JP2003510338A - 形態形成タンパク質、ホルモンおよびホルモンレセプターを使用する、組成物および治療方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、哺乳動物において組織形成を誘導するためのデバイスおよび方法を特徴とする。これらのデバイスおよび方法は、形態形成タンパク質、ホルモン、およびそのホルモンの可溶性レセプターの使用を包含する。ホルモンおよびそのレセプターを使用して、形態形成タンパク質の組織誘導活性を増強する。一実施形態では、哺乳動物中の標的位置での形態形成タンパク質の組織誘導能力を改善する本発明の方法は、標的位置に、形態形成タンパク質と、第１有効量のホルモンと、第２有効量の該ホルモンの可溶性レセプターとを投与する工程を包含し、ここで、形態形成タンパク質は、哺乳動物中の前駆細胞に到達可能である場合に組織形成を誘導し得、そしてホルモンおよびレセプターは共同して、その能力を増強する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） トランスホーミング増殖因子−β（「ＴＧＦ−β」）スーパーファミリーは、
増殖、分化、組織の形態形成および修復において多様な活性を有する、多数の進
化的に保存された形態形成タンパク質を表す。このスーパーファミリーとしては
、骨形成タンパク質（「ＯＰ」）および骨形態形成タンパク質（「ＢＭＰ」）が
挙げられる。ＯＰおよびＢＭＰは、それらのＣ末端付近の高度に保存された生物
活性システインリッチドメインを共有し、そしてホモダイマーおよびヘテロダイ
マーを形成する傾向を有する。

【０００２】 ＢＭＰファミリーに属する多くの形態形成タンパク質が、記載されている。い
くつかは、骨形成活性に基づく精製技術を使用して単離された。他は、ＢＭＰフ
ァミリーに共通の保存領域内におけるＤＮＡ配列相同性によって同定され、そし
てクローニングされた。これらのホモログは、それらが実証可能な骨形成活性を
有しても有さなくても、連続的に番号付けられたＢＭＰとして言及されている。
ＢＭＰファミリーの初期のメンバーのいくつかは、新たな軟骨および骨を誘導す
るそれらの能力によって同定されたが、他の多くのＢＭＰは、異なる組織誘導能
力またはさらなる組織誘導能力を有している。例えば、ＢＭＰ−１２およびＢＭ
Ｐ−１３（ＤＮＡ配列相同性により同定された）は報告によると、インビボにお
いて腱／靱帯様組織の形成を誘導する（ＷＯ ９５／１６０３５）。いくつかの
ＢＭＰ（その骨形成活性に基づいて元々単離されたもののいくつかを含む）は、
ニューロンの増殖を誘導し得、そして軸索の再生を促進し得る（ＷＯ ９５／０
５８４６；Ｌｉｅｍら，Ｃｅｌｌ，８２，９６９−７９頁（１９９５））。従っ
て、ＢＭＰは様々な潜在的組織誘導能力を有し得、それらの最終的な発現は発達
および環境の指示の複雑なセットに依存するようである。

【０００３】 哺乳動物ＢＭＰの多くが、種々の宿主系において活性なホモダイマーまたはヘ
テロダイマーとして組換え的に発現されており、形態形成タンパク質を用いる治
療的処置を実現可能なものとしている。骨の治癒および再生を促進する哺乳動物
骨形成タンパク質を含む、移植可能な骨形成デバイスが、記載されている（例え
ば、Ｏｐｐｅｒｍａｎｎら，米国特許第５，３５４，５５７号を参照のこと）。
いくつかの骨形成デバイスは、多孔性の生体適合性マトリックスを含む。このマ
トリックスは、骨形成タンパク質が移植部位へと拡散するのを可能にし、そして
前駆細胞の流入および流出を可能にする。補綴と既存の骨との間の結合強度を増
強する、骨形成タンパク質コーティング補綴デバイスもまた、記載されている（
Ｒｕｅｇｅｒら，米国特許第５，３４４，６５４号）。

【０００４】 （発明の要旨） 本発明は、形態形成タンパク質の組織誘導活性が、ホルモンの可溶性レセプタ
ーの存在下におけるホルモンによって増強され得るという発見に基づく。

【０００５】 従って、本発明は、哺乳動物の標的位置での形態形成タンパク質の組織誘導能
力を改善する方法を特徴とする。本方法では、標的位置に、形態形成タンパク質
と、第１有効量のホルモンと、第２有効量のこのホルモンの可溶性レセプターと
を投与する。ここで、この形態形成タンパク質は、この哺乳動物中の前駆細胞に
到達可能（ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）である場合に組織形成を誘導し得、そしてこ
のホルモンおよびこのレセプターは共同して、その能力を増強する。形態形成タ
ンパク質、ホルモンおよびホルモンレセプターは、標的位置に同時に投与され得
る。あるいは、この３つの成分は、任意の順序で別々に投与される；例えば、形
態形成タンパク質が最初に投与され得、次いで、ホルモンおよびホルモンレセプ
ターが、一緒に投与されるか；または、形態形成タンパク質およびホルモンが最
初に一緒に投与され、次いで、ホルモンレセプターが投与される。１つの実施形
態では、形態形成タンパク質は、核酸（例えば、プラスミド、ウイルスベクター
、または裸のＤＮＡ）を介して投与される。この核酸は、形態形成タンパク質を
コードする配列を含み、かつ患者の適切な前駆細胞中においてこの形態形成タン
パク質を発現し得る。

【０００６】 形態形成タンパク質は、ジスルフィド結合したサブユニット対を含んでダイマ
ー種を生成し得、ここでこのサブユニットの少なくとも１つが、ＢＭＰタンパク
質ファミリーに属するポリペプチドを含む。例えば、形態形成タンパク質は、参
照ＢＭＰ（例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ
−６、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭ
Ｐ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＣＯＰ−５またはＣＯＰ−７）のアミ
ノ酸配列と十分重複するアミノ酸配列を含み得、その結果これは、参照ＢＭＰの
形態形成活性と類似した形態形成活性を有する。１つの好ましい実施形態では、
形態形成タンパク質は、ＢＭＰ−２サブユニットまたはＢＭＰ−７（ＯＰ−１）
サブユニットを含む、ホモダイマーまたはヘテロダイマーである。

【０００７】 形態形成タンパク質は、組織形成を誘導し得る。例えば、形態形成タンパク質
は、腱／靱帯様組織、または神経様組織を形成するように、前駆細胞を誘導する
能力を有し得るか；あるいは、軟骨性骨もしくは膜性骨、または軟骨を形成する
ように、前駆細胞を誘導し得る骨形成タンパク質であり得る。従って、本発明の
方法を使用して、種々の組織欠損（例えば、骨、軟骨、軟部（ｓｏｆｔ ｔｉｓ
ｓｕｅ）、および神経組織の欠損）における組織の再生または修復を誘導し得る
。

【０００８】 本発明において有用なホルモンとしては、サイトカイン（例えば、インターロ
イキン１〜１８）、増殖因子（例えば、線維芽細胞増殖因子、血管内皮増殖因子
、血小板由来増殖因子、ＴＧＦ−β、またはプロスタグランジン）または形態形
成タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。

【０００９】 本発明はまた、形態形成タンパク質の組織誘導活性を改善するための、ホルモ
ンおよびその可溶性レセプターを含む薬学的組成物およびキットを特徴とする。
本発明はまた、同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）インプラントおよび異種（ｘ
ｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）インプラントにおける組織形成を誘導するための移植可能
な形態形成デバイスを提供する。このようなデバイスは、キャリア中に配置され
た形態形成タンパク質、ホルモンおよびその可溶性レセプターを含む。これらの
組成物およびデバイスを使用して、哺乳動物において前駆細胞から局所的組織形
成を誘導する方法もまた提供される。これらの形態形成デバイスを使用して、哺
乳動物において同種移植片修復を加速する方法が提供される。本発明はまた、形
態形成タンパク質、ホルモンおよびその可溶性レセプターでコーティングされた
補綴を備える補綴デバイス、ならびに、移植可能な補綴デバイスのインビボ組み
込みを促進して、関節部位での補綴と既存の標的組織との間の結合強度を増強す
る方法を提供する。この薬学的組成物を使用して、哺乳動物における組織変性状
態を処置する方法もまた提供される。

【００１０】 他に規定されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学
技術用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味
を有する。例示的な方法および材料を以下に記載するが、本明細書中に記載され
たものと類似または等価の方法および材料もまた、本発明を実施または試験する
において使用され得る。本明細書中に言及したすべての刊行物および他の参考文
献を、それらの全体において、参考として援用する。矛盾する場合には、定義を
含む本明細書が規制する。材料、方法および例は、例示のみであり、制限される
ことを意図しない。

【００１１】 本発明の他の特徴および利点は、以下の図面、詳細な説明、および特許請求の
範囲から明らかである。

【００１２】 （発明の詳細な説明） 本明細書中に記載された本発明が完全に理解され得るように、以下の詳細な説
明を記載する。

【００１３】 用語「生体適合性」とは、細胞性および体液性に関連した免疫応答、例えば、
炎症性応答および外来体線維性応答のような身体の種々の防御系に関連する有害
な効果を誘起しない物質をいう。この用語はまた、物質が患者に移植される場合
に、特定の望ましくない細胞障害性または全身性の影響が、その物質によって引
き起こされないことを意味する。

【００１４】 用語「ＢＭＰ」とは、ＤＮＡおよびアミノ酸配列相同性に基づいて規定される
、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのタンパク質のＢＭＰファミリーに属するタン
パク質をいう。本発明によれば、タンパク質は、ＢＭＰタンパク質ファミリーを
特徴づける保存されたＣ末端システインリッチドメイン内において、既知のＢＭ
Ｐファミリーメンバーと少なくとも５０％（例えば、少なくとも７０％または８
５％さえもの）アミノ酸配列相同性を有する場合、ＢＭＰファミリーに属する。
ＢＭＰファミリーのメンバーは、全体では、５０％より低いＤＮＡまたはアミノ
酸配列相同性を有し得る。

【００１５】 用語「形態形成タンパク質」とは、形態形成活性を有するタンパク質をいう。
例えば、このタンパク質は、増殖するように、そして／または局所環境の指示に
依存して、軟骨、骨、腱、靭帯、神経、または他の組織型の形成へと導く分化経
路を開始させるように、前駆細胞を誘導し得る。従って、本発明において有用な
形態形成タンパク質は、異なる環境では異なって挙動し得る。本発明の形態形成
タンパク質は、ＢＭＰファミリーに属する少なくとも１つのポリペプチドを含み
得る。

【００１６】 用語「骨形成タンパク質」とは、軟骨および／または骨を形成するように前駆
細胞を誘導し得る形態形成タンパク質をいう。骨は、膜性骨または軟骨性骨であ
り得る。ほとんどの骨形成タンパク質は、ＢＭＰタンパク質ファミリーのメンバ
ーであり、したがってＢＭＰでもある。しかし、逆は当てはまらないかもしれな
い。本発明によれば、配列相同性によって同定されたＢＭＰは、骨形成タンパク
質であるために、機能的バイオアッセイにおいて証明可能な骨形成活性または軟
骨形成活性を有さなければならない。

【００１７】 用語「形態形成活性」、「誘導活性」、および「組織誘導活性」とは、交換可
能に、必要に応じて細胞分化を導き得る１つ以上の細胞分裂（増殖）を受けるよ
うに標的細胞を刺激する因子の能力をいう。このような標的細胞は、本明細書で
は一般的に前駆細胞といわれる。細胞増殖は、代表的には、細胞周期調節の変化
によって特徴づけられ、そしてＤＮＡ合成または細胞増殖速度の測定を包含する
多くの手段によって検出され得る。細胞分化の初期は、代表的には、前駆細胞の
発現パターンに対する遺伝子発現パターンの変化によって特徴づけられ、このよ
うな変化は、特定の細胞発生運命または細胞型への方向付け（ｃｏｍｍｉｔｍｅ
ｎｔ）を示し得る。細胞分化の後期は、遺伝子発現パターン、細胞の生理および
形態の変化によって特徴づけられ得る。遺伝子発現、細胞の生理または形態にお
ける任意の再現可能な変化が、形態形成タンパク質によって誘導される細胞分化
の開始および程度を評価するために使用され得る。

【００１８】 用語「相乗相互作用」とは、２つ以上の因子の組み合わされた効果が、この個
々の効果の代数学的合計よりも大きい相互作用をいう。

【００１９】 用語「ホルモン／レセプター対」は、ホルモンとその可溶性レセプターとの組
み合わせをいう。ホルモン（例えば、サイトカイン、増殖因子、または形態形成
タンパク質）は、任意の哺乳動物起源（例えば、ヒト、ウシ、またはマウス）で
あり得る。ホルモンの可溶性レセプターは、このホルモンに対して特異的に結合
する化合物であり、そして例えば、このホルモンのネイティブな細胞性レセプタ
ーのホルモン結合ドメイン（例えば、細胞外ドメイン）のみを含むポリペプチド
、このホルモンに特異的な抗体、またはこのホルモンと特異的に相互作用する化
合物であり得る。可溶性レセプターはまた、このホルモンに特異的に結合するド
メイン、およびこのホルモンのネイティブな細胞性レセプターに対して特異的に
結合する別のドメインを含む化合物（例えば、タンパク質）であり得、その結果
、可溶性レセプターは、そのネイティブな細胞性レセプターへのホルモンの結合
を促進する；このような可溶性レセプターの例は、ＩＧＦ−結合タンパク質であ
る。

【００２０】 （形態形成タンパク質） 本発明の形態形成タンパク質は、細胞の分裂および分化を受けるように前駆細
胞を刺激し得る。本発明の形態形成タンパク質は、ＴＧＦ−βタンパク質スーパ
ーファミリーに属し得、そして以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｏ
Ｐ−１，ＯＰ−２，ＯＰ−３，ＢＭＰ−２，ＢＭＰ−３，ＢＭＰ−３ｂ，ＢＭＰ
−４，ＢＭＰ−５，ＢＭＰ−６，ＢＭＰ−９，ＢＭＰ−１０，ＢＭＰ−１１，Ｂ
ＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３，ＢＭＰ−１４，ＢＭＰ−１５，ＧＤＦ−１，ＧＤＦ
−２、ＧＤＦ−３，ＧＤＦ−５，ＧＤＦ−６，ＧＤＦ−７，ＧＤＦ−８，ＧＤＦ
−９，ＧＤＦ−１０，ＧＤＦ−１１，ＧＤＦ−１２，ＤＰＰ，Ｖｇ−１，Ｖｇｒ
−１，６０Ａタンパク質，ＮＯＤＡＬ，ＵＮＩＶＩＮ，ＳＣＲＥＷ，ＡＤＭＰ，
ＮＥＵＲＡＬ，およびＴＧＦ−β。

【００２１】 １つの好ましい形態形成タンパク質がＯＰ−１である。ｈＯＰ−１のヌクレオ
チド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１および２に提供する。記
載を容易にするために、ｈＯＰ−１を代表的な形態形成タンパク質として記載す
る。ＯＰ−１が、モルフォゲンのファミリーの単なる例であることは、当業者に
よって理解される。

【００２２】 他の有用な形態形成タンパク質としてはまた、既知の形態形成タンパク質、特
に、ＢＭＰタンパク質ファミリーを特徴付ける保存されたＣ末端システインリッ
チドメインにおいて既知のＢＭＰと少なくとも５０％（例えば、少なくとも７０
％または８５％さえもの）配列相同性を有するポリペプチドが挙げられる。これ
らの形態形成タンパク質としては、任意の既知の形態形成タンパク質の生物学的
に活性な改変体（保存的アミノ酸変化を含む改変体を含む）が挙げられる。例え
ば、有用な形態形成タンパク質としては、ｈＯＰ−１のＣ末端の７−システイン
ドメイン（このドメインは、配列番号２のＣ末端の１０２〜１０６アミノ酸残基
に対応する）と少なくとも７０％のアミノ酸配列相同性を共有する配列を含むタ
ンパク質が挙げられる。Ｃ末端の１０２個のアミノ酸残基は、配列番号２の残基
３３０〜４３１に対応する。本発明の１つの実施形態では、形態形成タンパク質
は、ジスルフィド結合したサブユニット対から構成されてダイマー種を生成し、
このサブユニットの少なくとも１つが、ＢＭＰファミリーに属する組換えポリペ
プチドを含む。

【００２３】 本明細書中で使用される場合、「アミノ酸配列相同性」は、アミノ酸配列の同
一性および類似性の両方を含むように理解される。相同な配列は、同一および／
または類似のアミノ酸残基を共有し、ここで類似の残基とは、整列された参照配
列における対応のアミノ酸残基に対する保存的置換であるか、または「点変異を
許容」される。従って、参照配列と７０％のアミノ酸相同性を共有する候補ポリ
ペプチド配列は、整列残基の任意の７０％が、参照配列中の対応残基に対して同
一であるか、またはその保存的置換であるかのいずれかである配列である。特定
の特に好ましい形態形成タンパク質は、ヒトＯＰ−１のＣ末端の７−システイン
ドメインと少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％）のアミノ酸配列同一
性を共有する。

【００２４】 本明細書中で使用される場合、「保存的置換」は、対応する参照残基に対して
物理的または機能的に類似した残基である。すなわち、保存的置換およびその参
照残基は、類似したサイズ、形状、電荷、化学的特性（共有結合または水素結合
を形成する能力を含む）などを有する。好ましい保存的置換は、Ｄａｙｈｏｆｆ
ら，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅ ５：３４５−３５２（１９７８＆補遺）において、受容される点変
異を規定した判断基準を満たすものである。保存的置換の例は、以下の群内にお
ける置換である：（ａ）バリン、グリシン；（ｂ）グリシン、アラニン；（ｃ）
バリン、イソロイシン、ロイシン；（ｄ）アスパラギン酸、グルタミン酸；（ｅ
）アスパラギン、グルタミン；（ｆ）セリン、スレオニン；（ｇ）リシン、アル
ギニン、メチオニン；および（ｈ）フェニルアラニン、チロシン。用語「保存的
改変体」または「保存的バリエーション」もまた、所定の親アミノ酸配列中のア
ミノ酸残基に代わる置換アミノ酸残基の使用を含み、ここで親配列に対して特異
的な抗体はまた、結果として生じた置換ポリペプチド配列に対して特異的（すな
わち、「交差反応性」または「免疫反応性」）である。

【００２５】 アミノ酸配列相同性は、当該分野において周知の方法によって決定され得る。
例えば、７−システインドメインの配列に対する候補アミノ酸配列の％相同性を
決定するために、２つの配列を最初に整列する。アラインメントは、例えば、Ｎ
ｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）に記載
された動力学的プログラミングアルゴリズム、およびＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．
によって生産される市販のスフトウェアパッケージであるＡｌｉｇｎ Ｐｒｏｇ
ｒａｍでなされ得る。両方の供給源による教示が、本明細書中で参考として援用
される。最初のアラインメントは、関連タンパク質のファミリーの多重配列アラ
インメントに対する比較によって規定され得る。一旦、アラインメントが作製さ
れ、そして規定されると、％相同性スコアが算出される。２つの配列の整列され
たアミノ酸残基は、それらの互いに対する類似性について連続的に比較される。
類似性因子としては、類似したサイズ、形状、および電荷が挙げられる。アミノ
酸類似性を規定する１つの特に好ましい方法が、Ｄａｙｈｏｆｆら（前出）に記
載されたＰＡＭ２５０行列である。類似性スコアは、最初に、整列された対様式
（ｐａｉｒｗｉｓｅ）のアミノ酸類似性スコアの合計として算出される。挿入お
よび欠失は、％相同性および同一性の目的のためには無視される。従って、ギャ
ップペナルティー（ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）は、この計算には使用されない。
次いで、生スコア（ｒａｗ ｓｃｏｒｅ）が、それを候補配列のスコアおよび７
−システインドメインのスコアの相乗平均によって除算することによって正規化
される。相乗平均は、これらのスコアの結果の平方根である。正規化された生デ
ータは、％相同性である。

【００２６】 本明細書中において有用な形態形成タンパク質としては、任意の天然に存在す
る既知のネイティブタンパク質（対立遺伝子改変体、系統発生的対応物、および
それらの他の改変体を含む）が挙げられる。これらの改変体としては、ネイティ
ブタンパク質の種々のグリコシル化パターンを有する形態、種々のＮ末端を有す
る形態、および活性な短縮化（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）形態もしくは変異形態が挙
げられる。有用な形態形成タンパク質としてはまた、生合成により生成されたタ
ンパク質（例えば、「ムテイン」または「変異タンパク質」）および一般的な形
態形成ファミリーのタンパク質の新規な形態形成的に活性なメンバーであるタン
パク質が挙げられる。特に有用な配列としては、以下のアミノ酸残基のＣ末端９
６〜１０２を含む配列が挙げられる：ＤＰＰ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来），Ｖ
ｇ−１（Ｘｅｎｏｐｕｓ由来），Ｖｇｒ−１（マウス由来），ＯＰ−１およびＯ
Ｐ−２タンパク質（米国特許第５，０１１，６９１号），ならびに以下のように
言及されるタンパク質：ＢＭＰ−２，ＢＭＰ−３，ＢＭＰ−４（ＷＯ ８８／０
０２０５、米国特許第５，０１３，６４９号およびＷＯ９１／１８０９８），Ｂ
ＭＰ−５およびＢＭＰ−６（ＷＯ ９０／１１３６６），ＢＭＰ−８およびＢＭ
Ｐ−９。本発明の実施において有用な他のタンパク質としては、以下の活性形態
が挙げられる：ＯＰ１，ＯＰ２，ＯＰ３，ＢＭＰ−２，ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−３
ｂ，ＢＭＰ−４，ＢＭＰ−５，ＢＭＰ−６，ＢＭＰ−９，ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ
−１１、ＢＭＰ−１２，ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４，ＢＭＰ−１５，ＤＰＰ，
Ｖｇ−１，Ｖｇｒ−１，６０Ａタンパク質，ＧＤＦ−１，ＧＤＦ−２，ＧＤＦ−
３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６，ＧＤＦ−７，ＧＤＦ−８，ＧＤＦ−９，およびＧ
ＤＦ−１０，ＧＤＦ−１１，ＧＤＦ−１２，ＧＤＦ−１３、ＵＮＩＶＩＮ，ＮＯ
ＤＡＬ，ＳＣＲＥＷ，ＡＤＭＰ，ＮＥＵＲＡＬ，ならびにＴＧＦ−Ｐ。

【００２７】 本発明の形態形成タンパク質として有用な骨形成タンパク質としては、７−シ
ステインドメインと６０％より高い同一性を共有する配列を含むタンパク質が挙
げられる。他の実施形態では、有用な骨形成タンパク質は、本明細書中に規定さ
れる一般配列（ＯＰＸ（配列番号３）、および一般配列７（配列番号４）、８（
配列番号５）、９（配列番号６）、および１０（配列番号７）を含む）のいずれ
か１つを有する骨形成的に活性なタンパク質として規定される。

【００２８】 以下に開示される、一般配列７（配列番号４）および一般配列８（配列番号５
）は、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、
ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、６０Ａ，ＤＰＰ，Ｖｇ−１，Ｖｇｒ−１およびＧＤＦ
−１を含む、現在までに同定された好ましいタンパク質ファミリーメンバーの間
で共有される相同性を収容し得る。これらのタンパク質のアミノ酸配列は、本明
細書中に記載され、および／または当該分野において記載されている。一般配列
は、Ｃ末端の６−または７−システイン骨格ドメイン（それぞれ、一般配列７お
よび８に表される）中のこれらの配列によって共有される同一のアミノ酸残基を
含み、そしてこの配列中の可変位置に代替の残基を含む。一般配列は、分子間ま
たは分子内ジスルフィド結合が形成され得る、適切なシステイン骨格を提供する
。これらの配列は、フォールディングされたタンパク質の三次元構造に影響を及
ぼし得る特定の特異的アミノ酸を含む。さらに、一般配列は、３６位（一般配列
７）または４１位（一般配列８）においてさらなるシステインを許容し、それに
よって、ＯＰ−２およびＯＰ−３の生物学的に活性な配列を包含する。

【００２９】

【表１】 ここで、各Ｘａａを、独立して以下のように定義する（「Ｒｅｓ．」は「残基
」を意味する）。

【００３０】

【表２】 一般配列８（配列番号５）は、一般配列７を全て含み、そしてさらに以下５つ
のアミノ酸を、そのＮ末端に含む。

【００３１】

【表３】 したがって、残基７から始めると、一般配列８における各「Ｘａａ」は、一般配
列７について定義したのと同じ特定のアミノ酸である（一般配列７について記載
した各残基の数が、一般配列８では５つシフトされるという差異を有する）。例
えば、一般配列７の中の「Ｘａａ（ｒｅｓ．２）＝（ＴｙｒまたはＬｙｓ）」は
一般配列８でのＸａａ（ｒｅｓ．７）に対応する。

【００３２】 一般配列９（配列番号６）および一般配列１０（配列番号７）は、以下のタン
パク質の複合アミノ酸配列である。

【００３３】

【表４】 一般配列７のように、一般配列９はＣ末端の６−システイン骨格を収容し得、そ
して一般配列８のように、一般配列１０はＣ末端の７−システイン骨格を収容し
得る。

【００３４】

【表５】 ここで、各Ｘａａは、独立して以下のように定義される。

【００３５】

【表６】 さらに、ラットＢＭＰ３ｂおよびｍＧＤＦ−１０における残基５３の後ろにＩｌ
ｅが存在し；ＧＤＦ−１における残基５４の後ろにＴｈｒが存在し；ＢＭＰ−３
における残基５４の後ろにＶａｌが存在し；ＢＭＰ−８およびＤＯＲＳＡＬＩＮ
における残基７８の後ろにＧｌｙが存在し；ｈＧＤＦ−１における残基３７の後
ろにＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ、およびＰｒｏが存在する。

【００３６】 一般配列１０（配列番号７）は一般配列９を全て含み、そしてさらに以下５つ
のアミノ酸残基を、そのＮ末端に含む。

【００３７】

【表７】 したがって、残基６から始めると、一般配列１０における各「Ｘａａ」は、一般
配列９について定義された特定のアミノ酸である（一般配列９で記載した各残基
の数が、一般配列１０では５つシフトされるという差異を有する）。例えば、一
般配列９での「Ｘａａ（ｒｅｓ．１）＝（Ｐｈｅ，Ｌｅｕ，またはＧｌｕ）」は
一般配列１０でのＸａａ（ｒｅｓ．６）に対応する。

【００３８】 上述のように、本発明で使用する、特定の好ましい骨形態形成タンパク質は、
ｈＯＰ−１のＣ末端の７−システインドメインとの６０％を超える同一性、好ま
しくは６５％を超える同一性を有する。これらの特に好ましい配列としては、Ｄ
ｒｏｓｏｐｈｉｌａ ６０Ａタンパク質を含む、ＯＰ−１およびＯＰ−２タンパ
ク質の対立遺伝子の変異体および系統発生的変異体が挙げられる。従って、特定
の好ましい実施形態において、有用なタンパク質は、一般アミノ酸配列「ＯＰＸ
」（配列番号３）を有するダイマーを含む活性タンパク質を含む。これらは７−
システイン骨格を規定し、そしてＯＰ−１およびＯＰ−２の同定されたいくつか
の変異体の間で相同性を含み得る。ＯＰＸ中の各Ｘａａは、マウスまたはヒトの
ＯＰ−１またはＯＰ−２のＣ末端配列の対応する位置で生じる残基から、独立し
て選択される。

【００３９】

【表８】 別の実施形態において、形態形成タンパク質は以下の一般アミノ酸配列の種、

【００４０】

【表９】 または配列番号１０の残基６〜１０２を含む。この文字列は、アミノ酸残基の
標準的な一文字コードを示す。そしてＸは、任意のアミノ酸残基を示す。システ
イン残基を強調表示する。

【００４１】 前述の一般配列（配列番号１０）の中の、好ましいアミノ酸配列は、

【００４２】

【表１０】 である。ここで、本配列の各々の位置で垂直に配置されている各々のアミノ酸は
、種々の組み合わせとして代替的に使用され得る（配列番号１０）。これらの一
般配列は、分子間または分子内ジスルフィド結合が形成され得る場所に、６−ま
たは７−システイン残基を有する。これらの配列はまた、タンパク質の三次構造
に影響するのに不可欠な他のアミノ酸を含む。

【００４３】 さらに別の実施形態において、有用な形態形成タンパク質は、低い、中程度の
、または高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、参照形態
形成タンパク質コード配列をコードするＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズす
る核酸により、コードされるアミノ酸配列を含む。例示的な参照配列は、ＯＰ−
１、ＯＰ−２、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、６０Ａ、Ｇ
ＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７などの保存された７−システイ
ンドメインを規定するＣ末端配列を含む。ここでは高いストリンジェンシーのハ
イブリダイゼーション条件を、４０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、５×デンハ
ート溶液、および０．１％ＳＤＳ中で３７℃、オーバーナイトでのハイブリダイ
ゼーション、および０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中で５０℃での洗浄と定
義する。標準的な高いストリンジェンシー条件は、市販の標準的な分子クローニ
ングテキストにおいて十分に特徴づけられている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら
編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ巻およびＩＩ巻
（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編， １９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編， １９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉ
ｇｇｉｎｓ編 １９８４）；およびＢ．Ｐｅｒｂａｌ、およびＡ Ｐｒａｃｔｉ
ｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）
を参照のこと。

【００４４】 当該分野で公知の適切なインビトロ、エキソビボ、およびインビボでのバイオ
アッセイ（本明細書中に記載したバイオアッセイを含む）は、新規のＢＭＰ関連
遺伝子産物が形態形成活性を有するかどうかを確認するのに用いられ得る。どこ
でおよびいつ、その遺伝子が発現されるかを定義するための、発現および局在化
の研究もまた、潜在的な形態形成活性を同定するのに用いられ得る。核酸および
タンパク質の局在化の手順は、当業者に周知である（例えばＡｕｓｕｂｅｌら編
、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔ
ｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９を参照のこと）。

【００４５】 多くの同定されたＢＭＰは、骨形成性であり、そして哺乳動物に移殖した場合
、骨および軟骨の形成を誘導し得る。既知の骨形成性タンパク質との配列相同性
に基いて同定されたいくつかのＢＭＰは、他の形態形成活性を有し、そしてホル
モンとホルモンの可溶性レセプターとの組み合わせは、それらの活性を増強する
のに用いられ得る。例えば、ＢＭＰ−１２およびＢＭＰ−１３は、報告では哺乳
動物に移殖した場合、腱／靭帯様組織の異所性形成を誘導する（Ｃｅｌｅｓｔｅ
ら、ＷＯ ９５／１６０３５）。このバイオアッセイを用いて、当業者は、腱／
靭帯様組織形成を誘導するＢＭＰの能力を刺激し得る、ホルモンとホルモンの可
溶性レセプターとの１つ以上の組み合わせを、容易に同定し得る。

【００４６】 形態形成性が既知である特定のＢＭＰはまた、ニューロンの分化を誘導し得る
。ＢＭＰ−２またはＯＰ−１で処理した胎児のマウス細胞は、星状細胞様（グリ
ア）細胞に分化し、そしてＢＭＰ−２を用いる末梢神経の再生が報告されている
（Ｗａｎｇら、ＷＯ９５／０５８４６）。さらに、ＢＭＰ−４、ＢＰ−５、およ
びＯＰ−１は、神経板に隣接する上皮層の外胚葉で発現される。異所性の組換え
ＢＭＰ−４およびＯＰ−１タンパク質は、背面ニューロン発生運命の分化を開始
するように神経板細胞を誘導する（Ｌｉｅｍら、 Ｃｅｌｌ， ８２， ９６９
−７９頁（１９９５））。脊髄レベルでＯＰ−１および他のＢＭＰは、神経堤細
胞の分化を誘導し得る。ＯＰ−１およびこれらのＢＭＰは、局在化の位置的な合
図に依存して、上衣板細胞、神経堤細胞および交連ニューロンを含む、多くのま
たは全ての背面ニューロン型を誘導し得ることが示唆される。

【００４７】 骨マトリックスに本来由来するいくつかの骨形成性タンパク質が、神経の発達
に関与していることは、これらおよび他のＢＭＰファミリーのメンバーが、いま
だ開示されていないさらなる組織誘導特性を有することを示唆する。本発明に示
したホルモン／レセプターの組み合わせは、種々の既知の形態形成タンパク質の
新規または既知の組織誘導特性を増強するのに使用され得ることが想定される。
また、本明細書中に記載される本発明は、将来同定される新たな形態形成タンパ
ク質の組織誘導活性を刺激するのに用いられ得ることが想定される。

【００４８】 （形態形成タンパク質の生成） 本発明の形態形成タンパク質は、種々の供給源に由来し得る。例えば、本発明
の形態形成タンパク質は、天然の供給源から単離され得るか、組換え生成され得
るか、または化学的に合成され得る。

【００４９】 （Ａ．天然に由来する形態形成タンパク質） 本発明の形態形成タンパク質は、周知技術を使用して、組織供給源（例えば、
哺乳動物組織供給源）から精製され得る。例えば、Ｏｐｐｅｒｍａｎｎら，米国
特許第５，３２４，８１９号および第５，３５４，５５７号を参照のこと。精製
プロトコールが公開されていない場合、新たに同定された形態形成タンパク質に
ついてのように、従来のタンパク質精製技術（例えば、免疫親和性）を、形態形
成活性アッセイと組み合わせて実施し得る。このようなアッセイは、一連の精製
工程を通して、形態形成活性を追跡することを可能にする。

【００５０】 （Ｂ．組換え発現した形態形成タンパク質） 本発明の別の実施形態では、形態形成タンパク質は、宿主細胞での適切な組換
えＤＮＡ分子の発現によって生成される。多くのＢＭＰおよびＯＰのＤＮＡおよ
びアミノ酸配列が報告されており、そしてその組換え産生のための方法は公開さ
れ、そしてそうでなければ当業者に公知である。クローニングおよび組換えＤＮ
Ａ技術の一般的考察については、Ａｕｓｕｂｅｌら，前出を参照のこと；Ｗａｔ
ｓｏｎら，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，第２版 １９９２（Ｗ．Ｈ．Ｆｒ
ｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）もまた参照のこと。

【００５１】 ウシおよびヒトのＢＭＰ−２（以前はＢＭＰ−２Ａ）およびＢＭＰ−４（以前
はＢＭＰ−２Ｂ）をコードするＤＮＡ配列、ならびに対応するタンパク質を組換
え産生するためのプロセスは、米国特許第５，０１１，６９１号；同第５，０１
３，６４９号；同第５，１６６，０５８号；および同第５，１６８，０５０号に
記載される。ヒトおよびウシのＢＭＰ−５およびＢＭＰ−６のＤＮＡおよびアミ
ノ酸配列、ならびにその組換え産生の方法は、それぞれ米国特許第５，１０６，
７４８号および同第５，１８７，０７６号に開示されている；米国特許第５，０
１１，６９１号および同第５，３４４，６５４号も参照のこと。Ｏｐｐｅｒｍａ
ｎｎら，米国特許第５，０１１，６９１号および同第５，２５８，４９４号には
、ＯＰ−１組換え発現の方法が開示される。ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−
５、ＢＭＰ−６、およびＯＰ−１（ＢＭＰ−７）アミノ酸配列のアラインメント
については、ＷＯ ９５／１６０３４を参照のこと。ＢＭＰ−８をコードするＤ
ＮＡ配列は、ＷＯ ９１／１８０９８に開示され、そしてＢＭＰ−９をコードす
るＤＮＡ配列は、ＷＯ ９３／００４３２に開示される。ＢＭＰ−１０およびＢ
ＭＰ−１１をコードするＤＮＡおよび推定アミノ酸配列は、それぞれＷＯ ９４
／２６８９３およびＷＯ ９４／２６８９２に開示される。ＢＭＰ−１２および
ＢＭＰ−１３についてのＤＮＡおよび推定アミノ酸配列は、ＷＯ ９５／１６０
３５に開示される。ＤＮＡおよびアミノ酸配列、ならびにこれらの配列によって
コードされるＢＭＰおよびＯＰを産生するための方法を記載する上記の特許開示
は、本明細書中に参考として援用される。

【００５２】 新しいＢＭＰ、ＯＰ、およびバイオアッセイによって抽出物中で同定された他
の形態形成タンパク質をコードする遺伝子をクローニングするために、「逆遺伝
学（ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」を伴う方法が用いられ得る。このよ
うな方法は、そのタンパク質をコードする遺伝子を得るために、公知または未知
の機能のタンパク質を用いて開始する。標準的タンパク質精製技術は、最初の工
程として使用され得る。十分なタンパク質が、部分アミノ酸配列を得るために精
製され得る場合、その部分アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列にハイブリダイ
ズし得る縮重ＤＮＡプローブは、その形態形成タンパク質または関連の形態形成
タンパク質をコードする全長クローンを単離するためのプローブとして、設計、
合成、および使用され得る。

【００５３】 あるいは、形態形成タンパク質を含む部分精製した抽出物が、そのタンパク質
に対して指向される抗体を惹起するために使用され得る。次いで、形態形成タン
パク質特異的抗体が、ｃＤＮＡから作製された発現ライブラリーをスクリーニン
グするためのプローブとして使用され得る（例えば、ＢｒｏｏｍｅおよびＧｉｌ
ｂｅｒｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５，２７
４６−４９頁（１９７８）；ＹｏｕｎｇおよびＤａｖｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０，３１−３５頁（１９８３）を参照の
こと）。

【００５４】 ＤＮＡ配列相同性に基づいて同定された新しいＢＭＰ、ＯＰ、および他の形態
形成タンパク質をクローニングおよび発現させるために、相同配列は、標準的組
換えＤＮＡ技術を使用してクローニングおよび配列決定され得る。利用可能なＤ
ＮＡ配列を用いて、形態形成タンパク質をコードするＤＮＡフラグメントは、所
望の宿主発現系と協調して作用するように選択された発現ベクター中に挿入され
得る。ＤＮＡフラグメントは、その転写がベクター中の異種プロモーター、好ま
しくは必要に応じて調節され得るプロモーターによって制御されるように、ベク
ターにクローニングされる。

【００５５】 ＢＭＰおよびＯＰの組換え発現に適切ないくつかの宿主−ベクター系は、上記
に引用された参考文献に開示される。有用な宿主細胞には、Ｅ．ｃｏｌｉのよう
な細菌、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＰｉｃｉａのような酵母、昆虫細胞
、および他の初代真核生物培養細胞、形質転換真核生物培養細胞または不死化真
核生物細胞が含まれるが、これらに限定されない。好ましい真核生物宿主細胞に
は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、およびＢＳＣ細胞が含まれる（以下を参照のこと）。

【００５６】 適切なベクターは、選択された宿主系に従って選択される。有用なベクターに
は、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、レトロウイルスおよび他の一
本および二本鎖ＤＮＡウイルス由来のベクターを含む昆虫および動物のウイルス
ベクターが含まれるが、これらに限定されない。

【００５７】 本発明の１つの実施形態では、形態形成タンパク質は、原核生物宿主において
発現された組換えＤＮＡ分子に由来し得る。組換えＤＮＡ技術を使用して、種々
の融合遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で天然供給源の骨形成配列の組換え発現を誘導
するように構築されている（例えば、Ｏｐｐｅｒｍａｎｎら，米国特許第５，３
５４，５５７号（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。類似の
手順を使用して、天然供給源の形態形成配列の短縮形態を含むＤＮＡは、酸不安
定切断部位（Ａｓｐ−Ｐｒｏ）をコードする配列によって、Ｅ．ｃｏｌｉでの発
現を促進するために適切なリーダー配列（例えば「ＭＬＥリーダー」）に連結さ
れた融合構築物として調製され得る。

【００５８】 本発明の他の実施形態では、形態形成タンパク質は、哺乳動物宿主−ベクター
系を使用して発現される（例えば、トランスジェニック産生または組織培養産生
）。そのように発現された形態形成タンパク質は、天然に存在するタンパク質と
より密接に類似し得る。組換えタンパク質のグリコシル化パターンは、時折、天
然のタンパク質のグリコシル化パターンと異なる得るが、このような差異は、し
ばしば、組換えタンパク質の生物学的活性に対して本質的ではない。組換えタン
パク質のトランスフェクション、発現および精製のための技術は、当該分野にお
いて周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（前出）、およびＢｅｎｄｉｇ、Ｇ
ｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７：９１−１２７頁（１９８８）を参
照のこと。

【００５９】 哺乳動物ＤＮＡベクターは、目的の遺伝子の発現を促進するために適切な配列
を含むべきである。このような配列としては、以下が挙げられる：転写開始配列
、終結配列、およびエンハンサー配列；スプライシングシグナルおよびポリアデ
ニル化シグナルのような効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；ｍＲＮＡを安定
化する配列；翻訳を増強する配列（例えば、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タ
ンパク質安定化配列；および所望の場合、タンパク質分泌を増強する配列。

【００６０】 哺乳動物細胞におけるＯＰ−１発現のために設計された種々の例示的発現ベク
ターの制限マップおよび供給源が、米国特許第５，３５４，５５７号に記載され
ている。これらのベクターの各々は、ｐＵＣ−１８ベクター中に挿入された全長
ｈＯＰ−１ ｃＤＮＡ配列を使用する。形態形成タンパク質の短縮形態をコード
するＤＮＡ配列もまた、その発現ベクターまたは宿主細胞が、発現されたタンパ
ク質のプロセシングおよび分泌を指示するために必要な配列を提供するという条
件下で、使用され得ることが当業者に理解される。

【００６１】 有用なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーターおよび後期プロモー
ター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｉ（「
ｍＭＴ」）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）長末端反復（「Ｌ
ＴＲ」）、マウス乳腺癌ウイルス（「ＭＭＴＶ」）ＬＴＲ、およびヒトサイトメ
ガロウイルス（「ＣＭＶ」）主要介在初期プロモーターが挙げられるが、これら
に限定されない。例えば、ＲＳＶ ＬＴＲ由来のエンハンサー配列とのＣＭＶま
たはＭＭＴＶプロモーターの組み合わせが、ヒト骨形成タンパク質を発現するに
特に有用であることが見出された。

【００６２】 好ましいＤＮＡベクターはまた、マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシンまた
はＤＨＦＲ）、および目的の遺伝子のコピー数を増幅する手段を含む。ＤＮＡベ
クターはまた、安定化配列（例えば、ｏｒｉ−またはＡＲＳ−様配列、およびテ
ロメア様配列）を含み得るか、あるいは、宿主細胞ゲノム中への指向性組み込み
または非指向性組み込みに有利なように設計され得る。

【００６３】 哺乳動物細胞系における遺伝子増幅の１つの方法は、ｄｈｆｒ^-細胞株におけ
る選択可能なジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子の使用である。一般
的に、ＤＨＦＲ遺伝子は、目的の遺伝子を有するベクターに提供され、そして細
胞傷害性薬物メトトレキセート（ＭＴＸ）を漸増濃度で添加することにより、Ｄ
ＨＦＲ遺伝子コピー数の増幅、ならびにそれと物理的に関連する遺伝子の増幅が
導かれる。トランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株
中の増幅可能な選択マーカー遺伝子としてのＤＨＦＲは、当該分野で特に十分に
特徴づけられている。他の有用な増幅可能なマーカー遺伝子には、アデノシンデ
アミナーゼ（ＡＤＡ）およびグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）遺伝子が挙げられ
る。

【００６４】 遺伝子増幅は、産生されたマーカータンパク質のレベルを低下させるためにマ
ーカー遺伝子発現調節配列（例えば、エンハンサー、プロモーター、および転写
開始配列または翻訳開始配列）を改変することによって、さらに増強され得る。
ＤＨＦＲ転写のレベルを低下させると、ＤＨＦＲ遺伝子コピー数（および物理的
に関連する遺伝子）が増加して、トランスフェクトした細胞がさらに低レベルの
メトトレキセート（例えば、０．１μＭ ＭＴＸ）での増殖に適用できるように
なる。ｐＨ７５４およびｐＨ７５２（Ｏｐｐｅｒｍａｎｎら，米国特許第５，３
５４，５５７号，図１９ＣおよびＤ）のような好ましい発現ベクターは、標準的
組換えＤＮＡ技術を使用して弱いＤＨＦＲプロモーターを生成するように操作さ
れている。当業者に理解されるように、本明細書に開示されるものとは異なる他
の有用な弱いプロモーターは、標準的な方法を使用して構築され得る。他の調節
配列もまた、同じ効果を達成するように改変され得る。

【００６５】 別の遺伝子増幅スキームは、ＳＶ４０ベクターでトランスフェクトしたＢＳＣ
４０−ｔｓＡ５８細胞の温度感受性（ｔｓ）に依る。３３℃まで温度が減少する
と、温度感受性ＳＶ４０ Ｔ抗原が安定化され、これにより組込まれたトランス
フェクトベクターＤＮＡの切り出しおよび増幅が導かれ、これによって目的の物
理的に関連する遺伝子が増幅される。

【００６６】 細胞／細胞株の選択は、当業者の必要性に依存する。サル腎細胞（ＣＯＳ）は
、高レベルの一過性遺伝子発現を提供し、従って、ベクター構築およびクローニ
ングされた遺伝子の発現を迅速にテストするのに有用である。目的の遺伝子を発
現するＣＯＳ細胞は、例えば、その遺伝子を有するＳＶ４０ベクターで細胞をト
ランスフェクトすることによって樹立され得る。他方で、安定にトランスフェク
トされた細胞株は、形態形成タンパク質の長期産生のために使用され得る。例と
して、ＣＨＯ細胞およびＢＳＣ４０−ｔｓＡ５８細胞の両方を、宿主細胞として
使用し得る。組換えＯＰ−１は、３つの異なる細胞発現系で発現されている：種
々の発現構築物の機能性を迅速にスクリーニングするためのＣＯＳ細胞、安定な
細胞株の樹立のためのＣＨＯ細胞、および組換えＯＰ−１タンパク質を産生する
代替手段としてのＢＳＣ４０−ｔｓＡ５８細胞。

【００６７】 いくつかの骨由来骨形成タンパク質（ＯＰ）およびＢＭＰは、その活性形態に
おける鎖間ジスルフィド結合を含むホモダイマーおよびヘテロダイマーとして見
い出されている。例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、およびＢＭＰ
−７（ＯＰ−１）（元は骨から単離された）は、ホモダイマーまたはヘテロダイ
マーのいずれかとして生物活性である。ＯＰおよびＢＭＰが、ヘテロダイマーを
形成する能力は、さらなる形態形成活性または改変された形態形成活性を形態形
成タンパク質に付与し得る。ヘテロダイマーは、ＯＰおよびＢＭＰレセプターに
ついてのホモダイマーとは質的または量的に異なる結合親和性を示し得る。次い
で、改変された結合親和性は、異なるシグナル伝達経路を媒介するレセプターの
異なる活性化を生じ得、最終的に、異なる生物学的活性へと導く。改変された結
合親和性はまた、組織型または細胞型特異的様式で顕在化され得、それによって
、特定の前駆細胞型のみが増殖および／または分化を受けるように誘導する。

【００６８】 ダイマー性タンパク質は、培養培地から単離され得、および／またはインビト
ロでリフォールディングされ、そしてダイマー化されて、生物学的に活性な組成
物を形成し得る。ヘテロダイマーは、別個の異なるポリペプチド鎖を組み合わせ
ることによってインビトロで形成され得る。あるいは、ヘテロダイマーは、別個
の異なるポリペプチド鎖をコードする核酸を同時発現させることによって、単一
の細胞中で形成され得る。例えば、ＷＯ９３／０９２２９および米国特許第５，
４１１，９４１号（例えば、へテロダイマータンパク質産生の例示的プロトコー
ル）を参照のこと。

【００６９】 （Ｃ．形態形成タンパク質のインビボ発現） 本発明の形態形成タンパク質はまた、患者においてインビボで産生され得る。
これを達成するために、形態形成タンパク質のコード配列に作動可能に連結され
たプロモーターを含む発現ベクターを、患者の前駆細胞中に導入し得る。あるい
は、患者から適切な前駆細胞を単離し得、この細胞を発現ベクターでトランスフ
ェクトまたは形質導入し得、そしてこの処理細胞を所望される位置でこの患者に
再導入し得る。

【００７０】 （１）ベクター 本発明に従う核酸構築物は、非複製線状または環状ＤＮＡまたはＲＮＡベクタ
ー由来であるか、あるいは自律複製プラスミドまたはウイルスベクター由来であ
る。あるいは、構築物は、宿主ゲノム中に組み込まれる。所望される前駆細胞を
トランスフェクトまたは形質導入し得る任意のベクターが使用され得る。好まし
いベクターは、ウイルスベクターであり、これには、複製欠損レトロウイルス（
例えば、ＷＯ８９／０７１３６；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ Ｍｅ
ｄ．３２３（９）：５７０−５７８（１９９０）を参照のこと）、アデノウイル
ス（例えば、Ｍｏｒｓｅｙら，Ｊ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，補遺１７Ｅ（
１９９３）を参照のこと）、アデノ随伴ウイルス（Ｋｏｔｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｌｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２１１−２２１５（１９９０））
、複製欠損単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ；Ｌｕら，要旨，６６頁，Ａｂｓｔｒ
ａｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，
２２−２６，１９９２年９月，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）
、ワクシニアウイルス（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅら，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈ
ｅｒ．７：６６３−７０（２０００））、およびこれらのベクターの任意の改変
バージョン由来のベクター。発現ベクターを構築する方法は、当該分野において
周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９を参照のこと。

【００７１】 （２）発現調節配列 これらのベクターにおいて、発現調節配列が、本発明において有用な形態形成
タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結される。真核生物細胞につい
て、発現調節配列としては、プロモーター、エンハンサー（例えば、免疫グロブ
リン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルスなど由来のもの）、およびポリア
デニル化配列が挙げられ得る。本発明の核酸構築物はまた、内部リボソーム侵入
部位（「ＩＲＥＳ」）、および望ましくはプロモーター／エンハンサー配列と形
態形成タンパク質コード配列との間に位置づけられ得るイントロンを含み得る。
これらおよび他の共通のベクターエレメントの選択は、慣習的である。例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ
＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；およびその中で引用された参考
文献を参照のこと。

【００７２】 本発明の１つの実施形態では、高レベルの構成的発現が所望される。この目的
のための例示的プロモーターとしては、制限されないが、以下が挙げられる：レ
トロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター／エンハンサー
、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）極初期プロモーター／エンハンサー（例えば
、Ｂｏｓｈａｒｔら，Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０（１９８５）を参照のこ
と）、ＳＶ４０プロモーター。ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、細胞質
β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモータ
ー。骨芽細胞におけるＢＭＰ発現に有用なプロモーターとしてはまた、Ｉ型コラ
ーゲン遺伝子プロモーターおよびＣＢＦＡ遺伝子プロモーターが挙げられる。軟
骨細胞および軟骨芽細胞におけるＢＭＰ発現に有用なプロモーターとしては、Ｉ
Ｉ型コラーゲン遺伝子プロモーターおよびＸ型コラーゲン遺伝子プロモーターが
挙げられる。別の実施形態では、所望される形態形成タンパク質のネイティブな
転写調節エレメントが使用され得る。

【００７３】 本願によって提供される指針を使用して、当業者は、本発明の範囲から逸脱す
ることなく、上記発現調節配列およびその改変バージョンの中から選択を行い得
る。

【００７４】 （３）核酸構築物の投与 本発明の核酸構築物は、インビボおよびインビトロでの一過性遺伝子移入およ
び／または安定な遺伝子移入の任意の形態で使用するための薬学的組成物として
処方され得る。組成物は、少なくとも核酸構築物および薬学的に受容可能なキャ
リア（例えば、生理食塩水）を含む。薬学的に受容可能なキャリアであることが
公知であり、そして当業者に周知の他の水性および非水性の滅菌懸濁物もまた使
用され得る。この構築物は、インビボおよびエキソビボでの遺伝子治療、インビ
トロでのタンパク質産生および診断アッセイのために使用され得る。

【００７５】 核酸構築物は、裸のＤＮＡとしてか、または例えば、リポソーム融合物（例え
ば、Ｎａｂｅｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１２８５−８（１９９０）；Ｌｅ
ｄｌｅｙ，Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ １１０：１−８および１６７−７４（１
９８７）；Ｎｉｃｏｌａｕら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ
８０：１０６８−７２（１９８３）を参照のこと）、赤血球ゴースト、もしくは
ミクロスフェア方法（微粒子；例えば、米国特許第４，７８９，７３４号，米国
特許第４，９２５，６７３号；米国特許第３，６２５，２１４号；Ｇｒｅｇｏｒ
ｉａｄｉｓ，Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍ
ｅｄｉｃｉｎｅ，２８７−３４１頁，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９７９
）によって、標的細胞中に導入され得る。

【００７６】 核酸構築物がウイルスベースである場合、これはまた、ビリオンとしてパッケ
ージングされ得、このビリオンが次いで、インビトロで細胞（例えば、患者から
単離された自己Ｔ細胞）を形質導入するために使用される。次いで、感染した細
胞を、患者に導入する。あるいは、組換えウイルスを、遺伝子治療分野の当業者
によって決定されるように、患者に直接（例えば、組織欠損部位に局所的に；ま
たは、静脈内、腹腔内、鼻腔内、筋内、皮下的、および／または皮内）投与し得
る。移植可能なポンプのような徐放性デバイスを使用して、細胞への組換えウイ
ルスの送達を容易にし得る。ウイルスが被験体に投与される場合、感染されるべ
き特定の細胞は、送達方法を制御することによって標的化され得る。本発明の処
置は、当業者によって決定されるように、必要に応じて反復され得る。

【００７７】 遺伝子治療における本発明の核酸構築物の投薬量は、主に、処置される状態の
ような因子に依存する。投薬量はまた、患者の年齢、体重、および健康に依存し
て変動し得る。例えば、ＢＭＰコードウイルスの有効なヒト投薬量は、一般的に
、投与される１用量あたり約１×１０⁷、１×１０⁸、１×１０⁹、１×１０¹⁰、
１×１０¹¹、１×１０¹²、１×１０¹³、１×１０¹⁴、１×１０¹⁵、または１×１
０¹⁶個のウイルス粒子の濃度でウイルスを含む、約０．５ｍｌ〜５０ｍｌの範囲
の生理食塩水溶液である。投薬量は、あらゆる有害な副作用に対する相関的な利
点のバランスを保つように調整される。ＢＭＰの発現レベルをモニターして、投
薬量投与の型および頻度を決定し得る。

【００７８】 （Ｄ．合成的非天然形態形成タンパク質） 本発明の別の実施形態では、形態形成タンパク質は、合成的に調製され得る。
合成的に調製された形態形成タンパク質は、ネイティブであっても、ネイティブ
ではないタンパク質（すなわち、さもなくば天然において見出されないタンパク
質）であってもよい。

【００７９】 ネイティブではない形態形成タンパク質は、ネイティブな形態形成タンパク質
を変異させることによって作製され得る。より高い形態形成活性を示す形態へと
サブユニットをリフォールディングおよび／または構築するのに有利な変異を作
製する方法は、記載されている。例えば、米国特許第５，３９９，６７７号を参
照のこと。

【００８０】 非天然骨形態形成タンパク質はまた、一連のコンセンサス配列を使用して合成
され得る（米国特許第５，３２４，８１９号）。これらのコンセンサス配列を、
天然の骨形成産物から得られる部分アミノ酸配列データに基づいて、および推定
または証明された発生機能を有すると文献に報告された他のタンパク質とのそれ
らの相同性に基づいて設計した。いくつかの生合成コンセンサス配列（コンセン
サス骨形成タンパク質または「ＣＯＰ」と呼ばれる）は、原核生物中で融合タン
パク質として発現されている。精製した融合タンパク質は、切断され、リフォー
ルディングされ、ホルモンおよびその可溶性レセプターと合わせられ、確立され
た動物モデルに移植され、そしてその骨および／または軟骨誘導活性について試
験される。特定の好ましい合成骨形成タンパク質は、ＣＯＰ５（配列番号１１）
およびＣＯＰ７（配列番号１２）と命名された２つの合成アミノ酸配列の一方ま
たは両方を含む。

【００８１】 ＣＯＰ５およびＣＯＰ７のアミノ酸配列が以下に示され、これはＯｐｐｅｒｍ
ａｎｎら、米国特許第５，０１１，６９１号および同第５，３２４，８１９号（
これらは本明細書中に参考として援用される）に記載される：

【００８２】

【表１１】 これらのアミノ酸配列では、ダッシュ（−）は、関連のタンパク質において比
較可能な配列を並べるためだけのフィラーとして使用される。整列されたアミノ
酸配列間の差異を強調する。

【００８３】 本発明の一実施形態において、形態形成タンパク質は、上記の一般配列の部分
または完全配列（配列番号４、５、６、７または１０）を含む合成骨形成タンパ
ク質であり、その結果、これは、適切にフォールディングされそして哺乳動物に
移植された場合、組織形成を誘導し得る。例えば、合成タンパク質は、有利な環
境に移植された場合、骨芽細胞からの骨形成を誘導し得るか、あるいは無血管位
置に移植された場合、または完全な骨発生のインヒビターと同時投与された場合
、軟骨形成を促進し得る。

【００８４】 別の実施形態において、本発明の合成形態形成タンパク質は、ＣＯＰ（例えば
、ＣＯＰ５（配列番号１１）またはＣＯＰ７（配列番号１２））の部分配列また
は完全配列と十分に重複した配列を含む。生合成ＣＯＰ配列は、リフォールディ
ングの間にダイマー化すると考えられ、そして還元された場合には活性ではない
ようである。ホモダイマーＣＯＰおよびヘテロダイマーＣＯＰの両方が、本発明
において企図される。特定の実施形態において、この合成タンパク質は、約２０
０アミノ酸長未満である。

【００８５】 これらおよび他の合成非天然骨形成タンパク質は、ホルモン／レセプター対と
共に使用され、そしてインビトロ、エキソビボまたはインビトロのバイオアッセ
イを使用して、前駆細胞誘導および組織再生について試験され得る。本発明のホ
ルモン／レセプター対に関連するタンパク質は、骨、軟骨、腱、靱帯、神経およ
び潜在的に他のタイプの組織の修復および再生のために有用であることが想定さ
れる。

【００８６】 （形態形成活性を有する相同タンパク質） 本発明において有用な形態形成タンパク質は、上記の骨形成ＣＯＰコンセンサ
ス配列との相同性に基づいてＤＮＡ配列の組換え発現によって産生され得る。合
成ＣＯＰ ＤＮＡ配列は、様々な種から関連のＤＮＡ配列を回収するためのプロ
ーブとして使用され得る（例えば、Ｏｐｐｅｒｍａｎｎら、米国特許第５，０１
１，５９１号および同第５，２５８，４９４号（これらは本明細書中で参考とし
て援用される）を参照のこと）。

【００８７】 ＣＯＰ配列プローブとハイブリダイズする遺伝子によってコードされる形態形
成タンパク質は、哺乳動物に移植された場合、ジスルフィド結合した２つのサブ
ユニットに構築されて、組織形成を誘導し得るヘテロダイマーまたはホモダイマ
ーを産生する。組換えＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４は、ホモダイマーとして、お
よびＯＰ−１サブユニットと共に構築されたヘテロダイマーとして種交差骨形成
活性を有することが示されている。合成ＣＯＰ配列プローブにハイブリダイズす
る遺伝子をコードする形態形成タンパク質としては、Ｖｇ１、インヒビン、ＤＰ
Ｐ、ＯＰ−１、ＭＢＰ−２およびＭＢＰ−４をコードする遺伝子が挙げられる。
Ｖｇ１は、初期胚パターン形成に関与する公知のＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ
形態形成タンパク質である。インヒビンは、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ由来
のタンパク質のＢＭＰファミリーのメンバーである別の発生遺伝子である。ＤＰ
Ｐは、背−腹パターンの発生を担うＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子によってコード
されるアミノ酸配列である。ＯＰ−１、ＢＭＰ−２、およびＢＭＰ−４は、軟骨
、骨、および神経組織の形成を誘導し得る骨形成タンパク質である。

【００８８】 本発明の別の実施形態において、形態形成タンパク質は、ストリンジェントな
条件下で「ＯＰＳ」核酸プローブにハイブリダイズする核酸によってコードされ
るポリペプチドを含み得る（Ｏｐｐｅｒｍａｎｎら、米国特許第５，３５４，５
５７号）。「ＯＰＳ」（ＯＰ−１「ショート」を表す）とは、Ｃ末端活性領域に
保存された６−システイン骨格を規定するヒトＯＰ−１タンパク質の一部（９７
アミノ酸；配列番号２、残基３３５〜４３１）をいう。

【００８９】 ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、６５℃（または、
プローブとミスマッチ塩基対を含まない核酸配列との間のハイブリッドについて
算出された融解温度よりも１０℃高く）での４×ＳＳＣでのハイブリダイゼーシ
ョン、次いでそのハイブリダイゼーション温度での０．１×ＳＳＣでの洗浄であ
る。別のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、４２℃での５０％
ホルムアミド、４×ＳＳＣでのハイブリダイゼーションである。

【００９０】 従って、この開示の点から、当業者は容易に遺伝子を設計および合成し得るか
、または形態形成活性を有するアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡもしくはゲノ
ムライブラリーから遺伝子を単離し得る。これらの遺伝子は、原核生物宿主細胞
または真核生物宿主細胞において発現されて、多量の活性な骨形成タンパク質、
または他の形態形成タンパク質を産生し得る。組換えタンパク質は、インビトロ
バイオアッセイおよびエキソビボバイオアッセイ、ならびに哺乳動物（ヒトを含
む）におけるインビボ移植によって示されるように、ネイティブの形態、短縮型
形態、変異形態、融合形態、または骨、軟骨もしくは他のタイプの組織の形成を
誘導し得る他の活性な形態であり得る。

【００９１】 （ホルモンおよびそのレセプター） 本発明のホルモン／レセプター対は、形態形成タンパク質の能力を刺激して、
前駆細胞からの組織形成を誘導し得る。本発明の方法において、哺乳動物におけ
る形態形成タンパク質の組織誘導活性は、有効量のホルモンおよびその可溶性レ
セプターを同時に投与することによって改善される。あるいは、形態形成タンパ
ク質およびホルモン／レセプター対は、連続して投与される。形態形成タンパク
質とホルモン／レセプター対との間の相乗作用は、形態形成タンパク質がホルモ
ン／レセプター対の４〜８時間前に投与された場合でさえ保存されることが見出
されている。形態形成タンパク質、ホルモンおよびホルモンレセプターはまた、
連続して投与され得る。

【００９２】 １つ以上のホルモン／レセプター対が、誘導されるべき所望の組織型および治
療薬が投与される部位に従って、１つ以上の形態形成タンパク質と共に使用する
ために選択され得る。形態形成タンパク質／ホルモン／レセプターの組み合わせ
の特定の選択、およびそれらが組み合わされる場合の相対濃度は、本明細書に記
載される手順を使用して、選択した処置部位で誘導されるべき組織型を最適化す
るように体系的に変えられ得る。

【００９３】 本発明において有用はホルモンとしては、インターロイキン１〜１８、線維芽
細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、血小板由来増殖因子、ＴＧＦ−β、およびプ
ロスタグランジン（例えば、Ｅ１およびＥ２）が挙げられるが、これらに限定さ
れない。標的細胞がホルモンに対する細胞表面レセプターを有することが好まし
くあり得る。ホルモンはまた、ＧＤＦのような形態形成タンパク質であり得、そ
の結果として、本発明の組成物は、２つの形態形成タンパク質およびそれらのタ
ンパク質の一方の可溶性レセプターを含む。

【００９４】 本発明の１つの好ましいホルモン／レセプター対は、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ
である。ＩＬ−６は、多機能性ホルモンのサブファミリーのメンバーである。こ
れは、標的細胞の有糸分裂誘導に影響を与え、そして他の局所因子の合成を調節
することによって、骨形成および骨再吸収の両方において役割を果たすようであ
る。臨床研究によって、ＩＬ−６は様々な疾患（例えば、線維性形成障害、骨減
少症、骨粗しょう症およびパジェット病）に関与することが示された。Ｅ．ｃｏ
ｌｉから発現される組換え全長ヒトＩＬ−６（２６ｋＤ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ
．Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ）およびＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から得ら
れ得る。バキュロウイルスから産生され、ヒトＩＬ−６Ｒの細胞外ドメイン（残
基１〜３３９；３８ｋＤ）全体を含む組換えｓＩＬ−６Ｒは、Ｓｉｇｍａおよび
Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から得られ得る。前
出の実施例１および２もまた参照のこと。これらのＩＬ−６およびｓＩＬ−６産
物の活性な対立遺伝子改変体、種改変体または他の改変体もまた使用され得る。

【００９５】 本発明のホルモンまたはホルモンレセプターは、ホルモンまたはレセプターの
生体活性（例えば、合成、半減期、バイオアベイラビリティ、ならびに結合タン
パク質およびレセプターのような他の生体分子との反応性）を増大し得る薬剤と
会合し得る。これらの薬剤は、タンパク質および脂質のようなキャリア分子を含
み得る。

【００９６】 ホルモンおよびホルモンレセプターは、哺乳動物における形態形成タンパク質
の組織誘導活性を相乗的に刺激し得る量で存在する。組織形成を最適に誘導する
形態形成タンパク質、ホルモンおよびホルモンレセプターの相対濃度は、本明細
書中に記載される手順を使用して、当業者によって実験的に決定され得る。

【００９７】 （前駆細胞） 本発明の形態形成タンパク質によって増殖および／または分化を誘導される前
駆細胞は、好ましくは哺乳動物細胞である。有用な前駆細胞の例は、哺乳動物軟
骨芽細胞、骨芽細胞および神経芽細胞、それらの初期発生前駆体、ならびにそれ
らから発生する全ての細胞（例えば、前軟骨芽細胞および前軟骨細胞）である。
前駆細胞は、１つ以上の組織型（例えば、軟骨性骨または膜性骨、軟骨、腱／靱
帯様組織、神経組織および腎臓組織）へと誘導され得る。形態形成タンパク質に
より示される特定の形態形成活性は、部分的に、前駆細胞の型ならびに処置部位
に依存する。これらの変数は実験的に試験され得る。

【００９８】 形態形成タンパク質は進化過程にわたって高度に保存され、そして非哺乳動物
前駆細胞は、同一かまたは種交差の形態形成タンパク質およびホルモン／レセプ
ターの組み合わせによって刺激されるようである。従って、スキームが、不利な
免疫反応なしで異種細胞をヒトに移植するために利用可能な場合、本明細書中に
記載される手順に従って、形態形成タンパク質およびホルモン／レセプター対に
よって刺激される非哺乳動物前駆細胞は、ヒトにおける組織再生および修復のた
めに有用であることが予想される。

【００９９】 （形態形成活性の試験） 選択した形態形成タンパク質の組織誘導活性を刺激し得るホルモン／レセプタ
ー対を同定するために、適切なアッセイが選択される。初めに、インビトロアッ
セイが行われ得る。有用なインビトロアッセイは、その発現が関連の細胞分化経
路と相関することが知られている核酸またはタンパク質マーカーをモニタリング
し得る。例えば、米国特許第５，８５４，２０７号（Ｌｅｅら）の実施例３およ
び４、ならびに前出の実施例１および２を参照のこと。

【０１００】 前出の実施例１および２は、ＩＬ−６およびｓＩＬ−６Ｒの有効濃度を同定し
そして最適化するためにＯＰ−１を使用する実験を記載する。ＯＰ−１は、骨形
成活性および神経形成活性を有することが知られている。従って、ＯＰ−１との
相乗効果をを有するホルモン／レセプター対を同定するために、適切な前駆細胞
中の分子マーカー（例えば、骨形成関連マーカーまたは神経形成関連マーカー）
の発現を試験するインビトロアッセイを実施し得る。

【０１０１】 ＯＰ−１を用いて潜在的なホルモン／レセプター対を骨形成活性について試験
するための１つの有用なアッセイは、アルカリホスファターゼ（「ＡＰ」）酵素
アッセイである。ＡＰは、一次骨芽性胎児ラット頭蓋冠（「ＦＲＣ」）細胞にお
ける骨芽細胞分化マーカーである。ＯＰ−１刺激性のＡＰ活性は、増加した定常
状態のＡＰ ｍＲＮＡレベルから生じる。組成物の骨形成活性をモニタリングす
るために有用な他のタンパク質マーカーとしては、Ｉ型コラーゲン、オステオカ
ルシン、オステオポンチン、骨シアロタンパク質およびＰＴＨ−依存性ｃＡＭＰ
のレベルが挙げられるが、これらに限定されない。

【０１０２】 ＡＰアッセイは一般的に、以下のように実施される。第１に、種々の濃度およ
び比のホルモンおよびホルモンレセプターを選択し、そしてそれらを形態形成タ
ンパク質の非存在下および存在下で試験することによって、ホルモン／レセプタ
ー対を同定する。第２に、形態形成タンパク質と相乗作用する最適な好ましい組
織誘導を達成するために必要なホルモンおよびホルモンレセプターの量を、用量
応答曲線を作ることによって決定する。

【０１０３】 必要に応じて、形態形成タンパク質および第１のホルモン／レセプター対によ
って誘導される形態形成活性をさらに刺激するかまたはそうでなければこれを変
化させるさらなるホルモン／レセプター対が同定され得、そして新たな多因子用
量応答曲線が作られる。例えば、米国特許第５，８５４，２０７号の実施例５を
参照のこと。

【０１０４】 （骨誘導アッセイ） 本発明の様々な形態形成組成物およびデバイスをまた、エキソビボバイオアッ
セイまたはインビボバイオアッセイを用いて評価し得る。骨誘導についてのラッ
トのバイオアッセイを使用して、１つ以上のホルモン／レセプター対と協調する
骨形成タンパク質の骨形成活性をモニタリングし得る。例えば、Ｓａｍｐａｔｈ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，６５９１〜９５頁
（１９８３）、および米国特許第５，８５４，２０７号の実施例７を参照のこと
。ラットバイオアッセイは、インビトロ研究からインビボ研究に移行する際の第
１の工程として有用である。

【０１０５】 骨形成デバイス試験のための大型動物効力モデルは当該分野で公知である。代
表的なモデルは、ネコ大腿モデル、ウサギ尺骨モデル、イヌ尺骨モデルおよびサ
ルモデルである。例えば、米国特許第５，３５４，５５７号および同第５，８５
４，２０７号（その中の実施例１０および１１）を参照のこと。

【０１０６】 一般的に、約５００〜１０００ｎｇの活性形態形成タンパク質および約１０〜
２００ｎｇの活性ホルモンおよび活性ホルモンレセプターが、ラットバイオアッ
セイのための２５ｍｇのキャリアマトリックスと合わせられる。大型動物におい
て、典型的に、キャリア１ｇあたり約０．８〜１ｍｇの活性形態形成タンパク質
が、約１００ｍｇ以上の活性ホルモンおよびホルモンレセプターと合わせられる
。形態形成タンパク質対ホルモン、およびホルモン対特定の組織型に対するホル
モンレセプターの最適な比は、本明細書中に記載される手順に従って当業者によ
って実験的に決定され得る。大型移植片の場合はより多くの量が使用され得る。

【０１０７】 （腱／靱帯様組織形成バイオアッセイ） 形態形成タンパク質により誘導される腱および靱帯様組織形成をモニタリング
するためのアッセイは、当該分野で公知である。例えば、Ｃｅｌｅｓｔｅら、Ｗ
Ｏ ９５／１６０３５（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。こ
のようなアッセイを使用して、特定の処置部位において、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ
−１３または他の形態形成タンパク質により腱／靱帯様組織形成を刺激するホル
モン／レセプター対を同定し得る。このアッセイをまた使用して、治療組織修復
レジメンのための濃度および処置スケジュールを最適化し得る。

【０１０８】 これらのアッセイを使用して、様々な組み合わせの形態形成タンパク質および
ホルモン／レセプターの組み合わせを試験し、そして形態形成タンパク質および
ホルモン／レセプターの有効な相対濃度を決定するためのインビボ用量応答曲線
を作り得る。

【０１０９】 （神経アッセイ） 骨形成タンパク質ＢＭＰ−４およびＢＭＰ−７（ＯＰ−１）は、背側ニューロ
ン発生運命への分化を受ける腹側神経板外移植片を誘導し得る（Ｌｉｅｍら、Ｃ
ｅｌｌ，８２．９６９〜７９頁（１９９５））。背側細胞分化の分子マーカーは
、Ｌｉｅｍらに記載されている。これらのマーカーは、ＰＡＸ３およびＭＳＸ（
その発現は、神経板細胞分化の初期段階を表す）；神経管閉鎖後の段階の背側神
経板細胞の分化を表すＢＭＰ様分子であるＤＳＬ−１；およびＳＬＵＧタンパク
質（神経管閉鎖後のその発現は、移動前の神経堤細胞に特徴的である）を含む。
これらの背側マーカーの発現は、異所性ＢＭＰ−４およびＯＰ−１によって腹側
神経板外移植片で誘導され得る。

【０１１０】 ＢＭＰ−２を用いる末梢神経再生アッセイは、記載されている（Ｗａｎｇら、
ＷＯ ９５／０５８４６、本明細書中に参考として援用される）。このアッセイ
は、ラットにおいて、切断した坐骨神経の付近での神経形成デバイスの移植を包
含する。この手順を使用して、神経形成活性を有する形態形成タンパク質のホモ
ダイマーおよびヘテロダイマー（例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６
、およびＯＰ−１）、または任意の選択された神経形成タンパク質／ホルモン／
ホルモンレセプターの組合せの神経誘導活性を増大する推定ホルモン／レセプタ
ー対の能力を評価し得る。

【０１１１】 （薬学的組成物） 本発明の薬学的組成物は、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２，３または
５個）の形態形成タンパク質、および少なくとも１つ（例えば、少なくとも２ま
たは３個）のホルモン／レセプター対を含む。この組成物は、投与された場合（
例えば、患者に移植された場合）、組織形成を誘導し得る。この組成物は、所望
の処置部位に、特定の型の組織を誘導するのに有効な用量で投与される。好まし
い薬学的処方物、および所定の用途のための治療的に有効な用量のレジメンの決
定は、十分に当業者の範囲内である。考慮する必要のある因子としては、例えば
、投与様式、患者の状態および体重、所望の処置の程度、ならびに患者の処置に
対する耐性が挙げられる。

【０１１２】 処置レジメンを最適化するために適切な出発点であると期待される用量は、イ
ンビトロアッセイ、およびエキソビボまたはインビボアッセイの結果に依存する
。このようなアッセイの結果に基づいて、適切な形態形成タンパク質およびホル
モン／レセプターの濃度比の範囲を選択して、動物、次いでヒトの処置部位で試
験し得る。

【０１１３】 本発明の薬学的組成物は様々な形態であり得る。これらには、例えば、固体形
態、半固体形態および液体形態（例えば、錠剤、丸剤、散剤、液体、懸濁液、坐
剤、ゲル、ペースト、ならびに他の注射可能な溶液および注入可能な液体）が挙
げられる。好ましい形態は、意図する投与様式および治療用途に依存する。投与
様式は、経口投与、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、病巣内投与または局所
投与を含み得る。ほとんどの場合において、本発明の薬学的組成物は、組織再生
または修復の必要な処置部位の付近に投与される。

【０１１４】 本発明の薬学的組成物は、例えば、摂取または安定性を刺激する補因子を含む
かまたは含まない滅菌等張性処方物中に入れられ得る。例えば、この組成物は、
５ｍｇ／ｍｌのクエン酸一水和物、２．７ｍｇ／ｍｌのクエン酸三ナトリウム、
４１ｍｇ／ｍｌのマンニトール、１ｍｇ／ｍｌのグリセリンおよび１ｍｇ／ｍｌ
のポリソルベート２０を含有する処方物緩衝液を含み得る。この溶液は凍結乾燥
され、冷凍下で貯蔵され、そして投与の前に滅菌Ｗａｔｅｒ−Ｆｏｒ−Ｉｎｊｅ
ｃｔｉｏｎ（ＵＳＰ）で再構築され得る。

【０１１５】 この組成物はまた、当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアを含み得る
。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ，第１６版、１９８０，Ｍａｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎ
ｙを参照のこと。このような薬学的に受容可能なキャリアとしては、他の医薬、
キャリア、遺伝子キャリア、アジュバント、およびヒト血清アルブミンまたは血
漿調製物のような賦形剤が挙げられ得る。この組成物は、単位用量の形態であり
得、そして通常は、特定の組織処置に基づく用量レジメンとして投与される。

【０１１６】 本発明の薬学的組成物はまた、例えば、ミクロスフェア、リポソーム、他の微
粒子送達システム、あるいは患部組織もしくはそれらの組織を浴する血流中か、
その付近、さもなければそれらと連絡して配置された徐放処方物を使用する形態
形成デバイスの形態で投与され得る。

【０１１７】 本発明のポリペプチド混合物を含むリポソームは、周知の方法によって調製さ
れ得る。例えば、ＤＥ ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，３６８８−９２頁（１９８５
）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７
７，４０３０−３４頁（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号および同
第４，５４４，５４５号を参照のこと。通常、リポソームは、脂質含有量が約３
０ｍｏｌ％コレステロールを超える、小さな（約２００〜８００オングストロー
ム）単層型である。コレステロールの割合は、目的のポリペプチドの最適放出速
度を制御するように選択される。

【０１１８】 本発明のポリペプチド混合物はまた、組織誘導の速度および特性を調節するた
めに、他の生物学的に活性な分子を含有するリポソームに結合され得る。このよ
うな結合は、トキシンまたは化学治療剤を標的化送達のために抗体にカップリン
グするために広く使用されてきたヘテロ二官能性架橋剤のような架橋剤によって
達成され得る。リポソームへの結合体化もまた、炭水化物指向性（ｃａｒｂｏｈ
ｙｄｒａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）架橋剤４−（４−マレイミドフェニル）酪酸
ヒドラジドを使用して達成され得る。例えば、Ｄｕｚｇｕｎｅｓら、Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｂｓｔ．，Ｓｕｐｐｌ．１６Ｅ ７７（１９９２）を参
照のこと。

【０１１９】 （形態形成デバイス） 本発明の薬学的組成物は、移植可能な生体適合性キャリアをさらに含み得る。
このような組成物はまた、形態形成デバイスと呼ばれる。キャリアは、治療的タ
ンパク質のための徐放性送達システムとして機能し、そしてタンパク質を非特異
性タンパク質分解から保護する。キャリアは、インビボで生分解性であり得る。
徐放性キャリアは、成形物品（例えば、坐剤またはカプセル）の形態の半透性ポ
リマーマトリックスを含み得る。このようなキャリアは、ポリラクチド（米国特
許第３，７７３，３１９号；ＥＰ ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とエチル
−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、
２２、５４７〜５６頁（１９８５））；ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリ
レート）またはエチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａ
ｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５，１６７〜２７７頁（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈ
ｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２，９８〜１０５頁（１９８２））から作製され得る。

【０１２０】 キャリアはまた、新しい骨または他の適切な組織によって置換されるまで、遊
走性前駆細胞の補充のための一過的な骨格および基層として、そしてその引き続
く固定および増殖のために役立ち得る。例えば、この、キャリアは粒子から構成
されるかさもなくば所望の多孔性または微構造を有する生体適合性マトリックス
を含み得る。この孔は、関連前駆細胞の遊走、固定、分化および増殖を可能にす
る。粒子の大きさは、７０μｍ〜８５０μｍ、例えば、７０μｍ〜４２０μｍま
たは１５０μｍ〜４２０μｍの範囲であり得る。粒子性マトリックスは、処置さ
れるべき組織欠損に広がる形状に、粒子性の材料を密封することによって形作ら
れ得る。当該分野で公知の種々のマトリックスが使用され得る。例えば、米国特
許第４．９７５，５２６号、同５，１６２，１１４号、および同５，１７１，５
７４号、ならびにＷＯ９１／１８５５８を参照のこと（これら全てが本明細書中
に参考として援用される）。

【０１２１】 有用なマトリックス材料としては、コラーゲン；セルロース（カルボキシルメ
チルセルロースを含む）；グリコール酸、乳酸、および酪酸のホモポリマーまた
はコポリマー（これらの誘導体を含む）；およびヒドロキシアパタイト、リン酸
三カルシウム、および他のリン酸カルシウムのようなセラミックスが挙げられる
。例えば、米国特許第５，８５４，２０７号、２５章、５９行〜２７章、６行を
参照のこと。これらまたは他の適切なマトリックス材料の種々の組み合わせは、
本明細書中に示されるアッセイによって決定されたように有用であり得る。材料
の選択は、部分的には、そのインビボ溶解率に依存する。骨においては、インプ
ラントが皮質骨または海綿質のいずれに配置されるかに従って、この溶解率は変
化し得る。

【０１２２】 他の有用なマトリックスとしては、粒子性の、脱塩された、グアニジン抽出さ
れた、同種間の骨；および特に処理された粒子性の、タンパク質抽出された、脱
塩された異種間の骨が挙げられる。例えば、米国特許第５，８５４，２０７号の
実施例６を参照のこと。このような異種間の骨粉末マトリックスは、トリプシン
のようなプロテアーゼを使用して処置され得る。好ましくは、異種間マトリック
スは、粒子内侵入容量（多孔性）および表面積を増加するための１種類以上の原
線維修飾剤を使用して処理され得る。有用な修飾剤としては、ジクロロメタン、
トリクロロ酢酸、アセトニトリルのような溶媒、およびトリフルオロ酢酸および
フッ化水素のような酸が挙げられる。好ましい原線維修飾剤は、加熱水性培地、
好ましくは、約４．５未満のｐＨを有する酸性水性培地、最も好ましくは、包括
的に約ｐＨ２〜４の範囲のｐＨを有する酸性水性培地の形態である。酸性水性培
地は、例えば、約３のｐＨを有する０．１％酢酸である。水性培地中での脱塩さ
れ、脱脂され、グアニジン抽出された骨コラーゲンの、上昇された温度（例えば
、約３７℃〜６５℃の範囲、好ましくは約４５℃〜６０℃の範囲）での約１時間
の加熱は、一般に、所望の表面形態を達成するのに十分である。熱処理がコラー
ゲン原線維を改変して、粒子表面積を増大させると仮定される。

【０１２３】 異種間骨マトリックスは、種々の臨床設定において使用され得る。種々の整形
外科の、歯周部の、および再建的な手順における骨形成のためのマトリックスと
してのその使用に加えて、このマトリックスはまた、徐放性キャリアとしてかま
たは整形外科もしくは一般的な補綴のインプラントのための膠原性コーティング
として使用され得る。

【０１２４】 脱塩したグアジニン抽出の異種のウシ骨は、標準的生体分子精製技術を使用し
てさらに分画され得るさらなる材料の混合物を含む。例えば、骨抽出物は、クロ
マトグラフィーによって分画され得、そしてクロマトグラムピークに対応する種
々の抽出画分は、活性マトリックスへ共に戻され得る。そうすることによって、
骨または組織誘導性活性のインヒビターを除去し得、これによってマトリックス
性質を改善する。

【０１２５】 形態形成タンパク質およびホルモン／レセプター対に加えて、本発明の形態形
成デバイスは、他のホルモンおよび栄養剤をさらに含み得る。このデバイスは、
抗生物質、化学療法剤、酵素、酵素インヒビターおよび他の生理活性剤をまた含
み得る。これらの成分は、キャリア上に吸着され得るかまたはキャリア内に分散
され得、そしてキャリア物質はゆっくり吸収されるので、移植部位において長期
間放出される。

【０１２６】 （マトリックス性質の一般的考慮事項） マトリックスの性能に影響する因子としては、マトリックス形態、粒子サイズ
（マトリックスが粒子から構成される場合）、マトリックスおよび形態形成タン
パク質の組み合わせの方法論、粒子内および粒子間多孔性の程度、鉱物の存在、
ならびに表面電荷の存在が挙げられる。例えば、骨においてＯＰ−１および形態
形成タンパク質刺激因子を使用する誘導、化学的修飾によるマトリックス電荷の
摂動は、骨誘導性反応を無効にし得ることが示されている。粒子サイズはまた、
最大の反応を誘導可能な７０μｍと４２０μｍとの間のサイズで、新しい骨の定
量的反応に影響する。さらに、骨鉱物を有するマトリックスの混入は、骨形成を
阻害し得る。骨マトリックスにおける個々の重金属濃度は、本明細書中に記載の
方法によって約１ｐｐｍ未満に低減され得る。

【０１２７】 骨マトリックスおよび骨形成タンパク質インプラントの境界面での連続的な細
胞反応は複雑である。多段階カスケードは以下を含む：移植されたマトリックス
へのフィブリンおよびフィブロネクチンの結合、間葉細胞の遊走および増殖、前
駆細胞の軟骨芽細胞への分化、軟骨形成、軟骨石炭化、血管浸潤、骨形成、再構
築、および骨髄分化。成功したマトリックスは、これらの段階のそれぞれを含み
得る。

【０１２８】 マトリックスは、手術を予測して所望のように形成され得るか、または、手術
中に医者または技術者によって形成され得る。新しい骨は、移植されたデバイス
の寸法に基本的に従って形成されることが示されてきた。マトリックス材料がイ
ンビボで生物分解性である場合、マトリックス材料は身体にゆっくりと吸収され
、そしてインプラントの形でかまたはインプラントに非常に近い形で、新しい骨
によって置換される。従って、このマトリックスは、好ましくは、組織欠損に広
がるようにそして新しい組織の所望の形態を取るように形成され得る。例えば、
偽関節（ｎｏｎ−ｕｎｉｏｎ）欠損の骨修復の場合には、偽関節に広がる寸法を
使用することが所望され、そして新しい骨が最終的に欠損を満たす。

【０１２９】 マトリックスは、緩やかに接着する粒子性材料（例えば、コラーゲン）から作
製される形状保持固体であり得る。あるいは、このマトリックスは、型取られた
多孔性固体であるか、または、周辺組織によって適所に維持された密接に詰め込
まれた粒子の凝集であり得る。粉砕された筋肉または他の組織もまた使用され得
る。骨髄腔が清浄され、そして分散した骨形成タンパク質およびホルモン／レセ
プター対を含む粒子が詰め込まれる場合、大きい同種系骨インプラントは、マト
リックスのキャリアとして作用し得る。

【０１３０】 マトリックスはまた、ペーストまたはヒドロゲルの形態を取り得る。「ヒドロ
ゲル」は、ゲルの形態で架橋した親水性ポリマーの３次元ネットワークをいう。
このゲルは、実質的に水から構成され、例えば、９０％を超える水から構成され
る。ヒドロゲルマトリックスは、ポジティブまたはネガティブの正味電荷を保有
し得るか、または非荷電（ｎｅｕｔｒａｌ）であり得る。代表的な正味ネガティ
ブ電荷のマトリックスは、アルギン酸塩である。正味ポジティブ電荷を保有する
ヒドロゲルは、例えば、コラーゲンおよびラミニンのような、細胞外マトリック
ス成分である。市販の細胞外マトリックス成分の例には、ＭＡＴＲＩＧＥＬ^TMお
よびＶＩＴＲＯＧＥＮ^TMが挙げられる。正味非荷電のヒドロゲルの例は、高度に
架橋されたポリエチレンオキシドまたはポリビニルアルコールである。

【０１３１】 （補綴デバイス） 本発明はまた、治療量および治療割合で、少なくとも１つの形態形成タンパク
質および少なくとも１つのホルモン／レセプター対を含む移植可能な補綴デバイ
スを特徴とする。このデバイスは、同じまたは他の形態形成タンパク質またはホ
ルモン／レセプター対を含む組成物と組み合わせて使用され得る。補綴デバイス
は、金属またはセラミックを含む材料から作製され得る。例示的な補綴デバイス
は、脊椎融合のための、腰部デバイス、ねじ、ロッド、およびチタンケージであ
る。このデバイスは、標的組織および補綴デバイスの表面が、標的組織とデバイ
スとの間の増強された組織増殖を可能にするのに十分な時間、少なくとも部分的
に接触して維持される部位で、哺乳動物（例えば、ヒト）において移植される。

【０１３２】 骨形成組成物は、哺乳動物の標的組織に隣接させて補綴インプラントの表面領
域に配分され得る。好ましくは、哺乳動物はヒト患者である。組成物は、インプ
ラント内へかまたはその表面への組織増殖の増強を促進するに十分な量で配分さ
れる。使用され得る組成物の量は、本明細書中およびＲｕｅｇｅｒら，米国特許
第５，３４４，６５４号（本明細書中に参考として援用される）に記載されるよ
うなバイオアッセイを用いて経験的に決定され得る。好ましくは、類似する補綴
デバイスをヒト患者に用いる前に、デバイス中の成分の濃度を最適化するために
動物研究を行う。このような補綴デバイスは、処置される動物において、整形外
科的損傷、傷害、または奇形を修復するのに有用である。

【０１３３】 （形態形成組成物および形態形成デバイスの有用性） 本発明の組成物、デバイスおよび方法により、医者は、種々の組織傷害、組織
退行性状態または疾患組織状態の処置が可能となる。この組成物およびデバイス
は、局所的な組織形成または再生を刺激することによって、これらの状態を緩和
または治療し得る。

【０１３４】 本発明のデバイスは、インプラントがこの哺乳動物の適切な前駆細胞に接近し
得るように、哺乳動物の所望の部位に移植され得る。このデバイスは、単独また
は組織修復および再生のための他の治療法と組み合わせて用いられ得る。

【０１３５】 本発明の形態形成デバイスはまた、軟骨または軟組織の修復に用いるために間
接またはその周囲に移植され得るか、または神経の再生および修復に用いるため
に、神経系関連組織またはその周囲に移植され得る。特定の形態形成タンパク質
（または形態形成タンパク質と他の生物学的因子との組合せ）の組織特異性は、
このような処置に利用され得る細胞のタイプまたは組織を決定し、そして当業者
によって選択され得る。従って、本発明によるホルモン／レセプター対の同時投
与による形態形成タンパク質誘導性組織再生を増強する能力は、特定の細胞のタ
イプまたは組織にも制限されないと考えられる。

【０１３６】 本発明の骨形成組成物およびデバイスにより、医者は、少なくともほぼ同じ程
度の骨形成または軟骨形成を達成するためにより少量の骨形成タンパク質を用い
て、骨、靭帯および／または軟骨形成を予測し得る。本発明の骨形成組成物およ
びデバイスを用いて、骨形成デバイスの先行技術において記載されてきた傷害、
奇形および障害をより効果的に処置し得る。これらとしては、例えば、骨折、偽
関節骨折（ｎｏｎ−ｕｎｉｏｎ ｆｒａｃｔｕｒｅ）、融合（ｆｕｓｉｏｎ）お
よび骨間隙（ｂｏｎｙ ｖｏｉｄ）（例えば、腫瘍切除から生じるものまたは嚢
胞から生じるもの）での局所的な骨形成；後天性および先天性の脳顔面頭蓋およ
び他の骨格または歯科的奇形の処置（例えば、Ｇｌｏｗａｃｋｉら，Ｌａｎｃｅ
ｔ，１，９５９−６３頁（１９８１））；下顎骨におけるような、失った骨の置
換または骨増量が必要である場所での歯科的および歯周的再構築の実施；ならび
に歯の損失を遅らせるかまたは予防するために、歯周病によって生じた歯槽骨損
失の補填（例えば、Ｓｉｇｕｒｄｓｓｏｎら，Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．６
６，５１１−２１頁（１９９５））を参照のこと）が挙げられる。

【０１３７】 同種異系骨を含むマトリックスを含む、本発明の骨形成性デバイスはまた、哺
乳動物における同種移植片修復および取り込みを促進するために、骨の置換を必
要とする部位に移植され得る。本発明の改善された骨形成デバイスの別の潜在的
な臨床的適用は、例えば以下の関節損傷の軟骨修復、または変形性関節症の処置
にある。ホルモン／レセプター対を同時投与することによる形態形成タンパク質
の軟骨誘導活性を増強する能力は、同じかまたは低いレベルの形態形成タンパク
質を使用する、より早いかまたはより広範な組織修復または置換を可能にし得る
。

【０１３８】 本発明の形態形成組成物および形態形成デバイスは、軟骨、骨および他の組織
の特定の先天性疾患および発達異常を処置する際に有用である。例えば、ホモ接
合性ＯＰ−１−欠損マウスは、腎不全に起因して誕生の２４時間以内に死亡する
（Ｌｕｏら，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．，１０（補遺１）Ｓ１６３頁（１
９９５））。これらのマウスにおける腎不全は、間葉組織凝縮の欠如に起因する
腎糸球体の形成の失敗に関与する。ＯＰ−１−欠損マウスはまた、それらの後肢
、肋骨籠および頭蓋に関連する種々の骨格異常性を有し、多指趾症であり、そし
て異常な網膜発達を示す。これらの結果は、背のニューロン発生運命への分化を
誘導するＯＰ−１の能力に関して上で議論した結果と組み合わせて、ＯＰ−１が
発達の間の上皮−間葉相互作用において重要な役割を果たすことを示す。本発明
の組成物、デバイスおよび方法がこれらおよび他の発達異常性を寛解するために
有用であることが予測される。

【０１３９】 骨の発達異常は、隔離されたかまたは複数の領域の骨格または特定の支持組織
型または結合組織型に影響を与え得る。これらの異常性はしばしば、複雑な骨移
植手順および整形外科デバイスを必要とする。このような手順の後に必要とされ
る組織修復および再生は、本発明の形態形成組成物、デバイスおよび方法を使用
してより迅速にかつ完璧に行われ得る。

【０１４０】 本発明の形態形成組成物およびデバイスの使用が有用である、先天的な骨疾患
を含む遺伝性状態の例としては、骨形成不全症、フルラー症候群およびマルファ
ン症候群、ならびに低ホスファターゼ血症に存在するような骨端成長中心および
骨幹端成長中心のいくつかの障害、アルカリホスファターゼ酵素活性の欠損が挙
げられる。

【０１４１】 炎症性関節疾患もまた、本発明の改善された方法、組成物およびデバイスの恩
恵を受け得る。これらの疾患としては、以下が挙げられるが、これらに限定され
ない：慢性関節リウマチおよび乾癬性関節炎、滑液包炎、潰瘍性大腸炎、限局性
腸炎、ホウィップル病、強直性脊椎炎（マリーシュトリュンペン病またはベヒテ
レフ病とも呼ばれる）、およびいわゆる「膠原病」（例えば、全身性エリテマト
ーデス（ＳＬＥ）、進行性全身性硬化症（強皮症）、多発性筋炎（皮膚筋炎）、
壊死性脈管炎（ｖａｓｃｕｌｉｔｉｄｅｓ），シェーグレン症候群（乾燥症候群
）、リウマチ熱、アミロイドーシス、血栓性血小板減少性紫斑病および再発性多
発性軟骨炎）。結合組織の遺伝的障害としては、マルファン症候群、ホモシスチ
ン尿症、エーレルス−ダンロー症候群、骨形成不全症、アルカプトン尿症、弾性
線維性仮性黄色腫、弛緩性皮膚、フルラー症候群、および進行性骨化性筋炎が挙
げられる。

【０１４２】 （実施例） 以下は、本発明の形態形成組成物およびデバイス、ならびにそれらを特徴付け
るために使用される方法を例示する実施例である。これらの実施例は、限定とし
て解釈されるべきではない。これらは、例示の目的で含まれ、そして本発明は特
許請求の範囲によってのみ限定される。

【０１４３】 （実施例１） 図１は、それぞれ、ＦＲＣ細胞におけるＯＰ−１誘導ＡＰ活性に対する、Ｉｌ
−６、ｓＩＬ−６Ｒおよび組換えヒトＩＬ−６と組換えヒトｓＩＬ−６Ｒとの混
合物（「ＩＬ−６／Ｒ」）の効果を各々示す。コンフルエントなＦＲＣ細胞を、
示された薬剤で２４時間処理した。使用した薬剤の濃度（ｎｇ／ｍｌ）を括弧中
に示す。ＩＬ−６／Ｒについて、これら２つのモル比を、約１．２で維持し、そ
してまたそれらの各々の量を括弧中に示す。総ＡＰ活性を分光光度的に決定した
。総細胞性タンパク質をＢｒａｄｆｏｒｄ Ａｓｓａｙにより決定した。ＡＰ比
活性をＡＰ／タンパク質単位として算出した。ＡＰ活性値を１５０ｎｇ／ｍｌ
ＯＰ−１（＝１）の活性で正規化し、そして３つの異なるＦＲＣ細胞調製物を使
用して、８〜１２の独立した決定の平均を示す。

【０１４４】 図１に示すように、試験した濃度範囲のＩＬ−６単独は、基底のＡＰ活性を刺
激しなかった。ＳＩＬ−６Ｒ単独は基底のＡＰ活性をわずかに刺激した（しかし
、その刺激はｓＩＬ−６Ｒ用量依存性ではなかったようである）。

【０１４５】 図１はさらに、ＩＬ−６がＯＰ−１誘導ＡＰ活性を用量依存性様式で増強する
ことを示す。約２倍の刺激の最大値を観察した（ｐ＜０．０５）。ＳＩＬ−６Ｒ
はまた、用量依存性様式でＯＰ−１誘導ＡＰ活性を増強した。ＩＬ−６で観察し
た刺激よりも高い倍率（約３．５倍；ｐ＜０．０２）の刺激が達成された。

【０１４６】 ＯＰ−１誘導ＡＰ活性に対するＩＬ−６Ｒの効果も試験した。ＩＬ−６および
その可溶性レセプターの最も高い試験用量（１００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−６および
１２５ｎｇ／ｍｌ ｓＩＬ−６Ｒ）で、ＯＰ−１誘導ＡＰ活性を約１０倍相乗的
に増強した。この増強は再現可能であった。しかし、より低い少量範囲では、Ｉ
Ｌ−６／Ｒの組み合わせは、ＩＬ−６またはそのレセプター単独のいずれかによ
り達成した増強をこえては刺激しなかったようである；対して、この組み合わせ
はＡＰ活性を抑制したようである。

【０１４７】 （実施例２） 図２は、ＩＬ−６単独で、鉱化された骨小節形成アッセイにおいてＯＰ−１作
用を増強したことを示す。ＦＲＣ細胞をαＭＥＮ（５％ＦＢＳ、３０μｇ／ｍｌ
ゲンタマイシン、１００μｇ／ｍｌアルコルビン酸および５ｍＭβ−グリセロー
ルホスフェートを補充した）中で増殖させ、そして（１）溶媒ビヒクル、（２）
２００ｎｇ／ｍｌ ＯＰ−１、または（３）２００ｎｇ／ｍｌ ＯＰ−１および
種々の濃度のＩＬ−６で、種々の時間処理した。培養培値に同じ処理薬剤を３日
毎に補充した。小節形成の進行を３日毎にモニターした。全部で１５日後、細胞
をホルマリンで固定し、そして撮影した。図３において見られるように、ＩＬ−
６／Ｒもまた、鉱化した骨小節の形成を誘導するＯＰ−１の能力を増強した。

【０１４８】 （実施例３） ＩＬ−６／Ｒが、ＯＰ−１応答性細胞を直接刺激することによるか、またはＯ
Ｐ−１応答性細胞の数を増加させることによりＯＰ−１との相乗作用をもたらす
か否かを決定するために、ＦＲＣの初代培養物をモデル系（ここでは、ＡＰ活性
レベルをＯＰ−１応答性の生化学的マーカーとして使用する）として使用した。
組織化学的データは、ＩＬ−６／Ｒ（４０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−６および５０ｎｇ
／ｍｌ ｓＩＬ−６Ｒ）およびＯＰ−１（２００ｎｇ／ｍｌ）で処理した培養物
中のＡＰ陽性細胞の数が、ＯＰ−１単独（２００ｎｇ／ｍｌ）で処理した培養物
中のＡＰ陽性細胞の数と似ていることを示した。しかし、ＡＰ活性レベルは後者
の培養物より前者の培養物において高かった。ＩＬ−６ＲとＯＰ−１との組み合
わせと比較して、ＩＬ−６単独（４０ｎｇ／ｍｌ）は、ＡＰ陽性細胞を刺激せず
；そしてｓＩＬ−６Ｒ単独（５０ｎｇ／ｍｌ）またはＩＬ−６Ｒ（４０ｎｇ／ｍ
ｌ ＩＬ−６および５０ｎｇ／ｍｌ ｓＩＬ−６Ｒ）は、より少ない程度にＡＰ
陽性細胞を刺激した。これらのデータは、ＯＰ−１に対するＩＬ−６／Ｒの相乗
的効果が、ＩＬ−６／Ｒの、ＯＰ−１応答性細胞の直接的な刺激から生じること
を示唆する。

【０１４９】 （実施例４） ＩＬ−６／ＲがＦＲＣ細胞上でのＯＰ−１レセプターの発現を刺激するか否か
を研究するために、３つのＢＭＰ Ｉ型レセプター（ＢＭＰＲ−ＩＡ、ＢＭＰＲ
−ＩＢおよびＡｃｔＲ−Ｉ）および１つのＢＭＰ ＩＩ型レセプター（ＢＭＰＲ
−ＩＩ）のｍＲＮＡレベルをノーザンブロット分析により測定した。

【０１５０】 簡単には、コンフルエントなＦＲＣ細胞を、（１）ビヒクル；（２）２００ｎ
ｇ／ｍｌ ＯＰ−１；（３）４０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−６および５０ｎｇ／ｍｌ
ｓＩＬ−６Ｒ；または（４）２００ｎｇ／ｍｌ ＯＰ−１、４０ｎｇ／ｍｌ Ｉ
Ｌ−６および５０ｎｇ／ｍｌ ｓＩＬ−６Ｒで４８時間処理した。総ＲＮＡをＴ
ＲＩ試薬（Ｓｉｇｍａ）を使用して単離し、そしてホルムアルデヒドを含むＡＧ
ＡＲＯＳＥ ＧＴＧ（ＦＭＣ）ゲル上にローディングした。ノーザンブロットを
調製し、そして種々のＢＭＰＲをコードする³²Ｐ標識化ｃＤＮＡでプロービング
した。これらのプローブはｍＲＮＡのみにハイブリダイズした。放射活性バンド
を検出し、そしてＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎ
ａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して定量した。ＢＭＰＲバンド
のバンド強度を正規化するために、ブロットをまた１８Ｓ ｒＲＮＡについてオ
リゴヌクレオチドでプロービングした。

【０１５１】 コントロールＦＲＣ細胞、ＯＰ−１処理した細胞、ＩＬ−６／Ｒ処理した細胞
、および（ＯＰ−１＋ＩＬ−６／Ｒ）処理した細胞におけるｍＲＮＡレベルを、
比較した（図４）。データは、ＯＰ−１はＩ型レセプターのｍＲＮＡレベルに影
響しないが、ＢＭＰＲ−ＩＩ ｍＲＮＡレベルを約２．２倍刺激することを示し
た。同様に、ＩＬ−６／Ｒは、Ｉ型レセプターのｍＲＮＡ発現レベルを変更しな
かったが、ＢＭＰＲ−ＩＩ ｍＲＮＡレベルを約１．５倍増加させた。ＯＰ−１
およびＩＬ−６／Ｒの存在下では、Ｉ型レセプターのｍＲＮＡレベルは有意には
変化せず；しかしＢＭＰＲ−ＩＩ ｍＲＮＡレベルは、コントロールよりもほぼ
３倍高かった。これらの結果は、ＩＬ−６／ＲがＢＭＰＲ−ＩＩ ｍＲＮＡ発現
を上昇させることにより、ＯＰ−１の骨形成活性を刺激し得ることを示唆する。

【０１５２】 （実施例５） 実施例１〜５で使用するＯＰ−１タンパク質を、試験細胞に外因的に提供した
。同じＩＬ−６／Ｒ相乗効果が、ＯＰ−１タンパク質が試験細胞中で細胞内に発
現される場合に観察されるか否かを研究するために、ＦＲＣ細胞をｐＷ２４（Ｃ
ＭＶプロモーターの制御下でＯＰ−１コード配列を保有するプラスミド）でトラ
ンスフェクトした。

【０１５３】 簡単には、コンフルエントなＦＲＣ細胞をｐＷ２４（２μｇ／ｍｌ）でトラン
スフェクトした。回収後、トランスフェクトした細胞を外因性ｓＩＬ−６Ｒ単独
またはＩＬ−６／Ｒで２４時間処理した。次いで、総ＡＰ活性レベルを決定した
（図５）。

【０１５４】 このデータは、ｐＷ２４トランスフェクト細胞におけるＯＰ−１誘導ＡＰ活性
のレベルがｓＩＬ−６Ｒにより用量依存性様式で増強されることを示した。７５
ｎｇ／ｍｌの濃度では、ｓＩＬ−６Ｒは、ＯＰ−１誘導ＡＰ活性を４倍も刺激し
た。

【０１５５】 このデータはまた、ｐＷ２４トランスフェクト細胞におけるＯＰ−１誘導ＡＰ
活性のレベルがＩＬ−６／Ｒによっても用量依存性様式で増強されたことを示し
た。ＩＬ−６／ＲをＩＬ−６については６０ｎｇ／ｍｌ、そしてｓＩＬ−６Ｒに
ついては７５ｎｇ／ｍｌの濃度で試験細胞に適用した場合に、ＯＰ−１誘導ＡＰ
活性の２．５倍の刺激を観察した。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、インターロイキン６（「ＩＬ−６」）および可溶性ＩＬ−６レセプタ
ー（「ｓＩＬ−６」）の組み合わせによって、ＯＰ−１が胎児ラット頭蓋冠（「
ＦＲＣ」）細胞におけるアルカリホスファターゼ（「ＡＰ」）活性を誘導する能
力が有意に増加されたことを示す棒グラフである。「ＯＰ」は、「ＯＰ−１」を
表し；「ＩＬ−６Ｒ」は、「ｓＩＬ−６Ｒ」を言及する。括弧内の数値は、この
アッセイに使用されたタンパク質濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示し；ＩＬ−６／ｓＩＬ
−６Ｒの組み合わせの場合、括弧内のバックスラッシュによって分けられた２つ
の数値が、それぞれ、ＩＬ−６およびｓＩＬ−６Ｒのタンパク質濃度を示す。

【図２】 図２は、ＯＰ−１およびＩＬ−６を使用する鉱化骨小節形成アッセイの結果を
示す写真である。ウェル内部の暗色スポットは、鉱化された骨小節を表す。

【図３】 図３は、ＯＰ−１、ＩＬ−６、およびｓＩＬ−６Ｒを使用する鉱化骨小節形成
アッセイの結果を示す写真である。ウェル内部の暗色スポットは、鉱化された骨
小節を表す。

【図４】 図４は、種々の試験群におけるＢＭＰＲ−ＩＡ、ＢＭＰＲ−ＩＢ、ＡｃｔＲ−
Ｉ、およびＢＭＰＲ−ＩＩのｍＲＮＡレベルを示す棒グラフである。「ｓＲ」は
、ｓＩＬ−６Ｒを表す。グラフにおける値は、２つの異なるＦＲＣ細胞調製物か
ら単離されたＲＮＡを用いる１２回のノーザンブロットの平均±ＳＥを表す。

【図５】 図５は、ＯＰ−１コードｐＷ２４プラスミドでトランスフェクトされたＦＲＣ
細胞におけるＡＰ活性が、異種ｓＩＬ−６Ｒ単独またはＩＬ−６およびｓＩＬ−
６Ｒの組み合わせ（「ＩＬ−６／Ｒ」）によって増強されることを示す棒グラフ
である。「ＩＬ６Ｒ」は、ｓＩＬ−６Ｒを表す。グラフにおける値は、３つの異
なるＦＲＣ細胞調製物および２つの異なるＤＮＡ調製物を用いる５つの独立した
測定の平均±ＳＥを表す。「ＩＬ−６／Ｒ（Ｘ／Ｙ）」は、Ｘ ｎｇ／ｍｌのＩ
Ｌ−６およびＹ ｎｇ／ｍｌのｓＩＬ−６Ｒを言及する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １０１ Ｃ０７Ｋ 14/715 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ０７Ｋ 14/51 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 14/715 Ａ６１Ｋ 37/24 (72)発明者 イー， リー−チュアン シー． アメリカ合衆国 テキサス 78250， サ ン アントニオ， インディアン ベンド 8027 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 BA63 CA01 DA02 EA02 EA04 FA02 GA11 HA17 4C084 AA01 AA02 BA01 BA08 DA18 DB60 DC50 MA02 NA05 ZA362 ZA892 ZA962 4H045 AA30 BA10 CA40 DA01 DA50 EA20

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 哺乳動物中の標的位置での形態形成タンパク質の組織誘導能
   力を改善する方法であって、該方法は、該標的位置に、該形態形成タンパク質と
   、第１有効量のホルモンと、第２有効量の該ホルモンの可溶性レセプターとを投
   与する工程を包含し、ここで、該形態形成タンパク質は、該哺乳動物中の前駆細
   胞に到達可能である場合に組織形成を誘導し得、そして該ホルモンおよび該レセ
   プターは共同して、その能力を増強する、方法。
2. 【請求項２】 前記形態形成タンパク質が、ジスルフィド結合したサブユニ
   ット対を含んでダイマー種を生成し、該サブユニットの少なくとも１つが、ＢＭ
   Ｐタンパク質ファミリーに属するポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記形態形成タンパク質が、骨形成タンパク質である、請求
   項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記骨形成タンパク質が、軟骨性骨または膜性骨を形成する
   ように、前記前駆細胞を誘導し得る、請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記骨形成タンパク質が、軟骨を形成するように前記前駆細
   胞を誘導し得る、請求項３に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記形態形成タンパク質が、腱／靱帯様組織、または神経様
   組織を形成するように、前記前駆細胞を誘導し得る、請求項１に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記形態形成タンパク質が、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭ
   Ｐ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）、ＢＭＰ−８、ＢＭ
   Ｐ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＣＯＰ−
   ５またはＣＯＰ−７のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％相同性のアミノ酸
   配列を含む、請求項１に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ
   −４およびＢＭＰ−６からなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項７
   に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記形態形成タンパク質がＯＰ−１である、請求項８に記載
   の方法。
10. 【請求項１０】 前記ダイマーが、ＢＭＰ−２サブユニットまたはＢＭＰ−
    ７（ＯＰ−１）サブユニットを含む、ホモダイマーまたはヘテロダイマーである
    、請求項２に記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記ホルモンが、インターロイキン６（ＩＬ−６）である
    、請求項１に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記ホルモンが、ＩＬ−６である、請求項７に記載の方法
    。
13. 【請求項１３】 前記ホルモンが、ＩＬ−６である、請求項９に記載の方法
    。
14. 【請求項１４】 前記形態形成タンパク質、前記ホルモン、および前記ホル
    モンレセプターが、前記標的位置に同時に投与される、請求項１に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記形態形成タンパク質、前記ホルモン、および前記ホル
    モンレセプターが、前記標的位置に別々に投与される、請求項１に記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記ホルモンおよび前記ホルモンレセプターが、前記標的
    位置に同時に投与される、請求項１に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記標的位置が、下顎骨欠損部位である、請求項１に記載
    の方法。
18. 【請求項１８】 前記標的位置が、骨折、偽関節骨折、危機的サイズの欠損
    、非危機的サイズの欠損、骨軟骨欠損、融合および骨間隙からなる群から選択さ
    れる骨欠損の部位である、請求項１に記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記標的位置が、組織変性状態を有する、請求項１に記載
    の方法。
20. 【請求項２０】 前記標的位置が、軟骨または軟部組織の欠損部位である、
    請求項１に記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記標的位置が、神経組織の欠損部位である、請求項１に
    記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記形態形成タンパク質が、マトリックス含有キャリア中
    において投与される、請求項１に記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記キャリアが、同種異系骨を含む、請求項２２に記載の
    方法。
24. 【請求項２４】 前記形態形成タンパク質が核酸を介して投与され、該核酸
    は、該形態形成タンパク質をコードする配列を含み、かつ前記前駆細胞中におい
    て該形態形成タンパク質を発現し得る、請求項１に記載の方法。