JP2003520025A - ｐ１９３タンパク質、並びにその核酸及び使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 記載されるのは、ｐ１９３と称される細胞周期制御タンパク質をコードする、及び該タンパク質の発現を制御するヌクレオチド配列、並びに該タンパク質配列をコードする及びその発現を制御するヌクレオチド配列を含む組換えベクター及び宿主細胞である。やはり記載されるのは、ｐ１９３又はその経路を制御することにより、細胞の細胞周期を修飾するための方法である。細胞内のアポトーシスを誘導するための方法は、細胞内のプロアポトーシスｐ１９３タンパク質のレベルを増加させることにより、提供される。細胞内のアポトーシスを抑制するか、又は細胞の増殖性潜在力を増加させるための方法は、細胞内のプロアポトーシスｐ１９３タンパク質のレベルを減少させることにより、及び／又は天然ｐ１９３シグナル伝達経路に干渉することにより、例えばドミナントネガティブ突然変異を有するｐ１９３タンパク質を利用することにより、提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 関連出願への参照 本出願は、そのまま参照により本明細書に参照されている、１９９９年８月２
３日出願の米国特許出願第６０／１５０，２６６号の利益を請求する。

【０００２】 発明の背景 本発明は、概して細胞生理学に、そしてより特定すると細胞周期の調節タンパ
ク質に関する。特に、本発明は、ｐ１９３と呼称される新規なアポトーシス関連
タンパク質とその修飾された形態；ｐ１９３タンパク質をコードするヌクレオチ
ド配列；及びｐ１９３をコードするヌクレオチド配列のクローニング、調製及び
発現に関わる産物及び方法に関する。

【０００３】 正常な発達は細胞増殖とプログラムされた細胞死（アポトーシス）との微妙な
均衡に依存する。この均衡が変化すると重大な病態生理学的結果をもたらし得る
；細胞増殖が選好されるときに腫瘍発生が生じるのに対し、アポトーシスが選好
されるときには自己免疫及び／又は退行性の障害が生じるのである。

【０００４】 哺乳動物の細胞では、アポトーシスは少なくとも２種の独立した調節経路によ
り誘導され得る。第一の経路は細胞死受容体（Ashkenazi, A. et al. (1998) Sc
ience 281, 1305-1308 に概説される、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー
のメンバー）の直接的な活性化による。例えば、ＴＮＦＲ１又はＣＤ９５受容体
の活性化は主にＦＡＤＤ（Ｆａｓ関連デスドメイン）を介したシグナル伝達カス
ケードを始動させ、それが速やかにカスパーゼ８を活性化し、それによりアポト
ーシスが始動される。アポトーシスはまたＢｃｌ−２ファミリーメンバー（Adam
s, J. M. et al. (1998) Sciece 281, 1322-1326 に概説される）の活性を介し
ても調節され得る。原型的なファミリーメンバーであるＢｃｌ−２は、元来はあ
るヒトのリンパ腫における染色体転座により活性化される遺伝子として同定され
た（Tsujimoto, Y. et al. (1984) Science 226, 1097-1099；Bakhshi, A. et a
l. (1985) Cell 41, 899-906；Cleary, M. L. et al. (1986) Cell 47, 19-28）
。その後の分析により、１つ又はそれより多くのドメイン（Ｂｃｌ−２相同性ド
メイン、ＢＨ１〜ＢＨ４として知られる）でＢｃｌ−２と相同性を共有する約２
０種のタンパク質のファミリーが同定された。機能分析は、Ｂｃｌ−２と最大の
相同性をもったファミリーメンバーが細胞の生存を促進する傾向があるのに対し
、より遠く関連しているものはアポトーシスを促進する傾向があることを示した
。このプロアポトーシス群はさらにＢａｘサブファミリー（ＢＨ１、２及び３ド
メインを含有する；Oltvai, Z. N. et al. (1993) Cell 74, 609-619；Chittend
en, T. et al. (1995) Nature 374, 733-736；Kiefer, M. C. et al. (1995) Na
ture 374, 736-739；Farrow, S. N. et al. (1995) Nature 374, 731-733；Hsu,
Y. T. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 3668-3672 を参照のこ
と）とＢＨ３のみのサブファミリー（その名称が示唆するようにＢＨ３ドメイン
だけを含有する；Boyd, J. M. et al. (1994) Cell 79, 341-351；Boyd, J. M.,
et al., (1995) Oncogene 11, 1921-1928；Yang, E. et al., (1995) Cell 80,
285-291；Wang, K. et al. (1996) Genes Dev. 10, 2859-2869；Inohara, N. e
t al. (1997) EMBO J. 16, 1686-1694；Conradt, B. et al. (1998) Cell 93, 5
19-529；O'Connor, L. et al. (1998) EMBO J. 17, 384-395；Hegde, R. et al.
(1998) Journal of Biological Chemistry 273, 7783-7786. 11-18 を参照のこ
と）へ細分されている。

【０００５】 アポトーシスへの傾倒は、少なくとも部分的には、プロ生存（pro-survival）
及びプロアポトーシスのＢｃｌ−２ファミリーメンバーの相対レベルにより支配
され、それが次いで、Ａｐａｆ−１（カスパーゼ８のアクチベーター）の活性を
調節する。このように、システインプロテアーゼのカスパーゼファミリーは、は
じめの調節経路にかかわらず、アポトーシスの下流エフェクターである。ひとた
び活性化されると、カスパーゼ群は、細胞のオルガネラを破壊するタンパク分解
カスケードを始動させることによって細胞死をもたらし、それによりアポトーシ
スの診断となる明瞭な形態学的変化を生じる（Thornberry, N. A. et al. (1998
) Science 281, 1312-1316 に概説される）。これには、核の凝縮、ヌクレオソ
ーム連結部でのＤＮＡの分断、ミトコンドリアの崩壊、及び最終的には細胞の自
己溶解が含まれる。

【０００６】 ＤＮＡ腫瘍ウイルスの発癌タンパク質は、細胞の増殖及び死の分子調節を解明
するより有用なモデル系を提供してきた。（ＳＶ４０のラージＴ抗原とアデノウ
イルスのＥ１Ａにより代表されるような）これらのタンパク質の形質転換活性は
、内因性の細胞へ結合し、それにより細胞死調節タンパク質の活性を変化させる
その能力に概ね存する（Ludlow, J. W. et al. (1995) Virus Research 35, 113
-121；及び Moran, E. (1993) FASEB Journal 7, 880-885 に概説される）。Ｔ
抗原（Ｔ−Ａｇ）の場合、網膜芽細胞腫ファミリーのメンバー（ＲＢとその関連
タンパク質、ｐ１０７及びｐ１３０；DeCaprio, J. A. et al. (1988) Cell 54,
275-283；Ewen, M. E. et al. (1991) Cell 66, 1155-1164；Li, Y. et al. (1
993) Genes Dev. 7, 2366-2377 及び Hannon, G. J. et al. (1993) Genes Dev.
Dec. 7, 2378-2391 を参照のこと）へ結合するにはアミノ酸の残基１０５ない
し１１５が必要とされる。Ｔ−Ａｂ／ＲＢ結合は、Ｅ２Ｆファミリーメンバーの
（ＲＢへの結合により不活性状態で維持される）封鎖を阻止する。これらの転写
因子は、ひとたび遊離されると、Ｓ期エントリーに必要とされる数多くの遺伝子
の発現を活性化する（Nevins, J. R. (1992) Science 258, 424-429；Hatakeyam
a, M. et al. (1995) Prog. Cell Cycle Res. 1, 9-19；及び La Thangue, N. B
. (1996) Bioch. Soc. Trans. 24, 54-59 に概説される）。ｐ５３への結合には
、Ｔ−Ａｇのアミノ酸残基３５０ないし４５０と５３２ないし６２５の間に位置
する不連続な領域が必要とされる（Kierstead, T. D. et al. (1993) J. Virol.
67, 1817-1829）。他の活性があるなかで、ｐ５３はプロアポトーシス及び増殖
阻害遺伝子の両方の転写活性補助因子として機能する。Ｔ−Ａｇ／ｐ５３結合は
これら遺伝子の転写活性化を妨げ、同時にそれらの活性を阻害する（Bates, S.
et al. (1999) Cell. & Mol. Life Sci. 55, 28-37；及び Ko, L. J. et al. (1
996) Genes Dev. 10, 1054-1072）。

【０００７】 発明の概要 本発明の特徴は、ｐ１９３と呼称されるアポトーシス関連タンパク質の同定及
び特徴づけである。ｐ１９３はＳＶ４０ Ｔ−Ａｇ結合性のタンパク質であり、
ＢＨ３のみのプロアポトーシスファミリーの新規メンバーであるらしい。このこ
とは、ｐ１９３の発現がＮＩＨ−３Ｔ３細胞における速やかなアポトーシス反応
を促進したという観察から裏付けられる。免疫細胞学的な分析では、ｐ１９３が
細胞質のタンパク質であること、及びＴ−Ａｇの同時発現が両タンパク質の細胞
質の局在化をもたらすことを示した。ｐ１９３誘導性のアポトーシスが起こるの
はＧ₁においてであり、パルスチェイス実験は、Ｔ−Ａｇも細胞周期の同一点で
（一過性にせよ）細胞質に局在化することを明らかにした。このデータは、細胞
質におけるＴ−Ａｇ／ｐ１９３結合により実現されるｐ５３の封鎖とは独立に、
Ｔ−Ａｇが抗アポトーシス活性を保有するという結論に一致する。

【０００８】 従って、本発明の１つの側面は、ｐ１９３タンパク質の細胞内レベルをモジュ
レートすること、及び／又は細胞におけるｐ１９３タンパク質のシグナル伝達経
路に干渉することを含む、細胞の細胞周期を修飾するための方法に関する。特に
、野生型プロアポトーシスｐ１９３活性を増加させることは、アポトーシスを誘
導するために使用され、プロアポトーシスｐ１９３の細胞における活性のレベル
を減少させること（ｐ１９３シグナル伝達経路に干渉することを含む）は、アポ
トーシスを抑制する、及び／又は細胞増殖を促進するために使用され得る。プロ
アポトーシスｐ１９３活性の増加は、例えば、プロアポトーシスｐ１９３タンパ
ク質をコードする導入ＤＮＡの発現により実現され得る。プロアポトーシスｐ１
９３活性の減少は、典型的には、（例えば、アンチセンス技術により）細胞のネ
ーティブｐ１９３の発現レベルを減少させること、及び／又は、例えば、ネーテ
ィブｐ１９３タンパク質の生物学的機能の少なくとも一部に拮抗するドミナント
ネガティブｐ１９３タンパク質の導入により、ネーティブｐ１９３が介して作用
する経路への干渉により、達成され得る。本発明のある側面では、細胞の細胞周
期を修飾する方法には、ｐ５３タンパク質の発現の細胞内レベルを減少させるこ
と、又はｐ５３経路に干渉すること、及び／又は、Ｅ１Ａタンパク質の細胞内に
おける発現のレベルを増加させることと併せて、細胞のネーティブｐ１９３タン
パク質の発現レベルを減少させること、及び／又はｐ１９３経路に干渉すること
、が含まれる。

【０００９】 もう１つの側面では、本発明はｐ１９３ポリペプチドをコードする核酸を包含
する発現ベクターを提供する。そのようなベクターは、本発明の方法では宿主細
胞を遺伝的に形質導入すること、及びプロアポトーシスｐ１９３ポリペプチドの
場合は、アポトーシスを細胞に誘導することに使用され得る。ドミナントネガテ
ィブ特性をもったｐ１９３ポリペプチドの場合、そのような形質導入は、効果的
にアポトーシスを誘導するか又は増殖を誘導するために使用され得る。

【００１０】 本発明のもう１つの好ましい態様は、単離されたｐ１９３タンパク質、好まし
くは、単離された組換えｐ１９３タンパク質を提供する。そのようなタンパク質
は適当な医薬的に許容される担体と組み合わせて、やはり本発明の一部を構成す
る、医薬組成物を産生し得る。そのようなタンパク質はまた、本発明のｐ１９３
に対する抗体の調製にも使用され得る。

【００１１】 本発明はまた、ｐ１９３タンパク質をコードする導入されたＤＮＡを有する宿
主細胞を、前記導入されたＤＮＡの発現に適した条件の下で培養することを含ん
でなる、ｐ１９３タンパク質を産生する方法に関する。

【００１２】 本発明は、ｐ１９３と呼称される新たに特徴づけられたアポトーシス関連タン
パク質、及び、ドミナントネガティブ特性を示すものを含む、新規な修飾された
ｐ１９３タンパク質；そのようなｐ１９３タンパク質をコードするヌクレオチド
配列；ｐ１９３タンパク質をコードするヌクレオチド配列のクローニング、調製
及び発現に関わる産物及び方法；細胞における細胞周期を修飾する、例えば細胞
のアポトーシス及び／又は増殖を調節するための方法及び材料；及びｐ１９３や
その細胞内のシグナル伝達経路に対する影響を評価することを含む、細胞周期に
対する効果について薬剤又は他の化学作用剤をスクリーニングするための方法を
提供する。追加の態様、並びに本発明の特徴及び利点は、本明細書の記載から明
らかであろう。

【００１３】 発明の詳細な説明 本発明の原理に関する理解を高めるために、本発明のある好ましい態様が以下
に参照され、特別なことばがそれを説明するために使用される。それでも、それ
により本発明の範囲が制限されないこと、本明細書に記載のような本発明の諸原
理の変更、さらなる修飾及び応用は、本発明が関わる当技術分野の技術者ならば
普通考慮されるものと考えられることを理解されたい。

【００１４】 上記に開示されるように、本発明は、ｐ１９３と呼称される新規なアポトーシ
ス関連タンパク質とその修飾された形態；ｐ１９３タンパク質をコードするヌク
レオチド配列；及びｐ１９３をコードするヌクレオチド配列のクローニング、産
生及び発現に関わる産物及び方法に関する。

【００１５】 配列番号１は、本明細書の実施例に利用されるようなマウスｐ１９３について
のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列（配列番号２も参照のこと）を示す。
配列番号３はヒトｐ１９３についてのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列（
配列番号４も参照のこと）を示す。このことに関して言えば、本明細書で使用さ
れる「ヌクレオチド配列」という用語は、天然又は合成のヌクレオチド及び／又
はヌクレオシド、及びその誘導体の連続アレイを意味するものとする。「アミノ
酸配列」という用語は、天然又は合成のアミノ酸及び／又はその誘導体の連続ア
レイを意味するものとする。「コードする」及び「コーディング」という用語は
、ヌクレオチド配列が、転写及び翻訳の機序を介して、細胞へ情報を提供し、そ
れから一連のアミノ酸が特定のアミノ酸配列へ組み立てられ、ポリペプチドが産
生される方法を意味する。

【００１６】 本発明が、本明細書に開示される特定のｐ１９３配列とは異なるが、それへの
実質的な同一性を有し、本明細書で同定されるようなプロアポトーシス活性又は
増殖活性を示すヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の使用も含むことが理解され
よう。そのような配列は、本発明の様々な側面における使用のためにｐ１９３核
酸及びｐ１９３タンパク質を提供すると考えられる。例えば、変異アミノ酸配列
をコードする核酸配列は本発明の範囲内にある。生成するポリペプチド分子の機
能特性に実質的には影響を及ぼさない「サイレント」変化を産生する、配列にお
ける欠失、挿入又は置換のような配列への修飾は、明らかに本発明により考慮さ
れる。例えば、遺伝暗号の縮重性を反映する、又はある一定部位での化学的に同
等なアミノ酸の産生をもたらすヌクレオチド配列における変更が考慮されると理
解される。従って、疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンのコドンは、グリシ
ンのようなもう１つのより疎水性でない残基、又はバリン、ロイシン、又はイソ
ロイシンのような、より疎水性の残基をコードするコドンにより置換され得る。
同様に、アスパラギン酸のグルタミン酸への置換のような、負電荷の残基の別の
残基への置換、又はリジンのアルギニンへの置換のような、陽電荷の残基の別の
残基への置換を生じる変化も生物学的に同等な産物を産生すると概して予測され
得る。

【００１７】 また、生成するポリペプチドの機能特性に実質的に影響を及ぼすｐ１９３配列
への修飾をなし得ることも発見されているが、そのような変化も明らかに本発明
により考慮される。例えば、ｐ１９３アミノ酸配列の修飾は、野生型ｐ１９３活
性の少なくとも一部に拮抗し、細胞におけるアポトーシス活性の抑制及び／又は
細胞の亢進された増殖能力を導く、ドミナントネガティブｐ１９３タンパク質を
産生するために使用され得る。

【００１８】 本発明を特定する１つのやり方では、配列番号１（ヌクレオチド６２〜５１２
８）又は配列番号３（ヌクレオチド８７〜５１８３）に記載のものとは異なるコ
ーディング配列を有する核酸（例えばＤＮＡ）が使用される場合があり、ここで
この核酸、又は少なくともそのコーディング部分は、配列番号１のヌクレオチド
６２〜５１２８、又は配列番号３のヌクレオチド８７〜５１８３、又は配列番号
１の少なくともほぼヌクレオチド６２〜３５１７又は配列番号３のほぼヌクレオ
チド８７〜３６１５を有する核酸へストリンジェント条件下で結合する。そのよ
うな核酸は、望ましくは、プロアポトーシスｐ１９３活性を有するポリペプチド
、又はドミナントネガティブなｐ１９３ポリペプチドをコードする。「ストリン
ジェント条件」は配列依存的であり、様々な状況において異なるものである。一
般に、ストリンジェント条件は、規定のイオン強度及びｐＨでの特定配列につい
ての熱溶解点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。Ｔｍは、（規定のイオ
ン強度及びｐＨにおいて）ターゲット配列の５０％が完全適合プローブへハイブ
リダイズする温度である。典型的に、ストリンジェント条件は、ｐＨ７で塩濃度
が少なくとも約０．０２モルであり、温度が少なくとも約６０℃であるものとな
る。

【００１９】 本発明を明確化するもう１つのやり方では、配列番号２若しくは配列番号４に
記載のアミノ酸配列、又はその少なくとも１つの有意な長さ（即ち、少なくとも
４０個のアミノ酸残基）のセグメントと、少なくとも約７０％の同一性、より好
ましくは少なくとも約８０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％の同
一性を有し、そのポリペプチドがプロアポトーシスｐ１９３活性又はドミナント
ネガティブなｐ１９３特性を保有するポリペプチドをコードする核酸が使用され
得る。このポリペプチドは、例えば、配列番号２の少なくともほぼアミノ酸残基
１ないし１１５２若しくは配列番号４のほぼアミノ酸残基１ないし１１７３、又
は配列番号２のアミノ酸残基１ないし１６８９若しくは配列番号４のアミノ酸残
基１ないし１６９８と、少なくとも約７０％、８０％、又は９０％の同一性を有
するアミノ酸配列を有する。そのようなポリペプチドは、特に機能的なプロアポ
トーシスタンパク質が所望される場合、好ましくは、配列番号２の残基１５６６
ないし１５７２にか、配列番号４の残基１５７５ないし１５８１に存在する、特
徴的なｐ１９３ ＢＨ３ドメイン： Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｕ を包含する。

【００２０】 同一性比率は、本明細書で使用されるように、国立衛生研究所、米国から利用
可能な改訂ＢＬＡＳＴコンピュータ・プログラム、バージョン２．０．８を使用
して配列情報を比較することによって決定されるような同一性比率を意味するも
のである。ＢＬＡＳＴプログラムは、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 87: 2264-68 (1990) の並置法に基づき、Altschul, et al., J. Mol.
Biol. 215: 403-10 (1990)；Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 90: 5873-7 (1993)；及び Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:
3389-3402 に論じられている。簡潔に言えば、ＢＬＡＳＴプログラムは、同一
の並置された記号（即ち、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を２つの配列のより
短い方の記号の全数で割ったものとして同一性を定義する。このプログラムは、
比較されるタンパク質の全長に渡る同一性比率を決定するために使用され得る。
ＢＬＡＳＴプログラムに好ましいデフォルト変数、ｂｌａｓｔｐには、Henikoff
, S. and Henikoff, J. G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919 (199
2)；Pearson, W. R.. Prot. Sci. 4: 1145-1160 (1995)；及び Henikoff, S. an
d Henikoff, J. G. Proteins 17: 49-61 (1993) に記載されるように：（１）５
００の記載；（２）１０の期待値；（３）Ｋａｒｌｉｎ−Ａｌｔｓｃｈｕｌ変数
λ＝０．２７０；（４）Ｋａｒｌｉｎ−Ａｌｔｓｃｈｕｌ変数Ｋ＝０．０４７０
；（５）ギャップ・ペナルティ：エグジステンス１１、エクステンション１；（
６）Ｈ値＝４．９４ｅ^-324；（６）ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスに見出される
適合及び不適合アミノ酸についてのスコア、が含まれる。このプログラムはまた
、Wootton and Federhen, Computers and Chemistry 17: 149-163, (1993) のＳ
ＥＧプログラムにより決定されるような検索配列のセグメントをマスク・オフす
るためにＳＥＧフィルターを使用する。

【００２１】 もう１つの形態では、配列番号１（ヌクレオチド６２ないし５１２８）若しく
は配列番号３（ヌクレオチド８７ないし５１８３）に記載のヌクレオチド配列の
コーディング部分、又はその少なくとも１つの有意な長さ（即ち、少なくとも１
００個のヌクレオチド）のセグメントと少なくとも約７０％の同一性を有し、そ
の核酸が本明細書に同定されるようなプロアポトーシスｐ１９３活性又はドミナ
ントネガティブなｐ１９３特性を保有するポリペプチドをコードする、コーディ
ング配列を含む核酸が使用され得る。この核酸は、例えば、配列番号１のヌクレ
オチド６２ないし５１２８若しくは配列番号３のヌクレオチド８７ないし５１８
３、又は少なくとも配列番号１のほぼヌクレオチド６２ないし３５１７若しくは
配列番号３のほぼヌクレオチド８７ないし３６１５と、少なくとも約７０％、少
なくとも８０％、又は少なくとも約９０％の同一性を有するコーディング配列を
有する場合がある。

【００２２】 ｐ１９３ヌクレオチド配列は、例えば、心筋細胞、肝細胞、平滑筋細胞、造血
幹細胞、腫瘍産生細胞等のような哺乳動物若しくは他の真核細胞へ核酸を機能的
に導入するベクターのようなビヒクルの提供における応用を含む、多種多様な応
用において有用な組換え核酸を提供することが当技術分野で知られているような
プロモーター配列へ機能可能的に連結され得る。本明細書で定義されるように、
ヌクレオチド配列は、それが他のヌクレオチド配列と機能的な関係へ配置される
とき、もう１つの核酸配列（例、プロモーターのような調節配列）へ「機能可能
的に連結」している。例えば、ヌクレオチド配列がプロモーター配列へ機能可能
的に連結していれば、このことは、このヌクレオチド配列がプロモーターと連続
していて、プロモーターがこの遺伝子の転写を促進する能力を示すことを一般に
意味する。細胞特異プロモーター、誘導プロモーター、及び構成プロモーターを
含む、多種多様なプロモーターが当技術分野で知られている。プロモーターは、
ヌクレオチド配列テンプレートから産生される所望の産物がターゲット細胞にお
いて構成的に産生されるように選択され得る。あるいは、所望される産物の産生
が所望のように調節され得るように、当技術分野で知られている諸要素を活性化
することを必要とする、誘導プロモーターのようなプロモーターが選択され得る
。なおさらに、１種又はそれより多くの選択された細胞型の遺伝子の転写を促進
するプロモーター、例えばいわゆる細胞特異プロモーターが選択され得る。

【００２３】 本発明による発現ベクターは、細胞における野生型ｐ１９３活性を有効に増加
させてアポトーシスを誘導するか、又は細胞における野生型ｐ１９３活性に干渉
してアポトーシスを抑制する、及び／又は増殖を誘導するように設計され得る。
例えば、プロアポトーシスｐ１９３ポリペプチドをコードする核酸を取込む発現
ベクターは、細胞におけるアポトーシス活性を増加させるために利用され得る。
一方、修飾されたｐ１９３ポリペプチドをコードする核酸を取込むベクター、例
えばドミナントネガティブに一致した活性を示すｐ１９３のトランケーション突
然変異体（ｐ１９３ｄｎ）は、野生型ｐ１９３活性に干渉し、それにより細胞に
おけるアポトーシスを抑制する、及び／又は細胞の増殖を誘導するために使用さ
れ得る。アンチセンス（ａｓ）ｐ１９３ヌクレオチド配列を取込むベクターを用
いた細胞の遺伝形質導入はまた、細胞におけるアポトーシス活性を有効に抑制す
る、及び／又は増殖を有効に誘導するために使用され得る。同様に、ｐ１９３ア
ンチセンスＲＮＡは、細胞において、ｐ１９３及びアポトーシス活性を減少させ
る、及び／又は増殖を誘導するように細胞へ投与され得る。

【００２４】 本発明の好ましい側面では、ｐ１９３ヌクレオチド配列は細胞特異プロモータ
ーへ機能可能的に連結し、例えば選択された細胞型においてそのヌクレオチド配
列の構成的な発現をもたらす。そのようなプロモーターの例示的な候補物には、
α−ミオシン重鎖（α−ＭＨＣ）プロモーター、β−ミオシン重鎖（β−ＭＨＣ
）プロモーター、ミオシン軽鎖−２Ｖ（ＭＬＣ−２Ｖ）プロモーター、心房性ナ
トリウム利尿因子（ＡＮＦ）プロモーター等のような心筋細胞特異プロモーター
が含まれる。さらなる細胞特異プロモーターには、ＰｅＰＣＫ、アルブミン、ト
ランスチレチン、及び主要尿タンパク質（ＭＵＰ）のような肝臓特異細胞が含ま
れる。内因性遺伝子を発現するあらゆる細胞型、及びその発現される遍在した、
肺、心臓、肝臓、目。そのような構築体は、選択された組織において、ｐ１９３
核酸の発現を選択的に可能にする。

【００２５】 本発明のもう１つの側面は、誘導プロモーターへ機能可能的に連結したｐ１９
３ポリペプチドをコードするｐ１９３ヌクレオチド配列を含む組換え核酸を提供
する。ｐ１９３ヌクレオチド配列は、例えば、細胞における発現がアポトーシス
を誘導するようなプロアポトーシスポリペプチド、又は発現がアポトーシスを抑
制する、及び／又は細胞増殖を促進するような、アポトーシス抑制性、及び／又
は増殖誘導性のポリペプチドをコードし得る。誘導プロモーターを使用すると、
この核酸を取込む細胞によりコードされるポリペプチドの発現は、誘導剤へ反応
してアップレギュレートされ得る。例示的な候補誘導プロモーター系には、例え
ば、メタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター系（ここでは、ＭＴプロモーターが
硫酸銅のような重金属により誘導される）；テトラサイクリン調節系（これは、
発現がテトラサイクリンの存在又は不在に依存する二元（binary）系である）；
グルココルチコイド応答プロモーター（これはグルココルチコイド応答配列から
誘導される合成配列を使用し、デキサメタゾン（適切な受容体を有する細胞）を
投与することによって in vivo で誘導される）；ムリステロン応答プロモータ
ー（これは性腺刺激ホルモン刺激ホルモン放出ホルモン受容体を使用し、ムリス
テロン（適切な受容体を有する細胞）で誘導される）；及びＴＮＦ応答プロモー
ターが含まれる。使用され得る、そしてより好ましい、さらなる誘導プロモータ
ーには、エクジソンプロモーター系（これは昆虫ホルモン（エクジソン）を使用
して誘導され、哺乳動物において完全なリガンド依存性の発現を提供する）；β
−ＧＡＬ系（これは、大腸菌ｌａｃオペロンオペレーターとＩ遺伝子産物をトラ
ンスで利用し、発現を調節するのに非代謝性（gratuitous）誘導物質（ＩＰＴＧ
）が使用される二元系である）；及びＲＵ４８６誘導系（これはＣＹＰ３Ａ５プ
ロモーターを使用し、十分特定された医薬品であるＲＵ４８６２より誘導される
）が含まれる。こういったプロモーター系と他の同様な誘導プロモーター系が知
られていて、本発明におけるそれらの使用は当業者の技術範囲内にある。

【００２６】 本発明の１つの側面は、ｐ１９３及びｐ５３の活性を（ドミナントネガティブ
ｃＤＮＡ変異体の発現により）阻止することが増殖誘導性のアポトーシスシグナ
ルに対して防護するという発見に関する。このことは、プロ増殖シグナル、例え
ばＥ１Ａによりコードされるようなシグナルに対して心筋細胞を反応性にする。
心臓組織の制御された再生、又は他のやり方で制御される移植された心筋細胞の
増殖を促進する治療アプローチが採用され得るが、これは増殖促進遺伝子に加え
てドミナントネガティブｃＤＮＡの発現を推進する調節可能なプロモーターの使
用に依存する。他のアプローチは、調節可能なプロモーターと組み合わせた増殖
促進遺伝子の発現とともに、ｐ５３及び／又はｐ１９３経路の医薬品による阻止
に依存し得る。例えば、Gudkov と共同研究者（Science (1999) 285; 1733-1737
）は、ｐ５３依存性の転写活性化及びアポトーシスを阻害する剤を開発した。ｐ
１９３活性を阻止する同様の試薬は当業者により容易に産生される。このアプロ
ーチには、異常なプロモーター活性（例えば、誘導剤の不在下でのプロモーター
活性の誘導）が起きたときに内因性の細胞周期をチェックする利点がある。特に
、プロアポトーシス遺伝子の一方又は両方の活性が医薬的に阻止され、再生増殖
が完了した後でその医薬品（群）が使用されなくなると、増殖促進遺伝子の異常
な活性化により、抗アポトーシス活性が存在しないために、細胞のアポトーシス
死をもたらすことになる。このアプローチは、制御された心筋細胞の in vivo
増殖に作用する臨床的により安全なモダリティを提供するために使用され得る。

【００２７】 さらなる、又は他の安全なアプローチには、発現カセットに、例えば有名な単
純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子のような、条件
致死遺伝子を内包することが含まれる。哺乳動物のチミジンキナーゼがガンシク
ロビルを細胞へ高率で取込まないのに対し、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子は、正常ヌクレ
オチド、並びにヌクレオチド類似体のガンシクロビルを高率で取込むことができ
る。ガンシクロビルの取込みは細胞毒である。従って、この作動様式では、調節
可能プロモーターの異常な活性化が抗アポトーシス（例、ｐ５３ｄｎ及びｐ１９
３ｄｎ）及びプロ増殖（例、Ｅ１Ａ）遺伝子、並びにＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の発現
をもたらす。不適切に増殖している細胞（例えば、異常なプロモーター活性が起
こっているもの）は、ガンシクロビルでの単純処置により消失され得る。

【００２８】 本発明はまた、ｐ１９３ヌクレオチド配列を取込み、細胞の in vitro 又は i
n vivo での遺伝形質導入に有用であるベクターに関する。これらの目的には種
々のベクター系が適切である。これには、例えば、Franz et al., Cardiovasc.
Res. 35 (3): 560-566 (1997)；Inesi et al., Am. J. Physiol. 274 (3 Pt. 1)
: C645-653 (1998)；Kohout et al., Circ. Res. 78 (6): 971-977 (1996)；Leo
r et al., J. Mol. Cell Cardiol. 28 (10): 2057-2067 (1996)；March et al.,
Clin. Cardiol. 22 (1 Suppl. 1): I23-29 (1999) 及び Rothman et al., Gene
Ther. 3 (10): 919-926 (1996) に例えば開示されるような、アデノウイルスベ
クターのようなウイルスベクターが含まれる。アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベ
クターもまた適していて、例えば、Kaptlitt et al., Ann. Thora. Surg. 62 (6
): 1669-1676 (1996)；及び Svensson et al., Circulation 99 (2): 201-205 (
1999) に開示される。使用し得るさらなるウイルスベクターにはレトロウイルス
ベクター（例えば、Prentice et al., J. Mol. Cell Cardiol. 28 (1): 133-140
(1996)；及び Petropoulos et al., J. Virol. 66 (6): 3391-3397 (1992) を
参照のこと）、及び Rebolledo et al., Circ. Res. 83 (7): 738-742 (1998)
に開示されるようなレンチ（ＨＩＶ−１）ウイルスベクターが含まれる。好まし
い発現ベクターのクラスは、上記に特定したものの１つのような、心筋細胞特異
プロモーターに機能可能的に連結したｐ１９３核酸を取込む。なおさらに、ＡＡ
Ｖベクターは、心筋細胞や他の細胞及び組織のトランスフェクションにおける使
用にきわめて適合していて、上記に特定されるもののなかで好ましい。

【００２９】 本発明によれば、リポソームをベースとする形質導入系を使用して、in vitro
又は in vivo で細胞をｐ１９３核酸で遺伝的に形質導入することができる。多
種多様なリポソーム形質導入系が知られていて、様々な細胞へ組換え発現ベクタ
ーを首尾よくデリバリーすることが報告されてきた。代表的な教示は、例えば、
R. W. Zajdel, et al., Developmental Dynamics. 213 (4): 412-20 (1998)；Y.
Sawa, et al., Gene Therapy. 5 (11): 1472-80 (1998)；Y. Kawahira, et al.
, Circulation 98 (19 Suppl): II262-7；考察 II267-8 (1998)；G. Yamada, et
al., Cellular & Molecular Biology 43 (8): 1165-9 (1997)；M. Aoki, et al
., Journal of Molecular & Cellular Cardiology 29 (3): 949-59 (1997)；Y.
Sawa, et al., Journal of Thoracic & Cardiovascular Surgery 113 (3): 512-
8; 考察 518-9 (1997) 及び I. Aleksic, et al., Thoracic & Cardiovascular
Surgeon 44 (2): 81-5 (1996) に見出し得る。このように、p１９３ ＤＮＡを
包含するリポソームの組換え発現ベクターは、本発明に記載の目的のために in
vitro 及び in vivo で細胞を形質導入するためにも利用され得る。

【００３０】 核酸構築体は、例えば、p１９３タンパク質をコードするヌクレオチド配列を
in vivo 又は in vitro で細胞へ導入し、細胞のネーティブなレベルに比べて増
加している細胞内ｐ１９３活性のレベルを達成するために使用され得る。そのよ
うな増加された活性は細胞においてアポトーシスを誘導し得る。アポトーシス活
性の誘導は、例えば、細胞死や、細胞収縮や核の濃縮及び切断のような他の特徴
的な形態学的変化により裏付けることができる。あるいは、又はさらには、ｐ１
９３活性を増加させるために、精製された（例えば、精製された組換え）ｐ１９
３タンパク質が（例えば、融合産生リポソーム又は他の高分子デリバリー系によ
り）細胞へ導入され得るか、又は、増加したアポトーシス活性を細胞へ提供する
ために、ｐ１９３活性を増加させる薬剤で細胞を処置し得る。

【００３１】 核酸構築体はまた、修飾されたｐ１９３ヌクレオチド配列を in vivo 又は in
vitro で細胞へ導入するためにも使用し得て、ここでその配列はドミナントネ
ガティブ遺伝子の特徴を提供し、野生型ｐ１９３活性に有効に拮抗し、例えばア
ポトーシスの抑制、及び／又は細胞の増殖能力における増加を生じる。同様のア
プローチでは、ドミナントネガティブｐ１９３タンパク質又は他の分子を、野生
型ｐ１９３活性に干渉するか又は拮抗する細胞へ導入することが可能であり、そ
れにより細胞内でアポトーシスを抑制する、及び／又は増殖を誘導する。野生型
ｐ１９３タンパク質の発現又は活性に有効に干渉するために、例えば、アンチセ
ンス（ａｓ）ｐ１９３ヌクレオチド配列を取込むベクターを使用し得る、及び／
又は薬剤として役立つ合成有機低分子を使用し得る。

【００３２】 本発明により、研究、治療、スクリーニング又は他の目的に in vitro 又は i
n vivo で応用し得る方法が利用可能になる。（センス又はアンチセンスの方向
で）導入されたｐ１９３ ＤＮＡを発現する細胞の in vitro 培養についての方
法は、例えば、細胞周期の研究及び理解、ｐ１９３活性又は細胞周期の他の側面
をモジュレートする化学薬剤又は物理因子のスクリーニング、又はヒトを含む哺
乳動物への後続の生着のために抑制されたアポトーシス活性及び／又は増加され
た増殖潜在力を有する細胞の培養において使用し得る。

【００３３】 本発明により培養される細胞は、多種多様な源から誘導され得る。例えば、そ
れらは、培養のためにある哺乳動物から採取された後にその哺乳動物（自己移植
）又は同種（同種移植）又は異なる種（異種移植）の他の哺乳動物へ生着される
。心筋細胞又は他の細胞はまた、胚性幹細胞、体幹細胞又は他の同様な全能細胞
のような幹細胞の分化から誘導され得る。そのような誘導についての一般的な方
法論はＦｉｅｌｄらの米国特許第５，６０２，３０１号及び５，７３３，７２７
号に開示されている。この点、そのように誘導されると、ｐ１９３核酸を取込む
遺伝的修飾は、例えば、１種又はそれ以上のベクターを利用して、組織特異プロ
モーターへ機能可能的に連結したｐ１９３核酸、及び幹細胞から分化している、
及び／又は分化したレベルにある（例えば、組織特異プロモーターへ機能可能的
に連結した選択遺伝子マーカーを含む）他の細胞からターゲット細胞型を選択す
ることを可能にする核酸を導入し、幹細胞のレベルで起こり得る。形質導入され
ない幹細胞から形質導入された幹細胞の選択を可能にする核酸も、そのような戦
略において使用され得る。幹細胞型及び／又は分化した細胞型のそのような選択
は、例えば、抗生物質（例えば、ネオマイシン又はハイグロマイシン）又は他の
化学薬剤への抵抗性を与える、適切なプロモーターへ機能可能的に連結した遺伝
子を利用して、達成され得る。

【００３４】 幹細胞から誘導された細胞を使用し、ｐ１９３と潜在的には他の核酸を取込む
遺伝的修飾は、幹細胞の分化後にも起こり得る。例えば、心筋細胞又は他のター
ゲット細胞系で富化された、例えば９０％又はそれ以上のターゲット細胞型を含
有する分化細胞の集団を、上記のように、プロモーター（所望により組織特異的
である）へ機能可能的に連結した（特にアンチセンスであるか又はドミナントネ
ガティブ突然変異を含む）ｐ１９３核酸を有するベクターを用いて形質転換し得
る。この細胞群へ他の機能性核酸を導入するために、同じであるか又は異なるベ
クターも使用し得て、例えばレポーター遺伝子及び／又は選択マーカーを提供す
る、あるいは、増殖因子及び／又は別の細胞周期調節タンパク質の発現がもたら
される。

【００３５】 例えば、本発明のある態様では、ｐ１９３タンパク質のレベルを減少させるこ
と、又はｐ１９３シグナル伝達経路に干渉することは、細胞周期に影響を及ぼす
他の手段とともに使用され得る。例えば、ｐ１９３及び／又はその（例えば、導
入されたアンチセンスｐ１９３核酸又はドミナントネガティブ突然変異を有する
核酸により影響される）経路のそのような修飾は、ｐ５３核酸（特にアンチセン
ス又はドミナントネガティブ突然変異）、Ｅ１Ａ核酸、又は両者の組み合わせと
ともに使用し得る。なおさらに言えば、ｐ１９３及び／又はその経路のそのよう
な修飾は、例えば、ＲＢファミリーメンバーを阻害する、Ｄ型サイクリン又はサ
イクリン依存性キナーゼ活性を過剰発現する、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤
を阻害する、下流ターゲットを過剰発現させる、等のような、細胞周期の制限点
にある主要な調節因子を操作することによって、Ｇ₁／Ｓ移行を緩和するか又は
促進する他の方法とともに使用され得る。

【００３６】 本発明を実行する１つの様式では、左心室、右心室、左心房、又は右心房の心
筋細胞、又はこれらのいくつか若しくはすべての混合物を、上記に開示されるよ
うな好適なベクターを使用して抗アポトーシス及び／又は増殖性のｐ１９３核酸
を取込むように in vitro で遺伝的に修飾され得る。例えば、そのようなプロト
コールで遺伝的に形質導入される細胞は、様々な発達段階、例えば、胎児、新生
児、及び成体の段階にある動物から入手し得る。好適な動物源には、ウシ、ブタ
、ウマ、ヒツジ及びマウス動物のような哺乳動物が含まれる。ヒト細胞は、ヒト
のドナー又は治療される患者から入手し得る。その後、修飾された心筋細胞は、
哺乳動物へ、例えば左若しくは右心房、又は左若しくは右心室へ移植され、哺乳
動物において細胞移植片を確立し得る。細胞の移植は、例えば注射又はカテーテ
ル挿入による手段を含む、任意の好適な手段により達成し得る。ｐ１９３核酸に
加えて、細胞はまた、他のタンパク質、例えば１種又はそれより多くのさらなる
細胞周期調節タンパク質を提供するために発現され得る他の機能性核酸配列を含
有するように in vitro で修飾され得る。１つの好ましい態様では、細胞内でア
ポトーシスを抑制するために、ｐ１９３をコードする核酸と少なくとも１つの他
の細胞周期調節タンパク質（例えばｐ１９３及びｐ５３優性の強制された発現を
組み合わせる）（Mowat, M., Nature Vol. 314, p. 633-636 (1985); Munroe, D
. G. Mol. Cell. Biol., Vol. 10, 3307-3313 (1990)）をコードする核酸で細胞
が修飾される。

【００３７】 培養、及び潜在的な移植のための細胞はまた、導入されたｐ１９３核酸を発現
するトランスジェニック動物（特に哺乳動物）からも入手し得る。既知の技術を
使用して、導入されたｐ１９３核酸をほとんどすべてのその細胞内に保留するト
ランスジェニック動物を生育させ、培養可能な細胞（例、心筋細胞）、組織又は
臓器を採取するための供給源として使用し得るか、又は研究又はスクリーニング
の目的の動物モデルとして使用し得る。例えば、トランスジェニックのウシ、ブ
タ、ウマ、ヒツジ又はマウス動物は、細胞、組織又は臓器の供給源として、又は
研究用の動物モデルとして使用し得る。例えば、野生型ｐ１９３タンパク質の低
下したレベルを有する、及び／又は導入されたドミナントネガティブｐ１９３タ
ンパク質を発現するトランスジェニック動物は、アポトーシス抑制性、及び／又
は増殖亢進性の細胞、組織又は臓器の供給源として使用し得るが、これは線維症
又は他の同様な障害に対して防護されるだろう。このように、そのような材料は
、ヒトのような他の動物への移植における使用のために重要な利点を保有するだ
ろう。

【００３８】 本発明はまた、（形質導入経路に影響する）細胞において、in vivo で（プロ
アポトーシスタンパク質を使用して）ｐ１９３活性を増加させる、又は（ｐ１９
３ｄｎを使用して）ｐ１９３活性を減少させるための細胞の遺伝的修飾について
提供する。ｐ１９３核酸を含有する発現ベクター（例えば、上記に記載のような
もの）は、細胞の組織における形質導入を達成するために、レシピエント哺乳動
物の組織へデリバリーされ得る。好ましい様式では、そのようなベクター内のｐ
１９３核酸は組織特異プロモーター、例えば心筋細胞特異プロモーターへ機能可
能的に連結される。このベクターのデリバリーは、適切にも、例えば血流への注
射、カテーテル挿入、又は注入か、又は他の既知手段により達成され得る。形質
導入された細胞のレシピエント哺乳動物の内部での確立を可能にするデリバリー
の様式が本発明のなかで考慮されることが理解される。形質導入された細胞の実
質的な集団をレシピエント内部で確立するために、ベクターの単回デリバリーが
使用され得るか、又はほとんど同時か又は時間をかけた頻回デリバリーが使用さ
れ得る。次いで、形質導入された細胞は、例えば構成的、誘導、又は組織特異プ
ロモーターの制御下で、コード化されたｐ１９３ポリペプチドを発現し、それに
より抑制又は誘導されたレベルのアポトーシスを示す。

【００３９】 in vitro 培養された細胞の移植、又は in vivo 遺伝形質導入用ベクターのデ
リバリーは、レシピエント内の選択された部位又は諸部位へ向けられる場合があ
る。例えば、アポトーシス抑制性及び／又は増殖亢進性の心筋細胞生着、又は対
応する in vivo 形質導入の場合、そのような部位又は諸部位は、レシピエント
の左若しくは右心房、又は左若しくは右心室においてであり得る。一般に、移植
又はデリバリーの部位又は諸部位はレシピエントの左若しくは右心室において生
じる。（諸）部位は、例えば、追加の生細胞についての必要性がある（諸）部位
、例えば心筋梗塞や心筋障害の場合のような心臓の障害又は疾患領域においてで
あり得る。（諸）部位はまた、移植されたか又は in vivo 形質導入された細胞
における発現を介して増殖因子、例えば神経増殖因子又は血管形成因子のような
他のタンパク質をデリバリーするためのターゲットであり得る。

【００４０】 本発明による細胞生着及び／又は in vivo 遺伝的修飾は、例えば、ヒトを含
む哺乳動物への治療をデリバリーするために使用し得る。このように、多種多様
な ex vivo 細胞移植及び埋め込み技術と遺伝子治療技術が本発明の一部を形成
するものとして考慮される。例えば、上記の技術は、野生型ｐ１９３タンパク質
の低下したレベルを有する、及び／又は破壊されたか部分的に破壊されたｐ１９
３シグナル伝達経路を有し、それにより細胞が減少したアポトーシス活性及び／
又は亢進した増殖能力を示す哺乳動物に細胞を提供するために使用され得る。例
えば、そのようなアプローチは、例えば梗塞又は心筋障害による収縮欠損の治療
において患者の収縮機能の改善又は保護をターゲットにするために使用され得る
。それらはまた、患者の他の組織又は臓器、例えば患者の肝臓又は肺の機能の改
善及び／又は保護をターゲットにするために使用され得る。ドミナントネガティ
ブ突然変異を有するｐ１９３タンパク質の使用は、そのような目的に特に有利で
あろう。さらに、例えば適切なｐ１９３核酸を用いた in vivo 遺伝形質導入と
その結果のプロアポトーシスタンパク質の発現による、プロアポトーシスｐ１９
３タンパク質の細胞へのデリバリーは、例えば不適切に増殖性の細胞の場合にア
ポトーシスが所望される細胞において、アポトーシスを促進するために使用し得
る。

【００４１】 本発明はまた、ｐ１９３ペプチド上に存在する１つ又はそれより多くのエピト
ープ、又はｐ１９３上のイディオタイプに対して特異性を有する抗体へのアクセ
スも提供する（例えば、図１４と実施例における不随の考察を参照のこと）。そ
のような抗体はポリクローナル若しくはモノクローナルであり得て、ｐ１９３ポ
リペプチド又はそのフラグメントを免疫原として用いて産生し得る。このことに
関し、「抗体」（Ａｂ）又は「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）という用語は、
本明細書で使用されるように、インタクト分子、並びに抗原に結合し得るそのフ
ラグメントを含むことを意味する。ｐ１９３に対する抗体は、例えば、ヒト又は
他の哺乳動物組織サンプルにおけるｐ１９３タンパク質の存在を検出するために
使用され得る。このことは、検出し得る標識抗体とサンプルとを接触させ、そし
てその標識を検出し、それによりサンプル中にｐ１９３タンパク質の存在を確定
することをふくみうる。検出は in vivo で造影することによって実行し得る。
ｐ１９３タンパク質はまた、本発明による適切な抗体を使用して、例えばＲＩＡ
、ＥＬＩＳＡ等を含む、既知の免疫アッセイ技術によっても検出され得る。

【００４２】 本発明の抗体は多種多様な既知の方法により調製され得る。例えば、ｐ１９３
タンパク質を発現する細胞を動物へ投与して、ｐ１９３タンパク質に結合し得る
ポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘導することが可能である。例えば
、ｐ１９３タンパク質又はそのフラグメントを化学的に合成し、ＨＰＬＣにより
精製して、実質的に混在物がないようにする。次いで、そのような調製物を動物
へ導入し、非活性が高いポリクローナル抗体を産生する。

【００４３】 ポリクローナル抗体は、例えば、マウス、ウサギ、又はヤギを含む任意の好適
な動物において産生し得る。ｐ１９３の免疫原性ペプチド又はそのフラグメント
は、そのままか又は適切な免疫活性化の担体へ結合して注射し得る。

【００４４】 モノクローナル抗体は、当業者により十分理解された技術を使用して様々な仕
方で調製し得る。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用し
て調製し得る（Kohler et al., Nature 256: 495 (1975)；Kohler, et al., Eur
. J. Immunol. 6: 511 (1976)；Kohler, et al., Eur. J. Immunol. 6: 292 (19
76)；Hammerling, et al., 『モノクローナル抗体とＴ細胞ハイブリドーマ』（M
onoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas）エルセヴィエ、Ｎ．Ｙ．，563-
681頁（1981）；Roger H. Kennett, et al.編、『モノクローナル抗体−ハイブ
リドーマ：生物学的分析の新次元』（Monoclonal Antibodies-Hybridomas: A Ne
w Dimension in Biological Analysis）プレナムプレス（1980））。一般に、そ
のような方法は、本発明のｐ１９３タンパク質、又はそのフラグメントで動物を
免疫化することを含む。そのような動物から脾細胞を抽出し、好適な骨髄腫細胞
系と融合させる。本発明によれば、任意の好適な骨髄腫細胞系を利用し得る。融
合の後で、生成したハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地で選択的に維持し、Wands,
et al., Gastroenterol. 80: 225-232 (1981) に記載のように希釈を制限する
ことによってクローン化する。次いで、そのような選択を介して得られるハイブ
リドーマ細胞をアッセイし、ｐ１９３タンパク質に結合し得る抗体を分泌するク
ローンを同定する。

【００４５】 本発明のｐ１９３抗体を産生して使用するために、上記の技術や抗体の産生及
び使用に関連した他の技術は当業者に明らかであり、容易に利用し得るだろう。 本発明とその利点に関するさらなる理解を深めるために、以下の特定の実施例
が提供される。これらの実施例は本発明を例示するものであって、制限するもの
ではないことを理解されたい。

【００４６】

【実施例】

実施例１〜３：方法 実施例１ ｐ１９３タンパク質の単離及び配列分析 ＡＴ−２心筋細胞をＮＥＴの２０ｍｌにおいてホモジェナイズし、プロテイン
Ａセファロースビーズで前洗浄し、抗Ｔ−Ａｇモノクローナル抗体のＰＡｂ４１
９と混合（９０分、４℃）した。免疫複合体をプロテインＡセファロースを用い
て回収し、ポリアクリルアミドゲル上で展開し、クマッシーブリリアントブルー
で染色することによって視覚化した。ｐ１９３を含有するゲルの領域を切出し、
イソプロピルアセトアミドでアルキル化し、記載（Shevchenko, A., Wilm, M.,
Vorm, O., and Mann, M. (1996) Anal. Chem. 68, 850-858）のように、Ｆ−ト
リプシン（トリプシン０．２μｇ，３７℃、１７時間）で消化した。次いでこの
ペプチドを５％ギ酸／５０％アセトニトリルで抽出し、Ｃ１８ ０．３２ｘ１０
０ｍｍキャピラリーカラム（ＬＣパッキング社）で分離した。単離されたＨＰＬ
Ｃ分画のそれぞれのアリコートを、ターゲットプレート上のマトリックスの前作
成（pre-made）スポット（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸２０ｍｇ＋ニト
ロセルロース５ｍｇ／（５０％アセトン／５０％ ２−プロパノール）１ｍｌの
０．５ｍｌ）へ塗布した。窒素レーザー、３３７ｎｍを用いたマトリックス介助
レーザーデソープションイオン化によりイオンを形成させた。線遅延（linear d
alayed）抽出モードで作動する、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
Ｖｏｙａｇｅｒ Ｅｌｉｔｅ飛行時間質量分析計を用いてスペクトルを得た。
引き続き、選択された前駆質量についてのフラグメントイオンを、線源崩壊後（
post-source decay；ＰＳＤ）実験（Kaufman, R., Kirsch, D. and Spengler, B
. (1994) International J. Mass Spec. and Ion Proc. 131, 355-385）から得
た。記載（Henzel, W. J., Grimley, C., Bourell, J. H., Billeci, T. M., Wo
ng, S. C. and Stults, J. T. (1994) Metods: A companion to Methods in Enz
ymology 6, 239-247）のように、改良サイクルを使用するオンラインＰＴＨ分析
装置の付いたモデル４７０Ａアプライド・バイオシステムズシークエンサーで自
動化されたタンパク質の配列決定を実施した。Ｎｅｌｓｏｎ Ａｎａｌｙｔｉｃ
７６０インターフェースを使用するＪｕｓｔｉｃｅ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎソ
フトウェアを用いてピーク群を統合した。ＤＥＣ５９００（Henzel, W. J., Rod
riguez, H., and Watanabe, C. (1987) J. Chromatogr. 404, 41-52）で配列の
解釈を実施した。

【００４７】 実施例２ ｐ１９３ ｃＤＮＡの単離及び分子分析 Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪ近交系マウスから産生した成体心臓ｃＤＮＡライブラリー
からｐ１９３ ｃＤＮＡを単離した（Kim, K. K., Daud, A. I. Wong, S. C., P
ajak, L., Tsai, S. C., Wang, H. Henzel, W. J., and Field, L. J. (1996) J
. Biol. Chem. 271, 29255-29264）。プラークハイブリダイゼーション、ファー
ジＤＮＡ単離、及びサブクローニングを、標準法（Sambrook J., Fritsch, E. F
., and Maniatis, T. (1989)『分子クローニング』（Molecular cloning）コー
ルドスプリングハーバーラボラトリープレス、コールドスプリングハーバー、Ｎ
．Ｙ．）を使用して実施した。チェインターミネーター法（シークエナーゼ、米
国バイオケミカルズ、クリーブランド、ＯＨ）を使用して、試験したｃＤＮＡク
ローンの両鎖につき配列を決定した。

【００４８】 ｐ１９３／Ｔ−Ａｇ結合を証明するために、エピトープ・タグが分子のＣ末端
へ取込まれるように、完全長のｐ１９３ ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ
−Ｈｉｓ発現ベクター（インビトロゲン、カールスバッド、ＣＡ）へサブクロー
ン化した（この構築体をＣＭＶ−ｐ１９３ｍｙｃと命名した）。Ｔ−Ａｇ ｃＤ
ＮＡをｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターへサブクローン化した（エピトープ・タグ
を欠く；この構築体をＣＭＶ−Ｔ−Ａｇと命名した）。ＩＰ／ウェスタン分析の
ために、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ，ロックヴィル、ＭＤ）を、リン酸カル
シウム法を使用して、ＣＭＶ−５−Ａｇ及びＣＭＶ−ｐ１９３ｍｙｃとともに同
時トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞から調製したタンパク質
（１ｍｇ）を、抗Ｔ−Ａｇ（ＰＡｂ４１９）、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０，サンタクル
スバイオテク）、又はＩｇＧサブタイプ適合非特異抗体（抗ＧＳＴ，ファルマシ
ア）と反応させ、生成した免疫複合体をウェスタンブロット分析にかけた。トラ
ンスフェクトしなかった細胞とトランスフェクトした細胞からの全タンパク質１
００μｇを対照として含めた。抗ｍｙｃ（９Ｅ１０）又は抗Ｔ−Ａｇ（ＰＡｂ４
１６）抗体でブロットをプローブし、ＥＣＬ法を使用してシグナルを顕色させた
。in vitro でのｐ１９３／Ｔ−Ａｇ結合を証明するために、ｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔ ＩＩＳＫ（ストラタジーン、ラジョア、ＣＡ）へサブクローン化された
完全長のｐ１９３ ｃＤＮＡから得た、³⁵Ｓ−メチオニン標識 in vitro 転写／
翻訳（ＴＮＴキット、プロメガ）産物を組換えＳＶ４０ Ｔ−Ａｇ（モレキュラ
ーバイオロジーリソース）の１．２μｇと混合し、抗Ｔ−Ａｇ（ＰＡｂ４１９）
又はＩｇＧサブタイプ適合非特異対照抗体（抗ＭＡＰキナーゼ＃Ｄ２，サンタク
ルスバイオテク）と反応させた。次いで、上記のように、免疫複合体をオートラ
ジオグラフィー（ｐ１９３）又はウェスタンブロッティング（Ｔ−Ａｇ）により
視覚化した。

【００４９】 ノーザンブロットでは、記載（Sambrook J., Fritsch, E. F., and Maniatis,
T. (1989)『分子クローニング』（Molecular cloning）コールドスプリングハ
ーバーラボラトリープレス、コールドスプリングハーバー、Ｎ．Ｙ．）のように
、全ＲＮＡの１０μｇをグリオキサールで変性し、アガロースゲル上で展開し、
Ｇｅｎｅｓｃｒｅｅｎ（ＮＥＮ）へ移し、ニック翻訳した（nick-translated）
完全長のｐ１９３ ｃＤＮＡと反応させた。Ｔ−Ａｇ上のｐ１９３結合部位をマ
ッピングするために、完全長ｐ１９３ ｃＤＮＡクローンと様々なＴ−Ａｇ欠失
構築体からの in vitro 翻訳産物を混合し、Ｎ末端特異的な抗Ｔ−Ａｇモノクロ
ーナル抗体（ＰＡｂ４１９）を用いて免疫複合体を産生した。次いで、免疫複合
体をオートラジオグラフィーにより視覚化した。文献に示されるように、終止コ
ドン又は塩基対置換を取込むオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＰＣＲ
増幅により様々なＴ−Ａｇ欠失構築体を産生した。各構築体の忠実度（fidelity
）を配列分析により確かめた。

【００５０】 実施例３ ｐ１９３の機能解析 ＦＡＣＳ解析のため、ＣＭＶ−β−ＧＡＬｍｙｃ又はＣＭＶ−ｐ１９３ｍｙｃ
をトランスフェクションしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔで標識し、
トリプシン処理し、そしてエタノール中の５％酢酸中で固定し、ＰＢＳで再水和
し、そして記載されるように、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ｍｙｃ抗体（９Ｅ１
０、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と反応させた（Ｅｓｓｅｒ， Ｃ．
， Ｇｏｔｔｌｉｎｇｅｒ， Ｃ．， Ｋｒｅｍｅｒ， Ｊ．， Ｈｕｎｄｅｉ
ｋｅｒ， Ｃ．及びＲａｄｂｒｕｃｈ， Ａ．（１９９５）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ
２１， ３８２−３８６； Ｂｒｏｗｎ， Ｄ．Ｒ．， Ｔｈｏｍａｓ， Ｃ
．Ａ．及びＤｅｂ， Ｓ．Ｐ．（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ．， １７， ２５１
３−２５２５）。その後、ＦＩＴＣ陽性細胞のＤＮＡ含量をＢｅｃｔｏｎ Ｄｉ
ｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ−ＰＬＵＳ装置上で解析した。免疫細胞診断的解析は
、記載されるとおり（４４）であり、そして画像は、ＢｉｏＲａｄレーザー走査
共焦点顕微鏡を用いて捉えるか、あるいは慣用的な光学又は蛍光顕微鏡を用いて
直接写真撮影した。

【００５１】 細胞死時間経過実験のため、血清枯渇（飢餓培地は、ＤＭＥＭ中に０．１％
ＦＢＳを含んだ）２周期により同調させたＮＩＨ−３Ｔ３細胞に、Ｌｉｐｏｆｅ
ｃｔｉｎ（Ｇｉｂｃｏ−Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニューヨーク州グランド
アイランド）を用いて、ＣＭＶ−ｐ１９３ｍｙｃ又はＣＭＶ−βＧＡＬいずれか
を、２４時間、トランスフェクションした。その後、培養をＰＢＳでリンスし、
そして飢餓培地中でさらに６時間、培養した。その後、ＤＭＥＭ中に³Ｈ−チミ
ジン（２６ Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国・バッキンガムシャー）
及び１０％ ＦＢＳを含む培地を添加し、そして記載されるように、その後、多
様な時点で、オートラジオグラフィー及び免疫細胞診断のため、細胞をプロセシ
ングした（Ｋｌｕｇ， Ｍ．Ｇ．， Ｓｏｏｎｐａａ， Ｍ．Ｈ．， Ｋｏｈ，
Ｇ．Ｙ．及びＦｉｅｌｄ， Ｌ．Ｊ．（１９９６）Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖ
ｅｓｔ． ９８， ２１６−２２４）。細胞周期中、Ｔ−Ａｇを位置決定するた
め、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中のＡＴ−２細胞の集密以下の培養に、³Ｈ
−チミジンの４０分間パルスを与えた。その後、細胞をリンスし、そしてその後
、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭで培養した。その後、記載されるように、多様
な時点で、オートラジオグラフィー及び免疫細胞診断のため、細胞をプロセシン
グした（Ｋｌｕｇ， Ｍ．Ｇ．， Ｓｏｏｎｐａａ， Ｍ．Ｈ．， Ｋｏｈ，
Ｇ．Ｙ．及びＦｉｅｌｄ， Ｌ．Ｊ．（１９９６）Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅ
ｓｔ． ９８， ２１６−２２４）。コロニー増殖アッセイのため、ＣＭＶ−ヌ
ル、ＣＭＶ−ｐ１９３ｓ又はＣＭＶ−ｐ１９３ａｓをトランスフェクションした
ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、１５日間、Ｇ４１８中で選択した（発現ベクターはまた
、ＣＭＶ−ｎｅｏ^rカセットもコードした）。その後、プレートを固定し、そし
てゲンチアナバイオレットで染色した。

【００５２】 実施例１−３：結果 ｐ１９３のクローニング 心筋細胞においてＴ−Ａｇ結合タンパク質を同定するため、トランスジェニッ
ク心臓腫瘍由来の細胞株、ＡＴ−２細胞（Ｄａｕｄ， Ａ．Ｉ．， Ｌａｎｓｏ
ｎ， Ｎ．Ａ．， Ｊｒ．， Ｃｌａｙｃｏｍｂ， Ｗ．Ｃ．及びＦｉｅｌｄ，
Ｌ．Ｊ．（１９９３）Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２６４， Ｈ１６９
３−７００）を³⁵Ｓ−メチオニン標識したものから調製したタンパク質を用い、
免疫複合体を生成した。３８０、１９３及び１２０ｋｄの見かけの分子量を持つ
タンパク質（図１ａを参照されたい）が、抗Ｔ−Ａｇ（ＰＡｂ４１９、レーン３
）又は抗ｐ５３（ＰＡｂ４２１及びＰＡｂ２４６、それぞれレーン２及び６）モ
ノクローナル抗体いずれかで生成した免疫複合体中に検出された。これらのタン
パク質は、ＩｇＧサブタイプが一致した非特異的対照抗体（ＤＹＳ１、レーン１
；ＰＡｂ２４０、レーン５）で生成した免疫複合体にも、一次抗体を欠く対照（
レーン４）にも存在しなかった。以前の研究は、１２０ｋｄ タンパク質がｐ１
０７であり（４５、４６）、そして１８０ｋｄ タンパク質（ＰＡｂ４２１抗ｐ
５３免疫複合体にのみ存在）が、酵母におけるｄｓＤＮＡ切断修復に関与するタ
ンパク質、ＲＡＤ５０（Ｋｉｍ， Ｋ．Ｋ．， Ｄａｕｄ， Ａ．Ｉ．， Ｗｏ
ｎｇ， Ｓ．Ｃ．， Ｐａｊａｋ， Ｌ．， Ｔｓａｉ， Ｓ．Ｃ．， Ｗａｎ
ｇ， Ｈ．， Ｈｅｎｚｅｌ， Ｗ．Ｊ．及びＦｉｅｌｄ， Ｌ．Ｊ．（１９９
６）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１， ２９２５５−２９２６４）のネ
ズミ相同体であることを示している。３８０ ｋｄタンパク質は、いまだに性質
決定されていない。

【００５３】 ｐ１９３をクローニングするため、大規模抗Ｔ−Ａｇ免疫複合体調製を、ポリ
アクリルアミドゲル上で分離し、そしてクーマシーブルー染色により、視覚化し
た。ｐ１９３を含む領域を切除し、ｉｎ ｓｉｔｕでトリプシンを用いて消化し
、ＨＰＬＣにより分画し、そしてポストソース分解（ＰＳＤ、図１ｂ）を用いた
質量分析により、解析した。ＰＳＤ実験から得られた情報を用いて、Ｆｒａｇ−
Ｆｉｔの修飾型を用い、タンパク質配列データベースを検索した。この検索によ
り、ｐ１９３は、先に同定された、ヒト未成熟骨髄細胞株から単離された未知の
機能のオープンリーディングフレーム（Ｎｏｍｕｒａ， Ｎ．， Ｎａｇａｓｅ
， Ｔ．， Ｍｉｙａｊｉｍａ， Ｎ．， Ｓａｚｕｋａ， Ｔ．， Ｔａｎａ
ｋａ， Ａ．， Ｓａｔｏ， Ｓ．， Ｓｅｋｉ， Ｎ．， Ｋａｗａｒａｂａ
ｙａｓｉ， Ｙ．， Ｉｓｈｉｋａｗａ， Ｋ．及びＴａｂａｔａ， Ｓ．（１
９９４）ＤＮＡ Ｒｅｓ． １， ２５１−２６２）に相同であることが示され
た。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を用い、最大のｐ１９３ペプチドに相同な
領域に渡る短いｃＤＮＡクローンを生成した。その後、このクローンを用い、成
体マウス心臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。

【００５４】 最終的に６つの重複するｃＤＮＡクローンが得られた（図１ｃ）。配列解析に
より、１６８９アミノ酸残基のタンパク質をコードし、そして１９２，３４６
ｄの推定分子量を持つ、長さ５０６７ヌクレオチドのオープンリーディングフレ
ームが明らかになった（図２ａ）。ＰＳＤ実験で同定されるｐ１９３タンパク質
分解ペプチドはすべて、該ｃＤＮＡクローンの推定されるアミノ酸配列に存在し
た。配列解析により、アミノ酸残基５９３−６１９にロイシンジッパー、アミノ
酸残基１０５２−１０５６にＬＸＣＸＥモチーフ（網膜芽細胞腫ファミリータン
パク質に結合するコンセンサス配列、Ｇｉｂｓｏｎ， Ｔ．Ｊ．， Ｔｈｏｍｐ
ｓｏｎ， Ｊ．Ｄ．， Ｂｌｏｃｋｅｒ， Ａ．及びＫｏｕｚａｒｉｄｅｓ，
Ｔ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． ２２， ９４６
−９５２を参照されたい）、及びアミノ酸残基１５６６−１５７２に２つのＧタ
ンパク質受容体モチーフの存在を明らかにした：他のＢＨドメインは、ｐ１９３
には存在しなかった。ｐ１９３のＢＨ３ドメイン及びＢＨ３のみのファミリーメ
ンバーのものの配列並列を図２ｂに示す。

【００５５】 クローニングされたｐ１９３はＴ−Ａｇに結合する これらのクローンが１９３ ｋｄ Ｔ−Ａｇ結合タンパク質をコードすること
を確認するため、全長ｐ１９３ ｃＤＮＡを、Ｃ末端に短いｍｙｃエピトープを
取り込んだＣＭＶ促進発現ベクターにサブクローニングした。ＣＭＶ−ｐ１９３
ｍｙｃと称される、生じたクローンのみを、ＣＭＶ−Ｔ−Ａｇ（Ｔ−Ａｇをコー
ドする発現構築物）と共に、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞にコトランスフェクションした
。トランスフェクション２４時間後に細胞から調製したタンパク質を、抗Ｔ−Ａ
ｇ及び抗ｍｙｃ抗体を用いて、免疫沈降／ウェスタンブロット解析に供した（図
３ａ）。ｐ１９３ｍｙｃは、抗Ｔ−Ａｇ免疫複合体中に検出され、そしてＴ−Ａ
ｇは、抗ｍｙｃ免疫複合体中に検出された。どちらのタンパク質も、ＩｇＧサブ
タイプが一致した非特異的対照抗体で生成された免疫複合体中には存在しなかっ
た。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳ｐ１９３及び組換えＴ−Ａｇの混合物の免疫沈降解析
もまた行った（図３ｂ）。放射標識ｐ１９３は、抗Ｔ−Ａｇ抗体で生成した免疫
複合体中に存在したが、ＩｇＧサブタイプが一致した非特異的対照抗体で生成し
た免疫複合体中には存在せず、１９３ｋｄ Ｔ−Ａｇ結合タンパク質のクローニ
ングに成功したことが確認された。ノーザンブロットにより、成体マウス組織に
おける幾分限定されたパターンのｐ１９３発現が明らかになった（図３ｃ）。該
タンパク質が元来、心臓腫瘍由来の細胞株で同定されたことを考慮すると予期さ
れる可能性があるように、比較的高レベルのｐ１９３ ｍＲＮＡが心臓に検出さ
れた。

【００５６】 ｐ１９３はＴ−ＡｇのＮ末端に結合する ｐ１９３に結合するＴ−Ａｇの領域を同定するため、一連のＴ−Ａｇ欠失構築
物由来のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳産物を、全長ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳ｐ１９３と混
合し、そして抗Ｔ−Ａｇ抗体で生成された免疫複合体を、ポリアクリルアミドゲ
ル上で分離し、そしてオートラジオグラフィーにより視覚化した（図４）。ｐ１
９３は、アミノ酸残基１４７から７０８と同程度のアミノ酸残基を含む欠失を持
つＴ−Ａｇ突然変異体で生成された免疫複合体中に存在し、ｐ１９３結合部位が
、Ｔ−Ａｇアミノ酸残基１から１４７内に存在することが示された。対照的に、
アミノ酸残基９２から７０８が欠失したＴ−Ａｇ突然変異体で生成した免疫複合
体中に、ｐ１９３は存在せず、結合部位のＣ末端境界が、Ｔ−Ａｇアミノ酸残基
１０７及び１０８内にあり、これはＲＢファミリーメンバーの結合を乱すが、ｐ
１９３結合に影響を与えなかったことが示された（図４、構築物１−１４７▲Ｒ
Ｂ）。したがって、ｐ１９３は、ＲＢファミリーメンバー結合部位と異なるＴ−
ＡｇのＮ末端領域に結合する。

【００５７】 ｐ１９３の発現はアポトーシスを促進する 細胞増殖に対するｐ１９３発現の影響を決定するため、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞に
、ＣＭＶ−βＧＡＬｍｙｃ（ｍｙｃエピトープタグと共にβ−ガラクトシダーゼ
をコードする発現構築物）又はＣＭＶ−ｐ１９３ｍｙｃいずれかをトランスフェ
クションした。トランスフェクション４８時間後のＦＩＴＣコンジュゲート化抗
ｍｙｃ抗体を用いたＦＡＣＳ解析により、ＣＭＶ−βＧＡＬｍｙｃを発現する大
部分の細胞は、正常２Ｃ ＤＮＡ含量を有することが明らかになった（図５ａ；
差し込み図は、ＣＭＶ−βＧＡＬｍｙｃトランスフェクション細胞を示す：左の
画像は、抗ｍｙｃ免疫蛍光を示し（矢印を参照されたい）、右の画像は、Ｈｏｅ
ｃｈｓｔ蛍光を介した核形態を示す（矢印を参照されたい））。対照的に、ＣＭ
Ｖ−ｐ１９３ｍｙｃを発現する細胞の大部分は、二倍体以下（ｈｙｐｏｄｉｐｌ
ｏｉｄ）のＤＮＡ含量を示し、アポトーシス細胞死を示した（図５ｂ）。培養の
視覚的検査により、トランスフェクション細胞の大部分が死んでおり、そして顕
著に凝縮した染色質を有することが確認された（図５Ｂ差し込み図：左の画像は
、抗ｍｙｃ免疫蛍光を示し（矢印を参照されたい）、右の画像は、Ｈｏｅｃｈｓ
ｔ蛍光を介した核形態を示す（矢印を参照されたい））。したがって、ｐ１９３
発現は、アポトーシスを誘導することが可能である。

【００５８】 細胞周期のどの時点で、ｐ１９３が細胞死を誘導するか決定するため、血清飢
餓ＮＩＨ−３Ｔ３細胞に、ＣＭＶ−ｐ１９３ｍｙｃをトランスフェクションした
。その後、血清及び³Ｈ−チミジンを含む培地を添加し、そしてその後、多様な
時点で、抗ｍｙｃ免疫細胞診断及びオートラジオグラフィーのため、培養をプロ
セシングした。ＣＭＶ−ｐ１９３ｍｙｃを発現する細胞のほとんどは、血清補充
２０時間後までに死に（図５ｃ、正方形記号のトレース）、そしてこれらの細胞
では、ＤＮＡ合成は再開されなかった（図５ｃ、ひし形記号のトレース）。これ
は、ｐ１９３誘導アポトーシスがＧ₁中に起こることを示唆する。対照的に、同
一チャンバースライド上の非トランスフェクション細胞の大部分は、血清補充１
４時間後までに、ＤＮＡ合成を再開し（図５ｃ、円記号のトレース）、したがっ
て、同調プロトコルの忠実性（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）が確かめられた。対照実験に
おいて、ＣＭＶ−βＧＡＬｍｙｃを発現する細胞は、非トランスフェクション細
胞のものに匹敵する速度でＤＮＡ合成を再開し（未提示）、導入遺伝子発現それ
自体は、細胞周期進行又は生存度に影響を与えないことが示された。同調培養に
おけるｐ１９３ｍｙｃ免疫反応性は、まず、細胞質中に均一に局在したが、細胞
死開始前に核周辺領域に限定されてきた（それぞれ図５ｄ及びｅ）。よく性質決
定されているプロアポトーシスタンパク質、Ｂａｘは、アポトーシス中、細胞質
から核周辺への同様の再分布を経る（Ｈｓｕ， Ｙ．Ｔ．， Ｗｏｌｔｅｒ，
Ｋ．Ｇ．及びＹｏｕｌｅ， Ｒ．Ｊ．（１９９７）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａ
ｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４， ３６６８−３６７２）。最後に、細胞周
期進行が遮断されると、ｐ１９３ｍｙｃ発現細胞が、生存可能であることに注目
することが興味深い；低血清条件下に維持すると、トランスフェクション４０時
間後、ｐ１９３発現細胞の＞９０％が生存可能であった。これは、アポトーシス
を始動させるのに、ある程度の細胞周期進行が必要であることを示唆する。

【００５９】 ＢＨ３のみのファミリーメンバーによる細胞死誘導は、Ｂｃｌ−２ファミリー
の生存促進（ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ）メンバーの同時発現により、アンタゴ
ナイズされる可能性がある。ｐ１９３がこの形質を共有するか決定するため、Ｎ
ＩＨ−３Ｔ３細胞に、ＣＭＶ−ｐ１９３ｍｙｃのみをトランスフェクションする
か、又はＣＭＶ−ｐ１９３ｍｙｃ及びＣＭＶ−Ｂｌｃ−Ｘ_L（ヒトＢｃｌ−Ｘ_Lを
コードする構築物）をコトランスフェクションした。ｐ１９３のみをトランスフ
ェクションした細胞の大部分は、トランスフェクション６８時間後、死んだが、
Ｂｃｌ−Ｘ_Lのコトランスフェクションは、ｐ１９３誘導アポトーシスを顕著に
アンタゴナイズした（図５ｆ）。対照実験において、ＣＭＶ−ｐ１９３ｍｙｃ及
びＣＭＶ−ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質をコードする発現構築物）のコトランス
フェクション後、実質的に生存細胞はまったく見られず、２つのＣＭＶ駆動構築
物の同時発現が、ｐ１９３誘導細胞死を寛解（ａｂａｔｅ）しないことが示され
た（図５ｆ）。

【００６０】 ｐ１９３誘導アポトーシスにおけるＢＨ３ドメインの重要性を確かめるため、
アミノ酸残基１５６３から１５７６（ＶＲＩＬＫＡＨＧＤＥＧＬＨＶ）が欠失す
るように、ＣＭＶ−ｐ１９３ｍｙｃ発現構築物を修飾した。この修飾により、Ｂ
Ｈ３モチーフ（アミノ酸残基１５６６−１５７２）の欠失が生じ、そして生じた
構築物は、ＣＭＶ−ｐ１９３［デルタ記号］ＢＨと名づけられた。ＣＭＶ−ｐ１
９３［デルタ記号］ＢＨをトランスフェクションしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞は生存
可能であった（図５ｆ）。実際、生存は、ＣＭＶ−ｐ１９３に加えＣＭＶ−Ｂｃ
ｌ−ＸＬをコトランスフェクションした細胞に関して得られるものと同様であっ
た。したがって、ＢＨ３ドメインは、ｐ１９３仲介アポトーシスに必要である。

【００６１】 Ｔ−ＡｇはＭ及びＧ₁中、一過的に細胞質に局在する ｐ１９３が元来、Ｔ−Ａｇ結合タンパク質として同定されたこと、及びＴ−Ａ
ｇが核腫瘍性タンパク質であることを考慮すると、ｐ１９３ｍｙｃの細胞質／核
周辺局在は、幾分驚くべきことである。この逆説にさらに取り組むため、ＣＭＶ
−１９３ｍｙｃ及びＣＭＶ−Ｔ−ＡｇをコトランスフェクションしたＮＩＨ−３
Ｔ３細胞を調べた。ｐ１９３及びＴ−Ａｇを同時発現する細胞で、生存は非常に
増進し（図５ｆ）、Ｂｃｌ−Ｘ_L同様、Ｔ−Ａｇがｐ１９３誘導アポトーシスを
アンタゴナイズすることが可能であることが示された。さらに、免疫細胞診断解
析により、ｐ１９３ｍｙｃ及びＴ−Ａｇが、コトランスフェクション細胞の大部
分（およそ６３％）で、細胞質に共に局在することが示された（それぞれ図６ａ
及びｂ）。対照的に、ＣＭＶ−βＧＡＬｍｙｃ及びＣＭＶ−Ｔ−Ａｇのコトラン
スフェクションは、顕著な細胞質Ｔ−Ａｇ免疫反応性を生じなかった（未提示）
。これらの結果は、ｐ１９３−Ｔ−Ａｇ結合が、通常、細胞質で起こる可能性を
提起する。

【００６２】 細胞質Ｔ−Ａｇ免疫反応性は、先に、有糸分裂細胞で注目されてきている（Ｓ
ｔｅｎｍａｎ， Ｓ．， Ｚｅｕｔｈｅｎ， Ｊ．及びＲｉｎｇｅｒｔｚ， Ｎ
．Ｒ．（１９７５）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ． Ｏｆ
Ｃａｎｃｅｒ １５， ５４７−５５４； Ｄａｖｉｓ， Ｄ．及びＷｙｎｆｏ
ｒｄ−Ｔｈｏｍａｓ， Ｄ．（１９８６） Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ． Ｃｅ
ｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． １６６， ９４−１０２）。パルス追跡実験を用い
、ＡＴ−２心筋細胞の細胞質に、どのくらい長くＴ−Ａｇが存続するか決定した
。集密以下の培養に、³Ｈ−チミジンの４０分間パルスを与え（Ｓ期の細胞に印
をつけるため）、その後、放射性同位体不含培地で追跡した。その後、多様な時
点で、抗Ｔ−Ａｇ免疫細胞診断及びオートラジオグラフィーのため、培養をプロ
セシングした。チミジン陽性細胞のかなりの割合が、Ｓ期４時間後から１０時間
後、細胞質Ｔ−Ａｇ免疫反応性を示した（図６ｃ）。対照的に、有糸形の³Ｈ−
チミジン陽性細胞は、Ｓ期4時間及び６時間後に観察されたのみであった。した
がって、細胞質Ｔ−Ａｇ局在は、細胞質分裂から十分にＧ₁まで持続した。この
点は、Ｓ期８−１２時間後、細胞質Ｔ−Ａｇ免疫反応性を持つ、³Ｈ−チミジン
陽性娘細胞の存在によってもさらに例示される（図６ｄ及びｅ）。したがって、
Ｔ−Ａｇは、ｐ１９３誘導細胞死が起こる細胞周期の時点（Ｇ₁）の同時点に、
細胞質に一過的に局在する。

【００６３】 ｐ１９３活性の減少が増殖を促進する 上に提示されるデータは、ｐ１９３の強いられた発現が、Ｓ期開始前にアポト
ーシスを促進することを示す。ｐ１９３アンチセンス構築物（ＣＭＶ−ｐ１９３
ａｓ）を使用するコロニー増殖アッセイを用い、減少したｐ１９３発現の結果を
決定した。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞にＣＭＶ−１９３ａｓをトランスフェクションす
ると、ＣＭＶ−ヌル（挿入物を欠く対照発現ベクター、図７Ａを参照されたい）
のトランスフェクションに比較した際、顕著に増加したコロニーサイズを生じた
。平行培養のノーザンブロットにより、ｐ１９３転写物が、アンチセンス構築物
をトランスフェクションした培養で、顕著に減少していることが示された（デー
タ未提示）。期待されたように、ＣＭＶ−１９３ｓ（センス方向にｐ１９３をコ
ードする発現ベクター）のトランスフェクションは、可視コロニーをまったく生
じず（図７Ａ）、これは、上述のｐ１９３のプロアポトーシス活性と一致する。

【００６４】 アンチセンス構築物の発現が、内因性ｐ１９３転写物のレベルに影響を与えた
ことを確認するため、ＲＴ−ＰＣＲ解析を行った（図７Ｂを参照されたい）。ベ
ータ−アクチン転写物の断片、及び内因性遺伝子に存在するが、発現ベクターに
存在しないｐ１９３転写物の断片の同時増幅を可能にする増幅プライマーを選択
した。ベータ−アクチン増幅産物及びｐ１９３増幅産物の相対比は、内因性ｐ１
９３転写物の定常状態レベルの定量的評価を提供する。ＣＭＶ−ヌルベクターを
発現する細胞、ＣＭＶ−ｐ１９３ａｓベクターを発現する細胞、又は非トランス
フェクションＮＩＨ−３Ｔ３細胞から、ＲＮＡを調製した。ｐ１９３増幅産物の
相対レベルは、対照細胞に対し、ＣＭＶ−ｐ１９３ａｓを発現する細胞由来のＲ
ＮＡで減少し、アンチセンス干渉が、内因性転写物の定常状態レベルを減少させ
るのに成功したことを示した（図７Ｂ）。しかし、ｐ１９３発現が完全には遮断
されなかったことに注目されたい。

【００６５】 実施例１−３：考察 我々は、ＡＴ−２心筋細胞腫瘍細胞株に存在するＴ−Ａｇ結合タンパク質、ｐ
１９３が、ＢＨ３のみのプロアポトーシス遺伝子ファミリーの新規メンバーであ
ることを示した。他のＢＨ３のみのタンパク質同様、ｐ１９３誘導アポトーシス
は、生存促進Ｃｌ−２ファミリーメンバー（我々の場合、Ｂｃｌ−Ｘ_lを試験し
た）の同時発現により、アンタゴナイズすることが可能である。ｐ１９３は、他
のＢＨ３のみのファミリーメンバーに比較した際、サイズが顕著に異なり；ＢＨ
３のみのファミリーメンバーの二番目に大きいファミリーメンバー、ＢＩＤはわ
ずか２１．９５ ｋｄである（Ｗａｎｇ， Ｋ．， Ｙｉｎ， Ｘ．Ｍ．， Ｃ
ｈａｏ， Ｄ．Ｔ．， Ｍｉｌｌｉｍａｎ， Ｃ．Ｌ．及びＫｏｒｓｍｅｙｅｒ
， Ｓ．Ｊ．（１９９６）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １０， ２８５９−２８６９
）。一過的トランスフェクション細胞において、Ｔ−Ａｇの同時発現は、ｐ１９
３誘導アポトーシスをアンタゴナイズし、そして両タンパク質の細胞質隔離を生
じる。さらに、Ｔ−Ａｇは、細胞周期でｐ１９３がアポトーシスを誘導するのと
同時点である、Ｇ１中、ＡＴ−２心筋細胞の細胞質に局在する。これらのデータ
は、細胞質におけるＴ−Ａｇ／ｐ１９３結合が、ＳＶ４０形質転換細胞における
ｐ１９３活性を修飾するか又は抑止することが可能であるという知見と一致する
。

【００６６】 ｐ１９３がＴ−Ａｇ仲介形質転換に重要であるならば、ｐ１９３結合部位での
及び／又はその近傍での突然変異が、Ｔ−Ａｇ形質転換活性を減少させるであろ
うことが期待されるであろう。実際、先の突然変異解析は、Ｔ−ＡｇのＮ末端に
形質転換活性を同定した。例えば、Ｋｏｈｒｍａｎ及びＩｍｐｅｒｉａｌｅ（Ｋ
ｏｈｒｍａｎ， Ｄ．Ｃ．及びＩｍｐｅｒｉａｌｅ， Ｍ．Ｊ．（１９９２）Ｊ
． Ｖｉｒｏｌ． ６６， １７５２−１７６０）は、アミノ酸残基１−１０８
が、Ｂ２−１細胞を効率的に形質転換するのに必要であり、そしておよそ１８５
ｋｄのタンパク質が、Ｔ−Ａｇのこの領域に結合することを立証した。さらに
、Ｔ−Ａｇ及び１８５ ｋｄタンパク質の間の結合は、ＲＢファミリーメンバー
の結合を抑止する点突然変異により、乱されなかった。分子量及び結合特異性の
類似性を考慮すると、ｐ１９３は、ｐ１８５と同一タンパク質である可能性があ
る。

【００６７】 他の研究は、Ｔ−Ａｇアミノ酸残基１−８２（Ｍａｒｓｉｌｉｏ， Ｅ．，
Ｃｈｅｎｇ， Ｓ．Ｈ．， Ｓｃｈａｆｆｈａｕｓｅｎ， Ｂ．， Ｐａｕｃｈ
ａ， Ｅ．及びＬｉｖｉｎｇｓｔｏｎ， Ｄ．Ｍ．（１９９）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ
． ６５， ５６４７−５６５２）、３−３５（Ｚｈｕ， Ｊ．， Ｒｉｃｅ，
Ｐ．Ｗ．， Ｇｏｒｓｃｈ， Ｌ．， Ａｂａｔｅ， Ｍ．及びＣｏｌｅ，
Ｃ．Ｎ．（１９９２）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６， ２７８０−２７９１）、及
び１７−２７（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ， Ａ．， ＭｃＣｌｅｌｌａｎ， Ａ．
Ｊ．， Ｖａｒｔｉｋａｒ， Ｊ．， Ｍａｒｋｓ， Ｉ．， Ｃａｎｔａｌｕ
ｐｏ， Ｐ．， Ｌｉ， Ｙ．， Ｗｈｙｔｅ， Ｐ．， Ｒｕｎｄｅｌｌ，
Ｋ．， Ｂｒｏｄｓｋｙ， Ｊ．Ｌ．及びＰｉｐａｓ， Ｊ．Ｍ．（１９９７）
Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １７， ４７６１−４７７３）での突然変
異がすべて、選択された細胞種において形質転換活性に影響を与えることを立証
している。これらの突然変異体のいくつかは、ＤｎａＪ分子シャペロンとして機
能する配列モチーフ、Ｎ末端Ｊドメインを乱すと考えられる（Ｓｒｉｎｉｖａｓ
ａｎ， Ａ．， ＭｃＣｌｅｌｌａｎ， Ａ．Ｊ．， Ｖａｒｔｉｋａｒ， Ｊ
．， Ｍａｒｋｓ， Ｉ．， Ｃａｎｔａｌｕｐｏ， Ｐ．， Ｌｉ， Ｙ．，
Ｗｈｙｔｅ， Ｐ．， Ｒｕｎｄｅｌｌ， Ｋ．， Ｂｒｏｄｓｋｙ， Ｊ．
Ｌ．及びＰｉｐａｓ， Ｊ．Ｍ．（１９９７）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ
． １７， ４７６１−４７７３； Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ｋ．Ｓ．， Ｍｕｌ
ｌａｎｅ， Ｋ．Ｐ．， Ａｋｓｏｙ， Ｉ．Ａ．， Ｓｔｕｂｄａｌ， Ｈ．
， Ｚａｌｖｉｄｅ， Ｊ．， Ｐｉｐａｓ， Ｊ．Ｍ．， Ｓｉｌｖｅｒ，
Ｐ．Ａ．， Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｔ．Ｍ．， Ｓｃｈａｆｆｈａｕｓｅｎ， Ｂ
．Ｓ．及びＤｅＣａｐｒｉｏ， Ｊ．Ａ．（１９９７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．
１１， １０９８−１１１０）。ＤｎａＪは、７０ ｋｄ熱ショックタンパク質
ファミリーのメンバーに結合し、そしてこの複合体は、正しいタンパク質フォー
ルディング、多タンパク質複合体の形成、及び細胞内膜を横断するタンパク質輸
送を促進する。（Ｇｅｔｈｉｎｇ， Ｍ．Ｊ．及びＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．（
１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５５，３３−４５）。我々のデータは、ｐ１９３の
結合部位のＣ末端境界が、Ｔ−Ａｇアミノ酸残基９２から１４７に存在すること
を示すが、結合部位のＮ末端境界はまだマッピングされていない。アミノ酸９２
の上流の残基を含む突然変異は、結合ドメインの直接の中断により、又はＴ−Ａ
ｇの三次構造を改変することにより、ｐ１９３／Ｔ−Ａｇ結合を改変することが
可能であった。Ｔ−Ａｇ形質転換活性に関するｐ１９３結合の重要性を確認する
には、結合部位を正確にマッピングした後、適切に突然変異させたＴ−Ａｇ発現
構築物で形質転換活性を評価する必要がある。最後に、ｐ１９３及びＲＢファミ
リーメンバー結合部位の相対近接度が得られたら、ＲＢ、ｐ１０７及び／又はｐ
１９３がＴ−Ａｇ結合に関し、立体的に競合するかどうか決定することが興味深
いだろう。こうした機構は、心筋細胞から調製された総タンパク質中に、過少リ
ン酸化ＲＢが存在するにも関わらず、心筋細胞株由来の抗Ｔ−Ａｇ免疫沈降物に
ＲＢが存在しないことを説明する可能性がある（図１、Ｋｉｍ， Ｋ．Ｋ．，
Ｓｏｏｎｐａ， Ｍ．Ｈ．， Ｄａｕｄ， Ａ．Ｉ．， Ｋｏｈ， Ｇ．Ｙ．，
Ｋｉｍ， Ｊ．Ｓ．及びＦｉｅｌｄ， Ｌ．Ｊ．（１９９４）Ｊ． Ｂｉｏｌ
． Ｃｈｅｍ． ２６９， ２２６０７−２２６１３もまた参照されたい）。

【００６８】 ｐ１９３はまた、Ｔ−Ａｇに結合する能力に関し、ＢＨ３のみのファミリーメ
ンバー中で、独特であるようである。しかし、ＢＨ３のみのタンパク質Ｂｉｋ及
びＢＮＩＰ−３（と共に、ＢＨ１、ＢＨ２及びＢＨ３ドメインを含むプロアポト
ーシスタンパク質、Ｂａｘ及びＢａｋ）は、アデノウイルスＥ１Ｂ １９Ｋタン
パク質に結合することが可能である（Ｆａｒｒｏｗ， Ｓ．Ｎ．， Ｗｈｉｔｅ
， Ｊ．Ｈ．， Ｍａｒｔｉｎｏｕ， Ｉ．， Ｒａｖｅｎ， Ｔ．， Ｐｕｎ
， Ｋ．Ｔ．， Ｇｒｉｎｈａｍ， Ｃ．Ｊ．， Ｍａｒｔｉｎｏｕ， Ｊ．Ｃ
．及びＢｒｏｗｎ， Ｒ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７４， ７３１−７３
３； Ｂｏｙｄ， Ｊ．Ｍ．， Ｍａｌｓｔｒｏｍ， Ｓ．， Ｓｕｂｒａｍａ
ｎｉａｎ， Ｔ．， Ｖｅｎｋａｔｅｓｈ， Ｌ．Ｋ．， Ｓｃｈａｅｐｅｒ，
Ｕ．， Ｅｌａｎｇｏｖａｎ， Ｂ．， Ｄ’Ｓａ−Ｅｉｐｐｅｒ， Ｃ．及
びＣｈｉｎｎａｄｕｒａｉ， Ｇ．（１９９４）Ｃｅｌｌ ７９， ３４１−３
５１； Ｂｏｙｄ， Ｊ．Ｍ．， Ｇａｌｌｏ， Ｇ．Ｊ．， Ｅｌａｎｇｏｖ
ａｎ， Ｂ．， Ｈｏｕｇｈｔｏｎ， Ａ．Ｂ．， Ｍａｌｓｔｒｏｍ， Ｓ．
， Ａｖｅｒｙ， Ｂ．Ｊ．， Ｅｂｂ， Ｒ．Ｇ．， Ｓｕｂｒａｍａｎｉａ
ｎ， Ｔ．， Ｃｈｉｔｔｅｎｄｅｎ， Ｔ．， Ｌｕｔｚ， Ｒ．Ｊ．ら（１
９９５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １１， １９２１−１９２８； Ｈａｎ， Ｊ．，
Ｓａｂｂａｔｉｎｉ， Ｐ．， Ｐｅｒｅｚ， Ｄ． Ｒａｏ， Ｌ．， Ｍ
ｏｄｈａ， Ｄ．及びＷｈｉｔｅ， Ｅ．（１９９６）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．
１０， ４６１−４７７）。Ｅ１Ｂ １９Ｋタンパク質の抗アポトーシス活性は
、少なくとも部分的に、プロアポトーシスＢｃｌ−２ファミリーメンバーとの結
合によるものであると考えられる（Ｗｈｉｔｅ， Ｅ．（１９９５）Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ． ＆ Ｉｍｍｕｎｏ． ３４−５８）
。以前の研究は、アミノ酸残基５２５から５４１にＴ−Ａｇ抗アポトーシス活性
を同定しており、これはｐ５３隔離と独立に作用するようである（Ｃｏｎｚｅｎ
， Ｓ．Ｄ．， Ｓｎａｙ， Ｃ．Ａ．及びＣｏｌｅ， Ｃ．Ｎ．（１９９７）
Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１， ４５３６−４５４３）。これらの著者らは、Ｔ−
Ａｇのこの領域及びＥ１Ｂ １９Ｋのアミノ酸残基７７から９３と共にＢｃｌ−
２アミノ酸残基１３３から１５１の間の有意な度合いの配列相同性に注目してい
る。これらの観察は、Ｔ−Ａｇアミノ酸残基５２５−５４２での結合活性が、プ
ロアポトーシスタンパク質のＥ１Ｂ １９Ｋタンパク質隔離と機能的に同様であ
る可能性があることを示唆するが、ＢａｋへのＴ−Ａｇの直接結合を確立するこ
とを目指す実験は成功しなかった（Ｃｏｎｚｅｎ， Ｓ．Ｄ．， Ｓｎａｙ，
Ｃ．Ａ．及びＣｏｌｅ， Ｃ．Ｎ．（１９９７）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１，
４５３６−４５４３）。

【００６９】 アンチセンストランスフェクション実験の結果は、ｐ１９３活性の減少は、Ｎ
ＩＨ−３Ｔ３細胞における顕著な増殖増進と関連することを示した。増殖速度の
増加は、使用した増殖条件下では幾分不定期に起こる、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞にお
けるアポトーシスの単純な阻害から期待されるであろうものより多い。これを証
拠立てて、予備実験は、ＣＭＶ−ｐ１９３ａｓ構築物を発現する細胞が、対照構
築物（Ｔｓａｉ、未公表データ）を発現する細胞に比較した際、より高いＤＮＡ
合成標識指標を示すことを示した。この観察は、ｐ１９３が細胞周期チェックポ
イントとして機能する可能性があり、そしてこのチェックポイントの通過が、ｐ
１９３活性の非存在下で加速されるという知見と一致する。この仮説は、ｐ１９
３仲介細胞死プログラムの始動には、少なくとも限定された度合いの細胞周期進
行が必要であることを示した、上述の血清飢餓実験により、部分的に支持される
。したがって、ｐ１９３は、Ｇ₁の特定の時点（すなわち推定される細胞周期チ
ェックポイント）の通過後の細胞死を誘発することのみ可能であり、そして該タ
ンパク質の集積それ自体は、細胞に有害でない。細胞質Ｔ−Ａｇ局在が細胞周期
の同一時点の間に起こるという観察が、この知見をさらに信頼できるものにする
。ｐ１９３の分子経路へのさらなる洞察は、さらなる機能損失モデルの生成を待
たなければならない。

【００７０】 ｐ１９３を性質決定する我々の努力は、部分的に、疾患心臓における再生増殖
を生じさせる、潜在的に療法的な標的を同定する希望が動機となっている。これ
に関し、初代心筋細胞培養への、Ｅ１Ａ又はＥ２Ｆ−１のトランスフェクション
は、Ｅ１Ｂ、Ｂｃｌ−２の同時発現又はｐ５３活性の抑止により、部分的にしか
弱められない、迅速なアポトーシス反応を生じることに注目することが興味深い
（Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ， Ｌ．Ａ．及びＳｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｍ．Ｄ．（
１９９５）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０， ７７９１−７７９４；
Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ， Ｌ．Ａ．， Ａｂｄｅｌｌａｔｉｆ， Ｍ．， Ｃ
ｈａｋｒａｂｏｒｔｙ， Ｓ．及びＳｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｍ．Ｄ．（１９９６
）Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １７９， ４０２−４１１； Ｌｉｕ， Ｙ．及びＫ
ｉｔｓｉｓ， Ｒ．Ｎ．（１９９６）Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １３３，
３２５−３３４； Ａｇａｈ， Ｒ．， Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ， Ｌ．Ａ．
， Ａｂｄｅｌｌａｔｉｆ， Ｍ．， Ｔｒｕｏｎｇ， Ｌ．Ｄ．， Ｃｈａｋ
ｒａｂｏｒｔｙ， Ｓ．， Ｍｉｃｈａｅｌ， Ｌ．Ｈ．及びＳｃｈｎｅｉｄｅ
ｒ Ｍ．Ｄ．（１９９７）Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １００， ２７
２２−２７２８； Ｂｉｓｈｏｐｒｉｃ， Ｎ．Ｈ．， Ｚｅｎｇ， Ｇ．Ｑ．
， Ｓａｔｏ， Ｂ．及びＷｅｂｓｔｅｒ， Ｋ．Ａ．（１９９７）Ｊ． Ｂｉ
ｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２， ２０５８４−２０５９４）。対照的に、Ｔ−Ａ
ｇでの形質転換は、持続する心筋細胞増殖を生じる。この観察は、心筋細胞にお
いて、Ｔ−ＡｇがＥ１Ａ及びＥ２Ｆ−１には欠けている抗アポトーシス活性を持
つことを示唆する。ｐ１９３がプロアポトーシスＴ−Ａｇ結合タンパク質であり
、そしてＴ−Ａｇ発現が、心筋細胞において、アポトーシス反応を引き出さない
ことを考慮すると、ｐ１９３活性の抑止が、Ｅ１Ａ及び／又はＥ２Ｆ−１誘導心
筋細胞アポトーシスをアンタゴナイズすることが可能であるかどうか決定するこ
とが興味深いだろう。

【００７１】 ｐ１９３活性の抑止はまた、心筋細胞アポトーシスを促進する病態生理学的条
件下で、心臓保護効果を有する可能性もある。多くの記述的研究が、拡張型心筋
症、虚血性心筋症、不整脈惹起性右心室形成異常、急性心筋梗塞、心筋炎、同種
移植片拒絶、及び異常早期興奮症候群を含む、多様な心臓血管疾患において、ア
ポトーシス心筋細胞の存在を確かめてきている（Ｈａｕｎｓｔｅｔｔｅｒ， Ａ
．及びＩｚｕｍｏ， Ｓ．（１９９８）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ ８２， １１１１−１１２９に概説される）。特に、アポトーシス及び生
じた心臓リモデリングは、拡張型心筋症及び心不全の開始に貢献する可能性があ
る（Ａｎｖｅｒｓａ， Ｐ．， Ｌｅｒｉ， Ａ．， Ｂｅｌｔｒａｍｉ， Ｃ
．Ａ．， Ｇｕｅｒｒａ， Ｓ．及びＫａｊｓｔｕｒａ， Ｊ．（１９９８）Ｌ
ａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７８， ７６７−７８６に概説される）。トランスジ
ェニックマウスにおける研究は、ＩＬ−６サイトカインファミリー／ｇｐ１３０
／ＬＩＦ受容体（Ｈｉｒｏｔａ， Ｈ．， Ｃｈｅｎ， Ｊ．， Ｂｅｔｚ，
Ｕ．Ａ．， Ｒａｊｅｗｓｋｙ， Ｋ．， Ｇｕ， Ｙ．， Ｒｏｓｓ， Ｊ．
， Ｊｒ．， Ｍｕｌｌｅｒ， Ｗ．及びＣｈｉｅｎ， Ｋ．Ｒ．（１９９９）
Ｃｅｌｌ ９７， １８９−９８）、ＴＮＦα／ＴＮＦＲｌ（Ｋｕｂｏｔａ，
Ｔ．， ＭｃＴｉｅｒｎａｎ， Ｃ．Ｆ．， Ｆｒｙｅ， Ｃ．Ｓ．， Ｓｌａ
ｗｓｏｎ， Ｓ．Ｅ．， Ｌｅｍｓｔｅｒ， Ｂ．Ｈ．， Ｋｏｒｅｔｓｋｙ，
Ａ．Ｐ．， Ｄｅｍｅｔｒｉｓ， Ａ．Ｊ．及びＦｅｌｄｍａｎ， Ａ．Ｍ．
（１９９７）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８１， ６２７−６
３５； Ｂｒｙａｎｔ， Ｄ．， Ｂｅｃｋｅｒ， Ｌ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓ
ｏｎ， Ｊ．， Ｓｈｅｌｔｏｎ， Ｊ．， Ｆｒａｎｃｏ， Ｆ．， Ｐｅｓ
ｈｏｃｋ， Ｒ．， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｍ．及びＧｉｒｏｉｒ， Ｂ．（１
９９８）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９７， １３７５−１３８１）、カテコール
アミン／Ｇｓａｌｐｈａ（Ｇｅｎｇ， Ｙ．Ｊ．， Ｉｓｈｉｋａｗａ， Ｙ．
， Ｖａｔｎｅｒ， Ｄ．Ｅ．， Ｗａｇｎｅｒ， Ｔ．Ｅ．， Ｂｉｓｈｏｐ
， Ｓ．Ｐ．， Ｖａｔｎｅｒ， Ｓ．Ｆ．及びＨｏｍｃｙ， Ｃ．Ｊ．（１９
９９）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８４， ３４−４２）、及
びｃＡＭＰ／ＣＲＥＢ（Ｆｅｎｔｚｋｅ， Ｒ．Ｃ．， Ｋｏｒｃａｒｚ， Ｃ
．Ｅ．， Ｌａｎｇ， Ｒ．Ｍ．， Ｌｉｎ， Ｈ．及びＬｅｉｄｅｎ， Ｊ．
Ｍ．（１９９８）Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０１， ２４１５−２
４２６）カスケードを含む、いくつかのシグナル伝達経路を関連付けてきている
。ｐ１９３がこれらの過程に関与する可能性がある役割は、確かめられないまま
である。

【００７２】 要約すると、本明細書に提示されるデータは、ｐ１９３がＢＨ３のみのプロア
ポトーシス遺伝子ファミリーの新規メンバーであることを示す。ｐ１９３は、Ｇ ₁ 中、ＤＮＡ合成の開始前に、細胞死を促進する。Ｔ−Ａｇは、細胞周期の同時
期中、細胞質に局在し、そしてＴ−Ａｇの同時発現は、ｐ１９３誘導細胞死をア
ンタゴナイズし、そして両タンパク質の細胞質局在を生じる。ｐ１９３は、いく
つかの細胞種で形質転換活性に貢献する領域で、Ｔ−ＡｇのＮ末端に結合する。
総合すると、これらの結果は、Ｔ−Ａｇが、ｐ５３隔離と独立の抗アポトーシス
活性を持ち、これは、細胞質におけるＴ−Ａｇ／ｐ１９３結合により始動される
ことを示唆する。

【００７３】 実施例４ ドミナントネガティブｐ１９３突然変異の性質決定 ＮＩＨ−３Ｔ３細胞におけるコロニー増殖アッセイは、アンチセンス発現の結
果として減少したｐ１９３活性が、細胞増殖の増加した速度を生じることを示す
（図７）。演繹的に、ｐ１９３のドミナントネガティブ変異体の発現もまた、細
胞増殖の増加した速度を生じるはずである。我々は、累進的により大きいＣ末端
一部切除体を宿する、入れ子型シリーズｐ１９３ ｃＤＮＡを生成した。該ｃＤ
ＮＡを、ＣＭＶ発現ベクターにサブクローニングした。ｐ１９３変異体の構造は
、図８Ａに示す。発現ベクターはまた、ネオマイシン耐性カセットも有した。Ｎ
ＩＨ−３Ｔ３細胞に、多様な発現ベクターをトランスフェクションし、そしてＧ
４１８の存在下で細胞を培養した。選択１５日後、培養を固定し、そしてゲンチ
アナバイオレットで染色した。多様な構築物をトランスフェクションした細胞の
代表的な培養を図８Ｂに示す。ＣＭＶ−ヌルベクターをトランスフェクションし
た細胞は、陰性対照に相当する（これは、いかなる陽性又は陰性細胞周期制御因
子も非存在下での増殖速度を反映する。培養プレートＡを参照されたい）。ｐ１
９３のプロアポトーシス活性と一致し、全長ｐ１９３をトランスフェクションし
た培養では、いかなるコロニーも観察されなかった（アミノ酸残基１−１６８９
；培養プレートＢ）。ｐ１９３アミノ酸残基１から１３４２を発現するベクター
をトランスフェクションした細胞で、細胞増殖のわずかな増進が検出された（培
養プレートＣ）。ｐ１９３アミノ酸残基１から１１５２を発現するベクターをト
ランスフェクションした細胞で、顕著な増殖増進が観察された（培養プレートＤ
）。ｐ１９３分子１−９１２、１−３０９、及び１−２４３を発現するベクター
（それぞれ培養プレートＥ−Ｇ）、又はＢＨ３ドメインのみが欠失したｐ１９３
分子を発現するベクター（培養プレートＦ）をトランスフェクションした細胞で
は、増殖増進は、わずかにしか、又はまったく観察されなかった。これらのデー
タは、ｐ１９３アミノ酸残基１−１１５２の発現が、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞におけ
る増殖を促進することを示し、これはｐ１９３アンチセンス構築物の発現でも観
察される傾向である（図７を参照されたい）。これに基づき、ｐ１９３アミノ酸
残基１−１１５２にコードされる配列は、ｐ１９３ドミナントネガティブを示す
、「ｐ１９３ｄｎ」と名づけられた。ｐ１９３アンチセンス構築物に比較した際
の細胞増殖に対するｐ１９３ｄｎのより大きい影響は、アンチセンス構築物の発
現が、内因性ｐ１９３転写物を完全には除去しないという事実を反映する（図７
）。

【００７４】 上述の実験は、（ＮＩＨ−３Ｔ３細胞において、増進された増殖及び抗アポト
ーシス活性を授与し、そして心筋細胞において、アポトーシスを遮断する特性に
より立証されるような）ｐ１９３にドミナントネガティブ表現型を授与する配列
修飾の予備的性質決定を提供する。これらの特性に責任があるｐ１９３アミノ酸
残基のさらなる描写（ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ）は、当業者により、容易に達成
される。例えば、上述の実験に定義される領域を含む細かい規模の欠失は、ドミ
ナントネガティブ表現型を授与するのに必要なアミノ酸をさらに描写するであろ
う。全体のタンパク質構造を保持するが、特定のアミノ酸相互作用を阻害するア
ミノ酸置換の使用は、一般的な分子生物学技術により、容易に行われる。本特許
出願の他の項で記載されるような、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＥＳ由来心筋細胞増殖アッ
セイ及びトランスジェニックマウスにおける標的化心臓発現は、修飾ｐ１９３構
築物を性質決定する必須の実験終点を提供する。

【００７５】 ｐ１９３ｄｎがドミナントネガティブ活性をコードすることをさらに確認する
ため、我々は、これが、メタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ）での処理に反応した
アポトーシスを遮断する能力を試験した。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞に、ＣＭＶ−ヌル
発現構築物、又はＣＭＶ−ｐ１９３ｄｎ発現構築物をトランスフェクションし、
そして安定細胞株を生成した。その後、細胞を、ＭＭＳ（０ｍＭ、０．１ｍＭ、
０．５ｍＭ又は１ｍＭ）を補った増殖培地中で、３７℃で３時間、インキュベー
ションした。その後、細胞を採取し、そしてＤＮＡ断片化の度合いを決定するこ
とにより、アポトーシスを測定した（ＤＮＡのヌクレオソーム切断はアポトーシ
スの診断法である）。１ｍＭ ＭＭＳの存在下で培養したＣＭＶ−ヌル対照細胞
から調製したＤＮＡに、はなはだしい断片化が明らかであり；対照的に、１ｍＭ
ＭＭＳ処理後のＣＭＶ−ｐ１９３ｄｎ細胞から調製したＤＮＡには、ＤＮＡ断
片化はまったく見られなかった（図８Ｃを参照されたい）。これらのデータは、
ｐ１９３ｄｎ構築物が、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞において、ＭＭＳ誘導アポトーシス
を遮断することを示し、そしてこの変異体がドミナントネガティブ活性をコード
するという知見を支持する。

【００７６】 実施例５ 心臓において、ｐ１９３ｄｎを発現するトランスジェニックマウスの生成 心臓に対するｐ１９３ｄｎの潜在的な心臓保護効果を調べるため、トランスジ
ェニックマウスを生成した。心臓発現は、α−心臓ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロ
モーターを用いて標的化した。ＭＨＣプロモーターは、５’隣接配列４．５ ｋ
ｂ及びエクソン１から３までを含むが、開始コドンを含まない遺伝子１ ｋｂか
らなった（Ｇｕｌｉｃｋ， Ｊ．， Ａ． Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ， Ｊ．
Ｎｅｕｍａｎｎ及びＪ． Ｒｏｂｂｉｎｓ（１９９１）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａ
ｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｃａｒ
ｄｉａｃ ｍｙｏｓｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｇｅｎｅｓ． Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６６：９１８０−
９１８５）。ｐ１９３ｄｎをコードするｃＤＮＡを、該プロモーターの下流に挿
入し、これにＳＶ４０初期領域転写ターミネーターが続いた（ＳＶ４０ヌクレオ
チド残基＃２５８６−２４５２、Ｒｅｄｄｙ， Ｖ．Ｂ．， Ｂ． Ｔｈｉｍｍ
ａｐｐａｙａ， Ｒ． Ｄｈａｒ， Ｋ．Ｎ． Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ， Ｂ
．Ｓ． Ｚａｉｎ， Ｊ． Ｐａｎ， Ｐ．Ｋ． Ｇｈｏｓｈ， Ｍ．Ｌ． Ｃ
ｅｌｍａ及びＳ．Ｍ． Ｗｅｉｓｓｍａｎ（１９７８）Ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ
ｏｆ ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００：４９４−
５０２を参照されたい）。生じた導入遺伝子はＭＨＣ−ｐ１９３ｄｎと名づけた
。導入遺伝子の概略図は、図９に示される。トランスジェニックマウスを生成す
るため、導入遺伝子ＤＮＡを、制限酵素で消化し、ＭＨＣ−ｐ１９３配列をベク
ターから分離し、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎガラスビーズ（Ｂｉｏ １０１、カ
リフォルニア州ビスタ）を用いてアガロースゲルから挿入物を精製した。精製挿
入物を、標準的方法論［３］を用いて、近交系Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪ（Ｊａｃｋｓ
ｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、マサチューセッツ州バーハーバー）接合体に
マイクロインジェクションした。マイクロインジェクションした胚は、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏで二細胞期まで培養し、そしてその後、偽妊娠ＳＷ／Ｔａｃｏｎｉｃ（
Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ、ニューヨーク州ジャーマンタウン）メスマウスに
移植した。すべての手術のため、マウスは、２．５％ アバーチン（０．０１５
ｍｌ／ｇ体重ＩＰ、Ｆｌｕｋａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ニューヨーク州
ロンコムコーマ）で麻酔した。すべての操作は、ＮＩＨ及び施設動物保護及び使
用指針（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓ
ｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）にしたがって行った。

【００７７】 マイクロインジェクションした胚から得られた子を、記載されるような診断Ｐ
ＣＲ増幅を用いて、導入遺伝子の存在に関してスクリーニングした（Ｓｔｅｉｎ
ｈｅｌｐｅｒ， Ｍ．Ｅ．， Ｋ．Ｌ． Ｃｏｃｈｒａｎｅ及びＬ．Ｊ． Ｆｉ
ｅｌｄ（１９９０）Ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍ
ｉｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｔｒｉａｌ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｆａ
ｃｔｏｒ ｆｕｓｉｏｎ ｇｅｎｅｓ． Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ １６：３
０１−３０７）。ＭＨＣ−ｐ１９３ｄｎ構築物でマイクロインジェクションした
胚から、１３の導入遺伝子初代（ｆｏｕｎｄｅｒ）動物を得た。初代動物のうち
７匹を無作為に選択し、トランスジェニック系列を確立した。Ｆ１トランスジェ
ニック動物から調製した成体心臓ＲＮＡを用い、異なる系統間で、ｐ１９３ｄｎ
発現レベルを階層化した。系統のすべて（ＭＨＣ−ｐ１９３ｄｎ系統４、５、６
、７、９、１０及び１３と称される。図１０を参照されたい）で、高レベルのｐ
１９３ｄｎ転写物が観察された：これらの解析に基づき、さらなる実験のため、
系列１３を選択した。

【００７８】 実施例６ ｐ１９３ｄｎの発現がｉｎ ｖｉｖｏで心臓保護性であることの立証 慢性イソプロテレノール注入に反応した心筋損傷を、対照及びＭＨＣ−ｐ１９
３ｄｎトランスジェニックマウスで監視し、導入遺伝子発現が心臓保護性である
かどうか決定した。非トランスジェニック対照及びＭＨＣ−ｐ１９３ｄｎトラン
スジェニックマウスを同定し、そして１１週齢になるまで隔離した。０．０２８
ｇ／ｍｌ イソプロテレノールを充填した移植浸透圧ミニポンプ（モデル２０
０１、Ａｌｚｅｔ、カリフォルニア州パロアルト、流速１μｌ／時間）を用い、
連続イソプロテレノール注入を投与した。処置７日後、マウスを屠殺し、心臓を
採取し、凍結保護し、そして標準的組織学的技術（Ｂｕｌｌｏｃｋ， Ｇ．Ｒ．
及びＰ． Ｐｅｔｒｕｓｚ（１９８２）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｉｍｍｕ
ｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ロンド
ン； ニューヨーク）を用い、切片作成した。その後、心臓切片を、シリウスレ
ッド（コラーゲンと反応し、提示される画像中に暗いシグナルを産生する）で染
色し、そしてファーストグリーン（筋細胞と反応し、提示される画像中に明るい
シグナルを産生する）で対比染色した。結果を図１１に示す。パネルＡ及びＢは
、イソプロテレノール注入７日後の非トランスジェニック心臓の切片を示す。心
室心筋中に豊富なシリウスレッド染色が明らかである（パネルＡは、心臓の尖部
近傍の左心室心筋を示し、パネルＢは心臓の基部近傍の心室心筋を示す）。暗い
染色は、イソプロテレノール誘導心筋細胞死から生じるはなはだしい線維症を示
す。パネルＣ及びＤは、イソプロテレノール注入７日後のＭＨＣ−１９３ｄｎト
ランスジェニック心臓の同様の解析を示す。本質的に、いかなる暗い染色も検出
されず、イソプロテレノール処置トランスジェニック心臓に、線維症が存在しな
いことが示される。この結果は、ｐ１９３ｄｎ導入遺伝子の発現が、イソプロテ
レノール誘導線維症から心筋を保護することを示す。他の研究（Ｃｏｍｍｕｎａ
ｌ Ｃ； Ｓｉｎｇｈ Ｋ； Ｐｉｍｅｎｔｅｌ ＤＲ； Ｃｏｌｕｃｃｉ Ｗ
Ｓ（１９９８）Ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ａｐｏ
ｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｒａｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｍｙｏｃ
ｙｔｅｓ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｅｔａ−ａｄｒｅｎ
ｅｒｇｉｃ ｐａｔｈｗａｙ， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２９：９８（１３）
：１３２９−３４）は、イソプロテレノール処置が、心筋細胞アポトーシスを誘
導することを示している：したがって、ｐ１９３ｄｎ発現は、心筋細胞アポトー
シス及びそれに続く線維症を遮断する。

【００７９】 実施例７ ｐ１９３ｄｎ及びｐ５３ｄｎの同時発現が、ＥＳ由来心筋細胞において、Ｅ１Ａ 誘導アポトーシスを遮断し、そして増殖を促進することの立証 以前の研究は、アデノウイルスＥ１Ａ腫瘍性タンパク質の発現が、心筋細胞に
おいて、細胞周期を再活性化するが、この再活性化の直後には、アポトーシス心
筋細胞死が続くことを示している（Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ， Ｌ．Ａ．及びＭ
．Ｄ． Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ． Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｅ１Ａ ｒｅｐｒｅｓ
ｓｅｓ ｃａｒｄｉａｃ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｒ
ｅａｃｔｉｖａｔｅｓ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｖｅｎｔｒｉｃｕ
ｌａｒ ｍｙｏｃｙｔｅｓ， ｖｉａ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｐｏｃｋｅｔ
ｐｒｏｔｅｉｎ−ａｎｄ ｐ３００−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ， Ｊ
． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９９５）２７０：７７９１−７７９４）。さら
に、ｐ５３に制御されるアポトーシス経路の遮断は、心筋細胞を部分的にしか救
出しない。したがって、ｐ１９３ｄｎ及びｐ５３ｄｎの同時発現が、Ｅ１Ａ誘導
心筋細胞アポトーシスを遮断することが可能であるかどうか決定する研究を使用
した。該実験は、先に記載された技術を利用し、分化しているＥＳ細胞から濃縮
された心筋細胞培養を生成した（Ｆｉｅｌｄらに対する米国特許第５，６０２，
３０１号及び第５，７３３，７２７号；及びＫｌｕｇ， Ｍ．Ｇ．， Ｍ．Ｈ．
Ｓｏｏｎｐａａ， Ｇ．Ｙ． Ｋｏｈ及びＬ．Ｊ． Ｆｉｅｌｄ（１９９６）
Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ
ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｅｍｂｒｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃ
ｅｌｌｓ ｆｏｒｍ ｓｔａｂｌｅ ｉｎｔｒａｃａｒｄｉａｃ ｇｒａｆｔｓ
， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ， ９８：２１６−２２４）。未分化ＥＳ
細胞に、ＭＨＣ−ｎｅｏｒ／ｐＧＫ−ｈｙｇｒｏｒ導入遺伝子を単独で、又はＭ
ＨＣ−Ｅ１Ａ、ＭＨＣ−ｐ１９３ｄｎ及び／又はＭＨＣ−ｐ５３ｄｎ導入遺伝子
と組み合わせて、トランスフェクションした。その後、トランスフェクションさ
れた未分化ＥＳ細胞を、ハイグロマイシン耐性に基づき、選択した。

【００８０】 ハイグロマイシン耐性クローンが十分に増幅されたら、培養を誘導し、分化さ
せた。心筋細胞が培養中に明らかになったら（通常、誘導後８日で起こる、拍動
細胞の存在により立証されるように）、培養をＧ４１８選択に供した。ｎｅｏｒ
カセットは、心臓ＭＨＣプロモーターの制御下にあるため、心筋細胞のみがこの
選択法で生き残る。Ｇ４１８選択６０日後、培養を固定し、そしてＰＡＳで染色
し、心筋細胞の視覚化を可能にした。

【００８１】 対照プレート（ＭＨＣ−ｎｅｏｒ／ｐＧＫ−ｈｙｇｒｏｒ導入遺伝子のみをト
ランスフェクションしたもの）は、拍動筋細胞の多数のコロニーを生じた（対照
プレート、図１２を参照されたい）。これは、陽性又は陰性因子の非存在下での
ＥＳ由来心筋細胞増殖の正常速度を示す。ｐ１９３ｄｎ及びｐ５３ｄｎのみをト
ランスフェクションした対照プレートもまた示す：これらの遺伝子の発現は、心
筋細胞収量のわずかな増加を生じ、その抗アポトーシス活性と一致する。対照的
に、ＭＨＣ−Ｅ１Ａ導入遺伝子をトランスフェクションしたプレートでは、非常
にわずかの心筋細胞しか観察されず、これは先の研究と一致する（Ｋｉｒｓｈｅ
ｎｂａｕｍ， Ｌ．Ａ．及びＭ．Ｄ． Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ． Ａｄｅｎｏｖｉ
ｒｕｓ ＥｌＡ ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ ｃａｒｄｉａｃ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓ
ｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｖａｔｅｓ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ ｉｎ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｍｙｏｃｙｔｅｓ， ｖｉａ ａｌｔｅ
ｒｎａｔｉｖｅ ｐｏｃｋｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−ａｎｄ ｐ３００−ｂｉｎｄ
ｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：７７９１
−７７９４， １９９５）。Ｅ１Ａ及びｐ５３ｄｎ又はＥ１Ａ及びｐ１９３ｄｎ
のコトランスフェクションは、心筋細胞生存度の顕著な増加を生じなかった。

【００８２】 これらの結果と非常に対照的に、ＭＨＣ−Ｅ１Ａ、ＭＨＣ−ｐ５３ｄｎ及びＭ
ＨＣ−ｐ１９３ｄｎのトランスフェクションは、心筋細胞の多くのそして実質的
により大きいコロニーを生じた。心筋細胞コロニーサイズは、対照プレートで観
察されるものより、はるかに大きかった。この結果は、ｐ５３ｄｎ及びｐ１９３
ｄｎの組み合わせ効果が、効率的にそして完全にＥ１Ａ誘導アポトーシスを遮断
することを示す。さらに、コロニーサイズの増加は、３つの導入遺伝子すべてを
発現するＥＳ由来心筋細胞の増進した増殖を示す。したがって、ｐ１９３ｄｎ及
びｐ５３ｄｎの同時発現は、Ｅ１Ａ誘導アポトーシスを遮断し、そしてそうする
ことにより、ＥＳ由来心筋細胞において、Ｅ１Ａ誘導細胞周期活性化を可能にす
る。

【００８３】 心筋細胞をさらに性質決定するため、図１２に示されるトランスフェクション
各々由来の代表的なプレートからタンパク質を調製した。その後、標準的プロト
コルを用い、タンパク質を、抗Ｅ１Ａ又は抗Ｔ−Ａｇ抗体でのウェスタンブロッ
ト解析に供した（図１３Ａ）。重要なことに、Ｅ１Ａ単独、又はＥ１Ａ＋ｐ５３
ｄｎ、又はＥ１Ａ＋ｐ１９３を発現する細胞において、Ｅ１Ａタンパク質はまっ
たく検出されなかった。対照的に、Ｅ１Ａ＋ｐ５３ｄｎ＋ｐ１９３ｄｎを発現す
る細胞において、豊富なレベルのＥ１Ａが検出された。これは、ｐ５３及びｐ１
９３経路が両方遮断されていない限り、心筋細胞において、Ｅ１Ａが致死的であ
ることを示唆する。さらに、これらのデータは、Ｅ１Ａ単独、又はＥ１Ａ＋ｐ５
３ｄｎ、又はＥ１Ａ＋ｐ１９３培養プレート上の心筋細胞が、おそらく、Ｅ１Ａ
構築物を取り込まない（又は別に、発現しない）子孫から生じるのであろうこと
を示す。該実験は、６０日齢培養に対して行った。

【００８４】 ｐ５３ｄｎ及びｐ１９３ｄｎ両方の同時発現の非存在下でのＥ１Ａ発現が、ア
ポトーシスを誘導することを確かめるため、１３日齢培養から調製したＤＮＡを
、ＤＮＡ断片化の度合いに関して解析した（ＤＮＡのヌクレオソーム切断は、ア
ポトーシスの診断法である）（図１３Ｂ）。Ｅ１Ａ単独、又はＥ１Ａ＋ｐ５３ｄ
ｎ、又はＥ１Ａ＋ｐ１９３を発現する細胞から調製したＤＮＡにおいて、はなは
だしい断片化が明らかである。対照的に、Ｅ１Ａ＋ｐ５３ｄｎ＋ｐ１９３ｄｎを
発現する細胞では、断片化はまったく観察されなかった。これらのデータは、ｐ
５３ｄｎ及びｐ１９３ｄｎの同時発現が、心筋細胞におけるＥ１Ａ誘導アポトー
シスを遮断することを確認する。

【００８５】 実施例８ ｐ１９３が細胞周期依存様式で発現されることの立証 多くの細胞周期制御タンパク質は、細胞周期の別個の相中に、発現され、そし
て／又は活性である。ｐ１９３の場合もそうであるかどうか決定するため、抗ｐ
１９３モノクローナル抗体を産生した。ｐ１９３アミノ酸残基１１５３−１６８
９をコードする組換えタンパク質を免疫原として用い、そして標準的アプローチ
を用いて、モノクローナル抗体を作成し、スクリーニングし、そして確認した。
細胞周期中のｐ１９３発現を監視するため、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、血清枯渇（
飢餓培地は、ＤＭＥＭ中に０．１％ ＦＢＳを含んだ）２周期により、同調させ
た。細胞同調を監視するため、いくらかの細胞を、ＤＭＥＭ中に３Ｈ−チミジン
（２６ Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国バッキンガムシャー）及び１
０％ ＦＢＳを含む培地中でインキュベーションし；その後、多様な時点で、細
胞をオートラジオグラフィーのためプロセシングし、ＤＮＡ合成を監視した。同
一チャンバースライド上の非トランスフェクション細胞の大部分は、血清補充１
４時間後までにＤＮＡ合成を再開し（図１４Ａ）、したがって、同調プロトコル
の忠実性が確かめられた。平行プレートから同様の時点で調製されたタンパク質
を、ウェスタンブロット解析に用いた（図１４Ｂ）。血清添加２、４、又は６時
間後には、ｐ１９３発現はまったく検出されなかった。血清添加８、１０及び１
２時間後に顕著なｐ１９３発現が検出され、これは、おおよそＤＮＡ合成の開始
と同時に生じていた。ｐ１９３のレベルは、続く時点で顕著に減少した。これら
のデータは、ｐ１９３発現が細胞周期進行中、緊密に制御されており、そしてピ
ークレベルは、Ｇ１／Ｓ境界で発生することを示す。興味深いことに、これは、
ｐ１９３の強いられた発現がアポトーシスを誘導する細胞周期の時点と正確に同
時点であり、そしてこれはまた、Ｔ−Ａｇが細胞質に局在する細胞周期の時点で
もある。

【００８６】 実施例９ ｐ１９３及びｐ５３活性の遮断が、肥大性刺激への増殖反応を生じる可能性があ ることを示唆するデータ 心臓損傷の多くの型は、機能する筋細胞の損失を代償する、肥大性増殖の最初
の局面を生じる。時間に渡り、肥大心臓は、代償不全になる可能性があり、この
過程は、心臓拡張及び最終的には心不全につながる。心筋細胞アポトーシスは、
しばしば、この過程中に観察される。通常、細胞増殖と関連する多数の遺伝子産
物が心臓肥大中に誘導されることもまた、よく確かめられている（例えばＩｚｕ
ｍｏ， Ｓ．ら Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８
５， ３３９−３４３； Ｍｕｌｖａｇｈ， Ｓ．Ｌ．ら， Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １４７， ６２７−６３６；
Ｓｉｍｐｓｏｎ， Ｐ．Ｃ． Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｓ
ｉｏｌｏｇｙ， ５１， １８９−２０２を参照されたい）。肥大刺激が実際、
分裂促進刺激であり、そして成熟心筋細胞において、こうした刺激に対する反応
が、まず、細胞サイズを増加させ、そしてその後、Ｇ１／Ｓを通過することであ
る可能性がある。我々のデータは、明らかに、２つのプロアポトーシス経路（ｐ
５３及びｐ１９３経路）が、実験的に増殖するよう誘導されている心筋細胞で活
性化されていることを示す。代償不全過程中に観察されるアポトーシス反応は、
活性ｐ５３及びｐ１９３経路の存在下での細胞周期活動の開始から生じる可能性
がある。

【００８７】 それならば、ｐ１９３及びｐ５３経路が遮断されていれば、肥大刺激が直接細
胞周期活動を生じる可能性があるということになる。これを試験するため、未分
化ＥＳ細胞に、ＭＨＣ−ｎｅｏｒ／ｐＧＫ−ｈｙｇｒｏｒ導入遺伝子を、ＭＨＣ
−ｐ１９３ｄｎ及びＭＨＣ−ｐ５３ｄｎ両方と組み合わせて、トランスフェクシ
ョンした。トランスフェクション細胞は、ハイグロマイシンへの耐性により濃縮
され、そしてその後、分化するよう誘導された。その後、ＥＳ由来心筋細胞は、
Ｇ４１８への耐性により濃縮された。その後、これらの培養において、心筋細胞
増殖を、５８日間の外因性イソプロテレノール（１μＭ ｍｇ／ｍｌ）存在下対
非存在下で比較した。顕著に増進された心筋細胞コロニーサイズは、イソプロテ
レノール処理培養において、明らかであり、これは、増加した細胞数の存在と一
致した（図１６を参照されたい）。これは、細胞周期アポトーシスチェックポイ
ントの弛緩が、そうでなければ肥大性刺激であろう刺激に対し、心筋細胞を増殖
性にすることを示唆する。

【００８８】 本発明は、図及び先行する説明に詳細に例示され、そして記載されたが、これ
は例示とみなすべきであり、そして性質上、制限するものとみなすべきでなく、
好ましい態様のみが示され、そして記載されており、そして本発明の精神の範囲
内にある改変及び修飾はすべて、保護されることが望ましいことが理解されるべ
きである。

【００８９】 本明細書に引用されるすべての刊行物は、当該技術分野の技術レベルを示し、
そして各々が個々に援用され、そして完全に示されているかのように、本明細書
に援用される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１。（ａ）抗Ｔ−ＡＧ又は抗Ｐ５３モノクローナル抗体を用いて産生した、
代謝標識ＡＴ−２心筋細胞由来の免疫複合体。ｐ１９３は、³⁵Ｓ−メチオニン標
識したＡＴ−２心筋細胞由来の抗Ｔ−ＡＧ（レーン３）及び抗ｐ５３（レーン２
及び６）に存在するが、ＩｇＧサブタイプに適合した非特異的な対照抗体で調製
した免疫複合体（レーン１及び５）や、一次抗体を欠く対照（レーン４）には存
在しない。分子量標品を左端に示す。（ｂ）ｐ１９３トリプシン分解ペプチドの
ＰＳＤ ＭＡＬＤＩ質量スペクトルと配列。検出されたｂ及びｙイオンとアンモ
ニウムイオンが示される。（ｃ）ｐ１９３タンパク質及びｃＤＮＡの概略図。い
くつかの構造モチーフの位置が示される。水平の実線はｃＤＮＡクローンの相対
位置を示す。

【図２】 図２。（ａ）ｐ１９３の推定アミノ酸配列。下線を施した配列はＰＳＤ質量分
析法により同定されたペプチドに対応する。太字の配列はＢＨ３ドメイン相同性
に対応する。（ｂ）ｐ１９３のＢＨ３ドメインといくつかの他のアポトーシス調
節タンパク質との比較。

【図３】 図３。（ａ）ｐ１９３はＮＩＨ−３Ｔ３細胞においてＴ−Ａｇへ結合する。（
ｃ−末端ｍｙｃエピトープ・タグを保留するｐ１９３タンパク質をコードする）
ＣＭＶ−ｐ１９３ｍｙｃ及び（ＳＶ４０ Ｔ−Ａｇをコードする）ＣＭＶ−Ｔ−
Ａｇで同時トランスフェクトされた細胞から調製されるタンパク質を指定の抗体
と反応させ、生成した免疫複合体を、抗ｍｙｃ及び抗Ｔ−Ａｇ抗体を使用するウ
ェスタンブロッティングにより分析した。Ｔｆｘ トランスフェクション；Ｔｏ
ｔ．Ｐｒｏ． 全タンパク質；ＩＰ 免疫沈降。（ｂ）in vitro 翻訳されたｐ
１９３は組換えＴ−Ａｇへ結合する。放射標識した in vitro 翻訳ｐ１９３を組
換えＴ−Ａｇと混合し、次いで指定の抗体と反応させた。生成した免疫複合体を
ポリアクリルアミドゲル上で展開し、ナイロン膜へ移した。オートラジオグラフ
ィーによりｐ１９３を視覚化し、Ｔ−Ａｇをウェスタンブロットにより視覚化し
た。（ｃ）成体マウスにおけるｐ１９３発現のノーザンブロット分析。指定の組
織から調製した全ＲＮＡ（１０マイクログラム）を完全長のｐ１９３ ｃＤＮＡ
でプローブした。ノーザンブロット物をメチレンブルーで染色することによって
ＲＮＡサンプルの完全性を確認した（下のパネル）。

【図４】 図４。ｐ１９３はＴ−ＡｇのＮ末端へ結合する。この概略図はマッピング実験
において使用されるＴ−Ａｇ構築体を示す。これらの産物を in vitro で翻訳し
、in vitro 翻訳された完全長のｐ１９３と混合した。抗Ｔ−Ａｇ抗体のＰＡｂ
４１９で産生した免疫複合体をポリアクリルアミドゲル上で分割し、オートラジ
オグラフィーにより視覚化した。構築体１−９２ｍｙｃは、Ｃ末端でｍｙｃエピ
トープ・タグをコードした。

【図５】 図５。ｐ１９３はアポトーシスを促進する。（ａ）トランスフェクション後４
０時間でのＮＩＨ−３Ｔ３細胞発現ＣＭＶ−βＧＡＬｍｙｃについてのＤＮＡ含
量分布。（ｂ）トランスフェクション後４０時間でのＣＭＶ−ｐ１９３ｍｙｃを
発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞についてのＤＮＡ含量分布。（ｃ）ＣＭＶ−ｐ１９
３ｍｙｃでトランスフェクトしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞の同調培養物における細胞
死及びＤＮＡ合成の経時変化。ＣＭＶ−ｐ１９３ｍｙｃ発現細胞の生存率（％）
（□）、ＣＭＶ−ｐ１９３ｍｙｃでトランスフェクトされた細胞のチミジン標識
インデックス（○）、及び同一チャンバースライドにある、トランスフェクトし
なかったＮＩＨ−３Ｔ３細胞についてのチミジン標識インデックス（◇）を示す
。（ｄ及びｅ）血清補充後、それぞれ８及び１４時間でのＮＩＨ−３Ｔ３細胞に
おけるｐ１９３ｍｙｃ免疫の局在性（シグナルは抗ｍｙｃエピトープ・タグの免
疫反応性に対応する）（ｆ）Ｂｃｌ−Ｘ_L又はＴ−Ａｇの同時発現はｐ１９３誘
導アポトーシスに拮抗する。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を指定の通りにトランスフェク
トした；トランスフェクション後６８時間でのｐ１９３陽性細胞の全数を示す。
（ｐ１９３ ＢＨ３ドメインを網羅する欠損部分を保留する）ｐ１９３デルタＢ
Ｈでトランスフェクトした細胞が生きていることも注目すること。

【図６】 図６。（ａ及びｂ）ｐ１９３ｍｙｃ（パネルａ、シグナルは抗ｐ１９３ｍｙｃ
の免疫反応性に対応する）及びＴ−Ａｇ（パネルｂ、シグナルは抗Ｔ−Ａｇの免
疫反応性に対応する）は、ＣＭＶ−ｐ１９３ｍｙｃとＣＭＶ−Ｔ−Ａｇを同時発
現する細胞の細胞質において封鎖される。（ｃ）細胞質のＴ−Ａｇ免疫反応性を
有するチミジン陽性細胞の比率を（パルスチェイス実験により決定されるような
）Ｓ期後の時間数に対してプロットする。（ｄ及びｅ）それぞれ、（パネルｃに
おける１０時間のパルスチェイス時点からの）細胞質分裂後の２種の³Ｈ−チミ
ジン陽性娘細胞に関するオートラジオグラフィー分析と抗Ｔ−Ａｇ免疫細胞学的
分析。

【図７】 図７。（Ａ）センス（ＣＭＶ−ｐ１９３ｓ）とアンチセンス（ＣＭＶ−ｐ１９
３ａｓ）の方向においてｐ１９３をコードする発現構築体を用いたＮＩＨ−３Ｔ
３コロニー増殖アッセイ。インサートを欠く発現ベクター（ＣＭＶ−ｎｕｌｌ）
を対照として使用した。（Ｂ）ＣＭＶ−ｎｕｌｌベクターを発現する細胞、ＣＭ
Ｖ−ｐ１９３ａｓベクターを発現する細胞、又はトランスフェクトしなかったＮ
ＩＨ−３Ｔ３細胞からのＲＴ−ＰＣＲ分析。

【図８】 図８。（Ａ）実施例４に記載のような、ネスティドｐ１９３Ｃ末端トランケー
ションを有するＣＭＶ発現ベクターの構造。（Ｂ）実施例４に記載のような、図
８Ａの発現構築体を使用するコロニー増殖アッセイ。（Ｃ）実施例４に記載のよ
うに、ｐ１９３ｄｎがＭＭＳ誘導アポトーシスを阻止するドミナントネガティブ
活性をコードすることを確かめるＤＮＡ切断試験。

【図９】 図９。実施例５にさらに記載のように、トランスジェニックマウスを産生する
ために使用されるＭＨＣ−ｐ１９３ｄｎトランス遺伝子の概略図。

【図１０】 図１０。実施例５にさらに記載のように、４、５、６、７、９、１０及び１３
と呼称したＭＨＣ−ｐ１９３ｄｎトランスジェニックマウス系統におけるトラン
ス遺伝子発現のノーザンブロット。

【図１１】 図１１。実施例６に記載のようにして得られる、対照とＭＨＣ−ｐ１９３ｄｎ
トランスジェニックマウスにおける、イソプロテレノール注入に反応した心筋障
害を示す心臓の切断面。（コラーゲンと反応して暗シグナルを産生する）シリウ
スレッドで切断面を染色し、（心筋細胞と反応して明シグナルを産生する）ファ
ストグリーンで対比染色した。

【図１２】 図１２。実施例７にさらに記載のように、ｐ５３ｄｎ、ｐ１９３ｄｎ、及びＥ
１Ａ遺伝子発現の単独、又は組み合わせた効果を示す、ＥＳ細胞誘導心筋細胞の
コロニー増殖アッセイ。

【図１３】 図１３。（Ａ）図１２に示したＥＳ細胞誘導心筋細胞のコロニー増殖アッセイ
から調製したタンパク質の、抗ＥＩＡ又は抗Ｔ−Ａｇ抗体を用いたウェスタンブ
ロットアッセイ；（Ｂ）ｐ１３ｄｎとｐ１９３ｄｎの両方の同時発現がないＥ１
Ａ発現がアポトーシスを誘導したことを示すＤＮＡ切断実験（実施例７を参照の
こと）。

【図１４】 図１４。ｐ１９３は細胞周期のＧ₁／Ｓにおいて発現される（実施例８参照）
。（Ａ）ＮＩＨ−３Ｔ３培養試験が十分同調していたことを示す、トリチウム化
チミジン陽性細胞の比率（％）の経時的プロット。（Ｂ）実施例８に記載のよう
に、同じ時期におけるｐ１９３発現のウェスタンブロット。ウェスタン分析は、
ｐ１９３がＧ₁／Ｓの間に発現されることを示す。

【図１５】 図１５。実施例９に記載のように、１９３ｄｎ及びｐ５３ｄｎを同時発現する
心筋細胞の増殖をイソプロテレノールが誘導することを示すコロニー増殖アッセ
イ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １０７ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｐ 1/16 Ｃ１２Ｎ 5/10 9/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 11/00 // Ａ６１Ｐ 1/16 25/00 9/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 11/00 5/00 Ｂ 25/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ツアイ，シン−チュォン アメリカ合衆国インディアナ州46202，イ ンディアナポリス，ブラク・ストリート 838，アパートメント エル Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA03 DA02 EA04 GA12 HA01 4B064 AG01 AG27 CA01 CA19 CC24 DA01 4B065 AA90Y AA91X AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA13 BA44 ZA36 ZA51 ZA59 ZA75 ZB21 ZB22 4C086 AA01 AA02 EA16 NA14 ZA51 ZA59 ZA75 ZB21 ZB22 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA41 EA20 FA74

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細胞の細胞周期を修飾する方法であって、細胞内のｐ１９３タンパク質のレベ
   ルを修飾する、及び／又は、細胞内のｐ１９３シグナル伝達経路と干渉する、こ
   とを含む前記方法。
2. 【請求項２】 細胞内のアポトーシスを抑制する、及び／又は、細胞の増殖性潜在力を増加さ
   せるために、細胞内のプロアポトーシスｐ１９３タンパク質のレベルを減少させ
   ることを含む、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 細胞内にアポトーシスを誘導するために、細胞内のプロアポトーシスｐ１９３
   タンパク質のレベルを増加させることを含む、請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 細胞が哺乳動物細胞である、請求項１−３のいずれか１項に記載の方法。
5. 【請求項５】 細胞がヒト細胞である、請求項４の方法。
6. 【請求項６】 細胞内のｐ１９３タンパク質活性のレベルを減少させるために、ｐ１９３タン
   パク質の部分又は全体をコードする核酸を、細胞内にアンチセンスの方向で導入
   することを含む、請求項２に記載の方法。
7. 【請求項７】 細胞のアポトーシスを抑制する、及び／又は、細胞の増殖性潜在力を増加させ
   るために、ドミナントネガティブなｐ１９３タンパク質をコードする核酸を細胞
   に導入することを含む、請求項１に記載の方法。
8. 【請求項８】 プロアポトーシスｐ１９３タンパク質を発現させ、細胞内にアポトーシスを誘
   導するために、プロアポトーシスｐ１９３タンパク質をコードする核酸を細胞内
   に導入することを含む、請求項３に記載の方法。
9. 【請求項９】 細胞内のｐ５３タンパク質のレベルを修飾する、及び／又は、細胞内のｐ５３
   シグナル伝達経路と干渉することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
10. 【請求項１０】 細胞内のＥ１Ａタンパク質のレベルを修飾することをさらに含む、請求項１又
    は９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 ｐ１９３タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクター。
12. 【請求項１２】 前記核酸がアンチセンス方向である、請求項１１に記載の発現ベクター。
13. 【請求項１３】 前記ｐ１９３タンパク質がプロアポトーシスｐ１９３タンパク質である、請求
    項１１に記載の発現ベクター。
14. 【請求項１４】 前記ｐ１９３タンパク質がドミナントネガティブな突然変異を含む、請求項１
    １に記載の発現ベクター。
15. 【請求項１５】 ｐ１９３タンパク質をコードする、導入された核酸を含む宿主細胞。
16. 【請求項１６】 前記核酸が、プロアポトーシスｐ１９３タンパク質をコードする、請求項１５
    に記載の宿主細胞。
17. 【請求項１７】 前記核酸が、ドミナントネガティブな突然変異を含むｐ１９３タンパク質をコ
    ードする、請求項１５に記載の宿主細胞。
18. 【請求項１８】 単離されたｐ１９３タンパク質。
19. 【請求項１９】 配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載
    の単離されたｐ１９３タンパク質。
20. 【請求項２０】 請求項１８若しくは請求項１９に記載の単離されたｐ１９３タンパク質、及び
    担体を含む組成物。
21. 【請求項２１】 細胞内にアポトーシスを誘導する方法であって、前記細胞内においてアポトー
    シスを誘導するのに有効な量のプロアポトーシスｐ１９３タンパク質を、前記細
    胞内に発現させることを含む、前記方法。
22. 【請求項２２】 前記細胞が、不適切に増殖性の細胞である、請求項２１に記載の方法。
23. 【請求項２３】 配列番号２若しくは配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号２若しくは配
    列番号４のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一性を有するアミノ酸配列、を
    コードする核酸配列を含む、発現ベクター。
24. 【請求項２４】 配列番号２の残基１ないし１１５２若しくは配列番号４の残基１ないし１１７
    ３のアミノ酸配列、または配列番号２の残基１ないし１１５２若しくは配列番号
    ４の残基１ないし１１７３のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一性を有する
    アミノ酸配列、を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、発現ベクタ
    ー。
25. 【請求項２５】 前記ポリペプチドが、それが発現している細胞内のアポトーシスを抑制する、
    及び／又は、増殖を誘導する、請求項２４に記載の発現ベクター。
26. 【請求項２６】 配列番号１のヌクレオチド６２ないし５１２８、または配列番号３のヌクレオ
    チド８７ないし５１８３と少なくとも７０％同一性を有する核酸配列を含む、発
    現ベクター。
27. 【請求項２７】 配列番号１のヌクレオチド６２ないし３５１７、または配列番号４のヌクレオ
    チド８７ないし３６１５と少なくとも約７０％同一性を有する核酸配列を含む、
    発現ベクター。
28. 【請求項２８】 組換えタンパク質である、請求項１８に記載のタンパク質。
29. 【請求項２９】 配列番号２若しくは配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号２若しくは配
    列番号４のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一性を有するアミノ酸配列を有
    する、請求項２８の組換えタンパク質。
30. 【請求項３０】 配列番号２の残基１ないし１１５２若しくは配列番号４の残基１ないし１１７
    ３のアミノ酸配列、または配列番号２の残基１ないし１１５２若しくは配列番号
    ４の残基１ないし１１７３のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一性を有する
    アミノ酸配列を有する、請求項２８の組換えタンパク質。
31. 【請求項３１】 ｐ１９３タンパク質に対する抗体を含む、組成物。
32. 【請求項３２】 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項３１の組成物。
33. 【請求項３３】 前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項３１の組成物。
34. 【請求項３４】 ｐ１９３タンパク質をコードする導入されたＤＮＡを有する宿主細胞を、前記
    導入されたＤＮＡの発現に適当な条件下で培養する、ことを含む、ｐ１９３タン
    パク質を産生するための方法。
35. 【請求項３５】 アミノ酸配列： Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｕ を含むＢＨ３ドメインを含む、単離されたアポトーシス関連タンパク質。
36. 【請求項３６】 アミノ酸配列： Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｕ を含むＢＨ３ドメインを含む、単離されたアポトーシス関連タンパク質をコード
    する、単離された核酸分子。
37. 【請求項３７】 細胞の細胞周期への効果について剤をスクリーニングするための方法であって
    、ｐ１９３タンパク質をコードする導入された核酸を有する細胞を剤と接触させ
    、そして、細胞への剤の効果を評価する、ことを含む前記方法。
38. 【請求項３８】 導入された核酸が、プロアポトーシスｐ１９３タンパク質をコードする導入さ
    れたＤＮＡである、請求項３７の方法。
39. 【請求項３９】 導入されたＤＮＡが、配列番号２若しくは配列番号４のアミノ酸配列、または
    配列番号２若しくは配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一性を有
    するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、請求項３８の方法。
40. 【請求項４０】 導入されたＤＮＡが、配列番号２若しくは配列番号４のアミノ酸配列をコード
    する核酸配列を含む、請求項３９の方法。