JP2003511656A - 化学構築物 - Google Patents

化学構築物

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ケイ，コリン
パイオ，アルフレッド
ウイリアムズ，ジャッフリー，マーチン
ザラメラ，アレッシオ
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Abstract

(57)【要約】 連結基Yを介して基質Rが連結されている固体支持体Qを含む、固相合成で使用するための化学構築物であって；ここで連結基Yは垂直且つ選択的に開裂可能な第１開裂部位および第２開裂部位を有し；第２開裂部位は選択的に開裂されて基質を遊離することが可能であり；そして第１の開裂部位は第２開裂部位と固体支持体との間に配置されており、且つ選択的に開裂されて基質および連結基Yの少なくとも一部分を含む断片Fruを遊離することが可能であり、連結基Yの該部分は紫外線、可視または蛍光分光測光法による断片Fruの分析を容易にする発色団Cuを含んでおり、発色団Cuの主対数Emax値は少なくとも2.5であり、(i) 発色団Cuの主対数Emax値は基質Rの主対数Emaxよりも少なくとも1.5倍大きいか、または(ii) 発色団Cuの吸収ピークは基質Rに帰属する吸収から遠隔の波長にある、化学構築物。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は、固相合成に利用するための化学構築物、および該構築物を利用した
固相合成の生成物を分析する方法に関する。
【０００２】発明の背景 固相合成は長年に亘りペプチド合成の分野で知られており、最近は非ペプチド
の合成にも次第に利用されるようになっている。
【０００３】 固相合成は、コンビナトリアルケミストリーおよび薬剤発見のための新規リー
ド化合物の可能性のあるソースとしての化学ライブラリーの調製の分野において
特に応用できることが、例えば、Anthony W. Czarnic、Analytical Chemistry N
ews and Features、1998年6月1日、pp.378A-386A、および、The Combinatorial
Index、Barry A. Bunin、Academic Press、San Diego 1998において見出されて
いる。コンビナトリアルケミストリー法の特長は、非常に多数の様々な化合物を
、比較的少数の分子ビルディングブロックから比較的少ない数の反応によって製
造できる点である。コンビナトリアルケミストリーは、固体支持体に連結された
出発化学原料の懸濁液をN個の部分に分配し、各々を異なる試薬と反応させる「
スプリットアンドプール」法を利用するものである。N個の反応の生成物をその
後プールし、完全に混合し、得られたプールをN’個の部分に分配し、再び各々
を異なる試薬と反応させる。この手順を一連の反応のステップの数だけ繰り返す
。こうして一連の反応が３段階である場合は、反応混合液を各ステージで１０個
の部分に分割し、各プールを他の部分と合わせる前に異なる試薬と反応させる場
合、該工程により得られる化合物の総数は103 = 1000となる。このように、スプ
リットアンドプール技術を利用することで、多数の異なる分子を最低限の数（上
記の場合は３０）の反応により合成できることがわかる。
【０００４】 各固体支持体（例えば樹脂ビーズ）は連結された単一の生成物分子を有してお
り、したがって原則として、反応生成物の各々を分離して分析することができ、
または単一の固体支持体を単離して支持体から反応生成物を開裂する簡単な方法
で生物学的試験に供することができる。しかしながら、コンビナトリアル法では
多数の化合物が生成されるので、各化合物を同定し特性分析することが事実上困
難な場合があり得る。従って、通常は化合物を、固体支持体上においてまたは支
持体から開裂させた後に、先ず試験し、つぎに生物学的活性を示す化合物のみを
同定する。生物学的試験を行う数を最少化するために、化合物を、所定数の化合
物を含むプール中で試験し、活性の無いプールは廃棄して活性の有るプールは更
に調査する。化合物の生物学的活性は、多数の化合物を短時間で分析することが
できる高スループット自動化アッセイ技術を用いて分析できる。
【０００５】 固相構築物に取り組む化学者が直面する問題の一つが、コンビナトアルライブ
ラリー中の多種の化合物の同定および特性分析の方法である。なぜならば、各化
合物は各化合物は該ライブラリー中に非常に少量しか含まれておらず、通常は、
一定の固体支持体上には生物学的試験と化合物の同定との両方を行うには不十分
な量の化合物しか存在しないためである。コンビナトアルライブラリーの合成に
利用する樹脂ビーズは、典型的には架橋ポリスチレン樹脂に由来するものであり
、通常は直径が90μｍおよび250μｍの(すなわち裸眼でかろうじて見える)オー
ダーのものである。一定の量または体積中の樹脂ビーズの数は平均ビーズサイズ
に依存するが、例えば、ビーズサイズが直径150μｍのとき、樹脂の重量1ミリグ
ラムあたり約500個のビーズが存在する。ビーズ上での化合物の典型的な添加量
は0.1〜0.4 mmol・g-1のオーダーであるため、上記の大きさのビーズは、ビーズ
一個あたりの各化合物の添加量が約１ナノモルである傾向がある。
【０００６】 コンビナトアルライブラリー中の化合物をどう同定するかという問題について
の既知のアプローチの一つは、各固体支持体に化合物の属性を決定することので
きるコーディングタグを付与することである。したがって、例えばコーディング
タグは固体支持体上で所望の標的化合物を構築するのと平行して連続的なステッ
プで組み入れることができる。コーディングタグは生成物化合物の合成の履歴を
反映しており、各生成物化合物に独自のものである。コーディングタグは通常は
、生成物化合物の構築に用いられる化学反応と垂直な(orthogonal)タイプの化学
反応を利用して支持体上で構築される。それにより、コーディングユニットと生
成物化合物とを取り違えることの無いようにしている。生成物化合物を試験し、
その生成物化合物を確認したら、その後にコーディングタグを外して化合物の同
定を可能にする。
【０００７】 その他のアプローチでは、Geysenら、Chemistry & Bioligy、1996、Vol.3, No
.8、pp 679-688、およびWO 97/37953に記載されているように、同位体標識など
のコーディングタグを、とりわけ固体支持体と基質との間のリンカー基に組込む
ことができる。このアプローチの利点は、垂直な化学反応を利用して別個のコー
ディングタグを形成する必要が無く、そのため関わる合成ステップの総数を減ら
すことができる点である。
【０００８】 固相合成を行う化学者が直面する他の問題は、ある一連の反応の生成物を定量
することが困難なことである。どの固相合成の手順においても、コンビナトリア
ル手順の一部であってもそうでなくても、一連のステップのうちの一のステップ
にとって最適な条件を決定することができることは重要である。また、反応をモ
ニターできることも重要である。それにより、例えば特定のある反応が完結した
かどうかを見極めることが可能になる。このことは、完結に至るまでのあるステ
ージでの失敗が副生成物の生成につながる可能性が有り、そのために本来は比較
的簡単なはずの分離の手順が複雑になってしまう多段階の固相合成において特に
重要である。複数の生成物が、ある反応ステップまたは一連のステップで形成さ
れた場合、または、ある反応ステップが完結しなかった場合、反応生成物を、絶
対的にまたは他の反応生成物に対する相対的な濃度で定量する方法があることは
非常に有用である。生成物がミリグラムの量で生成された場合は、各種の器具に
よる手法を用いて定量が可能である。例えば、核磁気共鳴（NMR）スペクトル観
測である。しかし、分析に利用できる生成物の量が1ナノモルほどで少ない場合
には、定量ははるかに困難である。
【０００９】 破壊的および非破壊的分析法の両者が固相合成の生成物を分析するのに知られ
ている(The Combinatorial Index, 前述)が、固相合成に関して認識されている
問題点の一つが、反応をモニターすることが、従来の溶液相反応をモニターする
ことよりも一般的に困難である点である（例えば、上述のCzarnikの例を参照）
。この問題点は、迅速な高スループット技術を用いてそのような方法により生成
する多数の化合物を分析する必要のあるコンビナトリアルケミストリー法の生成
物に関して特にあてはまる。質量分析などの技法は、潜在的には、高スループッ
ト分析を実現する手段として理想的に好適なものである。しかし、実質的な問題
は、全ての化合物が質量分析の条件において応答が保証されるわけではない点で
ある。実際に多くの化合物が、分子の断片化をそれほど引き起こさずに分子イオ
ンを検出することを目的とするマトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)
およびエレクトロスプレー質量分析などのいわゆる「ソフトな」質量分析の方法
では、「見ることができない」。本明細書においては、「ソフトな」という用語
は、分子イオンを与え断片をほとんど与えない質量分析の方法を意味する。この
理由の一つは、MALDIおよびエレクトロスプレーの条件下では、多くの化合物、
特にペプチドは、十分にイオン化せず、検出可能な質量スペクトルの応答を得る
ことができないことである。
【００１０】 Geysenら（前述）は、容易にイオン化できる塩基性の中心、例えばリシンをリ
ンカー基に導入することを提唱し、さらに塩基性の中心は、該構築物を質量分析
において検知可能にする荷電した残基を得る目的でワークアップの際にアルキル
化により四級化できることを提唱して、この問題の解決を目指した。しかしなが
ら、このアプローチの短所の一つは、種々の合成ステップにおいてアミン基の保
護が必要であり、分析の前に最終的な生成物のアミン基の脱保護が必要な点であ
る。
【００１１】 Geysenのアプローチの展開は、Carrascoら、Tetrahedron Letter、1997、38、
No. 36、pp6331-6334に開示されている。Carrascoの方法は、第１のリンカー基
を介して筆者らが「イオン化タグ」と呼ぶ残基に連結された樹脂ビーズを含む構
築物を形成すること含む。「イオン化タグ」はまた、第２のリンカー基を介して
基質に連結される。第１と第２のリンカー基は、垂直に(orthogonally)開裂でき
る。すなわち、それらは異なる化学反応を用いて選択的に開裂することができる
。Carrascoらにおいて開示される実施例中では、第１のリンカー基は光化学的に
開裂でき、一方で第２のリンカー基は化学的に開裂できる。Carrascoが用いた「
イオン化タグ」は、テトラペプチド鎖であり、（C末端から読むと）Gly-Phe-Lys
-Ala、およびリシンに連結したN-(2-トリメチルアンモニウム)-アセチル基を有
する。イオン化タグの目的は２つある。第一に、該構築物に予めイオン化された
「検出可能化基」を付与することで、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(M
ALDI)質量分析により検出できるようにすることであり、第２に、該構築物の質
量を増すことで、基質分子が、質量スペクトル中で低分子量のピークにより打ち
消されることなく、またはマスクされることなく検出できるようにすることであ
る。
【００１２】 上述の説明の通り、固相合成、特にコンビナトリアル合成についての、または
比較的少量の生成物しか生じないその他の連続した反応についての更なる問題は
、反応の生成物を正確に定量することが、特に生成物の量が1ナノモルほどの少
量である場合に、困難であることに関するものである。質量分析は反応の生成物
を同定するには非常に適しているものの、生成物の絶対的な濃度を、または混合
物中の生成物の相対的な濃度を測定する手段としては一般には適していない。
【００１３】発明の概要 本発明の目的は、公知の方法に固有の問題を回避し且つ固相合成技術で得られ
た生成物を定量分析する手段を提供する、固相支持体上の化学反応をモニタリン
グする手段を提供することである。本発明の別の目的は、固相合成の生成物を、
分析に利用可能な生成物の量が１ナノモルと少ない場合に定量分析する手段を提
供することである。
【００１４】 したがって、本発明は、第１の態様では、固相構築物の分析方法であって、 (i) 連結基Yを介して基質Rが連結されている固体支持体Qを含む化学構築物を
用意するステップ；ここで連結基Yは垂直且つ選択的に開裂可能な第１開裂部位
および第２開裂部位を有し；第２開裂部位は選択的に開裂されて基質を遊離する
ことが可能であり；そして第１の開裂部位は第２開裂部位と固体支持体との間に
配置されており、且つ選択的に開裂されて基質および連結基Yの少なくとも一部
分を含む断片Fruを遊離することが可能であり、連結基Yの該部分は紫外線、可視
または蛍光分光光度法による断片Fruの分析を容易にする発色団Cuを含んでいる
； (ii) 連結基Yを第１開裂部位で開裂して断片Fruを遊離させるステップ；およ
び (iii) 断片Fruを紫外線、可視または蛍光分光光度分析に供して基質Rを定量す
るステップ、 を含む方法を提供する。
【００１５】 本発明の方法によれば、分光光度分析を用いることによって所与のサンプル中
の基質Rの絶対量を測定することができ、あるいはサンプル中の別の成分(例えば
２種以上の基質Rが存在する場合)に対する基質Rの相対量(例えばモル比に関して
)を測定することができる。基質Rの定量方法に関して、この用途では、特に指示
しない限り、絶対測定と相対測定の双方が含まれる。
【００１６】 基質R中の発色団によって分析が絶対に妨害されないようにするために、発色
団は、通常、該発色団と基質とを識別する実質的な吸収バンドを有するように選
択される。したがって、例えば、発色団の吸収バンドは基質のどの有意な吸収バ
ンドからも遠隔に存在しうる。あるいは、発色団の吸収バンドは、基質のあらゆ
るオーバーラップしているバンドを効果的に圧倒する(swamp)ような強度のもの
であってもよい。好ましくは、発色団Cuの主logEmax(plincipal log Emax)値は
少なくとも2.5である。さらに好ましくは、発色団Cuの主logEmax値は基質Rの主l
ogEmaxよりも少なくとも1.5倍大きい。
【００１７】 好ましくは、分光光度分析は、スペクトルの紫外線領域の波長で行われる。
【００１８】 溶液中の化合物による可視光線または紫外線の吸収と化合物の濃度との関係は
、式E=A/cl(式中、Aはサンプル溶液の吸光度または光学密度であり、cはモル濃
度であり、lはサンプルの光路長であり、Eはモル吸光係数である)で表されるベ
ール-ランバートの法則によって規定される。モル吸光係数Eは、所与の化合物に
ついて所与の波長で一定であり、通常、Emax(吸収バンド極大におけるモル吸光
係数)として表される。EまたはEmaxの値は、通常、10-2m2mol-1の単位で表され
、特に指示されない限り、本明細書においてはEまたはEmax値に関してそのよう
な単位を使用する。EまたはEmax値は非常に大きい可能性があるので、対数値を
使用する場合が多く、そのような対数値は本明細書ではlogEmax値という。
【００１９】 所与の化合物はいくつかの異なる波長で有意な吸収ピークまたはバンドを有す
る場合が多く、よっていくつかのEmax値に関して規定できる場合が多い。本発明
に関して、「主Emax」という用語は、最大の吸光度が存在する波長でのEmaxを示
すために使用される。したがって、本発明に関して、発色団Cuの主logEmax値は
、好ましくは少なくとも2.5であり、通常、基質Rの主Emaxよりも少なくとも1.5
倍大きい。しかし、より典型的には、発色団Cuの主logEmaxは、基質Rの主logEma x よりも少なくとも２倍、さらに一般的には2.5倍、好ましくは３倍大きい。
【００２０】 化合物の分析は主極大での吸光度を測定することによって行われるが、側バン
ド(side band)または極大より低い吸収の測定を代わりに使用して存在する化合
物の量を測定してもよい。一般に、測定を行う波長は、基質Rおよび発色団Cuの
正確な吸収特性によって様々であり、ケース・バイ・ケースで決定されうる。
【００２１】 発色団Cuは、基質中のあらゆる発色団と、どの有意な吸収バンドからも遠隔の
吸収バンドを有するという点で識別されうる。このことは、発色団の吸収バンド
は、基質Rに帰属するどの有意な吸収からも遠隔にあり、基質Rに帰属するどの有
意な吸収とも有意な程度にはオーバーラップしない(例えば、各吸収ピークの曲
線下面積(area under curve, a.u.c.)に関してオーバーラップが５％未満)とい
うことを意味する。本発明に関して有意な吸収とは、logE値が１以上の吸収を意
味する。
【００２２】 さらなる態様においては、本発明は、連結基Yを介して基質Rが連結されている
固体支持体Qを含む、固相合成で使用するための化学構築物であって；ここで連
結基Yは垂直且つ選択的に開裂可能な第１開裂部位および第２開裂部位を有し；
第２開裂部位は選択的に開裂されて基質を遊離することが可能であり；そして第
１の開裂部位は第２開裂部位と固体支持体との間に配置されており、且つ選択的
に開裂されて基質および連結基Yの少なくとも一部分を含む断片Fruを遊離するこ
とが可能であり、連結基Yの該部分は紫外線、可視または蛍光分光光度法(好まし
くは紫外線分光光度法)による断片Fruの分析を容易にする発色団Cuを含んでおり
、発色団Cuの主logEmax値は少なくとも2.5であり、(i) 発色団Cuの主logEmax値
は基質Rの主logEmaxよりも少なくとも1.5倍大きいか、または(ii) 発色団Cuは基
質Rに帰属する吸収から遠隔の波長に吸収ピークを有するものである、化学構築
物を提供する。
【００２３】 構築物中に紫外線発色団が存在することにより、実施される合成の生成物の定
量が可能になる。そのような定量は、(i)絶対定量もしくは(ii)相対定量、また
はその両方でありうる。絶対定量は、基質分子または基質分子を含む断片もしく
は構築物の絶対濃度を決定できることを意味し、一方、「相対定量」という用語
は、本明細書で使用する場合、反応混合物中の別の成分(副産物または原料また
は別の基質)に対する基質(または基質を含む断片もしくは構築物)の量の決定を
意味する。
【００２４】 紫外線発色団は、一般的に、典型的な基質分子の吸収極大が見出される波長と
は通常異なる特有の、すなわち特徴的な波長において非常に強い吸収を有するよ
うに選択される。しかし、発色団の吸収が基質または基質Rに対して非常に大き
い場合、基質および発色団に帰属する吸収のオーバーラップの基質定量の測定値
の精度に対する影響力は最小になりうる。一般に、取り込まれる誤差が約10％未
満、好ましくはせいぜい約５％であるならば、吸収バンドのオーバーラップは実
施される意味のある分析を妨げないはずである。したがって、発色団を相対吸光
度および絶対モル吸収値に関して規定する代わりに、発色団Cと、基質に帰属す
る吸収とのその関係を、基質Rと発色団の吸収バンド間のオーバーラップから生
じる誤差の程度に関して規定してもよい。
【００２５】 したがって、さらなる態様では、本発明は、連結基Yを介して基質Rが連結され
ている固体支持体Qを含む、固相合成で使用するための化学構築物であって；こ
こで連結基Yは垂直且つ選択的に開裂可能な第１開裂部位および第２開裂部位を
有し；第２開裂部位は選択的に開裂されて基質を遊離することが可能であり；そ
して第１の開裂部位は第２開裂部位と固体支持体との間に配置されており、且つ
選択的に開裂されて基質および連結基Yの少なくとも一部分を含む断片Fruを遊離
することが可能であり、連結基Yの該部分は紫外線、可視または蛍光分光光度法
による断片Fruの分析を容易にする発色団Cuを含んでおり、発色団Cuと基質Rは、
所定の測定波長での基質R(またはいずれかの断片もしくは断片を含む構築物)の
量の測定における、発色団に帰属する吸収バンドと基質Rに帰属する吸収バンド
とのあらゆるオーバーラップから生じるいずれの誤差が10％未満、好ましくは５
％未満であるような吸収特性を有する、化学構築物を提供する。
【００２６】 発色団は、例えば、アリール基、好ましくは縮合多環式アリール基、例えば１
個以上(例えば１、２または３個）の環構成炭素原子が窒素、硫黄または酸素の
ようなヘテロ原子で置換されていてもよいC6〜C30の多環式アリール基を含む基
である。多環式アリール基は、例えば、ナフチル基、フェナントレニル基および
アントラセニル基のような多環式炭化水素、ならびにアクリジンもしくはフェナ
ントロリンのような多環式ヘテロアリール基である。そのようなアリール基また
は多環式基は、好ましくは、所与の反応スキームで使用される反応条件に関して
不活性であるか、および／または妨害しない１個または複数個の置換基で置換さ
れていてもよい。そのような置換基としては、例えば、アルキルおよびアルコキ
シ(例えば、１〜20個の炭素原子、好ましくは１〜６個の炭素原子を有するアル
キルおよびアルコキシ)が挙げられ、それぞれ場合によって１個以上の不飽和結
合を含んでいてもよく、場合によって酸素、窒素および硫黄から選択される１個
以上のヘテロ原子が挿入されていてもよく；アミノ(好ましくは保護アミノまた
は一置換もしくは二置換アミノ、例えばジメチルアミノ)；ハロゲン(例えばフル
オロ、クロロ、ブロモおよびヨード)；アルキルチオ(例えば、C1-20のアルキル
チオ、好ましくはC1-6のアルキルチオ)；ヒドロキシ、保護(例えばアシル化)ヒ
ドロキシ、チオ、保護(例えばアシル化)チオ、トリフルオロメチル、ニトロ、ア
ルキルスルホニル、アリール(例えば任意に置換されたフェニル、チエニル、フ
ラニル)、およびアリールアルキル(例えばベンジルおよびフェネチル)が挙げら
れる。
【００２７】 発色団のその他の例としては、高度に共役したアリールまたは非アリール系が
挙げられ、ただしそのような化合物は固相化学反応で使用される合成条件下で不
活性であることを条件とする。そのような化合物は、G-J-M型(ここでGは電子供
与基(例えばアミノまたはアルコキシ)であり、Jは共役型の多重、例えば二重結
合の配列であり、Mは電子求引基(例えばニトロまたはスルホニル)であり、基Gと
Mは共役型の多重結合の配列によって電子的に連結されている)のいわゆる「プッ
シュプル」系である。そのような発色団の一例は、ダンシル(1-ジメチルアミノ-
5-ナフチルスルホニル)基である。
【００２８】 発色団の正確な性質、その化学特性、およびその吸収特性は、所与の合成で使
用される化学反応のタイプによってケース・バイ・ケースで決定可能である。し
かし、発色団が反応物および合成に使用される反応条件に対して不活性であるの
が最も好ましい。
【００２９】 本発明で好ましい発色団としては、アントラセニル基およびダンシル(5-ジメ
チルアミノ-1-ナフチルスルホニル)基が挙げられ、アントラセニル基が特に好ま
しい。
【００３０】 基質Rの定量は、絶対定量でもよく、あるいは合成混合物中の基質Rと別の成分
(例えば別の基質、または原料、または副産物)の相対量を決定する相対定量でも
よい。相対定量は、発色団Cuが分光光度分析の基礎として使用可能な特徴的な吸
光度の共通セットを各基質に付与するという事実を使用する。
【００３１】 本発明の１つの実施形態では、分析は、１個のビーズまたは少数のビーズ、例
えば１〜20個のビーズ、より一般的には10個未満のビーズを用いて行われる。そ
のようなビーズは、通常、平均径90μm〜250μmであり、化合物の投入量は0.1mm
olg-1〜0.4 mmolg-1であり、個々のビーズの平均投入量は10ナノモル未満であり
、例えば５ナノモル未満であり、例えば約１ナノモルである。
【００３２】 したがって、１つの好ましい実施形態では、本発明は、固相構築物の分析方法
であって、 (i) 連結基Yを介して基質Rが連結されている固体支持体Q（例えば平均径90μm
〜250μmの樹脂ビーズ)を含む化学構築物を用意するステップ、ここで基質Rは各
固体支持体上に10ナノモル以下(例えば５ナノモル未満、例えば２ナノモル未満)
の量で存在しており；連結基Yは垂直且つ選択的に開裂可能な第１開裂部位およ
び第２開裂部位を有し；第２開裂部位は選択的に開裂されて基質を遊離すること
が可能であり；そして第１の開裂部位は第２開裂部位と固体支持体との間に配置
されており、且つ選択的に開裂されて基質および連結基Yの少なくとも一部分を
含む断片Fruを遊離することが可能であり、連結基Yの該部分は紫外線、可視また
は蛍光分光光度法による断片Fruの分析を容易にする発色団Cuを含んでいる； (ii) １個の固体支持体、または20個を超えない複数個の固体支持体(例えば10
未満、より特定すると５未満、例えば１個の固体支持体)を分離するステップ； (ii) 固体支持体を処理することによって、連結基を第１開裂部位で開裂して
基質Rを含む断片Fruを遊離させるステップ；および (iii) 断片Fruを紫外線、可視または蛍光分光光度分析に供して基質Rを定量す
るステップ、 を含む方法を提供する。
【００３３】 本発明の紫外線発色団含有構築物の使用の有意な利点は、これらの構築物を使
用することによって、非常に少量の基質化合物、例えば一般にスプリットおよび
ミックスコンビナトリアル法で使用されるサイズの単一樹脂ビーズから得られる
１ナノモルオーダーの量の基質化合物について定量的な情報が得られうるという
ことである。スプリットおよびミックス法によって形成されるコンビナトリアル
ライブラリーでは、各ビーズは、通常、１つの基質化合物のみを含むが、ライブ
ラリーは様々な基質を有する複数のビーズを含む。様々な基質を有するビーズ混
合物の分析は問題が多く、よって一般に単一ビーズで分析を行う必要がある。本
発明の構築物は、単一ビーズレベルで、特にサイズが直径90μm〜250μmのオー
ダーであり、添加量が0.1〜0.4mmolg-1のオーダーであるビーズを用いることで
、分析を効率的且つ正確に実施することが可能である。
【００３４】 連結基Yへの発色団の導入によって、基質を定量分析に供することが可能にな
る。しかし、定量分析はもちろんのこと、基質の定性分析も容易にするために、
断片Fruは、発色団Cuだけでなく質量分光分析学的増感基Gも含むのが好ましい。
【００３５】 増感基Gは、質量分光分析技術による分析に対する断片Frの感度を高め、ひい
ては基質Rの感度を間接的に高める。したがって、増感基は、質量分析計、特に
エレクトロスプレー質量分析計で遭遇する条件下で容易にイオン化して強いシグ
ナルをもたらすことが可能な基でありうる。イオン化可能な増感基の導入は、質
量分析計において強い応答をもたらすように断片を十分イオン化させるのに役立
つ。これは、適当なイオン化基が存在せず、且つハイスループットの質量スペク
トル技術による分析に問題が多い固相法によって合成される多くの分子に固有の
問題を克服する。
【００３６】 イオン化可能な基は、例えば塩基性アミノ基またはカルボキシレート基であっ
てよく、好ましくは塩基性アミノ基である。「塩基性アミノ基」という用語は、
本明細書で使用する場合、特に、容易にプロトン化されるアミノ基を意味するも
のである。
【００３７】 塩基性アミノ基は、第１級アミノ基、第２級アミノ基、または第３級アミノ基
であってよい。塩基性アミノ基が第３級アミノ基である場合、例えば、ピペリジ
ノ、ピペラジノ、ピロリジノ、またはモルホリノのような環状アミノ基であって
よく、ピペリジノまたはピペラジノ(例えばN-メチルピペラジノ)が好ましい。
【００３８】 本発明の１つの好ましい実施形態では、第１開裂部位での開裂が化学断片Fru
上の第１開裂部位に質量スペクトルまたはその他の増感基Gを形成または導入す
るように化学構築物は設計される。そのような構築物では、増感基Gは構築物の
「骨格」の開裂によって形成または導入され、側鎖の開裂またはペンダント型増
感基からの保護基の除去によるものではないと認識される。このような方法で増
感基Gを形成することの利点は、既存のまたは予め形成された増感基が化学反応
を妨害する可能性があるという問題が回避されることである。さらに、増感基を
別個に保護する必要がないので、脱保護という追加の問題（これは、第１および
第２の開裂部位での開裂について化学者が利用できる化学反応のタイプを限定し
うる要件である）が回避される。したがって、例えば、保護されたペンダント型
増感基が存在し、例えば脱保護に必要な条件にトリフルオロ酢酸などの酸の使用
が含まれる場合、このことは、構築物の残部に基質を連結している第２の開裂部
位として酸不安定性開裂部位を使用することを事実上妨げるであろう。本発明の
構築物はそのような問題を回避するものである。
【００３９】 増感基Gを構成する原子または官能基は、断片Fruが樹脂から開裂する前は構築
物中にマスキングされた形態で存在することができ、開裂条件は単に増感基Gを
脱マスキングするのに役立つ。あるいは、増感基Gを構成または含有する原子ま
たは官能基を開裂反応中に開裂部位に導入してもよい。例えば、増感基が塩基性
アミノ基である場合、アミノ基の窒素原子は開裂前に構築物中に存在してもよく
、あるいは開裂反応中に導入してもよい。
【００４０】 増感基Gが開裂反応中に外部の供給源から導入される場合、増感基Gは大きな化
学成分の一部を形成していてもよい。例えば、増感基Gは、基X-G(式中、Xは求核
性または求電性の残基、例えば窒素または硫黄ベースの求核基、例えば式G-Alk-
Nuc(ここでAlkは、任意に酸素、窒素および硫黄から選択される１以上のヘテロ
原子が挿入されていてもよいアルキレン基(例えばC2-20、好ましくはC2-6のアル
キレン基)であり、Nucはアミン(例えばNHまたはNR'(R'はC1-6アルキル基))など
の求核基、またはチオレート基である)で表される基である)の一部として導入し
てもよい。
【００４１】 化学断片Fruは、該断片の質量スペクトルに特徴的なサインを付与するための
手段を含むのが好ましい。このサインは、断片に「ピーク分裂(peak splitting)
」同位体標識を導入することによって有利に付与することができる。ピーク分裂
同位体標識は、安定ないくつかの同位体で存在する少なくとも１つの原子を含む
。所与の原子が同位体の混合物で標識されるように断片Fruの１以上の特定の原
子を同位体標識することによって、分子イオンの質量スペクトルが特徴的なパタ
ーンとして現れる。その正確なパターンは個々の同位体の相対量によって様々で
ある。したがって、例えば、断片Frの所定の原子が、その原子の50％がある１つ
の同位体であり、50％が別の同位体であるように標識されると、質量スペクトル
は、その分子イオンをピークの高さががほぼ等しい特徴的な二重項として示すだ
ろう。
【００４２】 ピーク分裂性原子の目的は、特徴的なパターンをもたらすことであり、分析断
片Frに由来する質量スペクトルにおけるいずれかのピークを特徴付けることによ
ってかかるピークを外来物質に帰属するピークから識別する。
【００４３】 同位体ピーク分裂標識として使用可能な原子の例としては、1H/2H(D)、79Br/8 1 Br、12C/13C、14N/15Nおよび16O/18Oが挙げられる。
【００４４】 断片Fruは、１つのピーク分裂同位体標識を含んでいてもよく、あるいは２つ
以上のそのような標識を含んでいてもよい。例えば、同位体標識は、１つの臭素
原子であってもよく、その場合、固体支持体からの開裂後に遊離する分析断片Fr u の分子イオンのピークは、二重項として現れる。第２のまたは後続のピーク分
裂標識を導入することによって、より複雑なピークパターンが分子イオンにもた
らされる。
【００４５】 同位体ピーク分裂標識は、好ましくは、第１開裂部位と第２開裂部位の間に配
置される。
【００４６】 第１開裂部位および第２開裂部位は、第１リンカー基L1および第２リンカー基
L2によって規定することができる。「スペーサー基」Aを、２つのリンカー基L1
およびL2の間に挿入でき、スペーサー基Aは、紫外線発色団Cuを含むか、あるい
はそれに連結されている。スペーサー基Aは、一般に、同位体ピーク分裂標識も
含む。したがって、本発明の１つの好ましい実施形態では、連結基Yが式L1-A-L2 (式中、L1は第１開裂部位を規定する第１リンカー基であり、Aは紫外線発色団Cu を含むか、それに連結されており、且つ任意にピーク分裂同位体標識を含んでい
てもよい化学基(スペーサー基)であり、L2は第２開裂部位を規定する第２リンカ
ー基である)で表される、上で定義したような化学構築物が提供される。
【００４７】 第１および第２開裂部位は、垂直且つ選択的に開裂可能である。すなわち、開
裂部位の一方に開裂をもたらすのに用いられる条件は他方を開裂させない。広範
な種類の異なるタイプの開裂反応が使用可能であり、例えば、酸触媒開裂、塩基
触媒開裂、酸化開裂、還元開裂、求核置換、求電子置換、ならびに熱、光化学お
よび酵素開裂から選択される反応がある。
【００４８】 したがって、好ましい実施形態では、第１開裂部位が、酸条件下での開裂、塩
基触媒開裂、酸化開裂、還元開裂、求核置換、求電子置換、ならびに熱、光化学
および酵素開裂からなる化学反応群より選択される１つのタイプの化学反応によ
って選択的に開裂可能であり、第２開裂部位が上記化学反応群から選択される異
なるタイプの化学反応によって選択的に開裂可能である、上で定義したような化
学構築物が提供される。
【００４９】 第１開裂部位／リンカーもしくは第２開裂部位／リンカーまたはその両方は、
「セーフティ・キャッチ(safety catch)」変種であってもよく、すなわち開裂部
位またはリンカー基は、第２ステップで開裂に供される前に、第１ステップで化
学修飾される必要がある。そのような機構の利点は、偶然開裂が生じる可能性を
防止するか、有意に低下させることである。「セーフティ・キャッチ」機構の一
例は、第１のステップで官能基を酸化することを含む。酸化は、その後の開裂ス
テップにおいて官能基が求核試薬による置換をより受けやすくなるようにするの
に役立つ。求核試薬はその構造がかなり多様であってよい。例えば、１つの実施
形態では、求核試薬はアミノ基含有求核試薬であってよく、アミノ基は、該アミ
ノ基が開裂部位に直接結合するように求核置換作用に関与する。あるいは、別の
実施形態では、アミノ基(またはその他の増感基)は、硫黄求核試薬などの別の求
核試薬を含む基(例えばジアルキルアミノアルキル−チオレートアニオン)で存在
し、開裂部位に結合されることになる。
【００５０】 酸性条件下で選択的に開裂できるリンカー基の例としては、適宜置換されたベ
ンジルオキシカルボニル基および適宜置換されたジフェニルメチルアミノ基があ
り、それらはともにトリフルオロ酢酸の作用により開裂され得る。
【００５１】 酸開裂性リンカー基の例は特にThe Combinatorial Index、Barry A. Bunin、A
cademic Press、San Diego 1998に示されており、その開示は参照により本明細
書に組み入れられるものとする。「Rink」タイプまたは「Knorr」タイプのリン
カー基は、典型的にはN-保護1-アミノ-1,1-ジフェニルメタン部分を含み、アミ
ノ基は脱保護されたときに基質への結合を可能にし、フェニル環の一つは例えば
ジメトキシ基で置換され、もう一方はカルボキシアルキルオキシ置換基を有して
おり第２の結合部位を提供する。TFAによる開裂により、末端にカルボキサミド
基を有する基質化合物が生じる。「Wang」タイプのリンカー基は典型的には置換
されたフェノキシアセチル基を含み、アセチル基は１の結合部位を提供し、フェ
ニル環上のベンジルヒドロキシル基は第２の結合部位を提供する。基質のカルボ
キシル基とベンジルヒドロキシル基との間にエステルが形成可能であり、該エス
テル基は、続いてＴＦＡで開裂されて末端にカルボキシレート基を有する基質化
合物を遊離する。
【００５２】 求核置換により開裂され得るリンカー基の例としては、スルホンアミドのアリ
ール（例えばフェニル）環にニトロ基などの電子吸引基を、好ましくはアリール
環のオルト位に、含有するスルホンアミドリンカー基がある。アミノ基とスルホ
ニル部分との間のリンカーの開裂は、チオールまたはチオレート求核試薬などの
求核試薬により、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン(DBU)、モルホリ
ンまたは炭酸ナトリウムなどの塩基の存在下で達成される。求核置換により開裂
され得る基のその他の例としては、5-カルボキシ-2-メルカプトピリミジンなど
のメルカプトピリミジンに基づく「セーフティーキャッチ」リンカーがある。こ
の場合、開裂は、酸化的条件下で反応させてスルホキシドまたはスルホン結合を
生成させ、その後に求核アミノ基と反応させて2-アミノピリミジンを形成するこ
とにより達成される。そのようなリンカーは、はじめに酸化剤、好ましくは過酸
などの比較的穏やかな酸化剤またはペルオキシモノ硫酸カリウム(例えばOxone(
商標))などの無機過酸塩で酸化し、その後に例えばピペリジンもしくはN-置換ピ
ペラジン（例えばN-メチルピペラジン）のような環状アミンまたはアミノ基含有
チオレート求核試薬（例えばジメチルアミノエチルチオレート）と反応させるこ
とにより開裂され得る。
【００５３】 塩基性条件下で選択的に開裂され得るリンカーの例としては、エステル結合を
含む基が挙げられる。
【００５４】 本発明の実施形態の一つでは、第１開裂部位（例えば、スルホンアミドリンカ
ーにより規定することができる）は求核置換により選択的に開裂可能であり、第
２開裂部位（例えば、Rinkリンカーにより規定することができる）は酸性条件下
で選択的に開裂可能である。
【００５５】 本発明のもう一つの実施形態では、第１開裂部位（例えば、エステル結合によ
り規定することができる）は塩基により選択的に開裂可能であり、第２開裂部位
（例えば、Rinkリンカーにより規定することができる）は酸性条件下で選択的に
開裂可能である。
【００５６】 第１および第２の開裂部位（例えば垂直に開裂可能な第１および第２リンカー
基L1、L2により規定される）を設けることにより、異なる開裂条件を使用するだ
けで、選択的に該構築物から断片Fruまたは基質Rを分離することが可能となる。
このことは、ある特定の反応ステップの条件が最適化されるように設計された実
験の間に、化学者は、分析断片Fruを開裂により遊離させるのに適した条件に該
構築物を供することができ、それによって実施される分析で各試験反応の結果を
判定することが可能になる。同様に、予備反応(preparative reaction)(例えば
、コンビナトリアルライブラリーの作製、またはその後のスケールアップ反応も
しくは商業的生産などの予備反応)の間に、多数の各固体支持体を反応容器から
除去し、第１開裂部位において該構築物を開裂し、そして得られる断片Fruを分
析して特定の反応ステップが進んでいるかどうかを確認することによって、品質
管理(QC)を行うことができる。一方で、第１開裂部位ではなく、例えば第２リン
カー基上の第２開裂部位における開裂により、基質Ｒが固体支持体から遊離され
る。このように、本発明の構築物の有利な点は、特定のプロセスステップを最適
化するためのまたはQCの目的のための実験レベルにおいても、また、スクリーニ
ングの目的で基質のみを選択的に遊離させるための予備的レベルにおいても、リ
ンカー基を改変することなく利用できる点である。
【００５７】 本発明の実施形態の一つでは、断片Fruおよびより好ましくはスペーサー基Aが
アルキレンジアミン基またはアミノアルコシキ基を含む。アルキレン基の正確な
サイズおよび置換の程度は現在のところ重要とは考えられていないが、例えばそ
の鎖は長さが炭素原子2〜30個であってよく、例えば炭素原子20個までであり、
より典型的には炭素原子10個未満であり、特に例示できるものとしては、エチレ
ンもしくはプロピレンジアミンまたは置換もしくは無置換のアミノアルコールで
ある。アルキレンジアミン基またはアミノアルコールは典型的には、先に正義し
たピーク分裂(peak splitting)同位体標識を含む。２個のアミノ基はそれぞれ第
１および第２のリンカー基に結合され得る。スペーサー基Aの質量を増すために
、アルキレンジアミン基をアリール基、例えばN-ベンジル基などのN-アリール基
で置換することができる。N-アリール基は場合により１個以上の置換基で置換さ
れていてもよい。
【００５８】 発色団Cuは断片Fruの主鎖または骨格に組込まれた一部分として(例えば、スペ
ーサー基Aの一部分として)形成されていてもよく、またペンダント基であっても
よい。従って、例えばそれがペンダント基である場合には、直接に、または場合
により1個以上の酸素、窒素もしくは硫黄原子に挿入された(例えば、炭素原子1
〜6個の)アルキレン鎖を介して、またはエーテル、チオエーテル、アミド、スル
ホンアミドもしくはエステル結合を利用してAに連結され得る。スペーサー基Aが
アルキレンジアミン基またはアミノアルコキシ基を含有している場合には、発色
団Cuは、例えば、アミノ基の、またはアミノ基上の窒素原子に（直接に、または
先に定義したような任意に挿入されたアルキレン鎖を介して）連結され得る。例
えば、発色団Cuはエチレンもしくはプロピレン鎖を利用することによって、また
はスルホニル基により窒素原子に連結され得る。
【００５９】 スペーサー基が好ましいことに１以上の質量スペクトルピーク分裂同位体標識
を含んでいる場合は、アルキレン鎖またはアルキレン鎖に結合した置換基の何れ
かにそれらは存在している。このようにして、例えばアルキレンジアミンの２つ
のアミノ基のうちの１つに結合したN-ベンジル基が、ピーク分裂性原子である重
水素で置換されたメチレン基を有することができる。あるいは、アルキレンジア
ミン上の置換基に含まれるアリール環（例えばN-ベンジル基）は、ピーク分裂性
の臭素原子で置換されることができ、特に例示できるアリール基はN-o-ブロモベ
ンジル基である。ベンジル基などの置換基が、アルキレンジアミンスペーサー基
Aのアミノ基の１つに結合している化合物においては、発色団Cuは直接または間
接的にもう一方のアミノ基に連結される。現時点で好ましい実施態様の一つは、
発色団Cuがアントラセニル基またはフェナントレニル基などの多環式アリール基
であってジアミンスペーサー基の一方の端にある窒素原子に連結したものである
。
【００６０】 アルキレンジアミン基およびアミノアルコール基はスペーサー基として特に例
示したものであるが、その他のスペーサー基も利用し得る。例えばスペーサー基
は、場合により1個以上の酸素、窒素または硫黄などのヘテロ原子が挿入された
、鎖中に最大で30個以上の炭素原子を含む炭化水素鎖からなっていてよい。それ
以外には、スペーサー基は例えば1個以上のアミノ酸を含有するペプチド鎖であ
ってよい。スペーサー基の正確な性質および長さは、スペーサー基が該構築物の
化学的性質を妨害しないのであれば、現時点では重要だとは考えられていない。
【００６１】 固体支持体Qは、固相合成、特にコンビナトリアルケミストリーにおける固相
合成における使用に適した固体支持体ならばいかなるタイプであってもよい。こ
のように固体支持体は、単なる例示であるが、ビーズ、固体表面、粒子、ペレッ
ト、ディスク、キャピラリー、中空糸、ニードル、ソリッドファイバーまたは有
機もしくは無機のゲル（シリカゲルなど）、および不溶性の有機粒子（フラーレ
ンから形成される粒子など）の形態であってよい。
【００６２】 ビーズの例としては、セルロースビーズまたは樹脂ビーズなどのポリマービー
ズがあり、樹脂ビーズの製造の原料の例としては特に、ポリスチレン樹脂、ポリ
アクリルアミド樹脂およびジメチルアクリルアミド樹脂などの機能が付与された
樹脂が含まれる。好ましい支持体の例は、先に参照したBarry A. BuninのThe Co
mbinatorial Index中に列挙されている。
【００６３】 これまで述べたものの他に、本発明はまた、先に定義した構築物を分析する方
法も提供する。その方法は、該構築物を第1開裂部位で開裂して化学断片Fruを遊
離させ、そしてその断片を紫外線、可視または蛍光分光分析、例えば定量的紫外
線分析に供することを含む。
【００６４】 開裂の生成物は、クロマトグラフィーに、好ましくは、様々な化合物の濃度を
それらがクロマトグラフィー用カラムから溶出してくる際に検出する手段を提供
するべく取り付けられた紫外線検出器を用いるHPLCなどの液体クロマトグラフィ
ーの技法に供することができる。そしてクロマトグラフィー用カラムは、基質の
同定を目的とする分析機器にさらに連結することができる。機器分析の好ましい
手段は質量分光分析であり、それにより、本発明の方法および構築物は、単一で
一連の分析操作で基質の同定と定量を同時に達成する手段を与える。
【００６５】 質量分光分析は好ましくは、MALDIまたはエレクトロスプレーまたはイオンサ
イクロトロン質量分光分析などの「ソフトな」質量分光分析技法である。この実
施においては、構築物は典型的には先に定義した質量分光分析で検出される基を
含む。
【００６６】 特に好ましい実施態様では、構築物は、第1開裂部位での開裂が化学断片Fru上
に質量分光分析学的増感基（例えば、質量分光分析の条件下でイオン化され得る
基）を生じさせ、その後に該化学断片を質量分光分析たとえばエレクトロスプレ
ー質量分光分析に供するように設計される。
【００６７】 断片Fruの分析は、構築物の反応の履歴に関する情報を提供する。このように
して、質量分光分析によって、ある一連の反応において所望の基質が形成された
かどうかを容易に知ることができる。従って、断片Fruの分析は、一連の固相反
応の基質または生成物の特長を解析するのに利用できるだけではなく、反応の進
行を追跡するのにもまた利用できる。反応生成物の定量は紫外線発色団により実
現される。
【００６８】 さらにまた本発明は、先に定義した化学構築物の作成に使用するための化学構
築物中間体を提供する。該構築物中間体は式Q-Y’(式中、Y’は反応形態または
保護形態の基Yであり、QおよびYは先に定義した通りである)である。
【００６９】 そのうえさらにまた本発明は、式Q-L1-AP（式中、QおよびL1は先に定義した通
りであり、APは、発色団Cuおよび場合により分裂同位体標識を含む反応形態また
は保護形態のスペーサー基Aである）の構築物中間体を提供する。特定の実施態
様では、構築物中間体は一般式Q-L1-N(Alk-Cu)-Alk-NH-X1（式中、Alkはアルキ
レン基であり、X1は水素またはアラルキル基である）を有する。構築物中間体は
好ましくは、ピーク分裂性の原子の組合せ、例えば1H/H2(D)、79Br/81Br、12C/1 3 C、14N/15Nおよび16O/18Oなどにより同位体標識されている。
【００７０】 本発明はさらに、先に定義した複数の化学構築物を含むライブラリーを作成し
、そのライブラリーを生物学的に活性な基質を同定するための生物学的試験に供
することを含む、製薬上利用できる基質を同定するための方法を提供する。該方
法は、同定された生物学的に活性な基質を製薬上許容される担体とともに製剤化
して医薬組成物を製造するさらなるステップを含んでもよい。
【００７１】実例となる実施形態の説明 本発明を以下の実施例を参照して説明するが、これらの実施例によって本発明
は限定されない。
【００７２】実施例 実施例１ アントラセニル紫外線発色団を含む構築物の調製 紫外線分光光度法を用いて、固相反応の生成物についての正確な定量的情報を
提供することができることを実証するために、アントラセニル紫外線発色団を含
む構築物を以下のスキーム１、２および３に示す合成経路に従って調製した。構
築物は、第1開裂部位にスルホンアミドリンカーおよび第2開裂部位にRinkリンカ
ーを有するように提供され、前記2種のリンカーに連結するエチレンジアミン鎖
およびジアミン鎖の2個の窒素原子は、紫外線発色団とピーク分裂(peak splitti
ng)重水素で標識したベンジル基または未標識のベンジル基のいずれかとの結合
点として役割を果たす。
【００７３】 下記のスキーム１は非樹脂結合中間体構築物の合成を示し、スキーム２はスキ
ーム１の構築物の樹脂支持体への結合と該樹脂上での後続の反応を示し、さらに
スキーム３は様々な基質基の構築物への結合と後続の開裂実験を示す。以下の実
験に関する節において用いた化合物番号は、スキーム１、２および３において識
別した化合物と合致する。
【００７４】スキーム１
【化１】
【００７５】スキーム１に関する実験
【化２】
【００７６】化合物(12)(X = 1 H, 1 H)の調製 無水トリエチルアミン(25μl、0.2mmol)を、アミン(X = H,H)(11)(0.05mmol)
の無水ジクロロメタン(1ml)溶液に添加した。次いで、2-ニトロ-4-メチルベンゾ
エートスルホニルクロリド(10)(25mg、0.1mmol)の無水ジクロロメタン(0.5ml)溶
液を滴下添加し、混合物を15分間攪拌した。溶媒を真空下で蒸発させ、残留物を
ヘキサン/酢酸エチル(2：1)を溶出剤として用いたフラッシュクロマトグラフィ
ーによって精製し、スルホンアミド(12)(23.3mg、95％)を無色油状物とて得た。
Rf 17/50[ヘキサン-酢酸エチル(2：1)];
【００７７】化合物(12)(X = 2 H, 2 H)の調製 無水トリエチルアミン(25μl、0.2mmol)を、アミン(X = 2H,2H)(11)(0.05mmol
)の無水ジクロロメタン(1ml)溶液に添加した。次いで2-ニトロ-4-メチルベンゾ
エートスルホニルクロリド(10)(25mg、0.1mmol)の無水ジクロロメタン(0.5ml)溶
液を滴下添加し、混合物を15分間攪拌した。溶媒を真空下で蒸発させ、残留物を
ヘキサン/酢酸エチル(2：1)を溶出剤として用いたフラッシュクロマトグラフィ
ーによって精製し、スルホンアミド(12)(23.5mg、94％)を無色油状物とて得た。
Rf 17/50[ヘキサン-酢酸エチル(2：1)];
【００７８】化合物(13)および(1)の調製
【化３】 ジ-tert-ブチルアゾジカルボキシレート(32.6mg、142μmol)を、窒素下におい
て無水テトラヒドロフラン(0.5ml)に溶解し、窒素下において無水テトラヒドロ
フラン(1ml)に溶解したトリフェニルホスフィン(37.1mg、142μmol)、3-(9-アン
トラセン)プロパノール(17.6mg、74μmol)およびスルホンアミド12(X = H,Hおよ
び2H,2H)(35mg、71μmol)の溶液に攪拌下にて滴下添加した。1時間後、tlcによ
り反応が終了したことを判定し、該溶液を蒸発させほぼ乾燥状態にした。残留物
を、10％のトリエチルアミンを含むヘキサン/酢酸エチル(2：1)を用いたフラッ
シュクロマトグラフィーによって精製し、スルホンアミド13(45mg、90％)を無色
油状物として得た。Rf 15/38(ヘキサン-酢酸エチル(2：1))；MS(エレクトロスプ
レー + ve) m/z 612, 614(MH-Boc)+, MS(エレクトロスプレー - ve) m/z 756, 7
58 (M-H+ホルメート)HPLC, Rt 6.9分。
【００７９】
【化４】 2M水酸化ナトリウム水溶液(0.35ml、0.7mmol)を、エステル(13)(0.25g、0.35m
mol)のメタノール-1,4-ジオキサン(4：1)(2ml)溶液に滴下添加した。室温で1時
間攪拌した後、(さらにメタノール-ジオキサン(約1ml)を必要に応じて添加して
確実に単一相にし)、十分量の2M HClを添加し溶液を穏やかに酸性にした。溶液
を、酢酸エチル(50ml)および水(10ml)を含む別のフラスコに移し、分離後に水層
を再度酢酸エチル(25ml)で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥させ(MgSO4)、
減圧下で蒸発させて酸(1)(0.23g、94％)を無色油状物として得た。RF 2/40[ヘキ
サン-酢酸エチル(2：1)]；δH(CDCl3)1.40 (9H, br. d, tBu), 1.90 (2H, br. m
, CH2), 3.3-3.7 (8H, br. m, 4xCH2), 7.10-8.30 (17H, br. m, Arom. H)；MS
(エレクトロスプレー + ve) m/z 697, 699 HPLC, Rt 7.2分。
【００８０】スキーム２
【化５】
【００８１】スキーム３
【化６】
【００８２】スキーム２および３に関する実験
【化７】 無水窒素でフラッシュした(flushed)反応容器中のビーズの平均直径が150μm
でありかつ0.4mmolg-1のローディングを有する無水アミノメチルArgogel(登録商
標)(0.87g、0.35mmol)を、無水ジクロロメタン(5ml)で膨張させた。窒素でフラ
ッシュした別のフラスコにおいて、安息香酸(1)(0.67g、0.93mmol)、PyBOP(0.72
8g、1.4mmol)および1-ヒドロキシ-ベンゾトリアゾール(0.19g、1.4mmol)を無水
ジメチルホルムアミド(2ml)に溶解し、得られた溶液を2分間攪拌してカニューレ
を用いて樹脂の懸濁液に移した。窒素流をゆっくりと溶液を通過させて5分間吸
引することで混合を確実にし、次いでジイソプロピルエチルアミン(0.49ml、2.8
mmol)を添加し、攪拌を18時間続けた。樹脂(2)を排水し洗浄して(ジクロロメタ
ン(3 x 7ml)、ジメチルホルムアミド(3 x 7ml)およびジクロロメタン(3 x 7ml))
、真空下で乾燥させた。(2)の分析サンプルのKaiser試験は陰性であった。
【００８３】
【化８】 樹脂(2)(0.35mmol)をジクロロメタン(3ml)中に膨張させ、フェノール(66mg、0
.7mmol)次いでトリフルオロ酢酸(4.5ml)を添加した。樹脂を窒素流を用いて5分
間穏やかに攪拌し、次いで排水してジクロロメタン(2 x 5ml)で洗浄した。この
工程を繰り返し、排水後に樹脂を洗浄し(ジクロロメタン(3 x 8ml)、10％ジイソ
プロピルアミンを含むジクロロメタン(2 x 6ml)およびジクロロメタン(4 x 8ml)
)、真空下で乾燥した。分析サンプルのKaiser試験は陽性であった。
【００８４】 窒素でフラッシュした反応容器中の樹脂を、無水ジクロロメタン(5ml)で膨張
させた。窒素でフラッシュした別のフラスコにおいて、C-4 RINK酸(0.795g、1.4
mmol)、PyBOP(1.46g、2.8mmol)および1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(0.378g
、2.8mmol)を無水ジメチルホルムアミド(3ml)に溶解し、得られた溶液をカニュ
ーレを用いて樹脂の懸濁液に移した。この混合物を、窒素流を溶液を通過させて
吸引することで穏やかに攪拌し、5分後に無水ジイソプロピルエチルアミン(0.98
ml、5.6mmol)を添加した。振盪機上で18時間攪拌を続けた。続いて樹脂(3)を排
水し洗浄して(ジクロロメタン(3 x 8ml)、ジメチルホルムアミド(3 x 5ml)およ
びジクロロメタン(3 x 5ml))、真空下で乾燥させた。分析サンプルのKaiser試験
は陰性であった。
【００８５】
【化９】 樹脂(3)のサンプル(50mg、14μmol)を、20％v/vピペリジンを含むジクロロメ
タン/ジメチルホルムアミド(1：1)(2ml)で15分間処理した。樹脂を排水し洗浄し
て(ジクロロメタン(3 x 2ml)、ジメチルホルムアミド(3 x 2ml)およびジクロロ
メタン(3 x 2ml))、次いで真空下で乾燥させることで、分析サンプルのブロモフ
ェノールブルー試験は陽性であった。樹脂を含む反応容器を窒素でフラッシュし
、無水ジクロロメタン/ジメチルホルムアミド(1：1)(0.5ml)を添加した。窒素で
フラッシュした別のフラスコにおいて、PyBOP(57mg、110μmol)、1-ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール(15mg、110μmol)および適当な酸(4a-d)(55μmol)を無水ジ
クロロメタン-ジメチルホルムアミド(1：1)(0.5ml)に溶解し、この溶液の一部分
を樹脂の懸濁液に添加し、窒素流をこの混合物を通過させて吸引することで均一
な混合を確実なものにした。18時間の攪拌後に、樹脂を排水し洗浄して(ジクロ
ロメタン(3 x 2ml)、ジメチルホルムアミド(4 x 2ml)およびジクロロメタン(3 x
2ml))、真空下で乾燥させることで樹脂(5a-d)を得た。それぞれの分析サンプル
のKaiser試験は陰性であった。
【００８６】 各々4種の樹脂の少量のサンプルを、DBU/メルカプトエタノールを含むアセト
ニトリルで処理することで6a-dを遊離し、これらをHPLCおよび低解像度の質量分
析によって分析した： 6a(R = 3-ジメチルアミノベンゾイル) HPLC Rt 4.51分, MS(エレクトロスプレー
+ ve) m/z 843.7および845.7； 6b(R = 2-ナフチルアセトイル) HPLC Rt 5.41分, MS(エレクトロスプレー + ve)
m/z 863.4および865.4； 6c(R = 4-ペンテノイル) HPLC Rt 4.98分, MS(エレクトロスプレー + ve) m/z 7
78.7および780.7； 6d(R = tert-ブチルアセトイル) HPLC Rt 5.18分, MS(エレクトロスプレー + ve
) m/z 795.0および797.0。
【００８７】相対的計量 紫外線分析を用いて多成分混合物中の標的化合物または基質の相対濃度を定量
化することができるか否かを確認するための実験を行った。
【００８８】 およそ等量(約50mg)の樹脂(5a)および(5b)を合わせて、4-メルカプト安息香酸
(43mg、20μmol)およびモルホリン(49μmol)を含むジクロロメタン(2ml)で処理
した。1時間後、溶液を排水し樹脂をジクロロメタン(2 x 1ml)で洗浄した。これ
らの洗浄物を合わせて酢酸エチル(10ml)で希釈し、まず50％炭酸水素ナトリウム
飽和水溶液(3ml)で、さらに水(3ml)およびブライン(2ml)で洗浄し、硫酸マグネ
シウム上で乾燥させた。濾過した溶液を蒸発させることで、(6a)と(6b)との混合
物を約5mg得た。この混合物中の成分比を、まずHPLCにおける254nmおよび386nm
のピークの面積を測定して評価し、これを1H NMRスペクトルにおける特性共鳴を
集積した大きさから決定された比と相関させた。
【００８９】HPLC分析 6a 6b 面積比(254nm) 1.00 1.30 面積比(386nm) 1.00 1.26 1 H nmr分析 6a 6b 比 1.00 1.33
【００９０】 同様の方法で、樹脂(5c)と(5d)との混合物から(6c)と(6d)との混合物を得て、
この混合物中の成分比を再度HPLCで評価し、これを1H nmr分光法を用いて測定し
た比と相関させた。
【００９１】HPLC分析 6c 6d 面積比(254nm) 1.00 0.93 面積比(386nm) 1.00 0.97 1 H nmr分析 6c 6d 比 1.00 0.96
【００９２】 最後に(6a)、(6b)、(6c)および(6d)を1つの溶液に合わせて、上記と同様にHPL
Cと1H nmrを用いて分析した：HPLC分析 6a 6b 6c 6d 面積比(254nm) 0.87 1.35 1.00 1.00 面積比(386nm) 0.84 1.30 1.00 0.99 1 H nmr分析 6a 6b 6c 6d 比 0.85 1.34 1.00 1.05
【００９３】 得られたデータから判るように、各々の場合においてnmr分析から得られた比
と紫外線分析で得られた比が密接に相関していることにより、固相合成の生成物
を定量化の手段として紫外線法が正確であることが実証された。
【００９４】 上記の分析実験において分析した生成物の混合物は、各々が単一の基質を含む
異なる樹脂を一緒に混合することで簡単に調製された。紫外線分析法が複数の反
応生成物または基質が形成されている反応混合物の分析にも適用可能であること
を実証するためにさらに一連の実験を行った。
【００９５】 樹脂3(214mg、59μmol)を20％v/vピペリジンを含むジクロロメタン/ジメチル
ホルムアミド(1：1)(3ml)で60分間処理した。樹脂を排水し洗浄して(ジクロロメ
タン(3 x 3ml)、ジメチルホルムアミド(3 x 3ml)およびジクロロメタン(93 x 3m
l))、さらに真空下で乾燥させることで、分析サンプルのブロモフェノールブル
ー試験は陽性であった。次いで反応容器を窒素でフラッシュし、樹脂を無水ジク
ロロメタン-ジメチルホルムアミド(1：1)(2ml)で膨張させた。
【００９６】 窒素でフラッシュした別のフラスコにおいて、PyBOP(245mg、470μmol)、1-ヒ
ドロキシベンゾトリアゾール(64mg、470μmol)、ならびに4-ペンテン酸(6.0μl
、59μmol)、3-ジメチルアミノ安息香酸(19.5mg、120μmol)およびtert-ブチル
酢酸(23μl、180μmol)の混合物を、無水ジクロロメタン/ジメチルホルムアミド
(1：1)(1ml)に溶解し、この溶液の一部分を樹脂の懸濁液に添加した。穏やかに
窒素流を混合物中に通過させ、5分後にジイソプロピルエチルアミン(165μl、94
0μmol)を添加した。18時間の攪拌後に、樹脂(7)を排水し洗浄して(ジクロロメ
タン(3 x 4ml)、ジメチルホルムアミド(4 x 4ml)およびジクロロメタン(3 x 4ml
))、真空下で乾燥させた。樹脂(7)の分析サンプルのKaiser試験は陰性であった
。
【００９７】 樹脂(7)の少量のサンプルを、DBU/メルカプトエタノールを含むアセトニトリ
ルで処理することで(6a)、(6c)および(6d)の混合物を遊離し、これらの成分の相
対的な量をHPLCにおける254および386nmのピークの面積を測定して評価した(表)
。
【００９８】 次いで樹脂(7)の1個のビーズを同様の方法で選択し、開裂させた。成分比は、
再度HPLCを用いて測定した。
【００９９】 樹脂(7)の約200mg(0.056μmol)をジクロロメタンで膨張させ、過剰な溶媒を排
水した。フェノール(10.5mg、0.112μmol)を添加し、次いで添加体積が全体積の
3分の1となるように80％トリフルオロ酢酸を含むジクロロメタンを添加した。2
時間の攪拌後に淡赤色の溶媒を底の丸いフラスコに排水し、樹脂を、蒸留したジ
クロロメタン(3 x 3ml)で洗浄した。有機物を合わせて乾燥状態まで蒸発させ、 第1級アミド(8a)、(8c)および(8d)の混合物を得た。これらの成分比を1H nmrス
ペクトルにおいて特性共鳴の集積化の大きさを測定することによって評価した。
【０１００】HPLC分析(バルク(bulk)ビーズ) 6a 6c 6d 面積比(254nm) 0.71 1.00 0.44 面積比(386nm) 0.71 1.00 0.46 HPLC分析(単一ビーズ) 6a 6c 6d 面積比(254nm) 0.71 1.00 0.42 面積比(386nm) 0.69 1.00 0.41 1 H nmr分析 8a 8c 8d 比 0.74 1.00 0.42
【０１０１】 上記の表に示した結果は、紫外線法によって得られた比と、十分に確立および
立証されているnmr分析法によって得られた比との間には非常に良好な相関関係
があることを示す。従って該データより、紫外線検出および分析法を用いて固相
合成の反応生成物についての定量的情報を得るための非常に正確な手段を提供す
ることができることが実証される。紫外線分析が、分析に利用可能な化合物量が
ほんの1ナノモルの桁にすぎない1個のビーズレベルでさえも定量的データが得ら
れる正確な手段を提供することが示されたという事実が、特に重要である。
【０１０２】 さらに構築物中に紫外線発色団および質量分析学的増感基を含有することによ
り、固相合成の生成物の迅速で単純な定性分析および定量分析を、紫外線検出お
よび質量分析と組合せた単純で十分に確立されているHPLC法によって着手するこ
とができることが、実施例から理解することできる。
【０１０３】実施例２ 紫外線発色団としてダンシル基を含む構築物の合成および分析 固相構築物を、下記のスキーム４に示すように塩基で開裂可能なエステル基、
ジアミノエチルスペーサー基、酸で開裂可能なRinkリンカーおよびダンシル基を
ともにカップリングさせることによって水酸化ポリスチレン樹脂上に形成した。
【０１０４】スキーム４
【化１０】
【０１０５】2A. ブロモアセチル化樹脂(10)の調製 1％DVBを含む置換度が0.87mmde/g(Novabiochemから入手-バッチ 01.64.0110(1
g、0.87mmolのローディング = 1等量)）である水酸化ポリスチレン樹脂9(100〜2
00メッシュ)の無水ジメチルホルムアミド(12ml)懸濁液に、ブロモ酢酸12C(0.6g
、5等量)、ブロモ酢酸13C(0.65g、5等量)、4-ジメチルアミノピリジン(DMAP)(触
媒量)およびジ-イソプロピルカルボジイミド(DIC)(1.4ml、10等量)を添加した。
混合物を室温で24時間攪拌した。樹脂を濾過し、ジメチルホルムアミド(2 x 10m
l)、ジクロロメタン(5 x 10ml)、メタノール(2 x 10ml)、再度ジクロロメタン(2
x 10ml)で洗浄し、次いで減圧下で乾燥した。樹脂上のブロモアセチル基の存在
をゲル相13C NMR分光法によってチェックし、確認した。 ゲル相13C NMR(C6D6)：25.82 (1C)。
【０１０６】2B. ジアミノエタンスペーサー基を含む樹脂(11)の調製 樹脂(10)(0.95g、0.83mmol = 1等量)の懸濁液を、無水メチルスルホキシド(10
ml)中に形成し、N-Boc-ジアミノエチレン(1.3ml、8.3mmol = 10等量)を添加し、
混合物を室温で24時間攪拌した。得られた樹脂(11)を濾過し、DMSO(2 x 10ml)、
ジクロロメタン(5 x 10ml)、メタノール(2 x 10ml)、ジクロロメタン(5 x 10ml)
で洗浄し、次いで減圧下で乾燥した。第2級アミンに関するクロラニル試験は、
陽性であった。 マジック角試料回転(Magic angle spinning：MAS) 1H NMR(CD2Cl2)：5.06(2H, b
w)；3.41(2H, bw)；3.14(2H, m)；2.69(2H, m)；1.42(9H, s) 元素分析(窒素％)：N％理論値 = 2.38；N％実験値 = 2.28。
【０１０７】2C. ダンシル発色団を含む樹脂(12)の調製 樹脂(11)(0.85g、0.74mmol = 1等量)および塩化ダンシル(2g、1.48mmol = 10
等量)の無水テトラヒドロフラン(10ml)懸濁液に、ジイソプロピルエチルアミン(
1.93ml、11.1mmol = 15等量)を添加し、得られた混合物を室温で24時間攪拌した
。このようにして形成された樹脂(12)を濾過し、テトラヒドロフラン(2 x 10ml)
、ジクロロメタン(5 x 10ml)、メタノール(2 x 10ml)、ジクロロメタン(5 x 10m
l)で洗浄し、減圧下で乾燥した。樹脂(12)に関して行ったクロラニル試験が陰性
であったことから、第2級アミン部位の全てがダンシル化されたことが確認され
た。 MAS 1H NMR(CD2Cl2)：8.49(1H, bs)；8.25(1H, bs)；8.15(1H, bs)；7.48(2H, b
m)；4.15(2H, bs)；3.39(2H, bs)；3.16(2H, bs)；2.81(6H, bs)；1.37(9H, bs)
。
【０１０８】2D. 樹脂(14)を得るための樹脂(12)の脱保護および樹脂(12)とRinkリンカーと
のカップリング 樹脂(12)(0.74mmol、1等量)の無水ジクロロメタン(10ml)懸濁液に、トリフル
オロ酢酸(2ml)を添加し、混合物を室温で24時間攪拌した。得られた樹脂13を濾
過し、ジクロロメタン(5 x 10ml)、メタノール(2 x 10ml)、ジクロロメタン(5 x
10ml)で洗浄し、減圧下で乾燥した。第1級アミンの存在を明らかにするために
行ったKaiser試験は陽性であった。
【０１０９】 Rinkリンカー(3.9g、10等量)の無水ジメチルホルムアミド(5ml)溶液に、HOBT(
0.97g、10等量)およびDIC(1.15ml、10等量)を添加し、得られた混合物を室温で1
5分間攪拌し、樹脂(13)のジメチルホルムアミド(5ml)およびジイソプロピルアミ
ン(0.250ml、2等量)懸濁液に添加した。混合物を室温で24時間攪拌した。このよ
うにして生産された樹脂(14)を濾過し、ジメチルホルムアミド(2 x 10ml)、ジク
ロロメタン(5 x 10ml)、メタノール(2 x 10ml)、ジクロロメタン(5 x 10ml)で洗
浄し、減圧下で乾燥した。樹脂(14)のKaiser試験は陰性であり、これによって樹
脂(13)の第1級アミノ基がRinkリンカーと完全に反応したことが確認された。
【０１１０】2E. 樹脂(16)を得るための樹脂(14)の脱保護および基質とのカップリング 樹脂(14)(49mg、24.5μmol = 1等量)を、20％ピペリジンのジメチルホルムア
ミド溶液(2ml)に懸濁し、懸濁液を2時間攪拌した。得られた樹脂(15)を濾過し、
ジメチルホルムアミド(2 x 10ml)、ジクロロメタン(5 x 10ml)、メタノール(2 x
10ml)、ジクロロメタン(5 x 10ml)で洗浄し、減圧下で乾燥した。Fmoc基を検出
するための紫外線分析により、第1級アミン(15)を遊離するための開裂反応が定
量的であったことが明らかとなった。第1級アミン基の存在は、Kaiser試験が陽
性であったことから確認された。
【０１１１】 4-ベンゾイル安息香酸(55.4mg、10等量)の無水ジメチルホルムアミド(0.5ml)
溶液に、HOBT(33mg、10等量)およびDIC(40μl、10等量)を添加し、得られた混合
物を室温で15分間攪拌し、樹脂(15)のジメチルホルムアミド(0.5ml)懸濁液に添
加した。混合物を室温で20時間攪拌した。得られた樹脂16を濾過し、ジメチルホ
ルムアミド(2 x 10ml)、ジクロロメタン(5 x 10ml)、メタノール(2 x 10ml)、ジ
クロロメタン(5 x 10ml)で洗浄し、減圧下で乾燥した。樹脂(16)のKaiser試験は
陰性であり、これによってアシル化反応が完了し、第1級アミンが残っていない
ことが確認された。
【０１１２】2F. ダンシル基と基質とを含む構築物の樹脂からの開裂 樹脂(16)(45mg、推定ローディング 0.5017mmol/g= >22.58μmol = 1等量)のテ
トラヒドロフラン(0.4ml)懸濁液に1N水酸化ナトリウム溶液(45μl、2等量)を添
加し、混合物を室温で24時間攪拌した。樹脂を濾過し、テトラヒドロフランなら
びに水で洗浄した。濾液を蒸発させて化合物(17)をナトリウム塩の形態で得た。
【０１１３】
【０１１４】 ダンシル発色団含有化合物(17)の分析を、実施例1Fおよび1Gに記載の方法と同
様の方法で行うことができる。
【０１１５】実施例３ 紫外線発色団としてダンシル基を含む第2構築物の調製 発色団としてダンシル基を含む第2構築物を調製した。構築物に至るまでのス
テップの順序を下記のスキーム５に示す。スキーム５から判るように、該構築物
は、スルホンアミドリンカー基が分析断片の遊離を可能にする第1開裂部位を提
供し、Rinkリンカーが基質の遊離を可能にする第2開裂部位を提供するという点
で実施例１の構築物に類似している。しかしながら本実施例において、発色団は
、スルホンアミド窒素に連結される以外にエチレンジアミン鎖とRinkリンカーと
の間に位置するリシン基に結合されている。
【０１１６】スキーム５
【化１１】
【０１１７】スキーム５に関する実験 以下の実験の詳細における化合物または構築物の番号は、スキーム５で特定す
る化合物および構築物を意味する。
【０１１８】化合物(3a)の調製
【化１２】 2-ニトロ-4-メチルベンゾエートスルホニルクロリド(1)(1.10g、3.90mmol)お
よびトリエチルアミン(0.39g、3.90mmol)の無水ジクロロメタン(40ml)溶液を攪
拌しながら、これにアミン(2a)(1.00g、3.9mmol)を含む無水ジクロロメタン(20m
l)を0℃にて30分間かけて添加した。反応混合物を室温でさらに2時間攪拌し、次
いで真空下で濃縮することで黄色油状物を得た。[MTBE：ヘキサン(1：1)]を溶出
剤として用いてクロマトグラフィーにより精製し、MTBE(5ml)およびヘキサン(2m
l)からの再結晶化によって、スルホンアミド(3a)(1.53g、79％)を白色フレーク
として得た。融点129〜130℃；Rf 0.31 [MTBE：ヘキサン(1：1)]；
【０１１９】化合物(4a)の調製
【化１３】 エステル(3a)(0.40g、0.80mmol)を含むメタノール(2ml)を、1M水酸化ナトリウ
ム水溶液(1.60ml、1.60mmol)で処理し、室温で1時間攪拌した。次いで反応物を
真空下で濃縮し、残留物を水(10ml)に溶解し、さらに1M塩酸(1.80ml、1.80mmol)
を用いて0℃にて酸性化した。得られた白色沈殿物をジクロロメタン(3 x 10ml)
で抽出した。合わせた有機抽出物をブラインで洗浄し乾燥させ(Na2SO4)、減圧下
で蒸発させることで酸(4a)(0.34g、88％)を白色固体として得た。融点143〜145
℃；RF 0.58 [MTBE：ヘキサン(1：1)];
【０１２０】化合物(3b)の調製
【化１４】 2-ニトロ-4-メチルベンゾエートスルホニルクロリド(1)(1.10g、3.90mmol)お
よびトリエチルアミン(0.39g、3.90mmol)の無水ジクロロメタン(40ml)溶液を攪
拌しながら、これにアミン(2b)(0.95g、3.9mmol)を含む無水ジクロロメタン(20m
l)を0℃にて30分間かけて添加した。反応混合物を室温でさらに3時間攪拌し、次
いで真空下で濃縮することで黄色油状物を得た。[MTBE：ヘキサン(1：1)]を溶出
剤として用いてクロマトグラフィーにより精製し、MTBE(5ml)およびヘキサン(2m
l)からの再結晶化によって、スルホンアミド(3b)(1.51g、79％)を白色フレーク
として得た。融点131〜132℃；Rf 0.28 [MTBE：ヘキサン(1：1)]；
【０１２１】化合物(4b)の調製
【化１５】 エステル(3b) (0.40g、0.80mmol)を含むメタノール(2ml)を、1M水酸化ナトリ
ウム水溶液(1.60ml、1.60mmol)で処理し、室温で1時間攪拌した。次いで反応物
を真空下で濃縮し、残留物を水(10ml)に溶解し、さらに1M塩酸(1.80ml、1.80mmo
l)を用いて0℃にて酸性化した。得られた白色沈殿物をジクロロメタン(3 x 10ml
)で抽出した。有機抽出物を合わせてブラインで洗浄し乾燥させ(Na2SO4)、減圧
下で蒸発させることで酸(4b)(0.36g、93％)を白色固体として得た。融点123.7〜
124.8℃；RF 0.59 [MTBE：ヘキサン(1：1)];
【０１２２】化合物(5)の調製
【化１６】 ビーズ直径が150μmであり、0.4mmolg-1のローディングを有するアミン樹脂(A
rgogel-NH2)(0.80g、0.32mmol)のDMF(4ml)およびジクロロメタン(4ml)懸濁液に
、安息香酸(4a)(0.46g、0.96mmol)および安息香酸(4b)(0.46g、0.96mmol)を添加
し、次いでPyBOP(0.99g、1.92mmol)、さらにHOBT(0.26g、1.92mmol)を添加し、
その4分後にHunig塩基(0.49g、3.84mmol)を添加した。反応物を窒素を用いて18
時間攪拌し、次いで樹脂をジクロロメタン(6 x 10ml)、DMF(6 x 10ml)、ジクロ
ロメタン(6 x 10ml)、エーテル(2 x 10ml)で洗浄し、真空下で乾燥させることで
スルホンアミド樹脂(5)(0.94g、97％)を黄色固体として得た。Kaiser試験は陰性
であり、さらにブロモフェノールブルー試験は陰性であった。
【０１２３】化合物(6)の調製
【化１７】 保護された樹脂(5) (0.85g、0.34mmol)をジクロロメタン(2ml)に懸濁し、トリ
フルオロ酢酸(2 x 4ml)で5分間処理した。溶媒を濾過により除去し、樹脂を10％
DIPEAのDMF溶液(3 x 5ml)、ジクロロメタン(6 x 5ml)、DMF(6 x 5ml)、ジクロロ
メタン(6 x 5ml)、エーテル(2 x 5ml)で洗浄した。次いでアミン樹脂をDMF(4ml)
に懸濁し、ジクロロメタン(2ml)FMoc-Lys(Dde)-OH(0.86g、1.62mmol)を添加し、
次いでPyBOP(0.84g、1.62mmol)およびHOBT(0.22g、1.62mmol)を添加した。4分後
、Hunig塩基(0.42g、3.24mmol)を添加した。反応物を、窒素を用いて18時間攪拌
し、次いで樹脂をジクロロメタン(6 x 10ml)、DMF(6 x 10ml)、ジクロロメタン(
6 x 10ml)、エーテル(2 x 10ml)で洗浄し、さらに真空下で乾燥させることでス
ルホンアミド樹脂6(0.96g、100％)を黄色固体として得た。Kaiser試験は、陰性
であり、さらにブロモフェノールブルー試験は陰性であった。定量的Fmoc基開裂
によって評価すると、99％がローディングする樹脂であった。
【０１２４】化合物(7)の調製
【化１８】 樹脂(6)(0.93g、0.28mmol)を、20％ピペリジンのDMF溶液(2 x 5ml)で10分間処
理した。溶媒を濾過により除去し、樹脂をDMF(6 x 5ml)、ジクロロメタン(6 x 5
ml)およびエーテル(2 x 4ml)で洗浄した。樹脂をDMF(5ml)およびジクロロメタン
(5ml)に懸濁し、Rink酸リンカー(0.92g、1.62mmol)を添加し、次いでPyBOP(0.84
g、1.62mmol)およびHOBT(0.22g、1.62mmol)を添加した。4分後、Hunig塩基(0.42
g、3.24mmol)を添加した。反応物を、窒素を用いて3時間攪拌し、次いで樹脂を
ジクロロメタン(6 x 5ml)、DMF(6 x 5ml)、ジクロロメタン(6 x 5ml)、エーテル
(2 x 3ml)で洗浄し、さらに真空下で乾燥させることでスルホンアミド樹脂(7)(1
.02g、98％)を黄色固体として得た。Kaiser試験は、陰性であり、さらにブロモ
フェノールブルー試験は陰性であった。定量的Fmoc基開裂によって評価すると、
94％をローディングする樹脂であった。
【０１２５】化合物(9a-d)および(10a-d)の調製
【化１９】 樹脂(7)(70mg、0.02mmol)を、20％ピペリジンのDMF溶液(2 x 1ml)で10分間処
理した。溶媒を濾過により除去し、樹脂をDMF(6 x 1ml)、ジクロロメタン(6 x 1
ml)、エーテル(2 x 1ml)で洗浄した。樹脂をDMF(0.5ml)およびジクロロメタン(0
.5ml)に懸濁し、適当な酸(8a-d)(0.15mmol)を添加し、次いでPyBOP(0.08g、0.15
mmol)およびHOBT(0.02g、0.15mmol)を添加した。4分後、Hunig塩基(0.04g、0.30
mmol)を添加した。反応物を、窒素を用いて3時間攪拌し、次いで樹脂をジクロロ
メタン(6 x 1ml)、DMF(6 x 1ml)、ジクロロメタン(6 x 1ml)、エーテル(2 x 1ml
)で洗浄し、さらに真空下で乾燥させることでスルホンアミド樹脂(9a-d)を黄色
固体として得た。Kaiser試験およびブロモフェノールブルー試験は、4種すべて
の場合において陰性であった。
【０１２６】 各々4種の樹脂の少量のサンプルを、DBU/メルカプトエタノールを含むアセト
ニトリルで処理し(10a-d)を遊離し、これらを低解像度の質量分析およびRP HPLC
(方法A)によって分析した： 10a(R' = Z-Gly-) MS(エレクトロスプレー + ve) m/z 961および963(MH)+；HPLC
, Rt 4.01分。 10b(R' = Boc-Abu-) MS(エレクトロスプレー + ve) m/z 955および957(MH)+；HP
LC, Rt 4.09分。 10c(R' = 1-ナフチルアセトイル-) MS(エレクトロスプレー + ve) m/z 938およ
び939(MH)+；HPLC, Rt 4.28分。 10d(R' = Boc-Phe-) MS(エレクトロスプレー + ve) m/z 1017および1019(MH)+；
HPLC, Rt 4.42分。
【０１２７】化合物(11a-d)および(12a-d)の調製
【化２０】 樹脂(9a-d)(約70mg、0.02mmol)を、10％ヒドラジンのDMF溶液(3 x 1ml)で30分
間処理した。溶媒を濾過により除去し、各々の樹脂をDMF(6 x 1ml)、ジクロロメ
タン(6 x 1ml)、エーテル(2 x 1ml)で洗浄した。次いで各々の樹脂の一部分に、
塩化ダンシル(40mg、0.15mmol)およびトリエチルアミン(15mg、0.15mmol)を含む
ジクロロメタン(1ml)を添加した。4時間の反応時間後に、樹脂をジクロロメタン
(6 x 1ml)、DMF(6 x 1ml)、ジクロロメタン(6 x 1ml)、エーテル(2 x 1ml)で洗
浄し、さらに真空下で乾燥させることでスルホンアミド樹脂(11a-d)を黄色固体
として得た。Kaiser試験およびブロモフェノールブルー試験は、4種すべての場
合において陽性であった。
【０１２８】 各々4種の樹脂の少量のサンプルを、DBU/メルカプトエタノールを含むアセト
ニトリルで処理し（12a-d）を遊離し、これらを低解像度の質量分析およびRP HP
LC(方法B)によって分析した： 12a(R' = Z-Gly-) MS(エレクトロスプレー + ve) m/z 1030および1032(MH)+；HP
LC, Rt 4.77分。 12b(R' = Boc-Abu-) MS(エレクトロスプレー + ve) m/z 1024および1026(MH)+；
HPLC, Rt 4.94分。 12c(R' = 1-ナフチルアセトイル-) MS(エレクトロスプレー + ve) m/z 1007およ
び1009(MH)+；HPLC, Rt 5.47分。 12d(R' = Boc-Phe-) MS(エレクトロスプレー + ve) m/z 1086および1089(MH)+；
HPLC, Rt 5.82分。
【０１２９】 構築物中に紫外線発色団および質量分析学的増感基を含有させることにより、
固相合成の生成物の迅速で単純な定性分析および定量分析を、単純かつ十分に確
立されているHPLC法を紫外線検出および質量分析と組合せることによって着手す
ることができることが、上記の実施例から理解することできる。
【０１３０】 上記の実施例は、単に本発明の実例として意図されたものであり、いかなる場
合においても本発明を限定することは意図されていない。一方で数多くの改変と
変更を、本発明の根底にある原理を逸脱することなく上記実施例に記載の構築物
に行うことできることは、容易に明らかであろう。さらにかかる改変と変更のす
べては、本出願によって包含されることを意図する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 21/27 Ｇ０１Ｎ 21/27 Ｚ 21/64 21/64 Ｆ 27/62 27/62 Ｖ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 カール，ロビン，アーサー，エリス イギリス国 エスジー１ ２エヌワイ ハ ートフォードシャイヤー， スティーヴネ イジ， ガンネルズ ウッド ロード， グラクソ ウエルカム ピーエルシー (72)発明者 ゲハン，シルヴィー イタリア国 アイ−37135 ヴェローナ， ヴィア アレッサンドロ フレミング ２， グラクソ ウエルカム エスピーエ ー (72)発明者 ケイ，コリン イギリス国 エスジー１ ２エヌワイ ハ ートフォードシャイヤー， スティーヴネ イジ， ガンネルズ ウッド ロード， グラクソ ウエルカム ピーエルシー (72)発明者 パイオ，アルフレッド イタリア国 アイ−37135 ヴェローナ， ヴィア アレッサンドロ フレミング ２， グラクソ ウエルカム エスピーエ ー (72)発明者 ウイリアムズ，ジャッフリー，マーチン イギリス国 シービー２ １イーダブリュ ケンブリッジ， レンスフィールド ロ ード， ザ ユニバーシティー オブ ケ ンブリッジ， ユニバーシティー ケミス トリー ラボラトリーズ， グラクソ ウ エルカム ケミストリー ラボラトリー (72)発明者 ザラメラ，アレッシオ イタリア国 アイ−37135 ヴェローナ， ヴィア アレッサンドロ フレミング ２， グラクソ ウエルカム エスピーエ ー Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA14 BA16 CA05 CA06 DA02 EA01 EA13 GA28 GB28 2G059 AA01 BB08 BB09 CC12 CC16 DD01 DD03 EE12 HH02 HH03 HH04 HH06 PP10 4H006 AA01 AA03 AB92

Claims (34)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 固相構築物の分析方法であって、 (i) 連結基Yを介して基質Rが連結されている固体支持体Qを含む化学構築物を
    用意するステップ；ここで連結基Yは垂直且つ選択的に開裂可能な第１開裂部位
    および第２開裂部位を有し；第２開裂部位は選択的に開裂されて基質を遊離する
    ことが可能であり；そして第１の開裂部位は第２開裂部位と固体支持体との間に
    配置されており、且つ選択的に開裂されて基質および連結基Yの少なくとも一部
    分を含む断片Fruを遊離することが可能であり、連結基Yの該部分は紫外線、可視
    または蛍光分光光度法による断片Fruの分析を容易にする発色団Cuを含んでいる
    ； (ii) 連結基Yを第１開裂部位で開裂して断片Fruを遊離させるステップ；およ
    び (iii) 断片Fruを紫外線、可視または蛍光分光光度分析に供して基質Rを定量す
    るステップ、 を含む方法。
  2. 【請求項２】 発色団Cuの主logEmax値が少なくとも2.5である、請求項１に
    記載の方法。
  3. 【請求項３】 発色団Cuの主logEmax値が基質Rの主logEmaxよりも少なくと
    も1.5倍大きい、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 発色団Cuの主logEmax値が基質Rの主logEmaxよりも少なくと
    も２倍大きい、請求項２または３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 発色団Cuが、基質Rに帰属するいずれの有意な吸収バンドか
    らも遠隔の吸収バンドを有するものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載
    の方法。
  6. 【請求項６】 分光光度分析を発色団の主Emaxに対応する波長で行う、請求
    項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 【請求項７】 分光光度分析を発色団の主でない吸収バンドに対応する波長
    で行う、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】 連結基Yを介して基質Rが連結されている固体支持体Qを含む
    、固相合成で使用するための化学構築物であって；ここで連結基Yは垂直且つ選
    択的に開裂可能な第１開裂部位および第２開裂部位を有し；第２開裂部位は選択
    的に開裂されて基質を遊離することが可能であり；そして第１の開裂部位は第２
    開裂部位と固体支持体との間に配置されており、且つ選択的に開裂されて基質お
    よび連結基Yの少なくとも一部分を含む断片Fruを遊離することが可能であり、連
    結基Yの該部分は紫外線、可視または蛍光分光光度法による断片Fruの分析を容易
    にする発色団Cuを含んでおり、発色団Cuの主logEmax値は少なくとも2.5であり、
    (i) 発色団Cuの主logEmax値は基質Rの主logEmaxよりも少なくとも1.5倍大きいか
    、または(ii) 発色団Cuは基質Rに帰属する吸収から遠隔の波長に吸収ピークを有
    するものである、化学構築物。
  9. 【請求項９】 発色団Cuの主logEmaxが基質Rの主logEmaxよりも少なくとも
    ２倍大きい、請求項７に記載の化学構築物。
  10. 【請求項１０】 連結基Yを介して基質Rが連結されている固体支持体Qを含
    む、固相合成で使用するための化学構築物であって；ここで連結基Yは垂直且つ
    選択的に開裂可能な第１開裂部位および第２開裂部位を有し；第２開裂部位は選
    択的に開裂されて基質を遊離することが可能であり；そして第１開裂部位は第２
    開裂部位と固体支持体との間に配置されており、且つ選択的に開裂されて基質お
    よび連結基Yの少なくとも一部分を含む断片Fruを遊離することが可能であり、連
    結基Yの該部分は紫外線、可視または蛍光分光光度法による断片Fruの分析を容易
    にする発色団Cuを含んでおり、発色団Cuと基質Rは、所定の測定波長での基質R(
    またはいずれかの断片もしくは断片を含む構築物)の量の測定における、発色団
    に帰属する吸収バンドと基質Rに帰属する吸収バンドとのあらゆるオーバーラッ
    プから生じる誤差がいずれも５％未満であるような吸収特性を有する、化学構築
    物。
  11. 【請求項１１】 発色団が縮合多環式アリール基を含む基である、請求項８
    〜１０のいずれか１項に記載の化学構築物。
  12. 【請求項１２】 多環式アリール基が、１個以上(例えば１、２または３個
    ）の環構成炭素原子が窒素、硫黄または酸素のようなヘテロ原子で置換されてい
    てもよいC6〜C30の多環式アリール基である、請求項１１に記載の化学構築物。
  13. 【請求項１３】 多環式アリール基が、ナフチル基、フェナントレニル基お
    よびアントラセニル基のような多環式炭化水素、ならびにアクリジンもしくはフ
    ェナントロリンのような多環式ヘテロアリール基から選択される、請求項１２に
    記載の化学構築物。
  14. 【請求項１４】 発色団がアントラセニル基を含む、請求項１３に記載の化
    学構築物。
  15. 【請求項１５】 発色団がダンシル(5-ジメチルアミノ-1-ナフチルスルホニ
    ル)基を含む、請求項１２に記載の化学構築物。
  16. 【請求項１６】 断片Fruが質量分光分析学的増感基Gを含む、請求項８〜１
    ５のいずれか１項に記載の化学構築物。
  17. 【請求項１７】 化学断片Fruが、特徴的なサインを該断片の質量スペクト
    ルに付与するための手段を含む、請求項８〜１６のいずれか１項に記載の化学構
    築物。
  18. 【請求項１８】 特徴的なサインを断片Fruの質量スペクトルに付与するた
    めの手段が第１開裂部位と第２開裂部位との間に配置されている、請求項１６に
    記載の化学構築物。
  19. 【請求項１９】 第１開裂部位および第２開裂部位が、第１リンカー基L1お
    よび第２リンカー基L2によって規定される、請求項８〜１８のいずれか１項に記
    載の化学構築物。
  20. 【請求項２０】 ２つのリンカー基L1およびL2の間にスペーサー基Aが挿入
    されており、スペーサー基Aが特徴的なサインを断片Fruの質量スペクトルに付与
    するための手段を含む、請求項１９に記載の化学構築物。
  21. 【請求項２１】 質量分光分析学的条件下でイオン化可能な基である増感基
    Ｇを含む、請求項８〜２０のいずれか１項に記載の化学構築物。
  22. 【請求項２２】 質量分光分析学的条件下、例えばエレクトロスプレー質量
    分光分析学的条件下で基Ｇがイオン化して陽イオンを形成可能である、請求項２
    １に記載の化学構築物。
  23. 【請求項２３】 固相構築物の分析方法であって、 (i) 連結基Yを介して基質Rが連結されている固体支持体Qを含む化学構築物を
    用意するステップ、ここで基質Rは各固体支持体上に10ナノモル以下の量で存在
    しており；連結基Yは垂直且つ選択的に開裂可能な第１開裂部位および第２開裂
    部位を有し；第２開裂部位は選択的に開裂されて基質を遊離することが可能であ
    り；そして第１の開裂部位は第２開裂部位と固体支持体との間に配置されており
    、且つ選択的に開裂されて基質および連結基Yの少なくとも一部分を含む断片Fru を遊離することが可能であり、連結基Yの該部分は紫外線、可視または蛍光分光
    光度法による断片Fruの分析を容易にする発色団Cuを含んでいる； (ii) １個の固体支持体、または20個を超えない複数個の固体支持体を分離す
    るステップ； (ii) 固体支持体を処理することによって、連結基を第１開裂部位で開裂して
    基質Rを含む断片Fruを遊離させるステップ；および (Iii) 断片Fruを紫外線、可視または蛍光分光光度分析に供して基質Rを定量す
    るステップ、 を含む方法。
  24. 【請求項２４】 固体支持体Qが平均径90μm〜250μmの樹脂ビーズである、
    請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 基質Rが各固体支持体上に５ナノモル未満の量で存在して
    いる、請求項２３または２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 基質Rが各固体支持体上に２ナノモル未満の量で存在して
    いる、請求項２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 分離される固体支持体の数が10個未満、例えば５個未満で
    ある、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 １個の固体支持体を分離し、開裂に供する、請求項２７に
    記載の方法。
  29. 【請求項２９】 連結基Y、発色団Cuおよび断片Fruが請求項８〜２２のいず
    れか１項で定義したとおりである、請求項１〜７および２３〜２８のいずれか１
    項に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 請求項８〜２２のいずれか１項で定義した複数の化学構築
    物を含むライブラリーを作成し、該ライブラリーを生物学的試験に供して生物学
    的に活性な基質を同定することを含む、薬学的に有用な基質を同定する方法。
  31. 【請求項３１】 同定された生物学的に活性な基質を製薬上許容される担体
    とともに製剤化して医薬組成物を製造するさらなるステップを含む、請求項３０
    に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 式Q-Y'(式中、Y'は反応形態または保護形態の基Yである)
    で表される、請求項８〜２２のいずれか１項に定義した化学構築物の作成に使用
    するための化学構築物中間体。
  33. 【請求項３３】 式Q-L1-AP(式中、QおよびL1は請求項８〜２２のいずれか
    １項で定義したとおりであり、APは発色団Cuを含み且つピーク分裂同位体標識を
    含んでいてもよい反応形態または保護形態のスペーサー基Aである)で表される構
    築物中間体。
  34. 【請求項３４】 一般式Q-L1-N(Alk-Cu)-Alk-NH-X1(式中、Alkはアルキレン
    基であり、X1は水素またはアラルキル基である)で表される請求項３３に記載の
    構築物中間体。
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