JP2003507131A - 非ヒト移植片の免疫原性の低下 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ブタの組織の分離およびそこからのマクロファージおよび／または小グリア細胞の除去により作成される移植材料に関する。この組織は、胚または胎児神経組織でもよく、除去は、上記調製物を、Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−Ｒエピトープに対する抗体と補体試薬に暴露することにより行われる。本発明はまた、神経組織を移植する時に有用な医薬調製物を調製するためのそのような移植材料の使用に関する。本発明はまた、組織分離のための１つ以上の酵素、抗体調製物、および補体試薬とを含むキットに関する。本発明はまた、ブタの胚または胎児神経組織からのマクロファージおよび／または小グリア細胞の除去方法に関する。最後に本発明は、そのような前処理したブタ神経移植片を用いる神経疾患の治療方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、ブタの組織の分離およびそこからのマクロファージおよび／または
小グリア細胞の除去により作成される移植材料に関する。この組織は、胚または
胎児神経組織でもよく、除去は、上記調製物を、ＧＡｌα１−３Ｇａｌβ１−Ｒ
エピトープに対する抗体と補体試薬に暴露することにより行われる。本発明はま
た、神経組織を移植する時に有用な医薬調製物を調製するためのそのような移植
材料の使用に関する。本発明はまた、組織分離のための１つ以上の酵素、抗体調
製物、および補体試薬とを含むキットに関する。本発明はまた、ブタの胚または
胎児神経組織からのマクロファージおよび／または小グリア細胞の除去方法に関
する。最後に本発明は、そのような前処理したブタ神経移植片を用いる神経疾患
の治療方法に関する。

【０００２】 （発明の背景） 神経移植は、パーキンソン病やハンティントン病の治療法の候補である（ペチ
ャンスキー（Peschanski）ら、１９９５；オラノウ（Olanow）ら、１９９７；ボ
ーロンガン（Borlongan）ら、１９９９；ヅネット（Dunnett）とビヨルクルンド
（Bjorklund）、１９９９）。ヒトのドナーの材料の供給は不足しているため（
ヅネット（Dunnett）とビヨルクルンド（Bjorklund）、１９９９）、動物起源の
組織が、適切な代替物と考えられており（イサクソン（Isacson）とブレーケフ
ィールド（Breakefield）、１９９７；エッジ（Edge）ら、１９９８）、遺伝的
修飾が可能であるという利点を有する（コッツィ（Cozzi）とホワイト（White）
、１９９５；ザワダ（Zawada）ら、１９９８）。免疫抑制ラットの線条に移植す
ると、ブタの胚からの腹側中脳組織は、解剖学的に正しい連結を増殖させ（イサ
クソン（Isacson）ら、１９９５）、誘導された行動欠陥を回復する（フファカ
ー（Huffaker）ら、１９８９；ガルペルン（Galpern）ら、１９９６）。これま
で小規模の安全性試験で１２人のパーキンソン病患者と１２人のハンティントン
病患者に、ブタの神経組織が投与されてきた（エッジ（Edge）ら、１９９８）。

【０００３】 しかしブタの神経移植片は、ヒトの脳で免疫関連の拒絶を受けやすい（ディー
コン（Deacon）ら、１９９７）。ネズミの神経移植片の拒絶は、ラット宿主を免
疫系のＴリンパ球に対する抗体で処理することにより防止することができる（オ
ークラ（Okura）ら、１９９７）。ヒトのＴ細胞のレパートリーは、ブタ細胞上
のブタの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）抗原により活性化される細胞（直
接認識）と、ヒトの抗原提示細胞によるプロセシングと提示を受けたブタのタン
パク質から得られるペプチドにより活性化される細胞（間接認識）とを含む（サ
タケ（Satake）ら、１９９４；ドーリング（Dorling）ら、１９９６）。直接認
識が起きるためには、ブタのドナー細胞は、クラスＩおよび／またはクラスIIＭ
ＨＣ抗原（それぞれ、ＣＤ８とＣＤ４ Ｔリンパ球により認識される）を発現す
る必要がある。マウス脳中のヒト神経組織の生存は、ＣＤ８ではなく宿主ＣＤ４
Ｔ細胞を枯渇させることにより延長することができ（ウッド（Wood）ら、１９９
６）、これは、ＣＤ４ Ｔ細胞が神経異種移植片の拒絶に必須であることを証明
しており、これはまた、非神経異種移植片の拒絶の場合も同様である（ピエソン
（Pierson）ら、１９８９；カウフマン（Kaufman）ら、１９９５；コルスグレン
（Korsgren）、１９９７）。インビトロでブタのＭＨＣクラスII抗原は、ブタの
ＭＨＣクラスＩ抗原より、ヒトＴ細胞中でより強い増殖応答を誘発し（カーク（
Kirk）ら、１９９３；クマガイ−ブリーシュ（Kumagai-Braesch）ら、１９９３
；ヤマダ（Yamada）ら、１９９５；ドーリング（Dorling）ら、１９９６）、Ｍ
ＨＣクラスII抗原を発現する細胞またはこれらの分子を発現する能力を有する細
胞は、いったん移植されると、ドナー組織の免疫原性に大きく寄与することを示
唆している。ＭＨＣクラスII抗原は、ニューロン中に存在することはまだ報告さ
れていない（ランプソン（Lampson）、１９９５）。

【０００４】 自己反応性を阻害する免疫抑制剤であるサイクロスポリンは、ラットで免疫攻
撃からブタの異種移植片を防御するのには不充分である（ウェンバーグ（Wennbe
rg）ら、１９９５）。ブタの神経移植片を有するラットをサイクロスポリンで連
続的に処理すると、移植後３〜４ヶ月の動物の７４％である程度の移植片生存が
得られた（パクザバン（Pakzaban）ら、１９９５）。ブタの神経移植片を有する
連続的サイクロスポリン治療を受けたパーキンソン病患者は、１．２×１０⁷ 個
の細胞が移植されたことを考慮すると、移植後７．５ヶ月に生存移植片はわずか
であり、剖検組織検査ではわずかに６３８個のドーパミン作用性の細胞しかなか
った（ディーコン（Deacon）ら、１９９７）。従って臨床の場では免疫抑制は、
より積極的でなければならず（これは、副作用の面でより重大な結果を招く（ボ
ーロンガン（Borlongan）ら、１９９６））、または移植前のドナーの組織免疫
原性の低下で補足する必要がある。

【０００５】 ＷＯ９６３７６０２Ａ１は、肝機能不全を特徴とする障害の患者を治療するた
めの肝細胞の使用に関する。特にいくつかの抗原（特にＭＨＣクラスＩ抗原）を
マスクすることにより、これらの肝細胞の免疫原性を小さくするための方法が開
示されている。Ｇａｌ（α１，３）Ｇａｌエピトープをα−ガラクトシダーゼで
除去する可能性も検討されるが、マクロファージおよび／または小グリア細胞上
のこのエピトープの発現のカプリングはなく、Ｇａｌ（α１，３）Ｇａｌエピト
ープを使用してこれらの細胞を除去する。神経細胞については、なにも言及され
ていない。

【０００６】 ＷＯ９６３６３５８Ａ１は、異種移植片移植受容者による抗体介在異種移植片
拒絶を阻害するための試薬と方法に関する。その目的は、ドナー臓器の内皮細胞
（すなわち、受容者の血液と最初に接触するドナー細胞）上の抗原をブロックす
ることである。この文献は、抗体介在免疫と、抗ドナー抗体を使用するその阻害
に関するのみであり、一方本発明は、神経細胞混合物から特異的な細胞集団を除
去して、受容者のＴ細胞を刺激することを少なくすることである。神経細胞につ
いてはなにも言及されておらず、ブロックするための可能な抗原としてＧａｌエ
ピトープのみが言及されている。ＷＯ９６３６３５８Ａ１は、非常に広範囲であ
り、すべての可能な異種移植片抗原の阻害に関する。本発明の方法と比較して最
も大きな差は、本発明は、Ｇａｌエピトープを介してマクロファージおよび／ま
たは小グリア細胞を枯渇させることに関し、そのエピトープをブロックすること
ではないことである。

【０００７】 コウルマンダ（Koulmanda, M）ら、Xenotransplantation 2(4), p 295-305 (1
995)は、移植後に膵臓組織から免疫原性細胞を枯渇させる方法に関する。その要
件は、９０％Ｏ₂ 中での培養である。このエピトープはヒトの抗ブタ抗体で認識
され拒絶に重要であるため、Ｇａｌエピトープの発現が膵臓組織中で研究された
。神経組織またはマクロファージ上のＧａｌエピトープの発現、およびこの細胞
集団を枯渇させるためのＧａｌエピトープの使用の可能性についてはなにも言及
されていない。この研究では、受容者を免疫抑制するのに、受容者の抗ＣＤ４処
理が使用されている。

【０００８】 （発明の要約） ブタの胚から分離した脳組織を初代培養で増殖させると、そのマクロファージ
および／または小グリア細胞が自己蛍光性となり、両方のクラスのＭＨＣ抗原を
発現し、ヒトＴリンパ球の増殖を誘導し、一方星状細胞は非自己蛍光性のままで
あり、ＭＨＣクラスＩ抗原のみを発現し、ヒトＴ細胞中で弱い増殖応答のみを示
すことが、証明されている（ブレビグ（Brevig）ら、１９９９）。ブタの脳組織
からマクロファージおよび／または小グリア細胞を除去するために、本発明の標
的候補は、炭水化物エピトープのＧａｌα１−３Ｇａｌβ１−Ｒ（α−ガラクト
シルエピトープ）であり、これは、ブタの胚の脳中で、マクロファージおよび／
または小グリア細胞および内皮細胞上にあるが、ニューロンや星状細胞中には存
在しないことを本発明者らが証明した（スミトラン（Sumitran）ら、１９９９）
。ヒトの血清は、α−ガラクトシルエピトープに対する高力価の天然の補体活性
化ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体（抗Ｇａｌ）を含有する（ガリリ（Galili）、１９９
３；ロザー（Rother）とスキント（Squinto）、１９９６）が、ブタの胚の腹側
中脳中で発現される他のエピトープに対する抗体も含有する（スミトラン（Sumi
tran）ら、１９９９）。従って、精製した抗Ｇａｌおよび補体は、神経疾患の治
療のために、移植の前にマクロファージおよび／または小グリア細胞および内皮
細胞を選択的に溶解し、分離したブタの神経組織からこれらの細胞を除去する能
力を有する。

【０００９】 上記したように、神経異種移植片の生存は、宿主のＴリンパ球により影響を受
ける。パーキンソン病、ハンティントン病、多発性硬化症、てんかん、卒中、疼
痛、および脊髄損傷のための治療的異種移植におけるドナー材料として興味のあ
る、ブタの胚脳組織の免疫原性を低下させるために、マクロファージおよび／ま
たは小グリア細胞の抗体性および補体性除去のための標的としてα−ガラクトシ
ルエピトープを使用する可能性が、本発明者らによりインビトロで研究された。
２７日齢のブタの胚から単離した脳細胞を抗Ｇａｌと補体に暴露させ、残存する
細胞を、（ｉ）フローサイトメトリーで分析して、マクロファージおよび／また
は小グリア細胞の含量を測定し、および（ii）ヒト末梢血ＣＤ４ Ｔリンパ球と
同時培養して、増殖性Ｔ細胞応答を誘発する能力を測定（これは、トリチウムチ
ミジンの取り込みを測定して評価）した。ブタ胚の脳細胞を正常なヒト血清（こ
れは、高力価の抗Ｇａｌを含有する）とともにインキュベートし、次にウサギの
補体とインキュベートすると、新たに単離した細胞と、短時間の初代培養で増殖
させた細胞の両方に適用した時、マクロファージおよび／または小グリア細胞の
数が低下した。精製したヒト抗Ｇａｌとウサギ補体で処理したブタ胚の培養脳細
胞は、０．８％のマクロファージおよび／または小グリア細胞を含有したが、ヒ
トＣＤ４ Ｔ細胞の増殖を誘導せず、培地とウサギ補体で対照処理をした脳細胞
は、３．４％のマクロファージおよび／または小グリア細胞を含有し、ヒトＣＤ
４ Ｔリンパ球で有意な増殖応答を誘導した。

【００１０】 （発明の詳細な説明） 本発明の１つの目的は、移植材料であり、 （ａ）ブタの胚または胎児神経組織の分離、 （ｂ）工程（ａ）の調製物を、Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−Ｒエピトープに対す
る抗体と補体試薬とに暴露させることによる、マクロファージおよび／または小
グリア細胞の除去、により作成されることを特徴とする。

【００１１】 組織の分離は、部分的でも完全でもよい。部分的分離は、細胞凝集物を含む懸
濁物への組織の分離を意味する。完全な分離は、単一細胞懸濁物への組織の分離
を意味する。部分的または完全な分離は、１つ以上の酵素（プロテアーゼおよび
／またはデオキシリボヌクレアーゼ）を使用して行うことが好ましい。そのよう
な酵素のいくつかの例は、バーカー（Barker）ら（１９９５）が記載しており、
例えばワーシントンバイオケミカルコーポレーション（Worthington Biochemica
l Corporation）からのウシトリプシンがある。別の適当な酵素は、シグマ（Sig
ma）のブタトリプシンIX型である。分離した組織を洗浄するための培地のいくつ
かの例は、ワッツ（Watts）ら（１９９８）が記載しており、例えばダルベッコ
ー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）がある。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）も
使用することができる。補体試薬は、ウサギ血清またはウサギ血清から精製した
補体が好ましい。

【００１２】 本発明の抗体の例は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。
抗体は、任意の種由来でよいが、好ましくはヒト由来である。モノクローナル抗
体という用語は、当該分野で認識されている用語である。本発明のモノクローナ
ル抗体は、コーラー（Kohler）ら、１９７５に記載されたような一般的方法によ
り調製することができる。ポリクローナル抗体は、例えば動物またはヒト血清か
ら精製される。また、コンピューターシミュレーションによりエピトープに結合
する新しい分子を作成できる可能性もある。コンピューターシミュレーション法
は、当業者に公知であり、例えばＥＰ０６６０２１０Ａ２に記載されている。

【００１３】 本発明の抗体は、Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−Ｒ末端エピトープに結合する。
そのようなエピトープの例は、Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮａｃ−Ｒ
エピトープである。Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−Ｒ抗原とその単離は、Subcellu
lar Biochemistry, Vol. 32: alpha-Gal and Anti-Gal、ガリリ（Galili）とア
ビラ（Avila）編、クルワーアカデミック／プレヌムパブリシャーズ（Kluwer Ac
ademic/Plenum Publishers）、ニューヨーク、１９９９；リウ（Liu）ら（１９
９７）；およびホールバーグ（Hallberg）ら（１９９８）に記載されている。

【００１４】 本発明の別の目的は、神経組織を移植する時に有用な、医薬調製物を調製する
ための上記移植材料の使用である。 本発明の別の目的は、その免疫原性を低下させるためのブタ組織の処理に使用
するためのキットであり、組織分離のために１つ以上の酵素、Ｇａｌα１−３Ｇ
ａｌβ１−Ｒエピトープに対する抗体の調製物、および補体試薬を含むことを特
徴とする。

【００１５】 抗体は、ポリクローナル抗体であることが好ましい。抗体はヒト起源であるこ
とが特に好ましい。抗体はまた、マクロファージおよび／または小グリア細胞に
結合することが好ましい。酵素と補体試薬の例は上記した。

【００１６】 本発明の別の目的は、ブタの胚または胎児神経組織からのマクロファージおよ
び／または小グリア細胞の除去方法であり、 （ａ）神経組織を分離し、Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−Ｒエピトープに対する抗
体で処理する、 （ｂ）工程（ａ）の調製物を、担体に結合した抗体に暴露するかまたはフロー選
別により、工程（ａ）の調製物からマクロファージおよび／または小グリア細胞
を枯渇させる、または （ｃ）工程（ａ）の調製物を補体試薬で処理して、工程（ａ）の調製物からマク
ロファージおよび／または小グリア細胞を枯渇させる、ことを特徴とする。

【００１７】 ブタの胚または胎児神経組織は、１つ以上の酵素（例えば、プロテアーゼおよ
び／またはデオキシリボヌクレアーゼ）を使用して分離することが好ましい、ま
た抗体は、ヒト起源の抗体のようなポリクローナル抗体であることが好ましい。
また補体は、ウサギ血清またはウサギ血清から精製した補体が好ましい。適当な
担体の例は、常磁性ビーズまたはプラスチック表面である。

【００１８】 小細胞塊中のマクロファージおよび／または小グリア細胞でさえ、この機序に
より除去することができるため、ドナー材料を分離し、抗体性および補体性溶解
を使用することが好ましい。

【００１９】 またドナー材料を単一細胞懸濁物に変換し、マクロファージおよび／または小
グリア細胞を物理的に除去（例えばパニング、常磁性ビーズ、またはフロー選別
、ただしこれは使用可能な神経細胞の量を減少させることがある）することも可
能である。Current Protocols in Immunology、コリガン（Coligan, J.E.）ら編
、１９９３、１〜３巻、ジョンワイリーアンドサンズインク（John Wiley and S
ons Inc.）を参照されたい。

【００２０】 本発明の別の目的は、神経障害の治療方法であり、 （ａ）ブタの胚または胎児神経組織を分離し、 （ｂ）分離した組織を、Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−Ｒエピトープに対する抗体
と補体試薬で処理して、マクロファージおよび／または小グリア細胞を除去し、 （ｃ）分離した抗体処理および補体処理組織を、ヒトの体に移植する、ことを特
徴とする。

【００２１】 好ましくは、障害は、パーキンソン病、ハンティントン病、多発性硬化症、て
んかん、卒中、疼痛、および脊髄損傷よりなる群から選択される。

【００２２】 ブタの脳組織から調製される懸濁物全体を移植する代わりに、本発明者らは、
分離した組織を抗Ｇａｌと補体で前処理することを提唱し、その効果を図１２に
示す。抗Ｇａｌと補体による前処理がヒトにおいてブタの神経移植片の生存を増
強させるなら、臨床的神経異種移植前にドナー組織の免疫原性を低下させる簡便
で安価な方法となるかも知れない。

【００２３】 神経異種移植後、移植片の直接的および間接的認識が起きるが、これらの２つ
の機序の相対的強度は、ブタ体ヒト異種移植片状況では不明である（ギル（Gill
）とウルフ（Wolf）、１９９５；アウチンクロス（Auchincloss）とサックス（S
achs）、１９９８）。本発明者らは、直接的認識に注目したが、抗Ｇａｌと補体
による前処理はまた、間接的認識を低下させるかも知れない（ブレビグ（Brevig
）ら、印刷中）。間接的認識の効果は、細胞すなわちα−ガラクトシルエピトー
プを有するタンパク質の除去により説明され、これは、宿主の抗原提示細胞によ
るエンドサイトーシス、プロセシングおよび提示のために、宿主抗Ｇａｌにより
オプソニン化することができる。ニューロンは、間接的経路を介してＴ細胞によ
り認識されるため、ブタ神経異種移植片は、完全に非免疫原性にすることができ
ない。

【００２４】 いくつかの非限定例を参照して本発明を説明する。

【００２５】 本明細書において以下の用語は記載の意味を有する： α−ガラクトシルエピトープは、Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−Ｒ（ここで、Ｒ
は分子の残りの部分である）を意味し、抗Ｇａｌは、Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１
−Ｒ（ここで、Ｒは分子の残りの部分である）に対する抗体を意味し、 ＢＳＡは、ウシ血清アルブミンを意味し、 ＤＭＥＭは、ダルベッコー改変イーグル培地を意味し、 ＥＤＴＡは、エチレンジアミン四酢酸を意味し、 ＦＣＳは、胎児牛血清を意味し、 ＦＩＴＣは、フルオレセインイソチオシアネートを意味し、 ＦＢＳは、胎児牛血清を意味し、 Ｇａｌは、Ｄ−ガラクトースを意味し、 ＧｌｃＮＡｃは、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンを意味し、 Ｉｇは、免疫グロブリンを意味し、 ｍＡｂは、モノクローナル抗体を意味し、 ＰＢＳは、リン酸緩衝化生理食塩水を意味し、 ＰＭＳＦは、フェニルメタンスルホニルフルオリドを意味し、 ＰＬＭＥＣは、ブタ肝臓微小血管内皮細胞を意味し、 ＲＰＥは、Ｒ−フィコエリトリンを意味し、 ＴＢＳは、トリス緩衝化食塩水を意味し、 ＴＨは、チロシンヒドロキシラーゼを意味し、 ＴＮＦは、腫瘍壊死因子を意味し、 ＶＣＡＭは、血管細胞接着分子を意味し、 ＶＭは、腹側中脳を意味する。

【００２６】 本明細書のすべての技術的および科学的用語は、特に明記しない場合は、当業
者により理解されるものと同じ意味を有する。「含む」という表現は、含むが限
定されないことを意味する。本明細書で使用される技術は、特に明記しない場合
は当業者に公知のものである。本明細書に記載の刊行物は、参照することにより
本明細書に組み込まれる。

【００２７】例 材料と方法

【００２８】例１と２について（例４〜７についても参照されたい） ブタの胎児脳細胞。２８、３５、４２、および５６日齢のブタ胎児の脳全体ま
たは腹側中脳から、脳細胞を単離した（表１）。６〜１５の胎児の各１２リット
ルから単離した脳を、ゲイの緩衝塩溶液（ライフテクノロジーズ（Life Technol
ogies）、スコットランド）にプールし、髄膜を注意深く除去した。脳を小片に
切り、２０％熱不活性化（５６℃、３０分）ウマ血清（ライフテクノロジーズ（
Life Technologies））を有する脳細胞培地（Ｌ−グルタミン、アミノ酸、ビタ
ミン（すべて、ライフテクノロジーズ（Life Technologies））、ペニシリン、
ヘキサマイシン、および重炭酸ナトリウムを補足したアール塩（Earle's Salts
）を有するイーグル最小基本培地）に移し、炎で磨いたピペットで粉砕し、最後
に８０μｍ孔を有するニテックス（Nitex）フィルターでろ過した。ろ液を、２
０％ウマ血清を有する脳細胞培地で希釈して、２８、３５、４２、および５６日
齢の脳についてそれぞれ１０、２０、３０、または５０mlの総量を得た。

【００２９】 脳細胞を、単離直後または初代培養で１２〜１４日後、分析した。上記のよう
に調製した５．０mlの細胞懸濁物を、ポリ−Ｄ−リジン（シグマ（Sigma）、ア
メリカ合衆国）被覆培養フラスコ（５０mlフラスコ；ヌンク（Nunc）、デンマー
ク）に加え、次に空気中５％ＣＯ₂ の加湿雰囲気中で３７℃でインキュベートし
た。２日間後、細胞が付着したら、培地を２０％ウマ血清を有する脳細胞培地に
交換し、次に週に２回、１０％ウマ血清を有する脳細胞培地に交換した。

【００３０】 プラスチックピペットで培養フラスコの底を静かになでて、培養した脳細胞を
離し（すべての細胞が離れたことを確認するために顕微鏡で培養フラスコをチェ
ックした）、Ｖ底試験管に（１つのフラスコの内容物を１つの試験管に）移し、
遠心分離（１００ｇ、１０分）した。上清を捨て、各試験管に５００μｌまたは
５００μｌのリンパ球培地を加え、内径０．５mmの針を有するシリンジを使用し
て細胞を再懸濁した。試験管を室温で１５分間放置して、細胞塊を沈殿させ、懸
濁物中の単一の細胞を有する上清を採取し、以後の分析に使用した。

【００３１】 染色試薬。脳細胞の免疫蛍光のために、以下の１次抗体と抗体−蛍光色素結合
体を使用した：マウス抗ＭＨＣＩ ＩｇＧ_2a（免疫原：ブタ胸腺；１：１０、ク
ローンＰＴ８５Ａ；獣医学研究開発（Veterinary Medical Research and Develo
pment）（ＶＭＲＤ）、アメリカ合衆国）、マウス抗ＭＨＣII ＩｇＧ_2a（免疫
原：ブタと他の種からの胸腺；１：１０、クローンＴＨ１６Ｂ；ＶＭＲＤ）、マ
ウス抗ブタＣＤ４ ＩｇＧ_2a（１：１；クローンＰＴ９０Ａ；ＶＭＲＤ）、マウ
ス抗ブタＣＤ４４ ＩｇＧ_2a（１：１；クローンＰＯＲＣ２４Ａ；ＶＭＲＤ）、
マウス抗ヒトＣＤ１８ ＩｇＧ₁ ＦＩＴＣ（１：１；クローンＭＨＭ２３；ダコ
（DAKO）、デンマーク）、マウス抗ヒトＣＤ５６ ＩｇＧ₁ ＲＰＥ（１：１；ク
ローンＭＹ３１；ＢＤ）、またはポリクローナルウサギ抗ウシＧＦＡＰ（１：１
０；ダコ（DAKO））。ヤギ抗マウス免疫グロブリンＦ(ab')₂ ＲＰＥ（１：１０
；ダコ（DAKO））を、ＭＨＣ抗体とＣＤ４およびＣＤ４４に対する抗体の２次試
薬として使用した。ブタ抗ウサギ免疫グロブリンＦＩＴＣ（１：１０；ダコ（DA
KO））を、ＧＦＡＰ抗体の２次抗体として使用した。種の一致したおよびイソタ
イプの一致した無関係の抗体（マウスＩｇＧ_2a陰性対照（１：１；ダコ（DAKO）
）またはマウスＩｇＧ₁ 陰性対照ＦＩＴＣ／ＲＰＥ／Ｃｙ５（１：１；ダコ（DA
KO））または２次抗体のみに暴露した試料を陰性対照として使用した。製造業者
によると、ブタ以外の他の種からの抗原に対する１次抗体は、対応するブタ抗原
と強く交差反応した。記載したものより高濃度の抗体が、より強い染色を与える
ことはなかった。食作用を証明するための染色試薬を以下に示す。

【００３２】 染色法。染色前に、同じ脳から得られた培養物からの脳細胞をプールして、培
養物間の変動の可能性を排除した。１．０×１０⁶ の新たに単離したまたは培養
した脳細胞を含有する１００μｌ容量の細胞懸濁物を、ファルコン試験管（ＢＤ
）に移し、１０μｌの抗体を入れた。暗所で室温で３０分後、細胞をＰＢＳで２
回洗浄（２５０ｇ、５分）し、間接的免疫染色のために１００μｌのＰＢＳに再
懸濁したか、または直接免疫染色のために５００μｌのＰＢＳに再懸濁した。間
接的染色のための試料には、１０μｌの２次抗体を加え、インキュベートし、前
述のように洗浄し、５００μｌのＰＢＳに再懸濁した。ＧＦＡＰで染色する前に
、細胞を２．０mlのＦＡＣＳ溶解溶液（ＢＤ）中で１０分間インキュベートし、
次に０．５mlのＦＡＣＳ透過性化溶液（ＢＤ）中で１０分間インキュベートして
、細胞を固定し透過性にした。

【００３３】 食作用の測定のために、脳細胞培養物の培地に、０．５mgのフルオレセイン標
識大腸菌バイオパーティクル（BioParticles）（モレキュラープローブズ（Mole
cular Probes）、アメリカ合衆国）を加えた。３７℃で３０分間インキュベート
後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、はがし、分離させ、フローサイトメトリー、蛍
光顕微鏡、または共焦点レーザー顕微鏡により分析した。大腸菌バイオパーティ
クルを与える前に、共焦点レーザー顕微鏡で分析すべき培養物に、２０μｌの過
塩素酸１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカ
ルボシアニン（ＤｉＩ：モレキュラープローブズ（Molecular Probes））ストッ
ク溶液（１．０mg ＤｉＩ／ml ９９％エタノール）を加え、３７℃で２時間イ
ンキュベートし、１０％ウマ血清を有する脳細胞培地で２回洗浄した。

【００３４】 フローサイトメトリー。上記したように脳細胞を染色し、ＦＡＣＳｃａｎフロ
ーサイトメーター（ＢＤ）上の各試料から１．０×１０⁴ のアンゲーテッドイベ
ントを得た。亜細胞破片を排除するために、前進スキャター閾値を設定した。装
置の設定は、すべての捕捉（acquisition）で同じであるが、固定細胞では前進
スキャター閾値を下げた。

【００３５】 共焦点レーザー走査顕微鏡。懸濁した脳細胞の液的を、顕微鏡スライド上にの
せ、通常の蛍光顕微鏡用のカバーガラスをかぶせた。次に試料の適当な部分を、
ライカ（Leica）ＴＣＳ４ＤＤＭＲ共焦点レーザー走査顕微鏡（ライカ（Leica）
、ドイツ）で２チャネルモードで励起波長４８８と５６８nmを使用して、フルオ
レセインとローダミン光学フィルターセットの付いた検出器と、線形ＡＤ変換を
使用して、走査した。

【００３６】 フロー選別。星状細胞とマクロファージ／小グリア細胞を分離するために、上
記のように調製した培養脳細胞の単一細胞懸濁物を、ヘリウム−ネオンレーザー
（４８８nm）、ＦＬ１／ＦＬ２ビームスプリッター（５６０nm）、およびＦＬ１
（５３０±１５nm）とＦＬ２（５７５±１３nm）フィルターの付いたＦＡＣＳＶ
ａｎｔａｇｅセルソーター（ＢＤ）で、２〜３×１０³ 細胞／ｓで選別した。２
％ＦＣＳを有する５．０mlのＰＢＳ中の６×１０⁷ 脳細胞に、２００μｌのマウ
ス抗ＣＤ５６ ＩｇＧ₁ ＲＰＥを加え、４℃で３０分間インキュベートし、２％
ＦＣＳ含有セルウォッシュ（CellWash）で２回洗浄（２５０ｇ、５分間）し、グ
リーン−蛍光／オレンジ−蛍光プロットで長方形ゲートを設定して選別し、ＣＤ
５６陽性細胞（星状細胞）を１つの試験管に入れ、自己蛍光性ＣＤ５６陰性細胞
（マクロファージ／小グリア細胞）を別の試験管に選別した。試料液は、２％Ｆ
ＣＳを有するＰＢＳである。シート液としてＦＡＣＳＦｌｏｗ（ＢＤ）を使用し
た。前進スキャター閾値を設定して、亜細胞破片を除去した。

【００３７】 細胞選別集団の純度を、さらに細胞の染色をすることなくフローサイトメトリ
ーにより測定した。マクロファージ／小グリア細胞の生存活性を、ヨウ化プロピ
ジウムで染色後にフローサイトメトリーで測定した。星状細胞の生存活性は、０
．４％トリパンブルー（シグマ（Sigma））と細胞懸濁物のアリコートを混合し
た１０分後に、青い細胞と細胞の総数を計測して決定した。

【００３８】 混合リンパ球−脳細胞培養。３名の健常血液ドナー（Ｈ−３９７０、Ｈ−３９
７７、およびＨ−８０５３）からの単核血液細胞（リンパ球と単球）を、浮上法
によりバッフィーコートから単離し、既に記載されている（ブレビグ（Brevig）
ら、１９９７）ように低温保存した。使用前に、水浴（３７℃）中で細胞を融解
し、ＲＰＭＩ（ライフテクノロジーズ（Life Technologies））で３回洗浄（５
００ｇ、１０分）し、リンパ球培地（ヘペスを有する９０％ＲＰＭＩ１６４０、
１０％熱不活性化ＦＣＳ、１００IU/ml ペニシリン、１００μg/mlストレプトマ
イシン、および２．０mM Ｌ−グルタミン；すべてライフテクノロジーズ（Life
Technologies））に、３７℃で空気中５％ＣＯ₂ の加湿雰囲気中で２４時間放
置した。２．０×１０⁵ のヒト単核血液細胞（応答物質）を含有する１００μｌ
容量のリンパ球培地を、Ｕ底マイクロタイタープレート（ヌンク（Nunc））のウ
ェルに入れた。未分離の脳細胞、選別した脳細胞、および同種の単核血液細胞（
刺激物質）にγ線照射（５０Ｇｙ）を行い、１００μｌのリンパ球培地中の２．
０×１０⁴ 細胞を、応答物質を有するウェルに加えた（組合せあたり３〜５個の
ウェル）。応答物質とリンパ球培地を入れたが刺激物質の無いウェルを、陰性対
照として使用した（組合せあたり５〜１２ウェル）。各ウェルに、細胞採取の２
４時間前に、１．０μＣｉ［ ³Ｈ］−チミジン（アマシャム（Amersham）、英国
）を加えた。３７℃で空気中５％ＣＯ₂ の加湿雰囲気中で４日間インキュベート
後、細胞採取システム（スカトロン（Skatron）、ノルウェー）で細胞を採取し
、βカウンターで計測した（２０００ＣＡ トリ−カーボ（Tri-Carb）；パッカ
ード（Packard）、アメリカ合衆国）。

【００３９】 統計解析。増殖データを、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）と片側の対になっ
ていないｔ検定により分析した。

【００４０】例３について（例４〜７も参照されたい） 細胞培養。不死化ヒト臍帯静脈内皮細胞株ＥＣＶ３０４（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ−
１９９８）をＤＭＥＭ／ＦＢＳで培養した。ブタ肝臓微小血管内皮細胞（ＰＬＭ
ＥＣｓ）を、地方の屠殺場から得られた新鮮なブタの肝臓から単離した。試料を
、０．０５％（w/v）コラゲナーゼ（カタログ番号１０８８７９３；ベーリンガ
ーマンハイム（Boehringer Mannheim）、ドイツ）とウシの膵臓からの０．００
２％（w/v）ＤＮａｓｅＩタイプII（カタログ番号Ｄ−４５２７；シグマ（Sigma
）、アメリカ合衆国）を含有する培地中で小片に砕き、次に３７℃で３０〜４５
分消化した。細胞懸濁物をろ過して非分離組織を除去し、ＰＢＳで３回洗浄し、
下記の培地を使用して０．２％ゼラチン被覆２５cm² フラスコ（ファルコン（Fa
lcon）、アメリカ合衆国）中で１週間培養した。拡張した細胞を、１００U/mlの
ヒト組換えＴＮＦ−α（ジェンザイム（Genzyme）、アメリカ合衆国）で１８時
間活性化し、ロックンローラー上で室温で１時間、５０μｇ（１ mg/ml）抗ブタ
ＶＣＡＭ抗体（クローン５Ｄ１１；アレキシオンファーマシューチカルズ（Alex
ion Pharmaceuticals）、アメリカ合衆国）でインキュベートし、ＰＢＳで１回
洗浄し、１００μｌの常磁性ヤギ抗マウスダイナビーズ（ダイナル（Dynal）、
ノルウェー）で４℃で４５分間インキュベートし、次に磁石上で免疫磁性選択を
行った。陽性に選択された細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、ゼラチン被覆６ウェル
組織培養プレート（ファルコン（Falcon））で、１０％ＦＢＳ（ギブコ（Gibco
）、アメリカ合衆国）、ペニシリン（１００IU/ml ；シグマ（Sigma））および
ストレプトマイシン（１００μg/ml ；シグマ（Sigma））および１ml／１００ml
培地の内皮細胞増殖因子（カタログ番号Ｅ−９６４０；シグマ（Sigma））を含
有するＤＭＥＭ中で培養した。培養の２日目に、ＰＢＳでビーズを洗い流した。
継代する前に細胞をコンフルエンスまで増殖させた。内皮細胞を、形態、および
抗Ｅセレクチン（クローンＢＢＩＧ−Ｅ４；カタログ番号ＢＢＡ１６；Ｒ＆Ｄシ
ステム（R & D systems）、英国）と抗ブタＶＣＡＭ抗体を使用してフローサイ
トメトリー表現型測定により解析した。９５％を越える細胞が内皮細胞であった
。

【００４１】 ブタ胚の腹側中脳細胞の単離。ピガム（Pigham）株（スイーデッシュランドレ
ース（Swedish Landrace）とヨークシャーソウ（Yorkshire sows）およびハンプ
シャーボア（Hampshire boars）の交配により得られた；ニホルムス飼育農場（N
yholms Breeding Farm）、スエーデン）のＥ２６〜２７のブタの胚から、腹側中
脳（ＶＭ）領域を得た。地方および国の動物倫理規則に従って、ブタを飼育し安
楽死させた。得られたＶＭ細胞は、約１０〜１５％のドパミン作用性細胞を含有
し、残りは他のニューロン、グリア、および内皮細胞であった。組織を、０．３
μＭのラザロイド（lazaroid）Ｕ−８３８３６Ｅ（アプジョンインク（Upjohn I
nc.）、アメリカ合衆国）を有するハンクス塩溶液中で検出した（ナカオ（Nakao
）ら、１９９４）。ＶＭ組織試料（約２×２×１mm）を４〜６個の小片に切断し
、これらを低温保存培地（グラスボン−フロダル（Grasbon-Frodl）ら、１９９
６）中に移し、同日または翌日の分析のためにフジンゲ（Huddinge）病院に輸送
した。次にピペットに数回通過させて細胞懸濁物中に組織を粉砕した。出荷の前
にかつインビトロ分析の前に、臭化エチジウムを使用して生存活性をチェックし
た。

【００４２】 フローサイトメトリックアッセイ。５０μｌのＰＢＳ中の５×１０⁵ ＶＭ細胞
を、５０μｌのヒトＡＢ血清、抗ＧａｌＡＢ枯渇ＡＢ血清、またはＲＰＭＩ１６
４０培地と、２２℃で１時間インキュベートした。細胞を、０．１％アジ化ナト
リウム含有ＰＢＳで３回洗浄した。ヤギ抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＭ抗体の１０μ
ｌの１：４希釈ＦＩＴＣ結合Ｆ(ab')₂断片（それぞれ１０９−０９６−０９８お
よび１０９−０９６−１２９；ジャクソンイムノリサーチラボズ（Jackson Immu
noResearch Labs）、アメリカ合衆国）を加え、試料を氷上で暗所で２５分間イ
ンキュベートした。細胞を洗浄し、次にフローサイトメトリーで分析した。ＶＭ
細胞またはＰＬＭＥＣをビオチン化バンデレイア・シンプリシフォリア（Bander
eia Simplicifolia）イソレクチンＢ４（４μg/ml；カタログ番号Ｌ−２１４０
；シグマ（Sigma））とともにインキュベートし、次に１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１
：２０００希釈したＦＩＴＣ結合アビジン（カタログ番号５５８８０；オルガノ
ンテクニカ（Organon Teknika）、アメリカ合衆国）で検出して、α−ガラクト
シルエピトープ発現を推定した。あるいは５０μlのＰＢＳ、５０μｌのヒトＡ
Ｂ血清、抗Ｇａｌ抗体枯渇ＡＢ血清、またはＲＰＭＩ１６４０培地中５×１０⁵
ＶＭ細胞を含有する試験管に、２００μｌのウサギ血清（カタログ番号４３９６
６５，バイオテストエージー（Biotest AG）、ドイツ）を加え、再度インキュベ
ートした（今度は１時間）。５μｌのヨウ化プロピオジウム（ＰＩ；ＰＢＳ中３
．２mM）を加えた直後に、４８８nmで励起するアルゴンレーザー（ヤコブズ（Ja
cobs）ら、１９８３）を備えたフローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｎ；ベクト
ンディッキンソン（Becton Dickinson）、アメリカ合衆国）で試料を分析して、
死滅細胞を検出した。対数増幅でデータを集め、蛍光強度を任意の線形単位で示
した。１０，０００細胞からの蛍光シグナルを取った。

【００４３】 抗チロシンヒドロキシラーゼ、抗単球／マクロファージ抗体、またはイソレク
チンバンデレイア・シンプリシフォリア（Bandereia Simplicifolia）ＩＢ４に
よる、ブタの胚ＶＭ組織の染色。Ｅ２６／Ｅ２７胚からの頭部全体を切断して、
冷０．１Ｍリン酸緩衝化４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）中に一晩浸漬
固定し、次に２０％ショ糖−ＰＢＳ溶液中で少なくとも２４時間インキュベート
した。試料を凍結し、スライド式ミクロトームで４シリーズの４０μｍ厚の冠状
切片を切った。浮動性の切片を染色した。

【００４４】 チロシンヒドロキシラーゼと小グリア細胞免疫染色のために、標準的免疫組織
学的方法を使用した（デュアン（Duan）ら、１９９５）。３％過酸化水素／１０
％メタノール溶液で、次に５％ブタ血清中で１ｈインキュベートして、内因性ペ
ルオキシダーゼ活性を除去した。ウサギ抗ＴＨ（１：５００；ペルフリーズ（Pe
l-Freez）、アメリカ合衆国）中、または０．３％トリトンＸ−１００を有する
ＰＢＳ（ｐＨ７．２〜７．４）（ＰＢＳ−Ｘ）で希釈したマウス抗ヒト単球／マ
クロファージ（１：５００；クローンＭＡＣ３８７；ＩｇＧ₁ ；セロテック（Se
rotec）、英国）モノクローナル抗体で、切片を室温で一晩インキュベートした
。後者の抗体は小グリア細胞に結合し、ブタ抗原（セロテック（Serotec））と
交差反応する。翌日、切片をＰＢＳ−Ｘで３回洗浄し、それぞれビオチン化ブタ
抗ウサギ抗体（１：２００；ダコ（DAKO）、デンマーク）と、またはポリクロー
ナルビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体（１：２００；クローンＢＡ−２００１；ベ
クターラボズ（Vector Labs）、アメリカ合衆国）と１時間インキュベートした
。ＰＢＳ−Ｘで洗浄後、ベクタスタチン（Vectastatin）（登録商標）標準ペル
オキシダーゼＡＢＣキットを使用した（ベクターラボズ（Vector Labs））。１
時間後、切片をＰＢＳ−Ｘで３回洗浄し、ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジ
ン）キット（ベクターラボズ（Vector Labs））を使用して視覚化した。切片を
ゼラチンスライド上にのせ、標準的アルコール／キシレン試薬を使用して脱水し
、ＤｅＰｅＸ（ビーディーエィチラボズ（BDH Labs）、英国）でカバーガラスを
のせた。

【００４５】 イソレクチンバンデレイア・シンプリシフォリア（Bandereia Simplicifolia
）ＩＢ４で染色するために、切片を３％過酸化水素／１０％メタノール溶液で処
理して、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックし、次に１％ＢＳＡブロッキン
グ溶液で１時間インキュベートした。０．２mM ＣａＣｌ₂ を含有するＰＢＳ（
ｐＨ＝６．８）（ＰＢＳ−Ｃａ）で希釈したビオチン化ＢＳ−ＩＢ４（Ｌ−２１
４０；シグマ（Sigma））の４μg/ml溶液を用いて、切片を一晩（４℃）インキ
ュベートした。翌日、切片をＰＢＳ−Ｃａで３回洗浄し、次にベクタスタチン（
Vectastatin）（登録商標）標準的ペルオキシダーゼＡＢＣキットに含有される
ＡＢ溶液で室温でインキュベートした。ＰＢＳ−Ｃａで洗浄後、切片をベクター
（Vector）（登録商標）Ｄａｂキット（ベクターラボズ（Vector Labs））を使
用して調製したＤＡＢ溶液と反応させた。切片をゼラチンスライド上にのせ、標
準的アルコール／キシレン試薬を使用して脱水し、ＤｅＰｅＸ（ビーディーエィ
チラボズ（BDH Labs）、英国）でカバーガラスをのせた。

【００４６】 内皮細胞およびＶＭ細胞膜の単離。細胞を、１mM ＰＭＳＦ含有ＰＢＳで１回
洗浄し、使用するまで−７０℃で凍結して維持した。凍結−融解を６回繰り返し
た後、細胞を氷上でＰＢＳ／１mM ＰＭＳＦ中でダウンス（Dounce）ホモジナイ
ザーを使用してホモジナイズした（約１０ストローク）。３，０００ｇで１５分
間遠心分離して核をペレットにし、上清を集め、ペレットを同じ緩衝液に再懸濁
し、再度遠心分離した。これを繰り返し、プールした上清を、１００，０００ｇ
で１時間１０分Ｔｉ７５ロータ中で超遠心分離し、ペレットをＰＢＳ／１mM Ｐ
ＭＳＦに再懸濁し、等量のＰＢＳ溶液中の３５％（w/v）ショ糖の上に重層した
。ＳＷ４０ロータでブレーキを使用せず１００，０００ｇで１時間遠心分離した
後、濁った界面として膜を採取し、再度４０，０００ｇで１時間遠心分離してペ
レットにした。ＶＭと内皮細胞膜タンパク質を、１００mM ＮａＣｌ、１０mM
ＥＤＴＡ、および１％イゲパル（Igepal）ＣＡ−６３０（Ｉ−３０２１；シグマ
（Sigma））（１mM ＰＭＳＦ（Ｐ−７６２６；シグマ（Sigma））、１μg/mlペ
プスタチンＡ（Ｐ−４２６５；シグマ（Sigma））および１μg/mlロイペプチン
（Ｌ−２０２３；シグマ（Sigma））を含有する）を有する１０mMトリス−塩酸
（ｐＨ７．５）で可溶化した。等量の可溶化細胞膜タンパク質と２×濃縮（redu
cing）試料緩衝液とを混合し、ゲルに適用した。

【００４７】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティング。５％スタッキングゲルと８％
分解ゲルを用いるリームリ（Laemmli）の方法（リームリ（Laemmli）ら、１９７
０）により、垂直ミニ−プロテアンII（Mini-PROTEAN II）電気泳動システム（
バイオラッド（Bio-Rad）、アメリカ合衆国）を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを
行った。分離したタンパク質を、ミニトランス−ブロット（Mini Trans-Blot）
電気泳動移動セル（バイオラッド（Bio-Rad））を使用して、電気泳動でハイボ
ンド（Hybond）（登録商標）−Ｃエキストラ膜（アマシャム（Amersham）、英国
）にブロットした。製造業者（バイオラッド（Bio-Rad））の説明書に従って銀
染色キットを使用して、タンパク質ゲルを染色した。ＰＢＳ中３％ＢＳＡで少な
くとも２時間ブロッキングした後、０．２mM ＣａＣｌ₂ を含有するＰＢＳで１
μg/mlに希釈したペルオキシダーゼ結合バンデレイア・シンプリシフォリア（Ba
ndereia Simplicifolia）イソレクチンＩＢ４（Ｌ−５３９１；シグマ（Sigma）
）で、室温で２時間プローブ結合させた。膜をＰＢＳ（ｐＨ６．８）で５回洗浄
し、結合したイソレクチンを、ＥＣＬ（登録商標）キット（アマシャム（Amersh
am））を使用して、化学発光により視覚化した。膜をヒト血清とプローブ結合さ
せると、これらは、０．０５％ツイーン２０を有するトリス緩衝化食塩水（ＴＴ
ＢＳ）中３％のＢＳＡで一晩ブロッキングされ、非希釈ＡＢ血清または抗Ｃａｌ
抗体枯渇ＡＢ血清と室温で１時間インキュベートし、ＴＴＢＳで５回洗浄し、ヤ
ギ抗ヒトＩｇＧorＩｇＭ抗体（それぞれカタログ番号１０９−０３６−０９８お
よび１０９−０３６−１２９；ジャクソンイムノリサーチラボズ（Jackson Immu
noResearch Labs））のペルオキシダーゼ結合Ｆ(ab')₂断片で、室温で１時間イ
ンキュベートした。ＴＴＢＳで洗浄後、抗体結合成分をＥＣＬ（登録商標）キッ
ト（アマシャム（Amersham））を使用して、検出した。

【００４８】例４〜７について。特に明記しない場合は、例１〜３についても参照されたい ブタ胚の脳細胞の単離と初代培養。０．３μＭのラザロイド（lazaroid）Ｕ−
８３８３６Ｅ（アプジョンインク（Upjohn Inc.）、アメリカ合衆国）を有する
ハンクス塩溶液中でピガム（Pigham）株の２７日齢のブタ胚から、脳を切り出し
た。既に記載されている（ブレビグ（Brevig）ら、１９９７）ように脳切片を単
離し、初代培養で増殖させた。簡単に説明すると、髄膜を除去し、各同腹子から
の脳をプールし小片に切り、これを、脳細胞培地（熱不活性化（５６℃、３０分
）ＦＣＳ（胎児牛血清）、Ｌ−グルタミン、アミノ酸、ビタミン、ペニシリン、
ストレプトマイシン、および重炭酸ナトリウム（すべてライフテクノロジーズイ
ンク（Life Technologies Inc.）、アメリカ合衆国）を補足したアール塩（Earl
e's Salts）を有するイーグル最小基本培地）に移した。組織片を、炎で磨いた
ピペットで粉砕し、得られた細胞懸濁物を、８０μｍ孔ナイロンメッシュ（スト
レノ（Streno）、デンマーク）でろ過した後、２０％ＦＣＳ（脳あたり１０ml）
を有する脳細胞培地で希釈した。５．０mlの細胞懸濁物のアリコートを、ポリ−
Ｄ−リジン（シグマ（Sigma）、アメリカ合衆国）被覆培養５０ml培養フラスコ
（ヌンク（Nunc）、デンマーク）に加え、次に空気中５％ＣＯ₂ の加湿雰囲気中
で３７℃でインキュベートした。３日後および再度６日後と９日後に、１０％Ｆ
ＣＳを有する脳細胞培地に培地を交換した。１０〜１２日後、プラスチックピペ
ットで培養フラスコの底を静かになでて、培養した脳細胞を離し、１０mlの試験
管に（１つのフラスコの内容物を１つの試験管に）移し、遠心分離（１００ｇ、
１０分）した。上清を捨て、内径０．５mmの針を有するシリンジを使用して、２
％ＦＣＳを有する５００μｌのＰＢＳにペレット中の細胞を再懸濁した。試験管
を室温で１５分間放置して、細胞塊を沈殿させ、懸濁物中の単一の細胞を有する
上清をプールし、以後の分析に使用した。

【００４９】 ブタ胚の脳細胞のバンデレイア・シンプリシフォリア（Bandereia Simplicifo
lia）イソレクチン染色。懸濁し接着し培養したブタ胚の脳細胞を、バンデレイ
ア・シンプリシフォリア（Bandereia Simplicifolia）イソレクチンＢ４（ＢＳ
−ＩＢ４）で染色して、それぞれフローサイトメトリーと光学顕微鏡でα−ガラ
クトシルエピトープの発現を測定した。１００μｌのＰＢＳ中５．０×１０⁵ の
脳細胞の懸濁液を、３．０μｇのＦＩＴＣ結合ＢＳ−ＩＢ４（シグマ（Sigma）
）有りまたは無しで、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ（２５０ｇ、５
分）で２回洗浄し、後述するようにフローサイトメトリーで分析した。培養皿に
接着した脳細胞を、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定し、トリ
ス緩衝化食塩水（ＴＢＳ）中１％のトリトンＸ−１００（シグマ（Sigma））で
透過性にし、ビオチン化ＢＳ−ＩＢ４（１００μg/mlＴＢＳ；シグマ（Sigma）
）で６０分間インキュベートし、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（Ｔ
ＢＳ中１：２００；ダコ（DAKO）、デンマーク）で６０分間インキュベートし、
最後にＴＢＳ中０．０５％の３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ；シグマ（
Sigma））で１５分間インキュベートして染色した。インキュベート（これはす
べて２０℃）とインキュベートの間、細胞をＴＢＳで完全に洗浄した。ＤＡＢで
インキュベート後、細胞をＴＢＳと蒸留水で洗浄し、アクアマウント（Aquamoun
t）（ＢＤＨラボラトリーサプライズ（BDH Laboratory Supplies）、英国）で被
覆し、倒立光学顕微鏡で観察した。

【００５０】 ヒト血清とウサギ補体によるブタ胚の脳細胞の処理。新たに単離したブタ胚の
脳細胞を、３つのアリコート懸濁物（２．０mlのＰＢＳ中３．０×１０⁶ 細胞）
に分け、その中の１つをヒト血清とウサギ補体で処理した。細胞に、８．０mlの
熱不活性化ヒト血清（血液型ＡＢのドナーからプールした）を加え、４℃で６０
分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し（４００ｇ、５分）、５．０mlのＬｏｗ
−Ｔｏｘ−Ｍウサギ補体（１つのバイアルの凍結乾燥した内容物を１０mlのＰＢ
Ｓで復元した；セダーレーンラボラトリーズ社（Cedarlane Laboratories Ltd.
）、カナダ）に再懸濁し、３７℃で６０分間インキュベートし、最後にＰＢＳで
洗浄した（４００ｇ、５分）。３つの細胞懸濁物を、上記したように別々の培養
フラスコで１０日間培養し、培養前に処理しなかった１つの培養フラスコの細胞
に、ヒト血清とウサギ補体で同じ処理を行った。すべての３つの培養物からの細
胞を、あらかじめ染色することなくフローサイトメトリーで分析して、自己蛍光
性マクロファージ／小グリア細胞の含量を測定した。

【００５１】 ヒトＣＤ４リンパ球の単離。２人の健常血液ドナーからの単核細胞（リンパ球
と単球）を、既に記載されている（ブレビグ（Brevig）ら、１９９７）ようにバ
ッファイーコートから単離し、氷上で数分間冷却し、洗浄した常磁性ダイナビ−
ズＭ−４５０ ＣＤ４（ダイナル（Dynal)、ノルウェー）と、ビーズ対細胞比０
．６で混合した。試験管を、転倒させながら４℃で４０分間インキュベートし、
磁性粒子濃縮器（ＭＰＣ；ダイナル（Dynal））中に３分間放置した。上清を捨
て、ビーズ上の陽性に単離した細胞を、２％ＦＣＳ含有ＰＢＳ中で５回洗浄し、
デタチャビーズ（Detachabead）ＣＤ４／ＣＤ８試薬（１．０μｌ／２．８×１
０⁵ ビーズ；ダイナル（Dynal））に再懸濁した。試験管を、転倒させながら２
０℃で５０分間インキュベートし、２％ＦＣＳを含有する５mlのＰＢＳを加え、
ＭＰＣ中に３分間放置した。上清中の陽性に単離した細胞を新しい試験管に移し
、２％ＦＣＳを有するＰＢＳ、ＭＰＣを有するＰＢＳで１回、および遠心分離５
００ｇ、１０分）して１回洗浄した。

【００５２】 １０μｌのマウス抗ヒトＣＤ３／４ ＦＩＴＣ／ＲＰＥ（ベクトンディッキン
ソン（Becton Dickinson）、アメリカ合衆国）を有する１００μｌのＰＢＳ中の
５．０×１０⁵ 細胞を、４℃で３０分間インキュベートして、ＰＢＳで２回洗浄
（２５０ｇ、５分）した後、単離したＣＤ４ Ｔリンパ球の純度を、フローサイ
トメトリーで分析した。個体ＡとＢから単離した細胞は、それぞれ９９．１％と
９９．７％の２重陽性細胞を含有した。

【００５３】 混合リンパ球−脳細胞培養。上記したように調製したブタ胚の脳細胞懸濁物を
、２％ＦＣＳを有する１９０μｌのＰＢＳ中の３．０×１０⁶ 細胞を含有するア
リコートに分け、各アリコートに、１．０mlの以下の試薬を加えた：ヒトＩｇＧ
（１０mg/ml）、ヒトＩｇＭ（２．０mg/ml）、ヒト抗Ｇａｌ（１００μg/ml）、
熱不活性化ヒト血清（血液型ＡＢのドナーからプールした）、またはリンパ球培
地（ヘペス、１０％熱不活性化ＦＣＳ、１００IU/ml ペニシリン、１００μg/ml
ストレプトマイシン、および２．０mMＬ−グルタミンを有する９０％ＲＰＭＩ１
６４０；すべてライフテクノロジーズ（Life Technologies））。ヒトＩｇＧ、
ＩｇＭ、および抗Ｇａｌは、使用前にリンパ球培地で希釈した。４℃で６０分後
、細胞を冷リンパ球培地で洗浄（４００ｇ、５分）し、１．０mlのＬｏｗ−Ｔｏ
ｘ−Ｍウサギ補体（１つのバイアルの凍結乾燥した内容物を、１０mlのＰＢＳで
復元した）に再懸濁した。３７℃で６０分間後、細胞を洗浄（４００ｇ、５分）
し、リンパ球培地に再懸濁し、計測した。インキュベーションと遠心分離工程中
に約１５％の脳細胞が失われた。細胞にγ線照射し（４０Ｇｙ）、１００μｌの
リンパ球培地中２．０×１０⁴ 脳細胞を、丸底９６ウェルプレート（ヌンク（Nu
nc））のウェルに入れた。２．０×１０⁵ ヒトＣＤ４ Ｔリンパ球を含有する１
００μｌ容量のリンパ球培地を、脳細胞を有するウェルに三重で加えた。ＣＤ４
Ｔ細胞とリンパ球培地を含有するが脳細胞を含有しないウェルを使用して、Ｃ
Ｄ４ Ｔ細胞のバックグランド増殖活性を測定した。各ウェルに、１．０μＣｉ
［ ³Ｈ］チミジン（アマシャム（Amersham））を、細胞を集める前に加えた。空
気中５％ＣＯ₂ の加湿雰囲気中で３７℃で３〜７日間インキュベート後、ガラス
繊維フィルター上に細胞を採取し、１４５０ミクロベータトリルックス（1450 M
icroBeta Trilux）β−カウンター（ワラック（Wallac）、フィンランド）中で
１５分間計測した。

【００５４】 脳細胞懸濁物を、あらかじめ染色することなくおよびヨウ化プロピオジウム（
１．０μg/mlＰＢＳ；シグマ（Sigma））で染色後、フローサイトメトリーで分
析して、マクロファージ／小グリア細胞および生存細胞の相対数を測定した。暗
所で室温で１０分間後、ヨウ化プロピオジウムを加えた試料を分析した。

【００５５】 フローサイトメトリー。各試料について、ＦＡＣＳortフローサイトメトメー
ター（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson））で１．０×１０⁴ 非ゲー
ティッドイベントを取った。前進スキャター閾値は、亜細胞破片を排除するよう
に設定した。

【００５６】例８について（例４〜７および例４自身も参照されたい） ブタ胚の脳細胞の単離と初代培養。２７日齢のブタの胚から前脳全体を解剖し
、分離し、別に詳述されている（ブレビグ（Brevig）ら、１９９９）ように、ポ
リ−Ｄ−リジン（シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.）、アメリカ合衆国）
被覆培養フラスコ中の、熱不活性化（５６℃、３０分）胎児牛血清（ＦＣＳ）、
Ｌ−グルタミン、アミノ酸、ビタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、およ
び重炭酸ナトリウム（すべてライフテクノロジーズ（Life Technologies））を
補足したアール塩（Earle's Salts）を有するイーグル最小基本培地で増殖させ
た。１０〜１２日間培養（３日ごとに培地を交換）後、脳細胞を切り離し、分離
し、洗浄（１００ｇ、１０分）し、２％ＦＣＳを有するリン酸緩衝化生理食塩水
（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に再懸濁した。

【００５７】 ヒト血清からの抗Ｇａｌの精製。例４のように、しかしブタサイログロブリン
（シグマ（Sigma））を有するビーズ化アガロースを使用して、２０人を越える
健常な血液型ＡＢのドナーからプールした血清からのヒト抗Ｇａｌの精製のみ。

【００５８】 ヒトＣＤ４ Ｔリンパ球の単離。ダイナビ−ズＭ−４５０ ＣＤ４（ダイナル
（Dynal)、ノルウェー）と対応するデタチャビーズ（Detachabead）試薬（ダイ
ナル（Dynal））を使用して、既に記載されている（ブレビグ（Brevig）ら、１
９９７）ように、２人の健常血液ドナーのバッファイーコートからヒトＣＤ４
Ｔリンパ球を単離した。マウス抗ヒトＣＤ３／４ ＦＩＴＣ／ＲＰＥ（ベクトン
ディッキンソン（Becton Dickinson））で染色後、フローサイトメトリーで純度
を分析した。個体ＡとＢから単離した細胞は、それぞれ９９．１％と９９．７％
の２重陽性細胞を含有した。２．０×１０⁵ ヒトＣＤ４ Ｔ細胞を含有する１０
０μｌ容量の培地を、脳細胞または培地のみを有するウェルに三重で加えた。各
ウェルに、１．０μＣｉ［ ³Ｈ］チミジン（アマシャム（Amersham）、英国）を
、細胞を集める２４時間前に加えた。空気中５％ＣＯ₂ の加湿雰囲気中で３７℃
で３〜７日間インキュベート後、ガラス繊維フィルター上に細胞を採取し、１４
５０ミクロベータトリルックス（1450 MicroBeta Trilux）β−カウンター（ワ
ラック（Wallac）、フィンランド）中で１５分間計測した。

【００５９】 ドナー組織の単離と前処理。腹側中脳（ＶＭ）を、頭殿長１９〜２１mmの２７
日齢のブタの胚から解剖した。１６個の胚からの組織片を、０．１％のブタトリ
プシンIX型（カタログ番号Ｔ−０１３４；シグマ（Sigma））と０．０５％のウ
シデオキシリボヌクレアーゼＩ、IV型（カタログ番号Ｄ−５０２４；シグマ（Si
gma））を含有する５．０mlのダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、カタ
ログ番号４１９６６−０１１；ライフテクノロジーズ（Life Technologies）、
スコットランド）にプールし、３７℃で２０分インキュベートし、ＤＭＥＭで５
回洗浄し、０．０５％デオキシリボヌクレアーゼを含有する１．０mlのＤＭＥＭ
中で、徐々に口径が小さくなる炎で磨いたガラスピペットで粉砕した。生じた細
胞懸濁物を、２つのアリコートに分け、６００μｌのＤＭＥＭ中の３００μｇの
ヒト抗Ｇａｌ（５００μg/ml）または６００μｌのＤＭＥＭのみ（対照）を加え
た。４℃で６０分後、細胞懸濁物を、ＤＭＥＭ（２００ｇ、５分）で洗浄し、Ｌ
ｏｗ−Ｔｏｘ−Ｍウサギ補体（１つのバイアルの凍結乾燥した内容物を、１０ml
で復元した、カタログ番号ＣＬ３０５１；セダーレーン（Cedarlane）、カナダ
）に再懸濁し、３７℃で６０分間インキュベートした。次に細胞をＤＭＥＭ（２
００ｇ、５分）で洗浄し、ＤＭＥＭに再懸濁して１．４×１０⁵ 細胞／μｌの濃
度にした。抗Ｇａｌ前処理および対照前処理した細胞懸濁物は、それぞれ９０％
と９２％の生存活性のある細胞（トリパンブルー陰性）を含有した。

【００６０】 ここで、上記段落は、本発明のキットの好適な実施態様であることに注意され
たい。

【００６１】 移植受容体と片側パーキンソン症の誘導。体重２３０〜３４０ｇの２２匹の雄
のルイス（Lewis）ラットを、ヒプノルム（Hypnorm）（クエン酸フェンタニル０
．２０mg/kgとフルアニソン６．３mg/kg、腹腔内投与；ヤンセン（Janssen）、
ベルギー）およびドルミクム（Dormicum）（ミダゾラム４．２mg/kg、腹腔内投
与；ホフマン−ラロシュ（Hoffmann-La Roche）、スイス）で麻酔し、両耳線の
下３．９mmに歯棒をセットしたコプフ（Kopf）定位枠に入れた。３２mMの６−水
酸化ドパミン塩酸（シグマ（Sigma））と１．０％アスコルビン酸を１．０μｌ
／分で、前頂と脳硬膜に対して以下の座標で注入して、ドパミン作用性黒質線条
体経路の片側の病変を作成した：後ろへ２．８mm、右へ２．０mm、および腹部へ
８．４mm。手術の完了時に、術後の疼痛を緩和するために、テムゲシック（Temg
esic）（ブプレノルフィヌム（buprenorphinum）０．１０mg/kg、筋肉内；レキ
ットアンドコールマン（Reckitt & Colman）、英国）を与えた。６週間後、Ｄ−
アンフェタミン硫酸（２．５mg/kg、腹腔内投与；シグマ（Sigma））に応答した
動物の旋回行動を、既に記載されている（ウンゲルステット（Ungerstedt）ら、
１９７０）ように自動ロータメーターシリンダー中で９０分試験し、１６匹のラ
ット（すべて病変と同側性のネットで８回／分の回転を有する）を、等回転速度
の２群（ｎ＝８）に割り当てた。

【００６２】 線条体移植。６−ヒドロキシドパミンの注入７週間後、抗Ｇａｌ前処理または
対照前処理ＶＭ細胞を有する３．０μｌＤＭＥＭを１．０μg/分で、前頂と脳硬
膜に対して以下の座標で投与した：前へ０．７mm、右へ２．６mm、および腹部へ
４．７mm（両耳線の下２．５mmに歯棒）。上記したように動物を麻酔し、疼痛を
和らげた。移植後３、７および１０週間目に、上記したようにＤ−アンフェタミ
ン硫酸に対する旋回を評価し、各時点についてマンホイットニー（Mann-Whitney
）統計的検定（ｐ＝０．０３）を行った（両側ｐ値は、ｚ統計量を使用して推定
した）。

【００６３】 組織処理と免疫組織化学。移植の１０週間後に、ペントバルビタールを過剰投
与し、０．１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中４％パラホルムアルデヒドを心
臓に潅流してすべてのラットを屠殺した。潅流後、脳を同じ固定液に６０分浸漬
し、０．１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の２０％ショ糖で一晩低温保護し
、二酸化炭素ガス中で凍結した。４つの並行シリーズの３０μ厚の凍結切片を切
断し、ゼラチン被覆ガラススライドにのせた。全シリーズの切片を、トリス緩衝
化食塩水（ＴＢＳ、ｐＨ７．４）中１０％ＦＣＳで３０分インキュベートし、次
に１％トリトンＸ−１００（シグマ（Sigma））を有するＴＢＳ中の以下の１つ
の１次抗体とインキュベートした：マウス抗ウシ神経繊維−７０ＩｇＧ₁ （１：
１０００；クローンＤＰ．５．１１２；エル・ソリアーノ（L. Soriano）博士か
ら購入、フランス（soriag@aol.com））、ポリクローナルウサギ抗ラットチロシ
ンヒドロキシラーゼ（１：２５０；ペルフリーズバオロジカルズ（Pel-Freez Bi
ologicals）、アメリカ合衆国）、またはマウス抗ラットＣＤ４５ ＩｇＧ₁ （
１：１００；クローンＭＲＣ ＯＸ−１；セロテック（Serotec）、英国）。神
経繊維とチロシンヒドロキシラーゼ抗体は、互いのブタ抗原と交差反応すること
が知られているが、神経繊維抗体は、齧歯類神経繊維と反応しない。１％トリト
ン−Ｘ１００を有するＴＢＳ中で３×１５分洗浄後、切片を、ビオチン化ヒツジ
抗マウスＩｇ（１％トリトン−Ｘ１００を有するＴＢＳ中１：２００；アマシャ
ム（Amersham））またはビオチン化ロバ抗ウサギＩｇ（１％トリトン−Ｘ１００
を有するＴＢＳ中１：２００；アマシャム（Amersham））で、２０℃で６０分イ
ンキュベートし、１％トリトン−Ｘ１００を有するＴＢＳで３×１５分洗浄し、
メタノール中０．０６％過酸化水素で３０分処理して、内因性ペルオキシダーゼ
をブロックし、１％トリトン−Ｘ１００を有するＴＢＳで３×１５分洗浄し、ペ
ルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（１０％ＦＣＳを有するＴＢＳ中１：２
００；ダコ（DAKO））で６０分インキュベートした。洗浄を繰り返した後、褐色
の沈殿物が出現するまで、０．００９％過酸化水素を有するＴＢＳ中０．０５％
の３，３’−ジアミノベンジジン（シグマ（Sigma））を切片に適用した。最後
に切片を蒸留水で洗浄し、アルコールで脱水し、キシレンで清澄化し、デペック
ス（Depex）封入剤（ＢＤＨラボラトリー（BDH Laboratory）、英国）でカバー
ガラスをのせた。

【００６４】例１−マクロファージ／小グリア細胞は培養で自己蛍光性となるが、星状細胞は ならない ２８日齢のブタ胎児の非染色脳細胞を、単離直後（Fresh）または初代培養で
１４日後（Cultured）フローサイトメトリーで分析した（図１）。プロットＡと
Ｂは、細胞の緑とオレンジの蛍光を示す。ヒストグラムＣとＤは、緑の蛍光の関
数としての細胞の頻度を示し、同一のマーカー（Ｍ１）とマーカー内に存在する
総細胞数のパーセントを示す。プロットＢは、自己蛍光性（Ｒ１）と非自己蛍光
性（Ｒ２）の細胞集団を規定するために設定した領域であり、プロットＥとＦは
、自己蛍光性（Ｒ１）と非自己蛍光性（Ｒ２）細胞のサイズ（前進スキャッター
）と粒度（側面スキャッター）を示す。

【００６５】 非染色細胞のフローサイトメトリー分析では、新たに単離したブタの胎児脳細
胞は、自己蛍光の無い細胞の単一の集団として現れ、一方これらの細胞の初代培
養物（星状細胞およびマクロファージ／小グリア細胞の増殖を促進するために調
製した）は、２つの細胞集団からなった：非自己蛍光性細胞のより大きい集団と
、自己蛍光性細胞のより小さい集団。自己蛍光性細胞は、非自己蛍光性細胞より
粒状であった（図１）。

【００６６】 ２８日齢の胎児ブタ脳から単離した脳細胞を、初代培養で１４日間増殖させた
。細胞を、ＦＩＴＣ結合（緑の蛍光）またはＲＰＥ結合（オレンジの蛍光）抗体
を使用して免疫染色した（図２）。イソタイプ対照（ＩＣ）ＩｇＧ₁ は、ＣＤ１
８とＣＤ５６染色の陰性対照であり、イソタイプ対照ＩｇＧ_2aは、ＣＤ４４とＣ
Ｄ４染色の陰性対照である。細胞を固定し、透過性にしてから、ＧＦＡＰについ
て染色した。ＧＦＡＰ対照は、２次抗体のみを与えた試料である。プロットＧと
Ｈに領域を設定して、自己蛍光性細胞と非自己蛍光性細胞のＧＦＡＰ染色を比較
した。任意の単位の平均の緑の蛍光：Ｇ_R1＝１５１、Ｇ_R2＝１９９、Ｈ_R1＝２４
、およびＨ_R2＝１３１。３５日齢の胎児ブタからの培養脳細胞で、同様の結果が
得られた。

【００６７】 自己蛍光性細胞のみがＣＤ１８陽性であり、非自己蛍光性細胞のみがＣＤ５６
陽性であったが、両方の集団はＣＤ４４陽性であった。ＣＤ４に対する抗体は、
自己蛍光性細胞の一部を染色したが、非常に弱かった。非自己蛍光性細胞は、自
己蛍光性細胞より、星状細胞マーカーグリア線維酸性タンパク質（グリア線維酸
性タンパク質ＧＦＡＰ）に対する抗体により、より強く染色された（図２）。

【００６８】 ２８日齢のブタ胎児から単離した培養脳細胞を、フルオレセイン標識大腸菌（
E. coli）とインキュベートした（図３）。図は、大腸菌（E. coli）の食作用を
示す。プロットＡは、フローサイトメトリーの３０分前にフルオレセイン標識大
腸菌（E. coli）（緑の蛍光）を与えた培養物からの細胞を示し、プロットＢは
、未処理培養物からの細胞を示す。共焦点レーザー顕微鏡画像は、親油性および
蛍光性ＤｉＩで染色後、フルオレセイン標識大腸菌（E. coli）と２重チャネル
走査した細胞の断面を示す。赤の疑似カラーは、ＤｉＩ（ローダミン光学フィル
ターセット）で染色した膜と他の脂質、および黄色の疑似カラーは、フルオレセ
イン標識大腸菌（E. coli）（フルオレセイン光学フィルターセット）を示す。
スケール棒：１０μｍ。フルオレセイン標識大腸菌（E. coli）とインキュベー
トした脳細胞培養物のフローサイトメトリー分析は、自己蛍光性細胞集団が、ド
ットプロットの緑蛍光軸に沿って２つに分かれ、非自己蛍光性細胞集団は１つの
まま維持されたことを示す（図３）。蛍光顕微鏡で観察すると、細菌の緑の蛍光
は、原形質膜と結合していなかった（示していない）。親油性で蛍光性のＤｉＩ
で染色し、次にフルオレセイン標識大腸菌（E. coli）とインキュベートした培
養物では、共焦点レーザー顕微鏡は、大部分の細胞がＤｉＩによりわずかに染色
されたことを示す。しかし一部の細胞は、細胞の境界内に蛍光性大腸菌（E. col
i）を持っていた（図３）。

【００６９】 星状細胞とマクロファージ／小グリア細胞の増殖を促進する条件下で培養（カ
ルテラノ（Castellan）ら、１９９１）したブタの胎児脳細胞は、フローサイト
メトリーで分析すると、自己蛍光性細胞と非自己蛍光性細胞の両方からなってい
た。自己蛍光は、マクロファージの公知の性質（ハベニス（Havenith）ら、１９
９３；ニコド（Nicod）ら、１９８９）であり、内因性フラボタンパク質（アウ
ビン（Aubin）ら、１９７９；ベンソン（Benson）ら、１９７９）が原因かも知
れない（これは、本研究で使用した４８８nmレーザーにより励起され、スペクト
ルの緑とオレンジの範囲で発光する）。自己蛍光性細胞は、再度マクロファージ
に典型的な高い粒状性を有していた。自己蛍光性細胞がマクロファージであるか
どうかを決定するために、我々は、星状細胞またはマクロファージに反応するこ
とが知られている抗体で培養細胞を染色し、細胞を食作用について試験した。自
己蛍光性細胞は、ＣＤ１８⁺ ＣＤ４４⁺ ＣＤ５６^- ＧＦＡＰ^- であり、これらの
細胞が確かに、マクロファージまたは小グリア細胞であることを強く示唆してい
る。マクロファージと小グリア細胞を区別するマーカーが無いため、我々は、こ
れらの細胞をマクロファージと呼ぶが、これは脳の発生の初期段階では一般的に
行われる（ペリー（Perry）ら、１９８８）。非自己蛍光性細胞は、ＣＤ１８^-
ＣＤ４４⁺ ＣＤ５６⁺ ＧＦＡＰ⁺ であり、これらの細胞が確かに、星状細胞であ
ることを強く示唆している。培養脳細胞をフルオレセイン標識大腸菌とインキュ
ベートした後、自己蛍光性細胞集団は、ドットプロットの緑蛍光軸に沿って２つ
に分かれ、かつ蛍光顕微鏡と共焦点レーザー顕微鏡は、細胞内に蛍光性細菌がい
ることを明らかにし、自己蛍光性細胞による食作用活性の強い証拠を示した。そ
の表現型特性と食作用活性に基づき、我々は、自己蛍光性細胞がマクロファージ
／小グリア細胞であり、非自己蛍光性細胞が星状細胞であると結論する。

【００７０】例２−マクロファージ／小グリア細胞はヒトＴリンパ球の増殖を誘導するが、星 状細胞は誘導しない ２８日齢の胎児ブタ脳から単離した脳細胞を、初代培養で１４日間増殖させ、
ＲＰＥ結合抗ＣＤ５６（オレンジの蛍光）で染色後フロー選別した（図４）。Ａ
．純度と生存活性。さらに染色することなく細胞をフローサイトメトリーにより
分析して純度を決定（ＣＤ５６陰性マクロファージを含めるために領域Ｒ１を設
定した）し、ヨウ化プロピオジウム（オレンジの蛍光）で染色して生存活性を決
定した。記載した番号は、領域Ｒ１内の細胞のパーセントである。星状細胞集団
の生存活性は、９１％であった（トリパンブルー排除により測定した）。Ｂ．ヒ
トＴ細胞増殖を誘導する能力。同種の単核血液細胞（ＭＢＣ；Ｈ−８０５３）、
選別した星状細胞、および選別したマクロファージにγ線照射（５０Ｇｙ）をし
て、その増殖を止め、２人のヒト（Ｈ−３９７０とＨ−３９７７）のいずれかか
らのリンパ球と混合した（１つの組合せについて３ウェル）。陰性対照として、
リンパ球を刺激物質無しでインキュベートした（１つの組合せについて１２ウェ
ル）。増殖活性は、４日間の同時培養後の［ ³Ｈ］チミジン取り込みにより測定
した。棒は、平均と平均の標準誤差を示す。

【００７１】 リンパ球の増殖活性は、同種の単核血液細胞と同時培養した時より、選別した
マクロファージと同時培養した時により高かった。２人のヒトのいずれかからの
選別した星状細胞とリンパ球の同時培養では、リンパ球のみを有するウェル中よ
り、リンパ球と星状細胞を有するウェル中でわずかに高かったが、その差は、１
人についてのみ統計的に有意であった。各個人についてＡＮＯＶＡを行った：Ｆ _H-3970 （ｄｆ３，１７）＝１３９、ｐ＝３．８×１０^-12 およびＦ_H-3977（ｄｆ
３，１７）＝２１６、ｐ＝１．０×１０^-13 。刺激物質細胞を、片側の対応の無
いｔ検定で比較すると、個人Ｈ−３９７７からのリンパ球については星状細胞と
培地の刺激活性を比較した時（ｐ＝０．０８）以外は、対応の無いｔ検定とすべ
てのｐ値は０．００１未満であった。

【００７２】 フロー選別により、高度に濃縮されたマクロファージ集団（マクロファージは
７．６％から９１％に増加）と高度に精製された星状細胞集団（９９％を越える
星状細胞）が得られ、選別した細胞の数パーセントのみが死滅していた。選別し
たマクロファージは、ヒトＴ細胞増殖の強いインデューサーであり、同種の単核
血液細胞より強かった。選別した星状細胞は、非常に弱い刺激物質であり、２人
のヒトの１人では、Ｔ細胞増殖は、バックグランド増殖活性より有意に高かった
。

【００７３】例３−α−ガラクトシルエピトープはマクロファージ／小グリア細胞上に発現さ れ、ニューロン上には発現されない ブタの胚ＶＭ細胞（ニューロン、グリア、および内皮細胞を含む）を、ビオチ
ン化バンデレイア・シンプリシフォリア（Bandereia Simplicifolia）イソレク
チンＢ４（ＢＳ−ＩＢ４）を使用して、α−ガラクトシルエピトープの発現につ
いてフローサイトメトリーにより分析した（図５Ａ）。対照と比較すると脳細胞
のバルク集団について、１対数未満の蛍光のわずかなシフトが見られた（ＦＩＴ
Ｃ結合アビジンのみ）。これは、少なくとも２つの１０対数ステップの対数スケ
ールで右へのシフトが見られるＰＬＭＥＣのＢＳ−ＩＢ４染色に匹敵する（図５
Ｂ）。

【００７４】 フローサイトメトリーデータを証明するために、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離
後に、ＶＭ、ＰＬＭＥＣおよびＥＣＶ細胞の細胞膜から単離されたＢＳ−ＩＢ４
反応性の可溶化糖タンパク質についてウェスタンブロット分析を行って、α−ガ
ラクトシルエピトープを有する可能なタンパク質を検出した。ＰＬＭＥＣは、高
レベルのα−ガラクトシルエピトープを発現することが証明された（図６）（高
分子量（＞２２０kDa）から低分子量（≦３０kDa）の範囲の分子量を有する成分
の染色により示されるように、いくつかの異なるタンパク質骨格について行った
エピトープ）。検出は、化学発光により行い、２つのブロットは、それぞれ５秒
および１０秒の露出を示す。より長時間露出（＞１０秒）すると、約１５０kDa
サイズの成分のＶＭレーンに弱い染色が見られた。これらの条件下で、同様のサ
イズと染色強度の成分が、ＥＣＶ膜タンパク質の中に見られた（図６）。

【００７５】 個体のＶＭ細胞集団上のα−ガラクトシルエピトープの分布を、ＢＳ−ＩＢ４
免疫組織化学を使用して調べた。図７は、チロシンヒドロキシラーゼについて免
疫組織化学的に染色した２７日齢のブタの胚のＶＭの矢状方向断面を示し、これ
は、ドパミン作用性ニューロン中のドパミン産生の律速酵素である。細胞体と一
部の軸索繊維が見られる（図７Ａ）。２７日齢のブタの胚の冠状切片の低倍率拡
大は、ペルオキシダーゼ結合ＢＳ−ＩＢ４イソレクチンを使用して、免疫組織化
学的に染色された（図７Ｂ）。

【００７６】 高倍率では、胚脳の微小血管内皮細胞の強い染色（図７Ｂ）と、小グリア細胞
／組織に存在するマクロファージのやや弱い染色（図７Ｃ）がある。ニューロン
またはグリア細胞では顕著な染色は見られない。パネルＣでＢＳ−ＩＢ４染色細
胞と形態の似た細胞の染色が、単球／組織マクロファージに特異的なマウスモノ
クローナル抗体で見られ、これはまたブタ小グリア細胞に結合する（図７Ｄ）。

【００７７】 ＶＭ膜タンパク質の染色（これは、ＥＣＶタンパク質の染色とほぼ同じ強度で
あった）は、α−Ｇａｌに関連した決定基の認識が原因かも知れない。しかしイ
ソレクチン組織化学は、ほとんどのα−Ｇａｌ発現が、胎児ブタ脳組織では内皮
細胞と小グリア細胞／マクロファージに限定されており、ニューロンや星状細胞
には無いことを示した（図７）。成体マウスの脳中のＢＳ−ＩＢ４反応性はまた
、毛細管に限定されていることが証明されている（ピーターズ（Peters）ら、１
９７９）。従ってウェスタンブロッティング実験で低レベルの発現のより可能性
のある説明は、α−Ｇａｌ発現細胞は、ＶＭ中の細胞の総数のほんの一部である
ということである。

【００７８】例４−ヒト血清からの抗体の精製 ２０人を越える血液型ＡＢドナーからプールした血清から、それぞれヤギ抗ヒ
トＩｇＧ（Ｆｃ特異的；シグマ（Sigma）、アメリカ合衆国）、ヤギ抗ヒトＩｇ
Ｍ（μ−鎖特異的；シグマ（Sigma））、またはブタサイログロブリン（α−ガ
ラクトシルエピトープの供給源；シグマ（Sigma））を有するビーズアガロース
を使用して、ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、および抗Ｇａｌを精製した。５ｍlのスラリ
ー（２．５mlの充填したビーズ）を、直径１０mmのカラムに注ぎ、ＰＢＳで洗浄
した。熱不活性化ヒト血清（４０ml）を、ペリスタポンプを使用して０．５ml／
分で適用し、アガロースを、数カラム容量のＰＢＳで洗浄し、結合したタンパク
質を、０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ＝２．５）で１．０ml／分で溶出した。
０．１mlの中和緩衝液（１．５Ｍトリス／塩酸、ｐＨ＝８．８）を含有する試験
管中に、１ml画分を集めた。２８０nmの吸光度を分光学的に読み、タンパク質を
含有する試験管の内容物をプールし、１％ＰＢＳに対して透析し、凍結乾燥し、
蒸留水（溶出容量の１／１００）に再懸濁した。タンパク質濃度は、ＢＣＡプロ
テインアッセイ試薬キット（ピアス（Pierce）、アメリカ合衆国）を使用して、
製造業者の説明書に従って測定した。

【００７９】 ＩｇＧとＩｇＭ調製物の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した：各試料４．
０μｇを、ＳＤＳ還元または非還元緩衝液中で５分間沸騰させ、既製の４−１５
％連続ゲル（バイオラッド（Bio-Rad）、アメリカ合衆国）に入れた。電気泳動
後、製造業者の説明書に従ってゲルを銀染色キット（バイオラッド（Bio-Rad）
）を使用して染色した。ＩｇＧレーンにはＩｇＭバンドは現れなかったが、Ｉｇ
Ｍレーンには弱いＩｇＧバンドが存在した。

【００８０】 ブタサイログロブリン（thyroglobulin）を使用してヒト血清から精製した抗
体のα−ガラクトシルエピトープ反応性を、５．０×１０⁵ のラージ（Raji）細
胞（ヒトバーキットリンパ腫細胞株）またはブタα１，３−ガラクトシルトラン
スフェラーゼ遺伝子（ラージ−ＧＴ細胞）を安定に発現するようにトランスフェ
クションし選択されたラージ細胞を、１０μｇの精製抗体を含むまたは含まない
１００μlのＰＢＳ中でインキュベートすることにより、評価した。４℃で６０
分後、細胞をＰＢＳで１回洗浄（２５０ｇ、５分）し、ウサギ抗ヒトＩｇＧＦ(a
b')₂ＦＩＴＣ（１：１０；ダコ（DAKO）、デンマーク）またはウサギ抗ヒトＩｇ
ＭＦ(ab')₂ＦＩＴＣ（１：１０；ダコ（DAKO））と、４℃で６０分インキュベー
トし、ＰＢＳで２回洗浄（２５０ｇ、５分）し、フローサイトメトリーで分析し
た。ラージ−ＧＴ細胞上のα−ガラクトシルエピトープの発現は、ラージ−ＧＴ
細胞とラージ細胞を３．０μｇのＦＩＴＣ結合ＢＳ−ＩＢ４で染色して証明した
。ラージ−ＧＴ細胞株のトランスフェクションと選択は、クマガイ−ブリーチ（
Kumagai-Braesch）ら（１９９８）により記載されている。

【００８１】例５−α−ガラクトシルエピトープを発現する胚ブタ脳組織から培養したマクロ ファージ／小グリア細胞 ブタ胚の脳細胞を、培地中の高血清含量（例１に示すように、自己蛍光性マク
ロファージ／小グリア細胞および非自己蛍光性星状細胞を産生する条件）の初代
培養中で増殖させた。

【００８２】 培養細胞を、染色せずに、およびＦＩＴＣ結合バンデレイア・シンプリシフォ
リア（Bandereia Simplicifolia）イソレクチンＢ４（ＢＳ−ＩＢ４ ＦＩＴＣ
）で染色した後に、フローサイトメトリーで分析した。ドットプロットは、緑の
蛍光（ＦＬ１）とオレンジの蛍光（ＦＬ２）の強度を示し（図８）、自己蛍光性
マクロファージ／小グリア細胞（ｍ）を非自己蛍光性星状細胞（ａ）から分離す
る線を有する。染色により、マクロファージ／小グリア細胞について１１６７単
位、および星状細胞について１６単位、緑の蛍光の幾何平均が増加した。従って
マクロファージ／小グリア細胞は、α−ガラクトシルエピトープを発現するが、
星状細胞の弱い染色が低α−ガラクトシルエピトープ発現を反映するのかまたは
ＢＳ−ＩＢ４ ＦＩＴＣの非特異結合を反映するのかは不明である。軸は対数ス
ケールであることに注意されたい。顕微鏡写真（３００×）は、培養した脳細胞
が、固定され、透過性になり、ビオチン化ＢＳ−ＩＢ４とペルオキシダーゼ結合
ストレプトアビジンに染色されたことを示す。ＢＳ−ＩＢ４陽性細胞は丸く、Ｄ
ＡＢ染色産物は細胞膜上に濃縮されている。

【００８３】 マケンジー（McKenzie）ら、１９９５により示されるように、ブタの組織を培
養するとα−ガラクトシルエピトープ発現は変化するが、胚ブタ脳からのマクロ
ファージ／小グリア細胞は、培養物中でそのα−ガラクトシルエピトープ発現を
維持した（図８）。

【００８４】例６−ヒト血清とウサギ補体は、培養した新たに単離されたブタ胚の脳細胞から マクロファージ／小グリア細胞を除去する 分離した脳組織をアリコートに分け、その１つは、ヒト血清とウサギ補体で処
理した後１０日間培養し、別の１つは、培養後に同じ処理を行った。これらの細
胞および未処理の培養細胞を、あらかじめ染色せずにフローサイトメトリーで分
析して、マクロファージ／小グリア細胞の含量を比較した。図９では、ヒストグ
ラムは、緑の蛍光強度（ＦＬ１）の関数としての細胞の頻度を示し、自己蛍光性
マクロファージ／小グリア細胞と、マーカー内の細胞のパーセントを規定するた
めの同一のマーカー（Ｍ１）を含有する。新たに単離された細胞および初代培養
で増殖させた細胞に適用する時の両方とも、ヒト血清とウサギ補体による処理で
、マクロファージ／小グリア細胞の相対数が減少した。

【００８５】例７−抗Ｇａｌと補体によるブタの脳細胞の処理は、マクロファージ／小グリア 細胞の含量と、ヒトＣＤ４ Ｔリンパ球増殖を誘導する能力とを低下させる ラージ細胞（Raji）とブタのα１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼを発
現するようにトランスフェクションしたラージ細胞（従って、α−ガラクトシル
エピトープ；Ｒａｊｉ−ＧＴ）を、α−ガラクトシルエピトープに対する抗体（
例４で記載したように正常血清から精製した；図１０ではａＧａｌとした）とと
もに、または抗体無しでインキュベートし、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧ（ａＩｇ
Ｇ）またはＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＭ（ａＩｇＭ）で染色した。Ｒａｊｉ−ＧＴ
細胞上のα−ガラクトシルエピトープの発現は、これらとラージ細胞をＦＩＴＣ
結合ＢＳ−ＩＢ４で染色して証明した。精製した抗体は、Ｒａｊｉ−ＧＴ細胞と
反応するがラージ細胞とは反応しないＩｇＧとＩｇＭの両方を含有した。ａＩｇ
ＧとａＩｇＭによるＲａｊｉ−ＧＴ細胞の非特異的染色は、最小であったが、こ
うして精製した抗体は、α−ガラクトシルエピトープと反応性のＩｇＧおよびＩ
ｇＭの両方を含有した（図１０）。

【００８６】 ブタ胚の脳細胞を、初代培養で１２日間増殖させ、分離し、ヒトＩｇＧ（図１
１中の丸）、ヒトＩｇＭ（図１１中の四角）、ヒト抗Ｇａｌ（図１１中の三角）
、ヒト血清（図１１中の菱形）、または培地（図１１中の黒丸）でインキュベー
トした。ヒトＩｇＧ、ＩｇＭおよび抗Ｇａｌは、例４に記載したように調製した
。４℃で６０分後、細胞を洗浄し、ウサギ補体を有する培地に再懸濁し、３７℃
で６０分インキュベートし、再度洗浄し、γ線照射してその増殖を止め、高度に
精製したヒト末梢血ＣＤ４ Ｔ細胞と混合した。ＣＤ４ Ｔ細胞はまた、脳細胞
の非存在下でも増殖させて、バックグランド増殖活性を測定した（図１１中のバ
ツ印）。増殖は、トリチウム化チミジンの取り込みとして測定し、三重測定の平
均をカウント／分（cpm）として図１１に示す。棒は、１ＳＥＭを示す。α−ガ
ラクトシルエピトープと反応性とＩｇＧおよびＩｇＭは、抗Ｇａｌ調製物中に存
在した（図１０）。マクロファージ／小グリア細胞の含量と細胞生存活性に及ぼ
す異なる脳細胞調製物の影響を、以下の表１に示す。

【００８７】

【００８８】 ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＭ、ヒト抗Ｇａｌ、またはヒト血清およびウサギ補体で
処理した培養したブタ胚の脳細胞は、ヒトＣＤ４ Ｔ細胞の増殖を誘導せず、一
方、培地とウサギ補体で対照処理を行った脳細胞は、ヒトＣＤ４ Ｔ細胞で有意
な増殖応答を誘導した（図１１）。

【００８９】 ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＭ、ヒト抗Ｇａｌ、およびヒト血清は、マクロファージ
／小グリア細胞の除去について同等に有効ではなかった（表１）が、残りの脳細
胞に対するＣＤ４ Ｔ細胞の増殖応答は、バックグランド活性より高かった（図
１１）。これは、閾値が存在することを示し、これより低いと、マクロファージ
／小グリア細胞が少なくなりすぎて、インビトロでおよびおそらくインビボでも
Ｔ細胞応答を誘発できないことを示唆する。

【００９０】 ブタ胚の脳細胞へのヒトＣＤ４ Ｔ細胞応答を研究するために、インビトロモ
デルを使用した（図１２）。培養細胞のみ（新たに単離した細胞は含まない）が
ヒトＴ細胞の増殖を誘導する（ブレビグ（Brevig）ら、１９９７）ため、脳細胞
を初代培養で増殖させてからヒトＣＤ４ Ｔ細胞と同時培養した。本明細書に記
載の条件で培養すると、脳内移植（メーソン（Mason）ら、１９８６；デュアン
（Duan）ら、１９９５）のように、ＭＨＣ抗原の発現をアップレギュレートする
（ブレビグ（Brevig）ら、１９９９）。

【００９１】 図１２は、臨床状況と本発明者らが使用したインビトロモデルでの、分離した
ブタの脳組織に及ぼす抗Ｇａｌと補体（Ｃ）の影響のまとめを示す。ブタの胚か
らの分離した脳組織は、ニューロン（Ｎ）、星状細胞（Ａ）、マクロファージ／
小グリア細胞（Ｍ）、および内皮細胞（Ｅ）を含有する。後者の２つの細胞型は
、α−ガラクトシルエピトープ（α−Ｇａｌ）を発現し、移植前に除去すると、
ドナー組織が、いったん移植されたＭＨＣ抗原（特にクラスII）をアップレギュ
レートする可能性を大幅に低下させる。高血清含量の培地での初代培養は、星状
細胞とマクロファージの増殖を促進し、ＭＨＣ抗原の発現をアップレギュレート
する。従って、これらの条件下で培養した分離したブタの脳組織は、インビトロ
でのブタの神経異種移植片に対するヒトＴ細胞応答を研究するのに使用すること
ができる。

【００９２】 本発明者らのアプローチ（図１２に示す）は、（ｉ）α−ガラクトシルエピト
ープを標的とすることである、なぜならこれは、新鮮なブタの脳組織中でマクロ
ファージ／小グリア細胞（しかしニューロンではない）上で発現されるからであ
る（スミトラン（Sumitran）ら、１９９９）、および（ii）抗体および補体性溶
解を使用することである、なぜなら、小細胞塊内のマクロファージ／小グリア細
胞さえ、この機序により除去することができるからである。

【００９３】 α−ガラクトシルエピトープは、胚のブタ脳中で内皮細胞上に豊富に発現され
ている（スミトラン（Sumitran）ら、１９９９）ため、およびブタ大動脈内皮細
胞は、抗Ｇａｌと補体による溶解に感受性である（ボーガン（Vaughan）ら、１
９９４）ため、分離したブタの脳組織を抗Ｇａｌと補体で前処理すると、おそら
く内皮細胞が除去される。培養物中では、ブタの大動脈内皮細胞は、クラスＩ（
しかし、クラスIIではない）ＭＨＣ抗原を構成的に発現し、ヒトＣＤ８（しかし
、ＣＤ４ではない）Ｔ細胞の増殖を誘導する（ムレイ（Murray）ら、１９９４）
。ヒト腫瘍壊死因子−α（これは、手術で誘導した炎症のために神経移植片中に
存在するかも知れない）で培養した後に、ブタ大動脈内皮細胞はまた、ＭＨＣク
ラスII抗原を発現し、ヒトＣＤ４ Ｔ細胞の増殖を誘導する（バッテン（Batten
）ら、１９９６）。従って内皮細胞の除去は、神経異種移植片の生存に有効であ
るが、ドナー由来の内皮細胞が、ヒトの異種移植片の新血管新生に必要であるか
どうかは不明である。しかし同種のラットモデルでは、全懸濁移植片および小グ
リア細胞と内皮細胞を枯渇させた移植片は、宿主の小グリア細胞による新血管新
生とコロニー形成という点で、同等に成長した（ペネル（Pennell）とストレイ
ト（Streit）、１９９７）。

【００９４】例８−ラット中のブタの神経異種移植片の生存と機能に及ぼす前処理の影響 ６−ヒドロキシドパミン誘導片側パーキンソン症の免疫適格ラットに、抗Ｇａ
ｌと補体または培地と補体（対照）で処理した分離したＶＭ組織を移植し、移植
片の機能的影響を、移植後１０週目に動物を屠殺するまで経時的に追跡した（図
１３）。抗Ｇａｌと補体で前処理したＶＭ細胞を移植した８匹のラットのうち５
匹では、１０週間の追跡中に、アンフェタミン誘導性の旋回行動の５０％を越え
る低下が起きた。＊移植の時間を越えて進行したこの受容体の病変。†ドパミン
作用性ニューロンのいくつかの塊を有する大きな移植片（図１４に写真を示す）
。‡少ないドパミン作用性ニューロンの小さい移植片。対照前処理したＶＭ細胞
を与えられた８匹のラットのいずれも、この程度の改善を示さなかった。組織学
的分析は、対照群の１匹の動物（示していない）で、マクロファージが密に浸潤
したわずかのドパミン作用性ニューロンを含有する小さい移植片を明らかにし、
抗Ｇａｌと補体で前処理したＶＭ細胞を与えられた１匹の動物で、ドパミン作用
性ニューロンのいくつかの塊を含有する大きな移植片（図１４）を明らかにした
。残りの動物は、移植片を完全に拒絶した。（Ａ）は、移植片中のブタの神経繊
維の均一な分布を示す。（Ｂ）染色された細胞体が塊を形成し、移植片−宿主界
面に存在するチロシンヒドロキシラーゼ（ドパミン作用性ニューロンのマーカー
）が染色された切片（これは、分離したＶＭ組織の線条体内移植片に共通である
）。（Ｃ）高倍率のドパミン作用性細胞体（矢印）。（Ｄ）は、移植片−宿主界
面の血管の周りの宿主白血球（ＣＤ４５について染色）による浸潤を示す（矢印
）。Ｇｒ、移植片。Ｓｔｒ、宿主線条体。スケール棒：２５０μｍ（ＡとＢ）、
および２５μｍ（ＣとＤ）。

【００９５】 従来の研究は、前処理していないブタの胚ＶＭ移植片が、片側パーキンソン症
の免疫適格ラットで行動的影響を誘導するかどうかについて一致しておらず（バ
ーカー（Barker）ら、２０００；ラーソン（Larsson）ら、２０００；ガルペル
ン（Galpern）ら、１９９６）、ドナー−組織前処理を試験するためにドナー材
料の同一のアリコートを使用することの重要性を強調している。抗Ｇａｌと補体
で前処理した移植片からの機能的利点は、移植後７週間に観察され、これは他の
研究と一致し（バーカー（Barker）ら、２０００；ラーソン（Larsson）ら、２
０００；ガルペルン（Galpern）ら、１９９６；フファカー（Huffaker）ら、１
９８９）、非前処理ブタの胚ＶＭ移植片からの機能的利点は、免疫抑制ラットで
７〜９週間後に起きた。

【００９６】 従来２つの研究が、脳組織の免疫原性を低下させることを試みた。バートレッ
ト（Bartlett）ら、は、インターフェロンγで培養してネズミの胚神経細胞上の
ＭＨＣ抗原をアップレギュレートし、フロー選別によりＭＨＣクラスＩ陽性細胞
を枯渇させるが、同種マウスの脳中の移植片の生存を改善することを示した（バ
ートレット（Bartlett）ら、１９９０）。分離したブタの胚脳組織の前処理とし
て、パクザバン（Pakzaban）らは、抗体の２価抗原結合断片によりＭＨＣクラス
Ｉ抗原をマスクし、ラット脳での移植片生存の改善を見いだした（パクザバン（
Pakzaban）ら、１９９５）。ブタ胚の脳細胞上のＭＨＣクラスＩ抗原をマスクす
ることは、ヒトＣＤ８ Ｔ細胞の増殖応答を、インビトロで約５０％低下させる
（ダーシモニアン（DarSimonian）ら、１９９９）。しかしＭＨＣ抗原は、新鮮
な脳組織中では非常に低レベルにしか存在せず（ランプソン（Lampson）、１９
９５）、移植後アップレギュレートされる（ウィドナー（Widner）ら、１９８８
；ヂュアン（Duan）ら、１９９５；メーソン（Mason）ら、１９８６）（図１２
）ため、ドナー組織前処理の最適の標的ではない。

【００９７】 我々は、抗Ｇａｌと補体による前処理は、ブタ神経組織の免疫原性を低下させ
ると結論する。臨床状況においてこの前処理から予測されることを推定するため
には、前処理したブタ神経組織を旧世界ザルの脳に移植することが必要であろう
。それは、これらの霊長類は、ヒトの免疫応答に匹敵する細胞性および体液性免
疫応答（特に、ブタの移植片への直接および間接Ｔ細胞応答の寄与）を有すると
考えられる（ブレビグ（Brevig）ら、２０００）ためである。抗Ｇａｌと補体に
よる前処理は、免疫抑制に対する有効な代替法または補足となり得、現在の免疫
抑制剤と異なり、副作用は無いと予想される。さらに免疫抑制と同様に、細胞性
免疫拒絶を低下させる他の方策（例えばＭＨＣクラスＩマスキング（パクザバン
（Pakzaban）ら、１９９５））およびセルトリ細胞同時移植（サンバーグ（Sanb
erg）ら、１９９６）および補体応答を低下させる方策（コッジ（Cozzi）ら、１
９９５）と組合せることができる。

【００９８】 文献 Aubin J E (1979) 生存活性のある哺乳動物細胞の自己蛍光性. J. Histochem. C
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【図面の簡単な説明】

【図１】 ２８日齢のブタの胚からの非染色脳細胞のフローサイトメトリー分析を示す。

【図２】 ２８日齢の胚のブタ脳から単離し、初代培養で１４日間増殖させた細胞による
、ＣＤ１８、ＣＤ５６、ＣＤ４４、ＣＤ４、およびＧＦＡＰの発現を示す。

【図３】 ２８日齢の胚のブタ脳からの培養細胞による大腸菌（Escherichia coli）の食
作用を示す。

【図４】 ＣＤ５６発現に基づき分離した、フロー選別した星状細胞とマクロファージ小
グリア細胞集団を示す。

【図５】 懸濁された腹側中脳細胞と、ブタ肝臓から単離した微小血管内皮細胞上のα−
ガラクトシルエピトープの発現を示す。

【図６】 細胞膜から単離したＢＳ−ＩＢ４反応性の可溶化した糖タンパク質のウェスタ
ンブロット分析を示す。

【図７】 チロシンヒドロキシラーゼについて免疫組織染色した２７日齢のブタの胚の腹
側中脳の矢状断面を示す。

【図８】 培養したブタ胚の脳細胞上のα−ガラクトシルエピトープの発現を示す。

【図９】 培養し新たに単離したブタ胚の脳細胞に及ぼすヒト血清とウサギ補体の作用を
示す。

【図１０】 ブタサイログロブリンを使用して正常ヒト血清から精製した抗体の、α−ガラ
クトシルエピトープに対する反応性を示す。

【図１１】 前処理したブタ胚の脳細胞と同時培養した、二人からのＣＤ４ Ｔリンパ球の
増殖応答を示す。

【図１２】 臨床状況とインビトロモデルでの、分離したブタの脳組織に及ぼす抗Ｇａｌと
補体の作用のまとめを示す。

【図１３】 パーキンソン病のラットモデルでのブタの神経移植片機能に及ぼす前処理の作
用を示す。

【図１４】 抗Ｇａｌと補体で前処理したブタの胚のＶＭ組織から得られる移植片の組織学
的分析を示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年１０月２６日（２００１．１０．２６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ホルゲルソン、ヤン スウェーデン国 フッディンゲ、ヴェヌス ヴェーゲン ６エイ Ｆターム(参考） 4C081 AB18 CD34 DA16 EA11 EA13 4C097 AA20 BB01 DD15 MM04 MM05

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 移植材料であって、 （ａ）ブタの胚または胎児神経組織の分離、 （ｂ）工程（ａ）の調製物を、Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−Ｒエピトープに対す
   る抗体と補体試薬に暴露させることによる、マクロファージおよび／または小グ
   リア細胞の除去 により作成されることを特徴とする上記材料。
2. 【請求項２】 分離は、１つ以上の酵素を使用して行われる、請求項１の移
   植材料。
3. 【請求項３】 酵素は、プロテアーゼおよび／またはデオキシリボヌクレア
   ーゼである、請求項２の移植材料。
4. 【請求項４】 補体試薬は、ウサギ血清またはウサギ血清から精製される補
   体である、請求項１〜３のいずれか一項の移植。
5. 【請求項５】 神経組織を移植する時有用な医薬調製物を調製するための、
   請求項１〜４のいずれか一項の移植材料の使用。
6. 【請求項６】 その免疫原性を低下させるためにブタ組織を処理するのに使
   用されるキットであって、組織分離のための１つ以上の酵素、Ｇａｌα１−３Ｇ
   ａｌβ１−Ｒエピトープに対する抗体の調製物、および補体試薬を含むことを特
   徴とする、上記キット。
7. 【請求項７】 抗体は、Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−Ｒエピトープに対する
   、好ましくはヒト起源の、ポリクローナル抗体である、請求項６のキット。
8. 【請求項８】 抗体は、マクロファージおよび／または小グリア細胞に対す
   る抗体である、請求項６または７のキット。
9. 【請求項９】 補体試薬は、ウサギ血清またはウサギ血清から精製される補
   体である、請求項６〜８のいずれか一項のキット。
10. 【請求項１０】 酵素はプロテアーゼおよび／またはデオキシリボヌクレア
    ーゼである、請求項６〜９のいずれか一項のキット。
11. 【請求項１１】 ブタの胚または胎児神経組織からのマクロファージおよび
    ／または小グリア細胞の除去方法であって、 （ａ）神経組織を分離し、Ｇａｌα１−３−Ｇａｌβ１−Ｒエピトープに対する
    抗体で処理する、 （ｂ）工程（ａ）の調製物を、担体に結合した抗体に暴露するかまたはフロー選
    別により、工程（ａ）の調製物からマクロファージおよび／または小グリア細胞
    を枯渇させる、または （ｃ）工程（ａ）の調製物を補体試薬で処理して、工程（ａ）の調製物からマク
    ロファージおよび／または小グリア細胞を枯渇させる ことを特徴とする上記方法。
12. 【請求項１２】 （ａ）ブタの胚または胎児神経組織は、１つ以上の酵素を
    使用して分離され、 （ｂ）抗体は、Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−Ｒエピトープに対する、好ましくは
    ヒト起源の、ポリクローナル抗体であり、 （ｃ）補体試薬は、ウサギ血清またはウサギ血清から精製される補体である、請
    求項１１の方法。
13. 【請求項１３】 酵素はプロテアーゼおよび／またはデオキシリボヌクレア
    ーゼである、請求項１２の方法。
14. 【請求項１４】 パーキンソン病、ハンティントン病、多発性硬化症、てん
    かん、卒中、疼痛、および脊髄損傷のような神経障害の治療方法であって、 （ａ）ブタの胚または胎児神経組織を分離し、 （ｂ）分離した組織を、Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−Ｒエピトープに対する抗体
    と補体試薬で処理して、マクロファージおよび／または小グリア細胞を除去し、 （ｃ）分離した抗体性および補体処理組織を、ヒトの体に移植する ことを特徴とする上記方法。