JP2001139496A - 後天的免疫寛容の獲得方法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 外来遺伝子が組み込まれたベクター等の外来
性ＤＮＡやその発現産物を「非自己」ではなく「自己」
として認識させることができる、外来性ＤＮＡやその発
現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法や、外来遺伝
子が組み込まれたベクター等の外来性ＤＮＡやその発現
産物に対する拒絶応答を回避することができる遺伝子治
療効果の持続方法や、外来遺伝子が組み込まれたベクタ
ー等の外来性ＤＮＡやその発現産物に対する後天的免疫
寛容を獲得した非ヒト動物を提供すること。 【解決手段】 外来遺伝子が組み込まれたウイルスベク
ター等の外来性ＤＮＡが導入された幼若Ｔリンパ球を胸
腺に移入して、胸腺器官内で前記外来性ＤＮＡを発現さ
せる。上記外来性ＤＮＡを幼若Ｔリンパ球に導入する方
法としては、例えば、幼若Ｔリンパ球とウイルスベクタ
ー感染ウイルスプロデューサー細胞とを共培養する方法
を挙げることができる。
性ＤＮＡやその発現産物を「非自己」ではなく「自己」
として認識させることができる、外来性ＤＮＡやその発
現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法や、外来遺伝
子が組み込まれたベクター等の外来性ＤＮＡやその発現
産物に対する拒絶応答を回避することができる遺伝子治
療効果の持続方法や、外来遺伝子が組み込まれたベクタ
ー等の外来性ＤＮＡやその発現産物に対する後天的免疫
寛容を獲得した非ヒト動物を提供すること。 【解決手段】 外来遺伝子が組み込まれたウイルスベク
ター等の外来性ＤＮＡが導入された幼若Ｔリンパ球を胸
腺に移入して、胸腺器官内で前記外来性ＤＮＡを発現さ
せる。上記外来性ＤＮＡを幼若Ｔリンパ球に導入する方
法としては、例えば、幼若Ｔリンパ球とウイルスベクタ
ー感染ウイルスプロデューサー細胞とを共培養する方法
を挙げることができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、幼若Ｔリンパ球を
介する胸腺へのＤＮＡ導入による、ウイルスベクター由
来成分等の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対す
る後天的免疫寛容の獲得方法や、遺伝子治療における外
来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する拒絶応答を
回避する遺伝子治療効果の持続方法や、ウイルスベクタ
ー由来成分等の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に
対して後天的免疫寛容を獲得したマウス等の非ヒト動物
に関する。
介する胸腺へのＤＮＡ導入による、ウイルスベクター由
来成分等の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対す
る後天的免疫寛容の獲得方法や、遺伝子治療における外
来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する拒絶応答を
回避する遺伝子治療効果の持続方法や、ウイルスベクタ
ー由来成分等の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に
対して後天的免疫寛容を獲得したマウス等の非ヒト動物
に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体は一般に自己を構成する抗原に対し
ては免疫応答を示さない。これは自然ないし先天的免疫
寛容と呼ばれている。一方、本来異種の抗原であっても
投与の時期（特に胎生期ないし新生期）、投与の方法
（たとえば免疫抑制剤を用いるとか）、投与するときの
性状（タンパク質抗原なら変性物を除いて投与する）に
よっては、その後の免疫応答に対して反応性を示さない
状態を誘導できる。これは、後天的ないし獲得寛容と呼
ばれている。また、免疫応答とは、一般に自己と自己以
外のもの（非自己）とを識別し、非自己に対して細胞性
や体液性の反応を起こしたものと捉えられている。この
識別は、リンパ球表面にある抗原受容体によって行わ
れ、非自己と認識した場合には、リンパ球が増殖して細
胞傷害性を発揮したり抗体を産生するようになる。しか
し、リンパ球による認識の最初の段階では、まず、樹状
細胞やマクロファージが異物（非自己）を取込み、Ｔリ
ンパ球によって認識されうる形で提示するという段階が
必要なので、自己と非自己の認識は樹状細胞やマクロフ
ァージとＴリンパ球との相互作用のレベルで行われてい
るとも考えられている。
ては免疫応答を示さない。これは自然ないし先天的免疫
寛容と呼ばれている。一方、本来異種の抗原であっても
投与の時期（特に胎生期ないし新生期）、投与の方法
（たとえば免疫抑制剤を用いるとか）、投与するときの
性状（タンパク質抗原なら変性物を除いて投与する）に
よっては、その後の免疫応答に対して反応性を示さない
状態を誘導できる。これは、後天的ないし獲得寛容と呼
ばれている。また、免疫応答とは、一般に自己と自己以
外のもの（非自己）とを識別し、非自己に対して細胞性
や体液性の反応を起こしたものと捉えられている。この
識別は、リンパ球表面にある抗原受容体によって行わ
れ、非自己と認識した場合には、リンパ球が増殖して細
胞傷害性を発揮したり抗体を産生するようになる。しか
し、リンパ球による認識の最初の段階では、まず、樹状
細胞やマクロファージが異物（非自己）を取込み、Ｔリ
ンパ球によって認識されうる形で提示するという段階が
必要なので、自己と非自己の認識は樹状細胞やマクロフ
ァージとＴリンパ球との相互作用のレベルで行われてい
るとも考えられている。
【０００３】一方、組換えＤＮＡ等の実験により得られ
た外来遺伝子を患者の体細胞に導入して、その遺伝子の
機能により該患者の遺伝子疾患を治療する遺伝子治療
は、癌、免疫不全、心血管疾患等の多くの遺伝子疾患に
適用されつつある。しかし、遺伝子治療を阻んでいる最
も大きな原因は、遺伝子を導入する際に用いるベクター
（遺伝子導入のための運び屋）成分に対する上記免疫応
答である。すなわち、細胞に遺伝子を導入することその
ものは技術的に完成しつつあるが、遺伝子導入の為には
必ず何らかのベクターを用いなければならない。また、
このベクターの遺伝子導入方法としては、レトロウイル
ス・アデノウイルス・レンチウイルス等いろいろなウイ
ルス系を用いるウイルスベクター法や、ＤＮＡを包み込
んだ膜を細胞と融合させるリポソーム法や、直接遺伝子
を導入するマイクロインジェクション法や、挿入ＤＮＡ
のサイズが制限されずかつ細胞親和性が高いというセン
ダイウイルス（ＨＶＪ）法（J. Biol. Chem. 264, 1212
6-12129, 1989、J. Biol. Chem. 266, 3361-3364, 199
1、Bioche. Biophys. Res. Commun. 186, 129-134, 199
2、Circ. Res. 73, 898-905, 1993、Science 243, 375-
378, 1989、J. Clin. Invest 94, 978-984, 1994）等が
知られている。
た外来遺伝子を患者の体細胞に導入して、その遺伝子の
機能により該患者の遺伝子疾患を治療する遺伝子治療
は、癌、免疫不全、心血管疾患等の多くの遺伝子疾患に
適用されつつある。しかし、遺伝子治療を阻んでいる最
も大きな原因は、遺伝子を導入する際に用いるベクター
（遺伝子導入のための運び屋）成分に対する上記免疫応
答である。すなわち、細胞に遺伝子を導入することその
ものは技術的に完成しつつあるが、遺伝子導入の為には
必ず何らかのベクターを用いなければならない。また、
このベクターの遺伝子導入方法としては、レトロウイル
ス・アデノウイルス・レンチウイルス等いろいろなウイ
ルス系を用いるウイルスベクター法や、ＤＮＡを包み込
んだ膜を細胞と融合させるリポソーム法や、直接遺伝子
を導入するマイクロインジェクション法や、挿入ＤＮＡ
のサイズが制限されずかつ細胞親和性が高いというセン
ダイウイルス（ＨＶＪ）法（J. Biol. Chem. 264, 1212
6-12129, 1989、J. Biol. Chem. 266, 3361-3364, 199
1、Bioche. Biophys. Res. Commun. 186, 129-134, 199
2、Circ. Res. 73, 898-905, 1993、Science 243, 375-
378, 1989、J. Clin. Invest 94, 978-984, 1994）等が
知られている。
【０００４】上記のいずれの遺伝子導入方法において
も、導入するベクターは我々の身体にとっては異物であ
るために、これらベクターの成分に対する免疫応答が惹
き起こされ、その結果、早晩のうちに（通常２週間から
１ヶ月のうちに）生体はベクターを排除してしまう。例
えばウイルスベクターの場合、ベクター成分が感染細胞
内でタンパク質として発現し、そのタンパク質が細胞表
面にペプチドとして発現され、Ｔリンパ球がベクター由
来のペプチドを認識して感染細胞を殺し、ベクター（ウ
イルス）を排除してしまう。このように、現在の遺伝子
治療においては、遺伝子導入そのものには成功しても、
長期の持続性効果を得ることには再現よく成功していな
い欠点があった。
も、導入するベクターは我々の身体にとっては異物であ
るために、これらベクターの成分に対する免疫応答が惹
き起こされ、その結果、早晩のうちに（通常２週間から
１ヶ月のうちに）生体はベクターを排除してしまう。例
えばウイルスベクターの場合、ベクター成分が感染細胞
内でタンパク質として発現し、そのタンパク質が細胞表
面にペプチドとして発現され、Ｔリンパ球がベクター由
来のペプチドを認識して感染細胞を殺し、ベクター（ウ
イルス）を排除してしまう。このように、現在の遺伝子
治療においては、遺伝子導入そのものには成功しても、
長期の持続性効果を得ることには再現よく成功していな
い欠点があった。
【０００５】また従来、後天的免疫寛容の獲得方法に関
して、脂溶性成分又は脂溶性成分含有物質を抗原と同時
には摂取させないことにより哺乳動物に対して免疫寛容
を誘導する方法（特開平９−１９４３９３号公報）や、
経口投与によって実質的に薬理効果を奏さず、注射によ
って薬理的効果を奏し、かつ注射による繰り返し投与に
よって薬理効果が発揮されなくなる薬物を有効成分とす
る医薬製剤であって、経口免疫寛容を誘導するのに十分
な投与単位数の該薬物含有経口投与用製剤と、経口免疫
寛容が誘導された後に投与するための該薬物含有注射用
製剤とからなる医薬製剤を用いる方法（特開平１０−２
９８１０１号公報）や、移植受け入れ患者に対応した特
異的な免疫寛容を得た動物から臓器を摘出することによ
り、移植された臓器のリンパ球などで構成される末梢性
免疫機構が、移植された後ヒトの組織適合抗原を攻撃せ
ず、良好な臓器生着を有する人工臓器を用いて移植患者
に免疫寛容を成立させる方法（特開平９−１８７４７０
号公報）が知られている。
して、脂溶性成分又は脂溶性成分含有物質を抗原と同時
には摂取させないことにより哺乳動物に対して免疫寛容
を誘導する方法（特開平９−１９４３９３号公報）や、
経口投与によって実質的に薬理効果を奏さず、注射によ
って薬理的効果を奏し、かつ注射による繰り返し投与に
よって薬理効果が発揮されなくなる薬物を有効成分とす
る医薬製剤であって、経口免疫寛容を誘導するのに十分
な投与単位数の該薬物含有経口投与用製剤と、経口免疫
寛容が誘導された後に投与するための該薬物含有注射用
製剤とからなる医薬製剤を用いる方法（特開平１０−２
９８１０１号公報）や、移植受け入れ患者に対応した特
異的な免疫寛容を得た動物から臓器を摘出することによ
り、移植された臓器のリンパ球などで構成される末梢性
免疫機構が、移植された後ヒトの組織適合抗原を攻撃せ
ず、良好な臓器生着を有する人工臓器を用いて移植患者
に免疫寛容を成立させる方法（特開平９−１８７４７０
号公報）が知られている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】ＦＴＯＣ（幼若胸腺組
織培養）においてレトロウイルスを介して遺伝子を直接
導入する方法やＴリンパ球発達におけるＭＡＰキナーゼ
の役割に関する情報が報告（Cell 86, 243-251, 1996）
されており、従来も胸腺に遺伝子を導入しようとする試
みがあったが、正常の実験動物においても大変効率が悪
く、既存のＴリンパ球による排除作用を抑える効果に乏
しく、そのため実用性に乏しかった（FASEB. J. 6, 285
3-2858, 1992、Ann. Surg. 222, 229-242, 1995、J. Cl
in. Invest. 98, 2640-2647, 1996）。
織培養）においてレトロウイルスを介して遺伝子を直接
導入する方法やＴリンパ球発達におけるＭＡＰキナーゼ
の役割に関する情報が報告（Cell 86, 243-251, 1996）
されており、従来も胸腺に遺伝子を導入しようとする試
みがあったが、正常の実験動物においても大変効率が悪
く、既存のＴリンパ球による排除作用を抑える効果に乏
しく、そのため実用性に乏しかった（FASEB. J. 6, 285
3-2858, 1992、Ann. Surg. 222, 229-242, 1995、J. Cl
in. Invest. 98, 2640-2647, 1996）。
【０００７】本発明者らは、遺伝子治療を受けさせる個
体のモデル動物として、マウスを用いて、グリーン蛍光
蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子とレトロウイルスベクター（ｐ
ＧＤ）とを結合させたｐＧＤ−ＧＦＰを皮内や腹腔内に
注入したところ、かかるマウスがベクター成分に対して
免疫応答を示し、ＧＦＰ遺伝子が組み込まれたウイルス
ベクターを２週間から１ヶ月のうちに体内から消失して
いたが、Ｔリンパ球を欠損した免疫不全マウスを用いて
同様に実験を行ったところ、かかる免疫応答が起こらな
かった。この原因はＴリンパ球を介した細胞性免疫応
答、すなわちＴリンパ球が遺伝子疾患の治療に有用なベ
クター遺伝子やその発現産物を非自己として認識し排除
しているものと考えられた。
体のモデル動物として、マウスを用いて、グリーン蛍光
蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子とレトロウイルスベクター（ｐ
ＧＤ）とを結合させたｐＧＤ−ＧＦＰを皮内や腹腔内に
注入したところ、かかるマウスがベクター成分に対して
免疫応答を示し、ＧＦＰ遺伝子が組み込まれたウイルス
ベクターを２週間から１ヶ月のうちに体内から消失して
いたが、Ｔリンパ球を欠損した免疫不全マウスを用いて
同様に実験を行ったところ、かかる免疫応答が起こらな
かった。この原因はＴリンパ球を介した細胞性免疫応
答、すなわちＴリンパ球が遺伝子疾患の治療に有用なベ
クター遺伝子やその発現産物を非自己として認識し排除
しているものと考えられた。
【０００８】本発明の課題は、上記のように遺伝子治療
用等の有用な外来遺伝子が組み込まれたベクター等の外
来性ＤＮＡやその発現産物を「非自己」ではなく「自
己」として認識させることができる、外来遺伝子が組み
込まれたベクター等の外来性ＤＮＡやその発現産物に対
する後天的免疫寛容の獲得方法や、外来遺伝子が組み込
まれたベクター等の外来性ＤＮＡやその発現産物に対す
る拒絶応答を回避することができる遺伝子治療効果の持
続方法や、外来遺伝子が組み込まれたベクター等の外来
性ＤＮＡやその発現産物に対する後天的免疫寛容を獲得
した非ヒト動物を提供することにある。
用等の有用な外来遺伝子が組み込まれたベクター等の外
来性ＤＮＡやその発現産物を「非自己」ではなく「自
己」として認識させることができる、外来遺伝子が組み
込まれたベクター等の外来性ＤＮＡやその発現産物に対
する後天的免疫寛容の獲得方法や、外来遺伝子が組み込
まれたベクター等の外来性ＤＮＡやその発現産物に対す
る拒絶応答を回避することができる遺伝子治療効果の持
続方法や、外来遺伝子が組み込まれたベクター等の外来
性ＤＮＡやその発現産物に対する後天的免疫寛容を獲得
した非ヒト動物を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、生体のＴ
リンパ球が遺伝子導入用ウイルスベクターの成分を「非
自己」ではなく「自己」として認識するように、生体の
Ｔリンパ球系を再教育し、かかる導入遺伝子ベクターに
対する免疫応答を回避させる方法を鋭意研究した結果、
本発明者らの胸腺での幼若Ｔリンパ球への遺伝子導入テ
クニック（J. Immunol. 161, 2888-2894, 1998、Immuni
ty 9, 565-574, 1998）を用いてマウス幼若Ｔリンパ球
にｐＧＤ−ＧＦＰ遺伝子を導入し、かかる遺伝子導入細
胞をＧＦＰの発現による蛍光染色を利用して精製し、正
常のマウスのＴリンパ球を一過性に抑制するため低線量
の放射線を照射し、遺伝子導入幼若Ｔリンパ球を胸腺に
移入し、このマウスの放射線照射からの回復を持ってか
ら、ｐＧＤ−ＧＦＰレトロウイルスを皮内や腹腔内に注
射したところ、幼若Ｔリンパ球前処理の効果で、マウス
内で導入遺伝子ＧＦＰの発現は長期間にわたり持続して
いた。すなわち、抗ベクター免疫応答を回避させること
ができ、持続的な遺伝子治療が可能になることを見い出
し、本発明を完成するに至った。
リンパ球が遺伝子導入用ウイルスベクターの成分を「非
自己」ではなく「自己」として認識するように、生体の
Ｔリンパ球系を再教育し、かかる導入遺伝子ベクターに
対する免疫応答を回避させる方法を鋭意研究した結果、
本発明者らの胸腺での幼若Ｔリンパ球への遺伝子導入テ
クニック（J. Immunol. 161, 2888-2894, 1998、Immuni
ty 9, 565-574, 1998）を用いてマウス幼若Ｔリンパ球
にｐＧＤ−ＧＦＰ遺伝子を導入し、かかる遺伝子導入細
胞をＧＦＰの発現による蛍光染色を利用して精製し、正
常のマウスのＴリンパ球を一過性に抑制するため低線量
の放射線を照射し、遺伝子導入幼若Ｔリンパ球を胸腺に
移入し、このマウスの放射線照射からの回復を持ってか
ら、ｐＧＤ−ＧＦＰレトロウイルスを皮内や腹腔内に注
射したところ、幼若Ｔリンパ球前処理の効果で、マウス
内で導入遺伝子ＧＦＰの発現は長期間にわたり持続して
いた。すなわち、抗ベクター免疫応答を回避させること
ができ、持続的な遺伝子治療が可能になることを見い出
し、本発明を完成するに至った。
【００１０】またこのとき、ベクター成分以外の外来分
子に対する免疫応答は正常に保たれており、マウスの免
疫系全体が傷害を受けたわけではなく、遺伝子治療用の
ベクターに対しての特異的免疫寛容が誘導されたこと
や、他の臓器で遺伝子導入に用いるベクターをそのまま
幼若Ｔリンパ球に発現させることは問題なく可能である
ことがわかった。この方法を用いることによって、自己
・非自己の識別をもたらす中心機関である胸腺に、幼若
Ｔリンパ球を介して効率よく遺伝子を導入することがで
き、胸腺気管内でのベクター成分の効率のよい発現と、
それによる効率のよいＴリンパ球の自己寛容の成立がも
たらされることがわかった。
子に対する免疫応答は正常に保たれており、マウスの免
疫系全体が傷害を受けたわけではなく、遺伝子治療用の
ベクターに対しての特異的免疫寛容が誘導されたこと
や、他の臓器で遺伝子導入に用いるベクターをそのまま
幼若Ｔリンパ球に発現させることは問題なく可能である
ことがわかった。この方法を用いることによって、自己
・非自己の識別をもたらす中心機関である胸腺に、幼若
Ｔリンパ球を介して効率よく遺伝子を導入することがで
き、胸腺気管内でのベクター成分の効率のよい発現と、
それによる効率のよいＴリンパ球の自己寛容の成立がも
たらされることがわかった。
【００１１】すなわち本発明は、幼若Ｔリンパ球を介し
て胸腺へ外来性ＤＮＡを導入することを特徴とする外来
性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛
容の獲得方法（請求項１）や、外来性ＤＮＡが導入され
た幼若Ｔリンパ球を胸腺に移入して、胸腺器官内で前記
外来性ＤＮＡを発現させることを特徴とする請求項１記
載の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天
的免疫寛容の獲得方法（請求項２）や、外来性ＤＮＡ
が、少なくともアレルギー性疾患惹起物質又は自己免疫
性疾患惹起物質をコードする遺伝子を含むＤＮＡである
ことを特徴とする請求項１又は２記載の外来性ＤＮＡ及
び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方
法（請求項３）や、外来性ＤＮＡが、少なくともペプチ
ド性治療薬をコードする遺伝子を含むＤＮＡであること
を特徴とする請求項１又は２記載の外来性ＤＮＡ及び／
又はその発現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法
（請求項４）や、外来性ＤＮＡが、少なくともベクター
を含むＤＮＡであることを特徴とする請求項１〜４のい
ずれか記載の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対
する後天的免疫寛容の獲得方法（請求項５）や、ベクタ
ーが外来遺伝子導入用ウイルスベクターであることを特
徴とする請求項５記載の外来性ＤＮＡ及び／又はその発
現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法（請求項６）
や、ウイルスベクターが、レトロウイルス、アデノウイ
ルス又はレンチウイルスに由来するベクターであること
を特徴とする請求項６記載の外来性ＤＮＡ及び／又はそ
の発現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法（請求項
７）に関する。
て胸腺へ外来性ＤＮＡを導入することを特徴とする外来
性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛
容の獲得方法（請求項１）や、外来性ＤＮＡが導入され
た幼若Ｔリンパ球を胸腺に移入して、胸腺器官内で前記
外来性ＤＮＡを発現させることを特徴とする請求項１記
載の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天
的免疫寛容の獲得方法（請求項２）や、外来性ＤＮＡ
が、少なくともアレルギー性疾患惹起物質又は自己免疫
性疾患惹起物質をコードする遺伝子を含むＤＮＡである
ことを特徴とする請求項１又は２記載の外来性ＤＮＡ及
び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方
法（請求項３）や、外来性ＤＮＡが、少なくともペプチ
ド性治療薬をコードする遺伝子を含むＤＮＡであること
を特徴とする請求項１又は２記載の外来性ＤＮＡ及び／
又はその発現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法
（請求項４）や、外来性ＤＮＡが、少なくともベクター
を含むＤＮＡであることを特徴とする請求項１〜４のい
ずれか記載の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対
する後天的免疫寛容の獲得方法（請求項５）や、ベクタ
ーが外来遺伝子導入用ウイルスベクターであることを特
徴とする請求項５記載の外来性ＤＮＡ及び／又はその発
現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法（請求項６）
や、ウイルスベクターが、レトロウイルス、アデノウイ
ルス又はレンチウイルスに由来するベクターであること
を特徴とする請求項６記載の外来性ＤＮＡ及び／又はそ
の発現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法（請求項
７）に関する。
【００１２】また本発明は、遺伝子治療における外来性
ＤＮＡを幼若Ｔリンパ球を介して胸腺へ導入することを
特徴とする遺伝子治療効果の持続方法（請求項８）や、
遺伝子治療における外来性ＤＮＡが導入された幼若Ｔリ
ンパ球を胸腺に移入して、胸腺器官内で外来性ＤＮＡを
発現させることにより、外来性ＤＮＡ及び／又はその発
現産物により惹起される免疫応答を回避することを特徴
とする請求項８記載の遺伝子治療効果の持続方法（請求
項９）や、外来性ＤＮＡが、少なくともベクターを含む
ＤＮＡであることを特徴とする請求項８又は９のいずれ
か記載の遺伝子治療効果の持続方法（請求項１０）や、
ベクターが外来遺伝子導入用ウイルスベクターであるこ
とを特徴とする請求項１０記載の遺伝子治療効果の持続
方法（請求項１１）や、ウイルスベクターが、レトロウ
イルス、アデノウイルス又はレンチウイルスに由来する
ベクターであることを特徴とする請求項１１記載の遺伝
子治療効果の持続方法（請求項１２）に関する。
ＤＮＡを幼若Ｔリンパ球を介して胸腺へ導入することを
特徴とする遺伝子治療効果の持続方法（請求項８）や、
遺伝子治療における外来性ＤＮＡが導入された幼若Ｔリ
ンパ球を胸腺に移入して、胸腺器官内で外来性ＤＮＡを
発現させることにより、外来性ＤＮＡ及び／又はその発
現産物により惹起される免疫応答を回避することを特徴
とする請求項８記載の遺伝子治療効果の持続方法（請求
項９）や、外来性ＤＮＡが、少なくともベクターを含む
ＤＮＡであることを特徴とする請求項８又は９のいずれ
か記載の遺伝子治療効果の持続方法（請求項１０）や、
ベクターが外来遺伝子導入用ウイルスベクターであるこ
とを特徴とする請求項１０記載の遺伝子治療効果の持続
方法（請求項１１）や、ウイルスベクターが、レトロウ
イルス、アデノウイルス又はレンチウイルスに由来する
ベクターであることを特徴とする請求項１１記載の遺伝
子治療効果の持続方法（請求項１２）に関する。
【００１３】さらに本発明は、幼若Ｔリンパ球を介して
胸腺へ外来性ＤＮＡを導入することを特徴とする外来性
ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容
を獲得した非ヒト動物（請求項１３）や、外来性ＤＮＡ
が導入された幼若Ｔリンパ球を胸腺に移入して、胸腺器
官内で前記外来性ＤＮＡを発現させることを特徴とする
請求項１３記載の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物
に対する後天的免疫寛容を獲得した非ヒト動物（請求項
１４）や、外来性ＤＮＡが、少なくともベクターを含む
ＤＮＡであることを特徴とする請求項１３又は１４記載
の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的
免疫寛容を獲得した非ヒト動物（請求項１５）や、ベク
ターが外来遺伝子導入用ウイルスベクターであることを
特徴とする請求項１５記載の外来性ＤＮＡ及び／又はそ
の発現産物に対する後天的免疫寛容を獲得した非ヒト動
物（請求項１６）や、ウイルスベクターが、レトロウイ
ルス、アデノウイルス又はレンチウイルスに由来するベ
クターであることを特徴とする請求項１６記載の外来性
ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容
を獲得した非ヒト動物（請求項１７）や、非ヒト動物が
齧歯類に属する非ヒト動物であることを特徴とする請求
項１３〜１７のいずれか記載の外来性ＤＮＡ及び／又は
その発現産物に対する後天的免疫寛容を獲得した非ヒト
動物（請求項１８）や、齧歯類に属する非ヒト動物がマ
ウスであることを特徴とする請求項１８記載の外来性Ｄ
ＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容を
獲得した非ヒト動物（請求項１９）に関する。
胸腺へ外来性ＤＮＡを導入することを特徴とする外来性
ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容
を獲得した非ヒト動物（請求項１３）や、外来性ＤＮＡ
が導入された幼若Ｔリンパ球を胸腺に移入して、胸腺器
官内で前記外来性ＤＮＡを発現させることを特徴とする
請求項１３記載の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物
に対する後天的免疫寛容を獲得した非ヒト動物（請求項
１４）や、外来性ＤＮＡが、少なくともベクターを含む
ＤＮＡであることを特徴とする請求項１３又は１４記載
の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的
免疫寛容を獲得した非ヒト動物（請求項１５）や、ベク
ターが外来遺伝子導入用ウイルスベクターであることを
特徴とする請求項１５記載の外来性ＤＮＡ及び／又はそ
の発現産物に対する後天的免疫寛容を獲得した非ヒト動
物（請求項１６）や、ウイルスベクターが、レトロウイ
ルス、アデノウイルス又はレンチウイルスに由来するベ
クターであることを特徴とする請求項１６記載の外来性
ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容
を獲得した非ヒト動物（請求項１７）や、非ヒト動物が
齧歯類に属する非ヒト動物であることを特徴とする請求
項１３〜１７のいずれか記載の外来性ＤＮＡ及び／又は
その発現産物に対する後天的免疫寛容を獲得した非ヒト
動物（請求項１８）や、齧歯類に属する非ヒト動物がマ
ウスであることを特徴とする請求項１８記載の外来性Ｄ
ＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容を
獲得した非ヒト動物（請求項１９）に関する。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明の外来性ＤＮＡ及び／又は
その発現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法は、幼
若Ｔリンパ球を介して胸腺へ外来性ＤＮＡを導入するこ
とを特徴とし、詳しくは、外来性ＤＮＡが導入された幼
若Ｔリンパ球を胸腺に移入して、胸腺器官内で前記外来
性ＤＮＡを発現させることを特徴とする。
その発現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法は、幼
若Ｔリンパ球を介して胸腺へ外来性ＤＮＡを導入するこ
とを特徴とし、詳しくは、外来性ＤＮＡが導入された幼
若Ｔリンパ球を胸腺に移入して、胸腺器官内で前記外来
性ＤＮＡを発現させることを特徴とする。
【００１５】本発明において外来性ＤＮＡとは、後天的
免疫寛容を獲得しようとする動物に元来存在しないＤＮ
Ａをいい、その翻訳産物が該動物にとって非自己として
認識されるＤＮＡをいう。また、本発明において外来遺
伝子とは、後天的免疫寛容を獲得しようとする動物に元
来存在しない遺伝子をいい、その翻訳産物が該動物にと
って非自己として認識される遺伝子をいう。そして、前
記外来性ＤＮＡとしては、外来遺伝子やベクターや目的
遺伝子が組み込まれたベクター等を具体的に挙げること
ができ、外来遺伝子としては、例えば、少なくともアレ
ルギー性疾患惹起物質や自己免疫性疾患惹起物質、特に
深刻なアレルギー性疾患惹起物質や慢性関節リウマチの
疾患惹起物質であるＭＢＰ（ミエリン塩基性タンパク
質）分子等の自己免疫性疾患惹起物質をコードする遺伝
子等や、少なくともペプチド性抗癌剤やペプチド性糖尿
病治療薬等をコードする遺伝子等を挙げることができ、
また、ベクターとしては、前記外来遺伝子の導入用等の
ウイルスベクター、プラスミドベクター、ファージベク
ター、酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベクター等のベクター
を例示することができるが、ウイルス粒子として感染さ
せた場合に形質転換効率が非常に高い点でウイルスベク
ター、特にレトロウイルス、アデノウイルス、レンチウ
イルス等に由来するウイルスベクターを用いることが好
ましい。これらウイルスベクターを用いる場合、該ウイ
ルスベクターを予め宿主細胞に感染させ、ウイルスプロ
デューサー細胞として用いることが好ましい。
免疫寛容を獲得しようとする動物に元来存在しないＤＮ
Ａをいい、その翻訳産物が該動物にとって非自己として
認識されるＤＮＡをいう。また、本発明において外来遺
伝子とは、後天的免疫寛容を獲得しようとする動物に元
来存在しない遺伝子をいい、その翻訳産物が該動物にと
って非自己として認識される遺伝子をいう。そして、前
記外来性ＤＮＡとしては、外来遺伝子やベクターや目的
遺伝子が組み込まれたベクター等を具体的に挙げること
ができ、外来遺伝子としては、例えば、少なくともアレ
ルギー性疾患惹起物質や自己免疫性疾患惹起物質、特に
深刻なアレルギー性疾患惹起物質や慢性関節リウマチの
疾患惹起物質であるＭＢＰ（ミエリン塩基性タンパク
質）分子等の自己免疫性疾患惹起物質をコードする遺伝
子等や、少なくともペプチド性抗癌剤やペプチド性糖尿
病治療薬等をコードする遺伝子等を挙げることができ、
また、ベクターとしては、前記外来遺伝子の導入用等の
ウイルスベクター、プラスミドベクター、ファージベク
ター、酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベクター等のベクター
を例示することができるが、ウイルス粒子として感染さ
せた場合に形質転換効率が非常に高い点でウイルスベク
ター、特にレトロウイルス、アデノウイルス、レンチウ
イルス等に由来するウイルスベクターを用いることが好
ましい。これらウイルスベクターを用いる場合、該ウイ
ルスベクターを予め宿主細胞に感染させ、ウイルスプロ
デューサー細胞として用いることが好ましい。
【００１６】本発明において用いられる幼若Ｔリンパ球
とは、抗原受容体及び機能的コレセプターＣＤ４／ＣＤ
８などを発現する成熟Ｔリンパ球になる前のＴリンパ球
をいい、例えば、成体胸腺リンパ球から分画・精製する
ことにより、また胎生１４〜１８日頃の胸腺葉から得る
ことができる。胎生１４〜１５日頃の胸腺葉は、左右両
葉が個別に心臓上方に存在し、透明感のある球体で周辺
組織とは区別しやすく成熟Ｔリンパ球の混入がない点
で、この時期の胸腺葉を用いることが好ましい。
とは、抗原受容体及び機能的コレセプターＣＤ４／ＣＤ
８などを発現する成熟Ｔリンパ球になる前のＴリンパ球
をいい、例えば、成体胸腺リンパ球から分画・精製する
ことにより、また胎生１４〜１８日頃の胸腺葉から得る
ことができる。胎生１４〜１５日頃の胸腺葉は、左右両
葉が個別に心臓上方に存在し、透明感のある球体で周辺
組織とは区別しやすく成熟Ｔリンパ球の混入がない点
で、この時期の胸腺葉を用いることが好ましい。
【００１７】本発明における外来性ＤＮＡを幼若Ｔリン
パ球へ導入する方法としては、本発明者らが開発した遺
伝子導入テクニック（J. Immunol. 161, 2888-2894, 19
98、Immunity 9, 565-574, 1998）、例えば、幼若Ｔリ
ンパ球とウイルスプロデューサー細胞を共培養し、ウイ
ルスプロデューサー細胞よりも大きさが小さく、密集度
が低いことを利用して、遺伝子が導入された幼若Ｔリン
パ球をフォーワード＆サイドスキャッター（forward an
d side scatter）により分離し、蛍光活性化セルソータ
ーにより、生存能力のある幼若Ｔリンパ球を分離・精製
する方法や、造血細胞マーカーＣＤ４５に対する抗体を
染色したものを使用して、フローサイトメトリーセルソ
ーターでＧＦＰ+ＣＤ４５+細胞をソートすることにより
遺伝子が導入された幼若Ｔリンパ球を、繊維芽細胞由来
のウイルスプロデューサー細胞から識別して分離・精製
する方法を用いることが、Ｔリンパ球の教育器官である
胸腺器官内で、外来性ＤＮＡ導入細胞を分化・成熟させ
ることができる点で好ましい。
パ球へ導入する方法としては、本発明者らが開発した遺
伝子導入テクニック（J. Immunol. 161, 2888-2894, 19
98、Immunity 9, 565-574, 1998）、例えば、幼若Ｔリ
ンパ球とウイルスプロデューサー細胞を共培養し、ウイ
ルスプロデューサー細胞よりも大きさが小さく、密集度
が低いことを利用して、遺伝子が導入された幼若Ｔリン
パ球をフォーワード＆サイドスキャッター（forward an
d side scatter）により分離し、蛍光活性化セルソータ
ーにより、生存能力のある幼若Ｔリンパ球を分離・精製
する方法や、造血細胞マーカーＣＤ４５に対する抗体を
染色したものを使用して、フローサイトメトリーセルソ
ーターでＧＦＰ+ＣＤ４５+細胞をソートすることにより
遺伝子が導入された幼若Ｔリンパ球を、繊維芽細胞由来
のウイルスプロデューサー細胞から識別して分離・精製
する方法を用いることが、Ｔリンパ球の教育器官である
胸腺器官内で、外来性ＤＮＡ導入細胞を分化・成熟させ
ることができる点で好ましい。
【００１８】本発明の外来性ＤＮＡの発現産物に対する
後天的免疫寛容は、例えば、上記方法により得られた幼
若Ｔリンパ球に前記外来遺伝子等の目的遺伝子が組み込
まれたベクターを導入し、かかるベクターが導入された
幼若Ｔリンパ球を、胸腺への直接注射や、経静脈注射す
ることにより胸腺に移入させ、胸腺器官内でかかる外来
性ＤＮＡを発現させることにより獲得することができ
る。その際、外来性ＤＮＡにより惹起される免疫応答も
同時に回避することができる。
後天的免疫寛容は、例えば、上記方法により得られた幼
若Ｔリンパ球に前記外来遺伝子等の目的遺伝子が組み込
まれたベクターを導入し、かかるベクターが導入された
幼若Ｔリンパ球を、胸腺への直接注射や、経静脈注射す
ることにより胸腺に移入させ、胸腺器官内でかかる外来
性ＤＮＡを発現させることにより獲得することができ
る。その際、外来性ＤＮＡにより惹起される免疫応答も
同時に回避することができる。
【００１９】本発明における遺伝子治療効果の持続方法
は、遺伝子治療における外来性ＤＮＡを幼若Ｔリンパ球
を介して胸腺へ導入することを特徴とし、特に遺伝子治
療における外来性ＤＮＡが導入された幼若Ｔリンパ球を
胸腺に移入して、胸腺器官内で外来性ＤＮＡを発現させ
ることにより、外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に
より惹起される免疫応答を例えば１ヶ月以上の長期間に
わたり回避することを特徴とするものであり、遺伝子治
療効果の持続は、前記外来性ＤＮＡ及び／又はその発現
産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法における外来性
ＤＮＡとして、遺伝子治療に有用な外来性ＤＮＡを用い
る場合に達成することができる。
は、遺伝子治療における外来性ＤＮＡを幼若Ｔリンパ球
を介して胸腺へ導入することを特徴とし、特に遺伝子治
療における外来性ＤＮＡが導入された幼若Ｔリンパ球を
胸腺に移入して、胸腺器官内で外来性ＤＮＡを発現させ
ることにより、外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に
より惹起される免疫応答を例えば１ヶ月以上の長期間に
わたり回避することを特徴とするものであり、遺伝子治
療効果の持続は、前記外来性ＤＮＡ及び／又はその発現
産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法における外来性
ＤＮＡとして、遺伝子治療に有用な外来性ＤＮＡを用い
る場合に達成することができる。
【００２０】本発明における外来性ＤＮＡ及び／又はそ
の発現産物に対する後天的免疫寛容を獲得した非ヒト動
物は、幼若Ｔリンパ球を介して胸腺へ外来性ＤＮＡを導
入することを特徴とし、特に外来性ＤＮＡが導入された
幼若Ｔリンパ球を胸腺に移入して、胸腺器官内で前記外
来性ＤＮＡを発現させることを特徴とする。かかる非ヒ
ト動物としては、非ヒト哺乳動物、例えばマウス、ラッ
ト、ウサギ等の哺乳動物を例示することができるが、育
成、使用の簡便さ等からしてマウスが好ましい。以下、
本発明を、非ヒト動物がマウスの場合を例にとった実施
例を挙げて更に具体的に説明するが、この発明の技術的
範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
の発現産物に対する後天的免疫寛容を獲得した非ヒト動
物は、幼若Ｔリンパ球を介して胸腺へ外来性ＤＮＡを導
入することを特徴とし、特に外来性ＤＮＡが導入された
幼若Ｔリンパ球を胸腺に移入して、胸腺器官内で前記外
来性ＤＮＡを発現させることを特徴とする。かかる非ヒ
ト動物としては、非ヒト哺乳動物、例えばマウス、ラッ
ト、ウサギ等の哺乳動物を例示することができるが、育
成、使用の簡便さ等からしてマウスが好ましい。以下、
本発明を、非ヒト動物がマウスの場合を例にとった実施
例を挙げて更に具体的に説明するが、この発明の技術的
範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２１】
【実施例】実施例１（培養液の調製） ＲＰＭＩ１６４０［最終濃度で、５０μＭの２−メルカ
プトエタノール（シグマケミカル社製）、１０ｍＭのヘ
ペス（Gibco BRL社製）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Gib
co BRL社製）、１×非必須アミノ酸（Gibco BRL社
製）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Gibco BRL社
製）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（Gibco BRL社
製）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Gibco
BRL社製）を含む培地］に、５６℃で３０分間前処理を
した１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加した培養液
（１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地）を調製した。
なお、実施例における操作はすべてクリーンフード内で
無菌的に行った。
プトエタノール（シグマケミカル社製）、１０ｍＭのヘ
ペス（Gibco BRL社製）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Gib
co BRL社製）、１×非必須アミノ酸（Gibco BRL社
製）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Gibco BRL社
製）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（Gibco BRL社
製）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Gibco
BRL社製）を含む培地］に、５６℃で３０分間前処理を
した１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加した培養液
（１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地）を調製した。
なお、実施例における操作はすべてクリーンフード内で
無菌的に行った。
【００２２】実施例２（マウス胎仔胸腺葉の採取） 妊娠日齢１５〜１６日目のマウスを頸部切断により殺
し、７０％のエタノールでマウスの腹部を清拭した後、
胎仔を子宮ごと１００ｍｍ無菌皿に取り出した。この子
宮から胎仔を取り出して、実施例１の培地２０〜３０ｍ
ｌの入った１００ｍｍ無菌皿に胎仔を移し、２〜３回静
かに皿を回転させ洗浄して血液とその余の夾雑物を取り
除いた。かかるマウス胎仔を顕微鏡下に置き、静かに胸
部を切開して２つの胸腺葉を取り出し、ガーゼの上に置
き血液を取り除き、マウス胎仔胸腺葉を採取した。
し、７０％のエタノールでマウスの腹部を清拭した後、
胎仔を子宮ごと１００ｍｍ無菌皿に取り出した。この子
宮から胎仔を取り出して、実施例１の培地２０〜３０ｍ
ｌの入った１００ｍｍ無菌皿に胎仔を移し、２〜３回静
かに皿を回転させ洗浄して血液とその余の夾雑物を取り
除いた。かかるマウス胎仔を顕微鏡下に置き、静かに胸
部を切開して２つの胸腺葉を取り出し、ガーゼの上に置
き血液を取り除き、マウス胎仔胸腺葉を採取した。
【００２３】実施例３（培養ウェルの調製） 殺菌したヘリスタット（Helistat）スポンジ（Colla-Te
c, Inc., Plainsboro,NJ 08536）の小片を２４ウェルプ
レート（直径１６ｍｍ、無菌）の培養ウェルに置き、実
施例１の培地１ｍｌを入れ、スポンジのなめらかな面を
上に向け、無菌ポリカーボネートフィルター膜（Costa
r, Nucleopore Corp. PC membrane, #110409,直径１１
３ｍｍ）をその上に置き、フィルター膜を鉗子で裏返し
て、フィルター膜の両面を培地で完全に浸した後、そこ
から０．５ｍｌの培地をウェルから静かに抜き取り、最
終の培地を１ウェル当たり０．５ｍｌに調製した。
c, Inc., Plainsboro,NJ 08536）の小片を２４ウェルプ
レート（直径１６ｍｍ、無菌）の培養ウェルに置き、実
施例１の培地１ｍｌを入れ、スポンジのなめらかな面を
上に向け、無菌ポリカーボネートフィルター膜（Costa
r, Nucleopore Corp. PC membrane, #110409,直径１１
３ｍｍ）をその上に置き、フィルター膜を鉗子で裏返し
て、フィルター膜の両面を培地で完全に浸した後、そこ
から０．５ｍｌの培地をウェルから静かに抜き取り、最
終の培地を１ウェル当たり０．５ｍｌに調製した。
【００２４】実施例４（マウス胸腺葉の組織培養） 実施例２で得られた４〜６葉の胸腺葉を、実施例３で調
製した培養ウェルのスポンジ上のフィルター膜に載置
し、胸腺葉が培地液に浸漬しない状態で、ＣＯ2インキ
ュベーター中にて培養した。
製した培養ウェルのスポンジ上のフィルター膜に載置
し、胸腺葉が培地液に浸漬しない状態で、ＣＯ2インキ
ュベーター中にて培養した。
【００２５】実施例５（胎仔胸腺組織培養後の単細胞浮
遊液の調製） ３０ｍｍ皿の蓋裏側の中心に、１００μｌの染色緩衝液
［０．２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と０．１％
のＮａＮ3を含むｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水
（ＰＢＳ）］を滴下し、その中に実施例４で組織培養し
た胸腺葉を移し、７型鉗子を用いて胸腺葉の数をカウン
トした。次に小さいナイロンメッシュ（およそ５ｍ
ｍ2）を胸腺葉が移された緩衝液の上に載せ、針先の曲
がった２６ゲージ針（先端から５ｍｍ、９０度の角度）
と１ｍｌシリンジを用いて、これらをナイロンメッシュ
に押しつけながら胸腺葉をそっと裂き、得られた単細胞
浮遊液をシリンジ内のプラスチックチューブに移し、細
胞の数をカウントして所定濃度の細胞懸濁液を調製し
た。
遊液の調製） ３０ｍｍ皿の蓋裏側の中心に、１００μｌの染色緩衝液
［０．２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と０．１％
のＮａＮ3を含むｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水
（ＰＢＳ）］を滴下し、その中に実施例４で組織培養し
た胸腺葉を移し、７型鉗子を用いて胸腺葉の数をカウン
トした。次に小さいナイロンメッシュ（およそ５ｍ
ｍ2）を胸腺葉が移された緩衝液の上に載せ、針先の曲
がった２６ゲージ針（先端から５ｍｍ、９０度の角度）
と１ｍｌシリンジを用いて、これらをナイロンメッシュ
に押しつけながら胸腺葉をそっと裂き、得られた単細胞
浮遊液をシリンジ内のプラスチックチューブに移し、細
胞の数をカウントして所定濃度の細胞懸濁液を調製し
た。
【００２６】実施例６（ウイルスプロデューサー細胞の
作製） ＧＦＰ遺伝子から調製したＳ６５Ｔ変異体をコードする
７４０ｂｐのＤＮＡ（クローンテック社製）をｐＧＤ′
のＢｃｌＩサイト（図１ａ）又はｐＭＳＣＶのＨｐａＩ
サイト（図１ｂ）にクローニングした。このクローニン
グにより得られた組み換えベクターをＧＰ＋Ｅ−８６細
胞にトランスフェクションした。Ｇ４１８耐性細胞の中
から、ＦＡＣＳバンテージセルソーター（Becton Dicki
nson社製）を用いてＧＦＰhighクローンを分離した。分
離されたクローンから得られた濾過上清の希釈液とＮＩ
Ｈ−３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５８）のＧ４１８
耐性細胞とをいっしょに１日間培養し、ウイルスの力価
を測定し、１０6ＣＦＵ／ｍｌ以上の力価を有するウイ
ルスプロデューサー細胞（組み換えベクターをインフェ
クションしたＧＰ＋Ｅ−８６細胞）を以下の実施例に用
いた。
作製） ＧＦＰ遺伝子から調製したＳ６５Ｔ変異体をコードする
７４０ｂｐのＤＮＡ（クローンテック社製）をｐＧＤ′
のＢｃｌＩサイト（図１ａ）又はｐＭＳＣＶのＨｐａＩ
サイト（図１ｂ）にクローニングした。このクローニン
グにより得られた組み換えベクターをＧＰ＋Ｅ−８６細
胞にトランスフェクションした。Ｇ４１８耐性細胞の中
から、ＦＡＣＳバンテージセルソーター（Becton Dicki
nson社製）を用いてＧＦＰhighクローンを分離した。分
離されたクローンから得られた濾過上清の希釈液とＮＩ
Ｈ−３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５８）のＧ４１８
耐性細胞とをいっしょに１日間培養し、ウイルスの力価
を測定し、１０6ＣＦＵ／ｍｌ以上の力価を有するウイ
ルスプロデューサー細胞（組み換えベクターをインフェ
クションしたＧＰ＋Ｅ−８６細胞）を以下の実施例に用
いた。
【００２７】実施例７（ウイルス感染幼若Ｔリンパ球の
作製） 上記実施例５によって得られた単細胞の幼若Ｔリンパ球
浮遊液を最終的に０．５〜２×１０4個／ウェルとなる
ように９６フラットウェルに分注し、さらにあらかじめ
トリプシン処理し、１日間培養した上記ウイルスプロデ
ューサー細胞を１ウェル当たりに２〜５×１０3個加え
て、これらをウェル内で混合した。この混合物を、最終
濃度１〜５ｎｇ／ｍｌのマウスの組換えＩＬ−７（イン
ターロイキン７；Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）、又はこれと最
終濃度１〜５ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子（ＳＣＦ）の存在
下において１〜２日間培養した。その後、共培養した幼
若Ｔリンパ球を静かにピペッティングしながら回収し
た。幼若Ｔリンパ球はプロデューサー細胞よりも小さ
く、密集度が低いことを利用して、遺伝子が導入された
幼若Ｔリンパ球（図２のａ部分）をフォーワード＆サイ
ドスキャッター（forward and side scatter）により分
離し（図２）、蛍光活性化セルソーターにより、生存能
力のある幼若Ｔリンパ球を分離・精製した。また、造血
細胞マーカーＣＤ４５に対する抗体を染色したものを使
用して、フローサイトメトリーセルソーターでＧＦＰ+
ＣＤ４５+細胞をソートすることにより、遺伝子が導入
された幼若Ｔリンパ球を、繊維芽細胞由来のウイルスプ
ロデューサー細胞から識別して分離・精製した。
作製） 上記実施例５によって得られた単細胞の幼若Ｔリンパ球
浮遊液を最終的に０．５〜２×１０4個／ウェルとなる
ように９６フラットウェルに分注し、さらにあらかじめ
トリプシン処理し、１日間培養した上記ウイルスプロデ
ューサー細胞を１ウェル当たりに２〜５×１０3個加え
て、これらをウェル内で混合した。この混合物を、最終
濃度１〜５ｎｇ／ｍｌのマウスの組換えＩＬ−７（イン
ターロイキン７；Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）、又はこれと最
終濃度１〜５ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子（ＳＣＦ）の存在
下において１〜２日間培養した。その後、共培養した幼
若Ｔリンパ球を静かにピペッティングしながら回収し
た。幼若Ｔリンパ球はプロデューサー細胞よりも小さ
く、密集度が低いことを利用して、遺伝子が導入された
幼若Ｔリンパ球（図２のａ部分）をフォーワード＆サイ
ドスキャッター（forward and side scatter）により分
離し（図２）、蛍光活性化セルソーターにより、生存能
力のある幼若Ｔリンパ球を分離・精製した。また、造血
細胞マーカーＣＤ４５に対する抗体を染色したものを使
用して、フローサイトメトリーセルソーターでＧＦＰ+
ＣＤ４５+細胞をソートすることにより、遺伝子が導入
された幼若Ｔリンパ球を、繊維芽細胞由来のウイルスプ
ロデューサー細胞から識別して分離・精製した。
【００２８】実施例８（遺伝子導入幼若Ｔリンパ球によ
る導入遺伝子の発現） 正常なマウス（Ｂ６）のＴリンパ球を一過性に抑制する
ために低線量の放射線を照射し、上記実施例７により得
られた遺伝子導入幼若Ｔリンパ球を胸腺へ直接注射する
ことにより胸腺に移入した。このマウスの放射線照射か
らの回復を待ってから、ｐＧＤ−ＧＦＰレトロウイルス
を導入した脾細胞を腹腔内に注射し、２週間後、抗ＧＦ
Ｐ抗体を酵素抗体法を用いて血中抗体価で測定した。ま
た、コントロールとして抗ＢＳＡ（仔牛血清アルブミ
ン）抗体をも同様に測定した。結果を図３に示す。図３
中、“No treatment”は無処理の正常なマウス（Ｂ６）
における血中抗体価を意味し、当然のことながら抗体が
生成しないことがわかる。“pGD-GFP ip”は、正常なマ
ウス（Ｂ６）にｐＧＤ−ＧＦＰレトロウイルス導入脾細
胞を腹腔内に注射したときの血中抗体価を意味し、ＧＦ
Ｐの発現により抗ＧＦＰ抗体が生成していることが示さ
れている。“pGD -GFP it”は、ｐＧＤ−ＧＦＰレトロ
ウイルス導入脾細胞を腹腔内に注射していない上記実施
例７により得られた遺伝子導入幼若Ｔリンパ球胸腺移入
マウス（Ｂ６）の血中抗体価を意味し、このマウスでは
抗ＧＦＰ抗体が殆ど生成しないことがわかる。“pGD -G
FP it→ pGD-GFP ip”は、上記実施例７により得られた
遺伝子導入幼若Ｔリンパ球胸腺移入マウス（Ｂ６）に、
ｐＧＤ−ＧＦＰレトロウイルス導入脾細胞を腹腔内に注
射したときの血中抗体価を意味し、このマウスにおいて
抗ＧＦＰ抗体が殆ど出現していないことがわかる。以上
の結果から、上記実施例７により得られた遺伝子導入幼
若Ｔリンパ球胸腺移入マウス（Ｂ６）において、ウイル
スベクター由来のＧＦＰ成分に免疫寛容が成立したこと
を確認した。すなわち、抗ベクター免疫応答を回避させ
ることができ、持続的な遺伝子治療が可能となることが
わかった。またこのとき、ベクター成分以外の外来分子
に対する免疫応答は正常に保たれており、マウスの免疫
系全体が傷害を受けたわけではなく、遺伝子治療用のベ
クターに対しての特異的免疫寛容が誘導されたことも確
認した。
る導入遺伝子の発現） 正常なマウス（Ｂ６）のＴリンパ球を一過性に抑制する
ために低線量の放射線を照射し、上記実施例７により得
られた遺伝子導入幼若Ｔリンパ球を胸腺へ直接注射する
ことにより胸腺に移入した。このマウスの放射線照射か
らの回復を待ってから、ｐＧＤ−ＧＦＰレトロウイルス
を導入した脾細胞を腹腔内に注射し、２週間後、抗ＧＦ
Ｐ抗体を酵素抗体法を用いて血中抗体価で測定した。ま
た、コントロールとして抗ＢＳＡ（仔牛血清アルブミ
ン）抗体をも同様に測定した。結果を図３に示す。図３
中、“No treatment”は無処理の正常なマウス（Ｂ６）
における血中抗体価を意味し、当然のことながら抗体が
生成しないことがわかる。“pGD-GFP ip”は、正常なマ
ウス（Ｂ６）にｐＧＤ−ＧＦＰレトロウイルス導入脾細
胞を腹腔内に注射したときの血中抗体価を意味し、ＧＦ
Ｐの発現により抗ＧＦＰ抗体が生成していることが示さ
れている。“pGD -GFP it”は、ｐＧＤ−ＧＦＰレトロ
ウイルス導入脾細胞を腹腔内に注射していない上記実施
例７により得られた遺伝子導入幼若Ｔリンパ球胸腺移入
マウス（Ｂ６）の血中抗体価を意味し、このマウスでは
抗ＧＦＰ抗体が殆ど生成しないことがわかる。“pGD -G
FP it→ pGD-GFP ip”は、上記実施例７により得られた
遺伝子導入幼若Ｔリンパ球胸腺移入マウス（Ｂ６）に、
ｐＧＤ−ＧＦＰレトロウイルス導入脾細胞を腹腔内に注
射したときの血中抗体価を意味し、このマウスにおいて
抗ＧＦＰ抗体が殆ど出現していないことがわかる。以上
の結果から、上記実施例７により得られた遺伝子導入幼
若Ｔリンパ球胸腺移入マウス（Ｂ６）において、ウイル
スベクター由来のＧＦＰ成分に免疫寛容が成立したこと
を確認した。すなわち、抗ベクター免疫応答を回避させ
ることができ、持続的な遺伝子治療が可能となることが
わかった。またこのとき、ベクター成分以外の外来分子
に対する免疫応答は正常に保たれており、マウスの免疫
系全体が傷害を受けたわけではなく、遺伝子治療用のベ
クターに対しての特異的免疫寛容が誘導されたことも確
認した。
【００２９】
【発明の効果】本発明によると、外来遺伝子が組み込ま
れたベクター等の外来性ＤＮＡが導入された幼若Ｔリン
パ球を胸腺に移入して、胸腺器官内で上記外来性ＤＮＡ
を発現させることにより当該外来性ＤＮＡやその発現産
物に対して後天的免疫寛容を獲得させることができ、ま
た、かかる外来性ＤＮＡやその発現産物に対する拒絶応
答を回避させ、遺伝子治療の効果を長期間安定して持続
して行うこともできる。さらに、本発明の外来遺伝子が
組み込まれたベクター等の外来性ＤＮＡやその発現産物
に対する後天的免疫寛容を獲得した非ヒト動物は、遺伝
子治療等の研究開発に用いると極めて有用である。
れたベクター等の外来性ＤＮＡが導入された幼若Ｔリン
パ球を胸腺に移入して、胸腺器官内で上記外来性ＤＮＡ
を発現させることにより当該外来性ＤＮＡやその発現産
物に対して後天的免疫寛容を獲得させることができ、ま
た、かかる外来性ＤＮＡやその発現産物に対する拒絶応
答を回避させ、遺伝子治療の効果を長期間安定して持続
して行うこともできる。さらに、本発明の外来遺伝子が
組み込まれたベクター等の外来性ＤＮＡやその発現産物
に対する後天的免疫寛容を獲得した非ヒト動物は、遺伝
子治療等の研究開発に用いると極めて有用である。
【図１】本発明における遺伝子導入に用いたベクターの
構成を示す図である。
構成を示す図である。
【図２】フォーワード＆サイドスキャッターによる遺伝
子導入幼若Ｔリンパ球とウイルスプロデューサー細胞の
分析結果を示す図である。
子導入幼若Ｔリンパ球とウイルスプロデューサー細胞の
分析結果を示す図である。
【図３】遺伝子導入幼若Ｔリンパ球胸腺移入マウスにお
ける免疫応答の結果を示す図である。
ける免疫応答の結果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 7/00 Ａ６１Ｋ 35/14 Ｚ 15/09 35/24 // Ａ６１Ｋ 35/14 35/76 35/24 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 35/76 15/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA02 DA02 EA02 GA11 GA18 HA17 4B065 AA90X AA92X AA95Y AA97Y AB01 AC14 BA02 BD50 CA24 CA44 4C084 AA13 NA14 ZB022 ZC552 4C085 AA02 4C087 AA01 AA02 BB37 BB42 BB65 BC83 CA12 NA14 ZB02 ZC55
Claims (19)
- 【請求項１】 幼若Ｔリンパ球を介して胸腺へ外来性Ｄ
ＮＡを導入することを特徴とする外来性ＤＮＡ及び／又
はその発現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法。 - 【請求項２】 外来性ＤＮＡが導入された幼若Ｔリンパ
球を胸腺に移入して、胸腺器官内で前記外来性ＤＮＡを
発現させることを特徴とする請求項１記載の外来性ＤＮ
Ａ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容の獲
得方法。 - 【請求項３】 外来性ＤＮＡが、少なくともアレルギー
性疾患惹起物質又は自己免疫性疾患惹起物質をコードす
る遺伝子を含むＤＮＡであることを特徴とする請求項１
又は２記載の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対
する後天的免疫寛容の獲得方法。 - 【請求項４】 外来性ＤＮＡが、少なくともペプチド性
治療薬をコードする遺伝子を含むＤＮＡであることを特
徴とする請求項１又は２記載の外来性ＤＮＡ及び／又は
その発現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法。 - 【請求項５】 外来性ＤＮＡが、少なくともベクターを
含むＤＮＡであることを特徴とする請求項１〜４のいず
れか記載の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対す
る後天的免疫寛容の獲得方法。 - 【請求項６】 ベクターが外来遺伝子導入用ウイルスベ
クターであることを特徴とする請求項５記載の外来性Ｄ
ＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容の
獲得方法。 - 【請求項７】 ウイルスベクターが、レトロウイルス、
アデノウイルス又はレンチウイルスに由来するベクター
であることを特徴とする請求項６記載の外来性ＤＮＡ及
び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方
法。 - 【請求項８】 遺伝子治療における外来性ＤＮＡを幼若
Ｔリンパ球を介して胸腺へ導入することを特徴とする遺
伝子治療効果の持続方法。 - 【請求項９】 遺伝子治療における外来性ＤＮＡが導入
された幼若Ｔリンパ球を胸腺に移入して、胸腺器官内で
外来性ＤＮＡを発現させることにより、外来性ＤＮＡ及
び／又はその発現産物により惹起される免疫応答を回避
することを特徴とする請求項８記載の遺伝子治療効果の
持続方法。 - 【請求項１０】 外来性ＤＮＡが、少なくともベクター
を含むＤＮＡであることを特徴とする請求項８又は９の
いずれか記載の遺伝子治療効果の持続方法。 - 【請求項１１】 ベクターが外来遺伝子導入用ウイルス
ベクターであることを特徴とする請求項１０記載の遺伝
子治療効果の持続方法。 - 【請求項１２】 ウイルスベクターが、レトロウイル
ス、アデノウイルス又はレンチウイルスに由来するベク
ターであることを特徴とする請求項１１記載の遺伝子治
療効果の持続方法。 - 【請求項１３】 幼若Ｔリンパ球を介して胸腺へ外来性
ＤＮＡを導入することを特徴とする外来性ＤＮＡ及び／
又はその発現産物に対する後天的免疫寛容を獲得した非
ヒト動物。 - 【請求項１４】 外来性ＤＮＡが導入された幼若Ｔリン
パ球を胸腺に移入して、胸腺器官内で前記外来性ＤＮＡ
を発現させることを特徴とする請求項１３記載の外来性
ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容
を獲得した非ヒト動物。 - 【請求項１５】 外来性ＤＮＡが、少なくともベクター
を含むＤＮＡであることを特徴とする請求項１３又は１
４記載の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する
後天的免疫寛容を獲得した非ヒト動物。 - 【請求項１６】 ベクターが外来遺伝子導入用ウイルス
ベクターであることを特徴とする請求項１５記載の外来
性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛
容を獲得した非ヒト動物。 - 【請求項１７】 ウイルスベクターが、レトロウイル
ス、アデノウイルス又はレンチウイルスに由来するベク
ターであることを特徴とする請求項１６記載の外来性Ｄ
ＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容を
獲得した非ヒト動物。 - 【請求項１８】 非ヒト動物が齧歯類に属する非ヒト動
物であることを特徴とする請求項１３〜１７のいずれか
記載の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後
天的免疫寛容を獲得した非ヒト動物。 - 【請求項１９】 齧歯類に属する非ヒト動物がマウスで
あることを特徴とする請求項１８記載の外来性ＤＮＡ及
び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容を獲得し
た非ヒト動物。
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Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7666998B2 (en) | 2001-12-04 | 2010-02-23 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Cell growth inhibitor containing anti-PepT antibody |
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| US7750204B2 (en) | 2002-06-05 | 2010-07-06 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods for producing antibody |
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| WO2012144512A1 (ja) * | 2011-04-22 | 2012-10-26 | 国立大学法人京都大学 | 関節リウマチの新規遺伝因子としてのミエリン塩基性蛋白の利用 |
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-
2007
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