JP2003507078A - 抗ウイルス剤の同定方法 - Google Patents

抗ウイルス剤の同定方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、抗ウイルス剤の同定方法を提供する。より詳しくは、本発明は、ＣＤＫ２複合体へのＥ７結合の特異的インヒビターを同定する方法およびＥ７誘発ＣＤＫ２キナーゼ活性の特異的インヒビターを同定する方法を提供する。本発明により同定された特異的インヒビター、該特異的インヒビターを含む組成物、および該化合物を用いる治療方法も提供する。より詳しくは、ＣＤＫ２キナーゼ活性におけるヒト・パピローマウイルスＥ７タンパク質誘発増大のインヒビターを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は、１９９９年８月２５に出願された係属中の米国特許出願第０９／３
８２,６１６号の一部継続である。
【０００２】 発明の分野 本発明は、抗ウイルス剤の同定方法、より詳しくは、ＣＤＫ２キナーゼ活性に
おけるヒト・パピローマウイルスＥ７タンパク質誘発増大のインヒビターを提供
する。
【０００３】 発明の背景 ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）は、８０を超える小さな（約８ｋｂ）の
ＤＮＡウイルスのファミリーであって、重層鱗状上皮に感染して、イボを発生さ
せる。ある種のハイリスクＨＰＶ株は、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８およびＨＰＶ３
１を含み、頚部癌における最も重要な病因であるとみなされてきており［zur Ha
usen, Biochim. Biophys. Acta 1288:F55-78 (1996)］、それは、該ハイリスク
ＨＰＶからのＥ６およびＥ７遺伝子が強力な腫瘍遺伝子であるという観察と一致
する。Ｅ６およびＥ７の腫瘍遺伝子可能性は宿主細胞タンパク質への結合特性に
起因するであろう。例えば、Ｅ６は腫瘍サプレッサータンパク質ｐ５３に結合し
て、該タンパク質のユビキチン依存性分解をもたらし［Scheffner, et al., Cel
l 63:1129-36 (1990)］、Ｅ７は結合し、腫瘍サプレッサー網膜芽腫タンパク質
（ｐＲｂ）の分解を促進する［Dyson, et al., Science 243:934-7 (1989); Jon
es, et al., Genes & Dev 11:2101-11 (1997)］。Ｅ６およびＥ７は他の活性を
有するが、ウイルスのライフサイクルにおけるそれらの役割は完全に解明されて
いない。
【０００４】 該ＨＰＶライフサイクルは、重層鱗状上皮内で分化依存性様式で調節される［
Jones, et al., Genes & Dev 11:2101-11 (1997)］。該ウイルスは、当該基底細
胞癌層中でエピソームとして維持され、それは重層上皮中の複製細胞集団である
。ケラチノサイトへの宿主細胞の分化により、該ウイルスは爆発的なＤＮＡ複製
を受ける。分化に続いて、ケラチノサイトは該細胞サイクルから外れ、上皮重層
化の通常経過の間に死滅する。通常、これらのイベントは不可逆的であるが、Ｈ
ＰＶ Ｅ７活性は、分化されたケラチノサイトにおけるＤＮＡ合成のスケジュー
ルされていないラウンドを進行させるのに充分である［Cheng, et al., Genes &
Dev. 9:2335-49 (1995)］。新たに合成された細菌性ＤＮＡは、該上皮の上層生
存可能層(upper viable layers)にパッケージされ、該死んだ分化細胞中の環境
に閉じ込められる。分化細胞中のスケジュールされていないＤＮＡ合成は該ＨＰ
Ｖウイルスライフサイクルの中心であり、該Ｅ７遺伝子産物はこのイベントにお
いて重要なウイルスタンパク質とみなされてきた。これらの観察と一致して、最
近の遺伝子解析は、Ｅ７はＨＰＶ感染ケラチノサイト中の成長複製（増殖）に必
要とされることを示した。該Ｅ７遺伝子産物は、多数の調節タンパク質と結合す
る９８個のアミノ酸タンパク質であり、ｐＲｂおよび、サイクリン依存性キナー
ゼ阻害性タンパク質（ＫＩＰ）ファミリーのタンパク質を含み、その機能は細胞
周期のＳ期移行への移行にとって重要である［Morgan, Ann. Rev. Cell Dev. Bi
ol. 13:261-291 (1997)］。
【０００５】 いかにしてＥ７がＳ期への進行を促進するかは、該ウイルスライフサイクルお
よびＨＰＶ関連癌に対するこのイベントの重要性のため、熱心な調査の対象であ
る。Ｅ７は、例えば、ＴＧＦ−βに介在されるもの［Pietenpol et al., Cell 6
1:777-85 (1990)］、基質付着性損失(loss of substrate adherence)［Ruesch,
et al., Virol. 250:19-29 (1998)］および血清奪剥［Pei, et al., Carcinogen
esis 19:1481-6 (1998)］を含む負の細胞成長信号に打ち勝つ。この活性は、部
分的に、Ｅ７が細胞を形質転換し、ｐＲｂファミリーのメンバーに結合する能力
と相関する［Galloway et al., Semin. Cancer Biol. 7:309-15 (1996)］。Ｅ７
は、例えば、ＴＡＴＡ−結合タンパク質［Massimi, et al., Oncogene 12:2325-
30 (1996)］、およびｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓファミリーのメンバー［Antin
ore, et al., EMBO. J., 15:1950-60 (1996)］のごとき転写因子を含む他のタン
パク質に結合する。
【０００６】 これらの結合活性にもかかわらず、Ｅ７の既知の機能は、もしあれば、ウイル
スライフサイクルにとって重要であるかは不明である。最も顕著には、Ｅ７はｐ
Ｒｂファミリーのメンバー［Dyson et al., Science 243:934-7 (1989); Ciccol
ini, et al., Oncogene 9:2633-8 (1994); Wu, et al., J. Virol. 67:2402-7 (
1993)］、ｐ２１［Funk, et al., Genes & Dev 11:2090-100 (1997); Jones, et
al., Genes & Dev 11:2101-11 (1997)］、およびｐ２７［Zerfass, et al., On
cogene 13:2323-30 (1996)］、細胞周期進行を調節するサイクリン依存性キナー
ゼリン酸化経路に関与するタンパク質に結合する。該サイクリン依存性キナーゼ
は、ｐＲｂがＳ期への移行に必要な様々な遺伝子をアップレギュレートするタン
パク質であるＥ２Ｆ［Mulligan, et al., Trends Genet 14:223-9 (1998)］を隔
離する能力を阻害することを含む様々な手段により細胞周期進行を調節する［Mo
rgan, Ann, Rev. Cell Dev. Biol. 13:261-291 (1997)］。両方ともがＣＤＫリ
ン酸化を阻害するｐ２１およびｐ２７へのＥ７の結合は、ＣＤＫ２活性における
正味の増加をもたらす。これらのインヒビタータンパク質は、少なくとも部分的
には、これらのタンパク質のアミノ末端に見出される共通サイクリン依存性キナ
ーゼ阻害性ドメインを介して作用する細胞周期進行の重要なレギュレータである
とみなされてきた［Polyak, et al., Cell 78:59-66 (1994); Chen, et al., Mo
l. Cell Biol. 16:4673-82 (1996)］。低い腫瘍遺伝子可能性を持つウイルスか
らのＥ７はこれらの結合活性を欠如し、１以上の細胞タンパク質との相互作用は
癌増殖に重要であることを示唆する。これらの特性のいずれがウイルスライフサ
イクルにおいて本質的であるかは不明である［Davies, et al., J. Virol., 67:
2521-8 (1993); Funk, et al., Genes & Dev 11:2090-100 (1997)］。 かくして、当該分野において、Ｅ７がウイルス複製を促進できるメカニズムを
より完全に決定し、Ｅ７特異的活性のインヒビターを同定する方法を開発する必
要がある。Ｅ７の阻害は、強力な抗ウイルス活性を生じ得、したがって、Ｅ７依
存性活性のインヒビターを同定する方法が所望される。
【０００７】 発明の概要 本発明は、抗ウイルス剤を同定する方法を提供する。好ましい具体例において
、本発明の方法は、ヒト・パピローマウイルスの増殖を低減するか、または阻害
する剤を同定する。 本発明は：（ａ）ヒト・パピローマウイルスまたはその断片の存在下、および
試験化合物の存在下または不存在下でのＣＤＫ２基質へのＣＤＫ２キナーゼ活性
を測定し、次いで、（ｂ）該試験化合物基質の不存在下で検出された該ＣＤＫ２
のリン酸化と比較して、該試験化合物の存在下でＥ７誘発ＣＤＫ２基質の減少し
たリン酸化が検出された場合、該試験化合物をＥ７誘発ＣＤＫ２キナーゼ活性の
インヒビターとして同定するステップを含む、Ｅ７誘発ＣＤＫ２キナーゼ活性の
インヒビターを同定する方法を提供する。本発明のＣＤＫ２キナーゼ活性は、本
明細書に記載され、例示されるＣＤＫ２／サイクリン複合体から検出されるもの
である。一つの局面において、本発明の方法は、ＣＤＫ２を活性化するＥ７断片
の使用を含み、ここに、該Ｅ７断片は、配列番号：１に記載のアミノ酸残基１に
始まり、アミノ酸残基２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５
、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７
、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９
、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１
、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３
、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５
、９６、および９７よりなる群から選択されるカルボキシ末端残基で終わるＥ７
の連続アミノ末端断片よりなる。好ましい具体例において、本発明の方法は、配
列番号：１に記載のアミノ酸残基１ないし２７、アミノ酸残基１ないし３８、ア
ミノ酸残基１ないし４８、アミノ酸残基１ないし６９、およびアミノ酸残基１な
いし８７よりなる群から選択されるＥ７断片の使用を含む。好ましくは、本発明
の方法は、ヒストンＨ１、ＨＰＶタンパク質Ｅ１、およびＨＰＶタンパク質Ｅ２
よりなる群から選択されるＣＤＫ２基質を含む。本発明の方法は、そこでＣＤＫ
２キナーゼ複合体へのＥＰ７結合が、該ＣＤＫ２複合体のサイクリン成分に影響
されるものを含む。
【０００８】 本発明は：（ａ）基質のＣＤＫ２キナーゼリン酸化を測定し；（ｂ）ヒト・パ
ピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７またはその断片の存在下で基質の増加したＣＤ
Ｋ２リン酸化を測定してＥ７誘発ＣＤＫ２キナーゼ活性を決定し；（ｃ）ＨＰＶ
Ｅ７またはその断片の存在下および試験インヒビター化合物の存在下で基質の
ＣＤＫ２キナーゼリン酸化を測定し；次いで、（ｄ）ステップ（ｂ）で測定され
た増加したリン酸化が、該試験化合物の存在するステップ（ｃ）において減少す
る場合、該試験化合物をＥ７誘発ＣＤＫ２キナーゼ活性のインヒビターとして同
定するステップを含む、Ｅ７誘発ＣＤＫ２キナーゼ活性のインヒビターを同定す
る方法も提供する。一つの局面において、本発明の方法は、ＣＤＫ２を活性化す
るＥ７断片の使用を含み、ここに、該Ｅ７断片は、配列番号：１に記載のアミノ
酸残基１に始まり、アミノ酸残基２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、
３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、
４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、
５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、
７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、
８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、
９４、９５、９６、および９７よりなる群から選択されるカルボキシ末端残基で
終わるＥ７の連続アミノ末端断片よりなる。好ましい具体例において、本発明の
方法は、配列番号：１に記載のアミノ酸残基１ないし２７、アミノ酸残基１ない
し３８、アミノ酸残基１ないし４８、アミノ酸残基１ないし６９、およびアミノ
酸残基１ないし８７よりなる群から選択されるＥ７断片の使用を含む。好ましく
は、本発明の方法は、ヒストンＨ１、ＨＰＶタンパク質Ｅ１、およびＨＰＶタン
パク質Ｅ２よりなる群から選択されるＣＤＫ２基質を含む。
【０００９】 本発明は：（ａ）ＣＤＫ２キナーゼ活性におけるＥ−７誘発増大のインヒビタ
ーを同定し；（ｂ）（ａ）で同定されたインヒビターの存在下および不存在下で
ウイルス増殖を測定し；次いで、（ｃ）該インヒビターの不存在下でのウイルス
増殖と比較して、該インヒビターの存在下で減少したウイルス増殖が検出された
場合、該インヒビターを抗ウイルス剤として同定するステップを含む、抗ウイル
ス剤を同定する方法も提供する。
【００１０】 本発明は、ＨＰＶ感染細胞をＥ７誘発ＣＤＫ２リン酸化のインヒビターに接触
させるステップを含む、ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７誘発ＣＤＫ２
キナーゼ活性を低減する方法をさらに提供する。もう一つの具体例において、本
発明は、ＨＰＶ感染細胞をＣＤＫ２キナーゼ複合体へのＥ７結合のインヒビター
に接触させることを含む、ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７誘発ＣＤＫ
２キナーゼ活性を低減する方法を提供する。
【００１１】 本発明は、その必要がある個人に、有効量のＨＰＶ Ｅ７誘発ＣＤＫ２キナー
ゼ活性インヒビターを投与するステップを含む、ヒト・パピローマウイルス（Ｈ
ＰＶ）増殖を軽減する方法も提供する。もう一つの局面において、本発明は、そ
の必要がある個人に、有効量のＣＤＫ２キナーゼ複合体へのＨＰＶ Ｅ７結合の
インヒビターを投与するステップを含む、ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）
増殖を軽減する方法を提供する。
【００１２】 発明の詳細な記載 本発明の方法は、ＣＤＫ２キナーゼ活性を誘発するウイルスタンパク質の使用
を含む。好ましくは、本発明の方法に用いるウイルスタンパク質は、（本明細書
で例示される）ＨＰＶ Ｅ７または、Ｅ７ Ｃｒ１および／またはＣＲ２領域に少
なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少
なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少
なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少
なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％相同である他のウイルスタンパク質
である。相同性は、例えば、基本的なＢＬＡＳＴ調査解析を用いて、デフォルト
パラメータで決定し得る。Ｅ７のＣＲ１および／またはＣＲ２領域に相同な例示
的なウイルスタンパク質は、アデノウイルスＥ１ＡおよびＳＶ−４０ Ｔ抗原を
含む。
【００１３】 本発明は：（ａ）ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７またはそのＥ７断
片の存在下、および試験化合物の存在下または不存在下でのＣＤＫ２基質へのＣ
ＤＫ２キナーゼ活性を測定し、次いで、（ｂ）該試験化合物基質の不存在下で検
出された該ＣＤＫ２のリン酸化と比較して、該試験化合物の存在下でＥ７誘発Ｃ
ＤＫ２基質の減少したリン酸化が検出された場合、該試験化合物をＥ７誘発ＣＤ
Ｋ２キナーゼ活性のインヒビターとして同定するステップを含む、Ｅ７誘発ＣＤ
Ｋ２キナーゼ活性のインヒビターを同定する方法を提供する。Ｅ７誘発ＣＤＫ２
キナーゼ活性は、Ｅ７およびＣＤＫ２キナーゼインヒビターの不存在下で観察さ
れたＣＤＫ２基質リン酸化と比較して、ＣＤＫ２キナーゼインヒビター（例えば
、ｐ２１および／またはｐ２７）の不存在下で該ＣＤＫ２複合体をＥ７と接触さ
せたときに観察されるＣＤＫ２基質の増加したリン酸化である。かくして、所望
により、Ｅ７不存在下のＣＤＫ２キナーゼ活性を対照と決定することができる。
一つの局面において、本発明の方法は、該ＣＤＫ２複合体を活性化する（ＣＤＫ
２活性を誘発する他のウイルスＥ７ホモログまたはオルトログを含む）Ｅ７の断
片またはその変異体の使用を含む。例示的なＥ７断片は、配列番号：１に記載の
アミノ酸残基１に始まり、アミノ酸残基２７、２８、２９、３０、３１、３２、
３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、
４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、
５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、
６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、
８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、
９３、９４、９５、９６、および９７よりなる群から選択されるカルボキシ末端
残基で終わるＥ７の連続アミノ末端断片よりなる。好ましい具体例において、本
発明の方法は、配列番号：１に記載のアミノ酸残基１ないし２７、アミノ酸残基
１ないし３８、アミノ酸残基１ないし４８、アミノ酸残基１ないし６９、および
アミノ酸残基１ないし８７よりなる群から選択されるＥ７断片の使用を含む。本
明細書で用いるＥ７変異体は、天然に産出するＥ７とは全く異なるがＣＤＫ２キ
ナーゼ活性を誘発する能力は保持するＥ７ポリペプチドをもたらす付加、欠失、
置換および他の共有的修飾を含むＥ７タンパク質を含む。好ましくは、本発明の
方法は、ヒストンＨ１、ＨＰＶタンパク質Ｅ１およびＨＰＶタンパク質Ｅ２より
なる群から選択されるＣＤＫ２基質を含むが、本発明の方法は、ＣＤＫ２のいず
れの生理学的、非生理学的または合成基質の使用も含む。合成基質は、天然に産
出するＣＤＫ２基質の非天然産出断片、アナログおよび変異体を包含する。好ま
しい具体例において、本発明の方法は、ｐ２１およびｐ２７のごときＣＤＫ２イ
ンヒビタータンパク質の不存在下で行われ、これによって、ＤＣＫ２阻害におい
てＥ７誘発低減よりも、むしろ、Ｅ７誘発キナーゼ活性を与える。
【００１４】 本発明は：（ａ）基質のＣＤＫ２キナーゼリン酸化を測定し；（ｂ）ヒト・パ
ピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７またはその断片の存在下で基質の増加したＣＤ
Ｋ２キナーゼリン酸化を測定してＥ７誘発ＣＤＫ２キナーゼ活性を決定し；（ｃ
）ＨＰＶ Ｅ７またはその断片の存在下および試験インヒビター化合物の存在下
で基質のＣＤＫ２キナーゼリン酸化を測定し；次いで、（ｄ）ステップ（ｂ）で
測定された増加したリン酸化が、該試験化合物の存在するステップ（ｃ）におい
て減少した場合、該試験化合物をＥ７誘発ＣＤＫ２キナーゼ活性のインヒビター
として同定するステップを含む、Ｅ７誘発ＣＤＫ２キナーゼ活性のインヒビター
を同定する方法も提供する。一つの局面において、本発明の方法は、ＣＤＫ２を
活性化するＥ７断片の使用を含み、ここに、該Ｅ７断片は、配列番号：１に記載
のアミノ酸残基１に始まり、アミノ酸残基２７、２８、２９、３０、３１、３２
、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４
、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６
、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８
、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０
、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２
、９３、９４、９５、９６、および９７よりなる群から選択されるカルボキシ末
端残基で終わるＥ７の連続アミノ末端断片よりなる。好ましい具体例において、
Ｅ７断片の使用を含む本発明の方法は、配列番号：１に記載のアミノ酸残基１な
いし２７、アミノ酸残基１ないし３８、アミノ酸残基１ないし４８、アミノ酸残
基１ないし６９、およびアミノ酸残基１ないし８７よりなる群から選択されるＥ
７断片を含む。好ましくは、本発明の方法は、ヒストンＨ１、ＨＰＶタンパク質
Ｅ１、およびＨＰＶタンパク質Ｅ２よりなる群から選択されるＣＤＫ２基質を含
む。該ＣＤＫ２キナーゼ活性を生じるＣＤＫ２複合体の成分は、サイクリン、例
えば、例えばＡ１およびＡ２を含むＡファミリーのメンバー、例えばＢ１および
Ｂ２を含むＢファミリーのメンバー、サイクリンＣ、例えばＤ１、Ｄ２およびＤ
３を含むＤファミリーのメンバー、例えばＥ１、Ｅ２およびＥｓを含むＥファミ
リーのメンバー、サイクリンＦ、例えばＧ１およびＧ２を含むＧファミリーのメ
ンバー、サイクリンＨ、サイクリンＩ、サイクリンＬ、および例えばＴ１、Ｔ２
ａ、およびＴ２ｂを含むＴファミリーのメンバーを該サイクリンがＣＤＫ２に結
合し、ＣＤＫ２キナーゼ活性へ影響することに関与する程度まで含むであろう。
【００１５】 本発明の方法は、天然に産出する起源ならびに所望する組換え産物をコードす
る１以上のポリヌクレオチドで形質転換されたまたはトランスフェクトされた組
換え起源からのＣＤＫ２複合体タンパク質、Ｅ７および／またはＣＤＫ２基質化
合物の使用を包含する。ＣＤＫ２キナーゼ活性を誘発するＥ７の断片も含まれる
。好ましくは、該ＣＤＫ２複合体、Ｅ７（またはその断片）および／またはＣＤ
Ｋ２基質化合物は組換え産物である。該化合物は、精製を容易にする方法によっ
ても生成し得る。すなわち、融合タンパク質がラベルまたはタグを含むとき、そ
れによって、かなり純粋な化合物の生成を許容する。好ましいラベルまたはタグ
は、（グルタチオン寒天を用いて精製を可能にする）グルタチオン−Ｓ−トラン
スフェラーゼ配列または（ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを用いて
精製を可能にする）ポリヒスチジン領域である。当該分野でよく知られ、規定通
りに用いられる他のラベルまたはタグも意図される。本発明は、しかしながら、
本質的に他のヒトタンパク質を含まないＥ７、ＣＤＫ２複合体、およびＣＤＫ２
基質の粗調製を用いる方法も包含する。
【００１６】 本発明の多数の具体例はＥ７（またはその断片）と該ＣＤＫ２複合体との結合
を妨げるか、逆転させるか、または不安定にする試験化合物の存在下、Ｅ７誘発
ＣＤＫ２キナーゼ活性の減少を検出するために実行する。このタイプの好ましい
方法は、溶液アッセイで実行する。このタイプの溶液キナーゼアッセイ、例えば
、ヒストンキナーゼアッセイは、当該分野でよく知られ、規定通り行われている
。
【００１７】 本発明の方法は、Ｅ７（または、ＣＤＫ２キナーゼ活性を誘発する能力を保持
するその断片、変異体もしくはアナログ）あるいは該ＣＤＫ２複合体に結合する
かのいずれかが固相担体に固定化され、固定化されていないいずれかのＥ７（ま
たはその断片、アナログもしくは変異体）あるいは該ＣＤＫ２複合体を検出可能
にラベル化するものを含む。該２つの化合物間の結合を試験化合物の存在下およ
び不存在下で調べ、結合した検出可能ラベルの量の変化を測定する。該試験化合
物の存在下でより少ない量の結合したラベルが検出されるアッセイにおいて、該
試験化合物は該ＣＤＫ２複合体へのＥ７結合のインヒビターであると同定される
。引続くキナーゼアッセイを用いて、該試験化合物のキナーゼ活性に対する効果
を決定する。
【００１８】 本発明は、Ｅ７とＣＤＫ２複合体との結合のインヒビターならびにＥ７促進リ
ン酸化のインヒビターを同定し得る細胞ベースのアッセイも含む。一つの局面に
おいて、本発明は、概略的に、１９９８年４月２日に公開され、出典明示して本
明細書の一部とみなされるＷＯ９８／１３５０２に記載されるスプリットハイブ
リッドアッセイ(split hybrid assay)を提供し、そこでは、例えば、（ｉ）該Ｃ
ＤＫ２複合体の成分は転写因子ＤＮＡ結合ドメインまたは転写因子トランス活性
化ドメインのいずれかを含むアミノ酸配列を持つ融合タンパク質として発現され
、および（ｉｉ）Ｅ７（またはその断片）もいずれかの転写因子ドメインが該Ｃ
ＤＫ２複合体タンパク質に融合されていない融合タンパク質として発現される。
該ＣＤＫ２複合体とＥ７融合タンパク質との間の結合は該転写因子の２つの成分
を近接させて生物学的活性な転写因子を生成する。レプレッサー遺伝子をコード
するプラスミドも同じ細胞型に導入され、該レプレッサーの発現は該２つの融合
タンパク質を含む生物学的活性な転写因子により認識される転写エレメントによ
り駆動される。次いで、該発現エレメントは、レポーター遺伝子の転写を妨げる
ように作用する。該Ｅ７とＣＤＫ２複合体融合タンパク質との間の結合を阻害す
る化合物の存在下、該生物学的活性な転写因子は形成されず、該レプレッサータ
ンパク質は発現されず、および該レポーター遺伝子の転写が可能となる。このタ
イプのアッセイにおいて、特異的結合相互作用の阻害は、正信号、すなわち、検
出可能なレポーター遺伝子の発現により検出する。本発明は、１９９５年８月３
日に公開され、出典明示して本明細書の一部とみなされるＷＯ９５／２０６５２
に記載されるこの方法についての多数の変形も包含する。さらに、本発明は、以
前記載されたジハイブリッドまたはツーハイブリッドアッセイ［Fields and Son
g, Nature 340:245-246 (1989); Fields, Methods: A Companion to Methods in
Enzymology 5: 116-124 (1993);１９９４年２月１日にFieldsらに対して発行さ
れた米国特許第５,２８３,１７３号］を包含し、そこでは、特異的結合相互作用
の阻害が負信号、すなわち、レポーター遺伝子の損失または発現により検出され
る。ジハイブリッドアッセイ（当該分野では「ツーハイブリッド」アッセイとも
いう）に対する修飾および変形は以前に記載され［Colas and Brent, TIBTECH 1
6:355-363 (1998)］、本明細書に包含される。しかしながら、細胞ベースのアッ
セイにおいては、正信号での結合の阻害の検出が好ましい。
【００１９】 もう一つの局面において、細胞ベースのアッセイが提供され、そこでは、Ｅ７
および該ＣＤＫ２キナーゼ複合体の成分が細胞内で発現（または過剰発現）され
、Ｅ７促進リン酸化を低減するインヒビターが同定される。所望により、Ｅ７促
進リン酸化の検出はＥ７の不存在下でＣＤＫ２キナーゼ複合体成分を発現する対
照細胞系統を用いて達成し得る。この対照細胞におけるキナーゼ活性はキナーゼ
複合体活性の基底レベルを同定するであろう。このタイプのアッセイについての
細胞系統はＥ７および／または該ＣＤＫ２複合体の成分をコードする外来ＤＮＡ
の導入によるか、または当該内在性細胞ゲノム中でコードされるこれらのアッセ
イ成分の１以上の発現を増加させる外来ＤＮＡを導入することによって生成し得
る。
【００２０】 本発明のアッセイは、特に、高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセ
イにかなう。ＨＴＳは、効果的に、多数（すなわち、数十ないし数千以上）の化
合物のスクリーニングを可能にする。細胞ベースＨＴＳ系も包含され、メラノフ
ォアアッセイ、酵母ベースアッセイ系、および哺乳類細胞発現系［Jayawickreme
and Kost Curr. Opin. Biotechnol. 8:629-634 (1997)］を含む。特に、自動化
およびミニチュア化ＨＴＳアッセイが好ましい［Houston and Banks, Curr. Opi
n. Biotechnol. 8:734-740 (1997)］。ＨＴＳアッセイは、所望する阻害特性を
有する「ヒット」または「リード化合物(lead compounds)」を同定するように設
計され、そこから、該所望する特性を向上するように修飾を設計し得る。しばし
ば、該「ヒット」または「リード化合物」の化学修飾は、「ヒット」と１以上の
結合パートナーポリペプチドとの間の同定可能な構造／活性関係に基づく。
【００２１】 特定の小分子インヒビターの同定のために用いられる多数の異なるライブラリ
ーが存在し、（１）化学ライブラリー、（２）天然産物ライブラリー、および（
３）無作為ペプチド、オリゴヌクレオチドまたは有機分子よりなるコンビナトリ
アルライブラリーを含む。 化学ライブラリーは、既知の化合物または天然産物スクリーニングにより「ヒ
ット」または「リード」と同定される化合物よりなる。天然産物ライブラリーは
、微生物、動物、植物または海洋生物のコレクションから誘導され、それを用い
て、（１）土壌、植物または海洋微生物からのブロスの発酵もしくは抽出、また
は（２）植物もしくは海洋生物の抽出によって、スクリーニング用混合物を生成
する。天然産物ライブラリーは、ポリケチド、非リボソームペプチド、および（
非天然的に産生する）それらの変異体を含む。レビューとして、例えば、出典明
示して本明細書の一部とみなされる［Science 282:63-68 (1998)］を参照せよ。
コンビナトリアルライブラリーは多数のペプチド、オリゴヌクレオチド、または
有機化合物を混合物として含む。それらは、伝統的な自動化合成方法、ＰＣＲ、
クローニングまたは私有の方法により比較的容易に調製される。特に興味深いこ
とは、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドコンビナトリアルライブラリーである
。興味のあるさらに別のライブラリーは、ペプチド、タンパク質、ペプチドミメ
ティクス、多重平行合成コレクション(multiparallel synthetic collection)、
リコンビナトリアル、およびポリペプチドライブラリーを含む。コンビナトリア
ル化学ライブラリーおよびそれから作製されるライブラリーのレビューとして、
出典明示して本明細書の一部とみなされる［Myers, Curr. Opin. Biotechnol. 8
:701-707 (1997)］を参照せよ。
【００２２】 本発明は、さらに、本発明の方法により同定された特定のインヒビターを提供
する。特定のインヒビターは、ＣＤＫ２複合体へのＥ７結合（またはＣＤＫ２キ
ナーゼ活性）を不可能にするか、逆転させるか、もしくは台無しにし、および／
またはＣＤＫ２キナーゼ活性のＥ７誘発増大を妨げるか、逆転させるかもしくは
台無しにするように作用するものである。Ｅ７誘発ＣＤＫ２キナーゼ活性の特異
的インヒビターおよび医薬上許容される担体を含む組成物も提供する。好ましく
は、本発明の組成物は医薬組成物である。本発明は、ウイルス感染、例えば、Ｈ
ＰＶ感染、アデノウイルス感染、またはＳＶ４０感染を軽減するための医薬の製
造における該ＣＤＫ２複合体へのＥ７結合のインヒビターの使用も提供する。
【００２３】 所望により、本発明の医薬組成物は、医薬賦形剤、補形剤または媒体として機
能する医薬上許容される（すなわち、滅菌および非毒性）の液体、半固体または
固体希釈物を含むことができる。分野公知のいずれの希釈剤も使用することがで
きる。例示的な希釈剤は、限定されないが、モノラウリル酸ポリオキシエチレン
ソルビタン、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシ安息香酸メチルおよびプロ
ピル、タルク、アルギナート、デンプン、ラクトース、スクロース、デキストロ
ース、ソルビトール、マンニトール、アカシアゴム、リン酸カルシウム、鉱油、
カカオ脂およびテオブロマの油を含む。
【００２４】 該医薬組成物は、デリバリーに簡便な形態にパッケージし得る。該組成物をカ
プセル、包装、カシェ、ゼラチン、ペーパー、または他の容器内に封入し得る。
これらのデリバリー形態は、該組成物の受容生物体への移行に適合する場合、特
に、該組成物が単位用量形態でデリバリーすべき場合に好ましい。該用量単位は
、例えば、錠剤、カプセル剤、坐剤またはカシェ剤にパッケージし得る。
【００２５】 本発明は：（ａ）ＣＤＫ２キナーゼ活性におけるＥ７誘発増大のインヒビター
を同定し；（ｂ）（ａ）で同定されたインヒビターの存在下および不存在下でウ
イルス増殖を測定し；次いで、（ｃ）該インヒビターの不存在下でのウイルス増
殖と比較して、該インヒビターの存在下で減少したウイルス増殖が検出された場
合、該インヒビターを抗ウイルス剤として同定するステップを含む、抗ウイルス
剤の同定方法も提供する。一つの局面において、Ｅ７誘発ＣＤＫ２キナーゼ活性
のインヒビターを同定する方法を用いて抗ウイルス剤として用いる試験化合物を
スクリーニングする。同定されたインヒビターは、例えば、細胞ベースのアッセ
イ（すなわち、細胞培養系）および／またはＨＰＶウイルス感染の動物モデルに
おいて抗ウイルス剤として作用する該インヒビターの能力の決定を可能にするア
ッセイにおいて用いる。
【００２６】 本発明のもう一つの局面は、その必要がある個人に、有効量のＥ７誘発ＣＫＤ
２キナーゼ活性インヒビターまたは該ＣＤＫ２複合体へのＥ７結合のインヒビタ
ーを投与するステップを含む、Ｅ７誘発ＣＤＫ２キナーゼ活性を阻害する方法を
提供する。また、その必要がある個人に、有効量のＥ７誘発ＣＫＤ２キナーゼ活
性インヒビターまたは該ＣＤＫ２複合体へのＥ７結合のインヒビターを投与する
ステップを含むウイルス増殖を軽減（阻害）する方法も提供する。さらに、本発
明は、その必要がある個人に、有効量のＥ７誘発ＣＫＤ２キナーゼ活性インヒビ
ターまたは該ＣＤＫ２複合体へのＥ７結合のインヒビターを投与するステップを
含む、ウイルス感染を予防または治療する方法を提供する。好ましくは、該その
必要がある個人には、本発明の医薬組成物が投与される。該医薬組成物は、治療
すべき対象に、例えば、静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、会陰内、 眼内、 眼球
後、肺内（例えば、エアロゾル化薬物溶液）もしくは皮下注射（長期放出用のデ
ポー投与を含む）による；経口、舌下、鼻腔内、肛門内、膣内、もしくは経皮デ
リバリーによる；または、例えば、脾被膜、脳の下、もしくは角膜内に埋め込む
外科手術によることを含むいずれかの常法により導入することができる。該治療
は単一用量または一定期間にわたる複数用量よりなることができる。例えば、ア
シクロビル(acyclovir)、ガンシクロビル(gancyclovir)、ビダラビジン(vidarab
idine)、フォスカーネット(foscarnet)、シドフォビル(cidofovir)、アマンチジ
ン(amantidine)、リバビリン(ribavirin)、トリフルオロチミジン、インターフ
ェロン−α、ジドブジン(zidovudine)、ジダノシン(didanosine)またはザルシタ
ビン(zalcitabine)を含む他の抗ウイルス剤の共投与も意図される。
【００２７】 非経口的に与えられる場合、一般に、特異的結合インヒビター組成物は、一日
あたり１μｇ／ｋｇないし１００μｇ／ｋｇの範囲の用量で、好ましくは一日あ
たり０．１ｍｇ／ｋｇないし５０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量にて、より好ましくは
１ないし２０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の用量にて注射する。該インヒビター組成物
は、最初ボーラスにより、その後、薬物製剤の治療循環レベルを維持する連続注
入により投与することができる。当業者は、良好な医療実践および当該個々の患
者の臨床状態により決定される有効用量および投与処方を容易に最適化するであ
ろう。用量頻度は該剤の薬物動態学パラメータおよび投与経路に依存するであろ
う。最適化医薬製剤は投与経路および所望の用量に依存して、当業者により決定
されるであろう。例えば、その開示は出典明示して本明細書の一部とみなされる
［Remington's Pharamaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing
Co., Easton, PA 18042) pages 1435-1712］を参照せよ。そのような製剤は、投
与された剤の物理状態、安定性、イン・ビボ放出速度、およびイン・ビボ排出速
度に影響するであろう。投与経路に依存して、適当な用量は、体重、体表面積、
または生体サイズに従って計算することができる。上記製剤の各々に関与する治
療用に適当な用量を決定するのに必要な計算のさらなる精密化は、過度な実験な
くして、特に、本明細書に開示される用量情報およびアッセイ、ならびに、ヒト
臨床実験で観察された薬理動態学的データを考慮して、当業者により規定通りに
行われる。適当な用量は、適当な用量−反応データと共に、血中レベル用量を決
定する確立されたアッセイの使用によって、確かめることができる。最終用量処
方は、担当医により、薬物作用を修飾する様々な要因、例えば、該薬物の特異的
活性、該損傷の重篤度、該患者の反応性、該患者の年齢、状態、体重、性別およ
び規定食、いずれの感染の重篤度、投与回数および他の臨床的要因を考慮して決
定される。実験を行うとき、様々な疾患および状態についての適当な用量レベル
および治療の持続時間に関して、さらなる情報が明らかになるであろう。
【００２８】 本発明の医薬組成物および治療方法は、ヒト医薬および動物医薬の分野におい
て、有用であろうことが理解されるであろう。かくして、治療すべき対象は哺乳
類、好ましくはヒトまたは他の動物であってよい。獣医学的目的のため、対象は
、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、およびヤギのごとき家畜、イヌまたネコ
のごとき愛玩動物；外来および／または動物園の動物；マウス、ラット、ウサギ
、モルモット、およびハムスターを含む実験動物；およびニワトリ、シチメンチ
ョウ、アヒル、およびガチョウのごとき家禽を含む。
【００２９】 実施例 本発明を以下の実施例により例示する。実施例１は、様々なタンパク質とのＥ
７の相互作用を特徴付ける結合アッセイに関する。実施例２は、ＣＤＫ２活性へ
のＥ７の効果を調べるキナーゼアッセイを記載する。実施例３は、種々のキナー
ゼへのＨＰＶ Ｅ７の効果に関する。実施例４は、ＣＤＫ２のＥ７誘発活性の反
応速度論を記載する。実施例５は、ＣＤＫ２活性化に必要なＥ７アミノ酸残基の
同定に焦点をあてる。実施例６は、サイクリンＡであるＥ７の相互作用を記載す
る。
【００３０】 実施例１ Ｅ７結合アッセイ ＨＰＶ Ｅ７結合相互作用を特徴付ける試みにおいて、ＨＰＶ６ｂ Ｅ７、ＨＰ
Ｖ１６ Ｅ７またはＨＰＶ３１ Ｅ７のいずれかと種々の細胞タンパク質またはそ
れらの断片とを用いてアッセイを設計した。該Ｅ７タンパク質はグルタチオン−
Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として発現され、精製を容易
にし、発現構築物を以下のように調製した。
【００３１】Ｅ７発現構築物 該Ｅ７遺伝子は、クローン化されたＨＰＶ３１、ＨＰＶ６、ＨＰＶ６ｂ ＤＮ
Ａ（ＨＰＶ３１およびＨＰＶ６ｂについては、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ [ＡＴＣＣ]; ＨＰＶ１６については、［Seed
off et al., Virol. 145:181-185 (1985)］および該ＡＴＣＣからも入手可能）
からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。以下に記載するＰＣＲ
プライマーを設計して、ＢａｍＨＩまたはＸｈｏＩサイトを該増殖産物中に加工
して、発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−３（Pharmacia Biotech）へのイン・フレ
ームサブクローニングを容易にした。該ベクターを用いて、各サブクローン化配
列の産物をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）部分をアミノ末端
に持つ融合タンパク質として発現させた。
【００３２】ＨＰＶ３１プライマー Ｅ７センス（ＢａｍＨＩサイトを持つ） 配列番号：２ CGGGATCCATGCGTGGAGAAACACCTAC Ｅ７アンチセンス（ＢａｍＨＩサイトを持つ） 配列番号：３ CGGGATCCTTACAGTCTAGTAGAACAGＨＰＶ６ｂプライマー Ｅ７センス（ＢａｍＨＩサイトを持つ） 配列番号：４ CGGGATCCATGCATGGAAGACATGTT Ｅ７アンチセンス（ＢａｍＨＩサイトを持つ） 配列番号：５ CCGCTCGAGTTAGGTCTTCGGTGCGCＨＰＶ１６プライマー Ｅ７センス（ＢａｍＨＩサイトを持つ） 配列番号：６ CGGGATCCATGCATGGAGATACACCTAC Ｅ７アンチセンス（ＢａｍＨＩサイトを持つ） 配列番号：７ CCGCTCGAGTTATGGTTTCTGAGAACAGATG
【００３３】 ＨＰＶ３１ Ｅ７につき、該増幅産物は予めＢａｍＨＩで消化したｐＧＥＸ−
４Ｔ−３にサブクローン化し、一方、ＨＰＶ６ｂおよびＨＰＶ１６ Ｅ７増幅産
物は予めＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＧＥＸ−４Ｔ−３にサブクロー
ン化した。制限マッピングを用いて適切な向きを決定し、Ｐｅｒｋｉｎ-Ｅｌｍ
ｅｒ ＡＢＩ-ＰｒｉｓｍＲ技術を用いて配列解析を行い、次いで、該発現構築物
を対数増殖期にあるＥ．ｃｏｌｉ菌のＪＭ１０９株に個々にトランスフェクトし
、０．５ｍＭ ＩＰＴＧで３０℃にて４時間の誘発後、遠心で収穫した。細胞ペ
レットを１１．３ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３８．７ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．０
７％ β−メルカプトエタノール、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、
０．０２５ＩＵ／ｍｌ アプロチニン、および１０ｎＭ ロイペプチンを含有する
溶菌バッファーに再懸濁させ、グルタチオン寒天ビーズ（Sigma）を用いて、製
造業者の提案するプロトコルに準じてタンパク質を精製した。ＰＢＳで徹底的に
洗浄した後、該ＧＳＴ−Ｅ７−連結ビーズを使用するまで４℃にて保存した。タ
ンパク質レベルは、ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイキットを用いて測定し、精
製されたタンパク質調製物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、引続いてクーマシーブルー染
色およびウェスタンブロッティングにより調べた。
【００３４】結合タンパク質発現構築物 完全長Ｅ７結合タンパク質ｐ２１およびｐ２７は、ポリヒスチジンタグと共に
発現させて精製を容易にした。ｐ２１およびｐ２７のヒスチジンタグ化断片も発
現させ、それらは、ｐ２１のアミノ末端残基１〜７８（Ｈｉｓ−ｐ２１Ｎと称す
る）、ｐ２１のカルボキシ末端残基７２〜１６４（Ｈｉｓ−ｐ２１Ｃと称する）
、ｐ２７からのアミノ末端残基１〜１０１（Ｈｉｓ−２７Ｎと称する）またはｐ
２７のカルボキシ末端残基９５〜１９８（Ｈｉｓ−２７Ｃと称する）を含んだ。
該完全長タンパク質または断片ポリペプチドをコードする発現構築物も以下のよ
うにして調製した。
【００３５】 Ｈｉｓ−ｐ２１と称される完全長ヒスチジンラベル化ｐ２１タンパク質は、Ｘ
ｈｏＩ／ＢａｍＨＩ ＰＣＲ断片として、同じ２つの酵素で予め消化されたｐＥ
Ｔ１５ｂ（Novagen）にサブクローン化した。テンプレートＤＮＡは該クローン
化−ｐ２１コード配列であり［Harper et al., Cell 75:805-816 (1993)］、プ
ライマーはｐ−２１−１’およびｐ２１−４’を含んで、該完全長ｐ２１コード
領域を増幅した。該ｐ２１のアミノおよびカルボキシ末端ヒスチジンタグ化断片
もＰＣＲにより増幅して、残基１ないし７８をコードする配列を増幅するために
プライマーｐ２１−１’およびｐ２１−２’、ならびに残基７２ないし１６４を
コードする領域を増幅するためにプライマーｐ２１−３’およびｐ２１−４’を
用いてＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片を生成した。
【００３６】 ｐ２１−１’ GCCTCGAGATGTCAGAACCGGCTGGGGATG 配列番号：８ ｐ２１−２’ GCGGATCCTTAGAAGGTAGAGCTTGGGCAG 配列番号：９ ｐ２１−３’ GCCTCGAGCTGCCCAAGCTCTACCTTC 配列番号：１０ ｐ２１−４’ GCGGATCCTTAGGGCTTCCTCTTGGAG 配列番号：１２
【００３７】 増幅反応は、Ｒｅａｄｙ-ｔｏ-ＧｏＴＭ ＰＣＲ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｅａｄｓ
（Amersham-Pharmacia Biotech）を用い、製造業者の提案するプロトコルに準じ
て行った。反応産物はＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化し、同体積のフェノール
およびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、次いで、２０μｌの水中
に懸濁させた。ベクターｐＥＴ１５ｂ（Novagen）へのライゲーションは、５μ
ｌ ＰＣＲ増幅産物、（予めＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化された）２μｌ ベ
クターＤＮＡ、２μｌ ５×ライゲーションバッファー（BRL）および１μｌ Ｔ
４リガーゼを含有する反応物中で１５℃にて一晩行った。適切な向きを有するク
ローンを選択し、それらの配列は制限解析およびＡＢＩ−ＰＲＩＳＭＲＲ（PE A
pplied Biosystems）技術を用いるＰＣＲ配列決定により確認した。
【００３８】 同様に、Ｈｉｓ−２７と称されるヒスチジンラベル化完全長ｐ２７タンパク質
は、ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ ＰＣＲ断片として、同じ２つの酵素で予め消化され
たｐＥＴ１５ｂ（Novagen）にサブクローン化した。ヒトｐ２７をコードするＤ
ＮＡ［Toyoshima and Hunter, Cell 78:67-74 (1994)］を完全長ｐ２７ ｃＤＮ
Ａを増幅するためのプライマー対ｐ２７−１およびｐ２７−５との増幅反応にテ
ンプレートとして用いた。同一のテンプレートＤＮＡを用いて、ｐ２７のヒスチ
ジンラベル化アミノおよびカルボキシ末端断片をコードするポリヌクレオチドを
増幅し、一緒に、ｐ２７−７’およびｐ２７−８’を用いてｐ２７残基１ないし
１０１をコードするＤＮＡを増幅し、ｐ２７−９’およびｐ２７−１０’を用い
て残基９５ないし１９８をコードするＤＮＡを作製した。
【００３９】 ｐ２７−１ CGGATCCTATGTCAAACGTGCGAGTG 配列番号：１１ ｐ２７−５ AGGATCCTTACGTTTGACGTCTTCTG 配列番号：１３ ｐ２７−７’ GCCTCGAGATGTCAAACGTGCGAGTGTC 配列番号：１４ ｐ２７−８’ GCGGATCCTTACACCTTGCAGGCACCTTTG 配列番号：１５ ｐ２７−９’ GCCTCGAGAAAGGTGCCTGCAAGGTGC 配列番号：１６ ｐ２７−１０’ GCGGATCCTTACGTTTGACGTCTCTG 配列番号：１７
【００４０】 全てのＰＣＲ増幅は、Ｒｅａｄｙ-ｔｏ-ＧｏＴＭ ＰＣＲ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂ
ｅａｄｓ（Amersham-Pharmacia Biotech）を用い、製造業者の提案するプロトコ
ルに準じて行った。
【００４１】 該完全長ｐ２７発現ベクターを生成することにおいて、先ず、該ＰＣＲ増幅産
物をＴＡクローニングキット（Invitrogen）を用いて、製造業者の提案するプロ
トコルに準じて、ベクターｐＣＲＩＩにサブクローン化した。完全長ｃＤＮＡを
ＢａｍＨＩ消化により該ベクターから取り出し、１％寒天ゲル電気泳動を用いて
該配列を単離した。該完全長バンドを該ゲルから切り出し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ Ｒ キット（Bio101)を用い、製造業者の提案するプロトコルに準じて、該断片を
精製した。該単離された断片は、ＢａｍＨＩで予め消化されたベクターｐＴｒｃ
ＨｉｓＢ（Invitrogen）にサブクローン化し、５μｌの消化されたＰＣＲ産物、
２μｌ ５×ライゲーションバッファー（BRL）、および１μｌ Ｔ４リガーゼ（B
RL）を用いて行った。該ライゲーション反応物を用い、標準形質転換プロトコル
に準じて、ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。
【００４２】 残基１ないし１０１および９５ないし１９８をコードするｐ２７ＤＮＡ断片を
クローン化するために、ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化し、同体
積のフェノールおよびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、次いで、
水中に再懸濁させた。上記のようにライゲーションを行い、該ライゲーション産
物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αを形質転換した。クローンを選択し、制限
解析およびＡＢＩ-ＰＲＩＳＭＲ技術を用いるＰＣＲ配列決定により向きを決定
した。
【００４３】 該ヒスチジンタグ化タンパク質をコードする発現構築物は標準技術を用いてＥ
．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（DE3）に形質転換し、発現されたタンパク質は変性条件
下でニッケル寒天アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。溶出さ
れたタンパク質を当該分野でよく知られた技術を用いて、大規模な段階的透析に
より再折畳みした。
【００４４】ＨＥＫ２９３細胞ライゼートの調製 ＨＥＫ２９３細胞を遠心にて収集し、リン酸バッファー化食塩水で２回洗浄し
、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ バナジル
酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１％ ＮＰ−４０Ｒお
よび１０％グリセロールを含有する３倍体積の低塩バッファー中に再懸濁させ、
次いで、氷上で１０分間インキュベートした。細胞を１３,０００×ｇにて遠心
し、細胞質抽出物を含有する上清を収集した。核を含有するペレットを該低塩バ
ッファーで１回洗浄し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、４２０ ＮａＣｌ、
１０ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ バナジン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍ
Ｍ ＥＧＴＡ、０．１％ ＮＰ−４０Ｒおよび１０％グリセロールを含有する３倍
体積の高塩バッファー中に懸濁させた。該核懸濁液を攪拌しつつ、４℃にてイン
キュベートし、１３,０００×ｇにて遠心し、その後、該核ライゼートを収集し
、使用するまで保存した。（下記の）沈降アッセイにおいて、核抽出物を１：２
の比率にて細胞質抽出物と混合した。
【００４５】結合アッセイ条件 グルタチオン寒天ビーズに結合したＧＳＴ−１６Ｅ７またはＧＳＴ−３１Ｅ７
融合タンパク質は、精製されたｐＲｂ（QED Bioscience Inc.）、Ｈｉｓ−ｐ２
１、Ｈｉｓ−ｐ２１Ｎ、Ｈｉｓ−ｐ２１Ｃ、Ｈｉｓ−ｐ２７、Ｈｉｓ−ｐ２７Ｎ
、Ｈｉｓ−ｐ２７Ｃ、またはＨＥＫ２９３細胞ライゼートのいずれかと共に、２
０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ
ＥＧＴＡ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１３％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、および
１×プロテアーゼインヒビタータブレット（Boehringer Mannheim）を含有する
結合バッファー中で４℃にて２時間インキュベートした。結合バファーで５回の
洗浄後、該グルタチオン寒天ビーズをＳＤＳサンプルバッファー中に再懸濁させ
、１００℃まで加熱して、結合タンパク質を溶出した。溶出されたタンパク質は
１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、該タンパク質はクーマシーブルー染色
およびウェスターンブロッティングを用いて分析した。
【００４６】 結果は、ＧＳＴ−３１Ｅ７が精製ｐＲｂおよびＨＥＫ２９３細胞ライゼート中
のｐＲｂに結合することを示した。該ＨＰＶ株からのＥ７タンパク質はｐ２１お
よびｐ２７両方の組換え形態に結合することが分り、以前の観察［Funk, et al.
, Genes & Dev 11:2090-100 (1997); Jones, et al., Genes & Dev. 11:2101-11
(1997); Zerfass, et al., Oncogene 13: 2323-30 (1996)］と一致した。しか
しながら、ｐ２１またはｐ２７のアミノ−またはカルボキシ−末端断片のいずれ
も、該完全長分子と比較して、顕著にはＥ７に結合できず、ｐ２１またはｐ２７
のカルボキシ−またはアミノ−末端半分のいずれもＥ７結合にとって十分ではな
いことを示している。
【００４７】 実施例２ キナーゼアッセイ キナーゼアッセイは、下記のように、Ｓｆ９細胞中でバキュロウイルスベクタ
ーからのサイクリンＥまたはサイクリンＡと共発現されたＣＤＫ２で行う。
【００４８】バキュロウイルスベクター構築物 組換えサイクリンＥおよびサイクリンＢは以下のように調製した。サイクリン
ＥをコードするＤＮＡは、公開された配列に基づいて設計されたプライマーＫＷ
１３３およびＰＨ１１３を用いてヒト肝臓ｃＤＮＡからクローン化した。
【００４９】 ＫＷ１３３ GATCAGATCTCATGAAGGAGGACGGCGGCG 配列番号：１８ ＲＨ１１３ GCAGATCTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGG 配列番号：１９
【００５０】 該サイクリンＥ増幅産物を該ＰＣＲにおいて修飾して、非常に安定な形態の該タ
ンパク質を生じる３’ＲＨ１１３を持つ異常ヌクレオチドを作製した。該増幅産
物は、ＧＳＴ融合体としてコードされたタンパク質を発現するベクターｐＡｃＧ
ＨＬＴ−Ｃ（PharMingen）に挿入した。
【００５１】 該サイクリンＡ遺伝子［Pines and Hunter, Nature 346:760-763 (1990)］は
、該融合遺伝子増幅産物の両側に配置されるＮｏｔＩ制限サイトを導入したプラ
イマーＲＨ１０１およびＲＨ１０３を用いることからのＰＣＲにより増幅した。
【００５２】 ＲＨ１０２ GGGCGGCCGCATGTCCCCTATACTAGGTTAT 配列番号：２０ ＲＨ１０３ GGGCGGCCGCGTCAGTCAGTCACGATG 配列番号：２１
【００５３】 該増幅産物はＧＳＴ融合体としてコードされたタンパク質を発現するバキュロウ
イルストランスファーベクターｐＶＬ１３９２（PharMingen）にサブクローン化
した。制限マッピングは正しい挿入向きを持つクローンを同定し、一つのクロー
ン、ｐＶＬ−ＧＳＴ−サイクリンＡを配列決定し、野生型であると確認した。
【００５４】バキュロウイルス発現 組換えバキュロウイルスは、サイクリントランスファーベクターおよびＢａｃ
ｕｌｏＧｏｌｄクリップル化(crippled)バキュロウイルスＤＮＡ（PharMingen）
と共に、製造業者の提案するプロトコルに準じて、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒ
ｕｇｉｐｅｒｄａ細胞（Ｓｆ９）を共トランスフェクトすることによって生成し
た。得られたウイルスは、３連続プラーク精製で精製した。以前記載された［De
sai et al., Mol. Biol. Cell 3:571-582)］赤血球凝集素タグを持つＣＤＫ２を
発現するバキュロウイルスをＣＤＫ２発現のために用いた。
【００５５】サイクリン／ＣＤＫ２複合体の精製 サイクリンＥおよびサイクリンＡは、Ｓｆ９またはＨｉｇｈ ＦｉｖｅＴＭ（I
nvitrogen）細胞のいずれかと該サイクリン発現ウイルスについて２０の、およ
び該ＣＤＫ発現ウイルスについて１０の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）にての組換
えバキュロウイルスとの共インフェクションによって、ＣＤＫ２と共発現させた
。Ｓｆ９細胞は、２８℃にて、回転フラスコ中、１０％ 胎児ウシ血清（ＦＢＳ
）、１００単位／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン
を含有するグレース培地（GIBCO/BRL）中で増殖させた。Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞
は、２８℃にて、振盪フラスコ中、１５０ｒ．ｐ．ｍにて、ＩｎｓｅｃｔＥＸＰ
ＲＥＳＳＴＭ培地（Bio Whittaker）中で成長させた。
【００５６】 細胞は遠心で収集し、細胞ペレットはリン酸バッファー化食塩水（ＰＢＳ）で
洗浄し、次いで、該細胞は１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２μｇ／ｍｌロイペプチン、０．２μｇ／ｍｌぺプ
スタチン、０．２μｇ／ｍｌアプロチニン、および０．２ｍＭ ＡＥＢＳＦを含
有する高張溶菌バッファー中に、初期感染した各１０７細胞につき１ｍｌの密度
にて再懸濁させた。１時間後、ＮａＣｌを添加して、１５０ｍＭの最終濃度にし
た。細胞に氷上で２分間超音波照射し（４の出力での１００％デューティーサイ
クル）、該ライゼートを遠心で透明化した。該ＧＳＴ−サイクリン／ＣＤＫ２複
合体は、グルタチオン−セファロースＲビーズ（Pharmacia Biotech）を用いる
アフィニティークロマトグラフィーによって単離した。該ビーズをＰＢＳで徹底
的に洗浄し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中の１５ｍＭ還元グルタ
チオンで溶出した。溶出されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスター
ンブロッティングによって分析して、該サイクリンＡ−およびサイクリンＥ−Ｃ
ＤＫ２複合体の純度を確認した。
【００５７】ＭＢＰ−Ｅ１およびＭＢＰ−Ｅ２発現および精製 マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）−Ｅ１融合タンパク質発現ベクターを以
下のように構築した。簡単には、該ベクターは、ｐＳＧＥ１−１８からのＨＰＶ
１８Ｅ１遺伝子［Sverdrup and Khan, J. Virol. 68:505-509 (1994)］を増幅し
、次いで、得られた増幅産物をＢａｍＨＩで予め消化されたｐＭＡＬ−ＣＲ１（
New England Biolabs, Inc.）にクローン化することによって構築した。該Ｅ１
遺伝子の５’および３’端に対するプライマーはＢａｍＨＩまたはＢｇｌＩＩサ
イトを該増幅産物に含ませた。得られたベクターは誘発性ＭＢＰ−Ｅ１融合タン
パク質をコードした。
【００５８】 該ＭＢＰ−Ｅ１融合タンパク質は、製造業者の提案するプロトコルに準じて精
製した。簡単には、組換えＭＢＰ−Ｅ１融合タンパク質を発現するＥ．ｃｏｌｉ
株ＤＨ５を４リットル規模で発酵させた。細胞は遠心で収集し、該細胞ペレット
は２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ
、１０％グリセロール、および５ｍＭ β−メルカプトエタノールを含有するカ
ラムバッファー中に再懸濁させ、該細胞は、１５,０００ないし２０,０００ｐｓ
ｉにてＡｖｅｓｔｉｎ ＥｍｕｌｓｉｆｌｅｘＴＭダイナミックホモジナイザー
を用いて溶菌した。ライゼートは、５ないし８℃にて、２５,０００×ｇにて６
０分間遠心し、該上清は、０．４５μｍフィルターを通して濾過した。濾過され
た上清を５０ｍｌアミラーゼ樹脂（New England BioLabs）を含有する２．６ｃ
ｍのアミロース−アフィニティーカラム上に充填した。該カラムを１２ベッド体
積のカラムバッファーで洗浄し、カラムバッファー中１０ｍＭ マルトースを用
いて溶出した。抽出画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて純度につき分析した。 Ｅ２マルトース結合融合タンパク質をコードする構築物を同様にして調製した
。
【００５９】キナーゼアッセイ ヒストンＨ１をキナーゼアッセイにおける基質として選んだ。なぜならば、ｐ
Ｒｂ、生理学的ＣＤＫ２基質はＥ７に結合し、該アッセイを妨害するであろうこ
とが知られているからである。必要とされる場合、該ＣＤＫ２キナーゼ活性の５
０％を阻害することが予め論証された濃度にて、Ｈｉｓ−ｐ２７を添加した。 ＧＳＴ−Ｅ７融合タンパク質を上記のように調製し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ 還元グルタチオン、０．１％ トリトンＲ Ｘ−１
００、１ｍ ＤＴＴ、および１×プロテアーゼインヒビタータブレット（Boehrin
ger Mannheim）を含有するバッファーを用いて該グルタチオン寒天ビーズから溶
出した。
【００６０】 いくつかのアッセイについて、ＨＥＫ２９３細胞ライゼート（上記のごとく調
製された１００μｇの全タンパク質）をｐ１３寒天ビーズ（Calbiochem）の存在
下、ＰＢＳ中の精製ＧＳＴ−３１Ｅ７と共に４℃にて１時間プレインキュベート
し、引続き、精製Ｈｉｓ−ｐ２７で４℃にて３０分間インキュベートした。プレ
インキュベーションは、タンパク質複合体形成を可能にするために行い、一方、
ｐ１３寒天ビーズはサイクリンキナーゼ寒天ビーズに結合して、精製を容易にす
る［Dreatta, et al., Cell 56:829-838 (1989)］。収集およびＰＢＳでの４回
の洗浄後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５
ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴ、および１０μＭ ＡＴＰを含有するＫＩＰバッ
ファーで、該ビーズをさらに２回洗浄した。該ビーズを３５μｌ ＫＩＰバッフ
ァーに再懸濁させ、０．６ｍｇ／ｍｌヒストンＨ１、０．２ｍＭ ＡＴＰ、５μ
Ｃｉ[γ−３２Ｐ]−ＡＴＰ／アッセイ、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３、１
０ｍＭ ＥＧＴＡ、および２０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する３５μｌのヒストンキ
ナーゼバッファーと混合し、次いで、室温にて２０分間インキュベートした。反
応を７０μｌの２×ＳＤＳサンプルバッファーの添加によって停止した。リン酸
化タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに引続きオートラジオグラフィーおよびＰｈ
ｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒＲ解析によって解析した。
【００６１】 他のアッセイには、精製サイクリンＡ−またはサイクリンＥ−複合化ＣＤＫ２
が含まれる。ＧＳＴ−Ｅ７をキナーゼバッファー（２０ｍＭ ＭｇＣｌ、１０ｍ
Ｍ ＥＧＴＡ、および４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０）中の精製組換えサイク
リン／ＣＤＫ２複合体に直接添加し、該キナーゼアッセイの開始前に氷上で２０
分間インキュベートした。いくつかのアッセイにおいて、ＧＳＴ−Ｅ７をｐ２１
またはｐ２７でプレインキュベートした。キナーゼ活性は、３０μｌアッセイあ
たり１μｌの２ｍＣｉ／ｍｌ [γ−３２Ｐ]ＡＴＰおよび３．７５μｇヒストン
Ｈ１の添加および３０℃にて２０分間のインキュベーションの後に測定した。反
応をＳＤＳサンプルバッファーの添加によって停止し、リン酸化タンパク質をＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥに引続き、オートラジオグラフィーおよびＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍ
ａｇｅｒＲ分析によって分析した。
【００６２】 結果は、Ｅ７は、サイクリンＥ／ＣＤＫ２活性のｐ２１−およびｐ２７−依存
性阻害に対してほとんどまたは全く効果を有しないことを示し、これらの観察は
、Ｅ７が著しくｐ２１［Funk, et al., Genes & Dev 11:2090-100 (1997); Jone
s, et al., Genes & Dev 11:2101-11 (1997)］および／またはｐ２７［Zerfass,
et al., Oncogene 13:2323-30 (1996)］の阻害活性をブロックするという以前
の報告と一致しなかった。せいぜい、ｐ２７の阻害活性に対して、ほんの少しか
、または全く効果がないことが認められた。
【００６３】 精製されたサイクリンＥ／ＣＤＫ２およびサイクリンＡ／ＣＤＫ２を用いて、
溶液キナーゼアッセイにおいてｐ２７およびＥ７の効果を直接調べた。上記の結
果と同様に、ＣＤＫ２活性のｐ２７阻害に対してほとんどまたは全くＧＳＴ−Ｅ
７の効果がないことが認められた。しかしながら、サイクリンＥ／ＣＤＫ２およ
びサイクリンＡ／ＣＤＫ２ヒストンＨ１キナーゼ活性に対するＧＳＴ−１６Ｅ７
およびＧＳＴ−３１Ｅ７の顕著な効果が認められた。ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇ
ｅＲ分析はＧＳＴ−１６Ｅ７の存在下、サイクリンＡ／ＣＫ２キナーゼ活性に２
６倍の増加を示した。ｐＲｂキナーゼ活性に低めの１．９倍の増加も認められた
。いずれのＧＳＴ−Ｅ７調製物においてキナーゼ活性は認められず、ＧＳＴ単独
でも効果はなかった。これらの結果は、Ｅ７は著しく実質的にサイクリン／ＣＤ
Ｋ複合体の基質特異性を変化させられることを示した。該ＧＳＴ−Ｅ７効果につ
いて線形用量反応が認められ、Ｅ７の５０％刺激濃度は約０．１８μＭであり、
ピーク刺激活性は約０．２９μＭであった。これらの結果は、Ｅ７が、ＣＤＫ２
活性および／または基質としてヒストンＨ１タンパク質を用いる基質特異性を直
接変化させられることを示した。
【００６４】 結果は、精製ＭＢＰ−ＨＰＶ１８Ｅ１融合タンパク質のサイクリンＥ／ＣＤＫ
２リン酸化がＨＰＶ１６Ｅ７の添加により２．３倍に刺激されることも示した。
ＣＤＫ２はＭＢＰ単独でリン酸化しなかった。Ｅ１のリン酸化は、過剰なＧＳＴ
−１６Ｅ７の存在下でさえ、ｐ２７の添加によって完全に阻害された。かくして
、ＧＳＴ−Ｅ７は、ＨＰＶ１８Ｅ１を含む複数基質のＣＤＫ２依存性リン酸化を
直接促進できた。ＣＤＫ２／サイクリンＡによるＨＰＶ Ｅ２のリン酸化もＥ７
の添加によって促進されたが、Ｅ２は、Ｅ７の存在下または不存在下でＣＤＫ２
／サイクリンＥに対して、不充分な基質であった。
【００６５】 Ｅ１リン酸化は重要な生物学的イベントである。何故ならば、それは、通常、
ＤＮＡ合成を支持しない分化細胞中でのＨＰＶゲノム増幅を可能にするからであ
る。Ｅ１は、起点依存性ＨＰＶ複製を開始する７２ｋＤａのリンタンパク質であ
る［Cho, et al., Intervirology 1994;37:150-8 (1994)］。アミノ配列相同性
に基づき、Ｅ１はヘリカーゼスーパーファミリーＩＩに分類されている［Koonin
, Nucl. Adids Res. 21:2541-7 (1993)］。Ｅ１のリン酸化は、ＨＰＶ ＤＮＡ複
製イン・ビトロ活性を活性化するのに重要であり、リン酸化がウイルスと宿主複
製機構とを調和させるのに重要であることを示唆している［Ma, et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. (USA) 96:382-7 (1999)］。Ｅ１はＲＸＬサイクリン相互作用
モチーフを持ち、それは、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）によるその効率
的なリン酸化を可能にする。ＣＤＫリン酸化サイトを欠如するＥ１はＥ２に結合
するが、ＨＰＶ複製を活性化するには不完全である［Ma, et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. (USA) 96:382-7 (1999)］。上記のリン酸化結果は、したがって、Ｈ
ＰＶ Ｅ７をＥ１に対するＣＤＫ２特異性に再指向するであろうメカニズムおよ
びＥ７が分化ケラチノサイトにおけるウイルスＤＮＡ複製を優先的に促進するで
あろう手段を示唆する。
【００６６】 結果は、Ｅ７はｐ２１およびｐ２７に結合し得るが、Ｅ７はこれらのタンパク
質のＣＤＫ阻害活性に打ち勝つ能力をほとんどまたは全く有しないことも示唆し
、これらの結果は以前の報告と一致しない。しかしながら、以前刊行された研究
は、Ｅ７−ＣＤＫインヒビター相互作用の機能的局面の研究をするために免疫沈
降キナーゼ活性を用い［Funk, et a., Genes & Dev 1:2090-100 (1997); Jones,
et al., Genes & Dev 11:2101-11 (1997); Zerfass, et al., Oncogene 13:232
3-30 (1996)］、一方、本発明の研究は精製キナーゼ複合体を用いた。したがっ
て、以前の研究は、これらの調製物の純度の欠如のため、キナーゼ活性に対する
いずれかの直接的Ｅ７効果を観察していたか、そのような効果は、該キナーゼへ
の直接的な結合ではなくて、該インヒビターへの結合に起因すると誤って解釈さ
れていたかであろう。 さらに、本発明の結果は、腫瘍遺伝子進行の高いまたは低い両方の可能性を持
つパピローマウイルスから誘導されたＨＰＶ−Ｅ７が著しくＣＤＫ２を活性化す
ることを示した。ＨＰＶ３１およびＨＰＶ１６は、それぞれ、１２．６および１
８．２倍ＣＤＫ２ヒストンキナーゼ活性を活性化し、一方、ＨＰＶ６ｂからのロ
ーリスク誘導Ｅ７は１５．８倍活性化した。
【００６７】 実施例３ 種々のキナーゼに対するＨＰＶ Ｅ７の効果 キナーゼ活性に対するＥ７効果が該サイクリン依存性キナーゼファミリーのメ
ンバーに特異的であるどうかを決定するための試みにおいて、種々のキナーゼ／
基質の組合せをＥ７存在下での促進された活性につき調べた。 基質としてヒストンＨ１を用いて、ＨＰＶ１６−Ｅ７をサイクリンＡ／ＣＤＫ
２またはサイクリンＥ／ＣＤＫ２のいずれかに添加した場合、上記のように、対
照に対して大きな増加（２６倍および１３倍）が認められた。サイクリンＥ／Ｃ
ＤＫ２に対する基質として網膜芽腫（ｐＲｂ）タンパク質を用いた場合、バック
グラウンドに対して、１．９倍の増加が認められた。ｐ２５と複合化する関連す
るサイクリン依存性キナーゼＣＤＫ５もＨ１リン酸化に増加を示したが、対照に
対して４．５倍の増加のＣＤＫ２よりも少なかった。他のアッセイにおいて、Ｍ
ＡＰキナーゼ活性およびＣＤＣ２／サイクリンＢ活性はＨＰＶ１６Ｅ７に影響さ
れないことが示され、Ｅ７キナーゼ活性は該サイクリン依存性キナーゼファミリ
ーのメンバーに特異的であることを示唆する。
【００６８】 実施例４ ＨＰＶ Ｅ７によるＣＤＫ２の活性化の反応速度論 次いで、ＣＤＫ２／サイクリンＡヒストンキナーゼ活性のＨＰＶ１６−Ｅ７刺
激への基質濃度の効果を決定する実験を設計し、実施例２に上記したキナーゼア
ッセイ実験条件を些細な修飾をして用いた。最初の実験は、１５分間のアッセイ
は該キナーゼ活性の直線範囲にあたることを示し、その結果、全てのアッセイを
１５分間で行った。さらに、サイクリンＡ／ＣＤＫ２複合体は、以前の実験でＣ
ＤＫ２キナーゼの最大活性化を生じることが決定されている量のＨＰＶ１６−Ｅ
７と共にプレインキュベートした。
【００６９】 この手法を用いると、結果は、ミカエリス−メンテン式を用いる非線形最小自
乗曲線フィットを可能にし、ヒストンＨ１に対して、１．１±０．２μＭのＫｍ 、サイクリンＡ／ＣＤＫ２によるヒストンリン酸化について以前決定された該Ｋ ｍ と同様の１．４μＭの濃度［Connell-Crowley et al., Mol. Biol. Cell 4:79
-92 (1993)］を与えた。したがって、これらの結果は、ＨＰＶ−Ｅ７がＣＤＫ２
活性に対して有する大きな効果は、基質結合の変化によっては達成されないが、
その代わりに、該ＣＤＫ２触媒メカニズムの直接変化によって達成されることを
示した。
【００７０】 実施例５ Ｅ７の突然変異誘発および重要なアミノ酸配列の決定 ＣＤＫ２の結合および／または活性化に重要なＥ７アミノ酸を同定する試みに
おいて、該Ｅ７配列に点突然変異を導入し、ＣＤＫ２キナーゼ活性の変化を下記
（以下）のように決定した。一般に、Ｅ７の構造は３つの領域に分割し得る：Ｃ
Ｒ１はアミノ酸残基１からだいたい残基１６まで広がり、ＣＲ２はだいたいアミ
ノ酸１７ないし３８を含み、およびＣＲ３はだいたい残基３９ないし９８を包含
する。ＣＲ２およびＣＲ３の各々の中に、いくつかの生物学的重要な領域が同定
され、ＣＲ２内にＲｂ結合ドメイン（残基２２〜２６）およびカゼインキナーゼ
ＩＩリン酸化サイト（残基３１〜３７）、ＣＲ３内に少なくとも２つの亜鉛結合
ドメインを含む。様々な突然変異体をこれらのＥ７領域を考慮して調製した。
【００７１】Ｅ７点突然変異 Ｅ７構築物のすべての部位指向突然変異は、ＱｉｋＣｈａｎｇｅＴＭキット（
Stratagene）を用いて行った。ほとんどの場合、ＨＰＶ１６Ｅ７は突然変異化さ
れた。９８個のアミノ酸タンパク質ＨＰＶ１６Ｅ７の以前規定された機能的領域
内の以下の保存アミノ酸変化を導入した：
【００７２】
【表１】
【００７３】 下記のＰＣＲプライマーを用いて該変化を導入した。 Ｍ１２→Ｌ１２（Δ１２） センス 配列番号：２２ TACATTGCATGAATATTTGTTAGATTTGCAACCAG アンチセンス 配列番号：２３ CTGGTTGCAAATCTAACAAATATTCATGCAATGTA Ｃ２４,Ｅ２６→Ｓ２４,Ｄ２６（Δ２４,２６） センス 配列番号：２４ GAGACAACTGATCTCTACTCTTATGTCAATTAAATGACAGC アンチセンス 配列番号：２５ GCTGTCATTTAATTGATCATAAGAGTAGAGATCAGTTGTCTC Ｓ３１,Ｓ３２→Ｇ３１,Ｇ３２（Δ３１,３２） センス 配列番号：２６ GAGCAATTAAATGACGGCGGAGAGGAGGAGGATGAA アンチセンス 配列番号：２８ TTCATCCTCCTCCTCTCCGCCGTCATTTAATTGCTC Ｃ９１→Ｗ９１（Δ９１） センス 配列番号：２７ ACACTAGGAATTGTGGGCCCCATCTGTTCTCAG アンチセンス 配列番号：２９ CTGAGAACAGATGGGGCCCACAATTCCTAGTGT
【００７４】 該Ｅ７コード領域内の複数の突然変異は、一連の部位指向突然変異誘発反応によ
り発生させた。各ステップにて、該突然変異誘発は、配列解析によって確認した
。単離された突然変異タンパク質を上記の条件下でＣＤＫ２を活性化する相対能
力につき調べた。結果を以下のテーブル１に記載する。
【００７５】
【表２】
【００７６】 結果は、Ｅ７は以前に決定された機能的ドメイン内のアミノ酸配列における複
数変化を許容し得、依然として、ＣＤＫ２キナーゼ活性を活性化し得ることを示
した。この結論は、５つまでの突然変異した残基を有するＥ７がＣＤＫ２を活性
化する能力にほとんど変化を示さなかったことによって論証される。
【００７７】 Ｅ７切取り突然変異体 ＣＤＫ２活性化に必要なＥ７領域をより完全に調べる試みにおいて、Ｅ７断片
を上記アッセイで試験した。ＨＰＶ１６−Ｅ７切取りは、該完全長コードＥ７配
列中の残基８７、６９、４８、３８、２７および１５の後に停止コドンが導入さ
れたＤＮＡを用いて発現させた。該ＧＳＴ−ＨＰＶ１６ Ｅ７ ｐＧＥＸ−４Ｔ−
３発現構築物は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ（Stratagene）での部位指向的当
然変異誘発を用いて修飾し、該適切な配列変化は、Ｐｅｒｋｉｎ-Ｅｌｍｅｒ Ａ
ＢＩ-ＰＲＩＳＭＲを用いて、配列によって確認した。該切取りＥ７−ＧＳＴ融
合タンパク質を精製し、上記のように試験した。該Ｅ７コード領域に停止コドン
を導入するために用いたプライマーを下に記載する。
【００７８】 ＧＳＴ−１６Ｅ７（１〜１５） センス 配列番号：４０ GCATGAATATATGTTAGATTTGTAACCAGAGACAACTGATCTC アンチ 配列番号：４１ GAGATCAGTTGTCTCTGGTTACAAATCTAACATATATTCATGC ＧＳＴ−１６Ｅ７（１〜２７） センス 配列番号：３０ CTACTGTTATGAGCAATAAAATGACAGCTCAGAG アンチ 配列番号：３１ CTCTGAGCTGTCATTTTATTGCTCATAACAGTAG ＧＳＴ−１６Ｅ７（１〜３８） センス 配列番号：４２ CAGAGGAGGAGGATGAAATATAAGGTCCAGCTGGACAAGCAG アンチ 配列番号：４３ CTGCTTGTCCAGCTGGACCTTATATTTCATCCTCCTCCTCTG ＧＳＴ−１６Ｅ７（１〜４８） センス 配列番号：３２ GACAAGCAGAACCGGACTGAGCCCATTACAATATTG アンチ 配列番号：３３ CAATATTGTAATGGGCTCAGTCCGGTTCTGCTTGTC ＧＳＴ−１６Ｅ７（１〜６９） センス 配列番号：３４ GCTTCGGTTGTGCGTATAAAGCACACACGTAGAC アンチ 配列番号：３５ GTCTACGTGTGTGCTTTATACGCACAACCGAAGC ＧＳＴ−１６Ｅ７（１〜８７） センス 配列番号：３６ GTTAATGGGCACACTATGAATTGTGTGCCCCATC アンチ 配列番号：３７ GATGGGGCACACAATTCATAGTGTGCCCATTAAC
【００７９】 結果は、当該カルボキシ末端から４８および９８の間のＨＰＶ１６Ｅ７残基の
欠失がＣＤＫ２活性能力に僅かな減少を生じることを示した。ＨＰＶ Ｅ７（１
〜８７）、ＨＰＶ Ｅ７（１〜６９）、ＨＰＶ Ｅ７（１〜４８）は、全て、同程
度のＣＤＫ２活性を示し、完全長Ｅ７の存在下での活性と比較して、それぞれ、
７６．６７％、８３．４５％および７３．２５％の相対キナーゼ活性であった。
ＨＰＶ Ｅ７（１〜３８）もおよそ７２％の相対キナーゼ活性を示した。残基２
８〜４８の切取りは、ＣＤＫ２活性化に、一つの実験では、完全長Ｅ７のものの
２８．６４％まで、反復実験では５２％までの著しい落ち込みをもたらし、該タ
ンパク質のアミノ末端部分に、Ｅ７の大部分のＣＤＫ２活性機能を示した。しか
しながら、ＨＰＶ Ｅ７（１〜１５）は、たった１５％の相対キナーゼ活性しか
示さず、大部分のＣＤＫ２促進活性はＣＲ１およびＣＲ２ Ｅ７領域の両方に見
られる配列に起因することを示す。これらの結果は、以下のＰＣＲ計画を用いる
ＨＰＶ１６ Ｅ７アミノ末端の切取りによって確認した。
【００８０】 該ｐＧＥＸ−４Ｔ−３ ＧＳＴ−ＨＰＶ１６ Ｅ７発現ベクターもテンプレート
として用いて、アミノ末端Ｅ７欠失突然変異体を調製した。ＨＰＶ１６ Ｅ７の
残基１〜３９は、（ｉ）該ｐＧＥＸ−４Ｔ−３ベクターのＥ７遺伝子の５’直接
のアンチセンス鎖にハイブリダイズする逆方向ＰＣＲプライマー、および（ｉｉ
）該Ｅ７遺伝子のコドン３９（およびコドン３９の下流）にての開始にハイブリ
ダイズする順方向の別のプライマーを用いて除去した。ＰＣＲ条件は、カルボキ
シ末端指向突然変異誘発に用いたものと同一であった。該反応は、全体ベクター
をもたらし、Ｅ７遺伝子はＥ７コードアミノ酸残基１〜３８のその領域の発現で
増幅した。用いたプライマーは以下である：
【００８１】 ＧＳＴ−１６７（３９〜９８）プライマー センス 配列番号：３８ GATGGTCCAGCTGGACAAGC アンチセンス 配列番号：３９ CATGGATCCACGCGGAACCAG
【００８２】 得られたＰＣＲ産物はＤｐｎＩで消化してテンプレートＤＮＡを除去し、フェノ
ール−クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿させ、次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｊ
Ｍ１０９に形質転換した。単離されたクローンを調製し、残基１〜３８をコード
するＥ７遺伝子の５’末端を欠損する適切な構築物を制限エンドヌクレアーゼ消
化および配列決定解析によって確認した。該ＧＳＴ−ＨＰＶ１６ Ｅ７（３９〜
９８）ポリペプチドを誘発し、該切取りタンパク質はグルタチオンアフィニティ
ークロマトグラフィーを用いて単離した。適切なサイズは、ＳＤＡ−ＰＡＧＥを
用いて決定した。同様に、ＨＰＶ１６アミノ酸９〜９８および１６〜９８をコー
ドするＧＳＴ−Ｅ７構築物を作製した。
【００８３】 サイクリンＡ／ＣＤＫ２を活性化する能力につきアッセイされたＧＳＴ−ＨＰ
Ｖ１６ Ｅ７（３９〜９８）は完全長ＧＳＴ−ＨＰＶ１６ Ｅ７の活性化活性の２
８．６％を示した。反復実験において、ＧSＴ−ＨＰＶ１６ Ｅ７（３９〜９８）
は、１８％の活性化可能性を示した。しかしながら、ＧＳＴ−ＨＰＶ１６ Ｅ７
（９〜９８）は完全長Ｅ７の６４％活性化を示し、ＧＳＴ−ＨＰＶ１６ Ｅ７（
１６〜９８）は５３％活性化を示した。これらの結果は、該カルボキシ末端切取
り突然変異体を用いた以前の結果と共に、Ｅ７内のより小さな領域、特に、該タ
ンパク質のアミノ末端部分がサイクリン依存性キナーゼの活性化に重要であるこ
とを示す。
【００８４】 これらの結果から、Ｅ７の内部アミノ酸領域または内部Ｅ７配列が除去された欠
失突然変異体のみをコードするさらなる構築物を調製した。構築物ＧＳＴ−１６
Ｅ７（１６〜３８）は、ＧＳＴ−１６ Ｅ７（１６〜９８）をコードする構築物
に停止コドンを導入することによって調製し、一方、構築物ＧＳＴ−１６Ｅ７（
３９〜９８）およびＧＳＴ−Ｅ７（２０〜４８）は、ｐＧＥＸ１６Ｅ７およびｐ
ＧＥＸ１６Ｅ７（１〜４８）をテンプレートとして用いてアミノ末端配列を除去
するためのＰＣＲプライマーを用いるＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ突然変異誘発
キットを用いて調製した。内部Ｅ７アミノΔ９〜１３、Δ１３〜１５、Δ３４〜
３７、Δ２１〜３７、Δ３１〜３７またはΔ１６〜３７を保有する構築物は、製
造業者の提案するプロトコルに準じてＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ突然変異誘発
キットを用い、テンプレートとしてｐＧＥＸ−１６Ｅ７ＤＮＡを用いて除去した
。
【００８５】 構築物ＧＳＴ−１６Ｅ７（１６〜３８）、ＧＳＴ−１６Ｅ７（３９〜９８）、
およびＧＳＴ−１６Ｅ７（２０〜４８）を用いたキナーゼアッセイからの結果は
、これらのＥ７残基は、それぞれ、完全長Ｅ７によるものの５３％、１８％およ
び３３％のレベルまでキナーゼ活性を誘発できることを示した。様々な内部欠失
突然変異体の活性の誘発をテーブル２に示す。
【００８６】
【表３】
【００８７】 まとめると、これらの結果は、Ｒｂ結合ドメイン、カゼインキナーゼＩＩドメイ
ンまたは亜鉛結合ドメインの不活性化は、Ｅ７ＣＤＫ２キナーゼ活性を活性化す
る能力にほんの僅かな減少しかもたらさないことを示す。同様に、該Ｒｂ結合ド
メインおよびカゼインキナーゼＩＩドメイン両方の欠失は完全長Ｅ７につき決定
されたもののたった２８％の損失しか生じず、単独でも組み合せても、ＣＲ１お
よびＣＲ２領域からの内部欠失のいずれもＥ７による活性化に顕著には影響しな
かった。
【００８８】 該Ｅ７ＣＲ１およびＣＲ２領域は、アデノウイルスＥ１Ａタンパク質およびＳ
Ｖ４０Ｔ抗原の非連続部分に高度な類似性を示す。この程度の類似性から、ＣＤ
Ｋ２の活性化もこれらおよび他のウイルス性タンパク質の生物学的特性であるこ
とが予想される。
【００８９】 実施例６ サイクリンＡとのＥ７相互作用 該ＣＤＫ２／サイクリン複合体へのＥ７結合を特徴付けるために、ＣＤＫ２お
よびサイクリンＡを別個に用いて、結合アッセイを行った。 ＨｉｇｈＦｉｖｅＴＭ細胞（Invitrogen）は、ＧＳＴ−サイクリンＡ（上記）
または赤血球凝集素（ＨＡ）−タグ化ＣＤＫ２［Desai, et al., Mol. Cell. Bi
ol. 3:571-582 (1992)］を発現するバキュロウイルスで感染させた。ＧＳＴ−サ
イクリンＡ発現細胞は、溶菌バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８
．０、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｎａ３ ＶＯ４、０．５％ ＮＰ−４０、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、４μｇ／ｍｌア
プロチニンおよび１ｍＭ ＰＭＳＦ）中で溶菌し（４×１０７細胞／ｍｌ）、不
溶性物質を遠心で除去した。ＧＳＴ−サイクリンＡ発現はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよ
び免疫ブロッティングによって確認した。ＨＡ−ＣＤＫ２発現細胞は、低塩高張
溶菌バッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、０．１％ ＮＰ−４０、１ｍＭ ＤＴＴ、２０μＭ 塩化４−（２−
アミノエチル）ベンゼンスルホニル（ＡＥＢＳＦ）および１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＴＭ プロテイナーゼインヒビターカクテル（Boehringer Mannheim））中で溶菌
した。
【００９０】 グルタチオン寒天ビーズ（２５μｌ）（Sigma）をＰＢＳ中の４％ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）でプレインキュベートし、１ｍｌ溶菌バッファーで３×洗浄
し、１ｍｌＧＳＴ−サイクリンＡライゼートに添加し、次いで、混合しながら４
℃にて１時間インキュベートした。該ビーズを１ｍｌ溶菌バッファーで４×洗浄
し、１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する１ｍｌ結合バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、
１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１％ ＮＰ−４０、１２．５％グリセロール、１ｍＭ Ｄ
ＴＴおよび１×ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭプロテイナーゼインヒビターカクテル）で
２×洗浄し、次いで、０．４ｍｌ結合バッファー中に再懸濁させた。精製ＨＰＶ
１６Ｅ７（４μｇ）を該ビーズに添加し、攪拌しながら４℃にて１．５時間イン
キュベートした。該ビーズを１ｍｌ結合バッファーで５×洗浄し、２×Ｌａｅｍ
ｍｌｉバッファー中で沸騰させ、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッテ
ィングを用いて分析した。
【００９１】 粗ＨＡ−ＣＤＫ２ライゼート（０．２ｍｌ）を１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有す
る高張溶菌バッファーチュで１：５に希釈し、１μｇマウスＩｇＧおよび２５μ
ｌプロテインＡ／プロテインＧプラス寒天（Santa Cruz Biotekhnology, Inc.）
で４℃にて１時間透明化した。ＨＡ−ＣＤＫ２の免疫沈降を１μｇ抗ＨＡ−モノ
クローナル抗体１２ＣＡ２（Roche Molecular Biochemicals）および２０μｌプ
ロテインＡ／プロテインＧプラス寒天で、４℃にて１時間行った。該ビーズは、
１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する１ｍｌ高張溶菌バッファーで３×、１ｍｌ結合
バッファーで２×洗浄し、０．４ｍｌ結合バッファーに再懸濁させた。精製ＨＰ
Ｖ１６Ｅ７（４μｇ）を該ビーズに添加し、４℃にて１．５時間インキュベーシ
ョンを行った。該ビーズを１ｍｌ結合バッファーで５×洗浄し、２×Ｌａｅｍｍ
ｌｉサンプルバッファーでブロットし、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブ
ロッティングによって分析した。
【００９２】 結果は、ＧＳＴ−サイクリンＡを含有するビーズへのＥ７結合を示したが、固
定化されたＨＡ−ＣＤＫ２ではビーズへの結合を示さなかった。これらの結果は
、ＣＤＫ２促進キナーゼ活性へのＥ７の作用は、該ＣＤＫ２／サイクリン複合体
中のサイクリン成分との結合相互作用によって影響されるであろうことを示す。
この結合相互作用は、サイクリンがＣＤＫ２基質特異性を媒介することに役割を
演じるという事実［Roberts, Cell 98:129-132 (1999)]の観点から、Ｅ７がＣＤ
Ｋ２基質特異性を変化させられるという理論と一致する。作用の一つの態様にお
いて、Ｅ７結合は、ウイルスＤＮＡ複製に関わるウイルス基質に対してＣＤＫ２
を再指向するであろう。あるいは、Ｅ７結合は、宿主細胞Ｓ期の開始を促進する
ことに関わるか、または、細胞基質を再指向させてウイルスＤＮＡを複製するこ
とに関わるかにいずれかの細胞基質に対するＣＤＫ２特異性を変化させ得る。
【００９３】 上記した例示的実施例に記載された本発明の数多くの修飾および変形は当業者
に思い浮かぶことは予想される。その結果、単に、特許請求の範囲に現われるよ
うな制限のみが本明細書に置かれる。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA28 AA40 BB20 CB01 DA20 FB01 4B063 QA06 QQ95 QR07 QR48 QR79 QS28 4C084 AA17 NA14 ZB33 ZC20

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ｅ７誘発ＣＤＫ２キナーゼ活性のインヒビターを同定する方
    法であって、 （ａ）ヒト・パピローマウイルスまたはその断片の存在下、および試験化合物
    の存在下または不存在下でのＣＤＫ２基質へのＣＤＫ２キナーゼ活性を測定し、
    次いで、 （ｂ）該試験化合物基質の不存在下で検出された該ＣＤＫ２のリン酸化と比較
    して、該試験化合物の存在下でＥ７誘発ＣＤＫ２基質の減少したリン酸化が検出
    された場合、該試験化合物をＥ７誘発ＣＤＫ２キナーゼ活性のインヒビターとし
    て同定するステップを含む該方法。
  2. 【請求項２】 該ＨＰＶ Ｅ７断片が配列番号：１に記載のアミノ酸残基１
    ないし２７、アミノ酸残基１ないし３８、アミノ酸残基１ないし４８、アミノ酸
    残基１ないし６９、およびアミノ酸残基１ないし８７よりなる群から選択される
    ことを特徴とする請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 Ｅ７誘発ＣＤＫ２キナーゼ活性のインヒビターを同定する方
    法であって、 （ａ）基質のＣＤＫ２キナーゼリン酸化を測定し； （ｂ）ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７またはその断片の存在下で基
    質の増加したＣＤＫ２リン酸化を測定してＥ７誘発ＣＤＫ２キナーゼ活性を決定
    し； （ｃ）ＨＰＶ Ｅ７またはその断片の存在下および試験インヒビター化合物の
    存在下で基質のＣＤＫ２キナーゼリン酸化を測定し；次いで、 （ｄ）ステップ（ｂ）で測定された増加したリン酸化が、該試験化合物の存在
    するステップ（ｃ）において減少する場合、該試験化合物をＥ７誘発ＣＤＫ２キ
    ナーゼ活性のインヒビターとして同定するステップを含む該方法。
  4. 【請求項４】 該ＨＰＶ Ｅ７断片が配列番号：１に記載のアミノ酸残基１
    ないし２７、アミノ酸残基１ないし３８、アミノ酸残基１ないし４８、アミノ酸
    残基１ないし６９、およびアミノ酸残基１ないし８７よりなる群から選択される
    ことを特徴とする請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 該ＣＤＫ２基質がヒストンＨ１、ＨＰＶタンパク質Ｅ１、お
    よびＨＰＶタンパク質Ｅ２よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１
    、２、３または４記載の方法。
  6. 【請求項６】 ＣＤＫ２キナーゼ活性の測定がサイクリンの存在下で行われ
    ることを特徴とする請求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】 該サイクリンがサイクリンＡおよびサイクリンＥよりなる群
    から選択されることを特徴とする請求項５記載の方法。
  8. 【請求項８】 抗ウイルス剤を同定する方法であって、 （ａ）ＣＤＫ２キナーゼ活性におけるＥ−７誘発増大のインヒビターを同定し
    ； （ｂ）（ａ）で同定されたインヒビターの存在下および不存在下でウイルス増
    殖を測定し；次いで、 （ｃ）該インヒビターの不存在下でのウイルス増殖と比較して、該インヒビタ
    ーの存在下で減少したウイルス増殖が検出された場合、該インヒビターを抗ウイ
    ルス剤として同定するステップを含む該方法。
  9. 【請求項９】 ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７誘発ＣＤＫ２キナ
    ーゼ活性を低減する方法であって、ＨＰＶ感染細胞をＥ７誘発ＣＤＫ２リン酸化
    のインヒビターに接触させるステップを含む該方法。
  10. 【請求項１０】 ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７誘発ＣＤＫ２キ
    ナーゼ活性を低減する方法であって、ＨＰＶ感染細胞をＣＤＫ２キナーゼ複合体
    へのＥ７結合のインヒビターに接触させることを含む該方法。
  11. 【請求項１１】 ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）増殖を軽減する方法
    であって、その必要がある個人に、有効量のＨＰＶ Ｅ７誘発ＣＤＫ２キナーゼ
    活性インヒビターを投与するステップを含む該方法。
  12. 【請求項１２】 ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）増殖を軽減する方法
    であって、その必要がある個人に、有効量のＨＰＶ Ｅ７誘発ＣＤＫ２キナーゼ
    活性インヒビターを投与するステップを含む該方法。
  13. 【請求項１３】 ＣＤＫ２キナーゼ複合体へのＥ７結合が該活性を有するサ
    イクリン成分との相互作用によって影響されることを特徴とする請求項１０およ
    び１２いずれかに記載の方法。
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