JP2003520601A - Recombinant attenuation of PRRSV - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 本発明は、ORF 1a、ORD 1b及び/又はORF 2の群から選択されるオープンリーディングフレーム(ORF)によってコードされるウイルスタンパク質の特定部位のアミノ酸突然変異によって弱毒化される、生きているPRRSウイルスに関する。また、本発明は前記ウイルスをコードするヌクレオチド配列、そのようなウイルスを産生する方法及びPRRS感染の予防及び治療用医薬組成物の調製のためのそれらの使用に関する。 (57) [Summary] The present invention relates to a live PRRS virus attenuated by site-specific amino acid mutations in a viral protein encoded by an open reading frame (ORF) selected from the group of ORF 1a, ORD 1b and / or ORF 2 About. The invention also relates to nucleotide sequences encoding said viruses, methods for producing such viruses and their use for the preparation of pharmaceutical compositions for the prevention and treatment of PRRS infection.
Description
【0001】発明の分野
本発明は、ORF 1a、ORF 1b及び/又はORF 2からなる群から選択されるオープ
ンリーディングフレーム(ORF)によってコードされるウイルス蛋白質の特定の
部位におけるアミノ酸突然変異によって弱毒化される、生きているPRRSウイルス
に関する。又、本発明は、前記ウイルスをコードするヌクレオチド配列、そのよ
うなウイルスを産生する方法及びPRRS感染の予防及び治療用医薬組成物を調製す
るためのそれらの使用に関する。FIELD OF THE INVENTION The present invention is attenuated by amino acid mutations at specific sites in a viral protein encoded by an open reading frame (ORF) selected from the group consisting of ORF 1a, ORF 1b and / or ORF 2. Concerning the live PRRS virus. The present invention also relates to the nucleotide sequences encoding said viruses, methods for producing such viruses and their use for preparing pharmaceutical compositions for the prevention and treatment of PRRS infections.
【0002】発明の背景
後に豚繁殖・呼吸障害症候群(PRRS)と命名された謎のブタの病気は、動脈ウ
イルス科(arteriviridae)のエンベロープを有するプラス鎖RNAウイルスが原因
となっている(E.J.Snijder, 1998)。約10〜15年前、2つの異なるPRRSウイルス
株が米国と欧州で独立して出現した。その病気は、現在北米、欧州及びアジアの
国々で生産されている多くのブタに特有である。それは、引き続いてブタの生殖
低下及び呼吸器疾患の主な原因である。米国において、感染率は最大70%である
と予測される。
ウイルスは、吸入、摂取、性交、咬創又は針によって伝染する。それは、粘膜
性マクロファージ、肺性マクロファージ又は領域性マクロファージで複製する。[0002] named the mystery of pig disease and porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) after the background of the invention, positive-strand RNA virus having an envelope of arterial virus family (arteriviridae) is causing (EJSnijder, 1998). About 10 to 15 years ago, two different PRRS virus strains emerged independently in the United States and Europe. The disease is endemic to many pigs currently produced in North America, Europe and Asian countries. It is subsequently the leading cause of hyporeproductive and respiratory disease in pigs. In the United States, infection rates are expected to be up to 70%. The virus is transmitted by inhalation, ingestion, intercourse, bites or needles. It replicates in mucosal macrophages, pulmonary macrophages or regional macrophages.
【0003】
無症状的に、疾患は回復又は持続感染を生じる。持続的に感染した動物は、経
口的/咽頭的流体、血液、糞、尿及び精液中にウイルスを流す。雌ブタの臨床症
状は、弱い生産ブタ、死産(stilbone)ブタ及び自動融解胎児(autolyzed fetu
ses)による流産又は早産と関係する。感染した新生児のブタは高い死亡率を有
し、又は肺炎にかかる。その後の育成及びブタの成長は、肺炎、同時発生的細菌
感染及び死亡率の増加によって悪化する。牡ブタは、発熱及び精液の形態的変化
を生じる傾向にある。
すべての動脈ウイルス(arteriviruse)について、PRRSウイルスゲノムは、約
15キロベースの単一のプラス鎖RNA分子である。ORF(オープンリーディングフレ
ーム)1a及び1bはレプリカーゼをコードし、ORF 2〜5は推定上の糖タンパク質(
gp 1〜4)をコードし、ORF 6は膜タンパク質(M)をコードし、ORF 7はヌクレオ
カプシドタンパク質(N)をコードする。Asymptomatically, the disease results in remission or persistent infection. Persistently infected animals shed the virus in oral / pharyngeal fluids, blood, feces, urine and semen. The clinical manifestations of sows include weakly producing pigs, stilbone pigs and autolyzed fetu.
ses) abortion or premature birth. Infected newborn pigs have a high mortality rate or develop pneumonia. Subsequent breeding and pig growth are exacerbated by pneumonia, concurrent bacterial infections and increased mortality. Boars tend to develop fever and morphological changes in semen. For all arteriviruses, the PRRS viral genome is approximately
It is a single plus-strand RNA molecule of 15 kilobases. ORFs (open reading frames) 1a and 1b encode replicase, and ORFs 2-5 are putative glycoproteins (
ORF 6 encodes a membrane protein (M) and ORF 7 encodes a nucleocapsid protein (N).
【0004】
米国(米国メリーランド州ロックビルのアメリカンタイプカルチャーコレクシ
ョン(American Type Culture Collection)に1991年7月18日に挿入された単離
したATCC VR-2332、Genebank U 87392 U00153)及び欧州(WO 92/21375、パリの
パスツール研究所に1991年6月5日に挿入された単離したリーリースタッドエージ
ェント(Lelystad Agent)(CDI-NL-2.91)、受入番号I-1102)におけるPRRS感
染の最初の性状は、ゲノム及び血清学的相違を有したウイルスを同定した。比較
は、両方が、臨床疾患が1980年代後半に記載されるよりも前に分岐した共通の祖
先を有したことを示した。全長ゲノム配列はPRRSウイルスの数及び完全な構造タ
ンパク質をコードするその領域について報告されていた(Snijderら、1998;Meu
lenbergら、1993b;Conzelmannら、1993;Murtaughら、1995;Kapurら、1996)
。PRRSウイルスは、ブタの肺のマクロファージ、単球、グリア細胞及びCL-2621
及びMARC-145として知られる2つのMA-104細胞亜集団(サルの胎児性腎細胞)に
おいてインビトロで複製され得る(K.D. Rossow、Porcine reproductive and re
spiratory syndrome、Vet Pathol 35:1-20、1998)。感染性PRRSクローンを産生
するための組み換え手段も入手可能である(EP 0 839 912 A1)。[0004] USA (Isolated ATCC VR-2332, Genebank U 87392 U00153) inserted July 18, 1991 in the American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, USA and Europe (WO First PRRS infection in an isolated Lelystad Agent (CDI-NL-2.91), accession number I-1102, inserted on June 5, 1991, at the Pasteur Institute in Paris, 92/21375. Characterization identified viruses with genomic and serological differences. Comparisons showed that both had common ancestors that diverged before the clinical disease was described in the late 1980s. A full-length genomic sequence was reported for the PRRS virus number and its region encoding the complete structural protein (Snijder et al., 1998; Meu).
lenberg et al., 1993b; Conzelmann et al., 1993; Murtaugh et al., 1995; Kapur et al., 1996).
. PRRS virus is associated with porcine lung macrophages, monocytes, glial cells and CL-2621.
And in two MA-104 cell subpopulations known as MARC-145 (monkey embryonic kidney cells) that can be replicated in vitro (KD Rossow, Porcine reproductive and re
spiratory syndrome, Vet Pathol 35: 1-20, 1998). Recombinant means for producing infectious PRRS clones are also available (EP 0 839 912 A1).
【0005】
ブタを保護するために、生きている弱毒化PRRSワクチンが市販されている(Re
spPRRS/Ingelvac(登録商標)PRS MLV、ベーリンガーインゲルハイム)。
死菌ワクチン(不活化ウイルス全体)又はサブユニットワクチン(従来法で精
製したウイルスタンパク質又は非相同的に発現した精製したウイルスタンパク質
)は、アジュバントの存在下でさえ、全身保護免疫応答を生じるために、その効
果において、たいていの場合、生ワクチンに劣る。
PRRSについて、現在入手可能な死菌ワクチンと比較して、弱毒化ワクチンは、
より長く持続し、より効果的である病気に対する免疫性を生じさせる(Snijder
ら、上記文献)。このPRRS生ワクチンは、適切と思われる宿主細胞においてウイ
ルスを連続的に培養することによって従来法で、病原性がなくなるまで弱毒化さ
れる(EP 0529584 B1)。いまだ、このPRRS生ワクチンは、改善に充分な能力か
ら離れる。第一に、それらは再感染を抑制しない。第二に、それらは予防接種を
した動物と野外ウイルスに感染した動物の間の血清学的識別ができない。しかし
、最も重要なことは、微生物全体からの生ワクチンは、弱毒化されているが、深
刻な安全性の問題と付随し得ることである。このことは、PRRSウイルスのような
RNAウイルスについて特に当てはまり、それらはRNA複写酵素による校正の欠如か
ら生じるRNAゲノムの不正確な複写によって高い確率の突然変異を有するものと
考えられている。
弱毒化される、生きているウイルスの復帰突然変異の可能性は、予防接種をし
た動物に対して深刻な脅威をもたらし得る。従来法で誘導される弱毒化ウイルス
について、弱毒化は通常の複数継代によって達成され、分子起源及び遺伝的安定
性は、依然として不明であり、復帰突然変異の発生は予測不可能である。
従って、本発明の技術的課題は、野生型ウイルスに戻る可能性が低いPRRSウイ
ルスを提供することであった。Live, attenuated PRRS vaccines are commercially available to protect pigs (Re
spPRRS / Ingelvac® PRS MLV, Boehringer Ingelheim). Killed vaccines (whole inactivated virus) or subunit vaccines (conventionally purified or heterologously expressed purified viral proteins) are used to generate a systemic protective immune response, even in the presence of adjuvants. In most cases, it is inferior to the live vaccine in its effect. Compared to currently available killed vaccines, attenuated vaccines for PRRS
Produces immunity to diseases that are longer lasting and more effective (Snijder
Et al., Supra). This live PRRS vaccine is conventionally attenuated until it is no longer pathogenic by continuously culturing the virus in a host cell that seems appropriate (EP 0529584 B1). Still, this live PRRS vaccine leaves us with insufficient capacity for improvement. First, they do not prevent reinfection. Secondly, they do not allow serological discrimination between vaccinated and field virus infected animals. But most importantly, live vaccines from whole organisms, although attenuated, can be associated with serious safety concerns. This is like the PRRS virus
This is especially true for RNA viruses, which are believed to have a high probability of mutation due to incorrect copying of the RNA genome resulting from lack of proofreading by RNA copy enzymes. The potential for live virus backmutations to be attenuated can pose a serious threat to vaccinated animals. For conventional attenuated viruses, attenuation is achieved by normal multiple passages, molecular origin and genetic stability remain unknown, and backmutation occurrence is unpredictable. Therefore, the technical problem of the present invention was to provide a PRRS virus that is unlikely to revert to a wild-type virus.
【0006】発明の要約
本発明は、ORF 1a、ORF 1b及び/又はORF 2の群から選択されるオープンリー
ディングフレーム(ORF)によってコードされるウイルスタンパク質の特定部位
のアミノ酸突然変異によって弱毒化される、生きているPRRSウイルスに関する。
また、本発明は、前記ウイルスをコードするヌクレオチド配列、そのようなウイ
ルスを産生する方法及びPRRS感染の予防及び治療用医薬組成物を調製するための
それらの使用に関する。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention is attenuated by amino acid mutations at specific sites in a viral protein encoded by an open reading frame (ORF) selected from the group ORF 1a, ORF 1b and / or ORF 2. , About the live PRRS virus.
The present invention also relates to the nucleotide sequences encoding said viruses, methods for producing such viruses and their use for preparing pharmaceutical compositions for the prevention and treatment of PRRS infections.
【0007】発明の開示
上記技術的課題の解決方法は、特許請求の範囲において特徴付けられる記載及
び実施態様によって達成される。
本発明の実施態様の前に、本明細書及び特許請求の範囲で使用されるように、
単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数
の参照を含むことに留意しなければならない。このように、例えば「PRRSウイル
ス」への言及は、複数のそのようなPRRSウイルスを含み、「細胞」への言及は1
個以上の細胞及び当業者に知られているその等価なものへの言及等である。他に
定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本
発明が属する当業者により一般に理解されることと同じ意味を有する。本明細書
に記載されるものと同じ、又は等価な方法及び材料が本発明の方法又は試験で使
用され得るが、好ましい方法、装置、及び材料は本明細書に記載される。本明細
書に記載されるすべての刊行物は、本発明に関連して使用され得る刊行物で報告
される細胞株、ベクター、及び方法論を記載又は開示する目的のために、参照に
より本明細書に組み込まれる。本明細書には、本発明が先の発明の長所によって
、そのような開示の日付を実際よりも早める権利はないと認めるものと解釈され
るものはない。[0007] Resolution of the disclosed above technical problem of the invention is achieved by the description and embodiments characterized in the claims. Prior to the embodiments of the present invention, as used in the specification and claims,
It should be noted that the singular forms "a", "an" and "the" include plural references unless the context clearly dictates otherwise. Thus, for example, reference to "PRRS virus" includes more than one such PRRS virus, and reference to "cell" is 1
References to one or more cells and their equivalents known to those of skill in the art. Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although the same or equivalent methods and materials described herein can be used in the methods or tests of the invention, the preferred methods, devices, and materials are described herein. All publications mentioned herein are incorporated herein by reference for the purpose of describing or disclosing cell lines, vectors, and methodologies reported in publications that may be used in connection with the present invention. Incorporated into. Nothing herein is to be construed as an admission that the invention is not entitled to antedate such disclosure by virtue of prior invention.
【0008】
驚いたことに、PRRSウイルスが常にその位置でVR-2332株の本来の病原性領域
のアミノ酸に戻る一部のオープンリーディングフレームにおいて特定のゲノム部
位を含むことが分かった。ここで、「病原性特定部位」と呼ばれるこの形態の進
化圧力又は単に「本発明の部位」としてあるいは単に「部位」として参照される
この形態の進化圧力は、莫大である。RespPRRSの2つの復帰変異株について、こ
の病原性特定部位で本来の病原性領域の分離したアミノ酸に対するアミノ酸突然
変異が米国及び欧州において地理学的に独立して発生することを初めて示すこと
ができた。本発明の弱毒化の根拠として定義される突然変異を有する生ワクチン
は、弱毒化ワクチンの現世代の欠点を回避することができる。前記弱毒型突然変
異の別の利点は、弱毒化ペスチウイルスの特有の標識として使用することを可能
にし、その領域由来のペスチウイルスからそれらを区別することを可能にするそ
れらの知られた分子特異性にある。Surprisingly, it was found that the PRRS virus always contains a specific genomic site in some open reading frame returning in its position to amino acids of the original pathogenic region of the VR-2332 strain. The evolutionary pressure of this form, referred to herein as the "pathogenic specific site," or of this form, referred to simply as the "site of the invention" or simply as the "site," is enormous. For the two revertants of RespPRRS, we were able to demonstrate for the first time that amino acid mutations to isolated amino acids of the original pathogenic region at this pathogenic specific site occur geographically independently in the United States and Europe. . Live vaccines with mutations defined as the basis for the attenuation of the invention can avoid the drawbacks of the current generation of attenuated vaccines. Another advantage of said attenuating mutations is their known molecular specificity which allows them to be used as a unique marker for attenuated pestiviruses and to distinguish them from pestiviruses from that region. is there.
【0009】
従来の方法で弱毒化されるウイルスRespPRRSのアミノ酸配列及びヌクレオチド
配列は、本来の領域の単離VR-2332と比較された。病原性特定部位を同定するた
めに、2つの記載される病原性復帰変異体は、互いに、及びVR-2332、さらにResp
PRRSと比較された。
これは、PRRSウイルスの病原性に関わる個々のウイルスタンパク質の病原性特
定部位を同定することを可能にした。
その結果、本発明の1つの局面は、RespPRRSではなく、PRRSウイルスATCC VR-2
332より少ない病原性であり、前記VR-2332株について図1に記載されるORF 1a、
前記VR-2332株について図2に記載されるORF 1b、及び/又は前期VR-2332k部に
ついて図3に記載されるORF 2の群から選択されるオープンリーディングフレー
ム(ORF)によってコードされるタンパク質を含むことを特徴とする、生きてい
るPRRSウイルスに関する(同定される病原性特定部位でアミノ酸の少なくとも1
個が前記の対応する位置でVR-2332株のアミノ酸の少なくとも1個と同一ではない
)。The amino acid and nucleotide sequences of the virus RespPRRS, which were attenuated by conventional methods, were compared to the isolated VR-2332 of the original region. In order to identify pathogenic specific sites, the two described virulence revertants were isolated from each other, and VR-2332, and Resp.
Compared to PRRS. This allowed the identification of virulence specific sites of individual viral proteins involved in PRRS virus virulence. As a result, one aspect of the invention is the PRRS virus ATCC VR-2, but not RespPRRS.
ORF 1a which is less pathogenic than 332 and is described in Figure 1 for the VR-2332 strain,
A protein encoded by an open reading frame (ORF) selected from the group of ORF 1b described in FIG. 2 for the VR-2332 strain and / or ORF 2 described in FIG. 3 for the early VR-2332k region is selected. A live PRRS virus, characterized in that it comprises at least one of the amino acids at the identified pathogenic site
Is not identical to at least one of the amino acids of the VR-2332 strain at the corresponding position above).
【0010】
アミノ酸及びヌクレオチドの番号付けは、VR-2332のデータベース登録に従う
。図1、2及び3は、すべてのPRRS株について代表する情報を与え、本発明を可
視化させ、異なって番号付けされる可能性のあるすべてのPRRSウイルスの好まし
いアミノ酸及び好ましい部位を同定させる。これらの位置の同定は、目的のPRRS
株及び列記される参照株において保存される特徴的な同一のアミノ酸を同定し、
続いて図1、2及び/又は3の部位に関連する目的のウイルスの部位の位置を決
定することによって達成される。
3つの前記部位は、VR-2332について図1、2及び3に記載されるウイルスORF
1a、ORF 1b及び/又はORF 2によってコードされるタンパク質について同定され
る。Amino acid and nucleotide numbering follows VR-2332 database entry. Figures 1, 2 and 3 give representative information for all PRRS strains, visualize the invention and identify preferred amino acids and preferred sites of all potentially differently numbered PRRS viruses. Identification of these positions is based on the desired PRRS.
Identifying a characteristic identical amino acid conserved in the strain and the reference strains listed,
This is accomplished by subsequently locating the site of the virus of interest relative to the site of Figures 1, 2 and / or 3. The three said sites are the viral ORFs described in Figures 1, 2 and 3 for VR-2332.
Identified for proteins encoded by 1a, ORF 1b and / or ORF 2.
【0011】
本発明の他の局面は、RespPRRSでないVR-2332において、ORF 1aの位置321〜34
1の少なくとも1つのアミノ酸が図1に記載される対応する位置でVR 2332株のア
ミノ酸と同一でないこと及び/又はORF 1bの位置936〜956の少なくとも1つのア
ミノ酸が図2に記載される対応する位置でVR 2332株のアミノ酸と同一でないこ
と及び/又はORF 2の位置1〜20の少なくとも1つのアミノ酸が図3に記載される
対応する位置でVR 2332株のアミノ酸と同一でないことを本質的に特徴とするORF
1a、1b及び2を含む生きている弱毒化PRRSウイルスに関する。このように、ORF
1aの部位321〜341、ORF 1bの部位936〜956、及び/又はORF 2の部位1〜20で(そ
れぞれ、図4、5又は6を参照のこと)、1つ以上のアミノ酸についてコードす
るヌクレオチドトリプレットは突然変異して、核酸レベルで、又はさらに優先的
にアミノ酸レベルで、前記部位で配列の1つ又は複数の変更を生じ、そのため前
記部位ですべてのヌクレオチド又はアミノ酸位置まで突然変異する場合がある。
前記部位の1つ、2つ又は3つのすべてが突然変異するウイルスは、本発明に包含
される。「突然変異」は、「置換」と呼ばれる他のものでアミノ酸を置換するこ
と又は他のもので(例えばCをTで)コードするヌクレオチドを置換すること、好
ましくはコードされるアミノ酸を置換し、又は「欠失」又は「付加」のようなそ
の他の突然変異のような方法で行うことを意味する。突然変異はコードするヌク
レオチド配列で常に行われる。
前記突然変異は、従来から知られている標準方法、例えばMeulenbergら、Adv.
Exp. Med. Biol, 1998,440: 199-206)に記載される感染性コピーの部位特異的
変異誘発(例えば、Sambrookら、(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Man
ual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N
ew York)によって行ってもよい。Another aspect of the invention is in VR-2332, which is not RespPRRS, at positions 321-34 of ORF 1a.
At least one amino acid of 1 is not identical to the amino acid of the VR 2332 strain at the corresponding position described in FIG. 1 and / or at least one amino acid of positions 936-956 of ORF 1b is the corresponding amino acid described in FIG. Essentially not identical to the amino acid of the VR 2332 strain at position and / or at least one amino acid at positions 1 to 20 of ORF 2 is not identical to the amino acid of the VR 2332 strain at the corresponding position depicted in FIG. Characteristic ORF
It relates to live attenuated PRRS viruses including 1a, 1b and 2. Thus, ORF
Nucleotides coding for one or more amino acids at sites 321-341 of 1a, sites 936-956 of ORF 1b, and / or sites 1-20 of ORF 2 (see FIGS. 4, 5 or 6, respectively). The triplet may be mutated, resulting in one or more alterations in the sequence at the site, at the nucleic acid level, or more preferentially at the amino acid level, thus mutating to all nucleotide or amino acid positions at the site. is there.
Viruses in which one, two or all three of said sites are mutated are included in the invention. A "mutation" is the replacement of an amino acid with another, called a "substitution", or the replacement of a nucleotide encoding with another (eg, C with T), preferably replacing the encoded amino acid, Or other mutations such as "deletion" or "addition". Mutations are always made in the encoding nucleotide sequence. Said mutations are standard methods known in the art, for example Meulenberg et al., Adv.
Exp. Med. Biol, 1998, 440: 199-206) site-directed mutagenesis of infectious copies (see, eg, Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Man.
ual, 2 nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N
ew York).
【0012】
「本質的に」は、配列の少なくとも75%、好ましくは85%、最も好ましくは本
発明の「部位」を除く配列のすべてが、VR 2332と同一であることを意味する。
しかし、本発明の前記部位の外側でアミノ酸をコードする付加的な核酸も突然変
異されてもよい。本発明の前記ウイルスは、依然として本発明の基準を満たして
いる(すなわち野生型に復帰しそうになく、VR 2332よりも病原性が低い)。
本発明の生きているPRRSウイルスは、ブタに感染する能力があり、ブタの体内
で複製する能力がある、E.J. Snijderら(上記参照)で定義されるPRRSウイルス
を参照する。従来法で弱毒化されるRespPRRSウイルスは、明確に否定される。そ
れは本発明のウイルスではなく、請求項の範囲から特に除かれる。RespPRRSウイ
ルスは、ベーリンガーインゲルハイムフェトメディカ社(Ingelvac(登録商標)
PRS MLV)から市販されている。その配列のほとんどは公然と入手可能である(G
enebank AJ 223082)。By “essentially” is meant that at least 75% of the sequences, preferably 85%, and most preferably all of the sequences except the “sites” of the present invention are identical to VR 2332.
However, additional nucleic acids encoding amino acids outside of said sites of the invention may also be mutated. The virus of the invention still meets the criteria of the invention (ie unlikely to revert to wild type and less pathogenic than VR 2332). Live PRRS virus of the present invention refers to the PRRS virus defined in EJ Snijder et al. (See above), which is capable of infecting pigs and capable of replicating in the body of pigs. RespPRRS virus, which is conventionally attenuated, is clearly denied. It is not a virus of the invention and is specifically excluded from the scope of the claims. RespPRRS virus is Boehringer Ingelheim Fetmedica (Ingelvac®)
From PRS MLV). Most of the sequences are publicly available (G
enebank AJ 223082).
【0013】
本発明に特に重要な部位及びアミノ酸は、VR-2332について定義される正確な
位置に限定されないが、その位置にあり、又はその他のPRRS株のその位置に対応
する好ましいアミノ酸を指摘するために典型的な方法で単に使用される。異なる
PRRSウイルスについて、好ましいアミノ酸の位置の番号付けは異なってもよいが
、動脈ウイルス科のウイルスの分子生物学の分野における専門家は、前記タンパ
ク質のその他の保存されたアミノ酸に関連するそれらの位置によってこれらの好
ましいアミノ酸を容易に同定するであろう。
用語「PRRSウイルスVR-2332よりも少ない病原性」は、VR-2332による目的のウ
イルスの臨床症状の比較の点で理解されるべきである。PRRSウイルスがPRRSウイ
ルスVR-2332よりも少ない病原性であるか否かを決定するための好ましい方法は
、実施例1に記載される。病原性特定部位の好ましいアミノ酸突然変異が病原性
の低減に関係するとは限らない。実施例1の方法は、本発明の教示に従うタンパ
ク質を含む生きているPRRSウイルスが単離した野外のVR-2332の病原性よりも少
ない病原性であるか否かを決定するための正確で、単純な実験装置を提供する。Sites and amino acids of particular interest to the present invention are not limited to the exact positions defined for VR-2332, but point to preferred amino acids at that position or corresponding to that position in other PRRS strains. Simply used in a typical way for. different
For the PRRS virus, the numbering of the preferred amino acid positions may vary, but experts in the field of molecular biology of viruses of the arterial viridae will be dependent on their position relative to other conserved amino acids of the protein. These preferred amino acids will be easily identified. The term "PRRS virus less pathogenic than VR-2332" should be understood in terms of a comparison of clinical manifestations of the virus of interest by VR-2332. A preferred method for determining whether a PRRS virus is less pathogenic than PRRS virus VR-2332 is described in Example 1. Preferred amino acid mutations at a pathogenic site are not always associated with reduced pathogenicity. The method of Example 1 is accurate for determining whether a live PRRS virus containing a protein according to the teachings of the present invention is less virulent than that of isolated field VR-2332, Provide a simple experimental device.
【0014】
病原性特定部位は、弱毒化ウイルスからVR-2332のアミノ酸への少なくとも1つ
のアミノ酸の復帰変異によって同定される。この特定のアミノ酸は、大きな二次
ペプチド構造、例えばアルファヘリックス又はβシート又はヘアピンβモチーフ
又はその他の一部である。従って、隣接アミノ酸がタンパク質の病原性の調節に
含まれる蓋然性が高い。従って、タンパク質化学の分野における専門家は、さら
に当初特定されていたアミノ酸の位置の左に、及び右に10個のアミノ酸の付近内
の病原性に関連した性質によってアミノ酸を特定する高い確率を期待する。10〜
20個のアミノ酸は、タンパク質のペプチドモチーフの典型的な領域である。従っ
て、本発明の好ましいウイルスは、模範的な方法で図1に記載される、又はその
他の株のそれに対応するタンパク質を含み、病原性特定部位は、当初特定されて
いたアミノ酸の位置の上流に10個のアミノ酸及び下流に10個のアミノ酸を含む。
より好ましくは、上述のそれらのウイルスであり、その病原性特定部位は、当初
特定されていたアミノ酸の位置の上流に5個のアミノ酸及び下流に5個のアミノ酸
を含む。最も好ましくは、上述のそれらのウイルスであり、その病原性特定部位
は、当初特定されていたアミノ酸の位置の上流に3個のアミノ酸及び下流に3個の
アミノ酸を含む。The pathogenic site is identified by a backmutation of at least one amino acid from the attenuated virus to the amino acid of VR-2332. This particular amino acid is a large secondary peptide structure, such as an alpha helix or β sheet or hairpin β motif or other part. Therefore, adjacent amino acids are likely to be involved in the regulation of protein pathogenicity. Therefore, experts in the field of protein chemistry also expect high probability of identifying amino acids by virtue of their pathogenicity-related properties within 10 amino acids to the left of the originally identified amino acid position and to the right. To do. Ten~
The 20 amino acids are a typical region of the peptide motif of proteins. Accordingly, preferred viruses of the invention include proteins corresponding to those of FIG. 1 in an exemplary manner, or of other strains, wherein the virulence site is upstream of the originally identified amino acid position. Contains 10 amino acids and 10 amino acids downstream.
More preferably, those viruses described above, the pathogenicity-specific site of which comprises 5 amino acids upstream and 5 amino acids downstream of the originally specified amino acid position. Most preferred are those viruses mentioned above, whose pathogenicity-specific site comprises 3 amino acids upstream and 3 amino acids downstream of the originally specified amino acid position.
【0015】
本発明の教示に従って、病原性特定部位でアミノ酸を突然変異することによっ
て、病原性野外株から弱毒化PRRS株を産生することが可能である。RNAウイルス
における突然変異の高い確率に関係する安全性の問題は、依然として残っている
。この問題は、ウイルスタンパク質の病原性特定部位の特定のアミノ酸を欠失す
ることによって大幅に低減することができる。従って、本発明は、ウイルスタン
パク質の病原性特定部位の少なくとも1つのアミノ酸が欠失していることを特徴
とする上述のPRRSウイルスに関する。用語「欠失」は、その位置で、又はそれら
の位置で図において参照されるアミノ酸との比較で欠失しているものと理解され
るべきである。このように、本発明によれば、「欠失」は1個又は複数個のヌク
レオチド又はアミノ酸の除去を意味する。In accordance with the teachings of the present invention, it is possible to produce an attenuated PRRS strain from a pathogenic field strain by mutating amino acids at the pathogenic site. The safety issues associated with the high probability of mutations in RNA viruses remain. This problem can be greatly reduced by deleting certain amino acids at the pathogenic site of viral proteins. Therefore, the present invention relates to the above-mentioned PRRS virus, which is characterized in that at least one amino acid at the pathogenic specific site of the viral protein is deleted. The term "deletion" should be understood to be deleted at that position or relative to the amino acids referenced in the figures at those positions. Thus, according to the present invention, "deletion" means the removal of one or more nucleotides or amino acids.
【0016】
従って、より好ましい実施態様において、本発明は、ORF 1aの位置321〜341の
少なくとも1個のアミノ酸が欠失し、及び/又はORF 1bの位置936〜956の少なく
とも1個のアミノ酸が欠失し、及び/又は位置1〜20の少なくとも1個のアミノ酸
が欠失していることを特徴とする、本発明の生きている弱毒化PRRSウイルスに関
する。このように、ORF 1aの部位321〜341、ORF 1bの部位936〜956、又はORF 2
の部位1〜20で、又は3つの部位すべてで、1個のアミノ酸トリプレット、複数の
トリプレットをコードしているヌクレオチドは、欠失して、前記部位で1個又は
複数個の欠失を生じる。1個のヌクレオチド又は1個のアミノ酸のみが欠失してい
るウイルス及び前記部位の1つ、又はすべての部位が完全に欠失しているウイル
スは、本発明に包含される(それぞれ、図4、5又は6を参照)。Thus, in a more preferred embodiment, the invention provides that at least one amino acid at positions 321-341 of ORF 1a is deleted and / or at least one amino acid at positions 936-956 of ORF 1b is deleted. It relates to a live attenuated PRRS virus according to the invention, characterized in that it is deleted and / or has at least one amino acid in position 1 to 20 deleted. Thus, ORF 1a sites 321-341, ORF 1b sites 936-956, or ORF 2
Nucleotides encoding one amino acid triplet, multiple triplets at sites 1-20, or at all three sites, are deleted, resulting in one or more deletions at said sites. Viruses in which only one nucleotide or one amino acid is deleted and viruses in which one or all of said sites are completely deleted are encompassed by the invention (FIG. 4, respectively). 5 or 6).
【0017】
特定のPRRSウイルスタンパク質の同定された病原性特定部位について、少なく
とも1個のアミノ酸が高い変異性圧力を受けており、野外株VR-2332の復帰変異体
の病原性に関係することは、好ましい実施例で示されている。この個々のアミノ
酸の位置は、本発明の最も好ましい実施態様である。
従って、最も好ましい実施態様において、本発明は、RespPRRSではなく、ATCC
VR 2332よりも少ない病原性である本発明の生きている弱毒化PRRSウイルスに関
し、ORF 1aの位置331のアミノ酸及び/又はORF 1bの位置946のアミノ酸及び/又
はORF 2の位置10のアミノ酸が前記対応する位置でATCC VR 2332株のアミノ酸と
同一でないことを特徴とする。このように、ORF 1aの部位331、ORF 1bの部位946
、又はORF 2の部位10又は3つの部位すべてで、1個のアミノ酸トリプレットをコ
ードするヌクレオチド又はアミノ酸は突然変異して、前記部位で1〜3の突然変異
を生じる(それぞれ、図4、5又は6を参照)。At least one amino acid is under high mutagenic pressure for the identified pathogenic site of the particular PRRS viral protein, implicated in the pathogenicity of revertants of the field strain VR-2332. , Shown in the preferred embodiment. This individual amino acid position is the most preferred embodiment of the invention. Therefore, in a most preferred embodiment, the invention relates to a live attenuated PRRS virus of the invention that is less pathogenic than ATCC VR 2332, but not RespPRRS, with the amino acid at position 331 of ORF 1a and / or ORF 1b. At position 946 and / or at position 10 of ORF 2 is not identical to the amino acid of ATCC VR 2332 strain at the corresponding position. Thus, site 331 of ORF 1a and site 946 of ORF 1b.
, Or ORF 2 at site 10 or all three sites, the nucleotide or amino acid encoding a single amino acid triplet is mutated resulting in 1-3 mutations at said site (FIGS. 4, 5 or respectively, respectively). See 6).
【0018】
前記理由のために、復帰しやすいアミノ酸を容易に欠失することによって、改
変したアミノ酸が病原性の強いタイプに復帰することを避けることは、安全であ
り、好ましい。従って、本発明は、この最も好ましい実施態様において、本発明
の生きている弱毒化されたPRRSウイルスに関し、VR-2332のその位置と比較した
場合に、ORF 1aの位置331のアミノ酸及び/又はORF 1bの位置946のアミノ酸及び
/又はORF 2の位置10のアミノ酸が欠失し、すなわち無いことを特徴とする。さ
らに、最も好ましい実施態様は、本発明の生きている弱毒化PRRSウイルスであり
、ORF 1aの位置331のアミノ酸、すなわちコーディングトリプレットが欠失して
いることを特徴とする。さらに、最も好ましい実施態様は、本発明の生きている
弱毒化PRRSウイルスであり、ORF 1bの位置946のアミノ酸、すなわちコーディン
グトリプレットが欠失していることを特徴とする。さらに、最も好ましい実施態
様は、本発明の生きている弱毒化されたPRRSウイルスであり、ORF 2の位置10の
アミノ酸、すなわちコーディングトリプレットが欠失していることを特徴とする
(それぞれ、図4、5又は6を参照)。前記最も好ましいウイルスはすべての他
の位置でVR-2332と同一である。For the above reasons, it is safe and preferred to avoid the reversion of the modified amino acid to the highly pathogenic type by easily deleting the reversible amino acid. Therefore, in this most preferred embodiment, the invention relates to the live attenuated PRRS virus of the invention, when compared to its position in VR-2332, the amino acid at position 331 of ORF 1a and / or the ORF. The amino acid at position 946 of 1b and / or the amino acid at position 10 of ORF 2 is deleted, ie is absent. Furthermore, the most preferred embodiment is a live attenuated PRRS virus of the invention, characterized in that the amino acid at position 331 of ORF 1a, ie the coding triplet, is deleted. Furthermore, the most preferred embodiment is the live attenuated PRRS virus of the invention, characterized in that the amino acid at position 946 of ORF 1b, ie the coding triplet, is deleted. Furthermore, the most preferred embodiment is a live attenuated PRRS virus of the invention, characterized by a deletion of the amino acid at position 10 of ORF 2, ie the coding triplet (FIG. 4, respectively). 5 or 6). The most preferred virus is identical to VR-2332 in all other positions.
【0019】
ここで、本発明の教示により、当業者は、VR-2332よりも少ない病原性であり
、生の医薬組成物を調製するのに有用であるPRRSウイルスの感染性クローンを遺
伝子組み換えにより産生することができるようになる。プラス鎖RNAウイルスの
組み換え感染性クローンを産生するのに要求されるすべての情報は、特にPRRSV
について、従来から容易に入手可能である。例えば、Meulenbergらの欧州特許出
願EP 0 839 912は(これによりその全内容は参照される)、生きている組み換え
PRRSウイルスの調製について明確に教示する。従って、他の局面において、本発
明は、本発明のウイルスをコードするヌクレオチド配列に関する。遺伝コード多
重ヌクレオチドの縮重により、変異体は同一のアミノ酸翻訳を生じる。また、そ
れらの縮重変異体も本発明に含まれる。Now, in accordance with the teachings of the present invention, one skilled in the art will genetically engineer a PRRS virus infectious clone that is less pathogenic than VR-2332 and that is useful in preparing raw pharmaceutical compositions. To be able to produce. All the information required to produce recombinant infectious clones of positive-strand RNA viruses can be found in particular PRRSV.
Regarding, it has been easily available. For example, the European patent application EP 0 839 912 of Meulenberg et al. (Which is hereby incorporated by reference in its entirety)
Clearly teach how to prepare PRRS virus. Therefore, in another aspect, the invention relates to nucleotide sequences encoding the viruses of the invention. Due to the degeneracy of the multiple nucleotides in the genetic code, variants produce identical amino acid translations. Also, degenerate variants thereof are included in the present invention.
【0020】
初めのページに記載したように、ブタの健康管理が医薬組成物のより少ない病
原性の生ワクチン株と病原性野生型ウイルス感染とを区別できることは重要であ
る。これは、特に野外感染の臨床症状が特異的又はその他の感染による多重感染
でない場合、又は観測及び評価の期間が短い場合には、しばしば困難である。目
的のウイルスの組み換え産生は、血清マーカー及び/又は病原性マーカーを確立
する遺伝コードの改変の導入を可能にする。血清マーカーは、感染した細胞又は
体液、例えば咽頭の液体又は鼻汁又は尿(これらに限定されない)から単離され
得る抗原的に検出可能な分子、例えばペプチド、タンパク質、糖タンパク質を参
照する。病原性マーカーは、組み換え解析方法、例えばPCR及び従来のシークエ
ンシング(これらに限定されない)によって同定され得る遺伝コードのマーカー
として理解されるべきである。従って、好ましい実施態様において、本発明は本
発明のヌクレオチド配列に関し、ヌクレオチド配列は病原性マーカー及び/又は
血清マーカーをコードするために改変される。特に、病原性を弱毒化する目的で
導入される突然変異又は欠失は、病原性及び血清マーカーとして有用である。開
示される病原性特定部位のこれらの突然変異をモニターすることによって、早期
段階で可能な限り病原性復帰変異体の発生を予測することができる。As described on the first page, it is important that porcine health care can distinguish between less pathogenic live vaccine strains of pharmaceutical compositions and pathogenic wild-type virus infections. This is often difficult, especially if the clinical manifestations of field infections are not multi-infections with specific or other infections, or if the observation and evaluation period is short. Recombinant production of the virus of interest allows the introduction of alterations in the genetic code that establish serum and / or pathogenic markers. Serum markers refer to antigenically detectable molecules such as peptides, proteins, glycoproteins that can be isolated from infected cells or body fluids such as, but not limited to, pharyngeal fluid or nasal fluid or urine. Pathogenic markers should be understood as markers of the genetic code that can be identified by recombinant analysis methods such as, but not limited to, PCR and conventional sequencing. Therefore, in a preferred embodiment, the invention relates to the nucleotide sequences of the invention, which nucleotide sequences are modified to encode a pathogenic marker and / or a serum marker. In particular, mutations or deletions introduced for the purpose of attenuating pathogenicity are useful as pathogenicity and serum markers. By monitoring these mutations of the disclosed virulence site, the occurrence of pathogenic revertants can be predicted as early as possible.
【0021】
本発明のヌクレオチド配列は、前記マーカーをコードするヌクレオチド配列が
構造的ウイルスタンパク質をコードするいずれのオープンリーディングフレーム
内に配置されるようなものであることがより好ましい。
本発明の別の局面は、本発明の感染性の生きている弱毒化PRRSウイルスの産生
方法に関し、前記方法は、少なくとも1つの全長DNAコピー又はインビトロ転写さ
れるRNAコピー又はそのいずれかの誘導体を含む上述の組み換え核酸を産生する
ことを含む。
本発明の他の好ましい実施態様は、本発明の方法に関し、特定の突然変異は分
子生物学的方法で挿入され、ORF 1aのアミノ酸位置321〜341に対応する核酸及び
/又はORFのアミノ酸位置936〜956に対応する核酸及び/又はアミノ酸位置1〜20
に対応する核酸が少なくとも1個のヌクレオチドが前記位置で置換又は欠失され
るような方法で突然変異されることを特徴とする。More preferably, the nucleotide sequence of the present invention is such that the nucleotide sequence encoding the marker is located in any open reading frame encoding a structural viral protein. Another aspect of the invention relates to a method of producing an infectious live attenuated PRRS virus of the invention, wherein said method comprises at least one full length DNA copy or an in vitro transcribed RNA copy or derivative thereof. Producing a recombinant nucleic acid as described above. Another preferred embodiment of the present invention relates to the method of the present invention, wherein the particular mutation is inserted in a molecular biology method, the nucleic acid corresponding to amino acid positions 321-341 of ORF 1a and / or amino acid position 936 of the ORF. Nucleic acid and / or amino acid positions 1-20 corresponding to 956
Is characterized in that the nucleic acid corresponding to is mutated in such a way that at least one nucleotide is replaced or deleted at said position.
【0022】
本発明の他の重要な局面は、本発明のPRRSウイルス及び医薬的に許容されるキ
ャリアを含む医薬組成物である。
「医薬組成物」は、それが投与される生物又はその表面に寄生する生物の生理
学的、例えば免疫学的機能を改変することができる1種以上の抗生物質又は駆虫
薬に制限されない成分及びその他の目的、例えば処理する形質、不妊、安定性、
組成物を経腸的又は非経口的ルート、例えば経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮
下、皮内又はその他の好適なルートで投与する可能性、投与後の耐容性、制御さ
れた放出特性(これらに限定されない)を達成するために添加されるその他の成
分から本質的になる。
医薬的に許容されるキャリアは、例えば安定性又は吸収の増加に作用し、又は
本発明のPRRSウイルスの遅い放出製剤の一部を形成する生理学的に許容される化
合物を含むことができる。そのような生理学的に許容される化合物としては、例
えばグルコース、スクロース又はデキストランのような炭水化物、アスコルビン
酸又はグルタチオンのような酸化防止剤、キレート剤、低分子量タンパク質又は
その他の安定化剤又は賦形剤が挙げられる(例えばRemington's Pharmaceutical
Sciences (1990). 18th ed. Mack Publ., Eastonを参照)。当業者は、生理学
的に許容される化合物を含む医薬的に許容されるキャリアの選択が例えば組成物
の投与経路に依存することを知っているであろう。Another important aspect of the present invention is a pharmaceutical composition comprising the PRRS virus of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier. A "pharmaceutical composition" is a component that is not limited to one or more antibiotics or anthelmintic drugs that can modify the physiological, e. Purpose of, for example, traits to be treated, infertility, stability,
Possibility of administering the composition by the enteral or parenteral route, for example oral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal or other suitable routes, tolerability after administration, controlled release It consists essentially of the other ingredients that are added to achieve the properties, including but not limited to. Pharmaceutically acceptable carriers can include, for example, physiologically acceptable compounds that act on stability or increase absorption or form part of a slow release formulation of the PRRS virus of the present invention. Such physiologically acceptable compounds include, for example, carbohydrates such as glucose, sucrose or dextran, antioxidants such as ascorbic acid or glutathione, chelating agents, low molecular weight proteins or other stabilizers or excipients. Agents (eg Remington's Pharmaceutical
Sciences (1990). 18 th ed. Mack Publ., Easton). Those skilled in the art will know that the choice of pharmaceutically acceptable carrier, including the physiologically acceptable compound, will depend, for example, on the route of administration of the composition.
【0023】
本発明の別の局面は、本発明のウイルスの使用に関する。本発明の生きている
弱毒化PRRSウイルスの有用性により、PRRS感染の予防及び治療のためのワクチン
の製造でこれらを使用することが可能である。弱毒化の中心である定義された分
子は、この従来法で弱毒化されたウイルスよりも優れたものを生成する。特に、
病原性特定部位の欠失を含む本発明のウイルスの使用は、欠失が復帰する可能性
が少ないために好ましい。
以下の実施例は、本発明をさらに詳しく説明するためのものであるが、これは
、ここに開示される本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでない。Another aspect of the invention relates to the use of the viruses of the invention. The utility of the live attenuated PRRS viruses of the present invention allows their use in the manufacture of vaccines for the prevention and treatment of PRRS infections. The defined molecule, which is the center of attenuation, produces better than this conventionally attenuated virus. In particular,
The use of the virus of the present invention containing a deletion of the pathogenic specific site is preferred because the deletion is less likely to revert. The following examples are intended to illustrate the invention in more detail, but this should not be construed as limiting the scope of the invention disclosed herein.
【0024】参考文献
1. Snijder E. J., Meulenberg J. J. M., 1998. The molecular biology of ar
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t Pathol 35: 1-20.
【0025】実施例1 弱毒化の形成
この実施例はPRRSウイルスの2つの異なる株の病原性の比較のための明瞭なガ
イダンスを提供する。
1グループ当たり少なくとも10頭の未経産雌豚が各試験に含まれ、PRRSの無い
農場から誘導される。
動物はPRRSウイルス特定血清抗体の無い試験、又はPRRSVについて負の試験を
受ける。試験に含まれるすべての動物は同じ源及び系統である。グループに割り
当てられる動物は無秩序である。
検証は、鼻孔当たり105TDCID50(第三継代)による1mlのPRRSVの鼻孔間適用で
妊娠90日で行われる。各試験設定について少なくとも3つのグループがある:
VR-2332検証についてのグループ;可能な限り弱毒化されたウイルスによる検証
についての試験グループ;厳格なコントロールグループ。
研究の妥当性は、厳格なコントロールが研究の時間的経過に対してPRRSネガテ
ィブである場合に与えられ、VR2332検証グループの厳格なコントロールと比較し
て少なくとも25%短い寿命の健康な子豚が生まれる。
弱毒化、すなわち弱い病原性は、生殖能力を決定する1つ以上のパラメータの
系統的に有意な変化で定義される:
試験グループの以下のパラメータの少なくとも1つで大きな減少が好ましい:
・死産の頻度
・妊娠の112日以前の流産
・ミイラ化した子豚の数
・寿命及び弱い(life and weak)子豚の数
・離乳前の死亡率
又は試験グループの以下のパラメータの1つの明らかな増大はさらに好ましい:
・雌豚当たり離乳した子豚の数
・雌豚当たり生まれた命の健康な子豚の数
・VR2332感染したグループとの比較 Example 1 Formation of Attenuation This example provides clear guidance for the comparison of pathogenicity of two different strains of PRRS virus. At least 10 heifers per group are included in each trial and are derived from farms without PRRS. Animals will be tested for no PRRS virus specific serum antibody or negative for PRRSV. All animals included in the study are of the same source and strain. Animals assigned to groups are chaotic. Validation is performed at day 90 of gestation with an intranasal application of 1 ml PRRSV with 10 5 TDCID 50 per nostril (3rd passage). There are at least 3 groups for each test setting: a group for VR-2332 validation; a test group for validation with as attenuated viruses as possible; a strict control group. Study relevance is given when strict controls are PRRS negative for the time course of the study, resulting in healthy piglets with at least 25% shorter lifespans compared to the VR2332 validation group strict controls. . Attenuation, or weak pathogenicity, is defined as a systematically significant change in one or more parameters that determine fertility: A large reduction in at least one of the following parameters of the test group is preferred: Frequency, abortion before 112 days of pregnancy, number of mummified piglets, number of life and weak piglets, pre-weaning mortality or one apparent increase in one of the following parameters of the test group: More preferred: -Number of weaned piglets per sow-Number of life-threatening piglets born per sow-Comparison with VR2332 infected group
【図1】標識された本発明の好ましい弱毒化部位を有するATTC VR-2332のOR
F 1aのアミノ酸配列である。PRRSウイルスATCC VR-2332株のアミノ酸配列のアラ
インメントである。FIG. 1 OR of ATTC VR-2332 with a preferred attenuated site of the invention labeled.
This is the amino acid sequence of F 1a. It is an alignment of the amino acid sequences of the PRRS virus ATCC VR-2332 strain.
【図2】標識された本発明の好ましい弱毒化部位を有するATTC VR-2332のOR
F 1bのアミノ酸配列である。PRRSウイルスATCC VR-2332株のアミノ酸配列のアラ
インメントである。FIG. 2 OR of ATTC VR-2332 with preferred attenuated sites of the invention labeled.
This is the amino acid sequence of F 1b. It is an alignment of the amino acid sequences of the PRRS virus ATCC VR-2332 strain.
【図3】標識された本発明の好ましい弱毒化部位を有するATTC VR-2332のOR
F 2のアミノ酸配列である。PRRSウイルスATCC VR-2332株のアミノ酸配列のアラ
インメントである。FIG. 3: OR of ATTC VR-2332 with preferred attenuated sites of the invention labeled.
This is the amino acid sequence of F 2. It is an alignment of the amino acid sequences of the PRRS virus ATCC VR-2332 strain.
【図4】ボールド体の本発明の好ましい弱毒化部位及び下線部の最も好まし
い部位を有するATTC VR-2332のORF 1aのヌクレオチド配列である。FIG. 4 is the nucleotide sequence of ORF 1a of ATTC VR-2332 with preferred attenuated sites of the invention in bold and most preferred underlined sites.
【図5】ボールド体の本発明の好ましい弱毒化部位及び下線部の最も好まし
い部位を有するATTC VR-2332のORF 1bのヌクレオチド配列である。FIG. 5 is the nucleotide sequence of ORF 1b of ATTC VR-2332 with preferred attenuated sites of the invention in bold and most preferred underlined sites.
【図6】ボールド体の本発明の好ましい弱毒化部位及び下線部の最も好まし
い部位を有するATTC VR-2332のORF 2のヌクレオチド配列である。FIG. 6 is the nucleotide sequence of ORF 2 of ATTC VR-2332 with the preferred attenuated site of the invention in bold and the most preferred underlined site.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 100 03 372.5 (32)優先日 平成12年1月26日(2000.1.26) (33)優先権主張国 ドイツ(DE) (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE,TR),EA(AM ,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM) ,AE,AU,BG,BR,CA,CN,CZ,EE, HR,HU,ID,IL,IN,JP,KR,LT,L V,MX,NO,NZ,PL,RO,SG,SI,SK ,UA,US,UZ,VN,YU,ZA (72)発明者 レングベルス ハイケ ドイツ連邦共和国 49545 テックレンブ ルク ニーデルドルフェルシュトラーセ 2 Fターム(参考) 4B024 AA01 BA32 CA04 CA06 DA02 EA04 GA11 4B065 AA97X AA99Y AB01 AC20 BA02 BA14 CA43 4C085 AA03 BA51 DD01 EE01 EE07 GG02 GG03 GG04 GG05 GG08─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page (31) Priority claim number 100 03 372.5 (32) Priority date January 26, 2000 (January 26, 2000) (33) Priority country Germany (DE) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, I T, LU, MC, NL, PT, SE, TR), EA (AM , AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM) , AE, AU, BG, BR, CA, CN, CZ, EE, HR, HU, ID, IL, IN, JP, KR, LT, L V, MX, NO, NZ, PL, RO, SG, SI, SK , UA, US, UZ, VN, YU, ZA (72) Inventor Leng Bells Haike Federal Republic of Germany 49545 Techrembe Luk Niederdolfelstraße Two F-term (reference) 4B024 AA01 BA32 CA04 CA06 DA02 EA04 GA11 4B065 AA97X AA99Y AB01 AC20 BA02 BA14 CA43 4C085 AA03 BA51 DD01 EE01 EE07 GG02 GG03 GG04 GG05 GG08
Claims (11)
RF 1a、1b及び2を含む、生きている弱毒化PRRSウイルスであって、ORF 1aの位置
321〜341のアミノ酸の少なくとも1つが対応する位置でVR 2332株のアミノ酸と同
一ではなく、及び/又はORF 1bの位置936〜956のアミノ酸の少なくとも1つが対
応する位置でVR 2332株のアミノ酸と同一ではなく、及び/又はORF 2の位置1〜2
0のアミノ酸の少なくとも1つが対応する位置でVR 2332株のアミノ酸と同一では
ないことを特徴とする前記生きている弱毒化PRRSウイルス。1. An essentially O as found in VR-2332 that is not RespPRRS.
A live attenuated PRRS virus comprising RF 1a, 1b and 2 and the location of ORF 1a
At least one of the amino acids 321 to 341 is not identical to the amino acid of the VR 2332 strain at the corresponding position and / or is identical to an amino acid of the VR 2332 strain at the corresponding position to at least one of the amino acids at positions 936 to 956 of ORF 1b. And / or positions 1-2 of ORF 2
Said live attenuated PRRS virus, characterized in that at least one of the 0 amino acids is not identical to the amino acid of the VR 2332 strain at the corresponding position.
、及び/又はORF 1bの位置936〜956のアミノ酸の少なくとも1つが欠失し、及び
/又は位置1〜20のアミノ酸の少なくとも1つが欠失している請求の範囲第1項に
記載の生きている弱毒化PRRSウイルス。2. At least one of the amino acids at positions 321-341 of ORF 1a is deleted and / or at least one of the amino acids at positions 936-956 of ORF 1b is deleted and / or at positions 1-20. The live attenuated PRRS virus of claim 1, wherein at least one of the amino acids is deleted.
ミノ酸及び/又はORF 2の位置10のアミノ酸が対応する位置のATCC VR 2332株の
アミノ酸と同一でない請求の範囲第1項又は第2項に記載の生きている弱毒化PR
RSウイルス。3. An amino acid at position 331 of ORF 1a and / or an amino acid at position 946 of ORF 1b and / or an amino acid at position 10 of ORF 2 are not identical to the amino acid of the ATCC VR 2332 strain at the corresponding position. Live attenuated PR according to paragraph 1 or 2
RS virus.
ミノ酸及び/又はORF 2の位置10のアミノ酸が欠失している請求の範囲第1項か
ら第3項のいずれか一項に記載の生きている弱毒化PRRSウイルス。4. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the amino acid at position 331 of ORF 1a and / or the amino acid at position 946 of ORF 1b and / or the amino acid at position 10 of ORF 2 is deleted. A live attenuated PRRS virus according to claim 1.
スをコードするヌクレオチド配列。5. A nucleotide sequence encoding the virus according to any one of claims 1 to 4.
修飾されている請求の範囲第5項に記載のヌクレオチド配列。6. The nucleotide sequence according to claim 5, which has been modified to encode a toxicity marker and / or a serum marker.
ドするオープンリーディングフレームのいずれの配列にも存在する請求の範囲第
6項に記載のヌクレオチド配列。7. The nucleotide sequence according to claim 6, wherein the nucleic acid encoding the marker is present in any sequence of the open reading frame encoding a structural viral protein.
、少なくとも1つの全長DNAコピー又は生体外転写RNAコピーを含む組み換え核酸
、あるいはそのいずれかの誘導体を産生することを含み、前記ヌクレオチド配列
が請求の範囲第5項から第7項のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列である
ことを特徴とする前記方法。8. A method of producing an infectious, live attenuated PRRS virus, the method comprising producing a recombinant nucleic acid comprising at least one full length DNA copy or an in vitro transcribed RNA copy, or a derivative thereof. 8. The method, comprising, wherein the nucleotide sequence is the nucleotide sequence according to any one of claims 5 to 7.
ミノ酸位置321〜341に対応する核酸及び/又はORFのアミノ酸位置936〜956に対
応する核酸及び/又はアミノ酸位置1〜20に対応する核酸を前記位置の少なくと
も1つのヌクレオチドが置換又は欠失するような方法で変異させる請求の範囲第
8項に記載の方法。9. A nucleic acid and / or amino acid position corresponding to amino acid position 321 to 341 of ORF 1a and / or amino acid position 936 to 956 of ORF 1a, wherein the specific mutation is inserted by a molecular biological method. 9. A method according to claim 8 wherein the nucleic acid corresponding to 1 to 20 is mutated in such a way that at least one nucleotide at said position is replaced or deleted.
ウイルス及び薬剤的に許容される担体を含む医薬組成物。10. The PRRS according to any one of claims 1 to 4.
A pharmaceutical composition comprising a virus and a pharmaceutically acceptable carrier.
請求の範囲第1項から第4項のいずれか一項に記載のPRRSウイルスの使用。11. Use of the PRRS virus according to any one of claims 1 to 4 in the manufacture of a vaccine for the prevention and treatment of PRRS infection.
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