JP2003528922A - 形態形成タンパク質および形態形成タンパク質刺激因子を用いた新脈管形成を誘導するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、形態形成タンパク質を用いた、哺乳動物の標的部位における脈管形成を誘導するための方法を提供する。さらに、本発明はまた、哺乳動物の標的部位における形態形成タンパク質の脈管形成の能力を改善するための方法を特徴とする。この方法において、形態形成タンパク質は、哺乳動物において前駆細胞に接近可能である場合、脈管形成を誘導し得、そして形態形成タンパク質刺激因子は、この能力を増強する。形態形成タンパク質および形態形成タンパク質刺激因子は、この標的部位に同時に投与され得る。あるいは、これらの２つの成分は、いずれかの順序で別々に投与される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） 血液血管（ｈｅｍｏｖａｓｃｕｌａｒ）発生は、脈管形成（ｖａｓｃｕｌｏｇ
ｅｎｅｓｉｓ）、間葉由来の内皮細胞の凝集を介した血管の新規形成、および新
脈管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）（既存の脈管網からの新規血管の増殖）
を含むプロセスである（ＺｉｍｒｉｎおよびＭａｃｉａｇ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎ
ｖｅｓｔ．、９７、１３９５頁（１９９６）；Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓら、Ｃｅ
ｌｌ、９３、６６１−６６４頁（１９９８）；ＩｓｎｅｒおよびＡｓａｈａｒａ
、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０３、１２３１−１２３６頁（１９９９）
）。脈管形成は、正常には胚発生に関与するが、一方、新脈管形成（これもまた
、胚の発生において役割を果たす）は、成体における種々の生理学的プロセスお
よび病理学的プロセスにおいて中心的に重要性なものである（Ｆｏｌｋｍａｎ、
Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、４０１、２１２−２２７頁（１９８２）
；ＦｏｌｋｍａｎおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３５、４４２
−４４７頁（１９８７）；Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、２２、２５１−２５６頁（１９９７）；Ｇｌｏｗａ
ｃｋｉ、Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．、３５５、Ｓ８２−Ｓ８９頁（１９９８）；
Ｇｅｒｂｅｒら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、５、６２３−６２８頁（１９９９））。

【０００２】 新脈管形成は、成体の組織の再構築の間および疾患における脈管系の生成にお
いて重要な役割を果たす、形態形成プロセスである。その重要な役割に起因して
、新脈管形成は、適切に調節されなければならない。新脈管形成因子と抗新脈管
形成因子との間の平衡は、適切な新脈管形成のために必要である。不適切な新脈
管形成は、過剰な血管の増殖または不適切な血管の増殖のいずれかを生じ得る。
例えば、過剰な血管新生は、慢性関節リウマチ、腫瘍増殖、腫瘍転移および糖尿
病性網膜症を生じる。一方、不適切な血管新生は、発作、虚血、および心筋梗塞
を含む心臓の発作を生じ得る。

【０００３】 種々の生理学的プロセスおよび病態生理学は、新脈管形成を必要とする。これ
らとしては、再生、創傷治癒、器官移植、骨修復、虚血性心臓疾患および虚血性
末梢血管疾患が挙げられる。

【０００４】 新脈管形成は、創傷治癒において重要な役割を果たす。新規に形成された毛細
管は、細胞、栄養素および細片を創傷へおよび創傷から運搬する手段として働く
。新脈管形成はまた、潰瘍のような炎症性疾患の治癒を加速することに関与する
。同様に、新脈管形成は、器官移植において役割を果たす。血管新生は、新規に
移植された器官の機能化のために重要である。新脈管形成は、新規に移植された
器官への血流を可能にし、従って、器官の維持のために栄養素を提供する。

【０００５】 新脈管形成はまた、組織形成の間に重要な役割を果たす。特定の組織を形成す
るために、その組織の適切な脈管の浸潤についての必要性が存在する。例えば、
骨形成の間、脈管浸潤の非存在下では、軟骨のみが形成される。しかし、脈管浸
潤が存在する場合、次いで骨形成が観察される。

【０００６】 心筋障害（例えば、心筋肥大または閉塞性の冠状動脈疾患）は、心筋虚血を生
じる。これらの病理学は、虚血性の損傷から心臓を保護するために、心筋への脈
管の供給における改善を必要とする。心筋梗塞は、深刻な組織損傷および壊死を
生じる。新脈管形成は、細胞の細片を除去し、そして必要な酸素の供給を心臓に
提供するように機能する。従って、哺乳動物において新脈管形成を増強するため
の方法を提供する必要性が存在する。

【０００７】 いくつかの新脈管形成因子が単離され、精製され、そして特徴付けられてきた
（ＦｏｌｋｍａｎおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３５、４４２
−４４７頁（１９８７）；Ｚａｇｚａｇ、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１４６、
２９３−３０９頁（１９９５）；Ａｌｉｎｉら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１７６、１
２４−１３３頁（１９９６））。例えば、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、トラ
ンスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子
−β（ＴＧＦ−β）および他の関連のペプチドが、新脈管形成活性を有するとし
て同定されている。しかし、現在まで、これらの新脈管形成因子が、上記の病態
生理学の処置のために不適切であることが証明された。従って、新脈管形成を誘
導する新規の因子および方法が、必要である。

【０００８】 トランスフォーミング増殖因子−β（「ＴＧＦ−β」）スーパーファミリーは
、増殖、分化、組織形態形成および修復において種々の活性を有する、進化的に
保存された形態形成タンパク質の多数を代表する。このスーパーファミリーとし
ては、骨形成タンパク質（「ＯＰ」）および骨形態形成タンパク質（「ＢＭＰ」
）が挙げられる。ＯＰおよびＢＭＰは、それらのＣ末端近くの高度に保存された
生物活性のシステインリッチドメインを共有し、そしてホモ二量体およびへテロ
二量体を形成する傾向を有する。

【０００９】 ＢＭＰファミリーに属する多くの形態形成タンパク質が、記載されてきた。い
くつかは、骨形成活性に基づいた精製技術を使用して単離された。他は、ＢＭＰ
ファミリーに共通する保存された領域内でのＤＮＡ配列の相同性によって同定さ
れ、クローニングされた。これらのホモログは、明らかな骨形成活性を有するか
否かにかかわらず、連続的に番号付けられたＢＭＰとしていわれる。このＢＰＭ
ファミリーの初期のメンバーのいくつかは新規の軟骨および骨を誘導するそれら
の活性によって同定されたが、他のＢＭＰの多くは、異なる組織誘導能力または
さらなる組織誘導能力を有する。他のＢＭＰは、他の組織を誘導すると報告され
ている。例えば、報告によれば、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのＢＭＰ様メン
バーであるＧＤＦ−５は、いくつかの新脈管形成活性を有する。しかし、ＴＧＦ
−βスーパーファミリーファミリーのメンバーであるＢＭＰ−２は、有さない（
Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．、２３５、２１８−２２６
頁（１９９７））。さらに、報告によれば、ＢＭＰ−１２およびＢＭＰ−１３（
ＤＮＡ配列の相同性によって同定された）は、インビボの腱／靭帯様組織形成を
誘導する（ＷＯ９５／１６０３５）。いくつかのＢＭＰ（元々その骨形成活性に
基づいて単離されたいくつかのＢＭＰを含む）は、ニューロン増殖を誘導し得、
そして軸策の再生を促進し得る（ＷＯ９５／０５８４６；Ｌｉｅｍら、Ｃｅｌｌ
、８２、９６９−７９頁（１９９５））。従って、ＢＭＰは、種々の潜在的な組
織誘導能力を有し得、その最終的な発現は、発生の合図および環境の合図の複雑
なセットに依存するようである。

【００１０】 精製されかつ高度に活性な多量の形態形成タンパク質の利用可能性は、脈管組
織再生を一般的に含む手順を激変させる。哺乳動物のＯＰおよびＢＭＰをコード
する遺伝子の多くは、現在クローン化され、そして細菌を含む種々の宿主系にお
いて活性な、ホモ二量体およびヘテロ二量体タンパク質として組換え的に発現さ
れ得る。ＯＰおよびＢＭＰのような形態形成タンパク質（増大した生物活性を有
する改変体および変異体を含む（以下を参照のこと））の活性形態を組換え的に
生成する能力は、形態形成タンパク質を使用する潜在的な治療処置を、実現可能
にする。

【００１１】 新脈管形成の誘導における、形態形成タンパク質の潜在的な治療的使用に関し
て、非常に活性な形態の形態形成タンパク質の必要性が存在する。従って、形態
形成タンパク質の新脈管形成特性を増大させることが、所望される。増大した新
脈管形成活性を有する形態形成タンパク質での処置は、新脈管形成をより迅速に
誘導し得、または新脈管形成誘導は、減少した濃度の形態形成タンパク質を使用
して達成され得る。

【００１２】 （発明の要旨） 本発明は、形態形成タンパク質が新脈管形成活性を保有し、そして形態形成タ
ンパク質の新脈管形成誘導活性が、形態形成タンパク質刺激性因子（ＭＰＳＦ）
によって増強され得るという発見に基づく。

【００１３】 従って、本発明は、形態形成タンパク質を使用して哺乳動物において標的部位
での新脈管形成を誘導するための方法を、特徴とする。さらに、本発明はまた、
哺乳動物において標的部位での形態形成タンパク質の新脈管形成能力を改善する
ための方法を、特徴とする。この方法において、この形態形成タンパク質は、哺
乳動物において前駆細胞に接触可能である場合に新脈管形成を誘導し得、そして
形態形成タンパク質刺激性因子がその能力を増強する。この形態形成タンパク質
およびＭＰＳＦは、標的部位に同時に投与され得る。あるいは、これら２つの成
分は、任意の順序で別々に投与される。

【００１４】 この形態形成タンパク質は、ジスルフィド結合して二量体種を生成するサブユ
ニットの組を含み得、ここで、このサブユニットの少なくとも１つは、ＢＭＰタ
ンパク質ファミリーに属するポリペプチドを含む。例えば、この形態形成タンパ
ク質は、参照ＢＭＰ（例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−
５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−
１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１
５、ＣＯＰ−５、ＣＯＰ−７）のアミノ酸配列に十分に複製的（ｄｕｐｌｉｃａ
ｔｉｖｅ）なアミノ酸配列を含み得、その結果、これは、参照ＢＭＰの活性と類
似の形態形成活性を有する。１つの好ましい実施形態において、この形態形成タ
ンパク質は、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）サブユニットを含むホモ二量体またはヘテ
ロ二量体である。あるいは、この形態形成タンパク質は、単量体種を含み得る。
しかし、この形態形成タンパク質が形態形成タンパク質刺激性因子の非存在下で
使用される場合、この形態形成タンパク質は、ＢＭＰ−２でなくてもＧＤＦ−５
でなくてもよい。

【００１５】 本発明の方法において使用される形態形成タンパク質は、新脈管形成を誘導し
得る。例えば、これは、前駆細胞に脈管組織の形成を誘導し得る。従って、本発
明の方法は、組織の欠損部位での修復を導く脈管組織の再生を誘導するために使
用され得る。

【００１６】 本発明において有用な形態形成タンパク質刺激性因子としては、ホルモン、サ
イトカインおよび増殖因子が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方
法において使用されるＭＰＳＦは、本発明において使用される形態形成タンパク
質の新脈管形成活性を誘導し得る。

【００１７】 他に定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語
は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を
有する。例示的な方法および材料を以下に記載したが、本明細書中に記載の方法
および材料に類似かまたは等価な方法および材料がまた、本発明の実施または試
験において使用され得る。本明細書中で言及する全ての刊行物および他の参考文
献は、その全体が参考として援用される。矛盾する場合は、本明細書（定義を含
む）が、支配する。これらの材料、方法および実施例は、例示的であるだけであ
り、限定するとは意図されない。

【００１８】 本発明の他の特徴および利点は、以下の図面、詳細な説明および特許請求の範
囲から明らかである。

【００１９】 （発明の詳細な説明） 本明細書中に記載される発明が十分に理解され得るために、以下の詳細な説明
を記載する。

【００２０】 用語「生体適合性」は、細胞関連性免疫応答および体液性免疫応答（例えば、
炎症応答および異物性線維性応答）のような、身体の種々の防御系に関連する有
害な効果を誘発しない物質をいう。この用語はまた、患者に移植される場合に、
この物質により、特定の望ましくない効果（細胞障害性効果または全身的効果）
が引き起こされないことを意味する。

【００２１】 用語「ＢＭＰ」は、ＤＮＡおよびアミノ酸配列の相同性に基づき規定される、
ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質のＢＭＰファミリーに属するタンパク
質をいう。本発明に従って、タンパク質が、ＢＭＰファミリーを特徴付ける保存
されたＣ末端のシステインリッチなドメイン内で、公知のＢＭＰファミリーのメ
ンバーと少なくとも７０％（例えば、少なくとも８０％または８５％でさえも）
のアミノ酸配列の相同性を有する場合、そのタンパク質はＢＭＰファミリーに属
する。ＢＭＰファミリーのメンバーは、全体的に７０％未満のＤＮＡまたはアミ
ノ酸配列の相同性を有し得る。

【００２２】 用語「形態形成タンパク質（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）」は
、形態形成活性を有するタンパク質をいう。例えば、このタンパク質は、前駆細
胞が増殖するように誘導し得、そして／または局所環境の合図に依存して軟骨、
骨、腱、靱帯、脈管、神経組織または他の型の組織の形成を誘導する分化経路を
開始するように誘導し得る。従って、本発明において有用な形態形成タンパク質
は、異なる環境で異なる挙動を示し得る。本発明の形態形成タンパク質は、ＢＭ
Ｐファミリーに属する少なくとも１つのポリペプチドを含み得る。

【００２３】 用語「骨形成タンパク質（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、軟
骨および／または骨を形成するように前駆細胞を誘導して、得る形態形成タンパ
ク質をいう。骨は、膜性の骨または軟骨内性骨であり得る。ほとんどの骨形成タ
ンパク質は、ＢＭＰファミリーのメンバーであり、従ってＢＭＰでもある。しか
し、この議論は真実でないかもしれない。本発明に従って、配列相同性により同
定されるＢＭＰは、骨形成タンパク質に対する機能的なバイオアッセイにおいて
、明白な骨形成活性または軟骨形成活性を有しなければならない。

【００２４】 用語「形態形成タンパク質刺激因子（ＭＰＳＦ）」は、前駆細胞から組織形成
を誘導する形態形成タンパク質の能力を刺激し得る因子をいう。ＭＰＳＦは、形
態形成タンパク質誘導活性に対して、直接的または間接的な効果を有し得る。例
えば、ＭＰＳＦは、別のＭＰＳＦの生物活性を増加させ得る。ＭＰＳＦの生物活
性を増加させる因子として、例えば、合成、半減期、他の生物分子との反応性（
例えば、タンパク質およびレセプターの結合）、またはＭＰＳＦのバイオアベイ
ラビリティーを増大させる因子が挙げられる。

【００２５】 用語「形態形成活性」、「誘導活性」および「組織誘導活性」は択一的に、標
的細胞を刺激して、必要に応じて細胞分化を導き得る１つ以上の細胞分裂（増殖
）を起こす因子の能力をいう。このような標的細胞は、本明細書中で一般的に前
駆細胞と呼ばれる。代表的に細胞増殖は、細胞周期の調節における変化により特
徴付けられ、そしてＤＮＡ合成率または細胞増殖率を測定することを含む多くの
手段により検出され得る。代表的に細胞分化の初期段階は、前駆細胞と比較して
の遺伝子発現パターンの変化により特徴付けられ；このような変化は、特定の細
胞運命または細胞型への方向付けの指標となり得る。細胞分化の後期段階は、遺
伝子発現パターン、細胞生理、および細胞形態における変化により特徴付けられ
る。遺伝子発現、細胞生理、または細胞形態における任意の再現性のある変化は
、形態形成タンパク質により誘導される細胞分化の開始および程度を評価するた
めに用いられ得る。

【００２６】 用語「新脈管形成」および「脈管形成活性」は択一的に、血管および関連細胞
（内皮細胞、脈管周囲細胞、間葉細胞、および平滑筋細胞を含む）ならびに血管
関連基底膜の形成を刺激する因子の能力をいう。これは、例えば、出芽による既
存の微小血管からの新たな毛細血管（すなわち、細胞増殖）の能力を含む。

【００２７】 用語「相乗相互作用（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）」
は、２つ以上の因子の組み合された効果が、それらの個々の効果の代数的な和よ
りも大きい相互作用をいう。

【００２８】 本発明の方法において有用な適切な形態形成タンパク質および形態形成タンパ
ク質刺激因子の詳細な説明が、以下に提供される。具体的には実施例は、新脈管
形成の誘導におけるこの形態形成タンパク質の有用性を実証するためのモデルを
提供する。

【００２９】 （形態形成タンパク質） 本発明の方法において用いられる形態形成タンパク質は、前駆細胞を刺激して
細胞分裂および／または細胞分化を起こし得る。それらはＴＧＦ−βタンパク質
スーパーファミリーに属し得、そしてそれらとして、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ
−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−３ｂ、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭ
Ｐ−６、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１
３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤ
Ｆ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、Ｇ
ＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＤＰＰ、Ｖｇ−１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質
、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、およびＮＥＵＲＡＬが挙
げられるがこれらに限定されない。しかし、形態形成タンパク質が、形態形成タ
ンパク質刺激因子の非存在下で用いられる場合、この形態形成タンパク質は、Ｂ
ＭＰ−２でもＧＤＦ−５でもない。

【００３０】 好ましい実施形態において、この形態形成タンパク質は、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ
−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ
−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ１３、ＢＭＰ−１４
、ＢＭＰ−１５、ＣＯＰ−５、ＣＯＰ−７、およびそれらのアミノ酸配列改変体
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。より好ましい実施形態において
、この形態形成タンパク質は、ＯＰ１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、
ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、およびそれらのアミノ酸配列改変体からなる群より選
択されるアミノ酸配列を含む。最も好ましい実施形態において、この形態形成タ
ンパク質は、ＯＰ−１である。

【００３１】 本発明において有用な好ましい形態形成タンパク質の１つは、ＯＰ−１である
。ｈＯＰ−１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１お
よび配列番号２に提供される。説明の容易さのために、ｈＯＰ−１が、代表的な
形態形成タンパク質として記載される。ＯＰ−１は、モルフォゲンのファミリー
の代表にすぎないことが、当業者により理解される。

【００３２】 他の有用な形態形成タンパク質として、公知の形態形成タンパク質（特にＢＭ
Ｐタンパク質ファミリーを特徴付ける保存的Ｃ末端システインリッチなドメイン
内で公知のＢＭＰ）と少なくとも７０％（例えば、少なくとも８０％または８５
％でさえも）の配列相同性を有するポリペプチドが挙げられる。これらの形態形
成タンパク質は、保存的アミノ酸の変化を含む改変体を含む、任意の公知の形態
形成タンパク質の生物学的に活性な改変体を包含する。例えば、有用な形態形成
タンパク質としては、ｈＯＰ−１のＣ末端の７システインドメイン（このドメイ
ンは配列番号２のＣ末端の１０２〜１０６アミノ酸残基に対応する）と少なくと
も７０％のアミノ酸配列相同性を共有する配列を含むタンパク質が挙げられる。
Ｃ末端の１０２アミノ酸残基は、配列番号２の残基３３０〜４３１に対応する。
本発明の１つの実施形態において、用いられる形態形成タンパク質は、ジスルフ
ィド結合して二量体を形成する一対のサブユニットからなり、ここで、これらの
サブユニットのうちの少なくとも１つは、ＢＭＰファミリーに属する組換えポリ
ペプチドを含む。本発明の別の実施形態において、用いられる形態形成タンパク
質は、ＢＭＰファミリーに属する単量体ポリペプチドからなる。

【００３３】 本明細書中で用いられる場合、用語「アミノ酸配列の相同性」は、アミノ酸配
列の同一性および類似性の両方を含むことが理解される。相同な配列は、同一な
アミノ酸残基および／または類似のアミノ酸残基を共有し、類似の残基は、整列
された参照配列における対応するアミノ酸残基に代わる保存的置換であるか、ま
たはその対応するアミノ酸残基の「許容される点変異」である。従って、参照配
列と７０％のアミノ酸相同性を共有する候補ポリペプチド配列は、整列された残
基の任意の７０％が、参照配列の対応する残基と同一であるか、またはそれらの
保存的な置換であるかのいずれかである、ポリペプチドである。特定の特に好ま
しい形態形成ポリペプチドは、ヒトＯＰ−１のＣ末端の７システインドメインと
少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％）のアミノ酸同一性を共有する。

【００３４】 本明細書中で用いられる場合、「保存的置換」は、対応する参照残基と物理的
または機能的に類似する、残基である。つまり、保存的置換およびその参照残基
は、類似の大きさ、形状、電荷、化学的特性（共有結合または水素結合を形成す
る能力を含む）などを有する。好ましい保存的置換は、Ｄａｙｈｏｆｆら，Ａｔ
ｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒ
ｅ，５，ｐｐ．３４５−３６２（１９７８および補遺）において受容される点変
異について規定された基準を満たす置換である。保存的置換の例は、以下のグル
ープ内での置換である：（ａ）バリン、グリシン；（ｂ）グリシン、アラニン；
（ｃ）バリン、イソロイシン、ロイシン；（ｄ）アスパラギン酸、グルタミン酸
；（ｅ）アスパラギン、グルタミン；（ｆ）セリン、スレオニン；（ｇ）リジン
、アルギニン、メチオニン；および（ｈ）フェニルアラニン、チロシン。用語「
保存的改変体」または「保存的改変」はまた、所定の親アミノ酸配列におけるア
ミノ酸残基に代わって置換するアミノ酸残基の使用を含み、ここで、親配列に特
異的な抗体はまた、得られる置換されたポリペプチド配列に対しても特異的であ
り、すなわち、「交差反応性」または「免疫反応性」である。

【００３５】 アミノ酸配列の相同性は、当該分野で周知の方法により決定され得る。例えば
、７システインドメイン配列に対する候補アミノ酸配列の相同性パーセントを決
定するために、その２つの配列が最初に整列される。このアライメントは、例え
ば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８，ｐ．４４３（１９
７０）に記載される動的プログラミングアルゴリズムおよびＤＮＡｓｔａｒ，Ｉ
ｎｃ．により製造される市販のソフトウェアパッケージであるＡｌｉｇｎ Ｐｒ
ｏｇｒａｍを用いて作成され得る。両方の供給源による技術は、本明細書中で参
考として援用される。最初のアライメントは、関連タンパク質のファミリーのマ
ルチ配列アライメントとの比較により細分され得る。一旦アライメントが作成お
よび細分されると、相同性パーセントスコアが算出される。この２つの配列の整
列されたアミノ酸残基は、お互いに対する類似性について連続的に比較される。
類似性の要因としては、類似の大きさ、形状、および電荷が挙げられる。アミノ
酸の類似性を決定する１つの特定の好ましい方法は、Ｄａｙｈｏｆｆら（前出）
に記載されるＰＡＭ２５０マトリクスである。類似性スコアは、整列された対を
なすアミノ酸の類似性スコアの和として最初に算出される。挿入および欠失は、
相同性パーセントおよび同一性パーセントの目的のために無視される。従って、
ギャップペナルティーは、この計算において用いられない。次いで、この未加工
のスコアは、候補配列および７システインドメインのスコアの幾何平均によりそ
れを除算することにより正規化される。この幾何平均は、これらのスコアの産物
の平方根である。この正規化された未加工のスコアが、相同性のパーセントであ
る。

【００３６】 本明細書における有用な形態形成タンパク質は、任意の公知の天然に存在する
ネイティブのタンパク質（その対立遺伝子改変体、系統発生的な対応物、および
それらの他の改変体を含む）を包含する。これらの改変体は、ネイティブタンパ
ク質の変化したグリコシル化パターン、変化したＮ末端、および活性な短縮形態
または変異形態を有する形態を包含する。有用な形態形成タンパク質はまた、生
合成により産生された形態形成タンパク質（例えば、「ムテイン」または「変異
体タンパク質」）および一般的な形態形成ファミリーのタンパク質の新規の形態
形成的に活性なメンバーである形態形成タンパク質を包含する。特に有用な配列
としては、以下のうちのＣ末端の９６〜１０２アミノ酸残基を含む配列が挙げら
れる：ＤＰＰ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来）、Ｖｇ−１（Ｘｅｎｏｐｕｓ由来）
、Ｖｇｒ−１（マウス由来）、ＯＰ１およびＯＰ２タンパク質（米国特許第５，
０１１，６９１号）、ならびにＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４（ＷＯ８８
／００２０５、米国特許第５，０１３，６４９号およびＷＯ９１／１８０９８）
、ＢＭＰ−５およびＢＭＰ−６（ＷＯ９０／１１３６６）、ＢＭＰ−８ならびに
ＢＭＰ−９と呼ばれるタンパク質。本発明の実施において有用な他のタンパク質
としては、ＯＰ１、ＯＰ２、ＯＰ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−３ｂ、
ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１
１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＤＰＰ、Ｖｇ
−１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、
ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、およびＧＤＦ
−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＧＤＦ−１３、ＵＮＩＶＩＮ、ＮＯＤＡ
Ｌ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、およびＮＥＵＲＡＬの活性な形態が挙げられる。し
かし、この形態形成タンパク質が、形態形成タンパク質刺激因子の非存在下で用
いられる場合、この形態形成タンパク質は、ＢＭＰ−２でもＧＤＦ−５でもない
かもしれない。

【００３７】 本発明の形態形成タンパク質として有用な骨形成タンパク質は、７システイン
ドメインと６０％より大きい同一性を共有する配列を含むタンパク質を包含する
。他の実施形態において、有用な骨形成タンパク質は、ＯＰＸ（配列番号３）お
よび一般配列７（Ｇｅｎｅｒｉｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（配列番号４）、８（配
列番号５）、９（配列番号６）ならびに１０（配列番号７）を含む、本明細書中
で規定される一般配列のいずれか１つを有する骨形成的に活性なタンパク質とし
て規定される。

【００３８】 以下に開示される一般配列７（配列番号４）および一般配列８（配列番号５）
は、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、Ｂ
ＭＰ−５、ＢＭＰ−６、６０Ａ、ＤＰＰ、Ｖｇ−１、Ｖｇｒ−１、およびＧＤＦ
−１を含む、今日までに同定された好ましいタンパク質ファミリーのメンバー間
で共有される相同性を有する。これらのタンパク質のアミノ酸配列は、本明細書
中および／または当該分野において記載されている。この一般配列は、Ｃ末端の
６システイン骨格ドメインまたは７システイン骨格ドメイン（それぞれ、一般配
列７および８により表わされる）におけるこれらの配列により共有される同一の
アミノ酸残基、ならびにこの配列内の可変性位置についての代替の残基を含む。
この一般配列は、分子内ジスルフィドまたは分子間ジスルフィド結合が形成され
得る適切なシステイン骨格を提供する。これらの配列は、フォールディングした
タンパク質の三次構造に影響を及ぼし得るある特定のアミノ酸を含む。さらに、
この一般配列は、３６位（一般配列７）または４１位（一般配列８）での付加的
なシステインを許容し、それによって、ＯＰ−２およびＯＰ−３の生物学的に活
性な配列を含む。

【００３９】 （一般配列７）

【００４０】

【化１】 （配列番号４）。 ここで、各Ｘａａは、独立して以下のように規定される（「Ｒｅｓ．」は「残基
」を意味する）：ｒｅｓ．２のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．３の
Ｘａａ＝（ＶａｌまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．４のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｐまた
はＧｌｕ）；ｒｅｓ．６のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＬｙｓまたはＡ
ｌａ）；ｒｅｓ．７のＸａａ＝（ＡｓｐまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．８のＸａａ＝
（Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．１１のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、
Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ＡｓｎまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．１２のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ａ
ｒｇ、ＡｓｎまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．１３のＸａａ＝（ＴｒｐまたはＳｅｒ）
；ｒｅｓ．１４のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．１５のＸａａ＝（
ＩｌｅまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．１６のＸａａ（ＡｌａまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ
．１８のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、ＰｒｏまたはＡｒｇ）；
ｒｅｓ．１９のＸａａ＝（ＧｌｙまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．２０のＸａａ＝（Ｔ
ｙｒまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．２１のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｍｅ
ｔ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、ＬｅｕまたはＧｌｙ）；ｒｅｓ．２３のＸａａ＝（Ｔｙｒ
、ＡｓｎまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．２６のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、
Ａｓｐ、Ｇｌｎ、ＡｌａまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．２８のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｌ
ｙｓ、Ａｓｐ、ＧｌｎまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．３０のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅ
ｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、ＩｌｅまたはＡｓｎ）；ｒｅｓ．３１のＸａａ＝（Ｐｈｅ
、ＬｅｕまたはＴｙｒ）；ｒｅｓ．３３のＸａａ＝（Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＭｅ
ｔ）；ｒｅｓ．３４のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、ＴｈｒまたはＰｒｏ
）；ｒｅｓ．３５のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ａｌａまたは
Ｌｙｓ）；ｒｅｓ．３６のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、ＳｅｒまたはＩ
ｌｅ）；ｒｅｓ．３７のＸａａ＝（Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＧｌｙまたはＬｅｕ）；ｒ
ｅｓ．３８のＸａａ＝（Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．３９のＸａａ
＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．４０のＸａａ＝（Ｔｈｒ
、ＬｅｕまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．４４のＸａａ＝（Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＴｈ
ｒ）；ｒｅｓ．４５のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＭｅｔまたはＩｌｅ）；ｒｅ
ｓ．４６のＸａａ＝（ＧｌｎまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．４７のＸａａ＝（Ｔｈｒ
、ＡｌａまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．４８のＸａａ＝（ＬｅｕまたはＩｌｅ）；ｒ
ｅｓ．４９のＸａａ＝（ＶａｌまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．５０のＸａａ＝（Ｈｉ
ｓ、ＡｓｎまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．５１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ
、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．５２のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、
Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＧｌｙまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．５３のＸａａ＝（Ａ
ｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．５４のＸａａ
＝（Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．５５のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ａｓｐ
、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、ＰｒｏまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．５６のＸａａ＝（
Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅま
たはＨｉｓ）；ｒｅｓ．５７のＸａａ＝（Ｖａｌ、ＡｌａまたはＩｌｅ）；ｒｅ
ｓ．５８のＸａａ＝（ＰｒｏまたはＡｓｐ）；ｒｅｓ．５９のＸａａ＝（Ｌｙｓ
、ＬｅｕまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．６０のＸａａ＝（Ｐｒｏ、ＶａｌまたはＡｌ
ａ）；ｒｅｓ．６３のＸａａ＝（ＡｌａまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．６５のＸａａ
＝（Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．６６のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｌｙｓ
、ＡｒｇまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．６７のＸａａ＝（Ｌｅｕ、ＭｅｔまたはＶａ
ｌ）；ｒｅｓ．６８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｙ）；ｒｅ
ｓ．６９のＸａａ＝（Ａｌａ、ＰｒｏまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．７０のＸａａ＝
（Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．７１のＸａａ＝（Ｓｅｒ、
ＡｌａまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．７２のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔまた
はＩｌｅ）；ｒｅｓ．７４のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．７５の
Ｘａａ＝（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＬｅｕまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．７６のＸａａ＝（
Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．７７のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａ
ｓｎ、ＡｒｇまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．７８のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓ
ｎ、ＴｙｒまたはＡｓｐ）；ｒｅｓ．７９のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ
、ＧｌｕまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．８０のＸａａ＝（Ａｓｎ、ＴｈｒまたはＬｙ
ｓ）；ｒｅｓ．８２のＸａａ＝（Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＡｓｎ）；ｒｅｓ．８４
のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．８５のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｓｎ
、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、ＡｒｇまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．８６のＸａａ＝（Ｔｙｒ、
ＧｌｕまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．８７のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕまた
はＰｒｏ）；ｒｅｓ．８８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｇｌｕ、ＴｒｐまたはＡｓｐ）
；ｒｅｓ．９０のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．
９２のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、ＧｌｎまたはＧｌｕ）；ｒ
ｅｓ．９３のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＧｌｕまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．９５
のＸａａ＝（ＧｌｙまたはＡｌａ）；およびｒｅｓ．９７のＸａａ＝（Ｈｉｓま
たはＡｒｇ）。

【００４１】 一般配列８（配列番号５）は、一般配列７の全ておよびさらに以下の５アミノ
酸をそのＮ末端に含む：Ｃｙｓ Ｘａａ Ｘａａ Ｘａａ Ｘａａ（配列番号８
）、ここで、ｒｅｓ．２のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＡｌａまたはＧｌｎ）；
ｒｅｓ．３のＸａａ＝（Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．４のＸａａ＝
（Ｈｉｓ、ＡｒｇまたはＧｌｎ）；およびｒｅｓ．５のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｓｅ
ｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、またはＴｙｒ）。従って、残基
７から始めると、一般配列８の各「Ｘａａ」は、一般配列７について規定される
ような特定のアミノ酸であり、一般配列７について記載される各残基数は、一般
配列８において５つシフトしていることが異なる。例えば、一般配列７における
「ｒｅｓ．２のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＬｙｓ）」は、一般配列８におけるｒｅ
ｓ．７のＸａａに対応する。

【００４２】 一般配列９（配列番号６）および一般配列１０（配列番号７）は、以下のタン
パク質の複合アミノ酸配列である：ヒトＯＰ−１（「ｈＯＰ−１」）、ｈＯＰ−
２、ｈＯＰ−３、ｈＢＭＰ−２、ｈＢＭＰ−３、ｈＢＭＰ−４、ｈＢＭＰ−５、
ｈＢＭＰ−６、ｈＢＭＰ−９、ｈＢＭＰ１０、ｈＢＭＰ−１１、Ｄｒｏｓｏｐｈ
ｉｌａ ６０Ａ、Ｘｅｎｏｐｕｓ Ｖｇ−１、ウニＵＮＩＶＩＮ、ｈＣＤＭＰ−
１（マウスＧＤＦ−５または「ｍＧＤＦ−５」）、ｈＣＤＭＰ−２（ｍＧＤＦ−
６、ｈＢＭＰ−１３）、ｈＣＤＭＰ−３（ｍＧＤＦ−７、ｈＢＭＰ−１２）、ｍ
ＧＤＦ−３、ｈＧＤＦ−１、ｍＧＤＦ−１、ニワトリＤＯＲＳＡＬＩＮ、ＤＰＰ
、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＳＣＲＥＷ、マウスＮＯＤＡＬ、ｍＧＤＦ−８、ｈＧ
ＤＦ−８、ｍＧＤＦ−９、ｍＧＤＦ−１０、ｈＧＤＦ−１１、ｍＧＤＦ−１１、
ｈＢＭＰ−１５、およびラットＢＭＰ３ｂ。一般配列７と同様に、一般配列９は
、Ｃ末端の６システイン骨格を所有し、そして一般配列８と同様に、一般配列１
０は、Ｃ末端の７システイン骨格を所有する。

【００４３】 （一般配列９）

【００４４】

【化２】 （配列番号６）。 ここで、各Ｘａａは、独立して以下のように規定される：ｒｅｓ．１のＸａａ＝
（Ｐｈｅ、ＬｅｕまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．２のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈ
ｉｓ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．３の
Ｘａａ＝（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＡｓｐ）；ｒｅｓ．４のＸａａ＝（Ｓ
ｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｓｎまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．５のＸａａ＝（Ｐｈｅ
またはＧｌｕ）；ｒｅｓ．６のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇ
ｌｕ、ＡｌａまたはＡｓｎ）；ｒｅｓ．７のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ
、ＡｌａまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．８のＸａａ＝（Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｉ
ｌｅまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．９のＸａａ＝（Ｇｌｙ、ＨｉｓまたはＬｙｓ）；
ｒｅｓ．１０のＸａａ＝（ＴｒｐまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．１１のＸａａ＝（Ｇ
ｌｎ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、ＳｅｒまたはＧｌｙ）；ｒｅ
ｓ．１２のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕまたは
Ｈｉｓ）；ｒｅｓ．１３のＸａａ＝（ＴｒｐまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．１４のＸ
ａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．１５のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ
）；ｒｅｓ．１６のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＴｙｒまたはＴｒｐ）；ｒｅｓ
．１８のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ
、ＨｉｓまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．１９のＸａａ＝（Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、
Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｒｇまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．２０のＸａａ＝（Ｔ
ｙｒまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．２１のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅ
ｔ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、ＬｙｓまたはＴｈｒ）
；ｒｅｓ．２２のＸａａ＝（ＡｌａまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．２３のＸａａ＝（
Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、ＡｌａまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．２４のＸａａ＝（Ｔ
ｙｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、ＰｈｅまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．２６のＸａａ＝（Ｇｌ
ｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｎまたは
Ｇｌｙ）；ｒｅｓ．２８のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ
、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．３０のＸａａ＝（Ａｌａ、
Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、ＧｌｎまたはＬｅ
ｕ）；ｒｅｓ．３１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｙまた
はＡｒｇ）；ｒｅｓ．３２のＸａａ＝（Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＶａｌ）
；ｒｅｓ．３３のＸａａ＝（Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、ＰｈｅまたはＶａｌ）；
ｒｅｓ．３４のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、
ＬｅｕまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．３５のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａ
ｓｐ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、ＧｌｎまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．３６のＸａａ
＝（Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅ
ｒ、ＧｌｕまたはＧｌｙ）；ｒｅｓ．３７のＸａａ＝（Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ
、Ｖａｌ、ＧｌｙまたはＴｙｒ）；ｒｅｓ．３８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｇｌｕ、
Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＡｒｇ）；ｒ
ｅｓ．３９のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、ＰｒｏまたはＰｈｅ）；ｒｅ
ｓ．４０のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、ＨｉｓまたはＭｅｔ）
；ｒｅｓ．４１のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、ＴｈｒまたはＧｌｎ）；
ｒｅｓ．４２のＸａａ＝（Ｈｉｓ、ＴｙｒまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．４３のＸａ
ａ＝（Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＬｅｕまたはＴｙｒ）；ｒｅｓ．４４のＸａａ＝（Ｉｌ
ｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＭｅｔまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．４５の
Ｘａａ＝（Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＩｌｅまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．４６のＸ
ａａ＝（Ｇｌｎ、ＡｒｇまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．４７のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ｓ
ｅｒ、Ａｌａ、ＡｓｎまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．４８のＸａａ＝（Ｌｅｕ、Ａｓ
ｎまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．４９のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ
またはＩｌｅ）；ｒｅｓ．５０のＸａａ＝（Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、
ＴｙｒまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．５１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａ
ｓｎ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＧｉｎ）；ｒｅｓ．５２
のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｌａまたは
Ｔｙｒ）；ｒｅｓ．５３のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ
、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、ＬｅｕまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．５４のＸａａ＝（
Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＶａｌまたはＡｓｐ）；ｒｅｓ．５５のＸａａ＝（Ｇ
ｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ｐ
ｒｏまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．５６のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ａｌ
ａ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．５７の
Ｘａａ＝（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＬｅｕまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．
５８のＸａａ＝（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．５
９のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇまた
はＧｌｙ）；ｒｅｓ．６０のＸａａ＝（Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒまたは
Ｓｅｒ）；ｒｅｓ．６１のＸａａ＝（Ｃｙｓ、ＶａｌまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．
６３のＸａａ＝（Ａｌａ、ＶａｌまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．６５のＸａａ＝（Ｔ
ｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、ＡｓｐまたはＴｙｒ）；ｒｅｓ．６６
のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．６７の
Ｘａａ＝（Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＴｈｒまたはＴｙｒ）；ｒｅｓ．６８のＸａａ＝（
Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＬｙｓまたはＶａｌ）；ｒ
ｅｓ．６９のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＧｌｙまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．７０
のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、ＬｅｕまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．７１のＸａａ＝
（Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＡｓｎまたはＧｌｙ）；ｒｅｓ．７２のＸ
ａａ＝（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．７４のＸａａ＝（Ｔ
ｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．７５のＸａａ
＝（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、ＧｌｎまたはＶａｌ）
；ｒｅｓ．７６のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ｌｅｕ、ＡｓｎまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．
７７のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、
ＧｌｙまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．７８のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｔ
ｙｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、ＡｓｎまたはＬｙｓ）；ｒｅ
ｓ．７９のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｇｌ
ｙ、ＧｌｎまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．８０のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ
、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、ＳｅｒまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．８１のＸ
ａａ＝（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＴｈｒまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．８２のＸａａ＝（Ｉ
ｌｅ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、ＡｓｐまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．８３
のＸａａ＝（Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、ＬｙｓまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．８４のＸａａ＝
（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、ＧｌｕまたはＧｌｙ）；
ｒｅｓ．８５のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｕま
たはＶａｌ）；ｒｅｓ．８６のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、ＧｌｕまたはＩｌｅ
）；ｒｅｓ．８７のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＰｒｏまたはＬｙｓ）
；ｒｅｓ．８８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＬ
ｙｓ）；ｒｅｓ．８９のＸａａ＝（ＭｅｔまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．９０のＸａ
ａ＝（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．９１
のＸａａ＝（ＶａｌまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．９２のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｌｙｓ
、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ、ＳｅｒまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．
９３のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＡｒｇまたはＴｈｒ）；ｒ
ｅｓ．９５のＸａａ＝（Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＴｈｒ）；およびｒｅｓ．９７の
Ｘａａ＝（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、ＬｅｕまたはＳｅｒ）。さらに、ラットＢ
ＭＰ３ｂおよびｍＧＤＦ−１０の残基５３の後にはＩｌｅ；ＧＤＦ−１の残基５
４の後にはＴｈｒ；ＢＭＰ３の残基５４の後にはＶａｌ；ＢＭＰ−８およびＤＯ
ＲＳＡＬＩＮの残基７８の後にはＧｌｙ；ｈＧＤＦ−１の残基３７の後にはＰｒ
ｏ、Ｇｌｙ、ＧｌｙおよびＰｒｏが存在する。

【００４５】 一般配列１０（配列番号７）は、遺伝子配列９の全てを含み、そしてさらにそ
のＮ末端で以下の５つのアミノ酸残基を含む：Ｃｙｓ Ｘａａ Ｘａａ Ｘａａ
Ｘａａ（配列番号９）、ここで、残基２のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ
、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、またはＣｙｓ）；残基３のＸａａ＝（Ｌｙ
ｓ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、またはＡｌａ）；残基
４のＸａａ＝（Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐ
ｒｏ、またはＴｙｒ）；および残基５のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ａ
ｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、ま
たはＬｅｕ）である。従って、残基６で始まる遺伝子配列１０の各「Ｘａａ」は
、遺伝子配列９について規定されるような特定のアミノ酸であり、遺伝子配列９
について記載される各残基番号が、遺伝子配列１０において５つシフトされるこ
とによって識別される。例えば、遺伝子配列９の「残基１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、
ＬｅｕまたはＧｌｕ）」は、遺伝子配列１０の残基６のＸａａに対応する。

【００４６】 上記のように、本発明において有用な特定の好ましい骨形態形成タンパク質は
、ｈＯＰ−１のＣ末端の７システインのドメインに６０％を超える、より好まし
くは６５％を超える同一性を有する。これらの特に好ましい配列としてＯＰ−１
タンパク質およびＯＰ−２タンパク質の対立遺伝子改変体ならびに系統発生的改
変体（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ６０Ａタンパク質を含む）が挙げられる。従って
、特定の特に好ましい実施形態において、有用なタンパク質として、一般的なア
ミノ酸配列「ＯＰＸ」（配列番号３）（これは、７システイン骨格を規定し、そ
してＯＰ−１およびＯＰ−２のいくつかの同定された改変体の間の相同性に適応
する）を有する二量体を含む活性なタンパク質が挙げられる。ＯＰＸの各Ｘａａ
は、マウスまたはヒトＯＰ−１もしくはＯＰ−２のＣ末端配列の対応する位置に
生じる残基から独立して選択される。

【００４７】

【化３】 （配列番号３） ここで、残基２のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；残基３のＸａａ＝（Ｌｙｓ
またはＡｒｇ）；残基１１のＸａａ＝（ＡｒｇまたはＧｌｎ）；残基１６のＸａ
ａ＝（ＧｌｎまたはＬｅｕ）；残基１９のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；残
基２３のＸａａ＝（ＧｌｕまたはＧｌｎ）；残基２６のＸａａ＝（Ａｌａまたは
Ｓｅｒ）；残基３５のＸａａ＝（ＡｌａまたはＳｅｒ）；残基３９のＸａａ＝（
ＡｓｎまたはＡｓｐ）；残基４１のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＣｙｓ）；残基５０
のＸａａ＝（ＶａｌまたはＬｅｕ）；残基５２のＸａａ＝（ＳｅｒまたはＴｈｒ
）；残基５６のＸａａ＝（ＰｈｅまたはＬｅｕ）；残基５７のＸａａ＝（Ｉｌｅ
またはＭｅｔ）；残基５８のＸａａ＝（ＡｓｎまたはＬｙｓ）；残基６０のＸａ
ａ＝（Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＡｓｎ）；残基６１のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ａｌａま
たはＶａｌ）；残基６５のＸａａ＝（ＰｒｏまたはＡｌａ）；残基７１のＸａａ
＝（ＧｌｎまたはＬｙｓ）；残基７３のＸａａ＝（ＡｓｎまたはＳｅｒ）；残基
７５のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＴｈｒ）；残基８０のＸａａ＝（ＰｈｅまたはＴ
ｙｒ）；残基８２のＸａａ＝（ＡｓｐまたはＳｅｒ）；残基８４のＸａａ＝（Ｓ
ｅｒまたはＡｓｎ）；残基８９のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；残基９１の
Ｘａａ＝（ＴｙｒまたはＨｉｓ）；および残基９７のＸａａ＝（ＡｒｇまたはＬ
ｙｓ）である。

【００４８】 別の実施形態において、本発明の方法で使用される形態形成タンパク質は、以
下の一般的なアミノ酸配列の種類：

【００４９】

【化４】 （配列番号１０） または配列番号１０の残基６〜１０２を含み、ここで文字は、標準的な１文字コ
ードのアミノ酸残基を示し、そしてＸは、任意のアミノ酸残基を表す。システイ
ン残基が強調されている。

【００５０】 上記一般的配列（配列番号１０）内の好ましいアミノ酸配列は：

【００５１】

【化５】 であり、ここで、配列中、各位置で縦に並べられた各々のアミノ酸は、種々の組
合せで代替的に使用され得る（配列番号１０）。これらの一般的配列は、６また
は７のシステイン残基を有し、ここで分子間または分子内ジスルフィド結合が形
成され得る。これらの配列はまた、タンパク質の３次元構造に影響する他の重要
なアミノ酸を含む。

【００５２】 なお別の実施形態において、有用な形態形成タンパク質は、低い、中程度の、
または高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、参照形態形
成タンパク質コード配列をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡにハイブリダイズす
る核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む。例示的な参照配列として、Ｏ
Ｐ−１、ＯＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、６０Ａ、ＧＤＦ−３
、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７などの保存された７システインのドメイ
ンを規定するＣ末端配列が挙げられる。高いストリンジェントのハイブリダイゼ
ーション条件は、本明細書中で４０％のホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅ
ｎｈａｒｄｔ溶液、および０．１％のＳＤＳ中での３７℃で一晩のハイブリダイ
ゼーション、ならびに０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃での洗浄と
して規定される。標準的なストリンジェンシー条件は、市販の標準的な分子クロ
ーニングの教科書に十分に特徴付けされている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ １９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（
Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉ
ｎｓ編、１９８４）；ならびにＢ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇ
ｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照のこ
と。

【００５３】 当該分野で公知の適切なインビトロ、エキソビボおよびインビボのバイオアッ
セイ（本明細書中で記載されているバイオアッセイを含む）を使用して、新規Ｂ
ＭＰ関連遺伝子産物が形態形成活性を有するか否かを確かめ得る。この遺伝子が
、どこで、そしていつ発現されるのかを規定する発現研究および局在化研究をま
た使用して、潜在的な形態形成活性を同定し得る。核酸およびタンパク質の局在
化手順は、当業者に周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｇｒｅｅ
ｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ
，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９を参照のこと）。

【００５４】 同定されたＢＭＰの多くは、骨原性であり、そして哺乳動物に移植された場合
に骨および軟骨の形成を誘導し得る。既知の骨原性タンパク質に対する配列相同
性に基づいて同定されたいくつかのＢＭＰは、脈管形成活性のような他の形態形
成活性を有し、そして本発明によるＭＰＳＦを使用してこれらの活性を高め得る
。

【００５５】 骨の基質に元々由来するこの骨原性タンパク質が新脈管形成に関与することは
、ＢＭＰファミリーのこれらおよび他のメンバーが、まだ開示されていないさら
なる組織誘導性特性を有することを示唆する。本発明に示すＭＰＳＦを使用して
種々の公知の形態形成タンパク質の新規または既知の組織誘導特性を高め得るこ
とが予見される。本明細書中で記載される本発明が、新規の形態形成タンパク質
が将来同定された場合に、そのタンパク質の組織誘導性活性を刺激するために有
用であることもまた、予見される。

【００５６】 （形態形成タンパク質の生成） 本発明の形態形成タンパク質は、種々の供給源に由来し得る。例えば、これら
は天然の供給源から単離され得るか、組換えで生成され得るか、または化学的に
合成され得る。

【００５７】 （１．天然に由来する形態形成タンパク質） 本発明で使用される形態形成タンパク質は、組織供給源（例えば、哺乳動物組
織供給源）から周知の技術を使用して精製され得る。例えば、Ｏｐｐｅｒｍａｎ
ｎら、米国特許第５，３２４，８１９号および同第５，３５４，５５７号を参照
のこと。精製プロトコルが刊行されていない場合、新しく同定された形態形成タ
ンパク質に関しては、従来のタンパク質精製技術（例えば、免疫アフィニティー
）が、形態形成活性のアッセイと組合せて実施され得る。このようなアッセイは
、一連の精製工程を介して形態形成活性の追跡を可能にする。

【００５８】 （２．組換え的に発現された形態形成タンパク質） 本発明の別の実施形態において、本発明で使用される形態形成タンパク質は、
宿主細胞中で適切な組換えＤＮＡ分子を発現することによって生成される。多く
のＢＭＰおよびＯＰのＤＮＡおよびアミノ酸配列が報告されており、そしてこれ
らの組換え生成のための方法が刊行されており、他に当業者に公知である。クロ
ーニングおよび組換えＤＮＡ技術の一般的な議論については、Ａｕｓｕｂｅｌら
（前出）を参照のこと；また、Ｗａｔｓｏｎら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮ
Ａ，第２版、１９９２（Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎおよびＣｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ）を参照のこと。

【００５９】 ウシおよびヒトのＢＭＰ−２（以前は、ＢＭＰ−２Ａ）およびＢＭＰ−４（以
前は、ＢＭＰ−２Ｂ）をコードするＤＮＡ配列ならびに対応するタンパク質を組
換え的に生成するためのプロセスが、米国特許第５，０１１，６９１号、同第５
，０１３，６４９号，同第５，１６６，０５８号および同第５，１６８，０５０
号に記載される。ヒトおよびウシのＢＭＰ−５およびＢＭＰ−６のＤＮＡ配列お
よびアミノ酸配列、ならびにこれらの組換え生成の方法が、米国特許第５，１０
６，７４８号，および同第５，１８７，０７６号にそれぞれ開示される；米国特
許第５，０１１，６９１号および同第５，３４４，６５４号も参照のこと。ＯＰ
−１の組換え発現についての方法は、Ｏｐｐｅｒｍａｎｎら，米国特許第５，０
１１，６９１号および同第５，２５８，４９４号に開示される。ＢＭＰ−２，Ｂ
ＭＰ−４，ＢＭＰ−５，ＢＭＰ−６およびＯＰ−１（ＢＭＰ７）のアミノ酸配列
のアラインメントについては、ＷＯ ９５／１６０３４を参照のこと。ＢＭＰ−
８をコードするＤＮＡ配列は、ＷＯ ９１／１８０９８に開示され、そしてＢＭ
Ｐ−９をコードするＤＮＡ配列は、ＷＯ ９３／００４３２に開示される。ＢＭ
Ｐ−１０およびＢＭＰ−１１をコードするＤＮＡおよび推定されるアミノ酸配列
は、ＷＯ ９４／２６８９３およびＷＯ ９４／２６８９２にそれぞれ開示され
る。ＢＭＰ−１２およびＢＭＰ−１３についてのＤＮＡおよび推定アミノ酸配列
は、ＷＯ ９５／１６０３５に開示される。上の特許開示（ＤＮＡおよびアミノ
酸配列を記載し、そしてこれらの配列によってコードされるＢＭＰおよびＯＰを
生成するための方法を記載する）は、参考として本明細書中で援用される。

【００６０】 バイオアッセイによって抽出物中で同定された新規のＢＭＰ、ＯＰおよび他の
形態形成タンパク質をコードする遺伝子をクローン化するために、「逆遺伝学（
ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」を伴う方法を使用し得る。このような方
法は、そのタンパク質をコードする遺伝子を得るために既知または未知の機能を
有するタンパク質を用いて開始する。標準的なタンパク質精製技術を、開始工程
として使用し得る。部分的なアミノ酸配列を得るために十分なタンパク質が精製
され得る場合、その部分的なアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列にハイブリダ
イズし得る縮重したＤＮＡプローブが、設計され、合成され、そしてその形態形
成タンパク質または関連する形態形成タンパク質をコードする全長クローンを単
離するためのプローブとして使用され得る。

【００６１】 あるいは、形態形成タンパク質を含む部分的に精製された抽出物を使用して、
このタンパク質に対する抗体を惹起させ得る。次いで、形態形成タンパク質に特
異的な抗体をプローブとして使用して、ｃＤＮＡから作製された発現ライブラリ
ーをスクリーニングし得る（例えば、ＢｒｏｏｍｅおよびＧｉｌｂｅｒｔ、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７５、２７４６〜４９頁（
１９７８）；ＹｏｕｎｇおよびＤａｖｉｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０、３１−３５頁（１９８３）を参照のこと）。

【００６２】 ＤＮＡ配列相同性に基づいて同定された新規のＢＭＰ、ＯＰおよび他の形態形
成タンパク質をクローニングならびに発現させるために、相同な配列を、標準的
な組換えＤＮＡ技術を使用してクローン化し、そして配列決定し得る。ＤＮＡ配
列が利用可能である場合、形態形成タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント
は、所望の宿主発現系で一緒に作用するように選択された発現ベクターに挿入さ
れ得る。ＤＮＡフラグメントは、ベクター中にクローン化され、その結果その転
写が、ベクター中の異種プロモーター、好ましくは必要に応じて調節され得るプ
ロモーターによって制御される。

【００６３】 ＢＭＰおよびＯＰの組換え発現に適切ないくつかの宿主ベクター系が、上に列
挙された参照文献中に開示される。有用な宿主細胞として、Ｅ．ｃｏｌｉのよう
な細菌、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＰｉｃｉａのような酵母、昆虫細胞
および他の主に形質転換または不死化された真核生物培養細胞が挙げられるが、
これらに限定されない。好ましい真核生物宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＣＯＳ、
およびＢＳＣ細胞が挙げられる（以下を参照のこと）。

【００６４】 適切なベクターは、選択される宿主系に従って選択される。有用なベクターと
して、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、昆虫ウイルスおよび動物ウ
イルスベクター（レトロウイルスならびに他の一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ
ウイルスに由来するベクターを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。

【００６５】 １つの実施形態において、本発明の方法において使用される形態形成タンパク
質は、原核生物宿主において発現される組換えＤＮＡ分子に由来し得る。組換え
ＤＮＡ技術を使用して、種々の融合遺伝子が、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて天然に供給
される骨形成配列の組換え発現を誘導するために構築されてきた（例えば、Ｏｐ
ｐｅｒｍａｎｎら、米国特許第５，３５４，５５７号（本明細書中で参考として
援用される）を参照のこと）。類似の手順を使用して、天然に供給される形態形
成配列の短縮形態を含むＤＮＡが、酸不安定切断部位（Ａｓｐ−Ｐｒｏ）をコー
ドする配列によってＥ．ｃｏｌｉにおける発現を促進するために適切なリーダー
配列（例えば、「ＭＬＥリーダー」）に連結された融合構築物として調製され得
る。

【００６６】 別の実施形態において、本発明で使用される形態形成タンパク質は、哺乳動物
宿主−ベクター系を使用して発現される（例えば、トランスジェニック生成、ま
たは組織培養生成）。このように発現された形態形成タンパク質は、より密接に
天然に存在するタンパク質に類似し得る。組換えタンパク質のグリコシル化パタ
ーンは、時折天然のタンパク質のグリコシル化パターンとは異なるが、このよう
な差異は、しばしば組換えタンパク質の生物学的活性について重要ではない。組
換えタンパク質のトランスフェクション、発現および精製のための技術は、当該
分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出、およびＢｅｎｄｉｇ、Ｇ
ｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７、９１−１２７頁（１９８８）を参
照のこと。

【００６７】 哺乳動物ＤＮＡベクターは、目的の遺伝子の発現を促進するための適切な配列
を含むべきである。このような配列として、転写開始配列、終止配列およびエン
ハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化シグナルのような効率的な
ＲＮＡプロセシングシグナル；ｍＲＮＡ安定化配列；翻訳増強配列（例えば、Ｋ
ｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質安定化配列；および所望である場合、
タンパク質分泌を増強する配列が挙げられる。

【００６８】 哺乳動物細胞でのＯＰ−１発現について設計された種々の例示的な発現ベクタ
ーの制限マップおよび供給源は、米国特許第５，３５４，５５７号に記載されて
いる。これらのベクターはそれぞれ、ｐＵＣ−１８ベクターに挿入された全長ｈ
ＯＰ−１ ｃＤＮＡ配列を使用する。形態形成タンパク質の短縮形態をコードす
るＤＮＡ配列がまた使用され得ること（ただしこの発現ベクターまたは宿主細胞
は、発現されるタンパク質の直接的なプロセシングおよび分泌に必要な配列を提
供する）が当業者に認識される。

【００６９】 有用なプロモーターとして、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、アデノウ
イルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｉ（「ｍＭＴ」）プロ
モーター、ラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）長末端反復（「ＬＴＲ」）、マウ
ス乳腺癌ウイルス（「ＭＭＴＶ」）ＬＴＲ，およびヒトサイトメガロウイルス（
「ＣＭＶ」）主要中期−初期プロモーターが挙げられるが、これらに限定されな
い。例えば、ＣＭＶまたはＭＭＴＶプロモーターとＲＳＶ ＬＴＲ由来のエンハ
ンサー配列との組合せは、ヒト骨形成タンパク質の発現において特に有用である
ことが見出されている。

【００７０】 好ましいＤＮＡベクターはまた、マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシンまた
はＤＨＦＲ）および目的の遺伝子のコピー数を増幅するための手段を含む。ＤＮ
Ａベクターはまた、安定化配列（例えば、ｏｒｉ様配列またはＡＲＳ様配列なら
びにテロメア様配列）を含み得るか、あるいは宿主細胞ゲノムへの指向された組
込みまたは指向されていない組込みを好むように設計され得る。

【００７１】 哺乳動物細胞系における遺伝子増幅の１つの方法は、選択可能なジヒドロ葉酸
レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子のｄｈｆｒ⁻細胞株での使用である。一般的に
、ＤＨＦＲ遺伝子が目的の遺伝子を保有するベクターに提供され、そして漸増濃
度の細胞毒性薬物であるメトトレキサート（ＭＴＸ）の添加が、ＤＨＦＲ遺伝子
のコピー数の増幅およびそれに物理的に関連する遺伝子の増幅を引き起こす。ト
ランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株中の選択可
能な、増幅可能なマーカー遺伝子としてのＤＨＦＲは、当該分野で特に十分に特
徴付けられている。他の有用な増幅可能なマーカー遺伝子としては、アデノシン
デアミナーゼ（ＡＤＡ）およびグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）遺伝子が挙げら
れる。

【００７２】 遺伝子の増幅は、生成されるマーカータンパク質のレベルを減少するためにマ
ーカー遺伝子発現の調節配列（例えば、エンハンサー、プロモーター、および転
写または翻訳開始配列）を改変することによって、さらに増強され得る。ＤＨＦ
Ｒ転写のレベルを低下すると、ＤＨＦＲ遺伝子のコピー数（および物理的に関連
する遺伝子）が増加し、低いレベルのメトトレキサート（例えば、０．１μＭ
ＭＴＸ）においてさえ、トランスフェクトされた細胞を増殖に適合可能にする。
好ましい発現ベクター（例えば、ｐＨ７５４およびｐＨ７５２（Ｏｐｐｅｒｍａ
ｎｎら、米国特許第５，３５４，５５７号、図１９ＣおよびＤ））は、弱いＤＨ
ＦＲプロモーターを作製するために、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して操作
されてきた。当業者に認識されるように、本明細書中で開示された弱いプロモー
ターとは異なる他の有用な弱いプロモーターが、標準的な方法を使用して構築さ
れ得る。他の調節配列はまた、同様の効果を達成するために改変され得る。

【００７３】 別の遺伝子増幅スキームは、ＳＶ４０ベクターでトランスフェクトされたＢＳ
Ｃ４０−ｔｓＡ５８細胞の温度感受性（ｔｓ）に依存する。３３℃までの温度低
下は、組込まれたトランスフェクトされたベクターＤＮＡの切除および増幅を導
く温度感受性ＳＶ４０ Ｔ抗原を安定化し、これによって、目的の物理的に関連
する遺伝子を増幅する。

【００７４】 細胞／細胞株の選択は、当業者の必要性に依存する。サル腎細胞（ＣＯＳ）は
、高いレベルの一過性の遺伝子発現を提供し、従って、ベクター構築物を迅速に
試験するためおよびクローニングされた遺伝子の発現のために有用である。目的
の遺伝子を発現するＣＯＳ細胞を、例えば、この遺伝子を保有するＳＶ４０ベク
ターを用いて、トランスフェクトすることによって樹立した。他方、安定してト
ランスフェクトされた細胞株は、形態形成タンパク質の長期産生のために使用さ
れ得る。例として、ＣＨＯ細胞およびＢＳＣ４０−ｔｓＡ５８細胞の両方は、宿
主細胞として使用され得る。組換えＯＰ−１は、３つの異なる細胞発現系で発現
されている：種々の発現構築物の機能性を迅速にスクリーニングするためのＣＯ
Ｓ細胞、安定した細胞株の樹立のためのＣＨＯ細胞、および組換えＯＰ−１タン
パク質を産生するための代替的な手段としてのＢＳＣ４０−ｔｓＡ５８細胞。

【００７５】 いくつかの骨由来の骨原性タンパク質（ＯＰ）およびＢＭＰは、それらの活性
形態において鎖間ジスルフィド結合を含むホモ二量体およびヘテロ二量体として
見出される。例えば、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７（ＯＰ−１）（
本来骨から単離される）は、ホモ二量体またはヘテロ二量体のいずれかとして、
生理活性である。ヘテロ二量体を形成するＯＰおよびＢＭＰの能力は、形態形成
タンパク質に対してさらなる形態形成活性または変更された形態形成活性を与え
得る。ヘテロ二量体は、ＯＰおよびＢＭＰレセプターについてのホモ二量体とは
、質的または量的に異なる結合親和性を示し得る。変更された結合親和性は、次
に、異なるシグナル伝達経路を媒介するレセプターの差次的な活性化を生じ得、
最終的に、異なる生物学的活性を生じる。変更された結合親和性はまた、組織ま
たは細胞型特異的様式において明白であり得、それにより、特定の前駆細胞型の
みに増殖および／または分化を誘導する。

【００７６】 二量体タンパク質は、培養培地から単離され得るかそして／またはインビトロ
で再折り畳みおよび二量体化され得、生物学的に活性な組成物を形成する。ヘテ
ロ二量体は、別々の別個のポリペプチド鎖を併用することによって、インビトロ
で形成され得る。あるいは、ヘテロ二量体は、別々の別個のポリペプチド鎖をコ
ードする核酸を同時発現することによって、単一細胞で形成され得る。例えば、
ヘテロ二量体産生のための例示的なプロトコルについては、ＷＯ９３／０９２２
９および米国特許５，４１１，９４１号を参照のこと。

【００７７】 （合成非ネイティブ形態形成タンパク質） 別の実施形態において、本発明の方法において使用される形態形成タンパク質
は、合成的に調節される。合成的に調製される形態形成タンパク質は、ネイティ
ブであってもよいし、非ネイティブ（すなわち、他に天然で見出されないタンパ
ク質）であってもよい。

【００７８】 非ネイティブ形態形成タンパク質は、天然の形態形成タンパク質を変異誘発す
ることによって作製され得る。サブユニットを再折り畳みおよび／またはアセン
ブリすることを支持する、より大きい形態形成タンパク質を示す形態への変異を
作製するための方法が、記載されている。例えば、米国特許第５，３９９，６７
７号を参照のこと。

【００７９】 非ネイティブの形態形成タンパク質はまた、一連のコンセンサス配列（米国特
許第５，３２４，８１９号）を使用して合成され得る。これらのコンセンサス配
列は、ネイティブな骨原性産物から得られる部分的なアミノ酸配列データに基づ
いてか、または推定または実証された発生機能を有することが報告されている他
のタンパク質とそれらの相同性に基づいて設計された。いくつかの生合成コンセ
ンサス配列（コンセンサス骨原性タンパク質または「ＣＯＰ」と呼ばれている）
を原核生物中で融合タンパク質として発現した。精製した融合タンパク質を、切
断し、再折り畳みし、ホルモンおよびその可溶性レセプターと組み合わされ得、
樹立された動物モデル中で移植され、そして、それらの骨および／または軟骨誘
導活性について調査した。特定の好ましい合成骨原性タンパク質は、ＣＯＰ５お
よびＣＯＰ７と命名される２つの合成アミノ酸配列の１つまたは両方を含む。

【００８０】 ＣＯＰ５およびＣＯＰ７のアミノ酸配列は、Ｏｐｐｅｒｍａｎｎら、米国特許
第５，０１１，６９１号および同第５，３２４，８１９号（これらは、本明細書
中に参考文献として援用される）において示されるように、以下に示される。

【００８１】

【化６】 これらのアミノ酸配列において、ダッシュ（−）は、関連したアミノ酸におけ
る比較可能な配列を並べるためのみに、フィルターとして使用される。整列され
たアミノ酸配列間の差異を強調して表示する。

【００８２】 １つの実施形態において、本発明の方法において使用される形態形成タンパク
質は、上記の一般的な配列（配列番号４、５、６、７、または１０）の部分的ま
たは完全配列を含む骨原性タンパク質であり、その結果、このタンパク質は、適
切に折り畳まれ、そして哺乳動物中に移植される場合に組織形成を誘導し得る。
例えば、合成タンパク質は、都合の良い環境中で移植される場合に、骨芽細胞か
ら骨形成を誘導し得る；または、これは、無血管部位に移植される場合または完
全な骨発達のインヒビターと共に同時投与される場合、軟骨形成を促進し得る。

【００８３】 別の実施形態において、本発明の方法において使用される合成形態形成タンパ
ク質は、ＣＯＰ（例えば、ＣＯＰ５またはＣＯＰ７）の部分的または完全配列を
十分に複製可能な配列を含む。生合成ＣＯＰ配列は、再折り畳みの間に二量体化
すると考えられ、そして還元される場合に活性でないようである。ホモ二量体お
よびヘテロ二量体のＣＯＰは、本発明において意図される。特定の実施形態にお
いて、この合成タンパク質は、約２００アミノ酸長未満である。

【００８４】 これらおよび他の合成非ネイティブ骨原性タンパク質は、ＭＰＳＦと協力して
使用され得、そして、前駆細胞誘導および組織再生のためのインビトロ、エキソ
ビボまたはインビボ生物アッセイを使用して試験され得る。本発明のＭＰＳＦと
結合したタンパク質は、血管、骨、軟骨、腱、靭帯、神経および潜在的に他の型
の組織の修復のために有用であると想定されている。

【００８５】 （形態形成活性を有する相同なタンパク質） 本発明において有用である形態形成タンパク質は、上記の骨原性ＣＯＰコンセ
ンサス配列との相同性に基づいて単離されたＤＮＡ配列の組換え発現によって産
生され得る。合成ＣＯＰ ＤＮＡ配列は、種々の種由来の関連ＤＮＡ配列を検索
するためのプローブとして使用される（例えば、Ｏｐｐｅｒｍａｎｎら、米国特
許第５，０１１，５９１号および同第５，２５８，４９４号（これらは、本明細
書中に参考文献として援用される）を参照のこと）。

【００８６】 ＣＯＰ配列プローブとハイブリダイズする遺伝子によってコードされる形態形
成タンパク質は、ジスルフィド結合した２つのサブユニットにアセンブリされ、
哺乳動物に移植される場合、組織形成を誘導し得るヘテロ二量体またはホモ二量
体を産生する。組換えＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４は、ＯＰ−１サブユニットと
アセンブリされたホモ二量体およびヘテロ二量体としての種交差骨原性活性を有
することが示されている。

【００８７】 合成ＣＯＰ配列プローブにハイブリダイズする形態形成タンパク質コード遺伝
子は、Ｖｇ１、インヒビン、ＤＰＰ、ＯＰ−１、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４を
コードする遺伝子を含む。Ｖｇ１は、初期胚のパターン形成に関与する公知のＸ
ｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓのタンパク質である。インヒビンは、Ｘｅｎｏｐｕ
ｓ ｌａｅｖｉｓ由来のタンパク質のＢＭＰファミリーのメンバーである別の発
生遺伝子である。ＤＰＰは、背腹側の発生を担うＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子に
よってコードされたアミノ酸配列である。ＯＰ−１、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−
４は、軟骨、骨、および神経組織形成を誘導し得る骨原性タンパク質である。

【００８８】 別の実施形態において、本発明の方法において使用される形態形成タンパク質
は、「ＯＰＳ」核酸プローブにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする
核酸によってコードされるポリペプチドを含み得る（Ｏｐｐｅｒｍａｎら、米国
特許第５，３５４，５５７号）。「ＯＰＳ」（ＯＰ−１「短い」を意味する）は
、Ｃ末端活性領域（９７アミノ酸；配列番号２、残基３３５−４３１）中の保存
された６つのサイトカイン骨格を規定するヒトＯＰ−１タンパク質の部分をいう
。

【００８９】 ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の１つの例としては、６５℃
（または、ミスマッチの塩基対を含まない、プローブと核酸配列との間のハイブ
リッドについての計算された融解温度よりも１０℃高い）での４×ＳＳＣ中のハ
イブリダイゼーション、次いで、このハイブリダイゼーション温度での０．１×
ＳＳＣ中の洗浄である。別のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は
、４２℃で、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ中のハイブリダイゼーションであ
る。

【００９０】 従って、この開示を考慮して、当業者は、遺伝子を容易に設計および合成し得
るか、または形態形成活性を有するアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡまたはゲ
ノムライブラリーから遺伝子を単離し得る。これらの遺伝子は、大量の活性骨原
性タンパク質または他に形態形成タンパク質を産生するために、原核生物または
真核生物において発現され得る。組換えタンパク質は、インビトロおよびエキソ
ビボバイオアッセイおよびヒトを含む哺乳動物におけるインビボ移植によって示
されるように、ネイティブ形態、短縮形態、変異体形態、融合物形態、または、
骨、軟骨、または他の型の組織の形成を含み得る他の活性化形態で存在し得る。

【００９１】 （形態形成タンパク質刺激因子（ＭＰＳＦ）） 本発明に従う方法において使用される形態形成タンパク質刺激因子（ＭＰＳＦ
）は、新脈管形成を誘導する形態形成タンパク質の能力を刺激し得る因子である
。１つの実施形態において、新脈管形成は、前駆細胞からの血管組織形成の誘導
を含む。本発明の別の実施形態において、有効量のＭＰＳＦを同時投与すること
によって、哺乳動物における形態形成タンパク質の脈管形成活性を改善するため
の方法が提供される。ＭＰＳＦは、形態形成タンパク質による新脈管形成に対し
て相加的な効果を与え得る。好ましくは、ＭＰＳＦは、形態形成タンパク質によ
る新脈管形成に対して相乗的な効果を有する。

【００９２】 本発明の形態形成タンパク質によって、増加および／または分化するように誘
導される前駆細胞は、好ましくは哺乳動物細胞である。好ましい前駆細胞として
は、哺乳動物の内皮細胞の前駆細胞、その全ての初期発生前駆細胞、およびそこ
から発生する全ての細胞が挙げられる。しかし、形態形成タンパク質は、進化全
体で高度に保存され、そして、非哺乳動物前駆細胞はまた、同じ種または交雑種
の形態形成タンパク質およびＭＰＳＦの組み合わせによって、刺激されるようで
ある。従って、スキームが、逆の免疫学的反応を引き起こすことなく、ヒトに異
種細胞を移植するのに利用可能となる場合、本明細書中に示される手順に従って
、形態形成タンパク質およびＭＰＳＦによって刺激された非ヒト前駆細胞は、ヒ
トにおける組織再生および組織修復において有用であることが想定される。

【００９３】 １つ以上のＭＰＳＦは、誘導されるのに所望の組織型ならびに形態形成タンパ
ク質およびＭＰＳＦが投与される部位に従って、１つ以上の形態形成タンパク質
と協力して使用のために選択される。形態形成タンパク質／ＭＰＳＦの特定の選
択およびそれらが組み合わされる相対的濃度は、本明細書中に記載される手順を
使用して、選択された処置部位において、誘導される組織型を最適化するために
、体系的に変化し得る。

【００９４】 本発明の好ましい形態形成タンパク質刺激因子（ＭＰＳＦ）は、ホルモン、サ
イトカインおよび増殖因子からなる群から選択される。１つの好ましい実施形態
において、骨原性タンパク質と協力して新脈管形成を誘導するためのＭＰＳＦは
、以下の群から選択される少なくとも１つの化合物を含む：線維芽細胞増殖因子
（ＦＧＦ）、特に酸性（ａＦＧＦ）および塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、形質転換
増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、形質転換増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、上皮増殖
因子（ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ
）、インシュリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、
血小板活性化因子（ＰＡＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、胎盤増殖因
子（ＰＧＦ）、プロリィフェリン（ｐｒｏｌｉｆｅｒｉｎ）、Ｂ６１、可溶性血
管細胞接着分子−１（ＳＶＣＡＭ−１）、可溶性Ｅ−セレクチン、エフリン（ｅ
ｐｈｒｉｎ）、１２−ヒドロキシエイコサテトラエン酸、ＨＩＶ−１のｔａｔタ
ンパク質、アンジオゲニン（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、プロスタグランジン、特
にＰＧＥ２、およびそのアミノ酸改変体。骨原性タンパク質と協力して新脈管形
成を誘導するためのより好ましいＭＰＳＦは、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＴ
ＧＦ）、血小板由来形質転換増殖因子−β１（ＴＧＦ−β１）およびそのアミノ
酸改変体からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含む。１つの最も
好ましいＭＰＳＰは、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）およびそのアミノ
酸改変体である。別の最も好ましいＭＰＳＦは、血小板由来形質転換増殖因子−
β１（ＴＧＦ−β）およびそのアミノ酸改変体である。

【００９５】 本発明の別の好ましい実施形態において、ＭＰＳＦは、別のＭＰＳＦの生物活
性を増加し得る化合物または薬剤を含む。ＭＰＳＦ生物活性を増加する薬剤は、
例えば、合成、半減期、結合タンパク質およびレセプターのような他の分子との
反応性、またはＭＰＳＦのバイオアベイラビリティーを増加する薬剤を含む。こ
れらの薬剤は、ホルモン、増殖因子、ペプチド、サイトカイン、タンパク質また
は脂質のようなキャリア分子、またはＭＰＳＦの発現または安定性を増加する他
の因子を含み得る。

【００９６】 例えば、選択されたＭＰＳＦがＦＧＦの場合、その生物活性を増加する薬剤は
、硫酸ヘパランプロテオグリカン（ＨＳＰＧ）（これは、本発明に従ってＭＰＳ
Ｆとして機能し得る）を含む。

【００９７】 好ましくは、ＭＰＳＦは、哺乳動物における形態形成タンパク質の組織誘導活
性を相乗的に刺激し得る量で存在する。哺乳動物に投与される場合に組織形成を
必要に応じて誘導する形態形成タンパク質およびＭＰＳＦの相対的な濃度は、本
明細書中に記載される手順を使用して、当業者によって経験的に決定される。

【００９８】 （推定形態形成タンパク質刺激因子を試験する） 選択された形態形成タンパク質の血管形成活性を刺激し得るＭＰＳＦを同定す
るために、適切なアッセイを選択する。最初に、形態形成タンパク質の血管形成
活性を刺激し得るＭＰＳＦを同定するためにインビトロアッセイを実行すること
が好ましい。有用なインビトロアッセイは、関連した分化経路を相関することが
公知のマーカーをモニターするアッセイである（実施例１〜３を参照のこと）。

【００９９】 実施例５〜６は、新脈管形成に対するその影響を決定するために、そして、Ｍ
ＰＳＦの有効濃度を同定および最適化するために、骨原性タンパク質ＯＰ−１を
使用する実験を記載する。ＯＰ−１は、いくらかの脈管形成活性を有する。従っ
て、血管形成関連マーカーの発現を調べるインビトロアッセイを使用して、ＯＰ
−１と協力して機能する１つ以上のＭＰＳＦを同定し得る。

【０１００】 （新脈管形成アッセイを使用して推定ＭＰＳＦを試験する） 新脈管形成活性について、ＯＰ−１を用いて潜在的なＭＰＳＦを試験するため
の好ましいアッセイは、絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイである。このＣＡＭアッセ
イは、脈管形成反応の測定である。この手順は、一般に以下の様である。

【０１０１】 第１に、ＭＰＳＦは、ＭＰＳＦの１つ以上の濃度を選択することによって、そ
して、それらを単独または形態形成タンパク質の存在下で試験することによって
、同定される（実施例５〜６）。第２に、形態形成タンパク質と協力して、最適
な好ましい相乗的な組織誘導を達成するのに必要なＭＰＳＦの量は、用量応答曲
線を作成することによって決定される。

【０１０２】 必要に応じて、形態形成タンパク質および第１のＭＰＳＦによって誘導される
脈管形成活性を刺激または他に変更する１つ以上のさらなるＭＰＳＦが同定され
得、そして、新しい多重因子用量応答曲線が作成され得る。

【０１０３】 （形態形成タンパク質およびＭＰＳＦの有用性） 形態形成タンパク質単独、または本発明のＭＰＳＦと組み合わせた形態形成タ
ンパク質は、血管組織形成が必要である種々の傷害または病理の処置を可能にす
る。この形態形成タンパク質単独、または本発明のＭＰＳＦと組み合わせた形態
形成タンパク質は、新脈管形成を刺激することによって、傷害または病理を改善
または治療し得る。

【０１０４】 本発明の１つの実施形態において、この形態形成タンパク質が、ＢＭＰ−２ま
たはＧＤＦ−５でないという条件で、有効量の形態形成タンパク質を投与するこ
とによって、哺乳動物中で新脈管形成を誘導するための方法が、提供される。本
発明の別の実施形態において、有効量の形態形成タンパク質刺激因子を、形態形
成タンパク質と同時投与することによって、哺乳動物中の形態形成タンパク質の
脈管形成誘導活性を改善するための方法が、提供される。

【０１０５】 １つの好ましい実施形態において、形態形成タンパク質刺激因子は、形態形成
タンパク質による新脈管形成に対する相乗的効果を与える。別の好ましい実施形
態において、形態形成タンパク質刺激因子は、形態形成タンパク質による新脈管
形成に対して相加的効果を与える。

【０１０６】 形態形成タンパク質およびＭＰＳＦは、哺乳動物の所望の部位で投与され得、
その結果、形態形成タンパク質およびＭＰＳＦは、哺乳動物の適切な前駆細胞に
アクセス可能である。形態形成タンパク質およびＭＰＳＦの組み合わせを使用し
て、新脈管形成を誘導する場合、これらは、標的部位に同時または別々のいずれ
かで投与され得る。例えば、形態形成タンパク質が最初に投与され、次いで、Ｍ
ＰＳＦが投与される。好ましい実施形態において、標的部位は、血管組織欠損部
位である。

【０１０７】 （実施例１：絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイ） 受精したニワトリの卵（Ｌｏｗｍａｎ Ｂｒｏｗｎ）を、インキュベートし、
そして、記載されるようにインキュベーションの３日目または４日目にビーズ移
植のために調製した（Ｖｕら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，５３，４９９−５０８
頁（１９８５）；Ｇｏｕｌｄら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，５６，５８７−５９４頁
（１９９５）、Ｋｉｒｃｈｎｅｒら、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．，５１，１
−１４頁（１９９６））。タンパク質ペレットを、インキュベーションの１０日
目に絨毛尿膜（ＣＡＭ）上に穏やかに配置した。次いで、卵を収穫まで回転する
ことなくインキュベートした。インキュベーションの１５日目（すなわち、５日
の総移植期間後）、ＣＡＭをリン酸緩衝化ホルマリン（１０％溶液）を用いて、
インサイチュで固定した。

【０１０８】 （実施例２：巨視的分析） 各処置群内で、無作為に選択されたＣＡＭを、Ｗｉｌｄ Ｍ４００フォトマク
ロスコープ（Ｗｉｌｄ Ｈｅｅｒｂｒｕｇｇ Ｌｔｄ．，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎ
ｄ）を使用して写真撮影した。このＣＡＭの光学顕微鏡写真を、多少の改変を用
いて、以前に記載されるように（Ｖｕら、前出；Ｆｌａｍｍｅら、Ｄｅｖｅｌｏ
ｐｍｅｎｔ，１１１，６８３−６９０頁（１９９１）：Ｏｌｉｖｏら、Ａｎａｔ
．Ｒｅｃ．，２３４，１０５−１１５頁（１９９２））、遮蔽した様式で視覚的
に評価した。結果は以下のように記載される：（ｉ）反応なし：血管は、ビーズ
の周りおよびＣＡＭの周囲に分布していない、（ｉｉ）疑問な反応：血管は、Ｃ
ＡＭの周囲から放射線状に広がり、そして、スポークホイール様パターンでビー
ズに向って方向的に移動する、または（ｉｉｉ）ポジティブ反応：血管は、顕著
なスポークホイールパターンで、ビーズの周りの領域をカバーする。

【０１０９】 （実施例３：顕微鏡分析） ペレットおよびＣＡＭの隣接組織を、外科的に切除し、ホルマリンに配置し、
エタノールを介して脱水し、そして、記載されるようにパラフィンワックスに包
埋する（ＹａｎｇおよびＭｏｓｅｓ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１１、７３１
−３４１頁（１９９０））。組織の連続切片を、５μｍで切断し、ガラススライ
ド上に固定し、そして、改変Ｇｏｌｄｎｅｒ毛状体技術を使用して染色した（Ｒ
ｉｐａｍｏｎｔｉら、Ｍａｔｒｉｘ，１２，３６９−３８０頁（１９９２）；Ｒ
ｉｐａｍｏｎｔｉら、Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ
ｓ：Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕ
ｃｔｉｖｅ Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｌｉｎｄｈｏｌｍ Ｔ．Ｓ．編、１３１−１４５
頁（１９９６）；ＢｒａｄｂｕｒｙおよびＲａｅ，Ｂｏｎｅ，Ｔｈｅｏｒｙ ａ
ｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ，ＢａｎｃｒｏｆｔおよびＳｔｅｖｅｎｓ編、１１３−１３８頁（１９９６
）；Ｐａｇｅら、Ｂｏｎｅ，Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ
Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＢａｎｃｒｏｆｔおよびＳ
ｔｅｖｅｎｓ編、３０９−３４０頁（１９９６））。染色は、核を青−黒色、赤
血球を赤色、細胞質を赤−紫色、フィブリンを赤色、そしてコラーゲンを青色に
する。切片を、光学顕微鏡によって調査し、そして、Ｐｒｏｖｉｓ ＡＸ７０研
究顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｏｐｔｉｃａｌ，Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）を使用して
写真撮影した。代表的な組織学的切片を、色モニターを用いて、Ｐｅｎｔｉｕｍ
（登録商標）コンピューターにインストールされたコンピューターソフトウェア
（Ｆｌｅｘｉｂｌｅ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標
）第２．１５版、ＣＳＩＲ，Ｓｏｕｔｈ Ａｆｒｉｃａ）で補助して、顕微鏡的
に評価した。

【０１１０】 平均のＣＡＭの厚み（μｍ）を、以前に記載されたもの（ＹａｎｇおよびＭｏ
ｓｅｓ、前出）を少し改変して、測定した。簡単に言うと、全ＣＡＭの幅（外関
節、中関節、および内胚葉関節）を、移植ビーズ下の中央の領域およびこのビー
ズから離れた末梢領域にわたって、５つの定期的に間隔をおいたサンプル点の個
々の距離のアレイを用いて測定した。この点の間隔は、使用者の偏りを減少させ
るために、重ね合わせた格子グリッド（Ｚｅｉｓｓ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ
Ｐｌａｔｔｅ ＩＩ）の補助によって決定した。各代表的なサンプル区画におい
て、厚みの比率（中心に配置された領域の平均の厚み／末梢の非反応性領域の平
均の厚み）を計算した。膜の厚みにおけるこれらの相対的な変化を、その領域に
おける血管および線維組織の数、サイズまたは密度の変化と結び付けて、種々の
ＣＡＭの血管形成応答の全体的な評価に使用した。

【０１１１】 この定性的な評価に基づいて、異なる処置群を以下のように分類した：（Ｉ）
弱い（毛細血管および線維組織は限定された増加またはこの増加を伴わない、Ｃ
ＡＭの厚みのごくわずかな増加または増加なし）、（ｉｉ）中程度（毛細血管お
よび線維組織の中程度の増加を伴う、ＣＡＭの厚みにおける中程度の増加）、（
ｉｉｉ）強い（毛細血管および線維組織の拡張性の増加を伴う、ＣＡＭの厚みの
中程度の増加）または（ｉｖ）非常に強い（毛細血管および線維組織の拡張性の
増加を伴う、ＣＡＭの厚みの拡張性の増加）。実験を、４連で実行し、少なくと
も３回反復した。

【０１１２】 （実施例４：統計的な分析） 定量的なデータ（顕微鏡評価および厚みの比率）を、それぞれ、ＧｒａｐｈＰ
ａｄ Ｐｒｉｓｍ^ＴＭ、第２版（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）を用いて、２方
向分散分析または１方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって分析した。ｐ＜０．０
５における結果を、有意とみなした。

【０１１３】 （実施例５：ＯＰ−１誘導脈管形成に対するｂＦＧＦおよびＴＧＦ−βの相乗
効果−顕微鏡分析） 図１および９は、ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）に対する、モルフォゲンである
ｐＴＧＦ−β１（２０ｎｇ）、ｂＦＧＦ（５００ｎｇ）またはｈＯＰ−１（１０
０および１０００ｎｇ）の単一適用およびｈＯＰ−１／ｂＦＧＦ（１００／１０
０ｎｇ）またはｈＯＰ−１／ｐＴＧＦ−β１（１００／５および１００／２０ｎ
ｇ）の２成分適用が、ＢＳＡ（５００ｎｇ）コントロール（１２．５％）と比較
して、有意に高い陽性の脈管形成スコア（５０．０％以上）を実証したことを示
す。ｈＯＰ−１／ｂＦＧＦおよびｈＯＰ−１／ｐＴＧＦ−β１の組合わせは、最
も高い陽性応答数（７５％以上）を誘発した。最も高い疑わしい血管形成応答数
（３７．５％）が、低い用量のｈＯＰ−１（１００ｎｇ）によって生成された。
これらのモルフォゲンはまた、コントロール（６２．５％）と比較して、より低
い非応答性の脈管形成スコア（２５％以下）を示した；ｈＯＰ−１／ｐＴＧＦ−
β１の組合わせは、最も低い数値の非応答性スコア（０％）を誘発した。

【０１１４】 （実施例６：ＯＰ−１誘導新脈管形成に対するｂＦＧＦおよびＴＧＦ−βの相
乗効果−顕微鏡分析） （Ａ．ＣＡＭの厚み） 図２〜８は、ｐＴＧＦ−β１（２０ｎｇ）、ｂＦＧＦ（５００ｎｇ）およびｈ
ＯＰ−１（１００ｎｇおよび１０００ｎｇ）に浸漬したビーズに近接したＣＡＭ
領域が、ＢＳＡ（５００ｎｇ）コントロールと比較して、ＣＡＭの厚みにおける
有意な増加を示したことを示す。さらに、ｈＯＰ−１／ｂＦＧＦ（１００／１０
０ｎｇ）およびｈＯＰ−１／ｐＴＧＦ−β１（１００／５および１００／２０ｎ
ｇ）の二成分の組み合わせは、それぞれのモルフォゲンの単一適用よりも、ＣＡ
Ｍの厚みに有意に高い増加が誘発された。ｈＯＰ−１／ｐＴＧＦ−β１の組合わ
せは、膜の厚みの最も高い増加を誘発した。反応性ＣＡＭの厚みにおける増加の
全ては、細胞形態における有意な変化（有核の赤血球を有する血管の数およびサ
イズにおける増加ならびに線維組織密度における増加（線維増殖）を含む）によ
って達成された。

【０１１５】 （Ｂ．全体の脈管形成スコア） コントロール：５００ｎｇ ＢＳＡで浸漬したビーズは、ＣＡＭの全体の厚み
にごくわずかな変化（図２）、および弱いまたはごくわずかなＣＡＭの全体の脈
管形成反応（図１０）を引き起こした。図３に示されるように、ビーズの真下の
ＣＡＭの外胚葉、中胚葉および内胚葉は、曝露されていない隣接するＣＡＭと比
較した場合、実質的に正常なパターンを発生した。外胚葉および内胚葉は、ＣＡ
Ｍの全体の広がりにおいて平坦な単層または単一の上皮であった。外胚葉は、皮
内毛細血管の正常な発達を示した。中胚葉は、中心に局在しかつ外胚葉にも隣接
した有核赤血球を含む分散した血管を有する別々に配置された線維組織を主に示
した。内胚葉に隣接した中胚葉は、血管を欠損していた。

【０１１６】 ｐＴＧＦ−β１：２０ｎｇ ｐＴＧＦ−β１の適用によって、反応性ＣＡＭの
厚みの中程度の増加（図２）および中程度の全体的な脈管形成応答（図１０）が
生じた。図４は、反応中心が、内胚葉に隣接した中胚葉の領域に主に位置したこ
とを示す。中胚葉の非常に顕著な拡張または厚み、内胚葉の非常に強力な層化が
存在し、これには層化した上皮の最も外側の細胞層の流出の徴候を伴った。中胚
葉はまた、広範囲に及ぶ毛細血管の数の増加、ならびに内胚葉に隣接した線維芽
細胞および結合組織線維（青く染色されるコラーゲン線維を含む）の凝集を介し
た間葉細胞密度の増加によって特徴付けられる。いくつかの区分において、外胚
葉は、二分子層の扁平上皮に変化した。

【０１１７】 ｂＦＧＦ：５００ｎｇ ｂＦＧＦの適用は、反応性ＣＡＭの厚みの中程度の増
加（図２）および強度な全体の脈管形成応答（図１０）を生じた。この反応の組
織学的特徴は、この応答が、外胚葉および内胚葉の両方の強度な層化によって特
徴付けられたことを示す（図５）。拡張した中胚葉は、大きな毛細血管の増加な
らびに最も主に外胚葉および内胚葉の両方に隣接した領域における新規の毛細血
管の密度および線維組織の密度の増加によって特徴付けられた。青く染色される
コラーゲン線維は、反応性中胚葉に広範に分布した。層状外胚葉に類似の形態学
的外観を有し、そしてこの外胚葉におそらく隣接した細胞のクラスターが、中胚
葉に観察された。

【０１１８】 ｈＯＰ−１：１００ｎｇおよび１０００ｎｇのｈＯＰ−１適用は、それぞれ、
反応性ＣＡＭの厚みに用量依存性の中程度から高度の増加（図２）および中程度
から強度の全体的な脈管形成応答（図１０）を引き起こした。１００ｎｇ ｈＯ
Ｐ−１に対するＣＡＭの反応（図６Ａ）は、外胚葉に部分隣接（ｓｕｂａｄｊａ
ｃｅｎｔ）した中胚葉の領域に主に局在した。外胚葉の強度の層化および内胚葉
の弱い増殖が存在した。中胚葉は拡張し、多数の毛細血管および広汎性の線維組
織が、外胚葉付近の領域に主に分布していた。１０００ｎｇのｈＯＰ−１に対す
る反応（図６Ｂ）はまた、外胚葉に部分隣接した中胚葉領域に主に限定されたが
、１００ｎｇのｈＯＰ−１によって誘発された応答よりも強度であった。外胚葉
の非常に強度な層化および内胚葉の中程度の細胞拡張が存在した。中胚葉は、拡
大し、新しい毛細血管および非常に密集した線維組織が、外胚葉に部分隣接した
領域に主に分布した。これ以前に、外胚葉内毛細血管は、血管を含まない層状外
胚葉の直下に位置した。中胚葉において、水症性細胞および壊死性細胞が、層化
された外胚葉の細胞に同一な形態学的外観を示すいくつかの細胞群で観察された
。両用量のｈＯＰ−１によって（図６Ａおよび６Ｂ）、中胚葉中の有核赤血球を
伴う複数の拡大した血管が存在した。

【０１１９】 ｈＯＰ−１／ｂＦＧＦ：１００ｎｇ ｈＯＰ−１と１００ｎｇ ｂＦＧＦの二
成分適用によって、反応性ＣＡＭの厚みに中程度から高度の増加（図２）、なら
びに非常に強度な脈管形成応答（図１０）が生じた。この組合わせは、外胚葉、
中胚葉、および内胚葉の強度な変化を引き起こした（図７）。外胚葉上皮は、層
化および細胞の肥厚に加えて円柱形態を獲得した内胚葉細胞を介して厚くなった
。中胚葉は、より強化され、ＣＡＭの反応性領域を介して広範に分布した線維芽
細胞および小さい血管の増加した密度を示した。主に青に染色されるコラーゲン
を含む線維組織は、非常に密集し、そして反応性中胚葉の外周部にわたって広が
った。

【０１２０】 ｈＯＰ−１／ｐＴＧＦ−β１：１００ｎｇ ｈＯＰ−１とｐＴＧＦ−β１（５
ｎｇおよび２０ｎｇ）の二成分適用は、反応性ＣＡＭの厚みの非常に高い増加（
図２）および非常に強度な全体の脈管形成応答（図１０）を示した。ＣＡＭの厚
みにおける増加は、適用した全ての形態形成タンパク質およびＭＰＳＦの間で最
も高かった。ＣＡＭの３つ全ての層は、非常に強度な肥厚によって特徴付けられ
た（図８Ａおよび８Ｂ）。両方の適用から生じる応答は、間葉組織および付随す
る線維組織の高い凝集ならびに大きい血管および小さい血管の拡張性の増殖によ
って特徴付けられた。層化した外胚葉の細胞に形態学的に同一な細胞群内に位置
する中胚葉に、死細胞もまた存在した。ＣＡＭ組織によるゲルビーズの付随する
発達は、しばしば明確であった（図８Ｂ）。

【０１２１】 本発明者らは、本発明の多数の実施形態を記載してきたが、本発明者らの基本
的な構造が変更されて、本発明の方法を利用する他の実施形態を提供し得ること
は、明らかである。従って、本発明の範囲が、例として提示された特定の実施形
態によるよりも、添付の特許請求の範囲によって規定されるべきであることが認
識される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ＢＳＡ（５００ｎｇ）、ｐＴＧＦ−β１（２０ｎｇ）、ｂＦＧＦ（５
００ｎｇ）、ｈＯＰ−１（１００ｎｇおよび１０００ｎｇ）、ｈＯＰ−１／ｂＦ
ＧＦ（１００／１００ｎｇ）またはｈＯＰ−１／ｐＴＧＦ−β１（１００／５ｎ
ｇおよび１００／２０ｎｇ）に浸したＡｆｆｉｇｅｌ（登録商標）Ｂｌｕｅ Ｇ
ｅｌアガロースビーズの適用後５日で写真撮影したニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）
における巨視的な脈管形成反応を評価するために使用される、代表的な等級の例
示である。（Ａ）応答なし：周辺ＣＡＭおよび適用部位周辺での血管の分布にお
いて変化なし。（Ｂ）不確かな応答：血管は、適用部位に対してより高い方向性
で周辺ＣＡＭから発する。（Ｃ）陽性の応答：周辺ＣＡＭからの血管は、適用部
位周辺でスポーク様の様式で集中する。ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン；ｐＴＧＦ
−β１＝血小板由来トランスフォーミング増殖因子−β１；ｂＦＧＦ＝塩基性繊
維芽細胞増殖因子；ｈＯＰ−１＝ヒト骨形成タンパク質−１。棒線は１ｍｍ。

【図２】 図２は、ＢＳＡ（５００ｎｇ）、ｐＴＧＦ−β１（２０ｎｇ）、ｂＦＧＦ（５
００ｎｇ）、ｈＯＰ−１（１００ｎｇおよび１０００ｎｇ）、ｈＯＰ−１／ｂＦ
ＧＦ（１００／１００ｎｇ）またはｈＯＰ−１／ｐＴＧＦ−β１（１００／５ｎ
ｇおよび１００／２０ｎｇ）に浸したＡｆｆｉｇｅｌ（登録商標）Ｂｌｕｅ Ｇ
ｅｌアガロースビーズの適用に応答するニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）の相対的な
厚さの比である。ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン；ｐＴＧＦ−β１＝血小板由来ト
ランスフォーミング増殖因子−β１；ｂＦＧＦ＝塩基性繊維芽細胞増殖因子；ｈ
ＯＰ−１＝ヒト骨形成タンパク質−１。値＝平均値±標準偏差、全てのサンプル
群についてＮ＝５、ＡＮＯＶＡによるｐ＜０．０５。

【図３】 図３は、５日間の５００ｎｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）への曝露後の、
代表的なコントロール処理したニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）の断面である。ビー
ズの近傍の領域は、中胚葉性（ｍｅ）間質を囲む薄い外胚葉性（ｅｃ）上皮およ
び内胚葉性（ｅｎ）上皮を有する正常な構造を示す。いくつかのゲルビーズ（ｇ
）のもともとの位置は、ＣＡＭの外胚葉性表面における湾入によって区別可能で
ある。中胚葉は、主に、広い細胞間の空間においてまばらにかつ大まかに整列し
た繊維芽細胞からなる。有核の赤血球を有する大きい血管（ｂｖ）の発生は、中
胚葉において観察された。外胚葉は、皮内毛細管（ｉｅｃ）の正常な発達を示す
。青く染色されたコラーゲン線維は、中胚葉内のいくつかの領域にまばらに分布
する。ゼラチン（ｇｌ）の痕跡は、ビーズの間、およびビーズと層状の外胚葉と
の間の領域に残る。尺度の棒線＝５０μｍ。

【図４】 図４は、２０ｎｇのｐＴＧＦ−β１の適用後の、ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）
の組織学的応答である。はっきりと厚くなった中胚葉（ｍｅ）および広範に層状
化した内胚葉（ｅｎ）が存在する。毛細管（ｃａ）の広範な増殖が、中胚葉全体
にわたって観察される。主に中胚葉の内胚葉性の部分に局在する、線維性結合組
織（ｃｔ）の別々の蓄積および濃縮は、毛細管の数の増大を伴う。青く染色され
たコラーゲン線維は、反応中心の位置における中胚葉内の濃縮された線維性組織
中に高密度に広がる。内胚葉細胞の脱落（矢頭）が観察される。尺度の棒線＝１
００μｍ。

【図５】 図５は、５００ｎｇのｂＦＧＦへの曝露後の、ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）の
組織学的応答である。はっきりと厚くなった中胚葉（ｍｅ）ならびに広範に層状
化した外胚葉（ｅｃ）および内胚葉（ｅｎ）の両方が存在する。繊維芽細胞の豊
富な結合性組織（ｃｔ）の高密度な蓄積は、中胚葉の外胚葉性部分および内胚葉
性部分の両方に近接した領域に位置する。毛細管（ｃａ）および多数の青く染色
されたコラーゲン線維は、反応性中胚葉の全体にわたって広く広がる。層状の外
胚葉に類似の外観を有する細胞の塊（ｃｄ）は、中胚葉内に包埋される。青く染
色されたコラーゲン線維は、反応中心の位置における中胚葉内の濃縮された線維
性組織において高密度に広がり、そして中胚葉の中心部分において良好に広がる
。ゼラチン（ｇｌ）の残渣は、ビーズの間、および外胚葉の近傍に位置する。尺
度の棒線＝１００μｍ。

【図６】 図６は、ｈＯＰ−１に対するニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）の曝露によって誘導
される組織学的効果である。（Ａ）１００ｎｇのｈＯＰ−１は、大まかに整列し
た中胚葉（ｍｅ）内で複数の拡大した血管（ｂｖ）の発達を誘導し、いくつかは
その管腔内に有核の赤血球を有する。数の増大した毛細管（ｃａ）および規定さ
れた線維性結合組織（ｃｔ）（青く染色されたコラーゲン線維を含む）の凝集は
、中胚葉の外胚葉性区域内に存在する。外胚葉（ｅｃ）および内胚葉（ｅｎ）の
両方は、多層の上皮に形質転換される。外胚葉細胞の脱落（矢頭）は、はっきり
と明確である。尺度の棒線＝５０μｍ。（Ｂ）１０００ｎｇのｈＯＰ−１は、非
常に拡大した中胚葉（ｍｅ）の外胚葉性セグメントにおいて多数の毛細管（ｃａ
）および結合組織の線維（ｃｔ）の蓄積を誘導した。外胚葉（ｅｃ）は、血管の
ない多層の扁平上皮に形質転換される。先の外胚葉内の毛細管は、ここで、外胚
葉の層状上皮の下部に位置し、上皮下の毛細管（ｓｅｃ）を形成する。内胚葉（
ｅｎ）の細胞は、多層の構造に整列される。水腫細胞および壊死細胞は、その厚
くなった中胚葉に包埋された層状外胚葉に形態学的に類似する細胞の塊（ｃｄ）
において見られる。尺度の棒線＝５０μｍ。

【図７】 図７は、ｈＯＰ−１／ｂＦＧＦの組み合わせ（１００／１００ｎｇ）の適用後
のニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）の組織学的反応である。有核の赤血球を有する多
数の拡張した血管（ｂｖ）および毛細管（ｃａ）は、水腫状の中胚葉（ｍｅ）内
に広く分布する。青く染色されたコラーゲン線維からなる線維性結合組織（ｃｔ
）は、非常に高密度であり、そして反応性中胚葉の厚さ全体にわたって広く分布
する。内胚葉（ｅｎ）および外胚葉（ｅｃ）（この断面にはない）は、層状化に
よって厚くなった。尺度の棒線＝５０μｍ。

【図８】 図８は、ｈＯＰ−１／ｐＴＧＦ−β１への曝露後のニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ
）の応答である。（Ａ）ｈＯＰ−１／ｐＴＧＦ−β１（１００／５ｎｇ）：ＣＡ
Ｍの３つ全ての層の非常に顕著な厚化が存在する。多層化された内胚葉（ｅｎ）
は、絨毛様のパターンを示す。広範な毛細管（ｃａ）および線維性組織（ｃｔ）
は、多くの拡張した血管（ｂｖ）を含む、反応性の中胚葉（ｍｅ）全体にわたっ
て位置する。青く染色されたコラーゲン線維は、外胚葉および内胚葉に隣接する
領域の位置で、中胚葉内の濃縮された線維性組織において高密度に広がり、中胚
葉の中心部分において良好に広がった。層状の外胚葉と類似の外観を有する細胞
の塊（ｃｄ）は、中胚葉に包埋される。内胚葉の脱落（矢頭）は、はっきりと見
られる。尺度の棒線＝５０μｍ。（Ｂ）ｈＯＰ−１／ｐＴＧＦ−β１(１００／
２０ｎｇ）：広範な線維性組織（ｃｔ）の濃縮および顕著に多数の毛細管（ｃａ
）が存在する。ビーズ（ｇ）の封入の証拠は、はっきりと顕著である。青く染色
されたコラーゲンを含む高密度な結合組織の線維は、封入されたビーズの区域を
取り巻く領域に整列される。多層化された内胚葉（ｅｎ）は、絨毛様であり、そ
して厚くなった外胚葉には、血管がない。内胚葉の脱落（矢頭）は、はっきりと
見られる。尺度の棒線＝１００μｍ。

【図９】 図９は、Ａｆｆｉｇｅｌ（登録商標）Ｂｌｕｅ Ｇｅｌアガロースビーズを使
用したｐＴＧＦ−β１、ｂＦＧＦ、ｈＯＰ−１、ｈＯＰ−１／ｂＦＧＦまたはｈ
ＯＰ−１／ｐＴＧＦ−β１の適用に対する、ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）の新脈
管形成応答の顕微鏡写真の評価である。全てのサンプル群についてＮ＝８；ＡＮ
ＯＶＡによるｐ＜０．０５。ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン；ｐＴＧＦ−β１＝血
小板由来トランスフォーミング増殖因子−β１；ｂＦＧＦ＝塩基性繊維芽細胞増
殖因子；ｈＯＰ−１＝ヒト骨形成タンパク質−１。

【図１０】 図１０は、Ａｆｆｉｇｅｌ（登録商標）Ｂｌｕｅ Ｇｅｌアガロースビーズを
使用したｐＴＧＦ−β１、ｂＦＧＦ、ｈＯＰ−１、ｈＯＰ−１／ｂＦＧＦまたは
ｈＯＰ−１／ｐＴＧＦ−β１の適用に対する、ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）の新
脈管形成応答の定性的な順位である。量はナノグラム量である。全てのサンプル
群についてＮ＝５。ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン；ｐＴＧＦ−β１＝血小板由来
トランスフォーミング増殖因子−β１；ｂＦＧＦ＝塩基性繊維芽細胞増殖因子；
ｈＯＰ−１＝ヒト骨形成タンパク質−１。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 27/02 Ａ６１Ｐ 29/00 １０１ 29/00 １０１ 35/00 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/475 // Ｃ０７Ｋ 14/475 14/515 14/515 Ａ６１Ｋ 37/02 ＺＮＡ (72)発明者 ラモシェビ， レンシャ ナサニエル 南アフリカ 1809 ヨハネスバーグ， ポ ピムビル， ホワイト シティ ジャバ ブ， エイ ムコンザ ストリート 456 Ｆターム(参考） 4C084 AA01 AA02 AA19 BA14 BA22 BA26 CA62 DA12 DB52 DB54 DB58 MA02 MA66 NA14 ZA331 ZA361 ZA961 ZB151 ZB261 ZC351 4H045 AA10 BA10 CA40 DA01 EA28 FA74

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 有効量の形態形成タンパク質を投与することによって哺乳動
   物において新脈管形成を誘導するための方法であって；ここで、該形態形成タン
   パク質は、ＢＭＰ−２でもＧＤＦ−５でもない、方法。
2. 【請求項２】 形態形成タンパク質を有効量の形態形成タンパク質刺激因子
   と同時投与することによって、哺乳動物において該形態形成タンパク質の新脈管
   形成誘導活性を改善するための方法。
3. 【請求項３】 請求項２に記載の方法であって、ここで、前記形態形成タン
   パク質刺激因子は、前記形態形成タンパク質による新脈管形成に対して付加効果
   を有する、方法。
4. 【請求項４】 請求項２に記載の方法であって、ここで、前記形態形成タン
   パク質刺激因子は、前記形態形成タンパク質による新脈管形成に対して相乗効果
   を有する、方法。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、ここで
   、前記形態形成タンパク質は、新脈管形成を誘導し得る骨形成タンパク質である
   、方法。
6. 【請求項６】 請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、ここで
   、前記形態形成タンパク質は、以下：ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、Ｂ
   ＭＰ−６、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、
   ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、Ｃ
   ＯＰ−５、ＣＯＰ−７およびこれらのアミノ酸配列改変体からなる群より選択さ
   れるアミノ酸配列を含む、方法。
7. 【請求項７】 前記形態形成タンパク質が単量体種である、請求項１〜４の
   いずれか１項に記載の方法。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の方法であって、ここで、前記単量体種が、
   以下：ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−
   ７およびこれらのアミノ酸配列改変体からなる群より選択される、方法。
9. 【請求項９】 前記形態形成タンパク質がジスルフィド結合した二量体種を
   含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
10. 【請求項１０】 請求項９に記載の方法であって、ここで、前記二量体種が
    、以下：ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ
    −７およびこれらのアミノ酸配列改変体からなる群より選択されるポリペプチド
    を含む、方法。
11. 【請求項１１】 前記形態形成タンパク質がＯＰ−１である、請求項１〜４
    のいずれか１項に記載の方法。
12. 【請求項１２】 請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、ここ
    で、前記形態形成タンパク質は、宿主細胞において組換えＤＮＡ分子の発現によ
    って産生される、方法。
13. 【請求項１３】 請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法であって、ここ
    で、前記形態形成タンパク質刺激因子が、以下：酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦ
    ＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング
    増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α
    ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、内皮細胞増殖因
    子（ＥＣＧＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、肝細胞増殖因子（
    ＨＧＦ）、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、
    胎盤増殖因子（ＰＧＦ）、プロリフェリン、Ｂ６１、可溶性血管細胞接着分子−
    １（ＳＶＣＡＭ−１）、可溶性Ｅセレクチン、エフリン、１２−ヒドロキシエイ
    コサテトラエン酸、ＨＩＶ−１のｔａｔタンパク質、アンギオゲニン、プロスタ
    グランジンおよびこれらのアミノ酸配列改変体からなる群より選択される少なく
    とも１つの化合物を含む、方法。
14. 【請求項１４】 請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法であって、ここ
    で、前記形態形成タンパク質刺激因子が、以下：塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ
    ＦＧＦ）、血小板由来トランスフォーミング増殖因子−β１（ＴＧＦ−β１）、
    およびこれらのアミノ酸配列改変体からなる群より選択される少なくとも１つの
    化合物を含む、方法。
15. 【請求項１５】 請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法であって、ここ
    で、前記形態形成タンパク質刺激因子が、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ
    ）およびこれらのアミノ酸配列改変体からなる群より選択される、方法。
16. 【請求項１６】 請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法であって、ここ
    で、前記形態形成タンパク質刺激因子が、血小板由来トランスフォーミング増殖
    因子−β１（ＴＧＦ−β１）およびこれらのアミノ酸配列改変体からなる群より
    選択される、方法。
17. 【請求項１７】 請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法であって、ここ
    で、前記形態形成タンパク質および前記形態形成タンパク質刺激因子が、標的部
    位に同時に投与される、方法。
18. 【請求項１８】 請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法であって、ここ
    で、前記形態形成タンパク質および前記形態形成タンパク質刺激因子が、標的部
    位に別々に投与される、方法。
19. 【請求項１９】 前記標的部位が血管組織の欠損である、請求項１７に記載
    の方法。
20. 【請求項２０】 前記標的部位が血管組織の欠損である、請求項１８に記載
    の方法。