JP2003523178A - 治療又は診断のための成分の攻撃目標を設定したデリバリー - Google Patents

治療又は診断のための成分の攻撃目標を設定したデリバリー

Info

Publication number
JP2003523178A
JP2003523178A JP2001537995A JP2001537995A JP2003523178A JP 2003523178 A JP2003523178 A JP 2003523178A JP 2001537995 A JP2001537995 A JP 2001537995A JP 2001537995 A JP2001537995 A JP 2001537995A JP 2003523178 A JP2003523178 A JP 2003523178A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
composition
antibody
mab
cells
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2001537995A
Other languages
English (en)
Inventor
プレス,マイケル
パーク,ジンハ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Southern California USC
Original Assignee
University of Southern California USC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Southern California USC filed Critical University of Southern California USC
Publication of JP2003523178A publication Critical patent/JP2003523178A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013Luminescence
    • A61K49/0017Fluorescence in vivo
    • A61K49/005Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0058Antibodies
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10Organic compounds
    • A61K49/14Peptides, e.g. proteins
    • A61K49/16Antibodies; Immunoglobulins; Fragments thereof
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04Organic compounds
    • A61K51/08Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06Antipsoriatics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00Drugs for disorders of the nervous system
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02Ophthalmic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77Internalization into the cell

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

(57)【要約】 細胞の内部移行のための、1以上の化合物の組成物及び方法が、開示される。本発明は、標的細胞に運ばれることができる薬物複合体組成物を提供し、この組成物は、受容体分子に対する結合特異性を有し、かつ治療又は診断に役立つ成分と複合化されている。この組成物が、患者に投与される時、上記担体化合物は、上記受容体と結合し、かつ上記標的細胞によって、内部移行される。さらに、モノクローナル抗体が開示され、かつ標的細胞中に内部移行される。本発明のモノクローナル抗体は、標的細胞に対して、特に表面抗体p185HER−2を発現している細胞に対して特異的である。本発明の抗体は、標的細胞中へのデリバリーのための分子と結合されることができる。そのような分子は、遺伝子治療を含む治療上の処置、及び画像形成(imaging)のために使用されることができる。本発明はまた、特定のモノクローナル抗体の可変領域のDNA配列も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】 関連出願データ 本出願は、1999年11月15日に出願された米国特許出願番号第60/1
65,563号の、35U.S.A119(e)に基づく利益を主張し、本出願
に援用する。
【0002】 本発明の分野 ここに記述された前記組成物及び使用の方法は、細胞の内部移行 (internaliz
ation)を強めるための材料及び方法の領域にある。
【0003】 背景 最近の化学療法手順において、ガンの化学療法における、抗細胞分裂薬、例え
ば、アドリアマイシン、ビンクリスチン、シスプラチン、ドキソルビシン、ダウ
ノマイシン、及びメトトレキサート、毒素、例えば、ジフテリア毒素、シュード
モナス毒素、及びヒマ毒(ricin)、抗腫瘍薬、例えばシクロホスファミド、及び
イソホスファミドの投与は、その患者の正常細胞に激しく有害な副作用を有し、
したがって、安全に投与されることが可能な投与量に厳しく制限される。概観の
ためには、Petersdorfら、Princeples of Internal Medicine,第10版、McGraw
-Hill、N.Y.、1983の中の、DeVita、「Principles of Cancer Therapy」、
765〜788頁を参照されたい。通常の治療手順においてさえ、化合物、例え
ば、タンパク質、ペプチド、遺伝子材料(genetic material)、並びにその他の薬
物及び診断のための化合物(diagnostic compound)を細胞内にデリバリーするこ
とは、しばしば困難であるが、それは細胞膜がしばしばこれらの化合物の通過を
阻むからである。
【0004】 多くのアプローチが、ガンの化学療法及び薬物デリバリーの効果及び特異性を
改善するために探求されてきた。1つのアプローチは、抗ガン薬を悪性細胞に特
異的に向かわせることを試みることであり、それにより、正常細胞への影響は最
小になるであろう。このアプローチは、通常、「薬物ターゲティング(drug targ
eting)」といわれている。このアプローチの1つの例においては、薬物は、生分
解性のポリアミノ酸高分子基材、又は、そのようなポリアミノ酸基材であって、
さらに担体薬(carrier agent)に結びつけられているものに、結合されている。
理論的には、標的細胞における上記ポリアミノ酸基材の分解は、細胞毒性薬を放
出する。残念なことに、ポリアミノ酸基材の使用は、多くの腫瘍細胞に効果的に
侵入するための上記複合体(conjugate)の能力を、減少するだろう。さらに、適
当な担体薬の欠乏がある。いくつかの化合物が、担体薬として考えられているに
もかかわらず、それらは、細胞中への内部移行の非予測性を含む不利を欠点とし
て有する。
【0005】 したがって、薬を細胞内にデリバリーするための新規な方法を持つことは、有
利であろう。特に、腫瘍細胞に、予想どおりに化学療法薬物を届ける、利用可能
なドラッグデリバリーシステム(drug delivery system)をもつことは、非常に望
まれることだろう。この目的を達成するために、いくつかのグループが、遺伝子
治療のための攻撃目標として、p185HER−2を過剰発現している細胞を試
験した(12〜15)。遺伝子の攻撃目標を定めたデリバリーは、ウイルス粒子
上の同族の受容体を、細胞の受容体結合基及び単鎖の抗体に変更することによっ
て、試みられた(16〜19)。これらのベクターは、p185HER−2を過
剰発現している細胞にうまく結合したが、いずれも、顕著な割合の遺伝子形質導
入をもたらしていない。ヒト化モノクローナル抗体、ハーセプチン(Herceptin)
(商標)は、HER−2/neuを過剰発現する乳ガン及び卵巣ガンの数人の女
性を有効に治療するために使用され、p185HER−2が、ヒトのガンを選択
的に攻撃目標とするために使用されうることが証明されている(10、11)。
結果は、ハーセプチン(商標)で治療された患者にとって改善されたが、ガンに
特異的抗原の発現に利用するために、抗体を基礎とした治療のさらに有効な群が
開発される必要がある。さらに、ベクター構築物(vector construct)の結合の後
の、細胞応答については非常にわずかしか知られていないため、受容体に結合し
た後に起こる(post-binding receptor-mediated)エンドサイトーシスの有効性を
評価する必要があり、エンドサイトーシスは、新規な治療の有効性を改善するた
めに役立つであろう。
【0006】 まとめ 本発明は、生物活性の、及び/又は診断の薬(diagnostic agents)の細胞内デ
リバリーを強めるための組成物及び方法に関し、さらに、高分子量かつ不安定な
薬、例えば、タンパク質及び核酸分子、並びに診断薬をデリバリーするための、
体を傷つけることの少ない(less invasive methods)方法を提供することに関す
る。
【0007】 さらに、特に、本発明は、その他の分子又は遺伝子治療ベクターを、特異的に
細胞にデリバリーするための担体化合物、例えばモノクローナル抗体に関するも
のであり、この細胞は、特異的な表面マーカータンパク質によって見分けること
ができ、さらに、これはひとたび結合すれば、受容体仲介エンドサイトーシス(r
eceptor-mediated endocytosis)と呼ばれる通常の細胞のプロセスによって内部
移行されるだろう。
【0008】 細胞の、1以上の化合物の内部移行を改善するための、組成物及び方法が開示
される。本発明は、標的細胞にデリバリーされることが可能である薬物複合体組
成物を提供し、その組成物は、受容体分子に対する結合特異性を有する担体化合
物を含み、さらに治療に役立ち(thrapeutic)又は診断のための(diagnostic)成分
(moiety)と複合化されている。この組成物が、患者に投与される時、前記担体化
合物は、前記受容体と結合し、さらに前記標的細胞によって内部移行される。
【0009】 さらに、本発明は、本発明の組成物を使用して、疾病状態を治療し、及び腫瘍
を抑制するための方法を提供する。さらにまた、疾病状態及び腫瘍を発見するた
め、及び本発明の想定される組成物を選別するために、本発明の組成物及び化合
物を使用する方法も記述される。
【0010】 本発明はまた、膜受容体タンパク質である、p185HER−2の細胞外領域
(extracellular domain)を認識する、4つの新規モノクローナル抗体を、内部移
行依存治療(internalization-dependent therapies)のために提供する。4つの
抗体全ては、p185HER−2に結合し、さらにそれらの2つは、生細胞上の
p185HER−2の接近可能なエピトープ(accessible epitopes)を認識する
。成功する遺伝子治療ベクターは、細胞を攻撃目標にすることだけでなく、その
ベクターの内部移行及び治療に役立つ遺伝子(therapeutic gene)の発現を必要と
するだろうし、そのベクターを構築する前に可能な限り多くのこれらのステップ
を評価することは重要である。ここでの最後に、本発明は、迅速で、定量化可能
なラジオイムノアッセイ(radioimmunoassay)を使用する、前記4つの抗p185 HER−2 モノクローナル抗体の内部移行潜在能力の特徴づけ(characterizatio
n)を開示する。本発明の結果は、2つのp185HER−2モノクローナル抗体
、8H11及び10H8が、生存可能な、元のままの標的細胞に結合し、さらに
エンドソーム経路を通じて内部移行され、かつ輸送されるであろうことを示し、
したがって、本発明の結果は、前記抗体が、治療効果のための内部移行を必要と
する治療ベクター(treatment vectors)を目標にすることにおいて有用であるだ
ろうということを立証する。
【0011】 加えて、モノクローナル抗体、Mab、8H11及び10H8の独自可変重(
VH)(unique variable heavy)及び可変軽(VL)(variable light)ドメイン(
domain)をコード化する遺伝子のDNA配列が、開示される。
【0012】 定義 多くの文法上の形の中の「抗体又は抗体分子(antibody or antibody molecule
)」の用語は、本明細書中では、イムノグロブリン分子の集合及び/又はイムノ
グロブリン分子の免疫学的な活性部分、すなわち部位(site)又はパラトープ(par
atope)を結合している抗体を含む分子の集合を言及する集合名詞として使用され
る。
【0013】 「抗体結合部位(antibody combining site)」は、重及び軽鎖可変ならびに抗
原と特異的に結合する超可変領域を含む抗体分子の構造部分である。
【0014】 多くの文法上の形の中の「モノクローナル抗体」の語句は、特定のエピトープ
と免疫反応することができる抗体結合部位の唯一の種類を含む抗体分子の集合を
いう。モノクローナル抗体は、したがって異なるエピトープに対して、それぞれ
免疫特異的な、多数の抗体結合部位を有する抗体分子、例えば、二重特異性モノ
クローナル抗体(bispecific monoclonal antibody)を含むことができる。
【0015】 「結合特異性を有する(having the binding specificity of)」の用語の使用
は、等価なモノクローナル抗体が、あらかじめ選ばれた標的エピトープに結合す
ることについて競うことを示す。
【0016】 用語「複合体組成物(conjugate composition)」、「複合体(conjugate)」、「
組成物(composition)」は、本明細書を通して互換性をもって使用される。
【0017】 用語「ヌクレオチド配列(nucleotide sequence)」は、ヌクレオチドのヘテロ
ポリマーまたはヌクレオチドの配列をいう。当業者は、容易にこの2つの定義の
どちらが適当であるか、文脈上の役割から理解するだろう。用語「核酸(nucleic
acid)」および「ポリヌクレオチド(polynucleotide)」も、ヌクレオチドのヘテ
ロポリマーを示すために、本明細書中では互換性をもって使用される。一般に、
本発明によって提供される核酸分子セグメントは、ゲノムのフラグメント及び短
いオリゴヌクレオチドリンカー(oligonucleotide linkers)、又はヌクレオチド
の配列から、又は個別のヌクレオチドから組み立てられ、合成核酸を提供するこ
とができ、この合成核酸は、微生物又はウイルスオペロンから誘導された調節要
素(regulatory elements)、あるいは真核生物遺伝子を含む組換え転写ユニット
中で発現されることができる。
【0018】 用語「オリゴヌクレオチドフラグメント(oligonucleotide fragment)」又は「
ポリヌクレオチドフラグメント(polynucleotide fragment)」、「部分(portion)
」又は「セグメント(segment)」は、、これは、mRNA又はDNA分子の同一
又は関連する部分を同定し又は増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR
)または多くのハイブリダイゼーション手順で使用するために充分長いヌクレオ
チド残基の一連なり(stretch)をいう。
【0019】 「オリゴヌクレオチド(oligonucleotides)」又は「核酸プローブ(nucleic aci
d probes)」は、本明細書中で提供されるポリヌクレオチド配列に基づき製造さ
れる。オリゴヌクレオチドは、少なくとも約15ヌクレオチド、さらに通常は少
なくとも約20ヌクレオチドを有する、そのようなポリヌクレオチド配列の部分
を含む。核酸プローブは、約6kb未満、通常は1kb未満のヌクレオチドを有
する、そのようなポリヌクレオチド配列の部分を含む。偽陽性(false positive)
を排除するための適当な試験の後、これらのプローブは、例えば、特定のmRN
A分子が細胞又は組織中に存在するか否かを決定するために使用されることがで
きる。
【0020】 用語「プローブ(probes)」は、天然か、又は組換え型又は化学的に合成した一
本又は二本鎖核酸を含む。それらは、ニックトランスレーション、クレノウ補充
反応(Klenow fill-in reaction)、PCR又は当業界で周知の方法によって、標
識されうる。本発明のプローブ、それらの製造及び/又は標識は、Sambrook,J.
ら、1989.Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor,
New York; 又は、Ausubel,F.ら、1989、Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley & Sons, New York, の中に詳しく述べられ、これら両者は
、全体として本出願に援用する。
【0021】 用語「組換え型の(recombinant)」は、ポリペプチド又はタンパク質を示すた
めに本明細書中で使用された場合、ポリペプチド又はタンパク質が、組換え型(
例えば、微生物、哺乳動物、又は昆虫を基礎とした)発現系から誘導されたこと
を意味する。「微生物の(microbial)」は、バクテリア又は真菌(例えば、酵母
)の発現系で製造された、組換え型ポリペプチド又はタンパク質を表す。生産物
として、「組換え型微生物の(recombinant microbial)」は、本質的に、天然の
内因性物質を含まず、かつ関連した天然のグリコシル化に随伴されないポリペプ
チド又はタンパク質を定義する。大部分の微生物培養、例えば、E.coli中
で発現されたポリペプチド又はタンパク質は、グリコシル化修飾されていないだ
ろう;酵母中で発現されたポリペプチド又はタンパク質は、一般に哺乳動物細胞
中で発現されたものと異なり、グリコシル化型を有するだろう。
【0022】 用語「組換え型発現ベヒクル(recombinant expression vehicle)又はベクター
(vector)」は、DNA(RNA)配列からポリペプチドを発現するためのプラス
ミド又はファージ又はウイルス又はベクターを表す。発現ベヒクルは、(1)遺
伝子領域(gene element)又は遺伝子発現中で調節の役割を有する領域、例えば、
プロモーター(promoters)又はエンハンサー(enhancers)、(2)mRNAに転写
され、かつタンパク質に翻訳される、構造又はコード配列(coding sequence)
、及び(3)適当な転写開始及び終結配列、の集合(assembly)を含有する転写単
位を含むことができる。酵母又は真核生物発現系における使用のために意図され
た構造単位は、宿主細胞によって、翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能に
するリーダー配列(leader sequence)を、好ましくは含む。それに代わり、リー
ダー又は輸送配列(transport sequence)なしに、組換え型タンパク質が発現され
るところでは、N−末端メチオニン残基を含むことができる。この残基は、最終
生成物を提供するために、発現された組換え型タンパク質から引き続いて切断さ
れるかもしれないし又は切断されないかもしれない。
【0023】 用語「組換え型発現系(recombinant expression system)」は、染色体DNA
中に組換え型転移ユニットを安定に結合した宿主細胞、又は染色体外にこの組換
え型転移ユニットを有している宿主細胞を意味する。本明細書中で定義された組
換え発現系は、発現されるであろうDNAセグメント又は合成遺伝子に結合され
た調節要素の導入により、非相同ポリペプチド又はタンパク質を発現するだろう
。この用語は、遺伝子発現において調節の役割、例えばプロモーター又はエンハ
ンサーを有する組換え遺伝子要素(element又はelements)を安定に組み込んだ
宿主細胞も意味する。本明細書中で定義された組換え発現系は、発現されるであ
ろう内在性(endogenous)DNAセグメント又は遺伝子に結合された調節要素の導
入により、細胞に対して内在性のポリペプチド又はタンパク質を発現するだろう
。この細胞は、原核(prokaryotic)又は真核(eukaryotic)であることができる。
【0024】 用語「活性(active)」は、いずれかの天然ポリペプチドの生物学的及び/又は
免疫学的活性を保有するポリペプチドの形態を表す。
【0025】 用語「天然ポリペプチド(naturally occurring polypeptide)」は、遺伝子的
に処理されていない細胞によって生産されたポリペプチドを表し、さらに、ポリ
ペプチドの翻訳後の修飾から生じる多くのポリペプチドを明確に意図し、その修
飾は、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、ホスホリル化、リピド化、
及びアシル化を含むが、これらに限定されない。
【0026】 用語「誘導体(derivative)」は、ユビキチン化、(例えば、放射性核種又はさ
まざまな酵素での)標識化(labeling)、PEG化(pegylation)(ポリエチレング
リコールで誘導体化(derivatization))、及び、通常、ヒトのタンパク質中に存
在しないアミノ酸、例えばオルニチンの化学合成による挿入又は置換といった技
術によって、化学的に修飾されたポリペプチドを表す。
【0027】 用語「組換え型変異体(recombinant variant)」は、アミノ酸の挿入、欠失、
及び置換によって、天然ポリペプチドから区別される全てのポリペプチドで、組
換えDNA技術を使用して作られたものを表す。興味ある活性、例えば細胞の輸
送(cellular trafficking)を失うことなく、どのアミノ酸残基が置換、追加、又
は欠失されることができるかを決定するガイドラインは、特定のポリペプチドの
配列を相同のペプチドの配列と比較すること、及び高い相同性の領域で行われる
アミノ酸配列の変更の数を最小にすることによって発見することができる。
【0028】 好ましくは、アミノ酸の「置換(substitutions)」は、1つのアミノ酸を、類
似の構造及び/又は化学的特性を有する別なアミノ酸で置換すること、すなわち
保存的アミノ酸置換(conservative amino acid replacement)の結果である。ア
ミノ酸置換は、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び/又は含まれる残基
の両親媒的性質の類似性を基礎にして行われることができる。例えば、非極性(
疎水性)アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、
フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンを含み;極性の中性アミノ
酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、
及びグルタミンを含み;正に帯電した(塩基性)アミノ酸は、アルギニン、リシ
ン、及びヒスチジンを含み;そして、負に帯電した(酸性)アミノ酸は、アスパ
ラギン酸及びグルタミン酸を含む。「挿入(insertions)」又は「欠失(deletions
)」は、典型的には約1〜5のアミノ酸の範囲内である。許容される変化は、ア
ミノ酸の挿入、欠失、又は置換を、ポリペプチド分子中に体系的に作ることによ
って実験的に決定されうるが、それは組換えDNA技術を使用し、さらに、得ら
れた組換え型変異体の活性を測定することによる。
【0029】 それに代わり、機能の変更が所望されるところでは、挿入、欠失、又は非保存
的変化(non-conservative alterations)が、変化したポリペプチドを生産するた
めに設計されうる。そのような変更は、例えば、本発明のポリペプチドの生物学
的機能又は生物化学的特性の1つ以上を変えることができる。例えば、そのよう
な変更は、ポリペプチドの特性、例えばリガンド結合親和性(ligand-binding af
finities)、鎖間親和性(interchain affinities)、又は分解/交代速度を変える
ことができる。さらに、そのような変更は、発現のために選択された宿主細胞に
おいて、発現、スケールアップ、及びその他同類のもののためにより良く適した
ポリペプチドを生み出すように選択されうる。例えば、システイン残基は、ジス
ルフィド架橋を排除するために、除去され、又は別なアミノ酸残基で置換される
ことができる。
【0030】 本明細書中で使用されるように、「実質的等価な(substantially equivalent
)」は、ヌクレオチド及びアミノ酸配列の両者を表すことができ、例えば、突然
変異体配列であり、それら配列は、1以上の置換、欠失、付加によって参照配列
から変化しているが、その全体の効果は、その参照(reference)及び対象(subjec
t)配列の間に不都合な機能的非類似をもたらさない。典型的には、そのような実
質的に等価な配列は、本願中でリストにした配列の1つから、約2%以下(すな
わち、その対応する参照配列と比較して、実質的に等価な配列中の個別の残基の
置換、付加、及び/又は欠失の数を、その実質的に等価な配列の残基の全数で割
ったものが、約0.02以下)で変化する。そのような配列は、その表にした配
列と98%の配列同一性(sequence identity)を有すると言われる。1つの実施
態様において、本発明の実質的等価な、例えば突然変異の配列は、表にした配列
から、2%以下で変化する(98%配列同一性);この実施態様の1つの変形で
は、0.5%以下で変化する(99.5%配列同一性);さらに、この実施態様
のさらなる変形では、0.1%以下で変化する(99.9%配列同一性)。本発
明の、実質的等価な、例えば突然変異のアミノ酸配列は、一般的に表にしたアミ
ノ酸配列と少なくとも98%の配列同一性を有し、ところが本発明の、実質的等
価なヌクレオチド配列は、例えば、遺伝暗号の縮重の重複性を考慮すると、さら
に低いパーセンテージの配列同一性を有することができる。等価性を決定する目
的のためには、成熟配列(mature sequence)の末端切断(truncation)(例えば、
偽の停止コドンを作り出す突然変異による)は、無視されるべきである。
【0031】 所望するところでは、発現ベクターは、そのポリペプチドを細胞の膜を通過さ
せるであろう「シグナル又はリーダー配列(signal or leader sequence)」を含
むように設計されることができる。そのような配列は、本発明のポリペプチドに
生来存在するか、又は組換えDNA技術によって非相同のタンパク質源から提供
されることができる。
【0032】 ポリペプチドの「断片(fragment)」、「部分(portion)」、又は「セグメント(
segment)」は少なくとも約5アミノ酸、しばしば少なくとも約7アミノ酸、典型
的には少なくとも約9〜13アミノ酸、さらに、多くの実施態様において、少な
くとも約17以上のアミノ酸のアミノ酸残基の一連なり(stretch)である。活性
であるためには、いずれのポリペプチドも、生物学的及び/又は免疫学的活性を
示すための充分な長さを有しなければならない。
【0033】 それに代わり、これらの同一又は類似のポリペプチドをコード化する組換え変
異体は、遺伝暗号における「縮重(redundancy)」を使用することによって、合成
又は選択されることもできる。多くのコドンの置換、例えば、多くの制限部位を
生み出すサイレント変化(silent changes)は、プラスミド又はウイルスベクター
中にクローニングすること、あるいは特定の原核又は真核システム中での発現を
最適化するために導入されることができる。ポリヌクレオチド配列中の突然変異
は、そのポリペプチド又はそのポリペプチドに付加された他のペプチドのドメイ
ンに反映されることができ、そのポリペプチドのいずれかの部分の性質を変化し
、例えばリガンド結合親和性、鎖間親和性、又は分解/交代速度といった性質を
変えることができる。
【0034】 本明細書中で使用される、用語「活性化された(activated)」細胞は、細胞外
又は細胞内(intracellular)の膜輸送に従事させられる細胞であり、輸送は、正
常又は疾病過程の一部としての、神経分泌分子又は酵素分子の運び出しを含む。
【0035】 本明細書中で使用されるように用語「精製された(purified)」は、指定された
核酸又はポリペプチドが、その他の生物学的な高分子、例えばポリヌクレオチド
、タンパク質、及びその他類似のものを実質的に含まずに存在することを表す。
1つの実施態様において、そのポリヌクレオチド又はポリペプチドは、それが質
量で少なくとも95%、さらに好ましくは少なくとも質量で99.8%の指定さ
れた存在する生物学的な高分子からなる程に精製される(しかし、水、緩衝液、
及びその他の小さな分子、特に1000ダルトン未満の分子量を有する分子は、
存在できる)。
【0036】 本明細書中で使用されるように、用語「単離された(isolated)」は、その天然
資源中で核酸又はポリペプチドとともに存在する少なくとも1つの他の成分(例
えば、核酸又はポリペプチド)から分離された核酸又はポリペプチドを表す。1
つの実施態様において、その核酸又はポリペプチドは、(どちらかといえば)溶
媒、緩衝液、イオン、又はその同種の物の溶液中に通常存在するその他の成分の
みの存在下に発見される。用語「単離された」及び「精製された」は、天然資源
中に存在する核酸又はポリペプチドを含まない。
【0037】 「医薬として許容される塩(pharmaceutically acceptable salt)」によって、
いわゆる医療上の判断の範囲内で、不都合な毒性、刺激、アレルギー反応、及び
その他同様のものなしに、ヒト及び下等動物(lower animal)の組織に接触して使
用するために適し、さらに合理的な利益/危険比に相応する塩が意味される。医
薬として許容される塩は、当技術分野で周知である。例えば、S.M.Bergeらは、J
. Pharmaceutical Science, 1977, 66:1〜19に、医薬として許容される塩を詳細
に記述する。この塩は、本発明の化合物の最後の単離及び精製の間に、その場(i
n situ)で製造されうるか、又は、遊離塩基官能基を適当な酸と反応させること
によって別途製造されうる。代表的な酸付加塩は、酢酸塩、アジピン酸塩、アル
ギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息
香酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳塩(camphorate)、カンファースル
ホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデ
シル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩(glucohept
onate)、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩(hemisulfate)、ヘプタン酸塩、ヘキサ
ン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ素酸塩、2−ヒドロキシエタンスルホン酸
塩、ラクトバイオネート(lactobionate)、乳酸塩、ラウリル酸塩、ラウリル硫酸
酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、2−ナフ
タレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パル
ミチン酸塩、パモエート(pamoate)、ペクチン塩、過硫酸塩、3−フェニルプロ
ピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバレート(pivalate)、プロピオン酸塩
、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエン
スルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩、及びその他同様のものを含む。代表
的なアルカリ又はアルカリ土類金属塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム、カ
ルシウム、マグネシウム、及びその他同様のもの、並びに非毒性のアンモニウム
、第4級アンモニウム、及びアミンカチオン、これらはアンモニウム、テトラメ
チルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン
、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン、及びその他同様のもの
を含む。
【0038】 本明細書中で使用されるように、用語「医薬として許容されるエステル(pharm
aceutically acceptable ester)」は、インビボで加水分解されるエステルを表
し、さらにヒトの体内で容易に分解して母体化合物又はそれらの塩を放すものを
含む。適当なエステル基は、例えば、医薬として許容される脂肪族カルボン酸、
特にアルカン酸、アルケン酸、シクロアルカン酸、及びアルカンジカルボン酸か
ら誘導されるエステルを含み、ここで、各アルキル又はアルケニル残基は、有利
には6炭素原子以下を有する。特定のエステルの例は、ギ酸エステル、酢酸エス
テル、プロピオン酸エステル、酪酸エステル、アクリル酸エステル、及びエチル
コハク酸エステルを含む。
【0039】 本明細書中で使用するような用語「医薬として許容されるプロドラッグ(pharm
aceutically acceptable prodrugs)」は、本発明の化合物のプロドラッグであり
、それは、いわゆる医療上の判断の範囲内で、不都合な毒性、刺激、アレルギー
反応、及びその他同様のものなしに、ヒト及び下等動物(lower animal)の組織に
接触して使用するために適し、合理的な利益/危険比に対応し、さらにそれらの
意図した使用に対して有効であり、並びに、可能なら、本発明の化合物の両性イ
オン型(zwitterionic forms)である。用語「プロドラッグ(prodrug)」は、イン
ビボで急速に変換されて、上記式の母体化合物を生成する化合物を表し、それは
例えば血液中での加水分解による。徹底的な議論が、T.Higuchi及びV.Stella, P
ro-drugs as Novel Delivery Systems, A.C.Sシンポジウムシリーズの14巻、及
びEdward.B.Roche編、Bioreversible Carriers in Drug Design, American Phar
maceutical Association及びPergamon Press, 1987中に提供されており、これら
の両者を、ここに援用する。
【0040】 ペプチドの生物学的機能を本質的に変更することなく、そのペプチドの構造中
に、修飾及び変化が作られうることは、当業界で周知である。例えば、ある種の
アミノ酸は、機能のいかなる感知できる喪失もなく、与えられたポリペプチド中
の他のアミノ酸と置換されうる。そのような変更を行うことにおいて、類似のア
ミノ酸残基の置換は、側鎖置換基の相対的な類似性、例えばそれらの大きさ、電
荷、疎水性、親水性、及びその他同様のものを基礎として行われうる。
【0041】 用語「オープン・リーディング・フレーム(open reading frame)」ORFは、
いかなる終止コドンもない、アミノ酸をコードしたヌクレオチド・トリップレッ
ト(nucleotide triplets)の一連なりを意味し、タンパク質に翻訳可能な配列で
ある。
【0042】 用語「発現調節フラグメント(expression modulating fragment)」EMFは、
操作可能に連結したORF又は別なEMFの発現を調節する、一連なりのヌクレ
オチドを意味する。
【0043】 用語「感染(infection)」は、ウイルス又はウイルスベクターの使用による、
適当な宿主細胞中への核酸の導入を表す。
【0044】 用語「形質転換(transformation)」は、適当な宿主細胞中にDNAを導入し、
それで、そのDNAが、染色体外要素として、又は染色体組込み(chromosomal i
ntegration)によって、転写可能であることを意味する。
【0045】 用語「トランスフェクション(transfection)」は、いずれかのコーディング配
列が、実際に発現されているか否かにかかわらず、適当な宿主細胞によって発現
ベクターが取込まれることを表す。
【0046】 上記用語のそれぞれは、文脈が異なる意味を示さないかぎり、それぞれについ
て記述された全てを包含することを意味する。
【0047】 本発明の詳細な説明 上出来の、攻撃目標を定めたドラッグデリバリー(successful targeted drug
delivery)は、細胞の内部移行及び細胞認識を必要とする。真核細胞膜の表面
受容体へのリガンド又はアセンブリータンパク質の結合は、クラスリン被覆小胞
(vesicle)内で膜複合体の細胞への陥入で終了する非平衡現象のカスケードを開
始するか又は伴う。この過程は、受容体介在エンドサイトーシス(receptor-medi
ated endocytosis)(RME)として公知である。RMEは、それによっていく
つかのタイプの生物活性分子、特に高分子が真核細胞に入り、そして攻撃目標を
定めた、薬のデリバリーのための担体薬を開発するために利用されうる主要な手
段である。
【0048】 上出来の、攻撃目標を定めたドラッグデリバリー処方計画の第2のプロング(p
rong)は、背後で特異的に宿主中の腫瘍細胞を認識し、そして正常細胞より、そ
のような細胞と優先的に結合する、よく特徴づけられた反応物の使用を必要とす
る。ガン細胞の遺伝子型及び分子構造中の差異についての最近の同定は、選択さ
れたヒトのガンの特異的な治療のための、そのような攻撃目標設定可能な反応物
(targetable reagents)を開発するための好機を提供している(1〜4)。例え
ば、ヒト乳ガン、子宮内膜ガン、卵巣ガン、胃ガン、及び唾液腺腫中のHER− /neuガン遺伝子の増幅は、これらのガンに対する潜在的な分子標的を提供
する。HER−2/neu遺伝子増幅は、p185HER−2の過剰発現と関連
する。
【0049】 以下の実施例に見ることができるように、2つのモノクローナル抗体がマウス
免疫細胞から単離され、さらにこれら抗体は、HER−2/neuガン遺伝子の
タンパク質受容体に、その細胞外ドメインで特異的に結合することが特徴である
。 この実施例は、両者のモノクローナル抗体が、上記タンパク質を過剰発現してい
る生細胞上のそのタンパク質に結合し、さらにエンドソームを含む経路中で、モ
ノクローナル抗体の内部移行の引き金をひくことを確立する。エンドソームに送
られることに続き、上記モノクローナル抗体及び結合されたHER−2/neu
タンパク質は、リソソーム中で分解され、さらにその細胞から排出される(41
)。
【0050】 両モノクローナル抗体は、HER−2/neuガン遺伝子のタンパク質生産物
に結合することについて、広範囲に性格づけされている。これらは、HER−2 /neu過剰発現細胞中で特異的に内部移行されることも示され、さらにエンド
ソームへの配置に続いて、細胞外に浮遊していることが発見されたタンパク質断
片として、分解及び細胞外空間中への排出が起こる証拠も示す。モノクローナル
抗体8H11及び10H8の各VH及びVL領域をエンコードしている遺伝子が
単離され、クローン化され、そして配列決定された。予測されたアミノ酸は、モ
ノクローナル抗体のアミノ酸配列のデータベースと相互参照(cross-referenced)
され、純粋なモノクローナル抗体可変領域として確認された。発現された遺伝子
の1つの部分的トリプシン消化物のアミノ酸配列解析は、予測されたアミノ酸配
列が正しかったことを立証した。
【0051】 リガンドが誘起し受容体が介在するエンドサイトーシス(ligand-induced rec
eptor-mediated endocytosis)のプロセスは、細胞の、表面タンパク質のダウン
レギュレーション(down-regulation)に対する普通の1つのものであるため、本
発明のモノクローナル抗体は、「抱き合わせられた(piggybacked)」遺伝子治療
ベクター、治療効果のある毒素(therapeutic toxins)、又は画像形成分子(imagi
ng molecules)の内部移行を誘発する能力のために利用されうる。毒素タンパク
質、化学物質、又は同位体標識も、これらのエフェクター(effector)分子を細胞
中に運ぶために、上記モノクローナル抗体に結合されることができ、それは攻撃
目標を定めた治療を強化し、又はエンドソームへの局在化をあてにする画像形成
剤を作り出すためである。遺伝子治療及び免疫毒素治療(immunotoxin therapy)
は、上記エフェクターベクター(effector vector)又はタンパク質が、攻撃目標
にした細胞のエンドソーム中に予想通り運ばれることができるとき、有効に強化
されることができる。同様に、ラジオグラフによる画像形成(radiographic ima
ging)は、上記のような標的とした残基(targeted moieties)によって確立され
るだろう。
【0052】 複合体組成物(conjugates compositions) 一般的な場合に、複合体の担体成分は、細胞特異的結合成分(cell-specific b
inding component)(又は部位(site))及び残基結合成分(moiety-binding compo
nent)(又は部位(site))を有する。この細胞特異的結合成分は、細胞の表面構
造に特異的に結合し、その表面構造は、例えばエンドサイトーシスのプロセスに
よってその内部移行をもたらす。その表面構造は、タンパク質、ポリペプチド、
炭水化物、脂質、又はそれらの組み合わせ物であることができる。それは、典型
的には、リガンドのエンドサイトーシスをもたらす表面受容体である。したがっ
て、上記結合成分は、上記受容体を結びつける天然又は合成リガンドであること
ができる。このリガンドは、抗体、タンパク質、ポリペプチド、炭水化物、脂質
、又はこれらの組み合わせ物であることができ、それは、細胞表面構造によって
認識されるために充分に露出された官能基を有する。それは、生物学的有機体、
例えばウイルス、細胞(例えば、哺乳動物、バクテリア、原生動物)、又は人工
的な担体、例えばリポソームであることもできる。
【0053】 上記担体を形成するのに有用なリガンドは、攻撃目標とされる特定の細胞によ
って、変化するだろう。肝細胞を攻撃目標にするためには、末端炭水化物基を露
出している糖タンパク質、例えばアシアロ糖タンパク質(ガラクトース末端)が
使用されうるが、その他のリガンド、例えばポリペプチドホルモンも使用される
ことができる。アシアロ糖タンパク質の例は、アシアロオロソムコイド(asialoo
rosomucoid)、アシアロフェチュイン(asialofetuin)、及び脱シアリル化(desial
ylated)水疱性口内炎ウイルス、を含む。そのようなリガンドは、末端シアリル
酸及び最後から2番目のガラクトース残基を持つ糖タンパク質の化学的又は酵素
的脱シアリル化によって形成されうる。それに代わり、アシアロ糖タンパク質リ
ガンドは、ガラクトース末端炭水化物、例えばラクトース又はアラビノガラクタ
ン(arabinogalactan)を、還元的ラクトースアミノ化(reductive lactosaminatio
n)によって、ガラクトースを有しないタンパク質(non-galactose bearing prote
ins)に結合することによって形成されうる。
【0054】 上記複合体組成物がその他の細胞表面受容体を攻撃目標とするために、その他
のタイプのリガンドを使用することができ、例えば、マクロファージ(リンパ腫
)に対するマンノース、線維芽細胞(線維肉腫)に対するマンノース−6−ホス
フェート糖タンパク質、エンテロサイト(enterocytes)に対する内因子−ビタミ
ンB12(intrinsic factor-vitamin B12)、及び脂肪細胞に対するインスリンで
ある。それに代わり、細胞特異的結合剤は、受容体又は受容体様分子(receptor-
like molecule)、例えば細胞表面上のリガンド(例えば抗原)に結合する抗体で
あることができる。そのような抗体は、以下に議論する標準の方法で製造される
ことができる。
【0055】 内部移行のための担体に結合された残基は、オリゴヌクレオチド、モノクロー
ナル又はポリクローナル抗体、抗体断片(antibody fragment)、治療に役立つ毒
素(therapeutic toxin)、又は画像形成分子、例えば同位体標識である。
【0056】 1つの実施態様において、本発明は、標的細胞を攻撃目標としたデリバリーの
ための複合体組成物であり、この組成物は受容体分子に対する結合特異性を有す
る担体化合物、及びその担体化合物に結合した残基を含む。この組成物は、担体
化合物が受容体分子と結合するときに、標的細胞によって内部移行される。好ま
しい実施態様において、この担体化合物は、モノクローナル又はポリクローナル
のいずれかの抗体、又はそのような抗体の断片である。多くの実施態様において
、本発明は、担体化合物として、モノクローナル抗体Mab 8H11、10H
8、5A7、及び11F11を提供する。
【0057】 本発明の複合体は、多くの種類の細胞に、異なる残基(moiety)をデリバリーす
るために有用であり、この細胞はガン細胞を含むが、これに限定されない。した
がって、ある実施態様中で、受容体分子はガン細胞によって過剰発現されたポリ
ペプチド、例えばp185HER−2タンパク質である。
【0058】 好ましい実施態様において、本発明の複合体は、p185HER−2/neu
ガン遺伝子を過剰発現しているガン細胞への残基のデリバリーを目標にする。こ
の組成物は、抗p185HER−2タンパク質であるモノクローナル抗体、及び
この抗体に結合された残基を含む。この抗体は、p185HER−2タンパク質
に対する結合特異性を有し、それがこのタンパク質に結合するときに内部移行さ
れる。本発明のある実施態様中、このモノクローナル抗体は、Mab 8H11
、Mab 10H8、Mab 5A7、及びMab 11F11の1つである。
この抗体に結合された残基は、治療に役立つ残基(therapeutic moiety)又は画像
形成化合物(imaging compound)である。
【0059】 残基結合成分は、デリバリーされる残基に結合する。残基との結合は、標的細
胞による内部移行の前に、細胞外での残基の著しい解離を防ぐために、インビボ
で充分安定でなければならない。しかしながら、この複合体は、細胞内の適当な
条件下で解離可能であり、それにより残基は作動可能な形態で放出される。例え
ば、この複合体は、リソソームの酸性かつ酵素が豊富な環境中で、不安定である
ことができる。上記結合成分及び残基の間の静電的引力に基づく非共有結合は、
細胞外での安定性を提供し、さらに細胞内条件下で解離可能である。
【0060】 実施例の製剤として、この複合体を形成するために、この残基及びこの担体を
混合し、さらに複合化に導く条件下でインキュベートする。例えば、この残基及
び担体を2M NaCl中に適当な割合で混合し、さらにこの溶液を0.15M
に希釈し、濾過して投与可能な組成物を提供することができる。
【0061】 抗体 好ましい実施態様において、本発明の担体化合物は、モノクローナル又はポリ
クローナル抗体、又はそれらの断片(fragments)である。モノクローナル抗体の
例は、Mab 8H11、10H8、5A7、及び11F11である。そのうえ
、治療に役立つか又は画像形成のための、この複合体の残基も、抗体であること
ができる。
【0062】 一般に、ポリクローナル及びモノクローナル抗体並びに所望する抗体を生産す
ることが可能なハイブリドーマを製造するための技術は、当技術分野で周知であ
る(Campbell,A.M., Monoclonal Antibodies Technology: Laboratory Techniqu es in Biochemistry and Molecular Biology , Elsevier Science Publishers,
アムステルダム, オランダ(1984);St.Grothら、J. Immunol. 35: 1〜21
(1990);Kohler 及び Milstein, Nature 256: 495〜497(1975))、
トリオーマ(trioma)技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら、Immunolo
gy Today 4: 72(1983);Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer The rapy , Alan R.Liss, Inc.(1985)中、77〜96頁)。
【0063】 抗体を生産することが公知であるいずれかの動物(マウス、ウサギ、等)は、
ペプチド、例えば、上記受容体分子p185HER−2タンパク質で免疫されう
る。免疫処置の方法は、当技術分野では周知である。そのような方法は、そのペ
プチドの皮下又は腹膜内注射を含む。当業者は、免疫処置のために使用されるペ
プチドの量が、免疫される動物、そのペプチドの抗原性、及び注射の場所に基づ
いて変化するだろうことを認めるだろう。免疫原として使用されたこのペプチド
は、ペプチドの抗原性を増加するために、修飾され、又はアジュバントとともに
投与されることができる。ペプチドの抗原性を増加する方法は、当技術分野で周
知であり、さらに抗原を非相同タンパク質(例えば、グロブリン又はβ−ガラク
トシダーゼ)と連結する(coupling)こと、又は免疫処置の間のアジュバントの封
入体の経由を含むが、これらに限定されない。
【0064】 モノクローナル抗体のためには、免疫された動物から脾臓細胞を取り出し、ミ
エローマ細胞、例えばSP2/0−Ag14ミエローマ細胞と融合し、さらに、
モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞になるようにせしめる。当業
界で周知の多くの方法のいずれか1つが、所望する特性を有する抗体を生産する
ハイブリドーマ細胞を同定するために使用されうる。これらは、ELISA分析
、ウエスタンブロット解析、又はラジオイムノアッセー(radioimmunoassay)でそ
のハイブリドーマを選抜(screening)することを含む(Lutzら、Exp. Cell Resea
rch, 175: 109〜124(1988))。
【0065】 所望の抗体を分泌するハイブリドーマは、クローンされ、そしてクラス(class
)及びサブクラス(subclass)が、当業者に公知の方法を使用して決定される(Cam
pbell,A.M., Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Bio chemistry and Molecular Biology , Elsevier Science Publishers,アムステル
ダム、オランダ(1984))。単鎖抗体の生産のために記述された手法(米国特許第
4,946,778号)は、攻撃目標とするペプチド、例えば、p185HER −2 タンパク質に対する単鎖抗体を生産するために適用されうる。
【0066】 ミニボディ(minibodies)及びその他の修飾された抗体の生産のために記述され
た手法も、10H8及び8H11可変重又は可変軽鎖配列を含む、様々なタイプ
の抗体修飾物(antibody modifications)を生産するために適用されうる(42、
43)。
【0067】 モノクローナル抗体、ハイブリドーマ細胞、又はハイブリドーマ細胞培養組織
(cell culture)を製造するその他の方法も、周知である。例えば、Sastryら、(1
989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:5728〜5732;及び Huseら、(1989)Scienc
e, 246:1275〜1281によって記述されている、免疫学的な集積からモノクローナ
ル抗体を単離する方法を参照されたい。
【0068】 ポリクローナル抗体については、抗血清を含む抗体が、免疫処置された動物か
ら単離され、さらに上述した方法の1つを使用して、所望の特異性をもつ抗体の
存在について、ふるいにかけられた。
【0069】 本発明はさらに、上述した抗体を、検出可能な標識された形態で提供する。抗
体は、放射性同位体、アフィニティーラベル(例えば、ビオチン、アビジン等)
、酵素標識(例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリホスフ
ァターゼ等)、蛍光標識(例えばFITC又はローダミン等)、常磁性原子等の
使用によって検出可能に標識されうる。そのような標識を行うための手法は、当
業者に周知であり、例えば、以下を参照されたい(Sternberger,L.A.ら、J Hist
ochem. Cytochem. 18:315(1970);Bayer, E.A.ら、Meth. Enzym. 62:308(1979);
Engval, E. ら、Immunol. 109:129(1972); Goding, J.W. J. Immunol. Meth. 1
3:215(1976))。
【0070】 所望するならば、抗体は、抗イディオタイプ抗体(anti-idiotype antibodies)
を作成するために使用されることもでき、抗イディオタイプ抗体は、今度は、当
業界で公知であるように、免疫応答を防止するために、ヒト化(humanized)され
ることができる。ヒト化モノクローナル抗体は、特にそれらがヒトにおいて治療
上使用されることができる範囲において、マウスモノクローナル抗体をこえる特
別の利点を提供する。特に、ヒト抗体は、「外来(foreign)」抗体ほど急速に、
血液循環(circulation)から取り除かれず、外来抗原及び外来抗体と同じやり方
では免疫系を活性化しない。
【0071】 本発明の抗体は、完全なヒト抗体であることもでき、この抗体は、例えば、抗
体ファージ展示ライブラリー(antibody phage display library)からの選択によ
って生産された抗体であり、そのライブラリーは、ヒト単鎖又は二重鎖抗体、例
えば「de Haard,H.J.ら(1999)J.Biol.chem. 274:18218〜30 及び Winter,G.ら(1
994) Annu.Rev.Immunol. 12:433〜55」中に記述されたものを展示する。
【0072】 本発明の標識された抗体は、興味のある受容体分子の断片が発現されている細
胞又は組織を同定するために、インビトロ、インビボ、及びインサイチュー(in
situ)測定に使用されうる。この抗体は、治療又はその他の診断に直接使用され
ることもできる。本発明は、さらに固体支持体(solid support)上に固定された
上述の抗体を提供する。そのような固体支持体の例は、プラスチック、例えばポ
リカーボネート、複合糖質、例えばアガロース及びセファロース、アクリル樹脂
、例えばポリアクリルアミド、及びラテックスビーズ(latex beads)を含む。抗
体をそのような固体支持体に結合するための手法は、当業界で周知である(Weir
,D.M.ら、Handbook of Experimental Immunology 第4版、Blackwell Scientifi
c Publications、Oxford、England、第10章(1986);Jacoby,W.D.ら、Meth.Enz
ym.34 Academic Press、N.Y.(1974))。本発明の固定された抗体は、インビトロ
、インビボ、及びインサイチュー測定のため、並びに、抗体が結合親和性を有す
る受容体の、免疫親和性精製(immuno-affinity purification)のために使用され
うる。この抗体は、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、又はその他同様のもの
による、細胞の活性化におけるシグナル伝達経路(signaling pathways)の機能を
さらに解明するための研究で使用されることもできる。
【0073】 抗血清力価(antisera titer)は、当業界で公知のいくつかの手段を通して確定
することができ、その手段は例えば、ドットブロット(dot blot)法及び密度分析
により、さらにまたタンパク質、二次抗血清(secondary antisera)、冷エタノー
ル、又は活性炭−デキストランを使用した、放射能標識したペプチド−抗体複合
体の沈殿と、それに続くガンマ線カウンター(gamma counter)での放射能壊変速
度の測定による。もし所望するなら、最高の力価の抗血清を、アフィニティーカ
ラムで精製することもできる。具体例としては、ペプチド、例えば、受容体分子
p185HER−2が、市販入手可能な樹脂に結合され、アフィニティーカラム
を形成するために使用されることができる。抗血清サンプルが、次にそのカラム
を通され、そのペプチドに対する抗体が、そのカラムに(そのペプチドを介して
)結合する。これら結合した抗体は、力価及び特異性を定めるために、続いて溶
出され、集められ、そして溶媒留去される。
【0074】 あるモノクローナル抗体が、本発明のモノクローナル抗体の特異性を有するか
どうかを決定するための追加の方法は、問題となっている抗体のCDR領域のア
ミノ酸残基の配列を決定することである。そのCDR領域に、同一又は機能的に
等価なアミノ酸残基の配列を有する抗体分子は、同じ結合特異性を有する。ポリ
ペプチドの配列決定のための方法は、当業界で周知である。これは、異なるCD
R領域を有する抗体は、同一のエピトープに結合できないことを示唆するもので
はない。
【0075】 本発明での使用のための代表的な抗体は、無処置のイムノグロブリン(intact
immunogloburin)分子、特に無処置のイムノグロブリン分子及びパラトープ(para
tope)を含むイムノグロブリン分子の部分を含み、この部分は、Fab、Fab
’、F(ab’)、及びF(v)として当業界で公知の、そして、抗体断片(a
ntibody fragments)とも呼ばれるそれらの部分を含む。Fc受容体を欠失してい
るFab断片は可溶であり、そして血漿半減期における治療上の利点、及び可溶
なFab断片を使用する方法についての診断上の利点をもたらす。可溶なFab
断片の製造は、免疫学分野で一般に知られており、多くの方法によって達成され
うる。
【0076】 例えば、抗体のFab及びF(ab’)部分(断片)は、公知の方法によっ
て、パパイン及びペプシンそれぞれの、実質的に無処置の抗体に対するタンパク
質分解反応によって製造される。例えばセオフィロポーラス及びディクソンに対
する米国特許第4,342,566号を参照されたい。Fab’抗体部分も周知
であり、F(ab’).sub.2部分から製造され、続けて例えばメルカプト
エタノールによる、その2つの重鎖部分を架橋しているジスルフィド結合の還元
をし、さらに続けて、試薬例えばヨウ化アセトアミド(iodoacetoamide)で、得ら
れたタンパク質メルカプタンのアルキル化を行う。
【0077】 本発明のポリヌクレオチド及び核酸 本発明のヌクレオチド配列は、以下に報告する。本発明は、本明細書中に開示
したcDNA配列に対応する遺伝子も提供する。対応する遺伝子は、本明細書中
に開示した配列情報を使用して、公知の方法に従って単離されうる。そのような
方法は、適当な遺伝子ライブラリー又は遺伝子材料のその他の資源の中で、遺伝
子の同定及び/又は増幅のために、開示された配列情報からのプローブ又はプラ
イマーの製造を含む。
【0078】 本発明の組成物は、単離されたポリヌクレオチドを含むが、これらに限定され
ず、このポリヌクレオチドは、組換えDNA分子、及びクローニングされた遺伝
子又はそれらの縮重した変異体、特に天然変異体(naturally occurring variant
s)、例えば対立遺伝子変異体(allelic variants)を含む。
【0079】 本発明の核酸 配列番号1は、Mab 8H11の可変軽領域(variable light region)をエ
ンコードし、配列番号2は、Mab 8H11の可変重領域(variable heavy re
gion)をエンコードし、配列番号3は、Mab 10H8の可変軽領域をエンコ
ードし、そして配列番号4は、Mab 10H8の可変重領域をエンコードする
。具体的実施例において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号1
のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又は配列番号2のヌクレオチド配
列を含むポリヌクレオチド、又は配列番号3のヌクレオチド配列を含むポリヌク
レオチド、又は配列番号4のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むが
、これらに限定されない。本発明のポリヌクレオチドは、さらに、上に列挙した
いずれかのポリヌクレオチドの補体(complement)を含む。
【0080】 本発明はまた、本発明の複合体組成物に使用するための残基として、ポリヌク
レオチドを提供する。例えば、本発明は、遺伝子治療ベクターの、攻撃目標を定
めたデリバリーを提供する。
【0081】 本発明のポリヌクレオチドは、上に列挙したポリヌクレオチドと本質的に等価
であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも提供する。本発明は、少なく
とも約95%、さらに典型的には少なくとも約99%、そして、なおさらに典型
的には少なくとも約99.5%の、上に列挙したポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドに対する配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオ
チドの補体(complement)も提供する。このポリヌクレオチドは、DNA(遺伝子
のもの(genomic)、cDNA、増幅されたもの(amplified)、又は合成されたもの
(synthetic))、又はRNAであることができる。そのようなポリヌクレオチド
を入手するための方法及びアルゴリズム(algorithms)は、当業者に周知であり、
例えば、ハイブリッド形成条件を決定するための方法を含むことができ、そのハ
イブリッド形成条件は、所望する配列同一のポリヌクレオチドを普通に単離する
ことができるものである。
【0082】 本発明によるポリヌクレオチドは、確立された組換えDNA技術により、多く
の他のヌクレオチド配列のいずれかと連結されることができる(Sambrook Jら、
(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labora
tory, NYを参照されたい)。ポリヌクレオチドに連結するための有用なヌクレオ
チド配列は、ベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ラムダ・ファージ誘導
体(lambda phage derivatives)、ファージミド(phagemids)、及びその他同様の
もので、当技術分野で周知のものを含む。従って、本発明は、本発明のポリヌク
レオチドを含むベクター及びそのポリヌクレオチドを含有する宿主細胞をも提供
する。一般に、ベクターは、少なくとも1つの器官中で機能する複製起点、適当
な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び宿主細胞のための選択マーカー(selectabl
e marker)を含む。本発明によるベクターは、発現ベクター(expression vector)
、複製ベクター(replication vector)、プローブ産生ベクター(probe generatio
n vector)、配列決定ベクター(sequencing vector)を含む。本発明による宿主細
胞は、原核又は真核細胞であることができ、さらに単細胞生物又は多細胞生物の
部分であることができる。
【0083】 本発明の範囲の中に入る配列は、本明細書中に記述された特定の配列に限定さ
れないばかりでなく、それらの対立遺伝子変異体(allelic variations)も含む。
例えば、対立遺伝子変異体は、配列番号1で提供された配列、それらを代表する
断片(representative fragment)、あるいは配列番号1又は配列番号1のヌクレ
オチド226〜2836と少なくとも98%同一のヌクレオチド配列を、別のヒ
トアイソレート(human isolate)からの配列と比較することにより、普通に決定
されることができる。対立遺伝子変異体は、さらに典型的には、配列番号1と少
なくとも99%同一であり、さらにより典型的には、配列番号1と99.8%同
一である。さらに、コドンの可変性に適応するために、本発明は、本明細書中に
開示した特定のORFsが含むものと同じアミノ酸配列をコードする核酸分子を
含む。言い換えれば、ORFのコード領域中で、1つのコドンの別なコドンへの
置換で、同じアミノ酸をコード化するものが、明らかに予想される。本明細書中
に開示された全ての特定配列は、特定の断片、例えばOFRを両方向(すなわち
、両鎖(both strands)の配列を決定する)で再度配列を決定することによって、
誤りを容易に検査されうる。
【0084】 本発明はさらに、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、又はそ
れらの断片の配列を有する核酸を含む、組換え構成体(recombinant constructs)
を提供する。本発明の組換え構成体は、ベクター、例えばプラスミド又はウイル
スベクターを含み、そのベクター中に上述の配列またはそれらの断片の1つの配
列を有する核酸が、前進(forward)又は逆方向(reverse orientation)で挿入され
ている。本発明のORFsの1つを含むベクターの場合、そのベクターは、例え
ば、そのORFに操作可能に連結されたプロモーターを含む制御配列を、さらに
含むことができる。
【0085】 多数の適当なベクター及びプロモーターが当業者に公知であり、さらに本発明
の組換え構成体を造り出すために市販入手可能である。以下のベクターが具体例
として提供される。バクテリア:pBs、ファージスクリプト(phagescript)、
PsiX174,pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、
pNH16a、pNH18a、pNH46a(ストラータジーン(stratagene))
;pTrc99A、pKK223−3、pKK233−3、pDR540、pR
IT5(ファルマシア(Pharmacia))。真核(Eukaryotic):pWLneo、ps
V2cat、pOG44、PXTI、pSG(ストラータジーン)pSVK3、
pBPV、pMSG、pSVL(ファルマシア)。
【0086】 本発明の核酸配列は、記述された核酸の変異体をコード化する配列に、さらに
向けられている。これらのアミノ酸配列変異型(amino acid sequence variants)
は、当業界で公知の方法により、天然又は変異型ポリヌクレオチド中に、適当な
ヌクレオチドの変更を導入することによって製造されうる。アミノ酸配列変異型
の構築には2つの変数がある:突然変異の場所及び突然変異の性質である。核酸
のアミノ酸配列変異型は、好ましくは、天然に存在しないアミノ酸配列を与える
ようにポリヌクレオチドを変異させることによって構築される。これらのアミノ
酸の変更は、その核酸中で他の種と異なる場所(可変部位(variable positions)
)、又は高度に保存されている領域(定常部(constant regions))中で行われる
ことができる。そのような場所(locations)の部位(sites)は、典型的には、一連
で、例えば、最初に保存的な選択を伴う置換により(例えば、別な疎水性アミノ
酸に対し、疎水性アミノ酸)、さらにより離れた選択を伴う置換(例えば、荷電
した(charged)アミノ酸に対し、疎水性アミノ酸)により修飾されるであろうし
、さらに目標とする場所で欠失又は挿入を行うことができる。アミノ酸配列の欠
失は、通常、約1〜30残基の範囲であり、好ましくは、約1〜10残基であり
、かつ典型的には切れ目なしである。アミノ酸の挿入は、1〜100以上の残基
の長さにわたるアミノ基及び又はカルボン酸末端連結物(fusions)、並びに単一
又は多数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。配列内挿入は、一般に約1〜10
アミノ酸残基の範囲に及ぶことができ、好ましくは1〜5残基である。末端挿入
の例は、分泌のため、又は別の宿主細胞中での細胞内攻撃目標設定(intracellul
ar targeting)のために必要な非相同シグナル配列(heterologous signal sequen
ce)を含む。
【0087】 好ましい方法中、新規な核酸をコード化するポリヌクレオチドは、部位特異的
突然変異誘発(site-directed mutagenesis)により変化される。この方法は、所
望のアミノ酸変異体のポリヌクレオチド配列をコード化するオリゴヌクレオチド
配列、並びに、変更される部位の一方の側に安定な重複部位(stable duplex)を
形成するための、荷電したアミノ酸の両側に充分隣接したヌクレオチドを使用す
る。一般的に、部位特異的突然変異誘発の手法は、当業者に周知であり、さらに
この手法は、出版物、例えば、Edelmanら、DNA 2:183(1983) によって例示さ
れている。ポリヌクレオチド配列中の部位特異的変更を起こすための万能かつ有
効な方法は、Zoller及びSmith、Nucleic Acids Res.10:6487〜6500(1982)によっ
て出版された。PCRも、新規な核酸のアミノ酸配列変異体を造り出すために使
用されうる。少量の鋳型DNAが出発物質として使用される場合に、その鋳型D
NA中の対応する領域と、配列がわずかに異なるプライマーは、所望するアミノ
酸変異体を生成することができる。PCR増幅は、そのプライマーによって特定
される部位でポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドテンプレートと異な
る生産物DNA断片(product DNA fragments)の集団をもたらす。この生産物D
NA断片は、プラスミド中の対応する領域を置換し、さらにこれは所望のアミノ
酸変異体を与える。
【0088】 アミノ酸変異体を造り出すための別な手法は、Wellsら、Gene 34:315(1985)中
に記述されている、カセット突然変異技術(cassette mutagenesis technique)で
あり;さらに、当業界で周知のその他の突然変異技術、例えば、Sambrookらの上
記文献及び Current Protocols in Molecular Biology、Ausubelら上記文献の中
にある技術である。遺伝暗号本来の縮重により、本質的に同一又は機能的に等価
なアミノ酸配列をコード化するその他のDNA配列が、これらの新規な核酸のク
ローン化及び発現のために本発明を実施する場合に使用されうる。そのようなD
NA配列は、厳密な条件下で、その適当な新規核酸配列にハイブリッド形成する
ことができるものを含む。
【0089】 治療に役立つ組成物 本発明の複合体は、疾患の治療のための他の組成物及び方法と結合して使用さ
れうる。例えば、腫瘍は、本発明の複合体と結びつけた手術、放射線照射、又は
化学療法で通常通り治療されうる。さらに、本発明の複合体は、医薬として許容
される希釈剤、及び場合により徐放性基質(sustained-release matrices)、例え
ば生分解性高分子と組み合わせて、治療に役立つ組成物を形成することができる
【0090】 本明細書中で使用するような徐放性基質は、酵素による又は酸−塩基加水分解
による加水分解、又は溶解によって分解される材料、通常高分子から作られた基
質である。ひとたび体内に挿入されると、この基質は、酵素及び体液による作用
を受ける。徐放性基質は、好ましくは生体適合性材料、例えば、リポソーム、ポ
リラクチド(polylactides)(ポリ乳酸)、ポリグリコライド(polyglycolide)(
グリコール酸の高分子)、ポリラクチドグリコライドコポリマー(polylactide c
o-glycolide)(乳酸とグリコール酸の共重合体)、ポリ無水物(polyanhydrides)
、ポリ(オルソ)エステル(poly(ortho)ester)、ポリペプチド、ヒアルロン酸、
コラーゲン、コンドロイチン硫酸、環状カルボン酸(carbocyclic acid)、脂肪酸
、リン脂質、多糖(polysaccharides)、核酸、ポリアミノ酸、アミノ酸、例えば
、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシン、ポリヌクレオチド、ポリビニル
プロピレン、ポリビニルピロリドン、及びシリコーンから選ばれる。好ましい生
分解性基質は、ポリラクチド、ポリグリコライド、又はポリラクチド−ポリグリ
コライドコポリマー(乳酸とグリコール酸の共重合体)のいずれか1つの基質で
ある。
【0091】 上述又はその他の治療で使用する場合、本発明の複合体の1つの治療に役立つ
量は、そのような形態が存在する場合は純粋な形態で、又は医薬として許容でき
る塩の形態で使用されうる。本発明の化合物の「治療に有効な量」は、血管由来
の疾患(angiogenic disease)を治療するために(例えば、腫瘍の増殖を制限する
ため、又は腫瘍の転移を遅延又は遮断するために)、いずれの医学的治療に対し
ても適用可能な合理的な利益/リスク比のもとでの、充分な量の化合物を意味す
る。しかしながら、本発明の複合体の合計した1日当たりの使用量は、主治医に
より、いわゆる医学的判断(medical judgement)の範囲内で決定されるだろう。
いずれかの特定の患者のための具体的な治療に有効な投与量レベルは、多くの因
子に依存するであろうし、その因子は、治療される疾患及びその疾患の重大さ;
使用される具体的な化合物の活性;使用される具体的な組成物;その患者の年齢
、体重、全身的な健康状態、性別、及び食事;投与の時間;投与の経路、及び使
用される具体的な化合物の排出速度;治療の継続期間;使用される具体的な化合
物と組み合わせて又は偶然一緒に使用される薬;及び医療分野で周知のその他同
様の因子を含む。例えば、所望する治療効果を達成するために必要な投与量より
少ないレベルで複合体の投与量を開始し、さらに所望の効果が達成されるまで投
与量を徐々に増加することは、本分野の技術において効果的である。
【0092】 本発明の複合体組成物は、無機又は有機酸から誘導された塩の形で使用される
ことができる。これらの塩は、以下:酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、ク
エン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩
、酪酸塩、樟脳塩(camphorate)、カンファースルホン酸塩、ジグルコン酸(diglu
conate)、グリセロリン酸塩(glycerophosphate)、ヘミサルフェート(hemisulfat
e)、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ素
水素酸塩、2−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩(イソチオネート(isothionate
))、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、2−ナフタ
レンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パモエート(pamoate)、ペクチン塩(pectinate)
、過硫酸塩(persulfate)、3−フェニルプロピオン酸、ピクリン酸塩、ピバル酸
塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、リン酸塩、グル
タミン酸塩、炭酸水素塩(bicarbonate)、p−トルエンスルホン酸塩、及びウン
デカン酸塩を含むがこれらに限定されない。水又は油に可溶又は分散可能な製品
が、これらによって得られる。
【0093】 医薬として許容される付加塩を形成するために使用できる酸の例は、例えば塩
酸、硫酸、及びリン酸等の無機酸、並びにマレイン酸、コハク酸、及びクエン酸
等の有機酸を含む。その他の塩は、アルカリ又はアルカリ土類金属、例えばナト
リウム、カリウム、カルシウム、又はマグネシウム、あるいは他の有機塩基との
塩を含む。本発明の複合体組成物の好ましい塩は、リン酸塩、トリス(tris)、及
び酢酸塩を含む。
【0094】 ヒト又は下等動物に投与される、本発明の複合体組成物の1日当たりの合計投
与量は、約0.001〜約1mg/患者のkg体重/日で変動することができる
。所望する場合、有効な一日当たりの投与量は、投与の目的のために、多数の投
与量に分割されることができ;したがって、1回に投与する組成物は、1日当た
りの投与量を調合するため、前記の量又はそれらの約数となる量(submultiples)
を含むことができる。
【0095】 それに代わり、本発明の複合体は、1以上の医薬として許容可能な賦形剤(exc
ipients)との併合で、関心のある複合体を含む医薬組成物として投与されること
もできる。医薬として許容可能な担体(carrier)又は賦形剤とは、非毒性固体、
半固体又は液体の増量剤(filler)、賦形薬(diluent)、カプセル化材料(capsulat
ing material)又は全てのタイプの配合補助剤(formulation auxiliary)を表す。
この組成物は、非経口で、大糟内に(intracistenally)、膣内に、腹腔内に、局
所的に(例えば、粉末、軟膏、液滴(drop)、経皮性絆創膏(transdermal patch)
による)、直腸に(rectally)、又はほおに(buccally)投与されることができる。
本明細書中で使用される「非経口(parenteral)」の用語は、投与の方法を表し、
この方法は、静脈内(intravenous)、筋肉内(intramuscular)、腹腔内(intraper
itoneal)、胸骨内(intrasternal)、皮下(subcutaneous)、及び関節内(intraart
icular)注射又は注入(infusion)を含む。
【0096】 非経口注入のための医薬組成物は、医薬として許容可能な滅菌水溶液又は非水
溶液、分散物(dispersions)、懸濁物(suspensions)、又は乳化物(emulsions)、
並びに使用直前に、滅菌した注射可能な溶液又は分散物中に再構築するための滅
菌した粉末を含む。適した水溶液又は非水溶液担体、希釈剤、溶媒、又は賦形剤
の例は、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリ
コール、ポリエチレングリコール、及びその他同様のもの)、カルボキシメチル
セルロース及びそれらの適当な混合物、植物油(例えば、オリーブオイル)、及
び注入可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルを含む。適当な流動性は、
例えば、レシチンのような被覆材料の使用により、分散物の場合は必要とされる
粒子径の管理により、さらに界面活性剤の使用により維持されることができる。
【0097】 これらの組成物は、アジュバント(adjuvants)、例えば保存薬、湿潤剤、乳化
剤、及び分散剤を含むこともできる。微生物の活動の防止は、多くの抗菌性及び
抗真菌性薬、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、及
びその他同様のものの含有によって保証されうる。等張性剤、例えば糖、塩化ナ
トリウム、及びその他同様のものを含むことも好ましいだろう。注入可能な医薬
形態の長時間にわたる吸収(prolonged absorption)は、吸収を遅延させる薬剤、
例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの含有によって達成されうる
【0098】 蓄積注射可能な形態(injectable depot forms)は、生分解性高分子、例えばポ
リラクチド−ポリグリコライド(polylactide-polyglycolide)、ポリ(オルソエ
ステル)、及びポリ(無水物)(poly(anhydride))の中に、薬物が微小に被包さ
れた基材(matrices)を形成することによって作られる。高分子に対する薬物の比
、及び使用される具体的な高分子の性質に依存して、薬物放出の速度が調節でき
る。蓄積注射可能な配合物はまた、薬物を、生体組織と適合性のあるリポソーム
又は微小エマルジョン(microemulsions)中に被包することによって製造される。
【0099】 注射可能な配合物は、例えば、細菌保持フィルター(bacterial-retaining fil
ter)を通しての濾過により、又は滅菌した固体組成物の形態中に殺菌剤を混合す
ることにより滅菌されることができ、この固体組成物は、使用直前に、滅菌水又
はその他の滅菌した注射可能な媒体中に溶解又は分散されることができる。
【0100】 局所投与(topical administration)は、肺及び目の表面を含んだ、皮膚又は粘
膜への投与を含む。吸入のための組成物を含む、局所投与のための組成物は、乾
燥粉末として製造されることができ、この粉末は、加圧することも、加圧しない
こともできる。非加圧の粉末組成物中では、微細に分割した形態の活性成分が、
例えば直径で最大100μmまでの大きさを有する粒子を含む、さらに大きな医
薬として許容可能な不活性担体と混合して使用されうる。適当な不活性担体は、
糖、例えばラクトースを含む。望ましくは、活性成分の粒子の、質量で少なくと
も95%が、0.01〜10μmの範囲にある効果的な粒子の大きさを有する。
【0101】 それに代わり、この組成物は、加圧され、さらに圧縮ガスを含むことができ、
ガスは例えば、窒素又は液化圧縮不活性ガス(liquified gas propellant)である
。この液化圧縮不活性ガス媒体及び実際の全組成物は、その活性成分が相当程度
その中に溶解しないものであることが好ましい。この加圧した組成物はまた、界
面活性剤、例えば液体又は固体のノニオン界面活性剤を含むことができ、あるい
は固体アニオン界面活性剤でもよい。固体アニオン界面活性剤を、ナトリウム塩
の形態で使用することが好ましい。
【0102】 局所投与のさらなる形態は、目に対してである。本発明の複合体は、医薬とし
て許容可能な眼用の媒体中にデリバリーされ、それでこの複合体が、充分な時間
の間、眼の表面と接触し続け、この複合体を眼の角膜及び内部領域、例えば、前
眼房、後眼房、硝子体、房水、硝子体液、角膜、虹彩/毛様体、水晶体、脈絡膜
/網膜、及び強膜に浸入せしめる。医薬として許容可能な眼用媒体は、例えば、
軟膏、植物油、又は被包する材料(encapsulating material)であることができる
。それに代わり、本発明の複合体は、硝子体及び房水中に直接注入されることも
できる。
【0103】 直腸又は膣投与のための組成物は、好ましくは坐剤であり、これは本発明の複
合体を、適当な非刺激性賦形剤又は担体、例えば、カカオバター、ポリエチレン
グリコール、又は坐薬用蝋(suppository wax)と混合することによって製造する
ことができ、この坐薬用蝋は、室温で固体であるが、体温では液体であり、その
ため、直腸又は膣内で溶解し、活性複合体を放出する。
【0104】 本発明の複合体はまた、リポソームの形態で投与されることができる。本分野
で公知のように、リポソームは、通常、リン脂質又はその他の脂質物質(lipid s
ubstance)から誘導される。リポソームは、水性媒体中に分散された、モノ又は
マルチラメラ(multi-lamellar)水和液晶によって形成される。いずれかの非毒性
、生理学的に許容され、かつ代謝可能な脂質であり、リポソームを形成可能なも
のが使用されうる。リポソーム形態中の本発明の組成物は、本発明の複合体に加
えて、安定剤、保存剤、賦形剤、及びその他同様のものを含むことができる。好
ましい脂質は、リン脂質及びホスファチジルコリン(レシチン)であり、天然及び
合成のものの両方である。リポソームを形成するための方法は、当業界で公知で
ある。例えば、Prescott編集、Methods in Cell Biology, 第XIV巻、Academic P
ress, New York, N.Y.(1976)、33頁以下参照されたい。
【0105】 本発明の複合体は、単独の活性医薬として投与されることができる一方、これ
らはまた、1以上の薬剤で、血管由来の疾患を治療するために、患者に一般に投
与されるものと組み合わせて使用することもできる。例えば、本発明の複合体は
、腫瘍を従来の細胞毒性治療、例えば化学物質及び放射線に対して、より一層敏
感にするために、短期間有効である。本発明の複合体はまた、現存する細胞毒性
アジュバント抗ガン治療(cytotoxic adjuvant anti-cancer therapies)の有効性
を高める。本発明の複合体はまた、その他の抗血管形成薬(antiangiogenic agen
ts)と併合され、それらの有効性を高めること、又は、その他の抗血管形成薬と
併合され、さらにその他の細胞毒性薬(cytotxic agents)と共に投与されること
ができる。特に、固形腫瘍の治療に使用される場合、本発明の複合体は、以下の
ものと共に投与されることができるが、それは、IL−12、レチノイド(retin
oids)、インターフェロン、アンジオスタチン(angiostatin)、エンドスタチン(e
ndostatin)、サリドマイド(thalidomide)、トロンボスポンジン−1(thrombospo
ndin-1)、トロンボスポンジン−2(thrombospondin-2)、カプトプリル(captopry
l)、抗腫瘍性薬、例えば、アルファ・インターフェロン、COMP(シクロホス
ファミド(cyclophosphamide)、ビンクリスチン(vincristine)、メトトレキセー
ト(methotrexate)、及びプレドニゾン(prednisone))、エトポサイド(etoposide)
、mBACOD(メトトレキセート(methotrexate)、ブレオマイシン(bleomycin
)、ドキソルビシン(doxorubicin)、シクロホスファミド(cyclophosphamide)、ビ
ンクリスチン(vincristine)、及びデキサメタゾン(dexamethasone))、PRO−
MACE/MOPP(プレドニゾン(prednisone)、メトトレキセート(methotrex
ate)(w/ロイコビン(leucovin)の助け)、ドキソルビシン、シクロホスファミド
、タキソール(taxol)、エトポサイド/メクロルエタミン(mechlorethamine)、ビ
ンクリスチン、プレドニゾン、及びプロカルバジン(procarbazine))、ビンクリ
スチン、ビンブラスチン(vinblastine)、アンジオインヒビン(angioinhibins)、
TNP−470、ペントサン・ポリサルフェート(pentosan polysulfate)、プレ
ートレット・ファクター4(platelet factor 4)、アンジオスタチン、LM−6
09、SU−101、CM−101、テクガラン(techgalan)、サリドマイド、
SP−PG、及びその他同様のもの、並びに放射線照射(radiation)である。
【0106】 人又はその他の哺乳動物宿主に対し、単一又は分割した投与量で投与されるで
あろう、本発明の組成物の合計の一日当たり投与量は、例えば、一日当たり0.
0001〜300mg/kg(体重)、さらにより一般的には、1〜300mg
/kg(体重)の量であることができる。
【0107】 血管由来の疾患の抑制、治療、又は予防のために、本発明の複合体と併合しう
る薬は、上に列挙したものに限られず、血管由来の疾患の治療又は予防のために
有用な、いかなる薬も原則として含まれることが、理解されるだろう。
【0108】 疾患を治療する方法 本発明は、多くの疾病状態の治療のための方法を提供する。一般に、この方法
は、本発明の複合体を患者に投与することを含む。好ましい実施態様においては
、当業者が理解するであろうとおり、この複合体は、治療上有効な量を、上で議
論したような医薬として許容可能な担体と共に投与される。治療されるべき疾病
状態は、とりわけ、ガン、乾癬(psoriasis)、黄斑変性(macular degeneration)
、神経性疾患(neurological disease)、又は組織の再狭窄(restonosis in a tis
sue)である。治療されるべきガンは、結腸直腸ガン、乳ガン、胃ガン、食道ガン
、小細胞肺ガン(small cell lung carcinoma)、及びさまざまなタイプのリンパ
腫、例えばバーキットリンパ腫、及びB小胞細胞リンパ腫(B follicular cell l
ymphoma)を含むが、これらに限定されない。
【0109】 いくつかの実施態様において、本発明の複合体は、組織中の腫瘍の増殖又は転
移を阻害するために投与される。この腫瘍は、黒色腫(melanoma)、癌腫(carcino
ma)、肉腫(sarcoma)、線維肉腫(fibrosarcoma)、神経膠腫 (glioma)、星細胞腫(
astrocytoma)である。
【0110】 本発明の複合体はまた、血管形成(angiogenesis)を阻害するために使用される
こともでき、血管形成は、多くの疾病プロセスで重要な役割を演じている。血管
形成阻害剤として、本発明の複合体は、原発及び転移固形腫瘍の両者の治療に有
用であり、この腫瘍は、乳房、結腸、直腸、肺、口腔咽頭部、咽頭喉頭部、食道
、胃、膵臓、肝臓、胆嚢及び胆管、小腸、尿路(腎臓、膀胱、尿路上皮を含む)
、女性生殖管(子宮頸部、子宮、及び卵巣、並びに絨毛癌、妊娠性栄養膜疾患(g
estational trophoblastic disease)を含む)、男性生殖管(前立腺、精嚢、睾
丸、生殖細胞腫瘍を含む)、内分泌腺(甲状腺、副腎、及び下垂体)、及び皮膚
、並びに、血管腫、黒色腫、肉腫(骨及び軟組織から生じるもの、並びにカポジ
肉腫を含む)、さらに、脳、神経、眼、及び髄膜の腫瘍(星細胞腫、神経膠腫、
グリア芽細胞腫、網膜芽細胞腫、神経腫、神経芽細胞腫、神経鞘腫、髄膜腫を含
む。上記複合体はまた、造血悪性疾患(hetatopoietic malignancies)から生じる
固形腫瘍、例えば、白血病(すなわち、緑色腫、プラスマ細胞腫及びそのプラー
ク(plaques)、並びに菌状息肉腫の腫瘍及び皮膚T−細胞リンパ腫/白血病)の
治療、並びに、リンパ腫(ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫の両者)の
治療に有効であることができる。加えて、これらの複合体又はそれらの発現をコ
ード化する遺伝子は、上述した腫瘍からの転移の予防に有用であることができ、
それは、単独で使用された場合、又は放射線治療及び/又はその他の化学療法に
役立つ薬と共に使用された場合のいずれかである。
【0111】 本発明の原理は、本発明が全ての哺乳動物に関して有効であることを示すこと
が理解されるべきであり、全ての哺乳動物が、「患者」の用語に含まれることが
意図されるけれども、本発明において、その多くの実施態様で治療される患者は
、好ましくは人間の患者である。そのような患者は、例えば、ブタ、ウシ、ウマ
、ヤギ、ヒツジ、ラバ、ロバ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、及びラットである
ことができる。
【0112】 追加の関連する実施態様において、治療されるべき組織は、固形腫瘍、転移、
皮膚ガン、乳ガン、血管腫又は血管線維腫、及びその他同様のものを有する患者
の腫瘍組織である。本発明の方法によって治療可能な、典型的な固形腫瘍組織は
、肺、膵臓、乳房、子宮、唾液腺、胃、結腸、喉頭、卵巣、カポジ肉腫、及びそ
の他同様の組織を含む。
【0113】 関連する実施態様において、本発明は、その他の治療、例えば、固形腫瘍にむ
けた、そして転移の定着の制御のための従来の化学治療又は放射線治療と共に行
う本方法の実施を意図する。本発明の複合体の投与は、典型的には、化学治療の
間又はその後に実施される。加えて、転移に対する予防として固形腫瘍を除去し
た手術の後、この複合体を投与することが好ましい。
【0114】 本発明の複合体の投与のための投与量の範囲は、その複合体の形態、及びその
効能に依存し、さらに疾病現象が改善される好ましい効果を生み出すために充分
多い量である。この投与量は、不都合な副作用、例えば過粘稠度症候群、肺水腫
、うっ血性心不全、及びその他同様のものを引き起こすほどには多くするべきで
はない。一般に、投与量は、患者の年齢、状態、性別、及び疾病の程度で変化す
るだろうし、それは当業者によって決定されることができる。投与量はまた、い
ずれかの合併症の事態において、個々の医師によって調節されることができる。
【0115】 本発明の複合体は、注射又は時間をかけた漸次の注入により、非経口投与され
ることができる。治療されるべき組織は、典型的には、全身投与により体内でア
クセスされることができ、そのため最も頻繁に、治療に役立つ組成物の静脈内投
与によって治療されうるけれども、その他の組織及びデリバリーの手段は、攻撃
目標に定めた組織が標的分子を含む可能性がある場所を考慮される。従って、モ
ノクローナル抗体、ポリペプチド、及びそれらの誘導体を含む本発明の複合体は
、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内(intracavity)、経皮、局所、眼内(intr
aoculary)、経口、鼻腔内に投与されることができ、さらに蠕動に似た手段によ
ってデリバリーされることができる。
【0116】 本発明の組成物は、例えば、単位投与量の注射によって、普通に静脈内に投与
される。本発明の組成物との関連において使用されたとき、「単位投与量(unit
dose)」の用語は、患者に対する単位投与量として適当な、物理的に分離した単
位を表し、各単位は、所望する治療効果を生み出すために計算された、あらかじ
め定めた量の活性物質を、必要とされる希釈剤(diluent)、例えば担体又は賦形
剤とともに含む。
【0117】 この複合物は、ある意味で投薬配合物と共存して、さらに治療上有効な量で投
与される。投与されるべき量及び時期は、治療されるべき患者、その活性成分を
利用するためのその患者の全身の適応力、及び所望される治療効果の程度に依存
する。投与されることを必要とする活性成分の正確な量は、医師の判断に依存し
、各個人に独自である。しかしながら、全身への適用のための適当な投与量範囲
は、本明細書中に開示され、かつ投与の経路に依存する。投与のための適当な治
療計画はまた、変動可能であるが、最初の投与に続いて、後続の注射又はその他
の投与により、1時間以上の間隔をおいて繰り返し投与されるのが典型である。
それに代わり、インビボ治療法のために特定された範囲で、血液中の濃度を維持
するために充分な、継続した静脈内注入が企図される。
【0118】 検出方法 本発明の複合体はまた、組織中の疾患を検出するために適している。好ましい
実施態様では、この組織はエキソビボ(ex vivo)である。例えば、この複合体が
抗体である場合、この複合体は、組織をエキソビボで染色するための免疫組織化
学的技術において使用されることができる。免疫組織化学的技術、例えば免疫染
色及びELISAは、例えば、Receptor Binding Techniques, Methods in Mole cular Biology . 106. M.Keen編、Humana Press, 1999; Brooksら、(1998) Cell
92:391〜400; Brooksら、(1996) Cell 85:683〜693; 及びBrooksら(1993)J.Cell
.Biol. 122:1351〜1359の中に記述される。
【0119】 ひとたび標的組織に結合した本発明の複合体は、直接又は間接に検出されるこ
とができる。直接の検出は、残基を含む複合体について実施されうるが、その残
基は、検出可能な標識、例えば蛍光色素、放射性標識、常磁性重金属、又は診断
用色素(diagnostic dye)である。
【0120】 インビボ(in vivo)検出のためには、検出可能に標識された複合体を使用する
ことが好ましい。この標識された複合体は、患者に、静脈内、筋肉内、経皮、滑
膜内、腫瘍内、眼内、鼻腔内、包膜内、局所的に、又は経口で投与される。患者
体内での検出のために適した標識が、特に好ましい。例えば、常磁性標識された
複合体は、磁気共鳴画像法(magnetic resonance imaging)により検出されること
ができる。放射性標識された複合体もまた、検出可能である。
【0121】 その他の応用 本発明はまた、本発明の担体化合物を選別するための方法を提供する。好まし
い実施態様において、そのような方法は、想定した担体を提供し、p185HE R−2 に結合するためのその想定した担体化合物の(第1)親和性(first affin
ity)を測定し、さらに、p185HER−2と結合することに対する抗体の(第
2)親和性を測定することを含む。第2親和性が、第1親和性未満の場合に、想
定した担体は、本発明の担体として選択される。多くの実施態様において、第2
親和性は、抗体について測定され、その抗体はMab 8H11、Mab 10
H8、Mab 5A7、及びMab 11F11を含む。
【0122】 さらに、本発明は、想定した担体化合物の内部移行潜在能力を決定するために
提供される。これらの方法においては、NIH/189細胞によって内部移行さ
れたMab 8H11の分画(fraction)は、NIH/189細胞によって内部移
行された想定した担体の分画と比較される。NIH/189細胞によって内部移
行された想定した担体の分画が、NIH/189細胞によって内部移行されたM
ab 8H11の断片より高い場合は、この想定した担体の内部移行潜在能力は
高い。別の実施態様においては、Mab 10H8は、この想定した担体の内部
移行潜在能力を決定するために使用される。
【0123】 本発明の担体化合物は、同位体、酵素、担体タンパク質、細胞毒性薬、蛍光分
子、化学発光、生物発光、及び多様な応用のためのその他の化合物であることが
できる。例えば、担体化合物は、抗血清に結合する能力を試験することを容易に
するため、又は、関連する受容体をもつ細胞の類(cell type)を検出するために
標識することができる。結合する技術は、一般に、ペプチドのアミノ酸上の利用
可能な官能基に基づいて選択されるが、その官能基は、アミノ、メルカプト(sul
fhydral)、カルボキシル、アミド、フェノール、及びイミダゾール基を含むが、
これらに限定されない。そのような結合(couplings)を達成するために使用され
る多くの反応剤は、特に、グルタルアルデヒド、ジアゾ化ベンジジン、カルボジ
イミド、及びp−ベンゾキノンを含む。
【0124】 カップリング反応の有効性は、その具体的な反応に対して適当な異なる技術を
使用して決定される。例えば、担体化合物をI125で標識することは、高い特
異的活性の、クロラミンT及びNaI125を使用して達成されることができる
。この反応は、メタ亜硫酸水素ナトリウム(sodium metabisulfite)で停止され、
さらに混合物は、使い捨てのカラムで脱塩される。標識されたペプチドは、カラ
ムから溶離され、分画が集められる。各分画から一部試料をとり、放射能がガン
マ線カウンターで測定される。この方法で、標識された担体化合物が得られ、そ
れは未反応のNaI125を含まない。
【0125】 細胞の内部移行を容易にする受容体の測定のためのキットはまた、本発明の一
部として企図される。最高の力価及び特異性をもち、さらに血漿の抽出物、組織
、及び細胞培養媒体中で、受容体分子を検出できる抗血清は、受容体の迅速で、
信頼でき、高感度で、かつ特異的な測定及び検出のための測定キット(assay kit
s)を確立するために使用されることができる。これらの測定キットは、以下の技
術:競合的(competitive)及び非競合的測定法(non-competitive assays)、ラジ
オイムノアッセイ(radioimmunoassay)(RIA)、生物発光及び化学発光測定法
、蛍光定量的測定法(fluorometric assay)、サンドイッチ測定法(sandwich assa
ys)、免疫放射線測定法、ドットブロット法(dot blots)、ELISAを含む酵素
結合測定法(enzyme linked assays)、ミクロタイタープレート法(microtiter pl
ates)、尿素又は血液の迅速モニタリング(monitoring)のための酵素を被覆した
細片(antibody coated strip)又は測定棒(dipsticks)、及び免疫組織化学を使用
することができるが、これらに限定されない。それぞれのキットに対して、測定
の範囲、感度、正確さ、信頼性、特異性、生産性は、当業者に周知の手段で確立
される。
【0126】 別のキットは、組織又は細胞中で、受容体分子を視覚化又は場所をつきとめる
ために使用されることができる。免疫組織化学的技術及びキット、例えばそのよ
うな技術を使用するものは、当業者に周知である。そのようなキットは、受容体
に対する抗血清を提供し、血清、及び蛍光分子、例えば蛍光性色素イソチオシア
ネートに結合され、又は一次抗血清(primary antiserum)を視覚化するために使
用されるいくつかのその他の試薬に結合された二次抗血清(secondary antiserum
)をブロッキング(blocking)するかもしれない。この技術を使用して、生検材料
の腫瘍が、そのペプチド受容体の存在について検査されうる。
【0127】 実施例 以下の実施例は、本発明を説明するために役立つ。分析方法の選択、並びに試
薬の濃度、温度、及びその他の変数の値は、本発明の応用を例示するためだけで
あり、これらの制限と考えるべきではない。
【0128】 特に実施例は、攻撃目標を定めた遺伝子治療及び免疫治療が、表面受容体への
連結の後、ウイルスの戦略、及び細胞の内部移行に対する生物学的毒素(biologi
cal toxin)を利用することを例示する。受容体介在エンドサイトーシス(recepto
r-mediated endocytosis)は、ベクター及び毒素の内部移行の最も普通の方法で
ある(31、32)。遺伝子治療及び免疫治療のための合理的な細胞特異的ベク
ターの設計は、したがって、標的細胞によって発現された細胞表面抗原、例えば
P185HER−2に向けたモノクローナル抗体の開発を必要とする(16、1
8、33)。さらに、これらのモノクローナル抗体の内部移行の潜在能力は、遺
伝子治療又は免疫治療ベクターの再攻撃目標設定の前に測定されるべきであり、
それは細胞下の作用部位への遺伝子又は毒素の有効なデリバリーを確実にするた
めである。ここで、ラジオイムノアッセイが、2つの新規なモノクローナル抗体
を同定するために使用されたが、これらのモノクローナル抗体は、細胞表面受容
体と結合した後、内部移行されたが、それゆえに、リソソーム内経路を通じた標
的細胞中への遺伝子又は毒素のデリバリーにとって有用であることができる。
【0129】 いくつかのモノクローナル抗体は、実験系中でリガンドの効果をまねる。ラッ
トp185受容体に対して向けられたモノクローナル抗体は、受容体の二量化、
ホスホリル化、及びラットp185の下方制御(downregulation)を引き起こすが
、一価のFab’は引き起こさない(34)。別のp185HER−2モノクロ
ーナル抗体は、受容体介在エンドサイトーシスを受けることが電子顕微鏡によっ
て示されており、これはp185HER−2を過剰発現しているNIH 3T3
細胞の膜でのキャップ形成(capping)に続いて起こる。細胞内輸送は、以前、膜
結合オルガネラ(organelles)中において、その他のモノクローナル抗体の免疫金
検出法(immunogold detection)により実証された(29)。この測定は、治療に
役立つモノクローナル抗体ハーセプチン(商標)に対する、マウス前駆体の細胞
下での運命を決めるために使用されたが、免疫毒素治療(immunotoxin therapies
)及び攻撃目標を定めた遺伝子治療のための実験手順中、わずかなその他のモノ
クローナルしか、内部移行について試験されていない(30、35、36)。さ
らに、使用されたラジオイムノアッセイは、リソソーム内輸送の証拠を確認して
いない。今回、迅速なラジオイムノアッセイを、p185HER−2受容体に対
する新規なモノクローナル抗体の、結合後の細胞下での運命を決定することにお
ける有用性を試験した。
【0130】 受容体介在エンドサイトーシスを通しての8H11及び10H8抗体の輸送、
及びリソソームへの局在による分解の証拠を示した。8H11及び10H8測定
において、上清のTCA可溶分画で、カウントを発見した。NIH 3T3パル
スコントロール細胞(pulsed control cells)の上清中では、TCA可溶部のカウ
ントは発見されなかった。本ラジオイムノアッセイは、それゆえ、受容体介在エ
ンドサイトーシスについて評価されるべき抗体の運命を表している。
【0131】 ベクター及び毒素の将来の再攻撃目標設定は、設計された構築物の結合後の運
命を特徴づけることによって改良することができる。特に、ウイルスエンドソー
ム逃避ドメイン(viral endosome escape domains)を欠く非ウイルス抗体ベクタ
ーが、エンドソーム膜の完全性を分断することが知られるウイルス又は毒素ポリ
ペプチドと融合された(15、32、37〜39)。エンドソームの経路をとる
ことは、これらの追加されたドメインにとって、分子複合体の細胞質移行を仲介
するために決定的に重要である。抗体にとって、受容体の2量化及び内部移行を
引き起こすためには2価性(divalency)が要求されるため、2価の結合部位が、
受容体介在エンドサイトーシスを保証するために、少なくとも数個の設計された
ベクター中に必要とされるだろう(34、40)。したがって、記述したラジオ
イムノアッセイは、2量化及びそれに続く受容体介在エンドサイトーシスのため
の抗体及び抗体を基礎としたベクターを前もって決定するのに有用であることが
できる。
【0132】 有効なモノクローナル抗体を基礎とした治療を開発するために、内部移行の潜
在能力を決定すること、及び、特に、リソソーム内経路(endolysosomal pathway
)へのモノクローナル抗体の輸送が重要である。目標として設定する特異性を変
更した後は、原核生物の及び植物毒素のモノクローナル抗体複合体、及び攻撃目
標を定めたウイルス及び非ウイルスベクター複合体は、内部移行の潜在能力の保
持について評価されるべきである。それゆえ、モノクローナル抗体8H11及び
10H8の内部移行を確定したラジオイムノアッセイは、内部移行に依存する治
療を改良するために、ガン特異的表面抗原に対して新規に開発されたモノクロー
ナル抗体の、細胞下の運命を評価するために使用することができる。
【0133】 一般的方法 p185HER−2の細胞外ドメイン(ECD)に対するモノクローナル抗体
の製造と単離は、BALB/cマウスの免疫化のための、組換えECDHER− タンパク質又は生存可能なHER−2/neu過剰発現細胞系統の使用、並び
にELISA及び免疫組織化学的測定によるハイブリドーマのスクリーニングを
含む。モノクローナル抗体は、アフィニティークロマトグラフィーによって精製
した。抗体の特異性は、ウエスタン免疫ブロット分析(Western immunoblot anal
yses)、免疫沈降測定法、及び免疫組織化学で決定した。生存可能なHER−2
/neu過剰発現細胞系統を特異的に認識するためのモノクローナル抗体の能力
は、蛍光顕微鏡観察及びフローサイトメトリー(flow cytometry)で決定した。モ
ノクローナル抗体の細胞輸送は、ラジオイムノアッセイ法で特徴付けをした。
【0134】 タンパク質製造及び精製 切断(trancated)p185HER−2タンパク質を合成し、抗p185HER
−2モノクローナル抗体を生み出すための初期免疫原として、マウス中に注射し
た。このHER−2/neu遺伝子のcDNAは、NcoI及びSphIサイト
の間で切断し、読みとり枠(open reading frame)部分を生じさせ、これは、膜貫
通ドメイン(transmembran domain)に伸展する開始コドンを含む(20)。2キ
ロベースのDNA挿入断片(insert)を、pTrcHisA発現ベクター(インビ
トローゲン(Invitrogen)、サンディエゴ、CA)の誘導性trp−lacプロモ
ーターの下流直後の多重クローニングサイト(multiple cloning site)中に結合
した。HER−2/neu遺伝子の上首尾のインフレームサブクローニング(in-
frame subcloning)は、制限酵素断片分析及び直接DNA配列決定(direct DNA s
equencing)(アメルシャム・ファルマシア・バイオテック、ピカットアウェイ、
NJ)によって、確認した。TOP10 E.コリ(E.coli)(インビトロゲン)
を、HER−2/neu発現ベクターを使用して形質転換し、さらに融合タンパ
ク質を生産するように誘発し、このタンパク質は、ECDHER−2がその後に
続く、6つの近接したヒスチジン残基を有するリーダーペプチドを含む。タンパ
ク質は、Ni2+−NTAアガロース上の金属キレートアフィニティークロマト
グラフィーを使用する条件によって精製したが、この条件は製造者(キアーゲン
(QIAGEN)、バレンシア、CA)によって提案されたものである。
【0135】 細胞培養 組換えECDHER−2タンパク質に加え、p185HER−2を過剰発現し
ている無処置(intact)の細胞(NIH/189及びSKBR−3細胞)を、BA
LB/cマウスを免疫化するために使用した。NIH/189及びNIH 3T
3細胞は、免疫測定のための、無処置又は可溶化したp185HER−2タンパ
ク質の原料として使用した。NIH/189細胞系統、これはp185HER− 過剰発現者として前に記述したものであり、C.リヒター・キングからの寛大
な寄贈品である(21)。
【0136】 NIH 3T3、NIH/189、及びA431ヒト類表皮ガン細胞系統は、
10%ウシ胎仔血清(FBS、ハイクローン、ローガン、UT)及びペニシリン
/ストレプトマイシン(ライフ・テクノロジーズ)を追加したDMEM(ライフ
・テクノロジー、グランドアイランド、NY)中で増殖した。SKBR−3ヒト
乳腺ガン細胞系統を、10%FBS及びペニシリン/ストレプトマイシンを追加
したマッコイの5A(McCoy’s 5A)媒体中で増殖した。正常HMEC(ヒト乳腺
上皮細胞)細胞は、この細胞の供給者(クローンティックス、サンディエゴ、C
A)によって配合された媒体中で増殖した。これらの細胞は、ウエスタンブロッ
ト及び免疫沈降のための、非p185HER−2を発現する対照として使用した
。Sp2/0−Ag14マウスミエローマ(myeloma)細胞は、細胞融合の前に、
ピルビン酸ナトリウム、L−グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、及
び15%FBSを追加したRPMI−1640媒体中で増殖した。
【0137】 免疫法 8〜9週齢のメスBALB/cマウスの2組を、免疫原としてタンパク質又は
生細胞のいずれかで免疫化した。3頭のメスBALB/cマウスは、それぞれ1
00mg、50mg、及び50mgの切断(truncated)HER−2/neuタン
パク質の3つの順次の免疫化を受けた。ECDHER−2の最初の免疫化は、フ
ロイントの完全アジュバント(Freund’s complete adjuvant)(シグマ、セント
ルイス、MO)中に乳化したタンパク質の腹腔内注射だった。3及び5週間後に
、マウスに、フロイントの完全アジュバント(シグマ)と混合した50mgのタ
ンパク質の2回の免疫化を行った。この操作で、2つのモノクローナル抗体(5
A7及び11F11)を生産したマウスは、3回の50mgECDHER−2
追加のブースト投与を与えた。
【0138】 マウスにはまた、グリコシル化領域を含む、すべての潜在的なECDHER− エピトープに対する最も広範囲のモノクローナル抗体を確実にするために、p
185HER−2を過剰発現している生細胞を接種した。最初の免疫化は、7ヶ
月の期間にわたり、無血清(serum-free)RPMI−1640媒体中の2〜5x1
SKBR−3ヒト乳ガン細胞の腹腔内注射であった。モノクローナル抗体8
H11及び10H8を生産したマウスは、フロイントの完全アジュバント中の5
x10NIH/189細胞の別の追加免疫(boost)をし、さらに皮下に1x1
細胞の注射をした。融合前の最後の免疫化は、PBS中の10x10NI
H/189細胞の腹腔内追加免疫、及び0.1M NaHPO及び10mM
TrisHCl、pH8を含む緩衝液中の50mgのECDHER−2タンパ
ク質の静脈内注射であった。
【0139】 ハイブリドーマ(hybidoma)の製造及びモノクローナル抗体のスクリーニング タンパク質又は細胞で免疫されたBALB/cマウスからの脾臓細胞を、Sp
2/0−Ag14マウスミエローマ細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を製造
した(22)。細胞は、ケーラー及びミルスタインによるものを少し変更した方
法で、ポリエチレングリコールで融合した(23)。ハイブリドーマ細胞は、酵
素結合免疫吸着検定法(ELISA)及び免疫組織化学によって、抗p185 ER−2 抗体製造のために選別した。
【0140】 タンパク質及び細胞ELISA ELISAは、抗体の分泌に対し、ハイブリドーマ細胞クローンの上清をスク
リーニングするための、最初の方法として使用した。ECDHER−2(250
ng/ウェル)タンパク質を、PBS中96ウェルプレート上にコートした。3
%ウシ血清アルブミン(BSA)中でブロッキングした後、50mLの上清を室
温で1〜2時間インキュベートした。PBSで3回洗浄した後、ホースラディッ
シュペルオキシダーゼ(horseradish peroxidase)接合ヤギ抗マウス第2抗体(バ
イオ−ラッド、ハーキュレス、CA)の1:2000希釈(3%BSA中)を、
室温で30分間インキュベートした。陽性のウェルを、o-フェニレンジアミン(
OPD)基質(シグマ)によって視覚化し、さらにELISAプレートリーダー
(バイオ−テック・インスツルメンツ、Inc.、ウイノースキー、VT)のO
.D.490nmで読みとった。
【0141】 高次構造(conformational)及びポリサッカライドエピトープ(polysaccharide
epitopes)を認識する抗体の検出を確実にするため、NIH3T3及びNIH/
189細胞を使用する細胞ELISAを、そのようなクローンを検出するために
使用した。細胞(1x10/ウェル)は、100%メタノールを使用し、96
ウェルのリンブロ・タイターテック(Linbro Titertek)(ICN、アーバイン
、CA)プレート上で、1.5%ゼラチン(ディフコ、デトロイト、MI)の上
に一晩付着後に、固定した。タンパク質ELISAのための手順を、細胞ELI
SAのために使用した。
【0142】 免疫組織化学 凍結かつパラフィンに包埋した、低(low)及び高(high) p185HER−2
体発現乳ガンとして知られる両者の外科的生検材料を、p185HER−2の結
合について、これら4つのモノクローナル抗体によって試験した。ヒト組織の使
用は、この仕事に先立ち、インターナショナル・レビュー・ボード・オブ・ザ・
USCスクール・オブ・メディスン(International Review Board of the USC S
chool of Medicine)により認可された。
【0143】 凍結した組織切片の免疫組織化学は、ヒト組織からの無処置のp185HER −2 に対する抗体を分泌した陽性ハイブリドーマを検出するための第2の方法と
して使用した。組織切片中のp185HER−2は、以前記述されたように(2
4)、ペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ技術によって検出した。
【0144】 単一の多腫瘍の塊(single multi-tumor block)として、パラフィン中に包埋し
た乳ガンの症例材料も、p185HER−2の認識について、試験した。ホルマ
リンで固定した乳ガン生検材料で、公知の、p185HER−2タンパク質の低
(low)及び高発現(high expression)を伴うものを、単一のパラフィンの塊中の特
定されたマトリクス中に包埋した(25)。腹水から精製されたモノクローナル
抗体を、単一標本中における局在性を比較するために、等しい濃度で使用した。
【0145】 ウエスタンブロット及び免疫沈降 モノクローナル抗体は、SDS−PAGEで等しくロード(load)されたマウス
及びヒト細胞系統の両者の全タンパク質可溶化液中の、完全長p185HER− について精査するために使用した。使用した方法は、以前記述された(26)
【0146】 免疫沈降は、マウス及びヒト細胞系統の可溶性洗剤可溶化液(soluble deterge
nt lysates)中の完全長HER−2/neuに結合するためのモノクローナル抗
体の能力を示した。使用した免疫沈降法は、以前記述されている(27)。p1
85HER−2ウエスタンブロットにおいての使用が以前報告された、ウサギポ
リクローナル抗体(R60)を使用した(9)。10%ヤギ血清中のR60ポリ
クローナル血清の1:2000希釈を、ブロット中の免疫沈降したp185HE R−2 タンパク質のC末端を検出するために使用した。
【0147】 フローサイトメトリー(flow cytometry) モノクローナル抗体−抗原複合体の細胞輸送の確認のための前提条件は、p1
85HER−2を過剰発現している細胞の表面上の標的に対する、モノクローナ
ル抗体の結合である。SKBR−3細胞の表面上の天然p185HER−2への
モノクローナル抗体の連結反応を確認するために、蛍光標示式細胞分取(FAC
S)を使用した。フローサイトメトリー法は、以前記述されている(28)。細
胞は、クールター・エリート・ESP・セル・ソーター(ベックマン・クールタ
ー、マイアミレーク、FL)で分析した。マウスIgGアイソタイプ(isotype)
対照を、FACS(Zymed)に対する陰性の対照として使用した。
【0148】 ラジオイムノアッセイ 細胞表面の抗原に対して向けられたモノクローナル抗体の内部移行及び細胞内
輸送を検出するための方法を使用したが、それは前にこの潜在能力をもつ抗p1
85HER−2モノクローナル抗体を特徴づけるために記述した通りである(2
9、30)。モノクローナル抗体8H11及び10H8は、Iodo−Gen法
(ピアス(Pierce))を使用して、125I(アメルシャム・ファルマシア)で標
識した。NIH3T3及びNIH/189細胞は、標識したモノクローナル抗体
でパルス(pulse)し、さらに1%BSA/RPMI−1640で追跡した。上清
、酸で解放可能な表面結合物(acid-releasable surface-bound)、及び細胞内標
識を集め、コブラ・オートメーティッド・ガンマ・カウンター(パッカード、メ
リデン、CT)でカウントした。この上清分画は、25%TCA沈殿可能成分及
び25%TCA可溶成分にさらに分割したが、それぞれは、脱落した(shed)元の
ままのモノクローナル抗体及び分解されたモノクローナル抗体を表す。これらの
分画を0、1、4、19、24時間で集めた。全ての時点の測定は、非特異的な
初期結合(T=0)に対して補正をしたが、それは、無標識モノクローナル抗体
による表面ブロッキング後の分画中のカウントを引き去ることによった。
【0149】 結果 4つのモノクローナル抗体を単離し、標準イムノアッセイにおける、及び内部
移行測定における、個々の特性の特徴付けを行い、内部移行依存治療での使用の
ためのそれらの潜在能力を決定した。
【0150】 モノクローナル抗体の製造及び特徴付け 70kDaの、切断ECDHER−2タンパク質を、細菌の封入体から単離し
たが、その細菌は、誘導性の発現プラスミドによって、形質転換されたものであ
る(図1)。このECDHER−2タンパク質溶液を、マウス中の免疫原として
使用し、このマウスは、組織切片のELISA測定、ウエスタン免疫ブロット、
及び免疫組織化学において、p185HER−2を認識する、5A7、11F1
1モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマクローンを生産するが、但し生
細胞中ではない(以下を参照されたい)。BALB/cマウスはまた、ハイブリ
ドーマクローン8H11及び10H8を単離するために、p185HER−2
過剰発現している生細胞、並びに、組換えECDHER−2タンパク質で免疫化
した。
【0151】 タンパク質ELISA及び細胞ELISAの両者を、ハイブリドーマ上清から
の、p185HER−2に対する抗体の検出のための最初のスクリーニング方法
として使用した。これらのスクリーニングのいずれかで陽性の上清は、抗体の存
在についてさらに試験したが、この抗体は、HER−2/neu遺伝子の過剰発
現を伴う患者からの凍結した乳ガン中の完全長内在性p185HER−2を検出
することができる。ハイブリドーマからのモノクローナル抗体で、これらのスク
リーニングでp185HER−2と結合するものは、5A7、11F11、8H
11、及び10H8であった。このハイブリドーマ細胞は、限界希釈で2回クロ
ーニングした後、モノクローナルに誘導された細胞系統(monoclonally derived
cell lines)として単離した。5A7、11F11、及び8H11は、IgG1
/kクラス(class)及びアイソタイプ(isotype)に属する。10H8は、IgG2
a/kクラス及びアイソタイプに属する。
【0152】 上記モノクローナル抗体の特異性は、ウエスタンブロット、免疫沈降測定法、
免疫組織化学、及び免疫蛍光法で試験した。ELISAにより、4つのモノクロ
ーナル抗体全てが、細菌細胞可溶化液から精製したECDHER−2に結合した
HER−2/neuを過剰発現しているか又は発現していないどちらかの全細
胞で実施された細胞ELISAは、全ての4つの抗体がNIH/189細胞上の
p189HER−2には結合するが、野生型NIH 3T3細胞の表面上の抗原
には結合しないことを示した(表1)。ウエスタンブロットでは、3つのモノク
ローナル抗体、5A7、11F11、及び10H8が、SKBR−3細胞(内在
性のもの)又はNIH/189細胞(形質移入されたもの)のいずれかからのヒ
トp185HER−2を認識した(図2)。これらの細胞系統中のその他のタン
パク質、又はA431細胞中で発現されたEGF−Rで確認された交差反応性(c
ross-reactivity)はなかった。8H11モノクローナル抗体は、ウエスタンブロ
ットでは、変性されたp189HER−2を検出しない。10H8及び8H11
の両者は、免疫沈降反応において、可溶なp189HER−2に結合することが
できた一方、5A7及び11F11は、可溶なp189HER−2に結合するこ
とができなかった(図3)。免疫ブロットにおける追加のバンドの存在は、スプ
ライスされた変異体、又はp189HER−2のタンパク分解的に分解された断
片の何れか1つを反映する。
【0153】 ヒト組織の膜中における内在性p189HER−2の認識 乳ガン組織中で、p189HER−2の内在形態に結合する能力は、公知の低
(low-)及び高発現(high-expression)組織サンプルで、免疫組織化学により試験
した。4つのモノクローナル抗体全ては、凍結ヒト乳ガン生検材料からの腫瘍細
胞の細胞膜上の内在性p189HER−2を認識した(表1)。対照として、上
記モノクローナル抗体を、p189HER−2の公知の低発現体に対して試験を
行い、そして抗体は、膜中の局在化を示さなかった(データは示していない)。
記録保管のパラフィンに包埋された生検材料中のp185HER−5の状態を測
定することに対する、これらモノクローナル抗体の有用性も試験した。ウエスタ
ンブロットでの発見同様、8H11はp185HER−5を認識できなかった一
方、5A7、11F11、及び10H8は、ホルマリンで固定した組織切片中の
p185HER−5を認識することができた(図4)。
【0154】 生存可能な完全p185HER−5過剰発現細胞に結合するモノクローナル抗 標準のイムノアッセイにおけるこれらのモノクローナル抗体の有用性が実証さ
れたのに対し、これらのモノクローナル抗体の潜在的な治療上の有用性は、生細
胞について評価されなければならなかった。p185HER−5へのモノクロー
ナル抗体の結合は、生きている、無傷の細胞中で、SKBR−3ヒト乳ガン細胞
を使用するフローサイトメトリー測定によって評価した。2つのモノクローナル
抗体、8H11及び10H8だけが、これらの細胞の表面で発現されたp185 HER−5 に結合することができた(図5)。8H11及び10H8の両者とも
、高レベルの蛍光標識を示している細胞の数を変化させた。5A7及び11F1
1は、SKBR−3細胞に結合せず、さらに対照IgG抗体の蛍光と同等の蛍光
を示した。同様の観察を、蛍光顕微鏡で行った(データは示していない)。
【0155】 p185HER−2過剰発現細胞中の抗p185HER−5抗体の内部移行及 び細胞輸送 大部分の攻撃目標を定めた治療は、細胞に特異的な抗原を攻撃目標とし、かつ
内部移行を引き起こすことができる抗体を必要とする。結合したモノクローナル
抗体の細胞下の分布を決定するために、培養したNIH/189細胞の各区画中
の、標識された抗体の相対量を決定するために、ラジオイムノアッセイを行った
。異なる細胞分画中の125I標識された8H11及び10H8の相対パーセン
テージは、8H11及び10H8の両者に対して同様であることが発見された(
図6)。これらのパルス追跡実験において、8H11及び10H8は、実験の開
始時に、ほとんど排他的に表面に結合しており(T=0時間)、さらに続いて内
部移行されることが発見された。表面標識は、8H11及び10H8に対する全
cpmの35%及び25%にそれぞれ減少したが、それは37℃に維持される場
合24時間にわたる(図6A及び6C)。インキュベーションの1時間で、細胞
内の125Iはピークまで立ち上がり、それから評価を通して水平状態となった
。表面に結合した標識されたモノクローナル抗体の減少の合計は、上清の放射能
の増加の合計によって相殺される。この上清分画は、TCA沈降可能分画及びT
CA可溶分画に、さらに分割したが、これら分画はもとのままのモノクローナル
抗体オキシラニルメチル及び分解されたモノクローナル抗体断片を表す。TCA
可溶なカウントの増加の合計は、TCA沈降可能な分画以上に速く上昇したが、
これは受動的に脱落したモノクローナル抗体と比較して、一層高い割合の内部移
行、リソソームによる分解、さらにエンドサイトーシスされたモノクローナル抗
体断片を反映している(図6B及び6D)。24時間後、モノクローナル抗体8
H11の45%が内部移行され、分解され、さらにエキソサイトーシスされた(
図6A)。モノクローナル抗体10H8の同様の量が内部移行されたが、モノク
ローナル抗体の一層高い分画が脱落した(図6C)。非特異的内部移行を試験す
るための対照として、標識した8H11及び10H8が、NIH 3T3細胞の
上清分画中にのみ、両者とも発見された。TCA可溶分画からのTCA沈降可能
物の分離は、8H11及び10H8の両者が、元のままのタンパク質としてのみ
発見されることを示した(データは示していない)。従って、8H11及び10
H8の両者は、NIH 3T3細胞の表面上のタンパク質に結合することも、エ
ンドサイトーシスによって内部移行されることも、リソソームに輸送されること
も、さらにエクソサイトーシスされることもない。
【0156】
【表1】
【0157】 参考文献一覧 本明細書中に引用した、以下の出版物の全ては、これら全てを本願中に援用す
る。
【0158】
【表2】
【0159】
【表3】
【0160】
【表4】
【0161】
【表5】
【0162】
【表6】
【0163】
【表7】
【図面の簡単な説明】
【図1】 ポリ−ヒスチジン標識(poly-His tag)を有する、組換え型HER−2/neu
細胞外ドメイン(ECD)タンパク質の精製を示す。HER−2/neuのcD
NAを、NcoI及びSphIサイトの間で切断し、70kDaのエピトープ標
識したタンパク質を産生するための発現ベクター中にサブクローニングした。T
M=膜貫通ドメイン(domain)である。精製したタンパク質は、SDS−PAGE
によって分離し、ニトロセルロースに移し、上記ポリ−ヒスチジン標識に対する
抗体によって検出した。
【図2】 ヒト及びマウス細胞系統からの全タンパク質可溶化液(lysate)のウエスタンブ
ロットを示す。モノクローナル抗体5A7、11F11、8H11、及び10H
8を、全タンパク質可溶化液中のp185HER−2に結合することについて試
験したが、この全タンパク質可溶化液は、正常ヒト上皮細胞(HMEC)、HE R−2 /neuを過剰発現しているヒト乳ガン細胞(SKBR−3)、EGF受
容体(A431)を過剰発現しているヒト・エピデルモイド癌細胞(human epide
rmoid carcinoma cells)、HER−2/neu発現を欠いているHIH3T3細
胞、及び、HER−2/neuを過剰発現するように操作されたNIH/189
細胞からのものである。
【図3】 モノクローナル抗体8H11による、p185HER−2の免疫沈降を示す。
全タンパク質可溶化液を8H11モノクローナル抗体とインキュベートした。免
疫複合体をSDS−PAGEによって分離し、さらにニトロセルロースに移した
。p185HER−2は、p185HER−2のカルボン酸末端エピトープを認
識するウサギポリクローナル抗体によって検出した。
【図4】 p185HER−2の免疫組織化学的局在化を示す。ガン細胞膜へのモノクロ
ーナル抗体の局在化について、単一の記録保管用パラフィン包埋乳ガンからの組
織切片を解析した。抗p185HER−2モノクローナル抗体の膜局在化を、ペ
ルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ法(peroxidase-anti-peroxidase method)に
よって検出した。
【図5】 SKBR−3細胞上のp185HER−2を検出するために、新規モノクロー
ナル抗体を使用した流動細胞数測定を示す。p185HER−2を過剰発現して
いるSKBR−3細胞は、図中に示したモノクローナル抗体とインキュベートし
、さらに2次FITCラベルした抗体(secondary FITC-labeled antibodies)で
標識した。8H11及び10H8モノクローナル抗体は、SKBR−3生細胞の
表面上のp185HER−2を検出する。IgG同位体対照、5A7、及び11
F11は、いかなる蛍光も示さない。
【図6A】 NIH/189細胞による、モノクローナル抗体8H11及び10H8の内部
移行及び異化反応を示す、受容体介在エンドサイトーシス(receptor-mediated e
ndocytosis)測定を示す。(上図)125Iでラベルしたモノクローナル抗体を
、氷上で、NIH/189細胞とインキュベートした。%合計cpmは、37℃
、様々なインキュベーション時間での、表面上、細胞内、上清中のラベルの割合
を示す。平均cpmは、3つのウェルについて計算した。(下図)上清のcpm
は、25%TCAで処理し、さらにTCA沈降可能cpm(元のままの抗体を表
す)及びTCA可溶cpm(抗体の小さなMWの代謝産物)に分割した。増加し
たTCA可溶cpm分画は、内部移行したモノクローナル抗体の分解及びエキソ
サイトーシス(exocytosis)を示す。(A及びB)は8H11、(C及びD)は1
0H8である。
【図6B】 NIH/189細胞による、モノクローナル抗体8H11及び10H8の内部
移行及び異化反応を示す、受容体介在エンドサイトーシス(receptor-mediated e
ndocytosis)測定を示す。(上図)125Iでラベルしたモノクローナル抗体を
、氷上で、NIH/189細胞とインキュベートした。%合計cpmは、37℃
、様々なインキュベーション時間での、表面上、細胞内、上清中のラベルの割合
を示す。平均cpmは、3つのウェルについて計算した。(下図)上清のcpm
は、25%TCAで処理し、さらにTCA沈降可能cpm(元のままの抗体を表
す)及びTCA可溶cpm(抗体の小さなMWの代謝産物)に分割した。増加し
たTCA可溶cpm分画は、内部移行したモノクローナル抗体の分解及びエキソ
サイトーシス(exocytosis)を示す。(A及びB)は8H11、(C及びD)は1
0H8である。
【図6C】 NIH/189細胞による、モノクローナル抗体8H11及び10H8の内部
移行及び異化反応を示す、受容体介在エンドサイトーシス(receptor-mediated e
ndocytosis)測定を示す。(上図)125Iでラベルしたモノクローナル抗体を
、氷上で、NIH/189細胞とインキュベートした。%合計cpmは、37℃
、様々なインキュベーション時間での、表面上、細胞内、上清中のラベルの割合
を示す。平均cpmは、3つのウェルについて計算した。(下図)上清のcpm
は、25%TCAで処理し、さらにTCA沈降可能cpm(元のままの抗体を表
す)及びTCA可溶cpm(抗体の小さなMWの代謝産物)に分割した。増加し
たTCA可溶cpm分画は、内部移行したモノクローナル抗体の分解及びエキソ
サイトーシス(exocytosis)を示す。(A及びB)は8H11、(C及びD)は1
0H8である。
【図6D】 NIH/189細胞による、モノクローナル抗体8H11及び10H8の内部
移行及び異化反応を示す、受容体介在エンドサイトーシス(receptor-mediated e
ndocytosis)測定を示す。(上図)125Iでラベルしたモノクローナル抗体を
、氷上で、NIH/189細胞とインキュベートした。%合計cpmは、37℃
、様々なインキュベーション時間での、表面上、細胞内、上清中のラベルの割合
を示す。平均cpmは、3つのウェルについて計算した。(下図)上清のcpm
は、25%TCAで処理し、さらにTCA沈降可能cpm(元のままの抗体を表
す)及びTCA可溶cpm(抗体の小さなMWの代謝産物)に分割した。増加し
たTCA可溶cpm分画は、内部移行したモノクローナル抗体の分解及びエキソ
サイトーシス(exocytosis)を示す。(A及びB)は8H11、(C及びD)は1
0H8である。
【図7】 軽鎖(上)及び重鎖(下)の両者についての、モノクローナル抗体8H11の
可変領域の配列を示す。
【図8】 軽鎖(上)及び重鎖(下)の両者についての、モノクローナル抗体10H11
の可変領域の配列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61K 49/00 A61P 9/10 A61P 9/10 17/06 17/06 25/00 25/00 27/02 27/02 35/00 35/00 C07K 16/28 C07K 16/28 G01N 33/574 A G01N 33/574 33/577 B 33/577 C12N 15/00 ZNAA (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE,TR),OA(BF ,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW, ML,MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,G M,KE,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ ,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ, MD,RU,TJ,TM),AE,AG,AL,AM, AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,B Z,CA,CH,CN,CR,CU,CZ,DE,DK ,DM,DZ,EE,ES,FI,GB,GD,GE, GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,J P,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR ,LS,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK, MN,MW,MX,MZ,NO,NZ,PL,PT,R O,RU,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ ,TM,TR,TT,TZ,UA,UG,UZ,VN, YU,ZA,ZW (72)発明者 パーク,ジンハ アメリカ合衆国,カリフォルニア 91030, サウス パサデナ,パイン ストリート 1218,#303 Fターム(参考) 4B024 AA01 AA11 BA41 CA04 DA02 DA06 EA04 GA11 HA01 HA03 4C076 AA01 AA06 AA12 AA13 AA17 AA19 AA22 AA25 AA26 AA30 AA33 BB01 BB13 BB15 BB16 BB22 BB24 BB25 BB27 BB29 BB30 BB31 BB32 CC01 CC10 CC11 CC20 CC27 EE59N FF68 4C085 HH03 HH05 HH07 HH11 HH13 JJ02 JJ03 JJ05 KA04 KA27 KA28 KA29 KA30 KA36 LL01 LL18 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA75 EA28 EA51 FA72

Claims (66)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 標的細胞に対し攻撃目標を設定したデリバリーのための複合
    体組成物であって、以下の: 受容体分子に対する結合特異性を有する担体化合物;及び 前記担体化合物に結合された成分、 を含み、前記担体化合物が前記受容体分子に結合する時に、前記組成物が前記標
    的細胞によって内部移行される、前記複合体組成物。
  2. 【請求項2】 前記担体化合物が、抗体である、請求項1に記載の組成物。
  3. 【請求項3】 前記抗体が、モノクローナルである、請求項2に記載の組成
    物。
  4. 【請求項4】 前記抗体が、Mab 8H11である、請求項3に記載の組
    成物。
  5. 【請求項5】 前記抗体が、Mab 10H8である、請求項3に記載の組
    成物。
  6. 【請求項6】 前記抗体が、Mab 5A7である、請求項3に記載の組成
    物。
  7. 【請求項7】 前記抗体が、Mab 11F11である、請求項3に記載の
    組成物。
  8. 【請求項8】 前記抗体が、モノクローナル抗体の断片(fragment)である、
    請求項2に記載の組成物。
  9. 【請求項9】 前記抗体が、ポリクローナルである、請求項2に記載の組成
    物。
  10. 【請求項10】 前記標的細胞が、ガン細胞である、請求項1に記載の組成
    物。
  11. 【請求項11】 前記受容体が、前記ガン細胞によって過剰発現されたポリ
    ペプチドである、請求項10に記載の組成物。
  12. 【請求項12】 前記ポリペプチドが、p185HER−2タンパク質であ
    る、請求項11に記載の組成物。
  13. 【請求項13】 前記成分が、オリゴヌクレオチドセグメントである、請求
    項1に記載の組成物。
  14. 【請求項14】 前記成分が、抗体である、請求項1に記載の組成物。
  15. 【請求項15】 前記成分が、モノクローナル抗体である、請求項14に記
    載の組成物。
  16. 【請求項16】 前記成分が、モノクローナル抗体の断片である、請求項1
    4に記載の組成物。
  17. 【請求項17】 前記成分が、ポリクローナル抗体である、請求項14に記
    載の組成物。
  18. 【請求項18】 前記成分が、毒素である、請求項1に記載の組成物。
  19. 【請求項19】 前記成分が、画像形成分子(imaging molecule)である、
    請求項1に記載の組成物。
  20. 【請求項20】 前記画像形成分子が、同位体標識(isotope label)である
    、請求項19に記載の組成物。
  21. 【請求項21】 請求項1に記載の組成物を投与することを含む、疾病状態
    の治療法。
  22. 【請求項22】 前記組成物が、静脈内(intravenously)、経皮(transderma
    lly)、滑膜内(intrasynovially)、筋肉内(intramuscularly)、腫瘍内(intratum
    morally)、眼内(intraocularly)、鼻腔内(intranasally)、包膜内(intrathecal
    ly)、局所的に(topically)、又は経口(orally)で投与される、請求項21に記載
    の方法。
  23. 【請求項23】 前記組成物が、化学療法の一部として投与される、請求項
    21に記載の方法。
  24. 【請求項24】 前記組成物が、放射線照射(radiation)と結合して投与さ
    れる、請求項21に記載の方法。
  25. 【請求項25】 前記疾病が、ガン(cancer)、乾癬(psoriasis)、黄斑変性(
    macular degeneration)、神経系疾患(neurological disease)、又は組織の再狭
    窄(restenosis)である、請求項21に記載の方法。
  26. 【請求項26】 請求項1に記載の組成物を投与することを含む、組織中に
    おけるガンの増殖又は転移を抑制する方法。
  27. 【請求項27】 前記組成物が、静脈内、経皮、滑膜内、筋肉内、腫瘍内、
    眼内、鼻腔内、包膜内、局所的に、又は経口で投与される、請求項26に記載の
    方法。
  28. 【請求項28】 前記組成物が、化学療法の一部として投与される、請求項
    26に記載の方法。
  29. 【請求項29】 前記組成物が、放射線照射(radiation) とともに投与され
    る、請求項26に記載の方法。
  30. 【請求項30】 前記腫瘍又は転移が、黒色腫(melanoma)、癌腫(carcinoma
    )、肉腫(sarcoma)、線維肉腫(fibrosarcoma)、神経膠腫 (glioma)、星細胞腫(as
    trocytoma)である、請求項26に記載の方法。
  31. 【請求項31】 請求項1に記載の組成物を投与することによって、組織に
    おける乾癬、黄斑変性、又は組織の再狭窄を抑制する方法。
  32. 【請求項32】 前記組成物が、静脈内、経皮、滑膜内、筋肉内、腫瘍内、
    眼内、鼻腔内、包膜内、局所的に、又は経口で投与される、請求項31に記載の
    方法。
  33. 【請求項33】 前記組成物を投与することが、化学療法の一部である、請
    求項31に記載の方法。
  34. 【請求項34】 前記組成物を投与することが、放射線照射とともに行われ
    る、請求項31に記載の方法。
  35. 【請求項35】 組織中における血管形成を検出する方法であって、請求項
    1に記載の組成物を、前記組織と接触させる方法。
  36. 【請求項36】 前記組織が、エキソビボ(ex vivo)である、請求項35に
    記載の方法。
  37. 【請求項37】 前記組織が、インビボ(in vivo)であり、かつ、前記組成
    物が、静脈内、経皮、滑膜内、筋肉内、腫瘍内、眼内、鼻腔内、包膜内、局所的
    に、又は経口で投与される、請求項35に記載の方法。
  38. 【請求項38】 前記成分が、蛍光色素(fluorochrome)、放射性標識(radio
    active tag)、常磁性重金属(paramagnetic heavy metal)、診断用色素(diagnos
    tic dye)、又は酵素である、請求項35に記載の方法。
  39. 【請求項39】 請求項1に記載の組成物を投与することにより、組織中の
    腫瘍又は腫瘍の浸潤を検出する方法。
  40. 【請求項40】 前記組織が、エキソビボ(ex vivo)、である、請求項39
    に記載の方法。
  41. 【請求項41】 前記組織が、インビボであり、かつ、前記組成物が、静脈
    内、経皮、滑膜内、筋肉内、腫瘍内、眼内、鼻腔内、包膜内、局所的に、又は経
    口で投与される、請求項39に記載の方法。
  42. 【請求項42】 前記成分が、蛍光色素、放射性標識、常磁性重金属、又は
    診断用色素である、請求項39に記載の方法。
  43. 【請求項43】 p185HER−2タンパク質に向けられた抗体。
  44. 【請求項44】 前記抗体が、Mab 8H11である、請求項43に記載
    の抗体。
  45. 【請求項45】 前記抗体が、Mab 10H8である、請求項43に記載
    の抗体。
  46. 【請求項46】 前記抗体が,Mab 5A7である、請求項43に記載の
    抗体。
  47. 【請求項47】 前記抗体が、Mab 11F11である、請求項43に記
    載の抗体。
  48. 【請求項48】 請求項1に記載の担体化合物をスクリーニング(screening
    )するための方法であって、以下の: 想定した担体化合物を供給し; 前記想定した担体化合物がp185HER−2に結合する第1親和性(first a
    ffinity)を測定し; p185HER−2との結合に対する、抗体の第2親和性(second affinity
    )を測定し:さらに、 前記第2親和性が、前記第1親和性より小さい場合、前記想定した担体化合物
    を、請求項1に記載の担体化合物として選択することを含む前記方法。
  49. 【請求項49】 前記抗体が、Mab 8H11である、請求項48に記載
    の方法。
  50. 【請求項50】 前記抗体が、Mab 10H8である、請求項48に記載
    の方法。
  51. 【請求項51】 前記抗体が、Mab 5A7である、請求項48に記載の
    方法。
  52. 【請求項52】 前記抗体が、Mab 11F11である、請求項48に記
    載の方法。
  53. 【請求項53】 想定した担体化合物の内部移行潜在能力を決定するための
    方法であって、以下の: NIH/189細胞によって内部移行された、Mab 8H11の最初の分画
    (first fraction)を決定し;さらに NIH/189細胞によって内部移行された、前記想定した担体化合物の第2
    の分画を決定する; を含む前記方法。 但し、それにより、前記第2の分画が、前記第1の分画と実際上同じであるか
    、又は前記第2の分画が、前記第1の分画より大きい場合、前記想定した担体の
    内部移行潜在能力は高い。
  54. 【請求項54】 前記HER−2/neu 発ガン遺伝子を過剰発現するガン細
    胞に対し攻撃目標を設定したデリバリーのための複合体組成物であって、以下の
    :抗p185HER−2タンパク質であるモノクローナル抗体;さらに、前記モ
    ノクローナル抗体に結合した成分;を含み、ここで、前記抗体が、前記p185 HER−2 タンパク質に結合する時に、前記組成物が、前記ガン細胞によって内
    部移行される前記組成物。
  55. 【請求項55】 前記抗体が、8H11である、請求項54に記載の組成物
  56. 【請求項56】 前記抗体が、10H8である、請求項54に記載の組成物
  57. 【請求項57】 前記抗体が、5A7である、請求項54に記載の組成物。
  58. 【請求項58】 前記抗体が、11F11である、請求項54に記載の組成
    物。
  59. 【請求項59】 前記成分が、治療に役立つ成分(therapeutic moiety)であ
    る、請求項54に記載の組成物。
  60. 【請求項60】 前記成分が、画像形成分子(imaging molecule)である、請
    求項54に記載の組成物。
  61. 【請求項61】 Mab 8H11の可変軽領域(variable light region)
    をコードしている単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチド
    が、実質的に配列番号1に等価であるポリヌクレオチド。
  62. 【請求項62】 請求項61に記載の前記ポリヌクレオチドの補体(complem
    ent)を含む、単離されたポリヌクレオチド。
  63. 【請求項63】 請求項61に記載の前記単離されたポリヌクレオチドを含
    むベクター。
  64. 【請求項64】 Mab 8H11の可変重領域(variable heavy region)
    をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが、
    実質的に配列番号2に等価であるポリヌクレオチド。
  65. 【請求項65】 Mab 10H8の可変軽領域(variable light region)
    をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが、
    実質的に配列番号3に等価であるポリヌクレオチド。
  66. 【請求項66】 Mab 10H8の可変重領域(variable heavy region)
    をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが、
    実質的に配列番号4に等価であるポリヌクレオチド。
JP2001537995A 1999-11-15 2000-11-15 治療又は診断のための成分の攻撃目標を設定したデリバリー Pending JP2003523178A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16556399P 1999-11-15 1999-11-15
US60/165,563 1999-11-15
PCT/US2000/031424 WO2001036005A2 (en) 1999-11-15 2000-11-15 Targeted delivery of therapeutic and diagnostic moieties

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003523178A true JP2003523178A (ja) 2003-08-05

Family

ID=22599451

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001537995A Pending JP2003523178A (ja) 1999-11-15 2000-11-15 治療又は診断のための成分の攻撃目標を設定したデリバリー

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP1231944A2 (ja)
JP (1) JP2003523178A (ja)
AU (1) AU1490801A (ja)
CA (1) CA2391450A1 (ja)
WO (1) WO2001036005A2 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008517253A (ja) * 2004-10-06 2008-05-22 ウェルスタット バイオロジクス コーポレイション 循環する癌細胞におけるHer−2/neuタンパク質のレベルの上昇の検出および処置
JP2019089806A (ja) * 2012-03-14 2019-06-13 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 多重特異性抗原結合分子およびその使用

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030049262A1 (en) * 1998-10-02 2003-03-13 Susan Love Methods for identification, diagnosis, and treatment of breast cancer
CN101678116A (zh) 2006-05-11 2010-03-24 根特大学 通过唾液酸粘附素靶向巨噬细胞
SG10202112460VA (en) 2015-07-06 2021-12-30 Regeneron Pharma Multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
EP3448891A1 (en) 2016-04-28 2019-03-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of making multispecific antigen-binding molecules
CN110325209A (zh) * 2017-02-24 2019-10-11 宏观基因有限公司 能够结合cd137和肿瘤抗原的双特异性结合分子及其用途

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU3737893A (en) * 1992-03-05 1993-10-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Diagnostic and/or therapeutic agents, targeted to neovascular endothelial cells
IL147241A0 (en) * 1999-06-25 2002-08-14 Genentech Inc METHODS OF TREATMENT USING ANTI ErbB ANTIBODY-MAYTANSINOID CONJUGATES
AU7710300A (en) * 1999-09-22 2001-04-24 Corixa Corporation Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008517253A (ja) * 2004-10-06 2008-05-22 ウェルスタット バイオロジクス コーポレイション 循環する癌細胞におけるHer−2/neuタンパク質のレベルの上昇の検出および処置
JP4798801B2 (ja) * 2004-10-06 2011-10-19 ウェルスタット バイオロジクス コーポレイション 循環する癌細胞におけるHer−2/neuタンパク質のレベルの上昇の検出および処置
JP2019089806A (ja) * 2012-03-14 2019-06-13 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 多重特異性抗原結合分子およびその使用
JP7308041B2 (ja) 2012-03-14 2023-07-13 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 多重特異性抗原結合分子およびその使用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2001036005A3 (en) 2002-01-24
EP1231944A2 (en) 2002-08-21
CA2391450A1 (en) 2001-05-25
WO2001036005A2 (en) 2001-05-25
AU1490801A (en) 2001-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5328155B2 (ja) Adam−9モジュレータ
US7666425B1 (en) Treatment and diagnosis of prostate cancer
JP5601836B2 (ja) Tes7およびtes7に結合する抗体
US8512702B2 (en) Prostate cancer diagnosis and treatment
EP1846767B1 (en) Kid31 and antibodies that bind thereto
US7847070B2 (en) LUCA2 and antibodies that bind thereto
US20060171952A1 (en) JAM-3 and antibodies that bind thereto
JPH11507509A (ja) 前立腺癌の治療および診断
JP2005524399A (ja) Alcamおよびalcam調節因子
JP4757493B2 (ja) 抗原pipaおよびそれに結合する抗体
WO2003047623A1 (en) Treatment of prostate cancer by inhibitors of ncam2
JP2006506071A5 (ja)
JP2020532572A (ja) 癌の診断に有用な抗体
JP2003523178A (ja) 治療又は診断のための成分の攻撃目標を設定したデリバリー