JP2003525624A

JP2003525624A - 炎症関連遺伝子

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Publication number: JP2003525624A
Application number: JP2001565761A
Authority: JP
Inventors: ガボール・ヤライ; ポール・ロイ・クーパー; シダ・ユーセフィ
Original assignee: ノバルティスアクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 2000-03-06
Filing date: 2001-03-05
Publication date: 2003-09-02
Also published as: AU5215601A; EP1261640A2; WO2001066597A3; WO2001066597A2; US20020187947A1

Abstract

(57)【要約】 (Ａ)配列番号２のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列の機能的等価変異体を含むポリペプチド、または(Ｂ)ポリペプチド(Ａ)をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、または(Ｃ)ポリペプチド(Ａ)と免疫反応性である抗体、または(Ｄ)ヌクレオチド(Ｂ)と相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、または(Ｅ)(Ｂ)の少なくとも１５連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドプローブの、好中球関連炎症性疾患の診断または処置用医薬の製造における使用。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、診断的および治療的適用におけるＥＸ３３と呼ばれる疾患関連Ｇ−
プロテイン結合レセプター遺伝子、ＥＸ３３によりコードされるタンパク質分子
および関連分子の使用、および治療的標的としての、ＥＸ３３によりコードされ
るタンパク質の使用に関する。

【０００２】炎症中に組織内に引き寄せられる細胞は、種々の白血球、特に好中性および好
酸性顆粒球および単球のような炎症性貪食細胞を含む。好中球は、慢性気管支炎
およびそれに関連する気腫を含む慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)、および成人呼吸
窮迫症候群(ＡＲＤＳ)、クーロン病および潰瘍性大腸炎のような炎症性大腸疾患
、および関節リウマチのような好中球関連呼吸器疾患における炎症および組織破
壊に関連している。

【０００３】炎症性状態における白血球の作用における重要な段階は、これらの細胞の組織
中、例えば、呼吸器炎症において気道中、または関節リウマチにおいて関節、中
への移動、細胞活性化およびさまざまな炎症性メディエーター、ロイコトリエン
、酸素ラジカル、プロテアーゼの放出を含む。白血球移動および活性化に必要な
シグナルは、しばしば７つの膜を貫通して伸びる(seven transmembrane-spannin
g)Ｇ−プロテイン結合レセプター(ＧＰＣＲ)スーパーファミリーに属するレセプ
ターを介して伝達される。ＧＰＣＲ遺伝子ファミリーは、最大の既知のレセプタ
ーファミリーである。ＧＰＣＲは、細胞外シグナルのトランスデューサーであり
、それらは組織が幅広いシグナル伝達分子に応答することを可能にする。

【０００４】例えば、白血球移動は、血液細胞の内皮表面への停止および堅い接着、および
内皮を通った間質へのおよびそこから特定の微環境への移動を含む。顆粒球(お
よび他の白血球)の組織への移動は、これらの各段階において根本的に重要であ
る走化性因子(ケモカイン)により制御される。内皮細胞の表面に提示されるケモ
カインは、顆粒球および他の白血球上のそれらの同族レセプターと相互作用し、
堅い接着が、ついで、組織を通った標的微環境への移住に続く。ケモカインの同
族レセプターは、ＧＰＣＲのサブ−ファミリーのメンバーである。走化性に加え
て、ＧＰＣＲスーパー−ファミリーのメンバーは、また、炎症性状態で観察され
るもののような、種々の細胞性過程の活性化を、例えば細胞内カルシウム放出ま
たはｃＡＭＰ生成と結合して、導くことができる、多くの他のシグナル伝達事象
に関連している。

【０００５】異なるＧＰＣＲの間のアミノ酸配列比較は、配列類似性が広範囲にわたり変化
し得、ＧＰＣＲの異なるサブファミリーが、しばしば明白な配列類似性を共有し
ないことを確認する。しかし、これら全てのレセプターは、３つの細胞内および
３つの細胞外ループにより接続された７つの膜貫通型ヘリックス(ＴＭ−Ｉから
−VII)を共通して有する。

【０００６】種々のクローニングストラテギーおよびデータベースマイニングアプローチが
、この共通構造により特徴付けられる多くのＧＰＣＲのクローニングを導く。し
かし、リガンドの同定は遅れており、そのタンパク質生成物が、基準として配列
類似性および予測的３Ｄ構造を使用して、ＧＰＣＲファミリーのメンバーである
多くのＧＰＣＲ遺伝子が存在するが、それに対するリガンドは知られていない。
これらのレセプターは、孤児Ｇ−プロテイン結合レセプター(ｏＧＰＣＲ)として
一般に知られている。

【０００７】Ｇ−プロテイン結合レセプターは、それらが広範囲の生理学的および病理学的
過程に関与しているため、治療的適用における重要な標的である。６０−７０％
の現在四版されている医薬が、ＧＰＣＲスーパーファミリーのメンバーに実際作
用すると概算される。

【０００８】ＧＰＣＲの同定に使用できる一つの方法は、縮重プライマーポリメラーゼ連鎖
反応(ＰＣＲ)である。この方法において、ＧＰＣＲ遺伝子サブ−ファミリーの二
つの選択した、保存領域に対応するオリゴヌクレオチドの二つの混合物を合成し
、低ストリンジェンシーポリメラーゼ連鎖反応条件を使用したゲノムまたはｃＤ
ＮＡ鋳型のフラグメントの増幅に使用される。プライマーの混合物は、それらが
関連するが、異なる配列である遺伝子フラグメントの増幅を可能にするように設
計する。増幅を単離し、ゲノムおよびｃＤＮＡクローンの両方で、完全長遺伝子
をクローンするのに使用できる。縮重ＰＣＲアプローチの主な利点は、それが目
的の特異的遺伝子−ファミリーのメンバーの単離を助けることである。

【０００９】好中球関連介在炎症性疾患状態で炎症性細胞に発現されるＧ−プロテイン結合
レセプター遺伝子の同定は、炎症性状態の理解に重要な機会を提供し、そこから
多くの重要な適用が発生するであろう。同定されたＧＰＣＲは、該遺伝子または
該遺伝子のタンパク質産物を直接標的とした治療(小分子医薬、アンチセンス分
子、抗体分子)の開発を導き得、または、このような医薬の開発が、該遺伝子の
ターゲティングより容易な場合、上流または下流での生化学的経路を標的とし得
る。該遺伝子および配列変異体を含むポリヌクレオチド配列を使用し、好中球関
連炎症性疾患状態の診断的試験を開発し得る。最後に、これらの炎症性状態に環
よするＧＰＣＲのＤＮＡ配列および、これらの遺伝子によりコードされるアミノ
酸配列に関する情報は、組換え技術によるタンパク質の大規模製造、および天然
に該タンパク質を生成する組織および細胞の同定を促進する。このような配列情
報はまたＧＰＣＲ遺伝子によりコードされるタンパク質と特異的反応する抗体物
質または他の新規結合分子の製造を可能にし、これはタンパク質が関与するリガ
ンド／抗リガンド結合反応の調節に使用し得る。

【００１０】したがって、一つの態様において、本発明は、(Ａ)配列番号２のアミノ酸配列
、または該アミノ酸配列の機能的等価変異体、すなわち、その生物学的または他
の機能的活性を保持した変異体を含むポリペプチド、または(Ｂ)ポリペプチド(
Ａ)をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド(以後、ＥＸ３３と呼
ぶ)、または(Ｃ)ポリペプチド(Ａ)と免疫反応性である抗体、または(Ｄ)ヌクレ
オチド(Ｂ)と相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド
、または(Ｅ)(Ｂ)の少なくとも１５連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドプ
ローブの、好中球関連炎症性疾患の診断または処置用医薬の製造における使用を
提供する。

【００１１】本明細書で使用する用語は、以下の意味を有する： “単離”は、その本来の環境から除かれた物質を意味する。 “ハイブリダイゼーション”または“ハイブリダイズ”は、ポリヌクレオチド
の鎖が、塩基対形成を介してその相補鎖と結合する任意の工程を意味する。 “ストリンジェントな条件”は、２０％までの塩基対ミスマッチを可能にする
実験条件を意味し、典型的に６５℃で０.１×ＳＳＣ(１５ｍＭＮａＣｌ、１.
５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７.０)の２回、１５分洗浄である。

【００１２】 “相同性”または“相同”は、部分的であるか、または、配列が同一である場
合、完全であり得る、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の類似の程度を意味
する。 “発現ベクター”は、目的のポリペプチドをコードするセグメント、および操
作か能に連結したその転写のために提供された更なるセグメントを含む、直鎖ま
たは環状ＤＮＡ分子である。

【００１３】 “アンチセンス”は、標的タンパク質のメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)にお
ける、オリゴ−またはポリヌクレオチドの、その相補的配列へのハイブリダイゼ
ーションを介したタンパク質合成の選択的阻害を意味する。アンチセンス該ねは
、最初に、ZamecnikおよびStephenson(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:280-284
; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:285-288)により提案され、続いて実験的ツー
ルとしておよび推定治療分子を生成する手段のとしての両方の広い適用が発見さ
れた(Alama, A., Pharmacol. Res. 36:171-178; Dean, N.M., Biochem. Soc. Tr
ans. 24:623-629; Bennet, C.F., J. Pharmacol. Exp. Ther. 280:988-1000; Cr
ooke, S.T., Antisense Research and Applications, Springer)。

【００１４】本明細書で使用する“変異体”は、アミノ酸配列に関して、１個以上のアミノ
酸により変えられているアミノ酸配列を意味する、変化は、アミノ酸置換、欠失
または挿入を含み得る。ヌクレオチド配列に関して、本明細書で使用する“変異
体”なる用語は、１個以上のヌクレオチドにより変えられているヌクレオチド配
列を言いする；変化は、ヌクレオチド置換、欠失または挿入を含み得る。アミノ
酸配列の機能的等価変異体は、例えば、そのアミノ酸配列を含むポリペプチドに
結合できる抗体を生成できる変異体であり得る。好ましいアミノ酸配列番号２の
機能的等価変異体は、配列番号２と、少なくとも８０％、より好ましくは少なく
とも９０％、そして特に９５％を超えるアミノ酸配列同一性を有する。

【００１５】配列番号２のような参照配列とｘ％同一性を有するアミノ酸配列は、参照配列
の１００アミノ酸当たり、１００−ｘアミノ酸変化以外、参照配列と同一の配列
を意味する。例えば、参照配列と少なくとも８０％同一性を有する対象アミノ酸
配列において、参照配列における２０％までのアミノ酸残基が、他のアミノ酸残
基により置換、欠失または挿入されていてよい。アミノ酸配列間の同一性パーセ
ントは、コンピュータープログラム、例えばBrutlag et al(Comp.App.Biosci.(1
990)6:237-245)のアルゴリズムをベースにしたＦＡＳＴＤＢプログラムを慣用的
に使用して決定でいる。

【００１６】ポリヌクレオチド(Ｂ)はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。特
定の実施態様において、ポリヌクレオチド(Ｂ)は、配列番号１のヌクレオチド配
列を含むｃＤＮＡ、またはストリンジェントな条件下で配列番号１とハイブリダ
イズするヌクレオチド配列を含むＤＮＡである。このようなハイブリダイゼーシ
ョン要求を満たすヌクレオチド配列は、１個以上のヌクレオチドの欠失、挿入ま
たは置換によりもたらされるものである。

【００１７】本発明の他の態様において、ポリヌクレオチド(Ｂ)は、配列番号１の連続２０
塩基対部分と配列が同一の連続２０塩基対ヌクレオチド部分を含む。本発明の更
なる態様において、ポリヌクレオチド(Ｂ)は、配列番号１由来の、少なくとも２
０、例えば少なくとも５０、例えば、少なくとも１００、例えば少なくとも２０
０、連続塩基を有する部分を含む。本発明の更に別の態様において、ポリヌクレ
オチド(Ｂ)は、配列番号２由来の少なくとも１０、例えば少なくとも５０、例え
ば少なくとも１００、例えば少なくとも２００連続アミノ酸をコードするヌクレ
オチド配列を含む。

【００１８】ポリヌクレオチド(Ｂ)は、ＧＰＣＲのファミリーまたはサブファミリーのメン
バーの中で保存されているアミノ酸配列モチーフを使用して設計された縮重プラ
イマーを使用したＰＣＲにより、最初にそのフラグメントを単離することにより
単離し得る。縮重プライマーは、ヒト細胞、特に白血球からまたは特に貪食細胞
、例えば好中性および好酸性顆粒球からまたはゲノムＤＮＡから単離されたＲＮ
Ａから調製したｃＤＮＡ由来のフラグメントの増幅に使用できる。単離フラグメ
ントを次いで配列決定し、完全長クローンを、最初に、その配列およびヒト細胞
、特に白血球からまたは特に貪食細胞、例えば好中性および好酸性顆粒球からま
たはゲノムＤＮＡから単離したＲＮＡを使用して設計した遺伝子特異的プライマ
ーを使用した５'および３' ＲＡＣＥ(ｃＤＮＡ末端急速増幅)を使用した、５'
および３''末端を含む重複フラグメントの単離、続いて標準法によるこれらのフ
ラグメントの接続により得る。

【００１９】ポリヌクレオチド(Ｂ)は、最初、ＧＰＣＲのファミリーまたはサブファミリー
のメンバーの中で保存されているアミノ酸配列モチーフを使用して設計した、縮
重プライマーを使用したＰＣＲにより、そのフラグメントの単離により単離する
。縮重プライマーは、ヒト細胞、特に白血球からまたは特に貪食細胞、例えば好
中性および好酸性顆粒球からまたはゲノムＤＮＡから単離したＲＮＡから調製し
た、ｃＤＮＡからのフラグメントの増幅に使用できる。単離フラグメントを次い
で配列決定し、完全長クローンを、このフラグメントまたはその一部を、ヒトｃ
ＤＮＡライブラリー、好ましくは白血球または、特に、顆粒球ｃＤＮＡライブラ
リーまたはヒトゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブ
として使用することにより得る。

【００２０】例えば配列番号１の配列を有する、ポリヌクレオチド(Ｂ)は、既知の方法およ
び装置を使用した化学合成、例えば、自動固相合成によるものを含む、ヌクエオ
チドから調製し得る。

【００２１】ポリペプチド(Ａ)は、前記のポリヌクレオチド配列を、転写のためのプロモー
ターおよび他の適当な調節要素を含む発現ベクターにクローニングし、細菌、植
物、昆虫、酵母、動物またはヒト細胞に導入させ、組換え発現ベクターを含む宿
主細胞を、適当な条件下で場陽することにより製造し得る。このようなポリペプ
チドの組換え発現のための技術は既知であり、例えば、J.Sambrook et al, Mole
cular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Press, 1990に記載され
ている。

【００２２】本発明の他の関心は、配列番号２の連続１０アミノ酸部分と配列が同一の連続
１０アミノ酸部分を含む。更なる態様において、ポリペプチド(Ａ)は、配列番号
２からの少なくとも１０、例えば少なくとも５０、例えば少なくとも１００、例
えば少なくとも２００、連続アミノ酸を含む。

【００２３】ポリペプチド(Ａ)は、１個以上の異種ポリペプチドとの組換え融合タンパク質
として発現し得る。例えば、それは、本発明のポリヌクレオチド配列と異種ポリ
ペプチド配列の間に位置する開裂部位を含む、ポリヒスチジンのような異種ポリ
ペプチドとの組換え融合タンパク質として発現し得、配列番号２のアミノ酸配列
を含むポリペプチドを、既知の技術を使用して異種部分から開裂および精製し得
るようにする。ポリペプチド(Ａ)はまた、既知の化学法、例えば、自動固相技術
を使用することを含む、アミノ酸から、全体または一部合成し得る。ポリペプチ
ド(Ａ)は既知の標準法により精製し得る。

【００２４】抗体(Ｃ)は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。このよう
な抗体は慣用法を使用して製造し得る。精製抗原に対するポリクローナル抗体を
製造する方法は、確立されている(Cooper and Paterson in Current Protocols
in Molecular Biology, Ausubel et al. Eds., John Wiley and Sons Inc., Cha
pter参照)。典型的に、ウサギ、またはマウスのような宿主動物を、本発明の精
製ポリペプチドまたはその免疫原性部分を抗原として免疫化し、適当な時間の後
に、宿主血清を集め、ポリペプチドに対して特異的な抗体に関して試験する。精
製抗原に対するモノクローナル抗体の製造法は確立されている(Chapter 11, Cur
rent Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. Eds., John Wiley and
Sons Inc.参照)。ポリクローナル抗体の製造のために、血清を飽和硫酸アンモ
ニウムまたはDEAE Sephadexで処理できる。モノクローナル抗体の製造のために
、免疫化動物の脾臓またはリンパ球を除去し、不死化するか、既知の方法により
ハイブリドーマを製造するのに使用する。不死化細胞により分泌された抗体は、
例えば、ウェスタン・ブロット分析を使用して、望ましい特異性の抗体を分泌す
るクローンを決定するためにスクリーニングする。ヒト化抗体は、慣用法で製造
できる。

【００２５】アンチセンスオリゴヌクレオチド(Ｄ)はＤＮＡ、ＤＮＡのホスホロチオエート
またはメチルホスホネートアナログのようなＤＮＡのアナログ、ＲＮＡ、ＲＮＡ
のアナログ、またはペプチド核酸(ＰＮＡ)であり得る。アンチセンスオリゴヌク
レオチドは慣用法で、例えば自動枯燥法を使用して合成できる。

【００２６】ポリヌクレオチドプローブ(Ｅ)は、前記のポリヌクレオチド(Ｂ)またはそれの
相補体の少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む。プローブは、ｃＤＮＡ、ゲノ
ムＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。通常、これは１５から５０ヌクレオチドを含
むオリゴヌクレオチドであり、これは、例えば、フルオロフォアで標識でき、検
出可能シグナルを提供する。ポリヌクレオチドプローブは、ストリンジェントな
条件下で、配列番号１の配列を有するポリヌクレオチドフラグメントｗ有スルポ
リヌクレオチドフラグメントと選択的にハイブリダイズできる。プローブは、こ
のようなハイブリダイゼーション条件下で、その同族配列にのみハイブリダイズ
する配列を有する。上記のＤＮＡプローブは、ノーザンおよびサザン・ブロット
分析、ドット・ブロットおよびスロット・ブロット分析、および蛍光イン・シテ
ュ・ハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)を含む多くのスクリーニング提要に有用
である。

【００２７】本発明はまた、前記のポリヌクレオチド(Ｂ)、すなわちＥＸ３３のフラグメン
トのＤＮＡ増幅のためのプライマーとして有用なオリゴヌクレオチドの対を含み
、ここで、該対の各プライマーは、少なくとも１５ヌクレオチド長であり、該対
は、ヒトゲノムＤＮＡまたは適当なヒトｃＤＮＡ標的とのポリメラーゼ連鎖反応
に使用した場合、ＥＸ３３の配列を全てまたは一部含むＤＮＡフラグメントの合
成をもたらす。プライマー対は、好ましくはＥＸ３３のコード領域またはその一
部の増幅ができる。このようなプライマー対の例は、以後、各々配列番号１１−
１２および配列番号１３−１４として示す。

【００２８】好中球関連炎症性疾患におけるポリペプチド(Ａ)の役割は、疾患のモデル、例
えば、ラットまたはマウスにおけるリポポリサッカライド誘導肺炎症モデル、ま
たはDurie et al., Clin. Immunol. Immunopathol. (1994) 73: 11-18; およびW
illiams et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 9784-9788に記載のモ
デルを使用して測定できる。

【００２９】前記のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオ
チドまたはプローブは、以後、集合的に本発明の薬剤と呼ぶが、好中球関連炎症
性疾患の処置(予防的または対症的)または診断に使用し得る。例えば、本発明の
ポリペプチド(Ａ)は、ポリペプチドを欠く、またはそうでなくても必要な哺乳類
、特にヒトの処置に使用し得る；ポリヌクレオチド(Ｂ)は、ＥＸ３３活性の増加
が必要な、例えば、対象が変異したＥＸ３３遺伝子を有するか、欠く、遺伝子治
療に使用し得る；または、例えば好中球関連炎症性疾患に関連するＥＸ３３の変
異形の検出のための診断的試薬として；アンチセンスオリゴヌクレオチド(Ｄ)は
、必要な場合のＥＸ３３活性を阻害し得る；抗体(Ｃ)は、ＥＸ３３ポリペプチド
の検出、または発現のレベルの測定に、またはＥＸ３３ポリペプチドのリガンド
／抗リガンド結合活性の阻害のために使用し得る；そしてプローブ(Ｅ)は、ＥＸ
３３遺伝子の存在または不存在の検出、すなわち、遺伝的異常性の検出に使用し
得る。(Ｂ)、(Ｃ)または(Ｅ)の診断的試薬としての使用は、好中球関連炎症性疾
患に特に関連するＥＸ３３の低い発現または過発現の検出を含み得る

【００３０】 “遺伝子治療”は、個体の幹細胞への遺伝的物質の導入に基づくヒト疾患の処
置の試みを意味する。遺伝子導入は、直接、インビボで、遺伝子担持ウイルスま
たは非ウイルスベクターの血液または組織への直接の投与、または間接的なエキ
ソビボでの遺伝的物質の研究室で操作した細胞への移入、続く遺伝子含有細胞の
個体へ戻す送達を介した投与により達成できる。細胞内の遺伝的物質を変えるこ
とにより、遺伝子治療は、罹患している病気異常生理学を直し得る。動物におけ
る特異的な組織および臓器系への遺伝子送達の適当なベクターおよび方法は、各
々Dracopoli, N.C. et al., Current Protocols in Human Genetics. John Wile
y and Sons Inc., Chapters 12 and 13に記載されている。前記のポリヌクレオ
チド(Ｂ)に関連して、遺伝子治療は、適当な制御エレメント下にＥＸ３３遺伝子
の発現カセットを含むウイルスまたは非ウイルス遺伝子治療ベクターの、疾患個
体の肺への送達を含み、それにより病気異常生理学が直り、または軽減される。

【００３１】したがって、本発明は、前記のポリペプチド(Ａ)、ポリヌクレオチド(Ｂ)、抗体(Ｃ)またはアンチセンス
オリゴヌクレオチド(Ｄ)を、薬学的に許容される担体と共に含む、好中球関連炎
症性疾患の処置用医薬組成物；

【００３２】必要とする対象に有効量の前記のポリペプチド(Ａ)、ポリヌクレオチド(Ｂ)、抗
体(Ｃ)、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド(Ｄ)を投与することを含む、好
中球関連炎症性疾患の処置法；

【００３３】対象由来の遺伝サンプルを、前記のポリヌクレオチドプローブ(Ｅ)と、プロ−グ
プローブが相補的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする条件下でインキュ
ベートし、第１反応産物を産生し、第１反応産物を、正常遺伝サンプルで得たコ
ントロール反応産物と比較することを含み、第１反応産物とコントロール反応産
物の差異が好中球関連炎症性疾患を発症する素因を示すものである、対象におけ
る好中球関連炎症性疾患を発症する素因を検出する方法；

【００３４】細胞または組織由来のＤＮＡを、前記のポリヌクレオチドプローブと、プローブ
がポリヌクレオチド(Ｂ)と特異的にハイブリダイズする条件下で接触させ、ハイ
ブリダイゼーションが起こるか否かを検出することを含む、対象由来の細胞また
は組織における前記の、例えば、配列番号１を含むポリヌクレオチド(Ｂ)の存在
を検出することを含む、対象における好中球関連炎症性疾患を診断する方法；

【００３５】患者から単離したＤＮＡ中の標的ヌクレオチド配列を、増幅する配列を穂兪的と
する前記のプライマーの対を使用したポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、増幅
配列を、多形性が存在するか否かの測定のために分析することを含む、患者にお
けるポリヌクレオチド(Ｂ)のヌクレオチド配列における異常を検出する方法；

【００３６】対象由来の細胞または組織における前記のポリペプチド(Ａ)または前記のポリヌ
クレオチド(Ｂ)のレベルを測定する、(Ａ)の生物活性を測定する、または(Ｂ)の
多形性のような変異の存在を測定する、そして結果を健康な対象から得られたも
のと比較することを含む、対象が好中球関連炎症性疾患を発症しているか、また
は発症の恐れがあるかを測定する方法を提供する。

【００３７】 “多形性”なる用語は、前記の本発明のポリヌクレオチドの配列と比較した任
意の配列の差異を意味する。

【００３８】ポリヌクレオチドプローブ(Ｅ)と相補的ポリヌクレオチド配列のハイブリダイ
ゼーションは、インシテュ(例えばＦＩＳＨ)ハイブリダイゼーション、ノーザン
またはサザン・ブロット分析、ドット・ブロットまたはスロット・ブロット分析
を使用して検出し得る。異常性は、また、例えば、実施例に後記のような、配列
感受性ゲル電気泳動(ＣＳＧＥ)およびＤＮＡ配列決定により検出し得る。遺伝低
異常性は、個体のＥＸ３３タンパク質の、正常ＥＸ３３タンパク質のアミノ鎖配
列と比較したアミノ酸配列における変化、あるいはタンパク質の欠失をもたらし
得る。あるいは、変化はアミノ酸配列を変えないが、代わりに、遺伝子の５'−
または３'−末端のいずれかでの制御要素の配列を変えることにより、または遺
伝子のイントロン配列領域内の制御要素の配列を変えることにより、ＥＸ３３遺
伝子の発現を変え得る。変化はまた転写が処理されるまたは翻訳される方法に影
響し得る。本発明はまた個体のＥＸ３３遺伝子のポリヌクレオチド配列における
異常性を検出するためのキットを含む。このような検出のためのハイブリダイゼ
ーションキットは、検出可能、例えば、化学ルミネッセンスまたは蛍光、標識を
その中に包含させることにより修飾し得る、前記のプローブ(Ｅ)を含み、標識試
薬、すなわち、放射活性同位体、化学ルミネッセンスまたは蛍光基をハイブリダ
イズ産物に包含させる試薬のような他の試薬、および緩衝液を含み得る。ＰＣＲ
増幅キットは、上記のようなプライマー対を、ＴａｑポリメラーゼのようなＤＮ
Ａポリメラーゼと共に含み得、増幅緩衝液等のような付加的試薬を含み得る。Ｐ
ＣＲ増幅キットの具体的実施態様は、ＣＳＧＥおよびＤＮＡ配列決定を含む、ポ
リヌクレオチド変化を検出する多くの技術に特異的な付加的な試薬を含み得る。

【００３９】対象が、好中球関連炎症性疾患を発症しているか、発症の恐れがあるかを測定
する方法は、対象がＥＸ３３の異常ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルを
有するかを、例えば、ノーザン・ブロット分析、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応
(ＲＴ−ＰＣＲ)、イン・シテュハイブリダイゼーション、免疫沈降、ウェスタン
・ブロット・ハイブリダイゼーションまたは免疫組織化学によって、測定するこ
とを含み得る。該方法に従い、細胞を対象から得、ＥＸ３３ＲＮＡまたはタンパ
ク質レベルを測定し、健康な対象から得たＥＸ３３ｍＲＮＡまたはタンパク質の
レベルと比較することを含む。ＥＸ３３の異常レベルは、異常型ＥＸ３３活性の
指標であるようである。他の実施態様において、本方法は、ＥＸ３３の少なくと
も一つの活性を、例えば後記のような細胞内Ｃａ^２＋の測定により測定し、健康
な対象から得た結果と比較することを含む。

【００４０】好中球関連炎症性疾患の阻害または逆転における本発明の薬剤の効果は、疾患
のモデル、例えばラットまたはマウスにおけるリポポリサッカライド誘導肺炎症
モデル、または、Durie et al., Clin. Immunol. Immunopathol. (1994) 73: 11
-18; and Williams et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 9784-9788
に記載のモデルにおいて証明し得る。

【００４１】本発明の薬剤は、任意の適当な経路で、例えば錠剤またはカプセルの形で、例
えば経口；非経腸的、例えば静脈内；局所的、例えば軟膏またはクリームで；経
皮的、例えばパッチで；吸入により；または経鼻的に投与し得る。

【００４２】本発明の薬剤を含む医薬は、慣用の希釈剤または賦形剤、およびガレヌス技術
において既知の技術を使用して製造し得る。したがって、経口投与形は錠剤およ
びカプセルを含み、吸入用組成物はエアロゾルまたは他の噴霧可能製剤または乾
燥粉末製剤を含み得る。

【００４３】本発明は、(ｉ)吸入可能な形、例えば、エアロゾルまたは他の噴霧可能組成物
の、または吸入可能粒子、例えば、微細形の本発明の薬剤(Ａ)、(Ｂ)、(Ｃ)、(
Ｄ)、または(Ｅ)、(ii)吸入可能な形の本発明の薬剤を含む吸入用医薬；(iii)こ
のような吸入可能な形の本発明の薬剤を含む、吸入デバイスと関連させた医薬製
品；および(iv)吸入可能な形の本発明の薬を含む、吸入デバイスを含む。

【００４４】本発明の実行に用いる本発明の薬剤の投与量は、もちろん、例えば、処置する
特定の状態、所望の効果および投与の形態に依存する。一版に、吸入における投
与のための適当な一日投与量は、１μｇから１０mg／ｋｇの範囲であるが、経口
投与の適当な一日投与量は、０.１mgから１０００mg／ｋｇ。

【００４５】前記のポリペプチド(Ａ)は、その活性の促進剤(アゴニスト)または阻害剤(ア
ンタゴニスト)の同定に、すなわち、好中球関連炎症性疾患の処置に有用な化合
物の同定に使用できる。したがって、本発明はまた、候補物質とポリペプチド(
Ａ)を合わせ、候補物質の該活性における影響を測定することを含む、好中球関
連炎症性疾患の処置への使用に適した、ポリペプチド(Ａ)の活性を調節する物質
の同定法を提供する。ポリペプチド(Ａ)の活性は、例えば、細胞内Ｃａ^２＋また
はｃＡＭＰ(サイクリックＡＭＰ)レベルの測定により、または形の変化により、
または適当なレポーター遺伝子アッセイにより測定し得る。本発明はまた候補物
質とポリペプチド(Ａ)を合わせ、結合が起こるか否かを測定することを含む、ポ
リペプチド(Ａ)に結合する好中球関連炎症性疾患の処置への使用に適した物質の
同定法も含む。

【００４６】上記のスクリーニング法は、例えば、その表面にポリペプチド(Ａ)を発現する
細胞、例えば昆虫、哺乳類または酵母細胞を調製し、ついで、得られた細胞候補
物質とインキュベートして、ポリペプチド(Ａ)の機能的活性の促進または阻害を
、または候補物質へのポリペプチド(Ａ)の結合を測定することにより行ない得る
。

【００４７】本発明が適用できる好中球関連炎症性疾患は、好中球関連炎症性または閉塞性
気道疾患、特に慢性気管支炎および気腫を含む慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)、お
よび成人(または急性)呼吸窮迫症候群(ＡＲＤＳ)、関節リウマチおよびクーロン
病および潰瘍性大腸炎のような炎症性大腸疾患を含む。

【００４８】本発明を、以下の実施例により説明する。実施例で使用する略語は、以下の意
味を有する：ＢＬＡＳＴ：ベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツールＢＳＡ：ウシ血清アルブミンｃＡＭＰ：環状アデノシン一リン酸ＤＴＴ：ジチオスレイトールＥＤＴＡ：エチレン−ジアミン四酢酸ＥＩＡ：酵素面計アッセイＥＳＴ：発現配列タグＦＣＳ：ウシ胎児血清ＧＭ−ＣＳＦ：顆粒球マクロファージ刺激因子ＧＰＣＲ：Ｇ−プロテイン結合レセプターＨＥＰＥＳ：４−(２−ヒドロキシエチル)ピペラジン−１−エタンスルホン酸ＩＰＴＧ：イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシドＩＬ１：インターロイキン１ＭＯＩ：感染多重度ＰＢＳ：リン酸緩衝化食塩水ＰＥＧ：ポリエチレングリコールＰＢＭＣ：末梢血単核細胞ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応ＰＭＳＦ：フェニルメチルスルホニルフウロリドＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動ＴＮＦ：腫瘍壊死因子

【００４９】実施例１血液(２００ml)を、クエン酸ナトリウムを含む試験管に、滅菌条件下で呼吸器
疾患の病歴のない正常ドナーから集める。好中球を確立された方法で精製する。
ＰＢＭＣを、末梢血細胞から、Ficoll Hypaque(pharmacia)遠心により分離する
。主に顆粒球および赤血球である残りの細胞集団を、赤血球融解溶液で(１５５
ｍＭＮＨ_４Ｃｌ、１０ｍＭＫＨＣＯ_３、０.１ｍＭＥＤＴＡ、ＰＨ７.３
)で処理する。純度を測定するために、顆粒球をHansel染料(Difco laboratories
LTD)で染色し、高倍率の光顕微鏡で差別化した。好酸球の汚染は２％未満であ
ることが分かる。刺激のために、好中球を５００万細胞／mlの濃度で、ＲＰＭＩ
−１６４０＋１０％ＦＣＳに再懸濁する。細胞を、５時間、５０ng／mlヒト組換
えＧＭ−ＣＳＦ(R&D System)の存在下または非存在下で培養する。好中球の上皮
性シグナルを介した刺激のために、ヒト一次気管支上皮細胞(Clonetics)を、７
０−８０％コンフルエントまで増殖させ、ＴＮＦα(１００ng／ml)およびＩＬ−
１β(１００ng／ml)と同時に４８時間刺激した。ついで、新たに単離した好中球
を、上皮培養物に、または、コントロールとして、新鮮培地に直接添加する。５
時間のインキュベーション後、好中球を注意深く上皮単層から洗い出し、分析の
ために回収する。総ＲＮＡを、製造者の記載の通りＴＲＩＺＯＬ試薬(Gibco/BRL
)を使用して抽出する。１mlのＴＲＩＺＯＬを、各５００万個のペレット化好中
球の再懸濁に使用する。ｍＲＮＡを、ＭＥＳＳＡＧＥＭＡＫＥＲｍＲＮＡ単離
キット(Gibco/BRL)を使用して、製造者が推奨する条件を使用して精製する。３
００ngのｍＲＮＡを、Superscript Choice System(Gibco/BRL)を使用したｃＤＮ
Ａの合成に使用する。一本鎖および二本鎖ｃＤＮＡを、製造者により提供された
条件を使用して作る。

【００５０】得られたｃＤＮＡサンプルを、ＧＰＣＲ遺伝子フラグメントの増幅の鋳型とし
て使用する。

【００５１】実施例２本実施例は、ＥＸ３３ｃＤＮＡクローンの単離を記載する。縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲを、プライマー(配列番号３−６)およびコプラ
イマー、およびPowers et al., J. Exp. Med. (1997) 186:825-835により記載の
条件を使用して行なう。実施例１で得た１００ngの一本鎖ｃＤＮＡを、１００μ
ｌ反応混合物のシードに使用し、４０サイクルのＰＣＲ(９５℃で１分、３７℃
で１分、および７２℃で１分)に、３μＭの各縮重オリゴヌクレオチドプライマ
ー：前向きプライマー：１：１混合物のＧＡＹＭＧＩＴＡＹＹＴＩＧＣＩ
ＡＴＨＧＴＩＣＡおよびＧＡＹＭＧＩＴＡＹＹＴＩＧＣＩＡＴＨＧＴＣＣＡ後向きプライマー：１：１混合物のＲＭＲＴＡＩＡＤＩＡＩＩＧＧＲ
ＴＴＩＡＩＲＣＡおよびＲＭＲＴＡＩＡＤＩＡＩＩＧＧＲＴＴＩＡＣＲＣＡを使用して、Perkin-Elmer DNAサーマル・サイクラー(Gene Amp PCR System 240
0)中で付す。ＰＣＲ反応産物を、０.５μｇ／ml臭化エチジウム含有１％アガロ
ースゲル上で可視化する。約１０ngの増幅産物を、２５ng ｐＣＲ２.１ベクタ
ー(TA Cloning Kit, Invitrogen)とライゲートし、ライゲーションを５０μｌ
One Shot(登録商標)コンピテント細胞(Invitrogen)中に挿入する。ライブラリー
を、５０μｇ／mlカルベニシリンならびに１００ｍＭＩＰＴＧおよび５０μｇ
／ml Ｘ−Ｇａｌを含む寒天プレートにプレーティングする。プレートを、３７
℃で一晩、ついで短く４℃でインキュベートし、青色／白色染色が明らかに識別
できるようにする。白色コロニーを、５０μｇ／mlカルベニシリンを含む２００
μｌのＬＢ−ブロスに精選し、一晩インキュベートする。クローンからの挿入物
を、培養物から、ｐＣＲ２.１ベクターのＴ７およびＳｐ６部位に対応するプラ
イマーを使用して増幅し、１.５％アガロースゲルで電気泳動する。予測したサ
イズ(５００−５５０ｂｐ)の増幅挿入物を、そのヌクレオチド配列を、自動ＡＢ
Ｉ３１０シークエンサー(Perkin-Elmer)で、Ｍ１３後向きおよび前向きプライマ
ーを使用して決定することにより分析する。得られた配列を、配列類似性探索に
おいて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して分析し、配列アラインメントをＧＣ
Ｇソフトウェアパッケージ(Wisconsin Package Version 9.1)を使用して行なう
。ＥＸ３３と呼ばれるクローンを、ＧＰＣＲ遺伝子由来の挿入物を含むとして同
定する。完全長ＥＸ３３遺伝子を次いでＲＡＣＥ(ｃＤＮＡ末端の急速増幅)によ
り単離する。ＥＸ３３遺伝子の５'および３'末端を、末梢血白血球から単離した
ｃＤＮＡを使用して得、遺伝子−特異的プライマーを、ＥＸ３３クローン中の挿
入物の配列を使用して設計する。プライマー配列は、配列番号７および８に示す
。ＲＡＣＥは、Life Technologiesの５'ＲＡＣＥシステムキットおよび３'ＲＡ
ＣＥシステムキットを、製造者の指示の通り使用して行う。増幅産物を、両方の
鎖におけるそのヌクレオチド配列を、ＡＢＩ３１０シークエンサー(Perkin-Elme
r)上で、Ｍ１３後向きおよび前向きプライマーならびに遺伝子特異的プライマー
を使用して分析する。得られた配列を分析し、配列連続(contig)を、ＧＣＧソフ
トウェアパッケージ(Wisconsin Package Version 9.1)を使用して得る。得られ
たｃＤＮＡ配列連続を配列番号１に示す。

【００５２】実施例３本実施例は、種々の組織および細胞タイプにおけるＥＸ３３遺伝子の細胞性発
現の分布のノーザン・ブロット分析およびＲＴ−ＰＣＲによる分析を記載する。

【００５３】ノーザン・ブロット分析に関して、種々の組織から単離した２０ｕｇの総ＲＮ
Ａを、１％変性ホルムアルデヒドアガロースゲルで４時間電気泳動することによ
り分離する。ＲＮＡをHybond N膜(Amersham)に、キャピラリートランスファーに
より移し、フィルターにＵＶ架橋させる。あるいは、予め作られた複数の組織の
ノーザン・ブロット(Clontech)を使用する。プローブを作成するために、ＥＸ３
３含有プラスミド(実施例４)を、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化させ、サブク
ローンの１.２kbp挿入物を、１％低融点アガロースゲルから単離する。プローブ
を、［α−^３２Ｐ］ｄＡＴＰ(Amersham)の存在下の２５ng ＤＮＡの無作為プラ
イミングにより標識する。ハイブリダイゼーションを、一晩、ExpressHybハイブ
リダイゼーション溶液(Clontech)中で、６５℃で行なう。次いで、ブロットを２
×ＳＳＣ、０.０５％ＳＤＳで２０分室温で洗浄し、次いで、２０分、０.１×Ｓ
ＳＣ、０.１％ＳＤＳで５０℃で洗浄する。フィルターをホスホロイメージャー
プレートに２時間から５日間の間曝し、STORM 840 PhosphorImager(Molecular D
ynamics)で可視化する。同じノーザンブロットをまたＧＡＰＤＨプローブとハイ
ブリダイズし、充填のためにコントロールする。ＥＸ３３は、組織限定パターン
で発現され、例えば、骨髄、肺および末梢血では豊富であるが、例えば、脳、腎
臓または肝臓ではない。

【００５４】ヒト末梢血白血球の中のＥＸ３３発現を測定するために、種々の白血球を、血
液から標準法により分離する。例えば、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を顆粒球およ
び赤血球から、Ficoll Hypaque(Pharmacia)遠心により、実施例１に記載のよう
に分離し、ＴおよびＢ細胞を、ＰＢＭＣからＭＡＣＳ(時期補助細胞ソーター、M
iltenyi Biotec)により単離する。ＲＮＡを、実施例１に記載のように種々の血
液細胞タイプから単離する。ＲＴ−ＰＣＲ分析を行ない、白血球の中のＥＸ３３
の発現を測定する。ＥＸ３３は優勢的に白血球の中で発現され、好中球および好
酸球のような顆粒球で強く発現されるが、ＴまたはＢリンパ球ではない。

【００５５】実施例４本実施例は、肺におけるＥＸ３３遺伝子の細胞性分布の、イン・シテュハイブ
リダイゼーションおよび免疫組織化学による分析を記載する。

【００５６】標識リボプローブを生成するために、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯプラスミド(Invitro
gen)のＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位の間に１.２kbp挿入物を含むサブクローン
を構築する。このサブクローンの挿入物は、下記実施例５の挿入物と同一であり
、同じ方法で製造される。この構築物中に、ベクター中のＴ３プロモーターを使
用して、イン・シテュハイブリダイゼーション実験におけるプローブとして使用
できる挿入物のアンチセンス鎖を転写する。ベクター中のＴ７プロモーターは、
ネガティブコントロールとして使用するセンス鎖を転写するのに使用する。パラ
フィン包埋および凍結ハイ組織サンプルからの連続組織切片を、１.２ｋｂ挿入
物から合成した放射標識ｃＲＮＡプローブとハイブリダイズする。リボプローブ
を、^３３Ｐ−ウリジン５'−トリホスフェートと、Ｔ３(アンチセンス)およびＴ
７(センス)ＲＮＡポリメラーゼの存在下、インビトロで転写する。プローブを次
いでカラム精製し、次いで５％ＴＢＥ−尿素アクリルアミドゲルでの電気泳動に
浮子、サイズおよび純度を確認する。組織切片をプロテイナーゼＫで消化し、プ
ローブと約８.０×１０^８dpm／mlで、６５℃で１８時間ハイブリダイズする。ス
ライドをＲＮＡｓｅＡで処理し、徹底的に(stringently)２時間、０.１×ＳＳ
Ｃ中で６５℃で洗浄する。スライドを、次いでKodak NTB-2エマルジョンで被覆
し、７日間、４℃で曝し、Kodak D-19現像液および定着液を使用して現像する。
スライドをヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、Nikonマイクロスコープに
接続したSony Digital Photo Cameraを使用して写す。アンチセンスプローブと
のハイブリダイゼーションに加えて、別のセクションをコントロールプローブの
二つのタイプとハイブリダイズする。全ての組織を、最初に、ベータ−アクチン
ｍＲＮＡに対するプローブとスクリーニングし、ＲＮＡがサンプル内に保存され
ていることを確認する。隣接連続セクションはまたアンチセンスプローブとして
の遺伝子の同じ領域由来のセンスコントロールリボプローブとハイブリダイズを
する。

【００５７】像を評価し、ＥＸ３３遺伝が肺胞マクロファージおよび好中球に優勢に発現さ
れることが判明する。ＥＸ３３タンパク質の発現を、次いで、免疫組織化学により標準法を使用して
試験する。実験を、上記のイン・シテュハイブリダイゼーションに関するものと
類似の組織切片で、実施例７に記載のように生成したポリクローナル抗体を使用
して行なう。タンパク質発現を、好中球およびマクロファージで検出し、イン・
シテュハイブリダイゼーション実験の結果を確認する。

【００５８】実施例５本実施例は、哺乳類発現系における、完全長機能的ＥＸ３３の、安定なトラン
スフェクションを使用した発現およびＥＸ３３タンパク質の天然リガンドまたは
人工アゴニストの同定のためのトランスフェクト細胞の使用に関する。

【００５９】発現ベクターの構築独特なＥｃｏＲＩを、ＥＸ３３開始コドン(ＡＴＧ)の５'に、ＰＣＲ増幅によ
り以下のプライマー：５'−ＣＴＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＴＧＴＧＧＡＡＣＡＧＣＴＣＴＧＡＣＧＣ
−３' を使用して挿入する。他のプライマーを使用して、ＥＸ３３の停止コドン(ＴＡ
Ｇ、逆相補：ＣＴＡ)に対して３'の独特なＸｂａＩ(ＴＣＴＡＧＡ)部位に挿入す
る。５'−ＴＧＧＴＧＴＣＴＡＧＡＧＴＣＡＣＡＧＴＴＣＴＡＡＴＧＧＡＧＣＣ−３'
組換増幅産物を、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限酵素で消化させ、１２１３ｂｐ
フラグメントとしてＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ消化ｐｃＤＮＡ３.１(＋)(Invitrogen
)哺乳類発現ベクターにライゲートし、E. coli DH5α細胞に形質転換する。形質
転換体を、ｐｃＤＮＡ３.１(＋)に存在するアンピシリン耐性遺伝子の存在を使
用して選択し、ＥＸ３３挿入物を含むベクターを、無作為に選択したコロニーか
らプラスミドを単離し、プラスミドを制限消化およびアガロースゲル電気泳動に
より、標準法を使用して同定する。

【００６０】哺乳類細胞中のＥＸ３３の安定な発現プラスミドベクター含有組換えＥＸ３３挿入物を、次いで、ＣＨＯ−Ｋ１細胞
にトランスフェクトする。１０％ＦＣＳおよび２ｍＭグルタミン含有ダルベッコ
修飾イーグル培地／Ham's f12(５０：５０)で増殖させたＣＨＯ細胞のコンフル
エントなフラスコをトリプシン処理し、１：２０希釈で、６ウェルプレートの２
ウェルに２ml／ウェルの同じ培地中でプレーティングする。細胞を次いで２４時
間、３７℃で５％ＣＯ_２で培養する。翌日、トランスフェクション混合物を調製
する。１μｇプラスミドＤＮＡを、各ウェルに関して１００μｌＯｐｔｉＭＥ
Ｍ無血清培地(Life Technologies)に混合する。各ウェルで１０μｌリポフェク
タミンを１００μｌＯｐｔｉＭＥＭ中に、別の試験管で希釈する。２つの溶液
を混合し、１５分、室温でインキュベートする。インキュベーション中、細胞を
ＯｐｔｉＭＥＭで洗浄しで血清を除去する。０.８ml／トランスフェクションの
無血清ＯｐｔｉＭＥＭを、ＤＮＡ−リポソームトランスフェクション混合物に添
加し、１mlのその溶液を次いで各ウェルに添加する。コントロール細胞を同様の
方法で、但しプラスミドＤＮＡをトランスフェクション混合物から除いて処理す
る。細胞を次いで、５時間、３７℃で５％ＣＯ_２でインキュベートし、次いでト
ランスフェクション混合物を２ml通常増殖培地と置きかえる。２４時間後、トラ
ンスフェクタントを、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、それらをＴ７
５フラスコに１mg／ml Ｇ４１８(Life Technologies)と共に再プレーティング
することにより選択する。細胞を次いで３７℃で５％ＣＯ_２で、コントロールフ
ラスコの細胞が死ぬまで培地を２日毎に定期的に変えてインキュベートする。次
いで、細胞を、９６ウェルプレートの個々のウェルにそれらを１細胞／ウェルの
密度にプレーティングし、それらをコンフルエンスまで増殖させることにより希
釈クローン化する。細胞の更なる拡張後、個々のコロニーを、ＲＴ−ＰＣＲによ
りおよびＥＸ３３タンパク質に対して発生させたポリ−またはモノクローナル小
唄を使用してＥＸ３３の発現に関してスクリーニングする。

【００６１】天然リガンドおよびアゴニストの細胞内カルシウムアッセイを使用した同定ＥＸ３３レセプタータンパク質を安定に発現する細胞系および非トランスフェ
クトコントロールを、Ｔ１６２フラスコでコンフルエントまで増殖させ、トリプ
シン処理し、適当な容量、約５０mlの抗生物質を含まない増殖培地に再懸濁する
。細胞を３０,０００細胞／ウェルで、１００μｌ／ウェルで９６−ウェルプレ
ートに蒔き、これは翌日のアッセイ時にコンフルエント単層の形成をさせる。２
４時間後、細胞を、２０ｍＭＨＥＰＥＳおよび２.５ｍＭプロベネシッド含有
１００ml細胞培地中の細胞質性カルシウムインディケーターFluo-3-AM(４ｍＭ)
と３７℃で６０時間インキュベートする。細胞を４回、２０ｍｍＨＥＰＥＳお
よび２.５ｍＭプロベネシッド含有ＰＢＳで洗浄し、１００mlのその溶液を次い
で各ウェルに添加する。天然リガンドおよび合成ライブラリー由来オンコレクシ
ョンからの試験化合物を、細胞に添加し、フルオレッセントシグナルを最初の６
０秒間は毎秒、次の３０秒間は５秒毎に読む。天然または合成アゴニストは、Ｅ
Ｘ３３発現およびコントロール細胞における同じ化合物により生成されるシグナ
ルのレベルの比較により同定する。

【００６２】実施例６本実施例は、ＡＴＧ開始コドン後に６ヒスチジンタグを有する完全長ＥＸ３３
の、Spodoptera frugiperda Sf9細胞中のバキュロウイルス系を使用した発現、
および得られたポリペプチドの生成に関する。

【００６３】組換えＥＸ３３バキュロウイルスの構築独特なＥｃｏＲＩ部位を、ＥＸ３３開始コドン(ＡＴＧ)の５'に、ＰＣＲ増幅
により、以下のプライマー：５'−ＣＴＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＴＧＴＧＧＡＡＣＡＧＣＴＣＴＧＡＣＧＣ
−３' を使用して挿入する。他のプライマーを使用して、ＥＸ３３の停止コドン(ＴＡ
Ｇ、逆相補：ＣＴＡ)に対して３'の独特なＸｂａＩ(ＴＣＴＡＧＡ)部位に挿入す
る。５'−ＴＧＧＴＧＴＣＴＡＧＡＧＴＣＡＣＡＧＴＴＣＴＡＡＴＧＧＡＧＣＣ−３'
組換え増幅産物を、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限酵素で消化させ、１２１３ｂ
ｐフラグメントとしてＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ消化pFastbac(登録商標)HTaバキュ
ロウイルストランスファーベクター(Life Technologies)にらーゲートする。こ
の構築物において、ＥＸ３３遺伝子は、ＥＸ３３コード領域が６×Ｈｉｓ親和性
タグ、続くＴＥＶプロテアーゼの認識部位および更なる７アミノ酸リンカー領域
の後に置かれるため、融合タンパク質として発現される。６×Ｈｉｓタグを含む
ＥＸ３３融合タンパク質は、親和性生成を助け、ＴＥＶプロテアーゼ開裂部位は
、６×Ｈｉｓタグの除去に使用する。組換えＥＸ３３配列をＤＨ１０Ｂａｃ細胞
(Life Technologies；Bac to Bacバキュロウイルス発現系)により担持されるBac
mid DNAに転位させる。ＥＸ３３組換えＢａｃｍｉｄｓをＤＨ１０Ｂａｃ細胞か
ら単離し、転位をＰＣＲ分析により確認する。

【００６４】Ｓｆ９細胞の組換えＥＸ３３ Bacmid DNAでのトランスフェクションおよび組換えバキュロウイルスストックの増幅組換えＥＸ３３ Bacmid DNAを、Ｓｆ９細胞に公開されたプロトコールを使用
してトランスフェクトする(Bac to Bacバキュロウイルス発現系マニュアル；Lif
e Technologies)。組換えバキュロウイルスを培養培地から２７℃で３日後に培
養培地から回収する。細胞上清を、５分、５００×ｇの遠心により浄化し、４℃
で保つ。組換えバキュロウイルスを、Ｓｆ９細胞(SF900 SFMII培地；Life Techn
ologies)を、１×１０^６細胞／mlの密度および感染多重度(ＭＯＩ)が０.０１で
４８時間、感染させることにより増幅した。Ｓｆ９細胞を次いで１０００×ｇで
５分間、遠心する。高力価ウイルスを含む上清を４℃で貯蔵する。

【００６５】組換えＥＸ３３のＳｆ９細胞中での発現２×１０^５および３×１０^６細胞／mlの間の密度で、ＳＦ９００ＳＦＭＩＩ
培地；Life Technologies)中に、シェーカーフラスコ(９０ＲＰＭで回転)または
スピナーフラスコ(７５ＲＰＭで回転)のいずれかで維持しているＳｆ９細胞を、
増幅組換えバキュロウイルスで、１.５×１０^６の細胞密度でＭＯＩが２.０で６
０時間感染させた。続いて、感染Ｓｆ９細胞を１０００×ｇで５分遠心し、上清
を注ぎ出し、細胞ペレットを−８０℃で凍結させる。

【００６６】粗融解物調製細胞(１×１０^９)を、１００ml融解緩衝液(２０ｍＭＨｅｐｅｓｐＨ７.
９、１００ｍＭＮａＣｌ、５％グリセロール、２ｍＭＥ−メルカプトエタノ
ール、０.５ｍＭイミダゾール、０.１％Nonidet P-40、４０ｐｇ／ml ＡＥＢ
ＳＦ、０.５ｐｇ／ml ロイペプチン、１ｐｇ／ml アプロチニンおよび０.７ｐ
ｇ／ml ペプスタチンＡ)に再懸濁する。細胞を、氷上で１５分インキュベート
し、次いで３９,０００×ｇで３０分、４℃で遠心する。

【００６７】金属キレート親和性クロマトグラフィー金属キレート親和性クロマトグラフィーを、室温で、ＢｉｏＣＡＤクロマトグ
ラフィーワークステーションに接続したカラムで行なう。２０ml Ｐｏｒｏｓ
ＭＣ／Ｍ(１６ｍｍＤ×１００ｍｍＬ)カラムをＮｉ^２＋で、使用前および各注入
後に満たす。Ｎｉ^２＋で満たすために、カラムを１０カラム容量(ＣＶ)の５０ｍ
ＭＥＤＴＡｐＨ８、１ＭＮａＣｌ、続いて１０ＣＶ水で洗浄する。カラ
ムを、５００ml ０.１ＭＮｉＳＯ_４ｐＨ４.５−５で満たし、１０ＣＶ水
で洗浄し、次いで任意の非結合Ｎｉ^２＋を、５ＣＶ０.３ＭＮａＣｌでの洗
浄により除去する。全ての段階を２０ml／分の流速で行なう。満たしたＭＣ／Ｍ
カラムを、５ＣＶ緩衝液Ｂ(２０ｍＭＨｅｐｅｓｐＨ７.９、１００ｍＭ
ＮａＣｌ、５％グリセロール、２ｍＭＥ−メルカプトエタノール、１ｍＭＰ
ＭＳＦ、１００ｍＭイミダゾール)で平行化し、部位を飽和させ、続いて１０
ＣＶ緩衝液Ａ(０.５ｍＭイミダゾール以外、緩衝液Ｂと同じ)で満たす。ラン
当たり９０−９５mlの粗融解物を、２０ml／分の流速で、カラムに充填する。続
く段階を、３０ml／分の流速で行なう。任意の非結合物質を１２ＣＶ緩衝液Ａで
の洗浄により除去し、ＥＸ３３は０−５０％緩衝液Ｂの１０ＣＶにわたる勾配で
溶出する。フラクション(８ml)を勾配にわたり集める。ＥＸ３３含有フラクショ
ンを合わせ、プロテアーゼ阻害剤を、上記融解緩衝液に関して記載の最終濃度ま
で添加する。ＤＴＴも最終濃度１ｍＭまで添加する。合わせたフラクションを、
一晩、４リットルの２０ｍＭＨｅｐｅｓｐＨ７.９、１ｍＭＤＴＴ、０.
２ｍＭＰＭＳＦに対して４℃で透析する。タンパク質濃度を測定し、必要な場
合、サンプルをMillipore Ultrafree-15遠心デバイス(ＭＷカットオフ５０ｋＤ
ａ)で４℃で濃縮する。デバイスは、使用前に水で濯ぐ。−８０℃で長期貯蔵に
使用する緩衝液は、２０ｍＭＨｅｐｅｓｐＨ７.９、１ｍＭＤＴＴ、〜
１００ｍＭＮａＣｌ、５％グリセロールである。グリセロールを４℃での貯蔵
のためにサンプルから除くことができる。

【００６８】実施例７本実施例は、ＥＸ３３タンパク質に対するポリクローナル抗体の生成に関する

【００６９】免疫化ウサギを、皮下部位４箇所を、５００μｇ生成ＥＸ３３タンパク質で以下のス
ケジュールにしたがって免疫化する：

【表１】

【００７０】試験採血(５００μｌ)を取り、血清を抗体力価に関して評価する。血清を、最
大力価が得られたときに回収する。これは、血液を取り(１０ml)、それを２時間
、４℃で凝血させることにより行なう。血液を１０００×ｇで５分遠心し、血清
を分離する。血清を除去し、アッセイまで−２０℃で貯蔵する。

【００７１】ＥＬＩＳＡスクリーニング Nunc-Immuno Plate Maxisorp ９６ウェルプレート(Nunc, Basle, CH)を固体
し自体として使用し、精製ＥＸ３３タンパク質(１００ng／ウェル)で４℃でコー
とする。プレートを３時間、３７℃で２％ＢＳＡ(Sigma)および０.０２％ＮａＮ _３ (Sigma)含有ＰＢＳで遮断する。遮断後、プレートを一晩室温で、異なる希釈
のＰＢＳと共にインキュベートする。ポリクローナル高体温存在を、ウサギに対
するビオチン標識ＩｇＧ−抗体(ヤギ抗−ＩｇＧ抗血清、１：２５０００希釈)で
、４０分のインキュベーション時間でチェックする。アルカリホスファターゼ接
合ストレプトアビジン(Immununo Research, Dianova, CH)を、次いで１：１００
００の希釈で添加する。反応の展開を、ジエタノールアミンに溶解したホスフェ
ート基質(Sigma、f.c. １mg／mlの添加により行なう。４５分後、４０５ｎｍの
吸光度を４９０ｎｍを参照して、ＥＬＩＳＡプレートリーダー(Biorad)で読む。

【００７２】ポリクローナル抗体の精製５mlタンパク質Ａ−アガロースを、クロマトグラフィーカラムに注ぎ、６カラ
ム容量の０.１Ｍトリス(ヒドロキシメチル)メチルアミン(Tris)緩衝液ｐＨ７.
５で洗浄する。抗−ＥＸ３３抗体を含むウサギ血清を、Tris緩衝液で希釈(１／
２)し、タンパク質Ａ−アガロースを添加する。非結合タンパク質を、６容量のT
ris緩衝液でカラムを洗浄することにより除去する。ＩｇＧは、３カラム容量の
０.１Ｍグリシン緩衝液ｐＨ３.０でカラムから溶出し、１mlフラクションと
して２８μｌの１Ｍ Trisを含む試験管に回収する。タンパク質含有に関して陽
性のフラクションを、純度に関してＳＤＳ−ＰＡＧＥで、還元条件下チェックす
る。免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖に対応する５０および２５Ｋｄの二つ
のバンドを可視化する。免疫グロブリンのみを含むフラクションをプールし、タ
ンパク質濃度に関して再チェックし、−２０℃で貯蔵する。

【００７３】実施例８この実施例は、ＥＸ３３タンパク質に対するモノクローナル抗体の生成に関す
る

【００７４】免疫化雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、腹腔内(ｉｐ)で１００μｇのＥＸ３３タンパク質で
下記のスケジュールにしたがって免疫化する：

【表２】

【００７５】血清を、抗体力価に関して、動物を融合のための脾臓細胞の調製のために殺し
た後にＥＬＩＳＡ(実施例７)で評価する。抗体力価が不充分な場合、(１／１０
００から１／１００,０００)、ハイブリドーマをスクリーンするか、そうでなけ
れば棄てる。

【００７６】ミエローマ細胞の調製Ｓｐ２／０マウスミエローマ細胞(ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５８１；２０μｇ
／ml ８−アザグアニン含有培養培地に維持)を、融合前に１週間、ＲＰＭＩ１
６４０(８−アザグアニジンば含まない)、１０％(ｖ／ｖ)ＦＣＳおよび１％ペニ
シリン−ストレプトマイシン(各々５０ＩＵ／mlおよび５０μｇ／ml)中で培養す
る。細胞を遠心(２００×ｇ、５分)で回収し、３回冷ＲＰＭＩ１６４０で洗浄す
る。約２.５×１０^６細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレート当たり使用
する。

【００７７】脾臓細胞懸濁液の調製マウスを麻酔(Forene)の過投与により殺し、脾臓を解剖し、細胞ストレイナー
(７０μｍメッシュ細胞ストレイナー；Becton & Dickinson, Oxford, UK, Cat.
No 2350)を通して圧縮する。細胞懸濁液をＲＰＭＩ１６４０で３回洗浄し(上記
の通り)、計数する：５.１０^６細胞／９６ウェルプレートが必要である。

【００７８】ミエローマ細胞および脾臓細胞の融合脾臓およびミエローマ細胞を混合し(２：１)、遠心し(２００×ｇ、５分)、ペ
レットを３７℃水浴で暖める。予め暖めたポリエチレングリコール４０００(１m
l／１０^８細胞)を、１分間にわたりゆっくり添加し、次いで２０mlの予め暖めた
培地を２分間にわたり添加する。遠心後、ペレットを注意深く選択培地(ＲＰＭ
Ｉ１６４０、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、１０％BM c
ondimed H1(Boehringer Mannheim, Lewes, UK; Cat. No. 1 088 947からの支持
細胞置換)、１０％ＨＡＴ−培地添加物(非融合ミエローマ細胞に対して選択する
ためのヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン細胞；Boehringer Mannh
eim, Lewes, UK; Cat. No. 644 579)に再懸濁し、２００μｌ／ウェルの９６ウ
ェルマイクロタイタープレートにプレーティングする。

【００７９】５日間の後、ハイブリッド細胞のクラスターは、マイクロタイターウェルの底
を倒立顕微鏡で試験することにより同定できる。１０−１４日後、培養上清を抗
体の存在に関してＥＬＩＳＡ(実施例７)で試験する。陽性クローンを２４ウェル
アッセイプレートに拡張し、再試験する。

【００８０】陽性ハイブリドーマのクローニングまだ陽性である拡張クローンを、限定希釈によりクローン化する。細胞を、連
続的に４希釈段階で９６ウェルマイクロタイタープレートで希釈する；５、２、
１および０.５細胞／ウェル。ＨＡＴ−培地添加物を、ＨＴ−培地添加物(Boehri
nger Mannheim, Lewes, UK; Cat. No. 623 091)で置きかえる。約１週間後、細
胞をＥＬＩＳＡ(実施例７)でスクリーニングする。一陽性クローンを含むこれら
のウェルの細胞は、拡張される。

【００８１】モノクローナル抗体上清の製造細胞を、培養フラスコで、標準培地(ＲＰＭＩ１６４０、１０％(ｖ／ｖ)ＦＣ
Ｓおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシン)でハイブリドーマが過増殖し、
死ぬまで増殖させる。残骸を遠心により除去し、抗体をＥＬＩＳＡ(実施例７)を
使用した力価で力価測定し、その後滅菌条件下で４℃、−２０℃または−７０℃
で貯蔵する。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 11/00 ４Ｃ０８６Ａ６１Ｐ 1/00 11/16 11/00 19/02 11/16 29/00 19/02 １０１ 29/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 １０１ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｍ 33/50 33/566 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者シダ・ユーセフィスイス、ツェーハー−3013ベルン、アルテンベルクシュトラーセ50ベー番Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA29 AA40 BA13 BB03 BB20 CB01 CB17 CB21 DA12 DA13 DA36 DA77 FB02 FB03 FB04 4B024 AA01 AA11 CA04 CA09 DA02 EA04 GA11 HA12 HA17 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ12 QQ43 QQ79 QQ91 QR08 QR32 QR56 QR62 QS25 QS34 4C084 AA02 AA06 AA13 BA01 BA08 BA22 BA23 CA53 CA56 DA45 NA14 ZA59 ZA60 ZA66 ZA96 ZB11 ZB15 4C085 AA13 AA14 BB11 DD62 DD63 EE01 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA59 ZA60 ZA66 ZA96 ZB11 ZB15

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 (Ａ)配列番号２のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列の機
能的等価変異体を含むポリペプチド、または(Ｂ)ポリペプチド(Ａ)をコードする
ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、または(Ｃ)ポリペプチド(Ａ)と免疫
反応性である抗体、または(Ｄ)ヌクレオチド(Ｂ)と相補的なヌクレオチド配列を
含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、または(Ｅ)(Ｂ)の少なくとも１５連続ヌ
クレオチドを含むポリヌクレオチドプローブの、好中球関連炎症性疾患の診断ま
たは処置用医薬の製造における使用。
【請求項２】配列番号２の連続１０アミノ酸部分と配列が同一の連続１０
アミノ酸部分を含むポリペプチド(Ａ)の、請求項１に記載の使用。
【請求項３】配列番号１のヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡである、また
はストリンジェントな条件下で配列番号１とハイブリダイズするヌクレオチド配
列を含むＤＮＡである、ポリヌクレオチド(Ｂ)の、請求項１に記載の使用。
【請求項４】ポリヌクレオチド(Ｂ)が配列番号１の連続２０塩基対と配列
が同一の連続２０塩基対ヌクレオチド部分を含む、請求項３に記載の使用。
【請求項５】配列番号１と相補的なヌクレオチド配列を含む、アンチセン
スオリゴヌクレオチド(Ｄ)の、請求項１に記載の使用。
【請求項６】配列番号１の少なくとも１５連続ヌクレオチドを含むポリヌ
クレオチドプローブ(Ｅ)の、請求項１に記載の使用。
【請求項７】疾患が慢性閉塞性肺疾患、成人呼吸窮迫症候群、関節リウマ
チまたは炎症性大腸疾患である、請求項１から６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】必要とする対象に有効量の請求項１または２に記載のポリペ
プチド(Ａ)、請求項１、３または４に記載のポリヌクレオチド(Ｂ)、請求項１に
記載の抗体(Ｃ)、または請求項１または５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオ
チド(Ｄ)を投与することを含む、好中球関連炎症性疾患の処置法。
【請求項９】対象由来の遺伝サンプルを、請求項１または６に記載のポリ
ヌクレオチドプローブ(Ｅ)と、プローブが相補的ポリヌクレオチド配列とハイブ
リダイズする条件下でインキュベートし、第１反応産物を産生し、第１反応産物
を、正常遺伝サンプルで得たコントロール反応産物と比較することを含み、第１
反応産物とコントロール反応産物の差異が好中球関連炎症性疾患を発症する素因
を示すものである、対象における好中球関連炎症性疾患を発症する素因を検出す
る方法。
【請求項１０】細胞または組織由来のＤＮＡを、ポリヌクレオチド(Ｂ)の
少なくとも１５連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドプローブと、プローブ
がポリヌクレオチド(Ｂ)と特異的にハイブリダイズする条件下で接触させ、ハイ
ブリダイゼーションが起こるか否かを検出することを含む、対象由来の細胞また
は組織における請求項１、３または４に記載のポリヌクレオチド(Ｂ)の存在を検
出することを含む、対象における好中球関連炎症性疾患を診断する方法。
【請求項１１】対象由来の細胞または組織における請求項１または２に記
載のポリペプチド(Ａ)または請求項１、３または４に記載のポリヌクレオチド(
Ｂ)のレベルを測定する、対象由来の細胞または組織における(Ａ)の生物活性を
測定する、または対象由来の細胞または組織における(Ｂ)の変異の存在を測定す
る、そして結果を健康な対象から得られたものと比較することを含む、対象が好
中球関連炎症性疾患を発症しているか、または発症の恐れがあるかを測定する方
法。
【請求項１２】候補物質とポリペプチド(Ａ)を合わせ、候補物質の該(Ａ)
の活性における効果を測定することを含む、請求項１または２に記載のポリペプ
チド(Ａ)の活性を調節する、好中球関連炎症性疾患の処置に使用するのに適した
物質の同定法。
【請求項１３】候補物質と請求項１または２に記載のポリペプチド(Ａ)を
合わせ、結合が起きるか否かを測定することを含む、好中球関連炎症性疾患の処
置に使用するのに適した物質の同定法。
【請求項１４】疾患が慢性閉塞性肺疾患、成人呼吸窮迫症候群、関節リウ
マチまたは炎症性大腸疾患である、請求項８から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】請求項１、３または４に記載のポリヌクレオチド(Ｂ)のフ
ラグメントの増幅のためのプライマーとして有用なオリゴヌクレオチド対であり
、該対の各オリゴヌクレオチドは、少なくとも１５ヌクレオチド長であり、該対
は、ヒトゲノムＤＮＡまたは適当なヒトｃＤＮＡ標的とのポリメラーゼ連鎖反応
に使用した場合、請求項１、３または４に記載のポリヌクレオチド(Ｂ)のヌクレ
オチド配列を全てまたは一部含むＤＮＡフラグメントの合成をもたらす、オリゴ
ヌクレオチドの対。