン重鎖を含む、単一ドメインＣＤ１５４結合分子を提供す
る。

【０００７】第２の態様において、本発明はまた、ＣＤ１５４結合分子が：ａ)連続して超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む(ここで、該Ｃ
ＤＲ１は配列番号５に示すアミノ酸配列を有し、該ＣＤＲ２は配列番号６に示す
アミノ酸配列を有し、そして該ＣＤＲ３は配列番号７に示すアミノ酸配列を有す
る)、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(Ｖ_Ｈ)、およびｂ)連続して超可変領域ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'を含む(ここで、
該ＣＤＲ１'は配列番号８に示すアミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ
−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａを有し、該ＣＤＲ
２'は配列番号９に示すアミノ酸配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｎ−Ｓｅｒを有し、そして該ＣＤＲ３'は配列番号１０に示すアミノ酸配
列Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ
を有する)、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(Ｖ_Ｌ) を含む、少なくとも一つの抗原結合部位を含むものである、重鎖(Ｖ_Ｈ)および軽鎖(Ｖ_Ｌ)可変領域の両方を含む、ＣＤ１５４結合分子および
その直接相同物を提供する。

【０００８】特記しない限り、ポリペプチド鎖は、本明細書で、Ｎ末端から始まり、Ｃ末端
で終わるアミノ酸を有するものとして記載する。抗原結合部位がＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインの両方を含む場合、これらは同じポリペプチド分子に位置するか、また
は好ましくは、各ドメインは異なる鎖上であり、Ｖ_Ｈドメインは免疫グロブリン
重鎖の一部またはそのフラグメントおよびＶ_Ｌは免疫グロブリン軽鎖の一部また
はそのフラグメントである。

【０００９】 “ＣＤ１５４結合分子”は、単独でまたは他の分子と結合してＣＤ１５４抗原
に結合することができる任意の分子を意味する。結合反応は、例えば、ＣＤ１５
４のそのレセプターへの結合の阻害を決定するためのバイオアッセイまたは結合
アッセイの任意の種類を含む標準法により、非関連特異性の抗体、例えば、抗Ｃ
Ｄ２５抗体を使用する陰性コントロール試験を参照して、示され得る。有利には
、本発明のＣＤ１５４結合分子のＣＤ１５４への結合は、競合結合アッセイによ
り示し得る。

【００１０】抗原結合分子の例は、Ｂ細胞により産生される抗体、またはハイブリドーマお
よびキメラ、ＣＤＲ−移植またはヒト抗体、または任意のそのフラグメント、例
えば、Ｆ(ａｂ')_２およびＦａｂフラグメント、ならびに一本鎖または単一ドメ
イン抗体を含む。

【００１１】一本鎖抗体は、通常１０から３０アミノ酸、好ましくは１５から２５アミノ酸
から成るペプチドリンカーにより共有結合的に結合した抗体の重鎖および軽鎖の
可変ドメインを含む。したがって、このような構造は、重鎖および軽鎖の定常部
分を含まず、小ペプチドスペーサーが全定常部よりも抗原性が少ないと考えられ
る。“キメラ抗体”は、重鎖または軽鎖、または両方の定常領域がヒト由来であ
るが、重鎖および軽鎖の可変ドメインの両方が非ヒト(例えばマウス)由来である
か、または異なるヒト抗体由来である抗体を意味する。“ＣＤＲ−移植抗体”は
、超可変領域(ＣＤＲ)が、非ヒト(例えばマウス)抗体または異なるヒト抗体のよ
うなドナー抗体由来であるが、免疫グロブリンの全てまたは実質的に全ての部分
、例えば、定常領域および可変ドメインのより保存された部分、すなわち、フレ
ームワーク領域がアクセプター抗体、例えば、ヒト起源の抗体由来である抗体を
意味する。ＣＤＲ−移植抗体は、しかしながら、超可変領域に隣接したフレーム
ワーク領域の部分にドナー配列の少数のアミノ酸を保持し得る。“ヒト化抗体”
は、例えば、ＥＰ０５４６０７３Ｂ１、ＵＳＰ５５４５８０６、ＵＳＰ５５６９
８２５、ＵＳＰ５６２５１２６、ＵＳＰ５６３３４２５、ＵＳＰ５６６１０１６
、ＵＳＰ５７７０４２９、ＥＰ０４３８４７４Ｂ１およびＥＰ０４６３１５１Ｂ
１に一般論として記載されているような、重鎖および軽鎖の両方の定常および可
変領域が全てヒト起源であるか、ヒト起源の配列と実質的に同じであり、同じ抗
体由来である必要はない抗体を意味し、マウス免疫グロブリン可変および定常領
域遺伝子がそのヒトカウンターパートに置き換えられているマウスにより製造さ
れた抗体を含む。

【００１２】特に好ましい本発明のＣＤ１５４結合分子はヒト抗体、特に、以下の実施例に
記載するようなＡＢＩ７９３抗体である。

【００１３】したがって、好ましい抗体において、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインは
ヒト起源、例えば、配列番号１および配列番号３に示すＡＢＩ７９３抗体のもの
である。定常領域ドメインは好ましくはまた、例えば、“Sequences of protein
s of immunological interest”, Kabat E. A. et al., US department of heal
th and human services, Public health services, National Institute of Hea
lthに記載のような、ヒト定常領域ドメインを含む。

【００１４】超可変領域は任意の種類のフレームワーク領域と関連し得るが、好ましくはヒ
ト起源である。適当なフレームワーク領域は、Kabat E. A. et al., 前掲に記載
されている。好ましい重鎖フレームワークはヒト重鎖フレームワーク、例えば、
配列番号１に示すＡＢＩ７９３抗体のものである。ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およ
びＦＲ４領域の配列を含む。同様の方法で、配列番号３は、連続してＦＲ１'、
ＦＲ２'、ＦＲ３'およびＦＲ４'領域を含む好ましいＡＢＩ７９３軽鎖フレーム
ワークを示す。

【００１５】したがって、本発明はまた、１位のアミノ酸から開始し、１１８位のアミノ酸
で終わる配列番号２に示すものと実質的に同一のアミノ酸配列を有する第１ドメ
インを、または上記の第１ドメインと、１位のアミノ酸から開始し、１０７位の
アミノ酸で終わる配列番号４に示すものと実質的に同一のアミノ酸配列を有する
第２ドメインのいずれかを含む、少なくとも一つの抗原結合部位を含む、ＣＤ１
５４結合分子を提供する。

【００１６】全ヒトに天然に見られるタンパク質に対して惹起させたモノクローナル抗体は
、典型的に非ヒトシステム、例えばマウスにおいて発生させる。この直接の結果
として、ハイブリドーマにより製造された異種発生の抗体は、ヒトに投与した場
合、望ましくない免疫応答を誘発し、これは大部分は異種発生のグロブリンの定
常部により介在される。これは、長期間にわたり投与することができないためこ
のような抗体の使用を明らかに限定する。したがって、ヒトに投与したときに簡
単には実質的な異種応答を誘発しない、一本鎖、単一ドメイン、キメラ、ＣＤＲ
−移植、または特にヒト抗体の使用が特に好ましい。

【００１７】前記の観点から、本発明のより好ましいＣＤ１５４結合分子は、少なくともａ)(ｉ)連続して超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む可変ドメ
インおよび(ii)ヒト重鎖の定常部またはそのフラグメントを含む免疫グロブリン
重鎖またはそのフラグメント；該ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ
配列番号５、６および７に示すようなアミノ酸配列を有する、およびｂ)(ｉ)連続して超可変領域ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'を含む可変ド
メインおよび(ii)ヒト軽鎖の定常部またはそのフラグメントを含む免疫グロブリ
ン軽鎖またはそのフラグメント；該ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'はそ
れぞれ配列番号８、９および１０に示すようなアミノ酸配列を有するを含むヒト抗ＣＤ１５４抗体、およびその直接相同物から選択される。

【００１８】あるいは、本発明のＣＤ１５４結合分子はａ)連続して超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む第１ドメイン(
該超可変領域は、それぞれ配列番号５、６および７に示すようなアミノ酸配列を
有する)；ｂ)連続して超可変領域ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'を含む第１ドメイ
ン(該超可変領域は、それぞれ配列番号８、９および１０に示すようなアミノ酸
配列を有する)；およびｃ)第１ドメインのＮ末端と第２ドメインのＣ末端、または第１ドメインのＣ末
端と第２ドメインのＮ末端のいずれかに結合するペプチドリンカー；を含む抗原結合部を含む一本鎖結合ドメイン、およびその直接相同物から選択し
得る。

【００１９】既知のように、１個または数個のアミノ酸の欠失、付加または置換のようなア
ミノ酸配列の小さな変化は、実質的に同一の特性を有する、元のタンパク質の対
立形を導き得る。

【００２０】したがって、“その直接相同物”なる用語は、任意の単一ドメインＣＤ１５４
結合分子(分子Ｘ)であり、 (ｉ)超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が全体として、各々配列番号
５、６および７に示す超可変領域と、少なくとも８０％相同、好ましくは少なく
とも９０％相同、より好ましくは少なくとも９５％相同である、そして (ii)ＣＤ１５４のそのレセプターへの結合を、分子Ｘと同じフレームワーク領域
を有するが、各々配列番号５、６および７に示すものと同一の超可変領域ＣＤＲ
１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有する参照分子と実質的に同程度阻害できる；任意の単一ドメインＣＤ１５４結合分子(分子Ｘ)、または、結合部当たり少なくとも二つの一ドメインを有する任意のＣＤ１５４結
合分子(分子Ｘ')であり、 (ｉ)超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣ
ＤＲ３'が全体として、各々配列番号５、６、７、８、９および１０に示す超可
変領域と、少なくとも８０％相同、好ましくは少なくとも９０％相同、より好ま
しくは少なくとも９５％相同である、そして (ii)ＣＤ１５４のそのレセプターへの結合を、分子Ｘ'と同じフレームワーク領
域および定常部を有するが、各々配列番号５、６、７、８、９および１０に示す
ものと同一の超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'
およびＣＤＲ３'を有する参照分子と実質的に同程度阻害できる；結合部当たり少なくとも二つの一ドメインを有する任意のＣＤ１５４結合分子(
分子Ｘ') を意味する。

【００２１】本明細書において、アミノ酸配列は、配列を最適に配置させ、アミノ酸配列中
のギャップまたは挿入部を非同一残基として数えて、それらが同様の位置に少な
くとも８０％同一アミノ酸残基を有する場合、互いに８少なくとも０％相同であ
る。

【００２２】ＣＤ１５４のそのレセプターへの結合の阻害は、簡便には、本明細書に後記の
ようなアッセイを含む種々のアッセイで試験し得る。“同程度”なる用語は、参
照および相同分子が、統計学的基準で、下記のアッセイの一つの本質的に同じＣ
Ｄ１５４結合阻害曲線を示すことを意味する。

【００２３】例えば、使用するアッセイは、本発明のＣＤ１６５結合分子の存在下の、ＣＤ
４０へのＣＤ１５４の結合阻害を試験するための無細胞結合アッセイであり得る
。

【００２４】より好ましくは、本発明のＣＤ１５４分子はａ)１位のアミノ酸から開始し、１１８位のアミノ酸で終わる配列番号２に示す
ものと実質的に同一のアミノ酸配列を有する可変ドメインおよびヒト重鎖の定常
部を含む一つの重鎖；およびｂ)１位のアミノ酸から開始し、１０７位のアミノ酸で終わる配列番号４に示す
ものと実質的に同一のアミノ酸配列を有する可変ドメインおよびヒト軽鎖の定常
部を含む一つの軽鎖を含む、少なくとも一つの結合部位を含む、ヒト抗ＣＤ１５４抗体である。

【００２５】ヒト重鎖の定常部は、γ_１、γ_２、γ_３、γ_４、μ、α_１、α_２、δまたはε
タイプ、好ましくはγタイプ、より好ましくはγ_１またはγ_４タイプであり得、
一方ヒト軽鎖はκまたはλタイプ(λ_１、λ_２およびλ_３サブタイプを含む)であ
り得るが、好ましくはκタイプである。これらの定常部全てのアミノ酸配列は、
Kabat et al. 前掲に記載されている。

【００２６】本発明のＣＤ１５４結合分子は、組換えＤＮＡ法により製造し得る。この観点
から、結合分子をコードする１個以上のＤＮＡ分子を構築し、適当な制御配列下
に置き、そして発現のための適当な宿主生物に転移し得る。

【００２７】非常に一般的な方法で、したがって、 (ｉ)本発明の単一ドメインＣＤ１５４をコードするＤＮＡ分子、本発明のＣＤ１
５４分子の重鎖または軽鎖またはそのフラグメント、および (ii)組換え手段により本発明のＣＤ１５４結合分子を製造するための本発明のＤ
ＮＡ分子の使用を提供する。

【００２８】本分野の現在の状態は、当業者が本明細書に提供された情報、すなわち、超可
変領域のアミノ酸配列およびそれらをコードするＤＮＡ配列を考えると、本発明
のＤＮＡ分子を合成できる程である。可変ドメイン遺伝子を構築する方法は、例
えば、ＥＰ−Ａ−２３９,４００に記載され、簡単に下記のように要約し得る：
どんな特異性でもＭＡｂの可変領域をコードする遺伝子をクローン化する。フレ
ームワークおよび超可変領域をコードするＤＮＡセグメントを除去し、フレーム
ワーク領域をコードするＤＮＡセグメントを、結合部において適当な制限部位と
共に融合する。制限部位を、標準法によるＤＮＡ分子の変異生成により適当な位
置に作り得る。二本鎖合成ＣＤＲカセットを、各々配列番号５、６、７、８、９
または１０に記載の配列にしたがったＤＮＡ合成により製造する。これらのカセ
ットを突出末端として提供し、フレームワークの接合部にライゲートできるよう
にする。

【００２９】更に、本発明のＭＡｂをコードするＤＮＡ構築物を得るために、製造したハイ
ブリドーマ細胞系由来のｍＲＮＡにアクセスする必要はない。したがって、ＰＣ
Ｔ出願ＷＯ９７／０７８６１は、遺伝子のヌクレオチド配列に関して記載の情報
のみを考慮した組換えＤＮＡ技術によるＭＡｂの製造に関する完全な指示を提供
する。方法は、所望のＤＮＡ配列を得るための、多くのオリゴヌクレオチドの合
成、それらのＰＣＲ法による増幅、およびそのスプライシングを含む。

【００３０】適当なプロモーターまたは重鎖および軽鎖定常部をコードする遺伝子を含む発
現ベクターは、公に入手可能である。したがって、本発明のＤＮＡ分子を製造し
たら、それを適当な発現ベクターに簡便に転移し得る。一本鎖抗体をコードする
ＤＮＡ分子を、また、例えば、ＷＯ８８／１６４９に記載のような標準法により
製造し得る。

【００３１】前記の観点から、ハイブリドーマまたは細胞系の寄託は、記載の完全さの基準
にしたがって、必要ではない。

【００３２】本発明の特定の実施態様において、ＣＤ１５４分子の製造のための組換え手段
は、下記の第１および第２ＤＮＡ構築物を含む：

【００３３】第１ＤＮＡ構築物は重鎖またはそのフラグメントをコードし、ａ)別のフレームワークおよび超可変領域を含む可変ドメインをコードする第１
部分(該超可変領域は、連続してＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３であり、そ
のアミノ酸配列は各々配列番号５、６および７に示す)；該第１部分は可変ドメ
インの第１アミノ酸をコードするコドンから開始し、可変ドメインの最後のアミ
ノ酸の最後のアミノ酸をコードするコドンで終わる、そしてｂ)重鎖定常部の第１アミノ酸をコードするコドンから開始し、定常部またはそ
のフラグメントの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わる重鎖定常部または
そのフラグメントをコードする第２部分、これは停止コドンに続くを含む。

【００３４】好ましくは、この第１部分は、１位のアミノ酸から開始し、１１８位のアミノ
酸で終わる配列番号２に示すアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有す
る可変ドメインをコードする。より好ましくは、第１部分は１位のヌクレオチド
から開始し、３５４位のヌクレオチドで終わる配列番号１に示すヌクレオチド配
列を有する。また好ましくは、第２部分はヒト重鎖の定常部、より好ましくはヒ
トγ１鎖の定常部をコードする。この第２部分は、ゲノム起源のＤＮＡフラグメ
ント(イントロンを含む)またはｃＤＮＡフラグメント(イントロン無し)であり得
る。

【００３５】第２ＤＮＡ構築物は、軽鎖またはそのフラグメントをコードし、ａ)別のフレームワークおよび超可変領域を含む可変ドメインをコードする第１
部分(該超可変領域は、連続してＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'であり、
そのアミノ酸配列は各々配列番号８、９および１０に示す)；該第１部分は可変
ドメインの第１アミノ酸をコードするコドンから開始し、可変ドメインの最後の
アミノ酸の最後のアミノ酸をコードするコドンで終わる、そしてｂ)軽鎖定常部の第１アミノ酸をコードするコドンから開始し、定常部またはそ
のフラグメントの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わる軽鎖定常部または
そのフラグメントをコードする第２部分、これは停止コドンに続くを含む。

【００３６】好ましくは、この第１部分は、１位のアミノ酸から開始し、１０７位のアミノ
酸で終わる配列番号４に示すアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有す
る可変ドメインをコードする。より好ましくは、第１部分は１位のヌクレオチド
から開始し、３２１位のヌクレオチドで終わる配列番号３に示すヌクレオチド配
列を有する。また好ましくは、第２部分はヒト軽鎖の定常部、より好ましくはヒ
トκ鎖の定常部をコードする。

【００３７】本発明はまた、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'、また
はＣＤＲ３'の１個以上の残基が、各々配列番号５、６、７、８、９または１０
に示す残基から変わっているＣＤ１５４結合分子を含む；例えば、変異、例えば
、対応するＤＮＡ配列の部位特異的変異により。本発明は、このような変化した
ＣＤ１５４結合分子をコードするＤＮＡ配列を含む。特に、本発明は、ＣＤＲ１
'、ＣＤＲ２'、またはＣＤＲ３'の１個以上の残基が、各々配列番号８、９また
は１０に示す残基から変わっているＣＤ１５４結合分子を含む。

【００３８】第１および第２ＤＮＡ構築物において、第１および第２部分は好ましくはイン
トロンにより分けられる。第１および第２部分の間に位置するイントロンにおい
て、エンハンサーを挿入し得る。転写されるが翻訳されないこの遺伝要素の存在
は、第２部分の有効な転写のために必要であり得る。より好ましくは、第１およ
び第２ＤＮＡ構築物は、有利にはヒト起源の重鎖遺伝子のエンハンサーを含む。

【００３９】各ＤＮＡ構築物は、適当な制御配列の制御した、特に、適当なプロモーターの
制御下に置く。ＤＮＡ構築物を発現のために転移する宿主生物に適合する限り、
任意の種類のプロモーターを使用し得る。しかし、発現を哺乳類細胞で行なう場
合、ウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、ラウス肉
腫(ＲＳＶ)またはマウス白血病(ＭＬＶ)プロモーターを使用し得る。

【００４０】記載の抗体は、細胞培養において、またはトランスジェニック動物において製
造し得る。適当なトランスジェニック動物は、例えば、卵に、適当な制御配列下
に置かれた第１および第２部分をミクロ注入し、このように調製した卵を適当な
擬似妊娠雌に移し、所望の抗体を発現する子孫を選択することを含む、標準法に
したがって得られ得る。

【００４１】抗体鎖を細胞培養で製造しなければならない場合、ＤＮＡ構築物を最初に単一
発現ベクターにまたは二つの別であるが、適合性の発現ベクターに挿入しなけれ
ばならず、前者が恐らく好ましい。

【００４２】したがって、本発明はまた、上記のＤＮＡ構築物の少なくとも一つを含む、原
核または真核細胞系において複製できる発現ベクターを提供する。

【００４３】ＤＮＡ構築物を含む各発現ベクターをついで適当な宿主生物に転移する。ＤＮ
Ａ構築物を二つの発現ベクターに別々に挿入したとき、それらは別々に、すなわ
ち、細胞あたり一つのタイプのベクターに転移し、または共転移し、後者が恐ら
く好ましい。適当な宿主生物は細菌、酵母または哺乳類細胞系であり得、後者が
好ましい。より好ましくは、哺乳類細胞系がリンパ球起源、例えば三重ローマ、
ハイブリドーマまたは正常不死化Ｂ細胞であり、簡便には任意の内因性抗体重鎖
または軽鎖を発現しない。

【００４４】宿主生物が、細胞あたりＣＤ１５４結合分子コード配列の多数のコピーを含む
ことが好ましい。宿主生物が哺乳類細胞系である場合、この望ましい目的は、標
準法にしたがったコード配列のコピー数の増幅により達成し得る。このような増
幅法は、しばしば、医薬に対する増加した耐性の選択を含み、該耐性は発現ベク
ターによりコードされる。本発明のＣＤ１５４結合分子の発現のための好ましい
システムは、ＥＰ０２５６０５５Ｂ、ＥＰ０３２３９９７Ｂおよび欧州特許出願
８９３０３９６４.４に記載のような、グルタミンシンテターゼベースシステム(
ＧＳ−ベース)を含む。

【００４５】本発明の更なる実施態様において、(ｉ)上記の発現ベクターで形質転換させた
生物を培養する、および(ii)培養からＣＤ１５４結合分子を回収することを含む
、ＣＤ１５４結合分子の製造法を提供する。

【００４６】好ましい実施態様において、免疫グロブリンレパートリーの変わりにヒトＩｇ
Ｇ／κレパートリーを発現するように操作したトランスジェニックマウスを使用
ｓてヒトＣＤ１５４に対する抗体を産生する。マウスを、マウスＣκ鎖に融合し
たヒトＣＤ１５４(ＣＤ１５４−κ)の細胞外ドメインを含む、可溶性ヒトＣＤ１
５４組換えタンパク質で繰り返し免疫化する。タンパク質をより免疫原性とする
ために、可溶性ＣＤ１５４をＫＬＨと架橋させる。ＣＤ１５４：ＫＬＨのプライ
ミングは、表面ＣＤ１５４を構造的に発現する組換えヒト細胞系の細胞での反復
免疫化に続く。これらのマウス由来の脾臓細胞を標準ハイブリドーマ技術により
不死化し、マウスハイブリドーマ細胞を得、それはＩｇＧ１／κタイプのヒト抗
ＣＤ１５４抗体を分泌する。これらの抗体を、競合ＥＬＩＳＡタイプアッセイで
測定して、ヒトＣＤ１５４に対するそれらの反応性およびＣＤ１５４のＣＤ４０
への結合を阻害するその能力により、最後に選択する。

【００４７】本発明により、本明細書に記載のＣＤ１５４結合分子、例えば、ヒト抗ヒト、
例えば、ＡＢＩ７９３抗体が望ましい抗原エピトープ特異性ｗ有スルことが判明
した。したがって、ＡＢＩ７９３はヒトならびにカニクイザルＣＤ１５４抗原の
両方のエピトープを認識する；このエピトープは、マウス抗ヒトＣＤ１５４Ｍａ
ｂ５ｃ８および２４−３１により認識される各エピトープと異なる。特に、マ
ウス抗ヒトＭａｂ５ｃ８は３量体ヒトＣＤ１５４上に形成されたエピトープの
みを認識するが、ヒト抗ヒトＡＢＩ７９３抗体は単量体および３量体ＣＤ１５４
の両方の上に提示されたエピトープに結合する。

【００４８】抗体、特にキメラおよびＣＤＲ−移植抗体および特にヒト抗体は、好ましくは
、マウス抗ヒトＣＤ１５４Ｍａｂ５ｃ８および２４−３１により認識される各
エピトープと異なるヒトＣＤ１５４の抗原性エピトープに対する結合特異性を有
するモノクローナル抗体であり、抗体は、生理学的ＣＤ１５４／ＣＤ４０相互作
用を妨害、調節および／または阻害でき、例えば、臓器移植拒絶反応の予防また
は自己免疫または炎症性疾病または疾患、アテローム性動脈硬化またはアルツハ
イマー病の予防または処置におけるこのような抗体の使用は新規であり、本発明
の範囲内に含まれる。

【００４９】したがって、本発明はまた、単量体ならびに３量体ヒトＣＤ１５４上に提示さ
れるヒトエピトープと特異的に結合し、複合体を形成する、ＣＤ１５４結合分子
、好ましくはヒト抗体を提供し、該エピトープはＡＢＩ７９３が特異的に結合す
るエピトープである。

【００５０】本発明のＣＤ１５４結合分子、例えば、抗体(以後、本発明の抗体と呼ぶ)は、
価値のある薬理学的特性を示し、例えば、それらは、例えば、下記の通りの標準
インビトロおよびインビボ試験法により証明されるような、例えば、ＣＤ１５４
／ＣＤ４０相互作用を妨害、調節および／または阻害をする：

【００５１】１．ＣＤ１５４：ＣＤ４０結合の阻害ＣＤ１５４がＣＤ４０に結合するのを阻害する能力を、無細胞競合的結合アッ
セイにより試験する。組換え可溶性ヒトＣＤ１５４(すなわち、マウスＣ_κに融
合したヒトＣＤ１５４の細胞外部分)をマイクロタイタープレート上に固定化し
、プレートを、推定阻害剤の存在下または非存在下に、ビオチニル化組換え可溶
性ヒトＣＤ４０とインキュベートする。ＣＤ１５４に結合したＣＤ４０のフラク
ションを、Ｅｕ標識ストレプトアビジンを検出試薬として使用して蛍光的に測定
する。本アッセイにおいて、本発明の抗体は、ＩＣ_５０、すなわち、結合の５０
％阻害を達成するのに必要な濃度で示して、５から１５０ng／mlの阻害能を有す
る。ＡＢＩ７９３は、７５±１１ng／mlのＩＣ_５０を有することが判明した。

【００５２】ＣＤ１５４：ＣＤ４０結合の本発明の抗体、例えば、ＡＢＩ７９３による阻害
は、ＣＤ１５４：ＣＤ４０で見られるＩＣ_５０より５０倍まで高い濃度で試験し
た場合、ＴＮＦ：ＴＮＦ−ＲＩ結合を阻害しないため、特異的である(ＣＤ１５
４およびＣＤ４０はＴＮＦおよびＴＮＦレセプター(ＴＮＦ−Ｒ)ファミリーのメ
ンバーである、すなわち、それらは各々ＴＮＦおよびＴＮＦ−Ｒと相同性を共有
する)。ＴＮＦ：ＴＮＦ−Ｒ結合の阻害は、ＣＤ１５４：ＣＤ４０結合アッセイ
と同じ形式に設定した競合的結合アッセイの手段で行なう。

【００５３】２．ＣＤ１５４／ＩＬ−４駆動Ｂ細胞増殖の阻害可溶性組換えマウスまたはヒトＣＤ１５４タンパク質は、ＩＬ−４と組み合わ
さって、構造的に表面ＣＤ４０を発現する精製ヒトＢ細胞を刺激し、免疫グロブ
リンを増殖および生成する。簡単に、培養を９６ウェル平底組織培養クラスター
(Costar)で、Ｎａ−ピルベート(１ｍＭ：Gibco)、ＭＥＭ非必須アミノ酸(Gibco)
、２−メルカプトエタノール(５０μＭ)、Ｌ−グルタミン(２ｍＭ)、ゲンタマイ
シン(５０μg／ml；Gibco)、バクトアスパラギン(２０μg／ml；Difco)、ヒトイ
ンシュリン(５μg／ml；Sigma)、ヒトトランスフェリン(４０μg／ml；Sigma)お
よび選択したウシ胎児血清(４０％、Hyclone Labs, UT)を添加したＲＰＭＩ(Gib
co)中に調製する。標準アッセイにおいて、精製Ｂ細胞(２.５×１０^５／ml；０.
２mlクラスター)を５日間、トリプリケートで、組換えヒトＣＤ１５４(３μg／m
l)およびＩＬ−４(１００Ｕ／ml)で刺激する。Ｂ細胞増殖を評価するために、細
胞を４日目に１mCi／ウェルの^３Ｈ−ＴｄＲでパルスし、放射活性の取り込みを
１６時間後に測定する。トリプリケート培養の間のＳＤは、＜２０％である。コ
ントロールクラスターをマウスＣＤ１５４で刺激する。このアッセイにおいて、
本発明の抗体はＣＤ１５４依存性Ｂ細胞増殖を阻害する：ＡＢＩ７９３は７３±
２１ng／mlのＩＣ_５０を有することが判明した。

【００５４】３．Staphylococcus aureus Cowan I株(ＳＡＣ)によるＢ細胞増殖の誘導ＳＡＣは、表面免疫グロブリンを架橋することによりヒト末梢Ｂ細胞の約２０
％を活性化する。精製Ｂ細胞(２.５×１０^５／ml；０.２mlクラスター)をトリプ
リケートで１０日間、可溶性ＳＡＣ(Sigma；希釈１：１０,０００)およびＩＬ−
２(Chiron；３００Ｕ／ml)で刺激する。Ｂ細胞褥を評価するために、細胞を４日
目に１mCi／ウェルの^３Ｈ−ＴｄＲでパルスし、放射活性の取り込みを１６時間
後に測定する。トリプリケート培養の間のＳＤは、＜２０％である。ＩＬ−２と
組み合わさったＳＡＣで引き金を引かれたＢ細胞増殖、すなわち、ＣＤ１５４非
依存性Ｂ細胞増殖は、本発明の抗体、例えば、ＡＢＩ７９３で、ＩＣ_５０より約
４０倍高い濃度まで阻害されない。

【００５５】４．腎臓異種移植移植を、混合リンパ球培養反応(ＭＬＲ)で測定してカニクイザルの遺伝的に異
なるドナー−レシピエント対で行なう。異種移植片を標準微小血管技術を使用し
て、ドナー腎臓動脈とレシピエント末端動脈の間、ならびにドナー腎臓静脈とレ
シピエント大静脈の間の端−側吻合(end-to-side anastamosis)を創生する。つ
いで、主たる尿管膀胱吻合術を創生する。左右相称天然腎摘出術を閉じる前に完
了させる。抗体、例えば、ＡＢＩ７９３を、２０mg／kgの投与量で移植の日(０
日目)および手術後１、４、１１、１８および２６日目に、続いて２８日毎に１
回６ヶ月まで静脈内投与する。このように処理したサルは所望の効果を示すこと
が判明した。

【００５６】本発明の抗体は、したがって、ＣＤ１５４調節および／または妨害、またはＣ
Ｄ１５４：ＣＤ４０相互作用の阻害が治療的に有利である疾患または疾病の処置
および／または予防、マクロファージ関連炎症過程の予防、または抗原に対する
抗体応答の抑制、例えば、Ｂ細胞増殖および分化の阻害、Ｔ細胞応答の阻害、Ｔ
またはＢ細胞耐容性の導入または調節またはＣＤ１５４抗原を発現する腫瘍細胞
の増殖の阻害が望まれる疾患の処置に有用である。このような状態は自己免疫お
よび非自己免疫疾患を含む。本発明の抗体の投与により治療できる可能性のある
具体的な状態は、例えば、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症；自己免疫性
溶血性貧血；黒色表皮症；アレルギー性接触性皮膚炎；アジソン病；アトピー性
皮膚炎；円形脱毛症；全身性脱毛症；アミロイド症；アナフィラキシー性紫斑病
；過敏症反応；再生不良性貧血；血管性水腫、遺伝性または特発性；強直性脊椎
炎；動脈炎、頭部、巨細胞性または側頭；動脈炎、高安；喘息；毛細血管拡張性
運動失調症；自己免疫卵巣炎；自己免疫精巣炎；自己免疫ポリエドクリン失調(A
utoimmune polyendocrine failure)；ベーチェット病；ベルジェ病；ビュルガー
病；水疱性天疱瘡；カンジダ症、慢性粘膜皮膚；カプラン症候群；心筋梗塞後症
候群；心膜切開術後症候群；心炎；セリアック病；シャガス病；チェディアック
−東症候群；チャーグ・ストラウス症候群；コーガン症候群；寒冷凝集素症；ク
レスト症候群；クローン病；クリオグロブリン血症；潜源性線維化性肺胞炎；疱
疹状皮膚炎(Dermatitis herpetifomis)；皮膚筋炎；糖尿病；Diamond-Blackfan
症候群；ディジョージ症候群；円板状エリテマトーデス；好酸球性筋膜炎；上鞏
膜炎；持続性隆起性紅斑(Drythema elevatum diutinum)；有縁性紅斑、多形また
は結節性；家族性地中海熱；フェルティ症候群；肺線維症、糸球体腎炎、アナフ
ィラキシー性、自己免疫性、膿痂疹後、または移植後；糸球体症、膜性；グッド
パスチャー症候群；移植片対宿主病；顆粒球減少症、免疫介在；環状肉芽腫；肉
芽腫症、アレルギー性；肉芽腫性筋炎(Granulomatous myositis)；グレーヴズ病
；橋本甲状腺炎；新生児の溶血性疾患；ヘモクロマトーシス、特発性；シェーン
ライン・ヘノッホ紫斑病；肝炎、慢性活動性および慢性進行性；ヒスチオサイト
ーシスX；好酸球増加症候群；特発性血小板減少性紫斑病；ヨブ症候群；若年性
皮膚筋炎；若年性関節リウマチ(若年性慢性関節炎)；川崎病；角膜炎；乾性角結
膜炎；ランドリー−ギラン−バレー−ストロール症候群；癩病、癩腫；レフラー
症候群；ライエル症候群；ライム病；リンパ腫様肉芽腫症；肥満細胞症、全身性
；混合性結合組織病；多発単神経炎；Muckle-Well症候群；粘膜皮膚リンパ節症
候群；多中心性細網組織球症；多発性硬化症；重症筋無力症；菌状息肉腫；壊死
性血管炎、全身性；ネフローゼ症候群；重複症候群；脂肪織炎；発作性寒冷血色
素尿症；夜間発作性血色素尿症；類天疱瘡；天疱瘡；紅斑性天疱瘡、落葉状また
は尋常性；オウム病；肺炎、過敏性；結節性動脈周囲炎；リウマチ性多発筋痛症
；多発性筋炎；多発性神経炎、特発性；ポルトガル家族性ポリニューロパシー(P
ortuguese familial polyneuropathics)；前子癇/子癇；原発性胆汁性肝硬変；
全身性進行性硬化(強皮症)；乾癬；乾癬性関節炎；肺胞蛋白症または線維症、レ
イノー現象／症候群；Reidel's甲状腺炎；ライター症候群、再発性多発性軟骨炎
；リウマチ熱；リウマチ様関節炎；サルコイドーシス；強膜炎；硬化性胆管炎；
血清病；セザリー症候群；シェーグレン症候群；スティーブンス・ジョンソン症
候群；ステイル病；亜急性硬化性全脳炎；交感性眼炎；梅毒；全身性エリテマト
ーデス；移植拒絶反応；結核；潰瘍性大腸炎；分類不能結合組織症候群；蕁麻疹
、慢性または寒冷；ブドウ膜炎；白斑；斑ウェーバー・クリスチャン病；ヴェ
グナー肉芽腫症；ウィスコット−アルドリッチ症候群；ならびにアテローム性動
脈硬化症、アルツハイマー病、ＨＩＶ感染、またはリンパ増殖症候群、例えば白
血病(例えば、Ｔ細胞白血病)またはリンパ腫(例えばＴ細胞リンパ腫)を含む。移
植拒絶反応は、異種−または同種移植片、例えば、細胞、組織または固体臓器、
例えば、膵臓島、骨髄、角膜組織、ニューロン組織、心臓、肺、複合心肺、腎臓
、肝臓、腸、膵臓、気管、食道の拒絶反応を意味する。

【００５７】予防的または防止的適用において、本発明のＣＤ１５４結合分子は、まだ疾患
状態ではない患者に、患者の抵抗力(免疫応答の調節または抑制)を促進するため
に投与し得る。このような量は、“予防的有効量”と定義する。好ましい予防的
使用は、移植片拒絶反応の予防である。

【００５８】上記の使用のために、必要な投与量は、もちろん、投与の形態、処置する特定
の状態、患者自身の免疫系の一般的状態、および望む効果に依存して変化する。
一般に、十分な結果が、約０.０５から１００mg／kg体重の投与量で得られるこ
とが示される。本発明の抗体は、任意の簡便な経路で、特に、経腸的に、例えば
、経口で、例えば、カプセルの形で、または非経腸で、例えば、注射用溶液また
は懸濁液の形で、局所的にまたは吸入(経鼻または経口吸入)により投与し得る。

【００５９】本発明の抗体を、少なくとも一つの薬学的に許容される担体または希釈剤と共
に含む医薬組成物は、慣用法で、例えば薬学的に許容される担体または希釈剤と
の混合により製造し得る。

【００６０】前記に従い、本発明は更に：１．対象に、有効な、非毒性量の本明細書に記載のＣＤ１５４結合分子、例えば
、ＡＢＩ７９３を投与することを含む、上記のような疾病、疾患または状態の、
処置を必要とする対象における、予防または処置、例えば、ＣＤ４０陽性細胞と
のＣＤ１５４−陽性細胞の相互作用により介在される免疫応答の阻害、Ｂ細胞増
殖および分化のまたはＴ細胞応答の阻害、ＴまたはＢ細胞耐容性の導入または調
節、またはマクロファージ関連炎症性過程の予防のための方法；２．上記のような方法における、本明細書に記載のＣＤ１５４結合分子、例えば
、ＡＢＩ７９３の使用；３．本明細書に記載のＣＤ１５４結合分子、例えば、ＡＢＩ７９３を、薬学的に
許容される希釈剤または担体と共に含む、例えば、上記のような方法に使用する
ための、医薬組成物；４．上記の方法に有用な医薬組成物の製造において使用するための、本明細書に
記載のＣＤ１５４結合分子、例えば、ＡＢＩ７９３を提供する。

【００６１】ＣＤ１５４結合分子、例えば、本発明の抗体は、唯一の活性成分として、また
は例えば、アジュバントとして、免疫抑制または免疫調節レジメにおける他の医
薬と共に、または他の抗炎症剤と共に、例えば、同種または異種移植片急性また
は慢性拒絶反応、または炎症性もしくは自己免疫疾患の処置のために、または化
学療法剤と共に投与し得る。例えば、本発明の抗体は、カルシニューリン阻害剤
、例えば、シクロスポリンＡまたはＦＫ５０６；免疫抑制特性を有する大環状ラ
クトン、例えば、ラパマイシンまたは４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパ
マイシン(ＲＡＤ)；免疫抑制特性を有するアスコマイシン、例えば、ＡＢＴ−２
８１、ＡＳＭ９８１等；コルチコステロイド；シクロホスファミド；アザチオプ
レン；メトトレキサート；リンパ球里帰り剤、例えば、ＦＴＹ７２０；レフルノ
ミド；ミゾリビン；ミコフェノール酸；ミコフェノール酸モフェチル；１５−デ
オキシスペルグアリンまたはそれらの免疫抑制性ホモログ、アナログまたは誘導
体；免疫抑制性モノクローナル抗体、例えば、ＣＤ４０に対するまたは他の白血
球レセプター、例えば、ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、Ｃ
Ｄ２５、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４５またはＣＤ５８に対するモノ
クローナル抗体、またはそれらのリガンド、または抗ＢＢ１モノクローナル抗体
；他の免疫抑制性化合物、例えば、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインの少なくとも一
部を有する組換え結合分子またはその変異体、例えば、非ＣＴＬＡ４タンパク質
配列に結合したＣＤＴＬ４の少なくとも細胞外部分またはその変異体、例えば、
ＣＴＬＡ４Ｉｇ(例えば、名称ＡＴＣＣ６８６２９)またはその変異体、例えば、
ＬＥＡ２９Ｙ；接着分子阻害剤、例えばＬＦＡ−１アンタゴニスト、ＩＣＡＭ−
１またはー３アンタゴニスト、ＶＣＡＭ−４アンタゴニストまたはＶＬＡ−４ア
ンタゴニスト；または化学療法剤、例えば、パクリタキセル、ゲンシタビン、シ
スプラチン、ドキソルビシンまたは５−フルオロウラシルと組み合わせて使用し
得る。

【００６２】本発明の抗体を、他の免疫抑制性／免疫調節性、抗炎症性または化学療法的治
療と組み合わせて投与する場合、共投与する免疫抑制性、免疫調節性、抗炎症性
または化学療法的化合物の投与量は、もちろん、用いる共医薬のタイプ、例えば
、ステロイドかカルシニューリン阻害剤か、用いる具体的医薬、処置する状態等
に依存して異なる。前記に従い、本発明は更なる態様において：５．治療的有効、非毒性量の本明細書に記載のＣＤ１５４結合分子、例えばＡＢ
Ｉ７９３と、少なくとも一つの第２医薬物質、例えば、上記の、例えば、免疫抑
制性、免疫調節性、抗炎症性または化学療法的医薬と、例えば、同時に、または
連続して共投与することを含む、上記の方法。６．ａ)本明細書に記載の遊離形または薬学的に許容される塩形のＣＤ１５４結
合分子、例えばＡＢＩ７９３である第１薬剤、およびｂ)少なくとも一つの共薬
剤、例えば、上記のいずれかの方法に使用するための、薬学的組合せ、例えば、
免疫抑制性、免疫調節性、抗炎症性または化学療法的医薬を含む、キット。本キ
ットはその投与のための指示書を含み得る。を提供する。

【００６３】本明細書で使用される限り、“共投与”または“併合投与”等の用語は、一人
の患者への選択治療剤の投与を含むことを意味し、薬剤が投与の同じ経路でまた
は同時に投与される必要はない処置レジメを含むことを胃とする。

【００６４】本明細書で使用する限り、“薬学的組合せ”なる用語は、１個以上の活性成分
の混合または組合せに由来する製品を意味し、活性成分の固定および非固定組合
せを含む。“固定組合せ”なる用語は、活性成分、例えばＡＢＩ７９３と共薬剤
の両方が、一つの物または調剤の形として同時に患者に投与されることを意味す
る。“非固定組合せ”なる用語は、活性成分、例えばＡＢＩ７９３と共薬剤が、
両方、患者に別々の物として、一斉に、同時にまたは連続的に具体的な時間制限
無しに投与され、ここで、このような投与は、患者の体内の二つの化合物の治療
的有効レベルを提供する。後者はまたカクテル治療、例えば、３個以上の活性成
分の投与にも適用される。

【００６５】好ましい組合せは、例えば、ａ)本発明の抗体、例えばＡＢＩ７９３、およびｂ)共薬剤として、ＣＴＬＡ４Ｉｇまたはその変異体、例えばＬＥＡ２９Ｙ；および／またはラパマイシンまたは４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマ
イシン；および／またはリンパ球里帰り剤、例えばＦＴＹ２０；および／またはＣＤ２５に対するモノクローナル抗体、例えばバシリキシマブま
たはダクリズマブ(daclizumab) を含む。

【００６６】好ましい組合せの例は、本発明の抗体とＬＥＡ２９Ｙ、ＲＡＤおよび所望によ
りＦＴＹ７２０の組合せ、または本発明の抗体とＬＡＥ２９Ｙおよびバシリキシ
マブまたはダクリズマブの組合せ、または本発明の抗体とＲＡＤの組合せ、また
は本発明の抗体とＬＡＥ２９Ｙの組合せである。本発明の抗体とＬＥＡ２９Ｙ、
ＲＡＤおよび所望によりＦＴＹ７２０の組合せは、有利にはＢまたはＴ細胞耐容
性の導入または調節に使用し得る。

【００６７】好ましくは、本発明の抗体はヒト抗体、最も好ましくはＡＢＩ７９３抗体また
はその直接相動物である。本発明を、添付の図面を引用した以下の実施例において説明のみの目的で更に
説明する。

【００６８】図１はエピトープ分析に関し、Jurkat D1.1細胞を使用した交叉遮断実験結果
を示す：単独で(通常の線)または示す量の非標識抗ＣＤ１５４ｍＡｂと先立つ予
備インキュベーションした後に(太線)、示すようにＦＴＣ−標識ｍＡｂで染色す
る。図２はエピトープ分析に関し、活性化ヒトＴ細胞を使用した交叉遮断実験結果
を示す：図１のように、しかしＰＭＡ／イオンマイシンで染色前に６時間活性化
した精製ＣＤ４陽性ヒトＴ細胞を使用した。図３はエピトープ分析に関し、活性化カニクイザルＴ細胞を使用した交叉遮断
実験結果を示す：図１のように、しかしＰＭＡ／イオンマイシンで染色前に４時
間活性化した精製ＣＤ４陽性カニクイザルＴ細胞を使用した。図４は３量体組換えヒトＣＤ１５４の検出を示す。図５は単量体組換えヒトＣＤ１５４の検出を示すレーンＭ：前染色マーカー；レーン１：ヒトＣＤ１５４：マウス−Ｃ_κ融合タン
パク質；レーン２：ヒトＣＤ１５４の細菌発現細胞外部分。

【００６９】実施例１：ハイブリドーマの産生および抗他の精製遺伝子操作したマウス６６(Medarex Inc. Annadale, NJ)を可溶性ヒトＣＤ１
５４で上記のように、アジュバント中でいくつかの部位に(５０μg)ｓ.ｃ.で免
疫化する。マウスを更に５回追加免疫し、最後の注射は融合３日前である。融合
日に、マウス６６をＣＯ_２吸入により殺し、脾臓細胞(４.１×１０^７)を、慣用
法で、ＰＥＧ４０００を使用して、同数の、マウスミエローマ細胞系ＰＡＩ−Ｏ
細胞と融合させる。融合細胞を、ＲＰＭＩ１６４０、１０％熱不活性かウシ退治
血清、５×１０^−５Ｍ β−メルカプトエタノール含有ＨＡＴ中、マウス腹膜細
胞(Balb Cマウス)の支持細胞層を含む６２４ウェル(１ml／ウェル)にプレーティ
ングする(plated out)。上清を回収し、ＥＬＩＳＡで試験し、ＣＤ１５４反応性
モノクローナル抗体に関してスクリーニングする。ＩｇＧ／κサブクラスの５つ
のモノクローナル抗体を同定する。クローニングを４×９６ウェルマイクロタイ
タープレートを使用して、０.５細胞／ウェルでプレーティングして行なう。２
週間後、ウェルを倒立顕微鏡で検査する。上清を増殖に関して陽性のウェルから
回収し、抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体の製造をＥＬＩＳＡにより評価する。
陽性ハイブリドーマをサブクローン化し、製造した抗体をＩ−２Ｌ上清から親和
性により単離する。ハイブリドーマ＃２０７.２を選択し、抗体ＡＢＩ７９３を
生成し、製造抗体をプロテインＡカラム上の親和性クロマトグラフィーにより精
製する。

【００７０】抗体ＡＢＩ７９３は、配列番号１から４に示すＤＮＡおよびアミノ酸配列によ
り特徴付けられる。

【００７１】実施例２：解離平行定数の測定組換えヒトＣＤ１５４対ＡＢＩ７９３の結合に関する会合および解離速度定数
をBIAcore分析により測定する。ＡＢＩ７９３を固定化し、１０から１６０ｎＭ
の範囲の濃度の可溶性組換えＣＤ１５４(ＣＤ１５４−κ)の結合を表面プラスモ
ン共鳴により測定する。選択形式は１価相互作用を表す。データ分析は、ＢＩＡ
評価ソフトウェアを使用して行なう。

【表１】

【００７２】実施例３：エピトープ分析交叉遮断実験を、マウス抗ＣＤ１５４ＭＡｂ５ｃ８および２４−３１の存在
下で行なう：表面ＣＤ１５４発現Ｔ細胞を、この目的でＦＴＣ標識した、３つの
うち１つの抗ＣＤ１５４Ｍａｂで染色する。ＦＴＣ−５ｃ８での染色前のJurkat
D1.1細胞(ＣＤ１５４を構造的に発現)の皮表式２４−３１とのプレインキュベ
ーションは、蛍光シグナルを無くし、すなわち、非標識５ｃ８とプレインキュベ
ーションしたのと同じ方法でＦＴＣ−５ｃ８の結合を遮断する(図１Ａ対１Ｂ)。
これは、５ｃ８および２４−３１がＣＤ１５４抗原における相互のまたは並列し
たエピトープを認識することを示す。対照的に、非標識ＡＢＩ７９３とのプレイ
ンキュベーションはＦＴＣ−標識５ｃ８の結合に影響しない(図１Ｄ)。これは、
ＡＢＩ７９３がマウス抗ヒトＣＤ１５４Ｍａｂ５ｃ８および２４−３１により認
識されるエピトープと異なる、ＣＤ１５４抗原上のエピトープを認識することを
証明する。これらの結果は、ヒト(図２)またはカニクイザル(図３)起源のＰＭＡ
／イオノマイシン活性化、単離ＣＤ１５４陽性Ｔ細胞を使用して確認される。こ
れらの結合アッセイにおいて、Jurkat細胞に関して記載のものと同じ方法を使用
し、ＡＢＩ７９３は、マウス抗ヒトＣＤ１５４Ｍａｂ５ｃ８および２４−３１に
より認識される各エピトープと異なる、ヒトおよびカニクイザルＣＤ１５４抗原
の両方のエピトープを認識する。

【００７３】ＣＤ１５４は非共有結合ホモトリマーとしてＴ細胞上に発現される；同様に、
生物学的に活性な可溶性ＣＤ１５４は本質的に非共有結合のホモトリマーを溶液
中で形成する。ＡＢＩ７９３により認識されるかエピトープがＣＤ１５４のその
ままの３量体構造に依存するかを分析するために、スロットブロット(図４)およ
びウェスタンブロット(図５)分析を行なう。図４は、ニトロセルロース膜にスポ
ットされた３量体ＣＤ１５４(すなわち、生物学的に活性な可溶性ＣＤ１５４)が
、ＡＢＩ７９３ならびに５ｃ８および２４−３１により認識されることを示す。
これはウェスタンブロット分析の結果と対照的である。ポリアクリルアミドゲル
電気泳動(ＰＡＧＥ)の条件下で、ＣＤ１５４はモノマーとして移動する。ニトロ
セルロース膜にブロッティングした後、ＡＢＩ７９３のみが約４０ｋＤａＣＤ
１５４融合タンパク質(図５、“ＡＢＩ７９３”、レーン１、矢印“Ａ”)、なら
びにＣＤ１５４の１５ｋＤ細菌発現細胞外ドメイン(図５、“ＡＢＩ７９３”
、レーン２、矢印“Ｂ”；このレーンで照らされている約３０ｋＤタンパク質は
、恐らくＣＤ１５４２量体であろう)を示すことができる。対照的に、５ｃ８
および２４−３１は、ＣＤ１５４組換えタンパク質を認識できなかったが、ニト
ロセルロース膜に直接スポットした組換えＣＤ１５４、すなわち、３量体にに結
合する(図４)。これは、ＡＢＩ７９３がＣＤ１５４単量体および３量体の両方を
認識するが、５ｃ８および２４−３１が３量体にのみ結合することを示す。これ
は、ＡＢＩ７９３が５ｃ８および２４−３１により認識されるものと異なるＣＤ
１５４抗原上のエピトープを認識することを証明する、ＦＡＣＳ試験の発見を強
める。

【００７４】３量体組換えヒトＣＤ１５４の検出：１μｇの組換え可溶性ヒトＣＤ１５４(すなわち、マウス−Ｃ_κに融合したヒ
トＣＤ１５４の細胞外部分)をニトロセルロースフィルターにスロットブロット
する。膜を５％ＢＳＡで遮断した後、個々の切片を１時間、種々の濃度の抗ヒト
ＣＤ１５４抗体(２.０；１.０；０.５；０.２５；０.１２５μg／ml)とインキュ
ベートする。結合抗体を、ついで、アルカリホスファターゼ結合γ鎖特異的ヤギ
抗ヒトＩｇＧ(ＡＢＩ７９３に関して)またはヤギ抗マウスＩｇＧ(５ｃ８および
２４−３１に関して)のいずれかと４５分間インキュベーションし、続いてＰＣ
ＩＢ／ＮＢＰとの標準反応することにより確認する。組換えＣＤ１５４のマウス
−Ｃ_κ部分との交叉反応を抑制するために、切片を各第２抗体のみとインキュベ
ートした。

【００７５】単量体ヒトＣＤ１５４の検出： E. coliに発現させた、マウスＣ_κに融合したＣＤ１５４の細胞外部分からな
る融合タンパク質、または細胞合い部分のみのいずれかの形の組換えヒトＣＤ１
５４の５つの個別のサンプルシリーズを、１つの４−２０％ＰＡＧＥ勾配ゲルで
電気泳動する。ニトロセルロースにブロッティング後、膜を切り、個々の切片を
連続して１時間、示す抗ヒトＣＤ１５４抗体とインキュベートする。結合抗体を
、ついで、アルカリホスファターゼ結合γ鎖特異的第２抗体(各々、ヤギ抗マウ
スＩｇＧおよびヤギ抗ヒトＩｇＧ)と４５分間インキュベーションし、続いてＰ
ＣＩＢ／ＮＢＰとの標準反応することにより確認する。

【図面の簡単な説明】

【図１】エピトープ分析に関し、Jurkat D1.1細胞を使用した交叉遮断実験
結果を示す：単独で(通常の線)または示す量の非標識抗ＣＤ１５４ｍＡｂと先立
つ予備インキュベーションした後に(太線)、示すようにＦＴＣ−標識ｍＡｂで染
色する。

【図２】エピトープ分析に関し、活性化ヒトＴ細胞を使用した交叉遮断実験
結果を示す：図１のように、しかしＰＭＡ／イオンマイシンで染色前に６時間活
性化した精製ＣＤ４陽性ヒトＴ細胞を使用した。

【図３】エピトープ分析に関し、活性化カニクイザルＴ細胞を使用した交叉
遮断実験結果を示す：図１のように、しかしＰＭＡ／イオンマイシンで染色前に
４時間活性化した精製ＣＤ４陽性カニクイザルＴ細胞を使用した。

【図４】３量体組換えヒトＣＤ１５４の検出を示す。

【図５】単量体組換えヒトＣＤ１５４の検出を示すレーンＭ：前染色マーカー；レーン１：ヒトＣＤ１５４：マウス−Ｃ_κ融合タン
パク質；レーン２：ヒトＣＤ１５４の細菌発現細胞外部分。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 7/06 7/06 9/00 9/00 9/04 9/04 9/10 9/10 11/00 11/00 11/06 11/06 13/02 13/02 13/12 13/12 15/00 15/00 17/00 17/00 １０１１０１ 17/04 17/04 17/14 17/14 19/00 19/00 21/00 21/00 21/04 21/04 25/00 25/00 25/14 25/14 25/28 25/28 27/02 27/02 29/00 29/00 １０１１０１ 31/04 31/04 31/06 31/06 31/08 31/08 31/10 31/10 31/12 31/12 31/18 31/18 35/00 35/00 35/02 35/02 37/00 37/00 37/02 37/02 37/08 37/08 41/00 41/00 43/00 １０５ 43/00 １０５１２１１２１Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 BA41 BA61 CA01 GA01 GA11 GA18 HA08 4C085 AA13 AA34 AA35 CC21 CC22 DD62 4H045 AA11 AA20 AA30 BA09 BA41 CA40 DA75 DA76 EA20 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】連続して超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含
む(ここで、該ＣＤＲ１はアミノ酸配列Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｓ
ｎを有し、該ＣＤＲ２はアミノ酸配列Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ
−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒを有し、そして該ＣＤＲ３はアミノ
酸配列Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅを有する)、
少なくとも一つの免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(Ｖ_Ｈ)を含む抗原結合部位を
含む、ＣＤ１５４結合分子；およびその直接相同物。
【請求項２】ＣＤ１５４結合分子が：ａ)連続して超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む((ここで、該
ＣＤＲ１はアミノ酸配列Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｓｎを有し、該Ｃ
ＤＲ２はアミノ酸配列Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓ
ｐ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒを有し、そして該ＣＤＲ３はアミノ酸配列Ｇｌｕ−
Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅを有する)、免疫グロブリン
重鎖可変ドメイン(ＨＶ)、およびｂ)連続して超可変領域ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'を含む(ここで、
該ＣＤＲ１'はアミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ
−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａを有し、該ＣＤＲ２'はアミノ酸配
列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒを有し、そして該
ＣＤＲ３'はアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−
Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒを有する)、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(ＬＶ) を含む、少なくとも一つの抗原結合部位を含むものである、重鎖(Ｖ_Ｈ)および軽鎖(Ｖ_Ｌ)可変領域の両方を含む、ＣＤ１５４結合分子および
その直接相同物。
【請求項３】ヒト抗体である、請求項１または２に記載のＣＤ１５４結合
分子。
【請求項４】ａ)１位のアミノ酸から開始し、１１８位のアミノ酸で終わ
る配列番号２に示すものと実質的に同一のアミノ酸配列を有する可変ドメインお
よびヒト重鎖の定常部を含む一つの重鎖；およびｂ)１位のアミノ酸から開始し、１０７位のアミノ酸で終わる配列番号４に示す
ものと実質的に同一のアミノ酸配列を有する可変ドメインおよびヒト軽鎖の定常
部を含む一つの軽鎖を含む、少なくとも一つの結合部位を含む、ヒト抗ＣＤ１５４抗体。
【請求項５】ＣＤ４０陽性細胞とのＣＤ１５４−陽性細胞の相互作用によ
り介在される免疫応答の阻害、ＣＤ１５４調節および／またはＣＤ１５４：ＣＤ
４０相互作用の妨害または阻害が治療的に有利である疾患または疾病の処置およ
び／または予防、マクロファージ関連炎症性過程の予防、または抗体の抗原への
反応の抑制が望まれる疾患の処置において使用する、請求項１から４のいずれか
に記載のＣＤ１５４結合分子。
【請求項６】ＣＤ４０陽性細胞とのＣＤ１５４−陽性細胞の相互作用によ
り介在される免疫応答の阻害、ＣＤ１５４調節および／またはＣＤ１５４：ＣＤ
４０相互作用の妨害または阻害が治療的に有利である疾患または疾病の処置およ
び／または予防、マクロファージ関連炎症性過程の予防、または抗体の抗原への
反応の抑制が望まれる疾患の処置のための医薬の製造おいて使用する、請求項１
から５のいずれかに記載のＣＤ１５４結合分子。
【請求項７】重鎖またはそのフラグメントをコードし、ａ)別のフレームワークおよび超可変領域を含む可変ドメインをコードする第１
部分(該超可変領域は、連続してＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３であり、そ
のアミノ酸配列は各々配列番号５、６および７に示す)；該第１部分は可変ドメ
インの第１アミノ酸をコードするコドンから開始し、可変ドメインの最後のアミ
ノ酸の最後のアミノ酸をコードするコドンで終わる、そしてｂ)重鎖定常部の第１アミノ酸をコードするコドンから開始し、定常部またはそ
のフラグメントの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わる重鎖定常部または
そのフラグメントをコードする第２部分、これは停止コドンに続くを含む、第１ＤＮＡ構築物。
【請求項８】軽鎖またはそのフラグメントをコードし、ａ)別のフレームワークおよび超可変領域を含む可変ドメインをコードする第１
部分(該超可変領域は、連続してＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'であり、
そのアミノ酸配列は各々配列番号８、９および１０に示す)；該第１部分は可変
ドメインの第１アミノ酸をコードするコドンから開始し、可変ドメインの最後の
アミノ酸の最後のアミノ酸をコードするコドンで終わる、そしてｂ)軽鎖定常部の第１アミノ酸をコードするコドンから開始し、定常部またはそ
のフラグメントの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わる軽鎖定常部または
そのフラグメントをコードする第２部分、これは停止コドンに続くを含む、第２ＤＮＡ構築物。
【請求項９】請求項７または８に記載のＤＮＡ構築物の少なくとも一つを
含む、原核または真核細胞系において複製できる発現ベクター。
【請求項１０】ＣＤ４０陽性細胞とのＣＤ１５４−陽性細胞の相互作用に
より介在される免疫応答の阻害、ＣＤ１５４調節および／またはＣＤ１５４：Ｃ
Ｄ４０相互作用の妨害または阻害が治療的に有利である疾患または疾病の処置お
よび／または予防、マクロファージ関連炎症性過程の予防、または抗体の抗原へ
の反応の抑制が望まれる疾患の処置に使用するための、請求項１から４のいずれ
かに記載のＣＤ１５４結合分子と、薬学的に許容される希釈剤または担体を含む
、医薬組成物。
【請求項１１】ａ)請求項１から４のいずれかに記載のＣＤ１５４結合分
子、およびｂ)少なくとも一つの共薬剤を含む、薬学的組合せ。
【請求項１２】対象に有効な、非毒性量の請求項１に記載のＣＤ１５４結
合分子を投与することを含む、処置を必要とする対象のＣＤ１５４調節および／
またはＣＤ１５４：ＣＤ４０相互作用の妨害または阻害が治療的に有利である疾
患、疾病または状態の予防または処置法。