JP2003509336A

JP2003509336A - 物質のｐｎｓにおける新規使用

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Publication number: JP2003509336A
Application number: JP2000615034A
Authority: JP
Inventors: ルンドベルグ、トーマス; マンニ、ルイジ
Original assignee: ルンドベルグ、トーマス
Priority date: 1999-05-03
Filing date: 2000-05-03
Publication date: 2003-03-11
Also published as: SE9901578D0; RU2001132588A; AU4447400A; WO2000066150A1; CN1353616A; EP1173196A1

Abstract

(57)【要約】末梢神経障害は、末梢運動および感覚ニューロンの構造および機能における障害を包含し、その完全ニューロンおよびその一部を包含することができる。ＣＣＫ−８およびその類縁化合物の外からの投与は、神経栄養因子、特にＮＧＦの細胞における産生を誘発し、末梢神経系における神経障害状態を処置することができることが証明された。従って、本発明は、末梢神経系における神経障害の処置におけるＣＣＫ−８活性を示す物質の使用およびＣＣＫ−８活性を示す物質を含有する医薬組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、末梢神経系における神経障害処置用医薬の製造におけるＣＣＫ−８
活性を示す物質の使用に関する。本発明はまた、少なくとも１種のＣＣＫ−８活
性を示す物質を含有する医薬組成物に関する。

【０００２】（発明の背景）末梢神経障害は、末梢運動および感覚ニューロンの構造および機能における障
害を包含し、また完全ニューロンおよびその一部を包含することができる。末梢
神経系における神経障害は、例えば手術により、怪我の結果として、神経毒性化
合物にさらされた後の副作用として、または化学的もしくは照射による癌処置後
に誘発されることがある。また、真性糖尿病の患者はしばしば、皮膚感染および
損傷した外傷治癒を生じることがある感覚ニューロンの障害を生じさせる末梢神
経障害による疾病に悩まされる。

【０００３】神経成長因子（ＮＧＦ）は、最高の特性を有する神経栄養因子である。ＮＧＦ
は神経ペプチド発現のモジュレーションにより末梢感覚ニューロンおよび交感神
経ニューロンの成長および分化において主要な役割を演じる。ＮＧＦの外部から
の投与は神経ペプチド合成を刺激し、さらにまた、一定の化学的損傷後の神経化
学的機能を回復させることが示されている(Donnerer J.,Neurosci.Lett.,221:33
-36,1996;Donnerer J.ら,Brain Res.,741:103-108,1996) 。従って、ＮＧＦは末
梢神経障害状態の処置に使用することができる。

【０００４】しかしながら、ＮＧＦの全身投与に付随する幾つかの問題が存在する。ＮＧＦ
分子は、血液循環中に注入されると、短い半減期間を示し、必要な高薬用量で用
いられると、副作用が生じる。また、局所施用は局限的効果を有することもある
が、通常、末梢神経系の全身的障害に対して影響を及ぼすことはできない。さら
にまた、ＮＧＦの外からの投与には、アレルギー反応をもたらすことがある夾雑
物が問題になる。ＮＧＦの局所投与はまた、患者に対して有毒であることが証明
されており、またＮＧＦは末梢神経系への浸透が困難である。ヒトにおけるＮＧ
Ｆの局所投与は、糖尿病性神経障害の臨床試験で主として試験されている(Apfel
SC.等、Neurology,51:695-702,1998)。見出された有害な現象には、注入部位の
痛覚過敏、全身性筋肉痛および幾つかの場合、内蔵の痛みがある。組織臓器を覆
う筋膜上への局所施用はまた、かなりの痛みを伴うことがある。

【０００５】これらの問題を克服するために、ＮＧＦ誘発活性を有する物質の投与によるＮ
ＧＦの産生を誘発することができれば、非常に好都合である。このような物質の
若干例は存在している(Riaz SS. 等、Prog.Neurobiol.,49:125-143,1996)。ＮＧ
Ｆ誘発剤としてのこれらの物質の効果のほとんどは、インビトロモデル、特にグ
リア細胞を用いて開示されている。これらの細胞はＮＧＦを産生し、末梢におい
ては、ＮＧＦは神経支配の組織標的により主として産生されることは知られてい
るが、この見解の証拠は引用された物質が末梢ＮＧＦ発現を変調させることがで
きるという仮説を支持しない。さらにまた、細胞培養物中で見出されたＮＧＦ増
加が使用された医薬の特異的で選択的な効果であるか、または一般的な非特異同
化作用であるかは明確ではない。或る種のＮＧＦ誘発剤−カテコールアミン類−
のインビボ効果を開示する数少ない研究は、末梢神経障害の若干のモデルにおけ
る運動機能の回復に限られている(Hanaoka Y. 等, Exp.Neurol.,115(2):292-296
,1992;J.Neurol Sci.,122(1):28-32,1994;Saita K.等、Neurotoxicology,16(3):
403-412,1995) 。

【０００６】 EP-A2-0239716 は、物質ＣＣＫ−８が動脈圧に影響することを示しており、こ
れはＣＮＳ−媒介メカニズムを示唆している。しかしながら、この刊行物はＣＣ
Ｋ−８にかかわり、ＮＧＦを包含する成長因子のいずれかの関連可能性を示して
いない。 Tirassa P.等は、ＣＣＫ−８が脳におけるＮＧＦレベルの増加を誘発させるこ
とを開示している(Br.J.Pharmacol.,123(6),1230-1236,1998) 。この効果の一部
は、感覚求心神経(sensory afferents) により媒介される。

【０００７】最近になって、本発明の発明者等は、中枢神経系における神経伝達物質として
動作することが知られている神経ペプチドＣＣＫ−８（Ａｓｐ−Ｔｙｒ（ＳＯ₃ Ｈ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−ＰｈｅＮＨ₂）［ＣＣＫ−８
は３３アミノ酸長ペプチドコレシストキニン(cholecystokinin) （ＣＣＫ）の２
６〜３３オクタペプチドである］、またはＣＣＫ−８活性を示すＣＣＫ−８の誘
導体は、上記問題を回避する方法で、末梢神経系における神経成長因子の産生を
誘発させることができることを見出した。一例として、末梢器官におけるＮＧＦ
のＣＣＫ−８刺激、及び引き続く末梢神経損傷の回復は、感覚求心神経の活性化
を必要としない（例えば、例参照）。これは、ＣＮＳとＰＮＳとにおけるＣＣＫ
−８誘発ＮＧＦ発現が相違するメカニズムによるものであることを示唆している
。

【０００８】（発明の概要）従って、本発明は末梢神経系の神経障害処置用医薬の製造のためのＣＣＫ−８
活性を示す物質の使用に関する。一態様において、この物質はＣＣＫ−８であり
、もう一つの態様では、この物質はＣＣＫ−８活性を示すＣＣＫ−８の誘導体で
ある。本発明はまた、上記物質を含有する医薬組成物に関する。本発明者等は、ＣＣＫ−８がｍＲＮＡ合成よりもむしろ、ＮＧＦの転換速度(t
urn-over rate)に作用するように見えることを示した。彼等はまた、ＣＣＫ−８
が通常の投与量でいずれかの副作用を生じさせるようには見えないことを証明し
た。ＣＣＫ−８は非常に強力であり、従って所望の効果の達成に、低用量の投与
のみを必要とする。ＣＣＫ−８はまた、患者において鎮静効果を有する。

【０００９】（発明の詳細な説明）本明細書に記載されているものとして、ＣＣＫ−８活性を示す物質の用語は、
本質的にＣＣＫ−８様神経栄養物質誘発活性を有する物質を意味する。これはま
た、ＣＣＫ−８活性を示す物質が、外から投与された場合、ＣＣＫ−８と実質同
一の様相で神経栄養物質、特に神経成長因子（ＮＧＦ）の細胞産生を誘発させる
能力を有することを意味する。ＣＣＫ−８活性は、本明細書の例の部分に記載さ
れている方法に従い測定することができる。神経栄養活性、特にＮＧＦの測定は
、例の部分に記載の方法に従い行うことができる。

【００１０】本発明の目的は、末梢神経系の神経障害処置用医薬の製造においてＣＣＫ−８
活性を示す物質を使用することにある。本発明で用いることができるＣＣＫ−８
類縁化合物の例は、US-A-5631230に見出すことができる。ＣＣＫ−８活性を示す
物質の別の例には、次の物質がある：ガストリン、セルレイン、ボンベシン、セ
ルレチド、ペンタガストリン（およびその類縁化合物３−ロイペンタガストリン
（３−ｌｅｕ−ＰＧ）、４−ＡｓｐＯＢｚｌ−ペンタガストリン（４−ＡｓｐＯ
Ｂｚｌ−ＰＧ）、ＧＲＰ（ガストリン放出ペプチド）、ＣＣＫ−８およびＣＣＫ
−４の環状類縁化合物、Ｓｕｃ−Ｔｙｒ−Ｎ−（Ｍｅ）−Ｈｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｈ
ｅ−ＮＨ₂、ＢＣ２６４、Ａ７１２６３、Ｕ６７８２７Ｅ、ベンゾジアゼピン、
Ｄ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−［（Ｎｌｅ２８，３１）ＣＣＫ−２６−３３］、Ｓｕｃ−
Ｔｒｐ−Ｎ（Ｍｅ）−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂、ＡＲＬ１５８４９ＸＸ
、ＡＲＬ１６９３５ＸＸ、ＡＲＬ１５７４５ＸＸ、

【００１１】Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−（Ｎ−Ｍｅ）Ｎｌｅ−Ａｓｐ−
Ｐｈｅ−ＮＨ₂（ＳＮＦ９００７）、ＣＣＫ−４（およびその類縁化合物ＣＣＫ
−４（Ｐｈｅｔ））、Ｈ−Ｔｙｒ−シクロ（Ｄ−Ｐｅｎ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌ／
Ｄ−３−トランスメルカプトプロリン）−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂配列の環状ペ
プチド、Ｈ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌ／Ｄ−３−トランスメル
カプトプロリン−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂配列の線状ペプチド、ＳＮＦ８７０２
、環状コレシストキニンペプチド類縁化合物ＪＭＶ−３２０、スクシニル−Ｔｙ
ｒ−（ＳＯ３Ｈ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−フェネチルアミド、Ｂｏ
ｃ−Ｔｒｐ−（Ｎ−Ｍｅ）Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂およびＢｏｃ−Ｔｒ
ｐ−（Ｎ−Ｍｅ）Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂、

【００１２】スルフェート化ＣＣＫ−８（ＣＣＫ−８Ｓ）およびＤ−Ｔｙｒ２５−（Ｎｌｅ２
８，３１）−ＣＣＫ２５−３３Ｓ、Ａ−７１３７８、シュード（pseudo）ガスト
リン［（Ｇｌｕ）５−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｎｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｎｌｅ−Ａ
ｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂］、（デス−ＮＨ₂）Ｔｙｒ（ＳＯ３−）−Ｎｌｅ−Ｇｌ
ｙ−Ｔｒｐ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂、アスペルリシン、Ａ７１６２３
、フェネチルエステル類縁化合物ＯＰＥ、Ｕ−６７８２７Ｅ、Ａｃ［Ｘ２７，Ｎ
ｌｅ２８，Ｎｌｅ３１］−ＣＣＫ２７−３３［ここで、Ｘは（Ｌ，Ｄ）Ｐｈｅ（
ｐ−ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）または（Ｌ，Ｄ）Ｐｈｅ（ｐ−ＣＨ２ＣＯＮＨＯＨ）であ
る］、Ａｃ［Ｐｈｅ（ｐ−ＣＨ２ＳＯ３Ｈ）２７，Ｎｌｅ２８，Ｎｌｅ３１］−
ＣＣＫ２７−３３、Ｂｏｃ［Ｎｌｅ２８，Ｎｌｅ３１］−ＣＣＫ２７−３３（Ｂ
ＤＮＬ）、ＣＣＫ−８中のＢｏｃ−Ｔｙｒ（ＳＯ３Ｈ）の代用としてＢｏｃ−Ｐ
ｈｅ（ｐ−ＣＨ２）ＳＯ３Ｈ、アセチル−ＣＣＫ−７、

【００１３】Ａｃ−Ｐｈｅ（４−ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓ
ｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂（２８）、Ａｃ−Ｐｈｅ［４−（テトラゾール−５−イル）
］−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂（３４）、３−
［４−（カルボキシメチル）−フェニル］プロパノイル−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔ
ｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂（５０）、ＭＫ３２９、Ｌ−３６４，７
１８、Ｔｈｒ２８ＮｌＥ３１ＣＣＫ２５−３３（ＣＣＫ９）、Ｄ−Ｔｙｒ２５（
Ｎｌｅ２８，３１）−ＣＣＫ（２５−３３）、［Ｎ−ＭｅＮｌｅ２８，３１］Ｃ
ＣＫ２６−３３、その２８および３１位置がリジン残基で置き換えられており、
またその側鎖がスクシン部分により架橋されている環状ＣＣＫ類縁化合物、Ｂｏ
ｃ−［Ｎｌｅ２８，３１］−ＣＣＫ−７、Ｂｏｃ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐ
ｈｅ−ＮＨ₂、チフルアドン(Tifluadom) 、

【００１４】２−（アミノメチル）−および３−（アミノメチル）−１，４−ベンゾジアゼピ
ン、ＪＭＶ２３６（Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（ＳＯ３）−Ｎｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｎｌ
ｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂）、ＣＣＫ−ＪＭＶ−１８０（ＢＯＣ−Ｔｙｒ（Ｓ
Ｏ３）Ａｈｘ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｈｘ−Ａｓｐ２フェニルエチルエステル）、
ＢＯＣ（Ｎｌｅ２８；Ｎｌｅ３１）ＣＣＫ２７−３３（ＢＤＮＬ−ＣＣＫ７）、
ＢＣ−１９７（ＢＯＣ−Ｄ．Ａｓｐ−Ｔｙｒ（ＳＯ３Ｈ）−Ｎｌｅ−Ｄ．Ｌｙｓ
−Ｔｒｐ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂）、Ｂｏｃ［Ｎｌｅ２８，Ｎｌｅ３
１］ＣＣＫ２７−３３、Ｂｏｃ［Ｄ−Ｔｙｒ（ＳＯ３Ｎａ）２７，Ｎｌｅ２８，
Ｎｌｅ３１］ＣＣＫ２７−３３、Ａｃ［Ｌ−Ｐｈｅ（ｐ−ＣＨ２ＳＯ３Ｎａ）２
７，Ｎｌｅ２８，Ｎｌｅ３１］ＣＣＫ２７−３３、

【００１５】Ａｃ［Ｄ−Ｐｈｅ（ｐ−ＣＨ２ＳＯ３Ｎａ）２７，Ｎｌｅ２８，Ｎｌｅ３１］Ｃ
ＣＫ２７−３３、Ｔｈｒ２８Ｎｌｅ３１−ＣＣＫ２５−３３（ＣＣＫ−９）、ｔ
−ブチルオキシカルボニル−Ｔｙｒ（ＳＯ３Ｈ）Ｎｌｅｐｓｉ（ＣＯＣＨ２）
Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂、ｔ−ブチルオキシカルボニ
ル−［Ｎｌｅ２８，３１］ＣＣＫ−８、デスアミノ−コレシストキニン−オクタ
ペプチド（ＣＣＫ７）、ＧＥ４１０、そのＣ末端Ｌ−Ｐｈｅ３３残基がＬ−Ｌｅ
ｕ、Ｄ−ＰｈｅまたはＮ−メチル−Ｌ−Ｐｈｅにより置き換えられており、コレ
シストキニンＣＣＫ２６−３３の３１位置に存在するメチオニン−３１の代わり
にアミノ酸フェニルアラニン、アラニン、グルタミン酸およびオルニチンにより
置き換えられているＮアルファ−ヒドロキシスルホニル−［Ｎｌｅ２８，３１］
ＣＣＫ２６−３３およびそのイプシロン−アミノ基がベンジルオキシカルボニル
基により保護されているその類縁化合物、

【００１６】Ｄ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ［（Ｎｌｅ２８，３１）ＣＣＫ２６−３３］、コレシストキ
ニンのＣ−末端ヘプタペプチドのシュード（pseudo）ペプチド類縁化合物、Ｚ−
Ｔｙｒ（ＳＯ３−）−Ｎｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｎｌｅ−Ａｓｐｐｓｉ−（
ＣＨ２ＮＨ）Ｐｈｅ−ＮＨ₂（１）、Ｚ−Ｔｙｒ（ＳＯ３−）−Ｎｌｅ−Ｇｌｙ
−Ｔｒｐ−Ｎｌｅｐｓｉ（ＣＨ２ＮＨ）Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂（２）、Ｚ−
Ｔｙｒ（ＳＯ３−）−Ｎｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐｐｓｉ（ＣＨ２ＮＨ）Ｎｌｅ−
Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂（３）、Ｚ−Ｔｙｒ（ＳＯ３−）−Ｎｌｅ−Ｇｌｙｐ
ｓｉ（ＣＨ２ＮＨ）Ｔｒｐ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂（４）、Ｚ−Ｔｙ
ｒ（ＳＯ３−）−Ｎｌｅｐｓｉ（ＣＨ２ＮＨ）Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｎｌｅ−Ａｓ
ｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂（５）、Ｚ−Ｔｙｒ（ＳＯ３−）−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ
−Ｎｌｅ−Ａｓｐｐｓｉ（ＣＨ２ＮＨ）−Ｐｈｅ−ＮＨ₂（６）、Ｚ−Ｔｙｒ
（ＳＯ３−）−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｎｌｅｐｓｉ（ＣＨ２ＮＨ）Ａｓｐ
−Ｐｈｅ−ＮＨ₂（７）およびＺ−Ｔｙｒ（ＳＯ３−）−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒ
ｐｐｓｉ（ＣＨ２ＮＨ）Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂（８）、

【００１７】Ｂｏｃ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（ＳＯ３−）−Ｎｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｎｌｅ−Ａｓ
ｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂、ＣＣＫ−（２７，３２）−ＮＨ₂、アセチル−ＣＣＫ−ヘ
プタペプチドの類縁化合物（Ａｃ−Ｔｙｒ（ＳＯ３Ｈ）２−Ｍｅｔ３−Ｇｌｙ４
−Ｔｒｐ５−Ｍｅｔ６−Ａｓｐ７−Ｐｈｅ８−ＮＨ₂）（ここで、Ａｓｐ７残基
はヒドロキシアミノ酸硫酸エステルにより置き換えられており、Ｇｌｙ４はＤ−
Ａｌａにより置換されているが、Ｔｒｐ５およびＭｅｔ６はそれらのＤエナンチ
オマーにより置き換えられている）、セルレチド（ＣＥＲ）(ceruletide)類縁化
合物Ｎｌｅ８−ＣＥＲ−（４−１０）、カルボベンゾキシ−Ｌ−チロシル（Ｏ−
スルフェート）−Ｌ−メチオニルグリシル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−メチオニ
ル−Ｌ−アスパルチル−ベータ−Ｌ−フェニルアラニンアミン（Ｚ−３２−ベー
タ−Ａｓｐ−ＣＣＫ−２７−３３）、

【００１８】［２８−スレオニン，３１−ノルロイシン］−および［２８−スレオニン，３１
−ロイシン］コレシストキニン−パンクレオザイミン−（２５−３３）−ノナペ
プチド、Ｚ−Ａｒｇ（Ｚ２）−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−Ｔｙｒ−（ＳＯ３Ｂａ１／
２）−Ｔｈｒ（Ｂｕｔ）−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−Ｐｈ
ｅ−ＮＨ₂およびＺ−Ａｒｇ（Ｚ２）−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−Ｔｙｒ（ＳＯ３−
Ｂａ１／２）−Ｔｈｒ（Ｂｕｔ）−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ
）−Ｐｈｅ−ＮＨ₂、Ｓｅｒ（ＳＯ３Ｈ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−
Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂

【００１９】（J.Biol.Chem.,1998,May22;273(21):12988-93;Pancreas,1997,Aug15(2):160-7;
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【００２３】ＣＣＫ−８活性を示すその他の物質もまた使用することができ、例えばＣＣＫ
−８の天然産出または人工的に変性された化合物、類縁化合物および誘導体を使
用することができる。このような物質は、ＣＣＫ−８中の少なくとも１個のアミ
ノ酸の付加、挿入、欠失または置換によって得ることができる。ＣＣＫ−８活性
を示す物質はまた、先駆体、代謝誘導体（例えば、代謝分解生成物）、アゴニス
ト、または同一性質を現わす前記物質の類縁体であると理解される。代謝誘導体
または代謝分解生成物はＣＣＫ−８様ペプチド、例えばその１個または２個以上
のアミノ酸が分子の一端または両端から削除されているＣＣＫ−８などの８個の
アミノ酸を有するペプチドであることができる。これらの変種は免疫学的方法、
例えばＲＩＡ（放射線免疫アッセイ法）、ＩＲＭＡ（放射測定法）、ＲＩＳＴ（
放射線免疫吸着試験法）、ＲＡＳＴ（ラジオアレルゴ吸着試験法）によるＣＣＫ
−８Ｋ類縁化合物であるものと確認することができる。

【００２４】コンピューターシュミレーションを用いることによってＣＣＫ−８活性を示す
新規化合物を創造することもできる。コンピューターシュミレーション方法は、
当業者に知られており、例えばEP 0660210 A2 に記載されている。前記物質は、慣用の技術を用いて製造することができ、例えばアミノ酸構築ブ
ロックから直接に合成することができ、または生物学的組織および細胞系からの
直接抽出および精製により得ることができ、または組み換えＤＮＡ技法などのバ
イオテクノロジイを用いることによって得ることができ、またはこのような物質
の製造業者または販売業者から常習的手段で購入することができる。ＣＣＫ−８を用いると好ましく、この場合、Ｄ−体およびＬ−体の両方のＣＣ
Ｋ−８を本発明で用いることができる。

【００２５】末梢神経系障害（neuropathies in the peripheral nervous system）の
用語は、末梢運動および感覚ニューロンの構造および機能における障害に付随す
るものを包含する種々の状態を意味する。末梢神経障害には、完全ニューロンま
たはその一部が包含される。末梢神経障害と見做すことができ、本発明に従い処
置することができる状態、症状、損傷および疾病の例には、例えば真性糖尿病患
者が付随する一群の神経障害から選ばれるもの；アルコール誘発神経障害；癌の
処置、例えば細胞性塞栓または放射線治療に付随する神経障害；聴覚損傷、例え
ば難聴、耳鳴り；視覚障害、例えば網膜損傷、角膜損傷；損傷した傷の治癒；手
術により誘発された損傷；外傷の結果としての損傷；神経毒性化合物、例えば抗
新生物医薬にさらされた後の副作用としての損傷；先天性および自己免疫性神経
障害；またはその他の主要疾病に関連する症候群がある。末梢神経障害（ＰＮ）
は、臨床処置における主要問題であり、痛みを伴うことがある。

【００２６】末梢神経系は、感覚(sensory) ［求心神経(afferent)］および運動(motor) ［
遠心神経(efferent)部分を包含する。感覚部分は、体幹および内蔵感覚神経を包
含する。運動部分は、自動神経系（不随意）および体幹神経系（随意）を包含す
る。本発明は、全末梢神経系における神経障害の処置に用いることができる。本発明のもう一つの目的は、末梢神経系における神経障害を処置するための医
薬組成物にあり、この医薬組成物は有効濃度の少なくとも１種のＣＣＫ−８活性
を示す物質を、少なくとも１種の医薬上で許容される担体または賦形剤と一緒に
混合されて、または別段の様相で含有する。ＣＣＫ−８活性を示す物質の例は、
ＣＣＫ−８およびその他の前記物質である。ＣＣＫ−８を用いると好ましい。

【００２７】医薬組成物は、調剤技術の当業者に公知の方法で製造する。担体または賦形剤
は、活性成分のベヒクルまたは媒体としての役目を果たすことができる固体、半
固体または液体であることができる。適当な担体や賦形剤は当業者に公知である
。この医薬組成物は、経口または非経口使用に適応させることができ、また錠剤
、カプセル剤、座薬、溶液、懸濁液等として投与することができる。医薬組成物は、例えば不活性稀釈剤または可食性担体を用いて経口投与するこ
とができる。これらはゼラチンカプセル内に封入することができ、または錠剤に
圧縮することができる。経口治療投与の場合、本発明による化合物は賦形剤に配
合することができ、錠剤、トローチ、カプセル、エレキシル、懸濁液、シロップ
、ウエフアー、チュウインガム等として用いることができる。これらの製剤は、
活性成分として、少なくとも４重量％の本発明による化合物を含有していなけれ
ばならないが、特定の剤型に従い変えることができ、また適当に４〜７０重量％
単位であることができる。組成物中に含有させる活性成分の量は、投与に適する
単位剤型が得られるような量にする。

【００２８】錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等はまた、少なくとも１種の下記助剤を含有
することができる：微結晶セルロース、トラガカントガムまたはゼラチンなどの
結合剤；デンプンまたは乳糖などの賦形剤；アルギン酸、プリモゲル(Primogel)
、コーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロテック
ス(Sterotex)などの潤滑剤；コロイド状二酸化シリカなどの滑剤；およびショ糖
またはサッカリンなどの甘味料を添加することができ、またはペパーミント、メ
チルサリシレートまたはオレンジフレーバーなどで風味付けすることができる。
単位剤型がカプセルである場合、上記種類に加えて、ポリエチレングリコールま
たは脂肪油などの液状担体を含有することができる。別の単位剤型は、単位剤型
の物理的形態（例えば、被覆）を変える別種の種々の材料を含有することができ
る。従って、錠剤または丸剤は、糖、シェラックまたはその他の腸溶被覆剤で被
覆することができる。シロップは、活性成分に加えて、甘味料としてショ糖およ
び何らかの保存剤、染料および風味付与剤を含有することができる。これらの種
々の組成物の製造に用いられる材料は、医薬的に純粋であり、また使用量で無毒
性でなければならない。

【００２９】非経口投与の場合、本発明による化合物は、溶液または懸濁液中に配合するこ
とができる。非経口投与の用語は、消化管を通のではなく、むしろいくつかの別
の経路を通る注入により、皮下、筋肉内、眼窩内、嚢内、脊椎内、胸骨内、血管
内、鼻内、肺内を通る注入により；尿管を通し、ウシの乳汁分泌管を通し、骨髄
などの器官中に等に投与されることを表わす。骨髄はまた、インビトロ処置する
ことができる。これらの製剤は、少なくとも０．１重量％の本発明による活性化
合物を含有することができるが、約０．１〜５０重量％で変えることもできる。
このような組成物に含有させる活性成分の量は、適当な用量が得られるほどの量
である。

【００３０】溶液または懸濁液はまた、少なくとも１種の次の助剤を含有することができる
：注射用水、食塩水、硬化油、ポリエチレングリコール、グリセロール、プロピ
レングリコールまたはその他の合成溶剤などの無菌稀釈剤；ベンジルアルコール
またはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または重硫酸ナトリウムな
どの酸化防止剤；エチレンジアミンテトラ酢酸などのキレート化剤；酢酸塩、ク
エン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロ
ースなどの毒性調節剤。非経口製剤は、ガラスまたはプラスティック製のアンプ
ル、使い捨て注射器または多回用量容器に封入することができる。

【００３１】局所投与の場合、本発明による化合物は、溶液、懸濁液または軟膏中に配合す
ることができる。これらの製剤は、少なくとも０．１重量％の本発明による活性
化合物を含有することができるが、約０．１〜５０重量％で変えることもできる
。このような組成物に含有させる活性成分の量は、適当な用量が得られるほどの
量である。投与は、触れる動作、加圧、マッサージまたは熱の適用により、温め
ることにより、または皮膚上に赤外光線を照射することにより促進させることが
でき、これにより皮膚浸透性が強化される。Hirvonen,J.,Kalia,YN. およびGuy,
RH. によるイオン導入法によるペプチドの経皮放出(Transdermal delivery of p
eptide by iontophoresis)、Nat.Biotechnol.,1996,Dec;14（13):1710-1713 は
、適用電場の駆動力を用いる皮膚を経過する医薬の輸送をどのようにして強化さ
せるのかを開示している。イオントフォレーゼは僅かに塩基性ｐＨで行うと好ま
しい。

【００３２】その他の投与形態には、当業者に公知の手段によって行うことができる肺を通
す吸入、口を通す口腔投与および小腸を経る腸投与がある。一例として、このような組成物を使用して、末梢神経系における神経障害を処
置することができる。本発明のもう一つの目的は、末梢神経系における神経障害の処置を要する対象
の処置方法にあり、この方法は、上記対象に対する医薬用量のＣＣＫ−８活性を
示す物質の投与を包含する。対象の用語は、ヒトを包含する全部の哺乳動物を意味する。ヒト対象が好適で
ある。医薬の用語は、ヒトまたは動物医療に使用される医薬を意味する。

【００３３】ＣＣＫ−８は、ＣＮＳおよびＰＮＳに広く分布する腸神経ペプチド(gut neuro
peptid) である。本発明者等は、最近になって、この神経ペプチドを生理学的循
環ＣＣＫレベル(Linden A.等、1989) に近い量で腹腔内投与すると、正常マウス
の脳ＮＧＦレベルおよび前脳コリン作用性ニューロンにおけるコリン−アセチル
トランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）活性(Tirassa等、1998、Tirassa 等、1999) の
増加が刺激され、また脳弓采−離断マウス(Tirassa等、1999) におけるコリン作
用性欠乏に対向することができることを証明した。この研究において、神経毒性
化合物の投与によって生じた末梢神経障害および交換神経切除の修復に使用した
場合、本発明者等はＣＣＫ−８がＣＡＰおよび６−ＯＨＤＡ処置による機能上お
よび生物化学上の損傷を回復させることを証明した。これらの結果は、ＣＣＫ−
８がＰＮＳの損傷した神経細胞の回復に関与することができることを示唆してい
る。

【００３４】結論として、感覚ＰＮの動物モデルを使用する本研究は、末梢神経ペプチドが
ＮＧＦの合成および発現に、ならびに末梢組織における感覚および交感神経神経
ペプチドレベルに影響を与えることができることを初めて証明したものである。
これらの発見を一緒に考慮すると、低用量のＣＣＫ−８のｉ．ｐ．注射は、外科
的および化学的に誘発された、または上記の別の主要疾病または症状に関連する
ＰＮにおける正常ＰＮＳ機能の回復を促進するための強力で有用な別種の戦略を
示すことが示唆している。ここで、本発明を下記例により説明する。この例は、説明の目的のものであっ
て、いかなる点でも、本発明を制限しようとするものではない。

【００３５】例１動物 C.River,Calco,Italy から購入したＣＤ−１株の成熟した３か月齢雄のマウス
を、４〜５匹／カゴで１２−１２時間明暗サイクル下に水および食物を自由に与
えて収容した。動物のケアいおよび飼育は、国内法および国際法に従い学内委員
会および学会の指針に一致させて行った(EEC council derective 86/609,OJ L35
8,I,Decmber 12,1987)。

【００３６】カプサイシンおよびＣＣＫによる処置感覚神経障害を誘発させるために、連続２日間、温和な麻酔下に、成熟マウス
（ｎ＝４８）にカプサイシン５０mg/kg を皮下注射するか、または対照として未
処理のまま放置した。成熟マウスに全身的に投与されると、カプサイシンは全身
性脱感作および感覚神経の喪失をもたらす(Holzer,P.,1991)。５日後、これらの
マウスを４群にわけ、次のとおりにＣＣＫ−８を用いて、または用いることなく
処置した：(i) ＣＡＰ（カプサイシン）−処置し、ＣＣＫを注射した（ｎ＝１２
）；(ii)ＣＡＰ−処置し、ベヒクルを注射した（ｎ＝１２）；(iii) 未処置であ
り、ＣＣＫを注射した（ｎ＝１２）；(iv)未処置であり、ベヒクルを注射した（
ｎ＝１２）。ＣＣＫ−８（８nmol/kg)またはベヒクル（食塩水）は、最後のＣＡ
Ｐ処置後の１０日目に開始して、連続１０日間にわたり皮下注射し、次いでマウ
スを犠牲にし、次いで末梢組織を切除し、直に凍結させ、次いでＮＧＦまたは神
経ペプチド測定用に使用した。

【００３７】挙動試験感覚脱神経化の効果を評価するために、ホットプレート応答を用いた。痛み反
応性を、ホットプレート装置(Socrel Hot-plate mode DS37、Ugo Basile,Italy)
を使用して測定した。温度は、５０±０．３℃に設定し、カットオフ時間は６
０秒であった。痛み反応性は、侵害受容性熱感受の最初の出来事までの感覚潜伏
期間により測定した（跳躍、前肢および後肢をなめる行為）。潜伏期間は、デジ
タルストップウォッチを用いて測定した。マウスの全群を、神経毒性化合物の２
回目の注射後の２日目に開始し、最後のＣＣＫ注射が行われるまで２日毎に試験
した。

【００３８】６−ＯＨＤＡおよびＣＣＫによる処置交感神経神経障害を誘発させるために、マウスに、医薬の酸化を遅延させるた
めのアスコルビン酸０．５mg/kg とともに生理学的食塩水中に溶解した（０．
８５％ＮａＣｌ）６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）１００mg/kg を注
射した。対照マウスには、このビヒクル溶液のみの注射を与えた。動物（ｎ＝
４８）を、連続２日間にわたり処置し、５日後に、下記群に分けた：(i) ６−Ｏ
ＨＤＡ処置し、ＣＣＫを２回、注射した（ｎ＝１２）；(ii)ベヒクルとともに６
−ＯＨＤＡを注射した（ｎ＝１２）；(iii) 未処置であり、次いでＣＣＫを注射
した（ｎ＝１２）；(iv)未処置であり、次いでベヒクルを注射した（ｎ＝１２）
。ＣＣＫ−８（８nmol/kg)またはベヒクル（食塩水）は、最後の６−ＯＨＤＡ処
置後の１０日目に開始し、連続１０日間、皮下注射し、次いでマウスを犠牲にし
、末梢組織を分離し、直に凍結させ、次いでＮＧＦまたは神経ペプチド測定に使
用した。

【００３９】交感神経神経支配の評価６−ＯＨＤＡ処置マウスおよび対照マウスを、ネムブタル(nembutal)麻酔下に
犠牲にし、次いで分離した虹彩を全体として標本に調製し、次いで処理して、ノ
ルアドレナリン作用性神経支配の速度を評価し、また軸索の数および密度を、グ
リオキシル酸誘発蛍光（ＧＡＩＦ）を用いて外形測定法により測定した(Hokfelt
等、1972) 。調製物を、それぞれ４７０mmおよび５００mmの透過遮断下に、励起
およびバリア発光フィルターを備えた蛍光顕微鏡で検査した。交感神経神経支配
を定量的に評価する場合、各実験群（ｎ＝８虹彩／群）のＧＡＩＦ処置虹彩の３
つの相違する領域におけるノルアドレナリン作用性軸索の数を、見知らぬ観察者
により計数し、処置ラットと未処置ラットとの間の差異を統計学的に評価した。

【００４０】ＮＧＦ測定全部のマウスを次いで、ネムブタルの過剰投与により犠牲にし、次いで末梢組
織を採取し、末梢神経支配、神経ペプチド含有量およびＮＧＦレベルの評価に使
用した。ＮＧＦレベルは、高度に敏感な２部位免疫酵素アッセイ法(two-site immunoen
zymatic assay)(WeskampおよびOtten,1987) により測定した。この方法はヒトお
よびマウス類ＮＧＦを認識し、脳由来神経栄養因子(brain derived neurotrophi
c factor) と交差反応しない(Bracci-Laudiero等、1992) 。簡単に説明すると、
ポリスチレン製９６−ウェル免疫プレート(Nunc)を、アフィニティ精製したポリ
クローナルヤギ抗−ＮＧＦ抗体により被覆した。この抗体は０．０５Ｍ炭酸塩緩
衝液（ｐＨ９．６）中で稀釈した脳由来神経栄養因子と交差反応しない。平行ウ
ェルは、精製したヤギＩｇＧ(Zymed,San Francisco,CA,USA)で被覆し、非特異的
信号を評価した。室温で一夜にわたり、次いで遮断緩衝液（０．０５Ｍ炭酸塩緩
衝液（ｐＨ９．５）、１％ＢＳＡ）を用いて２時間にわたりインキュベートした
後、プレートをトリス(Tris)−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）５０ｍＭ、ＮａＣｌ２００
ｍＭ、０．５％ゼラチン、０．１％トリトン(Triton)X-100 で３回、洗浄した。
プレートの多回洗浄後、試料およびＮＧＦ標準溶液を、試料緩衝液（０．１％ト
リトン(Triton)X-100 、１００ｍＭトリス(Tris)−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、４０
０ｍＭＮａＣｌ、４ｍＭＥＤＴＡ、０．２ｍＭＰＭＳＦ、０．２ｍＭベン
ズエトニウムクロライド、２ｍＭベンズアミジン、４０Ｕ／ｍｌアプロチニン、
０．０５％ナトリウムアジド、２％ＢＳＡおよび０．５％ゼラチン）により稀
釈し、ウェルに分配し、次いで室温で一夜にわたり放置した。

【００４１】これらのプレートを次いで、３回、洗浄し、次いで４ｍＵ／ウェルの抗−β−
ＮＧＦ−ガラクトシダーゼ(Boehringer Mannheim,Germany) とともに３７℃で２
時間にわたりインキュベートし、さらに洗浄した後、各ウェルに基質溶液１００
μｌ［クロロフェノールレッド４mg/kg(Boehringer Mannheim,Germany)、基質緩
衝液：１００ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＭｇＣｌ₂、
０．１％ナトリウムアジドおよび１％ＢＳＡ］を添加した。３７℃における２時
間のインキュベート後、その光学濃度をＥＬＩＳＡ読取装置(Dynatech)を用いて
５７５nmで測定し、次いで標準および試料の数値を、非特異的結合を考慮して補
正した。アッセイ操作中のＮＧＦ回収は、既知量の高度に精製したＮＧＦを内部
対照として試料にまたは均質化緩衝液に添加することによって評価した。外因性
ＮＧＦの収量は、内因ＮＧＦ＋外因ＮＧＦ値から内因ＮＧＦの量を控除すること
によって計算した。これらの条件下に、ＮＧＦ回収は９０％を越えた。データは
pg/g含水組織として表わし、全部のアッセイを３回づつ行った。

【００４２】神経ペプチド分析高特異性競合放射線免疫アッセイ法（ＲＩＡ）を使用した（検出限界１．５fm
ol＝２pg/ インキュベート；検出可能濃度１５fmol/l＝２０pg/ml ）。簡単に説
明すると、組織試料を凍結状態で小片に切り取り、１mol/l 酢酸中で１０分間、
沸騰させ、次いで均質化した。１００００g で１０分間にわたり遠心処理した後
、この上清を凍結乾燥させ、分析に先立ち、−２０℃で保存した。物質Ｐ−様免
疫反応（ＳＰ−ＬＩ）の組織濃度は、放射性リガンドとして¹²⁵Ｉ−［Ｔｙｒ⁸ ］−ＳＰを使用し、また標準として合成ＳＰを使用して、Ｃ−末端指向抗血清Ｓ
Ｐ２（Brodin等、1986) を用いて分析した。カルシトニン遺伝子関連ペプチド様
免疫反応（ＣＧＲＰ−ＬＩ）の組織濃度は、放射性リガンドとしての¹²⁵Ｉ−ヒ
スチジル−ラットＣＧＲＰおよび標準としてのラットＣＧＲＰと共役結合したラ
ットＣＧＲＰに対してウサギで産生された抗血清ＣＧＲＰ−８を用いて分析した
。神経ペプチドＹ−様免疫反応（ＮＰＹ−ＬＩ）の組織濃度は、トリ類膵臓ポリ
ペプチドと０．１％交差反応するが、他のペプチドとは交差反応しない抗血清Ｎ
１を用いて分析した。このアッセイ法の検出限界は、１１pmol/lであった。

【００４３】ＮＧＦｍＲＮＡのその場でのハイブリド形成後肢皮膚からの１４ミクロン切片を、低温槽により切り取り、ポリ−Ｌ−リジ
ン被覆スライド上に置いた。これらのスライスを０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．４
）中の４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いで０．１ＭＰＢＳ中で反復洗
浄し、次いで７０％、８０％、９５％エチルアルコールにより脱水させた。アセ
チル化後［０．１ＭＴＥＡ（ｐＨ８．０）中２５％無水酢酸］、これらのスラ
イスを、３０ng/ml の最終濃度のハイブリド形成緩衝液［５０％ホルムアミド、
２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、２５０mg/ml 変性剪断サーモン試験したＤＮＡ(d
enatured sheared salmon tested DNA) ］で、ジゴキシゲニン標識したＮＧＦプ
ローブ（配列５ＴＣＣＴＧＴＴＧＡＧＡＧＴＧＧＴＧＣＣＧＧＧＧＣＡＴＣＧＡ
３´に対して相補性）を含有するハイブリド形成混合物中において４２℃で１６
時間、インキュベートした。洗浄後、これらのスライスを１．５U/mlヒツジ抗−
ジゴキシゲニンＰＯＤ共役結合した抗体（ポリクローナルＦａｂフラグメント；
Boheringer Mannheim ）とともに、室温で２時間にわたりインキュベートした。
免疫ペルオキシダーゼ反応は、標準ＤＡＢ法（０．６mg/ml ＤＡＢおよび０．０
１５％Ｈ₂Ｏ）を用いて検出した。

【００４４】ＲＩ−ＰＣＲ総ＲＮＡは、ＴＲＩＺＯＬキット(Gibco) を用い、製造業者の指示に従い抽出
した。組織をＴＲＩＺＯＬ試薬中で均質化し、４℃で１５分間インキュベートし
、次いで遠心処理した（１００００g 、４℃、１５分間）。各ＴＲＩＺＯＬ試薬
０．７５ｍｌについてクロロホルム０．２mlを、上清に添加し、４℃で１５分間
のインキュベート後、４℃において試料を回転させ、相分離した。ＲＮＡは３Ｍ
酢酸ナトリウム０．１容量および等容量のイソプロパノールの添加により上部水
性相から沈殿させた。−２０℃で６０分間のインキュベーション後、沈殿物を遠
心処理によりペレット化し、７５％エタノールで１回、洗浄し、次いで５０mlＲ
Ｎａｓｉｎを含有していない水中に再溶解した。ＲＮＡ１mgを含有する量（最大
１０ml）のＲＮＡ溶液を、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５プライマー２５０ng、ＭＬＶ
−ＲＴ２００単位(Promega) およびＲＮａｓｅリボヌクレアーゼインヒビター０
．５Ｕ(Promega) を使用し、総反応容積２０mlで逆転写システム(Promega) によ
り一本鎖ｃＤＮＡに逆転写した。

【００４５】４２℃で６０分間のインキュベーション後、水５０mlの添加により反応を停止
させた。試料サイズ、各ＲＮＡ試料の完全性および逆転写の変化における相対的
差異を補償するために、グリセロアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ（ＧＡＰＤＨ）を、ネズミ類ＮＧＦで共−増幅した。ＰＣＲ反応は、３０サイ
クル（９５℃で６０秒間、５５℃で６０秒間および７２℃で１２０秒間）のＧｅ
ｎｅＡｍｐＰＣＲシステム９６００熱循環器(thermal cycler)(Perkin Elmer)で
、試料ｃＤＮＡ５ml、１０ＸＴａｑポリメラーゼ緩衝液５ml(Promega) 、２．５
mM ＭｇＣｌ₂、各ｄＮＴＰ０．２mM(Promega) 、５pmol−各プライマー

【化１】および２ＵＴａｑポリメラーゼ(Promega) を含有する混合物５０mlで行った。

【００４６】このＰＣＲ生成物は、ＮＧＦについて３４３塩基長さのフラグメントであり、
またＧＡＰＤＨについて１９０塩基長さのフラグメントであった。ＰＣＲ後、未
稀釈反応生成物を、エチジウムブロマイド１mg/ml を含有する２％アガロースＭ
Ｐ(Boheringer Mannheim) ゲル上に加えた。このゲルを１V/cmで１５分間、次い
で５V/cmで３時間、経過させた。ＤＮＡ含有バンドを、紫外線（ＵＶ）透過装置
を用いて写真にとった（図４−Ｃ）。全部のＰＣＲ生成物の同一性は、アガロー
スゲル上で既知長さのＤＮＡ配列に基づく正確なサイズと比較することによって
、またサザンブロッティング(Southern blotting) により確認した（データは示
されていない）。バンド濃度測定による評価（中間レベルの任意単位で表わされ
る）は、自動式像分析装置(Vidas System;Kontron Electronics)により行った。
この装置は、中間調閾値操作(gray scale thresholding operation) を用いるエ
チジウムブロマイド染色バンドの光学濃度を測定する装置である。ＧＡＰＤＨバ
ンドの光学濃度を標準化因子として用いた。図４−Ｄに示されているデータは、
５回の相違するＲＴ−ＰＣＲから得られたＮＧＦ標準化濃度測定値の平均値±Ｓ
Ｅを表わす。

【００４７】統計学的分析変更因子として食塩水、ＣＡＰ、ＣＣＫおよびＣＡＰ＋ＣＣＫによる処理を考
慮して、マッキントッシュ(Macintosh) 用スーパー(Super)ANOVAパッケージ(Aba
cus Concepts Inc.,Berkeley,CA,USA)を用いる変更因子分析を用いることによっ
てデータを得た。ホットプレート応答の場合、ＣＡＰおよび／またはＣＣＫの効
果は、反復測定（１０回の試験）および処理（４種のレベル：ベヒクル、ＣＡＰ
、ＣＣＫおよびＣＡＰ＋ＣＣＫ）を考慮して分析した。各群間の差異は、Tukey-
Kramer比較によって決定した；ｐ＜０．０５は統計学的に有意であると考えた。

【００４８】結果ホットプレート応答感覚神経支配の喪失を評価するために、マウスをホットプレート応答について
試験した。図１に示されているように、ＣＡＰで処置されたマウスは、対照マウ
スに比較して、末梢有害刺激に対して遅延した応答を示す。ＣＡＰはホットプレ
ート応答における潜伏期間を強化し、この変更された応答は、処置後の少なくと
も１か月間持続する。このことは、足における感覚末梢神経支配の欠落を示唆す
る。ＣＡＰ処置マウスにおけるＣＣＫ−８の皮下投与は、感覚機能の漸進的回復
を生じさせ、これはＣＣＫ−８処置の１０日後に回復されるものと見做される
（図１参照）。ビヒクルマウスとベヒクル＋ＣＣＫマウスとの間の潜伏期間の差
異は見出されず、従って我々の実験条件において、ＣＣＫが反映する痛覚過敏作
用はない。さらにまた、我々の実験条件において、ＣＣＫ−８投与は体重の損失
を生じさせない（データは示されていない）。

【００４９】６−ＯＨＤＡ／ＣＣＫ処置マウスにおける虹彩交感神経神経支配の評価ＧＡＩＦ処置虹彩に対して行われた形態学的観察は、６−ＯＨＤＡが末梢交感
神経神経末端の大量の変質を生じさせることを示した。図２に示されているよう
に、対照マウスの虹彩（２Ａ）は、交感神経系カテコールアミン組織蛍光繊維の
濃密なネットワークを示すのに対して、６−ＯＨＤＡ処置マウスの虹彩は、これ
らの繊維を完全に喪失していた（２Ｂ）。ＣＣＫ処置後、交感神経切除したマウ
スの虹彩における末梢神経支配（２Ｃ）は、食塩水で処置した交感神経切除した
マウスの虹彩に比較して、有意に増大する。虹彩神経支配に対する交感神経切除
およびＣＣＫ処置の効果は、各実験群のＧＡＩＦ処置した虹彩におけるノルアド
レナリン作用性軸索の数の定量的評価によって確認された。

【００５０】ＮＧＦの発現ＣＣＫ処置が、カプサイシンのチャレンジ後、末梢組織におけるＮＧＦ発現を
誘発させることができるかを評価するために、足皮膚のＮＧＦレベルをＥＬＩＳ
Ａによって測定した。図３に示されているように、足皮膚のＮＧＦレベルはＣＡ
Ｐ処置後に増加する。ＣＡＰ処置と同様に、ＣＣＫ−８処置は神経栄養物質レベ
ルを増加させる。ＮＧＦタンパク質発現の高値調整はまた、ＣＡＰチャレンジし
たマウスに対して行われた場合、ＣＣＫ−８処置によって強化される。

【００５１】ＮＧＦの高値調整に含まれる細胞を同定し、またＣＣＫがまたＮＧＦｍＲＮＡ
合成に影響を及ぼすかについて評価するために、我々は、その場でのハイブリッ
ド形成およびＲＴ−ＰＣＲを用いることによって、足皮膚におけるＮＧＦｍＲＮ
Ａ発現を分析した。図４Ｂに示されているように、基底上皮層に局在化している
細胞がＮＧＦｍＲＮＡを発現する。カプサイシンによる処置後に見出されたＮＧ
ＦｍＲＮＡの減少した発現（Ｃ）は、ＣＣＫ−８による処置によって完全に逆転
された（Ｄ）。ＲＴ−ＰＣＲにより行われた定量的評価は、ＮＧＦｍＲＮＡがＣ
ＡＰ処置マウスの足皮膚では減少すること、およびＣＣＫによる処置がＣＡＰ処
置マウスにおけるＮＧＦ遺伝子転写の高値調整を促進することを証明する。

【００５２】交感神経切除およびＣＣＫ−８処置がＮＧＦ発現に対して影響を及ぼすかにつ
いて評価するために、ＮＧＦレベルを、連続１０日間にわたり食塩水またはＣＣ
Ｋ−８注射を受けた６−ＯＨＤＡ処置マウスの眼で測定した。図５に示されてい
るように、この眼におけるＮＧＦレベルは６−ＯＨＤＡ群およびＣＣＫ−８群で
増加する。このＮＧＦタンパク質発現の高値調整はまた、ＣＡＰチャレンジした
マウスに対して行われた場合、ＣＣＫ−８処置によって強化される。

【００５３】神経ペプチドレベル末梢組織における神経ペプチド発現がＣＡＰおよび６−ＯＨＤＡによるチャレ
ンジによって影響されること、またＮＧＦがこの神経ペプチドの減少を逆転させ
ることは証明されている(Donnerer J.,1996,Neurosci.Lett.,221:33-36;Donnere
r J.等、1996,Brain Res.,741:103-108)。ＣＣＫ−８が末梢組織におけるＮＧＦ
発現を増加させることができることを我々の結果が証明したことから、我々はＣ
ＡＰ処置マウスの足皮膚において、また６−ＯＨＤＡ処置マウスの種々の組織
（心臓、腸、脾臓および眼）において、神経ペプチドレベルにも影響することが
できるかについて試験した。図６に報告されているように、我々のデータは、３
０日後、ＣＡＰ群およびＣＣＫ群において感覚神経ペプチドＳＰおよびＣＧＲＰ
の量は対照値とは相違しないのに対して、ＣＡＰ＋ＣＣＫ群では増加することを
示す。このことは、感覚神経支配がＣＡＰ感覚損傷マウスにおいてＣＣＫにより
促進されること、およびこの相互関係が感覚機能の回復およびＮＧＦ遺伝子転写
の増加とに相関関係を有することを示唆している。図７に報告されているように
、６−ＯＨＤＡ処置は眼、心臓および脾臓におけるＮＰＹ濃度を減少させるのに
対して、腸における変化は見出されなかった。対照マウスにおける１０日間の毎
日のＣＣＫ−８注射は、末梢組織のＮＰＹレベルに特異的に影響を与え、腸およ
び眼では増加を誘発するが、心臓および脾臓では誘発しない。ＣＣＫ−８処置を
交感神経切除マウスに対して行った場合、心臓および眼におけるＮＰＹの６−Ｏ
ＨＤＡ誘発欠損を回復させることができる。

【００５４】検討成熟マウスに注入されたＣＡＰが末梢感覚神経支配を喪失させることを示す従
来の発見(Holzer P.,1991)に一致して、ホットプレート試験により見ることがで
きるように、本発明者の研究結果は、この処置が感覚応答の損傷を減少させるこ
とを証明した。本発明者による結果は、１０日間の低用量のＣＣＫ−８の投与が
ＣＡＰ処置マウスにおける感覚機能の回復を促進することができることを示した
。しかしながら、６−ＯＨＤＡの投与は、ノルアドレナリン作用性交感神経系の
後−終神経節(post-ganglionic terminals) を損傷することが証明されている(H
oeldtke R.等、1974) 。本発明者等のデータは、ＣＣＫ−８の投与が虹彩におけ
る６−ＯＨＤＡ−損傷した交感神経神経支配を回復させることができることを証
明している。ＣＣＫ−８は挙動上の機能に影響を与えることは知られているが(W
oodruff GN. 等、1991) 、ＣＣＫ−８を生理学的用量で受容したマウスでは、過
剰敏感性および体重の減少は見出されなかった。従って、本発明者等のデータは
ＣＣＫ−８投与の効果が大きい用量依存性を有し、また例えばＣＣＫ−８が長期
間にわたり投与された場合に食物摂取の不変化が見られるように、対象に対する
寛容性を有することを示している従来の研究(Crawley NJ.等、1983) と一致する
。本研究は、ＣＣＫ−８による処置が末梢組織におけるＮＧＦ発現の誘発および
化学的に損傷した感覚および交感神経神経支配の回復を生じさせることを証明し
ている。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１：カプサイシン(Capsaicin) （ＣＡＰ）で３日間処置した成熟マウスのホ
ットプレート応答。ＣＡＰ処置マウス群および対照マウス群を、カプサイシンの
最後の注入後の１０日目から開始して、１０日間にわたりＣＣＫ−８で処置した
。ＣＡＰ処置マウスにおける有害刺激に対する応答の潜伏期間は、全観察期間に
わたり対照よりも長いままであったが、ＡＮＯＶＡにより明らかにされているよ
うに、ＣＣＫ−８による処置はＣＡＰ処置マウスにおける応答−潜伏期間の減少
を生じさせ、処置の８〜１０日後に底値に達した。垂直線はＡＮＯＶＡにおける
相当する誤差平均二乗値(error mean square) から誘導される集合ＳＥＭを示す
。^*ｐ＜０．０５。

【図２】図２：正常マウス（Ａ）、１０日間にわたり食塩水が与えられた（Ｂ）または
ＣＣＫ−８が与えられた（Ｃ）６−ＯＨＤＡ処置マウスの虹彩の交感神経繊維。
交感神経神経支配は、グリオキシル酸−誘発蛍光（ＧＡＩＦ）により可視化され
る。交感神経神経支配の格別の減少が、６−ＯＨＤＡ処置後に見出されたが、パ
ネルＤに示されているように、ＣＣＫ−８処置後に部分的回復が見出された。

【図３】図３：後肢皮膚におけるＮＧＦレベルに対するカプサイシンおよびＣＣＫ−８
の効果。Ａ：含水重量のｐｇ／ｇｒとして表わされるＮＧＦは、ＣＡＰ処置後に
直に増加し、神経毒性化合物の注入から４日間にわたりより高いレベルに達する
。次いで、ＣＡＰ処置の終了時点後の１０日目および２０日目に測定して、神経
栄養物質量は対照よりも低いレベルにゆっくりと減少する。Ｂ：生理学的量のＣ
ＣＫ−８による１０日間の処置により、正常マウスにおけるＮＧＦレベルは増加
し、ＣＡＰ損傷マウスにおける神経栄養物質発現をさらに増強することができる
。

【図４】図４：成熟マウスの後肢皮膚におけるＮＧＦｍＲＮＡ発現に対するカプサイシ
ンおよびＣＡＰ＋ＣＣＫ処置の効果。その場でのハイブリッド形成（Ａ−Ｄ）は
、ＮＧＦｍＲＮＡが通常、皮膚の基底表皮層（Ｂ）で発現することを示す。特異
的ＮＧＦｍＲＮＡが、ハイブリッド形成およびセンスＮＧＦプローブを用いるハ
イブリッド形成前に、Ｒｎａｓｅ−ＡによるｍＲＮＡの消化を包含する特異性試
験により確認された。これはハイブリッド形成信号の不存在に生じた（Ａ）。Ｃ
ＡＰによる処置後に見出されたＮＧＦｍＲＮＡの減少した発現（Ｃ）は、ＣＣＫ
−８による処置によって完全に逆転された（Ｄ）。この組織学的データは、ＲＴ
−ＰＣＲ後の濃度分析により行われたＮＧＦｍＲＮＡの定量的評価によって確認
された（Ｅ−Ｆ）。垂直線は、ＡＮＯＶＡにおける相当する誤差平均二乗値(err
or mean square) から誘導される集合ＳＥＭを示す。^*ｐ＜０．０５。

【図５】図５：食塩水またはＣＣＫ−８を１０日間にわたり与えられた正常マウスおよ
び６−ＯＨＤＡ処置マウスの眼におけるＮＧＦレベル。このＮＧＦレベルは６−
ＯＨＤＡ群およびＣＣＫ−８群の両方で増加する。６−ＯＨＤＡチャレンジした
マウスで行った場合、ＮＧＦの高値調整(upregulation)は、ＣＣＫ−８処置によ
ってさらに強化される。

【図６】図６：ＣＣＫ−８による処置前および処置後の成熟マウスの後肢におけるＳＰ
レベルおよびＣＧＲＰレベルに対するカプサイシンの効果。腸神経ペプチドは、
ＣＡＰ処置マウスの足皮膚においてのみ両方の感覚神経ペプチドのレベルを増加
する。垂直線は、ＡＮＯＶＡにおける相当する誤差平均二乗値(error mean squa
re) から誘導される集合ＳＥＭを示す。^*ｐ＜０．０５。

【図７】図７：成熟マウスの末梢組織中の神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）濃度に対する６−
ＯＨＤＡおよび／またはＣＣＫ−８の効果。６−ＯＨＤＡによる処置は、眼、心
臓および脾臓のＮＰＹ濃度を格別に減少させるのに対して、腸における変化は見
出されなかった。ＣＣＫ−８による処置は、正常マウスの眼および腸のＮＰＹ含
有量を増加させ、また心臓および眼における６−ＯＨＤＡ誘発ＮＰＹ減少を回復
させる。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年８月１３日（２００１．８．１３）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B063 QA01 QQ53 QQ79 QQ91 QR02 QR32 QR56 QR62 QS25 QS33 QS34 QS36 QX01 4C084 AA02 AA17 BA01 BA08 BA17 CA18 CA28 NA14 ZA20 ZA32 ZA94 ZB26 ZC35 ZC39

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】末梢神経系における神経障害処置用医薬の製造におけるＣＣ
Ｋ−８活性を示す物質の使用。
【請求項２】処置しようとする神経障害がアルコール誘発神経障害である
ことを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】処置しようとする神経障害が真性糖尿病患者に付随すること
を特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項４】処置しようとする神経障害が細胞性塞栓症などの癌の処置に
関連することを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項５】処置しようとする神経障害が聴覚障害および／または視覚障
害であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項６】処置しようとする神経障害が手術により誘発される損傷であ
ることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項７】処置しようとする神経障害がジストロフィーであることを特
徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項８】物質がＣＣＫ−８であることを特徴とする、請求項１〜７の
いずれかに記載の使用。
【請求項９】末梢神経系における神経障害を処置するための医薬組成物で
あって、少なくとも１種のＣＣＫ−８活性を示す物質、特にＣＣＫ−８を、少な
くとも１種の医薬上で許容される担体または賦形剤と一緒に混合物中に、または
別段の様相で含有することを特徴とする上記医薬組成物。
【請求項１０】末梢神経系における神経障害の処置を必要とする対象の処
置方法であって、医薬用量のＣＣＫ−８活性を示す物質を上記対象に投与するこ
とを包含する上記方法。