JP2003504030A - 新規抗真菌剤および殺菌剤、その製造および使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はヒトおよび植物に対して病原性である酵母および／または真菌を制御するための酵母−いわゆるキラー酵母−からの蛋白質毒素の組換え体供給に関しており、酵母および／または真菌は選択的に殺される。高選択性は該蛋白質毒素の抗真菌剤および／または殺菌剤としての使用を可能にする。さらに、そのような蛋白質毒素は作物保護にも用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は酵母から得ることができる抗真菌剤（ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ）お
よび殺菌剤（ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ）、その製造および使用法に関する。

【０００２】 ヒトにおける真菌および／または酵母感染が最近非常に増加しており、また食
品および動物飼料の望まれない汚染が続いているので、選択的抗真菌剤はきわめ
て重要である。細胞性および体液性防御系が完全には機能的ではないレベルに保
たれていなければならない免疫抑制患者において、抗真菌剤は特に重要である［
Ａｎａｉｓｓｉｅ，１９９２；Ｍｅｕｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｗｉ
ｎｇａｒｄ，１９９５］。真菌症（ｍｙｃｏｓｅｓ）により非常に危険にさらさ
れているのはＨＩＶ−１（ＡＩＤＳ）に感染した患者であり、患者は疾患の後の
段階で、ヒトに病原性である真菌および／または酵母による日和見感染により非
常に頻繁に死亡する［Ｌｅｖｙ，１９９３］。そのような感染の治療に現在用い
られている抗真菌剤（例えば、アンフォテリシンＢ、フルコナゾール、イトラコ
ナゾール、ケトコナゾール）は、真核生物の細胞質膜の構造完全性を破壊し、従
って、感染宿主生物体に損傷を与えるのでかなりの副作用を起こす［Ｈｅｃｔｏ
ｒ，１９９３］。さらに、通常の抗真菌剤の適用は、非常に短時間内にフルコナ
ゾール耐性を導き、それはヒトに病原性である微生物間に急速に拡がるので、問
題をさらに大きくする［Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｃｈａｖｅ
ｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｍａｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｐ
ｆａｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｒｅｘ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｔ
ｒｏｉｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３］。従って、細菌抗生物質のように、
高度に選択的に認識され、可能であれば、ヒトに対して病原性である真菌および
酵母のみを攻撃する抗真菌剤を開発することが強く望まれている。しかしながら
、高等生物の細胞過程のほとんどすべては、真核生物で高度に機能相同性を示す
遺伝子産物により支配されているので、”特異的抗菌抗生物質（ｓｐｅｃｉｆｉ
ｃａｌｌｙ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）”の開発は現在
に至るまで成功していない［Ｋｕｒｚ，１９９８；Ｋｏｍｉｙａｍａ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９８］。

【０００３】 選択的抗真菌剤の標的は、細胞の機械的および浸透圧安定性に絶対必要である
が、より高等な真核生物では存在しない唯一の弱点である、酵母細胞壁のβ−１
，３−グルカンであり、病原性酵母を制御することが開発されるかも知れない［
Ｒｏｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４］。酵母および真菌の細胞壁構造に選択
的に携わる物質には非常に興味が惹かれるが、真菌症を制御するための抗生物質
様阻害剤は未だに用いられていない。細菌性抗生物質産物は本世紀の初めには発
見されているが、酵母での類似の効果は６０年代の初めに、いわゆるキラー酵母
を同定することにより観察されている［Ｂｅｖａｎ ＆ Ｍａｋｏｗｅｒ，１９
６３］：醸造酵母サッカロミセス セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）の毒素産生（ｔｏｘｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）キラー
株は、感受性酵母をレセプター依存性過程で破壊する”キラー毒素（ｋｉｌｌｅ
ｒ ｔｏｘｉｎｓ）の能力は、真核生物宿主細胞を目立って損傷させることなく
酵母細胞質中で安定におよび高コピー数で生き残る、レトロウイルス様二本鎖Ｒ
ＮＡウイルスの感染に基づいている［Ｔｉｐｐｅｒ ＆ Ｓｃｈｍｉｔｔ，１９
９１］。現在知られている酵母Ｓ．セレビジエの三つのキラー毒素（Ｋ１、Ｋ２
、Ｋ２８）はグリコシル化されていないα／β−ヘテロダイマーであり、それは
高分子プレプロ毒素として感染細胞により翻訳され、複雑な修飾による細胞内分
泌経路の間に処理されて生物活性キラー蛋白質を与える［Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８６；Ｄｉｇｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｓｃｈｍｉｔｔ
＆ Ｔｉｐｐｅｒ，１９９５］。Ｓ．セレビジエ毒素の毒性効果は、膜完全性（
ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）の破壊（毒素Ｋ１、Ｋ２）かまたは（
キラー毒素Ｋ２８の場合のような）ＤＮＡ合成の直接阻害による細胞周期の停止
に基づいている［Ｂｕｓｓｅｙ，１９９１；Ｓｃｈｍｉｔｔ ＆ Ｃｏｍｐａｉ
ｎ，１９９５；Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９６］。Ｋ１、Ｋ２および
Ｋ２８の部類のキラー毒素は、その作用様式およびその物理化学的特性ではお互
いに異なっているが、それらは狭い作用スペクトルを持ち、および主として密接
に関連した種の感受性酵母を破壊するという特性を共有している。この制限され
た作用スペクトルは、これまで特徴付けられている醸造用酵母キラー毒素が、感
受性標的細胞を破壊できるためには酵母細胞壁および細胞質膜レベルで異なった
レセプター集団と相互作用しなければならないという事実に基づいている。酵母
細胞壁の主たる毒素レセプターは高度に分岐したβ−１，６−Ｄ−グルカンかま
たは細胞壁マンノプロテイン（ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｍａｎｎｏｐｒｏｔｅｉｎ
）の外側マンノトリオース側鎖（ｏｕｔｅｒ ｍａｎｎｏｔｒｉｏｓｅ ｓｉｄ
ｅ ｃｈａｉｎｓ）である［Ｂｕｓｓｅｙ，１９９１；Ｓｃｈｍｉｔｔ ＆ Ｒ
ａｄｌｅｒ １９８７，１９８８］。

【０００４】 酵母Ｓ．セレビジエ、ハンセニアスポラ ウバルム（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏ ｒａ ｕｖａｒｕｍ ）、チゴサッカロミセス バイリ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒ ｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉ ）およびウスチラゴ マイディス（Ｕｓｔｉｌａｇ ｏ ｍａｙｄｉｓ ）のウイルス蛋白質毒素の他に、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒ ｙｏｍｙｃｅｓ ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クリプトコッカス（Ｃ ｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、トリコス ポロン （Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイベロミ セス （Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）
およびウィリオプシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）属でもキラー株が報告されてい
る［ＭｃＣｒａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，
１９９６；Ｓｃｈｍｉｔｔ ＆ Ｎｅｕｈａｕｓｅｎ，１９９４；Ｗａｌｋｅｒ
ｅｔ ａｌ．，１９９５］。しかしながらこれらの酵母においては、キラー現
象の遺伝子的基礎はウイルスゲノムではなく、線状ｄｓＤＮＡプラスミドかまた
は染色体酵母遺伝子である［Ｓｃｈｒｕｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４］。

【０００５】 種々の毒素産生”キラー酵母”の分子生物学に対する集中的な研究は、毒性蛋
白質（”キラー毒素”）の分泌は酵母で広範囲にわたっており、選択的抗真菌剤
開発の可能性が存在していることを過小評価すべきではないことを示しているが
〔Ｎａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｈｏｄｇｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１
９９５；Ｐｏｌｏｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ｓｃｈｍｉｔｔ ＆
Ｎｅｕｈａｕｓｅｎ，１９９４；Ｎｅｕｈａｕｓｅｎ ＆ Ｓｃｈｍｉｔｔ，１
９９６；Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７］、これまでそのような蛋白
質毒素を提供することは不可能であった。

【０００６】 従って、本発明の目的はヒトおよび植物に病原性である酵母および／または真
菌を制御するために適した抗真菌または殺菌蛋白質毒素を提供することである。 驚くべきことに、野生型酵母ウィリオプシス カリフォルニカ（Ｗｉｌｌｉｏ ｐｓｉｓ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ）株３／５７（ＤＳＭ１２８６５）からのキ
ラー毒素ウィカルチン（ＷＩＣＡＬＴＩＮ）（蛋白質毒素）、それは高度に効率
的な様式で産生および分泌される、および酵母チゴサッカロミセス バイリ（Ｄ
ＳＭ１２８６４）からのウイルス−コード化チゴシン（ＺＹＧＯＣＩＮ）（蛋白
質毒素）がヒトおよび植物に病原性である酵母および／または真菌を制御するた
めに特に適していることが証明された。さらに、食品および動物飼料分野で危険
である真菌および有害酵母も破壊できる。従って、両方の蛋白質毒素は酵母およ
び／または真菌感染、特に真菌症を制御するための抗真菌剤および／または殺菌
剤として用いられる可能性を持っている。これらの指摘は作用様式の研究により
本発明で証明される。本発明のために適した方法で毒素遺伝子はクローン化され
および配列決定され、培養におけるウィカルチンおよびチゴシンの組換え産生お
よび過剰発現のための方法が確立された。

【０００７】 従って、本発明の主題は、ウィリオプシス カリフォルニカ（特に好適にはＤ
ＳＭ１２８６５株）およびチゴサッカロミセス バイリ（特に好適にはＤＳＭ１
２８６４株）から得ることができる蛋白質毒素に関する。両方の株はブタペスト
条約（ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ）の規定に従ってＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ
Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌ
ｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｍａ
ｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ ｌｂに１９９９年６月９日に寄託された。

【０００８】 本発明のためには、株は特にＤＳＭ１２８６４およびＤＳＭ１２８６５であり
、それは生物学的に強力な蛋白質毒素を分泌し、その広い作用スペクトルのため
（実施例４および７を参照されたい）、ヒトおよび植物に対して病原性である多
数の酵母および真菌を破壊する。それ故本発明は蛋白質毒素の意味において選択
的な抗真菌剤または殺菌剤−および本発明に従った下記のポリペプチドおよび本
発明に従ったそのコード化核酸（特に毒素遺伝子の機能性単位中の）−その特異
的、レセプター仲介産生のため酵母および／または真菌のみを破壊しおよびより
高等な真核生物−およびそれ故ヒトおよび哺乳類細胞−および植物、好適には作
物植物（ｃｒｏｐ ｐｌａｎｔｓ）には完全に無害である生物医薬として可能性
がある−に関する［Ｐｆｅｉｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８参照］。

【０００９】 ヒトおよび植物に非病原性または病原性である以下の酵母および／または真菌
が選択的に破壊できる： チゴシン感受性酵母種：サッカロミセス セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）、カンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａ ｌｂｉｃａｎｓ ）、カンジダ クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）、カ ンジダ グラブラータ （Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ ビニ （Ｃａｎｄｉｄａ ｖｉｎｉｉ）、ハンセニアスポラ ウバルム（Ｈａｎｓｅｎ ｉａｓｐｏｒａ ｕｖａｒｕｍ ）、クルイベロミセス マルキシアヌス（Ｋｌｕ ｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ ）、メツキニコウィア プルチェル リマ （Ｍｅｔｈｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、ウスチラゴ マイジス （Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）、デバリオミセス ハンセニ（ Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ ）、ピチア アノマラ（Ｐｉｃｈ ｉａ ａｎｏｍａｌａ ）、ピチア ジャディニイ（Ｐｉｃｈｉａ ｊａｄｉｎｉ ｉ ）、ピチア メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎｅｆａ ｃｉｅｎｓ ）、ヤロウィア リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｌｉ ｃａ ）およびチゴサッカロミセス ルーキシ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ ｅｓ ｒｏｕｘｉｉ ）。 ウィカルチン感受性酵母種：カンジダ アルビカンス、カンジダ グラブラータ 、カンジダ トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、デバリ オミセス ハンセニ 、クルイベロミセス ラクチス、メツキニコウィア プルチ ェルリマ 、ピチア アノマラ、ピチア ジャディニイ、サッカロミセス セレビ ジエ 、スポロトリクス（Ｓｐｏｒｔｈｒｉｘ）種、トルロスポラ デルブルエキ （Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、トルロスポラ プレト リエンシス （Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ）、ヤロウィ ア リポリチカ およびチゴサッカロミセス バイリ。

【００１０】 ウィカルチン産生酵母株ＤＳＭ１２８６５の特に高い活性は多分、その著しい
分泌効率に基づいており、それは同じ酵母種の他の株と比較すると著しくより明
白である。チゴシン産生酵母株ＤＳＭ１２８６４の’キラー’特性は、毒素コー
ド化二本鎖ＲＮＡウイルス（Ｍｚｂ−ｄｓＲＮＡ）による感染に基づいており、
それは細胞質中に高コピー数（ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ）で安定に存
続し、問題の酵母（株ＤＳＭ１２８６４）がチゴシンを産生および分泌すること
を可能にする［Ｓｃｈｍｉｔｔ ＆ Ｎｅｕｈａｕｓｅｎ，１９９４参照］。同
じ種の他の株は細胞質中に毒素コード化ｄｓＲＮＡウイルスをとどめないので毒
素産生を示さず、表現型的に’非キラー’と分類される。

【００１１】 本発明の別の主題は従って蛋白質毒素をコード化している核酸−配列ＩＤ番号
：１および２のアミノ酸配列およびグルカナーゼ活性を持つ−またはその機能性
変異体、および少なくとも８ヌクレオチド、好適には少なくとも１５または２０
ヌクレオチド、特に少なくとも１００ヌクレオチド、とりわけ少なくとも３００
ヌクレオチドを持つその断片である（以後”本発明による核酸”と称される）。

【００１２】 細胞内プロセッシングおよび分泌後、蛋白質毒素をコード化している完全核酸
は３０９アミノ酸および３４ｋＤａの分子量（配列ＩＤ番号：１）または９９ア
ミノ酸および１０ｋＤａの分子量（配列ＩＤ番号：２）のサイズを持っている。
酵母Ｓ．セレビジエにおける配列ＩＤ番号：１に従った核酸の発現は組換え体ウ
ィカルチンを生じ、それは著しいβ−１，３−Ｄ−グルカナーゼ活性を持つグリ
コシル化蛋白質として酵母の培養上清内へ分泌される［実施例１０参照］。本発
明に従ったさらなる実験から、本発明による核酸は、配列ＩＤ番号：１の場合は
グルカナーゼ活性を持つ蛋白質毒素をコード化し、配列ＩＤ番号：２の場合は多
分インビボでＯ−グリコシル化されおよびチゴシンと称される蛋白質毒素をコー
ド化している核酸であることが確認された。本発明による核酸はＤＳＭ１２８６
５（配列ＩＤ番号：１）およびＤＳＭ１２８６４（配列ＩＤ番号：２）から得る
ことができる。

【００１３】 好適な態様において、本発明による核酸はＤＮＡまたはＲＮＡ、好適には二本
鎖ＤＮＡ、特に配列ＩＤ番号：１の１位から９４７位と一致した、および配列Ｉ
Ｄ番号：２の１位から７１３位と一致した核酸配列を持つＤＮＡである。本発明
に従うと、二つの位置がコード化領域の開始および終結、即ち、各々の場合にお
いて問題とする読み取り枠の最初および最後のアミノ酸を決定する。

【００１４】 用語”機能的変異体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｖａｒｉａｎｔ）”とは本発明
による核酸と機能的に関連する核酸であることを意味することを理解されたい。
関連核酸の例は、異なった酵母細胞または株および培養物または対立変異体（ａ
ｌｌｅｌｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ）由来の核酸である。本発明はまた、種々の酵
母／酵母株または皮膚糸状菌および糸状菌のような他の病原体から誘導できる核
酸の変異体も包含している。

【００１５】 本発明に従った用語”変異体”は、相同性、特に約６０％、好適には約７５％
、特には約９０％、およびとりわけ約９５％の配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す核酸を意味していることをさらに理解されたい。

【００１６】 本発明による核酸の断片は、例えば、さらなる変異体を同定するためのプロー
ブとして、またはアンチセンス核酸として個々のエピトープを発生するために使
用できる。例えば、少なくとも約８ヌクレオチドの核酸はアンチセンス核酸とし
て、少なくとも約１５ヌクレオチドの核酸はＰＣＲ法におけるプライマーとして
、少なくとも約２０ヌクレオチドの核酸はさらなる変異体の同定のために、およ
び少なくとも約１００ヌクレオチドの核酸はプローブとして適している。

【００１７】 さらに好適な態様において、本発明による核酸は一つまたはそれ以上の非コー
ド配列および／またはポリ（Ａ）配列、一つまたはそれ以上のＫｅｘ２ｐエンド
ペプチダーゼ認識配列（細胞内プレ蛋白質プロセッシングに必要とされる）、お
よび一つまたはそれ以上のＮ−グリコシル化可能部位を含んでいる。非コード配
列は、本発明による核酸を含んでいるコード化毒素遺伝子の制御された発現のた
めのプロモーター配列またはエンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）配列のような調
節配列である。

【００１８】 さらなる態様において、本発明による核酸はベクター、好適には発現ベクター
または遺伝子治療に有効であるベクターに含まれている。 発現ベクターの例は、配列ＩＤ番号：２に従った核酸の場合、原核生物および
／または真核生物発現ベクターであろうし、配列ＩＤ番号：１に従った核酸の場
合、排他的に真核生物発現ベクターであろう。大腸菌における配列ＩＤ番号：１
に従った毒素−コード化核酸の発現は、それぞれの異種的に発現された蛋白質毒
素が細菌細胞に有毒であるので不可能である。大腸菌における配列ＩＤ番号：１
に従ったウィカルチン−コード化核酸のクローニングはプロモーターを運んでい
ないプラスミドでのみ可能である（例えば、プラスミドｐＢＲ３２２誘導体の助
けにより）。配列ＩＤ番号：２に一致するチゴシン−コード化核酸の異種発現を
可能にする原核生物ベクターの例は市販品として入手可能なベクターｐＧＥＸ−
４Ｔ−１であり、それはグルタチオンＳトランスフェラーゼ／チゴシン融合蛋白
質が大腸菌において発現されることを可能にする。大腸菌でのチゴシン発現のた
めの別のベクターは、例えば、発現された蛋白質のＮｉ２＋−ＮＴＡカラムを通
した有利な精製を可能にするＮ末端Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｈｉｓ６タグをコード化し
ているＴ７発現ベクターｐＧＭ１０（Ｍａｒｔｉｎ，１９９６）である。サッカ
ロミセス セレビジエでの発現のために適切な真核生物発現ベクターの例は、ベ
クターｐ４２６Ｍｅｔ２５またはｐ４２６ＧＡＬ１（Ｍｕｍｂｅｒｇ ｅｔ ａ
ｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，５７６７）であり、
昆虫細胞中での発現のためにはＥＰ−Ｂ１−０１２７８３９またはＥＰ−Ｂ１−
０５４９７２１に開示されているようなバキュロウイルスベクター、および哺乳
類細胞での発現のためにはＳＶ４０ベクター（自由に手に入る）である。

【００１９】 一般に、発現ベクターはまた、例えば、大腸菌中での発現のためのｔｒｐプロ
モーター（例えば、ＥＰ−Ｂ１−０１５４１３３を参照されたい）、酵母中での
発現のためのＡＤＨ−２プロモーター（Ｒｕｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８３
），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８，２６７４）、昆虫細胞中での発現のため
のバキュロウイルス ポリヘドリンプロモーター（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｐ
ｏｌｙｈｅｄｒｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）（例えば、ＥＰ−Ｂ１−０１２７８３
９を参照されたい）、または初期ＳＶ４０プロモーターまたはＬＴＲプロモータ
ー、例えば、ＭＭＴＶのプロモーター（マウス乳腺腫瘍ウイルス；Ｌｅｅ ｅｔ
ａｌ．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ，２１４，２２８）のような宿主細胞に適し
ている調節配列を含んでいる。

【００２０】 遺伝子治療に有効であるベクターの例は、ウイルスベクター、好適にはアデノ
ウイルスベクター、特に、例えば、二つの挿入された末端反復的配列（ＩＴＲ）
のみから成るアデノ関連ウイルスベクターのようなアデノ関連ウイルスベクター
である。

【００２１】 適切なアデノウイルスベクターは、例えば、ＭｃＧｒｏｒｙ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ
ａｌ．（１９８８）Ｖｉｒｏｌ．１６３，６１４；Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．ｅｔ
ａｌ．（１９８２）”真核生物ウイルスベクター”（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．編）
１８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｃｈｒｏｂｏｃｚｅｋ，Ｊ．ｅｔ
ａｌ．（１９９２）Ｖｉｒｏｌ．１８６，２８０；Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｓ．ｅ
ｔ ａｌ．（１９８６）ＥＭＢＯ Ｊ．，５，２３７７またはＷＯ９５／００６
５５、に記載されている。

【００２２】 適切なアデノ関連ウイルスベクターの例は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９
２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８，９７；
ＷＯ９５／２３８６７；Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ，６３，３８２２；ＷＯ９５／２３８６７；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ，Ｊ．Ａ．ｅｔ
ａｌ．（１９９５）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６，１５３１ま
たはＫｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
５，７９３、に記載されている。

【００２３】 遺伝子治療に有効であるベクターはまた、本発明による核酸をリポソームと複
合体形成させることによっても得ることができる。この目的のために適した脂質
混合物はＦｅｉｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ ８４，７４１３；Ｂｅｈｒ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａ
ｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，６９
８２；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６９，２５５０またはＧａｏ，Ｘ．＆ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．（１９９１）
Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１８９，１９５、に記載されて
いるようなものである。リポソーム製造の場合、ＤＮＡは陽性の正味の電荷が残
り、およびＤＮＡがリポソームにより完全に複合体形成されるような比で、リポ
ソーム表面上にイオン的に結合される。

【００２４】 さらに別の態様において、本発明による核酸はベクター中に、好適にはトラン
スジェニック植物発生のための発現ベクター中に含まれている。上記のキラー毒
素ウィカルチンおよびチゴシンは広い作用スペクトルを持ち、および植物に対し
て病原性である酵母および真菌も破壊するので、例えば、トウモロコシに対して
病原性である病原体、ウスチラゴ マイジスの感染に耐性様式（ｒｅｓｉｓｔａ
ｎｔ ｆａｓｈｉｏｎ）で振る舞うトランスジェニック植物を提供することが可
能である。同様の実験がすでにタバコ植物で実施されており、それは、天然には
ウイルスによりコード化されているＵ．マイジス キラー毒素ＫＰ４の異種発現
により、問題とする蛋白質毒素を分泌することができ、ある種の病原性Ｕ．マイ ジス 株から特異的に保護されている（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｋｉ
ｎａｌ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｂｅｖａｎ，１９８４）。天然のアグロバク テリウム ツメファシエンス （Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉ ｅｎｓ ）Ｔｉプラスミドの修飾誘導体に基づいている市販品として入手可能な形
質転換系から出発し、毒素遺伝子ＷＣＴおよびＺＢＴとしても示されている本発
明の核酸はいわゆる二方向性ｐＢｌベクター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）内へクローン
化でき、トランスジェニック植物の発生に用いられる。この目的のためには、各
々の毒素遺伝子ＷＣＴおよびＺＢＴは強力なカリフラワーモザイクウイルスプロ
モーター（ＣａＭＶ−Ｐ）の転写調節下に置かれる。構築されるべきベクターの
より詳細な構築は実施例９で概要が示されている。

【００２５】 例えば、本発明による核酸は、配列ＩＤ番号：１および２に開示された配列を
参照して、または遺伝子コードを考慮しながら（例えば、Ｕｈｌｍａｎ，Ｅ．＆
Ｐｅｙｍａｎ，Ａ．（１９９０）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０，
５４３，Ｎｏ．４を参照されたい）配列ＩＤ番号：１および２に開示したペプチ
ド配列を参照して、例えば、ホスホトリエステル法に従って化学的に合成できる
。本発明による核酸を得るための別の可能性は、適切なプローブによる適切な遺
伝子バンクの単離である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９
８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａ
ｎｕａｌ．第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
を参照されたい）。例えば、適切なプローブは約１００から１０００ヌクレオチ
ドの長さ、好適には約２００から５００ヌクレオチドの長さ、特には約３００か
ら４００ヌクレオチドの長さを持ち、その配列が配列ＩＤ番号：１および２に一
致する核酸配列から推論できる一本鎖ＤＮＡ断片である。

【００２６】 本発明の別の主題は、配列ＩＤ番号：１および２に一致するアミノ酸配列、そ
の機能性変異体、および少なくとも６アミノ酸、好適には少なくとも１２アミノ
酸、特に少なくとも６５アミノ酸、とりわけ３０９アミノ酸（配列ＩＤ番号：１
）および９９アミノ酸（配列ＩＤ番号：９９）の部分であるようなポリペプチド
である（以後、”本発明に従ったポリペプチド”）。例えば、約６−１２、好適
には約８アミノ酸の長さであるポリペプチドがエピトープを含んでおり、それは
支持体へ結合後、特異的ポリクローナルまたはモノクローナル抗体の製造に役に
立つであろう（この前後関係については例えば、ＵＳ５，６５６，４３５を参照
されたい）。少なくとも約６５のアミノ酸の長さを持つポリペプチドは支持体な
しで、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体の製造に直接役立つことができ
る。

【００２７】 本発明の目的のための用語”機能性変異体”とは、本発明に従ったペプチドに
機能的に関連している、即ち、グルカナーゼ活性を示すポリペプチドを意味して
いると理解されるべきである。変異体はまた、種々の酵母／酵母株または皮膚糸
状菌、糸状菌のような他の感染性因子から誘導されるであろう（ＤＨＳ系に従っ
て）対立変異体またはポリペプチドも意味していると理解される。

【００２８】 より広い意味において、それらは図２に示したようなアミノ酸配列を持つポリ
ペプチドと配列相同性、特に約７０％の、好適には約８０％、特には約９０％、
とりわけ約９５％の配列同一性を持つポリペプチドを意味していると理解される
べきである。この用語はまた、約１−６０、好適には約１−３０、特には約１−
１５、とりわけ約１−５アミノ酸の領域でのポリペプチドの欠損も含んでいる。
例えば、最初のアミノ酸メチオニンは、これなしでもポリペプチドの機能はあま
り変化しないので存在しなくてもよい。加えて、本発明に従った上記ポリペプチ
ドを含む融合蛋白質もまた含まれ、融合蛋白質それ自身がグルカナーゼ機能を持
つかまたは融合部分が分離した後にのみ特異的機能を獲得することが可能である
。特に、これらには約１−２００、好適には約１−１５０、特に約１−１００、
とりわけ約１−５０アミノ酸の特に非ヒト配列を含んでいる融合蛋白質が含まれ
る。非ヒトペプチド配列の例は、原核生物ペプチド配列（例えば、大腸菌ガラク
トシダーゼから）、またはいわゆるヒスチジンタグ（例えば、Ｍｅｔ−Ａｌａ−
Ｈｉｓ６タグ）である。いわゆるヒスチジンタグを持つ融合蛋白質は金属イオン
含有カラムを通した（例えば、Ｎｉ２＋−ＮＴＡカラムを通した）発現蛋白質の
精製に特に都合よく適している。”ＮＴＡ”はキレーター ニトリロ三酢酸（Ｑ
ｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ）を示している。これに関して、本発明は
また、プロ蛋白質の意味で、またはより広い意味において、プレドラッグとして
マスクされている本発明に従ったポリペプチドも包含している。

【００２９】 本発明に従ったポリペプチドの一部は、例えば、抗体により特異的に認識でき
るエピトープに相当している。 本発明に従ったポリペプチドは当業者には一般的に知られている方法、例えば
、すでに上で記載したような適切な発現系における、本発明による核酸の発現に
より製造される。正しく処理される、およびそれ故に生物的に活性である蛋白質
毒素の製造に適した宿主細胞は、排他的に真核生物生物体、好適には発芽酵母サ
ッカロミセス セレビジエおよび分裂酵母シゾサッカロミセス ポムベ（Ｓｃｈ ｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ）である。

【００３０】 特に、上記のポリペプチドの一部は伝統的ペプチド合成（メリーフィールド技
術）によっても合成できる。これらは抗血清を得るために特に適しており、本発
明に従ったポリペプチドのさらに別の機能性変異体にたどり着くため、適切な遺
伝子発現ライブラリーがそれでスクリーニングできる。

【００３１】 本発明のさらに別の主題は従って、本発明に従ったポリペプチドの製造法に関
しており、ここで本発明による核酸は適切な宿主細胞中で発現され、必要なら単
離される。

【００３２】 非常に特別に好適であるのは分裂酵母シゾサッカロミセス ポムベであり、な
ぜならこの酵素は本来ウィカルチンおよびチゴシン耐性であり、外来蛋白質の異
種発現に繰り返して用いられて成功している［Ｇｉｇａ−Ｈａｍａ ＆ Ｋｕｍ
ａｇａｉ（１９９７），”分裂酵母：シゾサッカロミセス ポムベにおける外来
遺伝子発現”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ］。実施例１１に例示されてい
るように、配列ＩＤ番号：１および２に従った毒素−コード化核酸は、例えば、 Ｓ．ポムベ ベクターｐＲＥＰＩ［Ｍａｕｎｄｒｅｌｌ（１９９０），Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１０８５７−１０８６４］内へクローン化でき、そこで
それらは分裂酵母のチアミン制御ｎｍｔ１プロモーターの転写調節下に存在して
いる［ｎｍｔ＝’チアミンについてメッセージなし’］。そのようなベクターで
形質転換されている酵母は問題とする外来遺伝子を、酵母の培養培地中の各々の
チアミン濃度の関数として発現する。もし望むなら、このことは、酵母に対して
有毒である蛋白質を発現することが原則として可能になるように、外来蛋白質が
産生される段階と酵母増殖段階が時間で分離されることを可能にする。Ｓ．ポム ベ で異種として発現される毒素ウィカルチンおよびチゴシンの同時分泌およびか
なりのより容易な精製を可能にするため、発現／分泌ベクター［ベクターｐＴＺ
α／γ；実施例１１参照］がすでに合成されており、それはウイルスＫ２８プレ
プロ毒素遺伝子の分泌およびプロセッシングシグナル［Ｓｃｈｍｉｔｔ ＆ Ｔ
ｉｐｐｅｒ，１９９５］を含んでいるため、読み枠内の下流に配置されている各
々の外来蛋白質の有効な分泌を可能にしている。

【００３３】 本発明の別の主題は、本発明に従ったポリペプチドと特異的に反応する抗体に
関しており、それは上記のポリペプチドの一部で可能であり、それ自身が免疫原
性であるかまたは免疫原性であるように作製されるか、または例えば、ウシ血清
アルブミンのような適切な担体へ結合させることによりその免疫原性が改良され
ている。

【００３４】 抗体はポリクローナルかまたはモノクローナルである。本発明の主題をまた構
成するその製造は、例えば、哺乳動物（例えば、ウサギ）を本発明に従ったポリ
ペプチドまたは上記のその一部で免疫することによる（もし適切であれば例えば
、フロイントアジュバントおよび／または水酸化アルミニウムゲル存在下で）一
般的に通例の方法により実施される（例えば、Ｄｉａｍｏｎｄ，Ｂ．Ａ．ｅｔ
ａｌ．（１９８１）Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１３４４を参照されたい）。免疫学的反応により動物に形成
されたポリクローナル抗体は、続いて一般的に通例の方法により血液から容易に
単離でき、例えば、カラムクロマトグラフィーにより精製される。抗体をアフィ
ニティ精製にかけるのが好適であり、そこでは例えば、問題とする抗原（チゴシ
ンまたはウィカルチン）は自由に入手可能なＣｎＢｒ−活性化セファロースマト
リックスに共有結合で結合されており、それは各々の場合で毒素特異的である抗
体を精製するために用いられる。

【００３５】 モノクローナル抗体は例えば、Ｗｉｎｔｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｗｉｎ
ｔｅｒ，Ｇ．＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３４９，
２９３）の既知の方法により製造できる。

【００３６】 本発明の別の主題は、本発明による核酸または本発明に従ったポリペプチド（
個々にまたは組み合わせて）および必要に応じ、適切な添加物または補助剤を含
む薬剤製品（ｄｒｕｇ ｐｒｏｄｕｃｔ）、および表皮、皮膚および皮下皮膚糸
状菌症、粘膜の真菌症および全身性真菌症、特に好適にはカンジダ真菌症のよう
な真菌症を処置するための薬剤製品の製造法であり、ここで本発明による核酸ま
たは本発明に従ったポリペプチドは医薬として受容可能な添加物および／または
補助剤と一緒に処方される。

【００３７】 実施例１２は、株ＤＳＭ１２８６５により産生されおよび精製された毒素ウィ
カルチンは、比較のために試験されおよび真菌症の治療でしばしば用いられてい
る局所抗真菌剤クロトリマゾールおよびミコナゾールよりも著しく強力な酵母に
対する毒性を持っていることを例示している。

【００３８】 本発明はまた、上記の意味において、ＤＳＭ１２８６４および／またはＤＳＭ
１２８６５から得ることができる抗真菌剤または蛋白質毒素および／または抗真
菌的に活性な本発明に従ったポリペプチドを含んでいる薬剤製品にも関する。

【００３９】 ヒト遺伝子治療での使用に適しているのは、特に、そのままの形の本発明によ
る核酸または遺伝子治療で有効である上記ベクターの一つの形またはリポソーム
との複合体の形を含む薬剤製品である。

【００４０】 適切な添加剤および／または補助剤の例は生理学的食塩水、安定化剤、プロテ
イナーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤などである。 本発明の別の主題は本発明による核酸、本発明に従ったポリペプチドまたは本
発明に従った抗体、および、もし適切であれば、適切な添加物または補助剤を含
む診断薬、および表皮、皮膚および皮下皮膚糸状菌症、粘膜の真菌症および全身
性真菌症、特に好適にはカンジダ真菌症のような真菌症を診断するための診断薬
の製造法であり、ここで本発明による核酸、本発明に従ったポリペプチドまたは
本発明に従った抗体は適切な添加物および／または補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔｓ
）と混合される。

【００４１】 例えば、ポリメラーゼ連鎖反応に基づいた（例えば、ＥＰ−０２００３６２に
従ったＰＣＲ診断薬）または実施例１３に非常に詳細に記載されているような、
ノーザンおよび／またはサザンブロットに基づいた診断薬は、本発明の核酸によ
り本発明に従って製造できる。これらの試験は本発明による核酸と相補的鎖、通
常は対応するｍＲＮＡとの特異的ハイブリダイゼーションに基づいている。本発
明による核酸は、例えば、ＥＰ００６３８７９に記載されているように修飾でき
る。好適には、本発明に従ったＤＮＡ断片は適切な試薬、例えば、放射性標識α
−Ｐ３２−ｄＡＴＰにより、一般的に知られている方法で標識されるか、または
非放射性ビオチン標識して提供され、好適には適切な膜（例えば、セルロースま
たはナイロン）へ結合されている単離ＲＮＡとインキュベートされる。加えて、
ハイブリダイゼーションおよび膜への結合に先立って、単離されたＲＮＡを例え
ば、アガロースゲル電気泳動によりサイズに従って分離するのが都合がよい。も
し各々の組織試料からの試験ＲＮＡ量が同一であれば、プローブにより特異的に
標識されていたｍＲＮＡの量が決定できる。

【００４２】 別の診断薬は本発明に従ったポリペプチドまたは前に非常に詳細に説明されて
いるその免疫原性部分を含んでいる。好適には固体相、例えば、ニトロセルロー
スまたはナイロンへ結合されているポリペプチドまたはその一部は、インビトロ
で例えば抗体と反応できるようにするため、例えば血液のような試験されるべき
体液と接触させることができる。抗体／ペプチド複合体は続いて例えば、標識抗
−ヒト−ＩｇＧまたは抗−ヒト−ＩｇＭ抗体により検出される。標識は、例えば
、呈色反応を触媒するペルオキシダーゼのような酵素である。自己免疫抗体の存
在および量は呈色反応により容易におよび迅速に決定できる。

【００４３】 別の診断薬は本発明に従った抗体それ自身から成っている。これらの抗体は例
えば、ヒト組織試料の問題とするポリペプチドの存在を容易におよび迅速に試験
するのを可能にする。この場合、本発明に従った抗体は、例えば、上にすでに説
明したような酵素で標識される。特異的抗体／ペプチド複合体はそれ故酵素的呈
色反応により容易におよび迅速に検出できる。

【００４４】 本発明の別の主題は、本発明による核酸および／または本発明に従ったポリペ
プチド、単独または組み合わせて、およびもし適切であれば適切な添加物または
補助剤を含む殺菌剤、および有害な酵母および有害な真菌を抑制するための殺菌
剤の製造法に関しており、ここで本発明による核酸または本発明に従ったポリペ
プチドは農業的に受容可能な添加物および／または補助剤と一緒に処方される。

【００４５】 すでに説明したように、本発明に従った蛋白質毒素を発現するトランスジェニ
ック植物が好適な態様において発生される。従って本発明はまた、本発明に従っ
たポリペプチドおよび／または蛋白質毒素を含んでいるような植物細胞および本
質的にトランスジェニック植物にも関する。

【００４６】 本発明の別の主題はまた、本発明による核酸、本発明に従ったポリペプチドま
たは本発明に従った抗体、および、もし適切であれば、適切な添加物または補助
剤を含んでいる、例えば、阻害剤または促進剤のような機能性相互作用剤を同定
するためのアッセイにも関する。

【００４７】 機能性相互作用剤、特に感受性酵母細胞中で配列ＩＤ番号：２に従った蛋白質
毒素チゴシンと相互作用するものを同定するために適したアッセイは、例えば、
二−ハイブリッド系（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．＆ Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ，Ｒ．（１
９９４）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０，２８６）である。この
アッセイにおいて細胞（例えば、酵母細胞）は、本発明に従ったポリペプチドお
よび既知の蛋白質ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、大腸菌からのＧａｌ４またはＬ
ｅｘＡ）を含んでいる融合蛋白質を発現する、および／または未知のポリペプチ
ドおよび転写活性化ドメイン（例えば、Ｇａｌ４、ヘルペスウイルスＶＰ１６ま
たはＢ４２）を含んでいる融合蛋白質を発現する一つまたはそれ以上の発現ベク
ターで形質転換されるかまたはトランスフェクトされる。加えて、細胞はレポー
ター遺伝子（例えば、大腸菌ＬａｃＺ遺伝子、緑色蛍光蛋白質または酵母アミノ
酸生合成遺伝子Ｈｉｓ３またはＬｅｕ２）を含んでおり、そのレポーター遺伝子
は、例えば、ｌｅｘＡプロモーター／オペレーターのような調節配列（ｒｅｇｕ
ｌａｒｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により、または酵母上流活性化配列（ＵＡ
Ｓ）により調節されている。未知のポリペプチドは、例えば、遺伝子ライブラリ
ー（例えば、ヒト遺伝子ライブラリー）を起源とするＤＮＡ断片によりコード化
されている。通常、ｃＤＮＡ遺伝子ライブラリーは最初説明した発現ベクターに
より酵母中で生成され、そのためその後すぐにアッセイが実施できる。

【００４８】 酵母発現ベクターにおいて、例えば、本発明に従ったポリペプチドおよびＬｅ
ｘＡ ＤＮＡ結合ドメインが形質転換酵母中で発現されるように、本発明に従っ
たポリペプチドはＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインをコード化している核酸上の機
能性単位中にクローン化される。別の酵母発現ベクターにおいて、未知のポリペ
プチドおよびＧａｌ４転写活性化ドメインの融合蛋白質が形質転換酵母中で発現
されるように、ｃＤＮＡ遺伝子ライブラリーのｃＤＮＡ断片はＧａｌ４転写活性
化ドメインをコード化している核酸上の機能性単位中にクローン化される。両方
の発現ベクターで形質転換された酵母、例えばＬｅｕ２−、はさらにＬｅｕ２を
コード化する核酸を含んでおり、それはＬｅｘＡプロモーター／オペレーターに
より調節されている。本発明に従ったポリペプチドおよび未知のポリペプチド間
で機能性相互作用が起こった場合、Ｇａｌ４転写活性化ドメインはＬｅｘＡ Ｄ
ＮＡ結合ドメインを通してＬｅｘＡプロモーター／オペレーターへ結合し、Ｌｅ
ｘＡプロモーター／オペレーターを活性化してＬｅｕ２遺伝子を発現する。その
結果、Ｌｅｕ２−酵母はロイシンを含んでいない最少培地上で増殖できる。

【００４９】 アミノ酸生合成遺伝子の代わりにＬａｃＺまたは緑色蛍光蛋白質レポーター遺
伝子を使用する場合、転写活性化は青または緑の蛍光を発するコロニーの形成に
より検出できる。しかしながら、青または緑の蛍光染色はまた分光光度計で、例
えば、青色染色の場合は５８５ｎｍで容易に定量もできる。

【００５０】 この様式で、発現遺伝子ライブラリーは、本発明に従ったポリペプチドと相互
作用するポリペプチドを容易におよび迅速にスクリーニングできる。発見された
新規ポリペプチドは続いて単離でき、さらに特徴付けされる。

【００５１】 ２−ハイブリッド系の別の可能な使用は、本発明に従ったポリペプチドおよび
既知または未知のポリペプチド間の相互作用に対して、例えば、化学物質のよう
な他の物質により影響及ぼすことを含んでいる。このことはまた新規の有用性が
高い活性成分を発見することを可能にし、それは化学的に合成できおよび治療薬
として用いることができるかも知れない。本発明は従って、ポリペプチド様相互
作用剤を発見するための方法を意図しているのみでなく、上記蛋白質／蛋白質複
合体と相互作用できる物質を発見する方法にも拡大解釈される。そのようなペプ
チド様、および化学物質相互作用剤は本発明の目的には機能性相互作用剤と称さ
れ、それは阻害または促進作用を持つことができる。

【００５２】 本発明の別の主題は、分泌された毒素のクロマトグラフィー的精製、例えば、
限外濾過およびカチオン交換クロマトグラフィーおよび／またはラミネリン−セ
ファロースおよび／またはマンノプロテイン−セファロースによるアフィニティ
ークロマトグラフィーを非常に容易にする合成培養培地（ＢＡＶＣ培地）から構
成される培地での培養および培地内への蛋白質毒素の分泌による蛋白質毒素の製
造法に関する［実施例１および実施例の付録参照］。株ＤＳＭ１２８６５により
産生および分泌されるウィカルチンの場合、１％の最終濃度で、植物由来（およ
び容易に入手可能な）β−１，３−Ｄ−グルカン ラミナリンを培地に補給する
ことにより毒素産生をさらに増加させることができる。実施例１４に例示したよ
うに、培養培地へのラミナリンの添加はウィカルチン産生の誘導を導き、これは
転写誘導が寄与していることがノーザン分析から認められた。

【００５３】 合成Ｂ培地が、ＤＳＭ１２８６４により分泌される毒素チゴシンを産生させる
ために使用できる［Ｒａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３参照］。 以下の実施例は本発明を例示することが意図されており、これらの実施例に本発
明が制限されるものではない。

【００５４】実施例

【００５５】実施例１： キラー酵母Ｗ．カリフォルニカ株３／５７（ＤＳＭ１２８６５）の培養上清から の抗カンジダ毒素ウィカルチンの単離、濃縮および精製 感受性酵母に対するメチレンブルー寒天上の寒天拡散試験において、キラー酵
母Ｗ．カリフォルニカ３／５７により分泌されたキラー毒素ウィカルチンはｐＨ
４．７および２０℃で最適阻害作用を示した。合成液体培地において、キラー酵
母Ｗ．カリフォルニカ株３／５７はＢＡＶＣ培地（ｐＨ４．７）中で増殖させた
場合に最大毒素産生を示した。毒素濃度を達成するため、キラー酵母は最初に５
ｍｌのＹＥＰＤ培地中、３０℃で振盪しながら２４時間インキュベートし、次に
そのすべてを２００ｍｌのＢＡＶＣ培地に移し、再び２０℃で４８時間、振盪機
（１４０ｒｐｍ）上で培養した。各々２．５ｌのＢＡＶＣ培地（５ｌのエルレン
マイアーフラスコ中、ｐＨ４．７）の４つの主培養物は第二の前培養液に植え付
け（１％接種物）、穏やかに振盪しながら（６０ｒｐｍ）２０℃で５日間インキ
ュベートした。分泌されたキラー毒素を濃縮するため、細胞を含まない培養上清
は、４℃および１バールの圧力でポリスルホン酸膜（’ＥａｓｙＦｌｏｗ’［Ｆ
ａ．Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ］；排除限界１０ｋＤａ）により２００倍に濃縮して５
０ｍｌの容量とした。そのようにして得られた濃縮物の低分子量化合物を除くた
めおよび脱塩するため、毒素は透析チューブ（排除限界１０−２０ｋＤａ）中、
＋４℃で一夜、５ｍＭクエン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ４．７）に対して透析した
。毒素濃縮液を保存するため、透析生成物は０．２μｍの膜を通して濾過滅菌し
、１ｍｌづつ−２０℃で凍結した。

【００５６】 毒素活性は感受性指標酵母サッカロミセス セレビジエ１９２．２ｄに対する
メチレンブルー寒天（ＭＢＡ；ｐＨ４．７）上の寒天拡散試験で検出および標準
化した。このためには、対数希釈した毒素濃縮液を０．１Ｍクエン酸／リン酸緩
衝液（ｐＨ４．７）で調製し、その１００μｌを、感受性指標酵母が接種されて
いる（２ｘ１０５細胞／ｍｌ）ＭＢＡプレートに前もって開けられたくぼみ（く
ぼみ直径９ｍｍ）中へピペッティングした。プレートを２０℃で３日間インキュ
ベートした後、あきらかに認識できる阻害ゾーンを測定した。阻害ゾーン直径お
よび毒素濃度の対数間の直線関係が存在することが明らかになった。１ｘ１０４
単位／ｍｌの任意の毒素活性が２０ｍｍ（くぼみ直径で補正）の阻害ゾーン直径
に割り当てられた。

【００５７】 濃縮ウィカルチンはＢｉｏｓｃａｌｅ−Ｓ（ＦＰＬＣ）でのカチオン交換クロ
マトグラフィーかまたは植物由来β−１，６−Ｄ−グルカン プスツランが前も
って結合されているエポキシ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−６Ｂマトリックス（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製された。
その比活性が６２５倍に濃縮されている毒素調製試料（表１）はゲル電気泳動的
に純粋であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０−２２％濃度勾配ゲル）後に約３７ｋＤ
ａに単一バンドのみを示し、それはクーマシーブルー（蛋白質染色）および過ヨ
ウ素酸−シッフ染色（ＰＡＳ；炭化水素染色）の両方で検出可能であった。陽性
ＰＡＳ染色は抗カンジダ毒素ウィカルチンのＮ−グリコシル化の可能性を示唆し
ている。精製毒素のエンドグリコシダーゼ−Ｈによる処理により、ウィカルチン
は約３ｋＤａのＮ−グリコシドで結合された炭化水素残基を持っており、そのサ
イズはまた、酵母における蛋白質毒素中の単一グリコシル化部位を示唆している
。脱グリコシル化ウィカルチンは著しく制限された毒性を示すので、ウィカルチ
ンの炭化水素部分は感受性標的細胞への結合に多分必要とされ、毒素の生物活性
に間接的に影響していることが推論できる。 表１：キラー酵母ウィリオプシス カリフォルニカの培養上清からのウィカルチ
ン濃度〔ＵＦ、限外濾過〕

【００５８】

【表１】

【００５９】実施例２： ウィカルチンのＮＨ２−末端アミノ酸配列の決定および酵素的β−１，３−グル カナーゼ活性の検出 精製キラー毒素のＮ−末端アミノ酸の配列決定により最初の１０のアミノ酸が
決定された。図１に見られるように、ウィカルチンのＮ−末端は酵母サッカロミ セス セレビジエ のＢＧＬ２遺伝子によりコード化されているエンド−β−１，
３−Ｄ−グルカナーゼのアミノ末端への著しい相同性を示した。

【００６０】 ウィカルチンおよびＢｇｌ２の相同性が決定されたので、未精製毒素濃縮物お
よび精製毒素試料中にグルカナーゼ活性が検出できるかいなかが調べられた。ウ
ィカルチン試料において、基質としてβ−１，３−Ｄ−グルカン ラミナリンを
用いた酵素アッセイおよび基質として４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−
グルコシド（ＭＵＣ）を用いる蛍光アッセイの両方で明白なβ−１，３−Ｄ−グ
ルカナーゼ活性が検出された；また試験されたβ−１，６−Ｄ−グルカン プス
ツランはウィカルチンにより加水分解されなかった。

【００６１】実施例３： 細胞壁グルカンの存在下および不存在下におけるウィカルチン処理酵母細胞の生 存率：競合分析 ＹＥＰＤ液体培地（ｐＨ４．７）中、２０℃で１ｘ１０５Ｕ／ｍｌの精製ウィ
カルチン存在下に増殖させた株Ｓ．セレビジエ１９２．２ｄの感受性酵母細胞は
図２に示された殺細胞速度論を示した。植物由来β−１，６−Ｄ−グルカン プ
スツランは毒素処理酵母細胞の生存率を著しく増加させることを可能にし、１０
ｍｇ／ｍｌの濃度で加えた場合にはウィカルチン毒性を完全になくした。プスツ
ランと反対に、β−１，３−Ｄ−グルカン ラミナリンは毒素処理酵母の生存率
を増加できなかった（図２）。

【００６２】 示された結果は、ウィカルチンの作用が酵母細胞壁の初期ドッキング部位（毒
素レセプター）として働くβ−１，６−Ｄ−グルカンへの結合を必要とするとい
う結論を可能にする。この結果に一致して、染色体ＫＲＥ１遺伝子座位の欠失を
持つ酵母は毒素耐性を示すが、ＫＲＥ１を運ぶエピソームベクターで形質転換し
た場合には毒素感受性を再び取り戻すことが示されている（図３）。ｋｒｅ１変
異体における毒素耐性は著しく減少したβ−１，６−Ｄ−グルカン含量に基づい
ており、従って、致死的作用に必要とされる酵母細胞表面への毒素結合を減少さ
せる。

【００６３】実施例４： 作用のスペクトルおよびウィカルチンの殺菌スペクトル 寒天拡散試験において、精製Ｗ．カリフォルニカ毒素ウィカルチンは表２に示
した酵母に対して明白な毒性を示した。酵母カンジダ クルセイの３つの株を除
いて、試験された２２の臨床患者単離物のすべて、およびヒトに病原性である、 カンジダ 種のすべての他の対照株が高度に効率のいい様式でウィカルチンにより
破壊された。総計で１０の異なった属からの１４の毒素感受性酵母種について、
ウィカルチンは作用スペクトルを示し、それはキラー毒素としては異常に広範囲
である。 表２：異なった属の病原性および非病原性酵母に対するウィカルチンの作用スペ
クトル。すべての株は精製ウィカルチンに対する寒天拡散試験（ＭＢＡ；ｐＨ４
．７）で試験された。適用された毒素活性は１ｘ１０６Ｕ／ｍｌであった。株Ｃ ．トロピカリス （患者番号５４１９６５）はホスピタルマインツ大学の医微生物
学および衛生学部から入手した。

【００６４】

【表２】

【００６５】実施例５： 酵母Ｗ．カリフォルニカ株３／５７（ＤＭＳ１２８６５）のウィカルチンコード 化ＷＣＴ遺伝子のクローニング、配列決定および分子の特徴付け ウィカルチンのＮ末端アミノ酸から出発し、同定およびクローニング、および
染色体に位置している毒素遺伝子ＷＣＴの分子生物学の特徴付けを導く特異的Ｄ
ＮＡオリゴヌクレオチドを発生させた。ＷＣＴのＤＮＡ配列（配列ＩＤ番号：１
）は潜在的に３０９アミノ酸および３４，０１７Ｄａの計算分子量のＮ−グリコ
シル化蛋白質をコード化している単一の読み取り枠を示した。ＷＣＴコード化キ
ラー毒素の作用の研究から、ウィカルチンは酵母に非常に有毒であり、その主た
る標的は酵母に観察される細胞壁β−１，３−Ｄ−グルカンである糖蛋白質であ
ることが示された。その酵母および真菌に対する選択的毒性は、ウィカルチンが
感受性標的細胞の細胞壁構造および／または完全性を破壊することに基づいてお
り、このように最も敏感であるところで酵母を攻撃して最終的にそれらを殺す。

【００６６】実施例６： キラー酵母Ｚ．バイリ株４１２（ＤＳＭ１２８６４）の培養上清からのウイルス 毒素チゴシンの濃縮および精製 酵母Ｚ．バイリ株４１２のウイルス−コード化キラー毒素チゴシンはＲａｄｌ
ｅｒ ｅｔ．ａｌ．（１９９３）に記載されている方法によりキラー酵母の培養
上清から単離され、限外濾過により濃縮され、最終的にアフィニティークロマト
グラフィーにより精製された。本研究で開発されたチゴシンの一工程精製は、感
受性酵母の細胞壁マンノプロテインへの毒素の天然の親和性を利用する。Ｓ．セ レビジエ 株１９２．２ｄから、Ｓｃｈｍｉｔｔ ＆ Ｒａｄｌｅｒ（１９９７）
により記載されている方法により単離および部分精製されたマンノプロテインは
エポキシ−活性化セファロース−６Ｂマトリックス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）へ共
有結合で結合され、カラムクロマトグラフィーによる毒素精製のためのＦＰＬＣ
で用いられた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、この様式で精製されている高度に生物活性
なチゴシンは約１０ｋＤａの見かけの分子量を持つ単一の蛋白質バンドを示した
（図４）。

【００６７】実施例７： チゴシンの作用スペクトルおよび殺菌スペクトル 寒天拡散試験で決定された酵母Ｚ．バイリ株４１２（ＤＳＭ１２８６４）のウ
イルスチゴシン作用スペクトルは、病原性および非病原性酵母属を含んでおり、
その中で、カンジダ アルビカンスおよびスポロトリクス シェンキはヒトおよ
び動物で重要な病原体であり、およびウスチラゴ マイジスおよびデバリオミセ ス ハンセニ は農業および食品部門で重要な有害酵母である（表３）。 表３：異なった属の病原性および非病原性酵母へのチゴシンの作用スペクトル。
すべての株は１ｘ１０４Ｕ／ｍｌの活性を持つチゴシン試料に対して、寒天拡散
試験（ＭＢＡ；ｐＨ４．５）で試験された。

【００６８】

【表３】

【００６９】実施例８： 酵母Ｚ．バイリ株４１２（ＤＳＭ１２８６４）のチゴシン−コード化ＺＢＴ遺伝 子（ＺＢＴ）のクローニングおよび配列決定 キラー酵母Ｚ．バイリ株４１２の毒素−コード化二本鎖ＲＮＡゲノムのｃＤＮ
Ａは水酸化メチル水銀で変性された精製Ｍ−ｄｓＲＮＡを鋳型としておよび種々
のヘキサヌクレオチドをプライマーとして使用し、Ｓｃｈｍｉｔｔ（１９９５）
により記載されている方法と類似の方法により合成された。ＥｃｏＲＩ−制限ベ
クターｐＵＣ１８への結合、大腸菌での形質転換および同定された組換え体プラ
スミドの単離後、いくつかのｃＤＮＡクローンが単離され、配列決定された。チ
ゴシン−コード化読み取り枠のｃＤＮＡ配列（配列ＩＤ番号：２）は２３８アミ
ノ酸の前駆体蛋白質（プロ毒素）の遺伝子情報を含んでおり、アミノ酸位置ＲＲ
１３９に潜在的Ｋｅｘ２−エンドペプチダーゼ切断部位を運んでいる。生物活性
チゴシン、その分子量（１０ｋＤＡ；９９アミノ酸）およびＮ末端アミノ酸配列
は精製されたチゴシンで決定されたデータと正確に一致した、はインビボで後期
ゴルジ段階で起こるＫｅｘ２−仲介 プロ−チゴシン−プロセッシングにより形
成される。

【００７０】 チゴシンの毒性のため、酵母Ｓ．セレビジエでのＺＢＴ−ｃＤＮＡの異種発現
は形質転換した酵母それ自身を自身の毒素により殺すことになる。ウイルスＫ２
８毒素の例で示されているように、分裂酵母は外来蛋白質の発現または分泌に特
に適しているので、将来の目的は毒素耐性分裂酵母シゾサッカロミセス ポムベ 中での異種チゴシン発現であろう。

【００７１】実施例９： トランスジェニック植物での毒素遺伝子ＷＣＴおよびＺＢＴの発現 上記のキラー毒素ウィカルチンおよびチゴシンは広い作用スペクトルを持って
おり、および植物病原性酵母および真菌を破壊するので、例えば、トウモロコシ
病原体ウスチラゴ マイジスの感染に抵抗性を示すトランスジェニック植物を構
築することが可能であろう。類似の実験はすでにタバコ植物で実施されており、
それは、天然にはウイルスによりコード化されているＵ．マイジス キラー毒素
ＫＰ４の異種発現により、問題とする蛋白質毒素を分泌することができ、ある種
の病原性Ｕ．マイジス株から特異的に保護されている（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．
，１９９６；Ｋｉｎａｌ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｂｅｖａｎ，１９８４）。
天然のアグロバクテリウム ツメファシエンスＴｉプラスミドの修飾誘導体に基
づいている、市販品として入手可能な形質転換系から出発し、我々がクローン化
した毒素遺伝子ＷＣＴおよびＺＢＴはいわゆる二方向性ｐＢｌベクター（ＣＬＯ
ＮＴＥＣＨ）内へクローン化でき、それらはトランスジェニック植物の発生に用
いられる。この目的のためには、問題とする毒素遺伝子、ＷＣＴおよびＺＢＴ、
は強力なカリフラワーモザイクウイルスプロモーター（ＣａＭＶ−Ｐ）の転写調
節下に置かれる。構築されるべきベクターの構築は図５に示されている。

【００７２】実施例１０： Ｓ．セレビジエにおける酵母Ｗ．カリフォルニカ３／５７（ＤＳＭ１２８６５） のウィカルチン−コード化ＷＣＴ遺伝子の異種発現 酵母Ｓ．セレビジエにおいてＷＣＴ遺伝子を異種的に発現させるため、ウィカ
ルチン−コード化ＷＣＴ遺伝子は９３０ｂｐ ＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ断片として
２μベクターｐＹＸ２４２（一般的に入手可能である）内へクローン化された。
得られたベクターｐＳＴＨ２（図６）は酵母トリオースリン酸異性化酵素プロモ
ーター（ＴＰＩ）の転写調節下にある毒素遺伝子を含んでおり、酵母（Ｓ．セレ ビジエ ）内への形質転換後にウィカルチンの構成的発現を可能にしている。この
様式で得られた酵母形質転換体の培養上清のゲル電気泳動による分析は、組換え
体ウィカルチンが外部培地内へ分泌され、同種ウィカルチン（野生株ＤＳＭ１２
８６５）のβ−１，３−Ｄ−グルカナーゼ活性に相当する活性を持っていること
を示した（図６）。

【００７３】実施例１１： 分裂酵母シゾサッカロミセス ポムベにおけるウィカルチンおよびチゴシンの異 種発現実験 分裂酵母はウィカルチンおよびチゴシンへの耐性を示したので、両方とも無傷
の細胞としておよび無細胞壁スフェロプラストとして、問題とする毒素の異種発
現のための宿主として適している。組換え体毒素が分裂酵母により発現されるば
かりでなく、同時に細胞内分泌経路に送り込まれて外部培地内へ分泌されること
を確実にするため、Ｓ．ポムベで機能的でありおよび酵母Ｓ．セレビジエのウイ
ルスＫ２８プレプロ毒素遺伝子のｃＤＮＡから誘導された、分泌およびプロセッ
シングシグナル（Ｓ／Ｐ）を運ぶベクター（ｐＴＺα／γ；図７）が構築された
［Ｓｃｈｍｉｔｔ，１９９５；Ｓｃｈｍｉｔｔ ＆ Ｔｉｐｐｅｒ，１９９５参
照］。分泌およびプロセッシングシグナルは下流読み枠に配置された異種蛋白質
が分裂酵母中で小胞体内腔内へ持ち込まれ、酵母の分泌経路に送り込まれること
を確実にする。Ｓ／Ｐ−領域のＣ−末端上に存在するＫｅｘ２ｐ切断部位は、酵
母Ｋｅｘ２ｐ−エンドペプチダーゼによる、後期ゴルジ区画中のその細胞内輸送
担体からの所望の外来蛋白質の切断を受け、それは最終的に生物活性蛋白質（チ
ゴシンおよび／またはウィカルチン）として外部培地内へ分泌されるであろう。

【００７４】実施例１２： 精製ウィカルチンおよび局所抗真菌剤クロトリマゾールおよびミコナゾールの比 較生物活性 精製ウィカルチンは広い作用スペクトルを持ち、またヒトに病原性である酵母
および／または真菌を効果的に殺すので、抗真菌剤の候補として重要である。従
って、ウィカルチンと現在広範囲に用いられている局所抗真菌剤クロトリマゾー
ルおよびミコナゾールとの比較研究が実施された。第一に、酵母指標としてスポ ロトリックス（ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ） 種に対するクロトリマゾールおよびミコ
ナゾールの毒性効果がＭＢＡ寒天拡散試験が試された。この目的には、クロトリ
マゾールを１０ｍｇ／ｍｌの濃度でエタノール（９６％）に溶解し；この保存溶
液をｄｄＨ２Ｏで希釈し、０．１から１０ｍｇ／ｍｌの濃度で１００μｌをＭＢ
Ａ試験で使用した。１０−５０μｇ量のクロトリマゾールが用いられた場合、阻
害ゾーンは１２から３２ｍｍの間であった。ミコナゾールは１００μｇ／ｍｌの
ＤＭＳＯ（１００％）保存溶液を調製して使用され、スポロトリックス種に対す
る生物活性がＭＢＡ試験においてクロトリマゾールと同一の様式で試験された。
バイオアッセイにおいて、０．０８−０．３μｇのミコナゾール使用は２２から
３６ｍｍの阻害ゾーンを生じた。１０μｇのクロトリマゾールおよび０．０８μ
ｇのミコナゾールの生物活性が２μｇの精製ウィカルチンの毒性に相当した。三
つの試験化合物の分子量に基づいた比較は、０．０７ピコモルのみのウィカルチ
ンが０．２ピコモルのミコナゾールおよび２９ピコモルのクロトリマゾールと同
一の活性であることを示している；従ってウィカルチンは非常に強力な抗真菌剤
である（図８）。

【００７５】実施例１３： 遺伝子特異的ＤＮＡプローブを用いたサザンハイブリダイゼーションによる酵母 Ｗ．カリフォルニカ３／５７（ＤＳＭ１２８６５）のウィカルチン−コード化Ｗ ＣＴ遺伝子の検出 配列ＩＤ番号：１に従った核酸が続いてのサザンハイブリダイゼーションのた
めのウィカルチン特異的ＤＮＡプローブを発生させるのに使用できることを証明
するため、ＤＩＧ−標識９３０ｂｐＤＮＡプローブがベクターｐＳＴＨ１内へク
ローン化されているＷＣＴ遺伝子の検出に用いられた。構築されたベクターｐＳ
ＴＨ１は、一般的に入手可能な原核生物クローニングベクターｐＢＲ３２２の誘
導体を代表している。

【００７６】 図９に示されたアガロースゲル電気泳動および対応するサザンブロットは疑い
なく核酸プローブがウィカルチン−コード化ＷＣＴ遺伝子を検出するために使用
できることを示している。実施例１４： β−１，３−Ｄ−グルカンによる酵母ウィリオプシス カリフォルニカ３／５７ （ＤＳＭ１２８６５）ウィカルチン−コード化ＷＣＴ遺伝子の転写誘導を検出す るためのノーザンブロット分析 β−１，３−Ｄ−グルカン−誘導ＷＣＴ転写を検出するため、酵母株ＤＳＭ１
２８６５を３００ｍｌのＢＡＶＣ培地または０．０３％の植物由来β−１，３−
Ｄ−グルカン ラミナリンを補給したＢＡＶＣ培地中、穏やかに振盪しながら（
６０ｒｐｍ）２０℃で４８時間増殖させ、異なった時間間隔後、総ＲＮＡを調製
するために使用した。ＲＮＡ単離の前に、すべての試料（１０ｍｌ）は１ｘ１０
８細胞／ｍｌの同一細胞密度とし、変性アガロースホルムアルデヒドゲルでの電
気泳動により分離した。図１０から観察されるように、非誘導条件下（補給なし
のＢＡＶＣ培地）およびラミナリン補給ＢＡＶＣ培地中の両方でＷＣＴ転写体の
１１００塩基サイズが検出された。グルカン添加なしでは、最大ＷＣＴ発現は対
数増殖期の終わりに達成された（１９時間後）；増殖静止期では著しく弱いハイ
ブリダイゼーションシグナルは減少した転写を示唆している。誘導培養条件下（
ラミナリン存在下）、ＷＣＴ転写体は１０時間後に非誘導培養よりもより高い強
度を示し、β−１，３−Ｄ−グルカン添加によりウィカルチン−コード化ＷＣＴ 遺伝子の転写が誘導できるという結論が認められる。 実施例付表： 実施例で使用された培地および溶液： ａ）ＢＡＶＣ培地 グルコース ５０ｇ／ｌ Ｄ，Ｌ−リンゴ酸 ２０ｇ／ｌ クエン酸三ナトリウム ０．５ｇ／ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４ １．５ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４ １．０ｇ／ｌ ＣａＣｌ２ ０．５ｇ／ｌ ミオ−イノシトール ０．０４ｇ／ｌ アミノ酸保存溶液（１０ｘ） ２００ｍｌ／ｌ 微量元素保存溶液（１００ｘ） １０ｍｌ／ｌ ビタミン保存溶液（１００ｘ） ２０ｍｌ／ｌ： ｂ）アミノ酸保存溶液（１０ｘ） アラニン ０．７５ｇ／ｌ アルギニン一塩酸塩 ３．５ｇ／ｌ アスパラギン酸 ０．５ｇ／ｌ グルタミン酸 ３ｇ／ｌ ヒスチジン一塩化物 ０．２ｇ／ｌ メチオニン ０．４ｇ／ｌ セリン ０．５ｇ／ｌ スレオニン ２ｇ／ｌ トリプトファン ０．４ｇ／ｌ ｃ）微量要素保存溶液（１００ｘ） ホウ酸 ２００ｍｇ／ｌ ＦｅＣｌ３ｘ６Ｈ２Ｏ ２００ｍｇ／ｌ ＺｎＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ ２００ｍｇ／ｌ ＡｌＣｌ３ ２００ｍｇ／ｌ ＣｕＳＯ４ｘ５Ｈ２Ｏ １００ｍｇ／ｌ Ｎａ２ＭｏＯ４ｘ２Ｈ２Ｏ １００ｍｇ／ｌ Ｌｉ２ＳＯ４ｘＨ２Ｏ １００ｍｇ／ｌ ＫＩ １００ｍｇ／ｌ 酒石酸水素カリウム ２ｇ／ｌ ｄ）ビタミン保存溶液（１００ｘ） ４−アミノ安息香酸 ２０ｍｇ／ｌ ビオチン ２ｍｇ／ｌ 葉酸 ２ｍｇ／ｌ ニコチン酸 １００ｍｇ／ｌ 塩酸ピリドキシン １００ｍｇ／ｌ リボフラビン ５０ｍｇ／ｌ チアミン二塩酸塩 ５０ｍｇ／ｌ Ｄ−パントテン酸カルシウム １００ｍｇ／ｌ ビオチン：５ｇ ＫＨ２ＰＯ４／５０ｍｌ蒸留水に溶解 葉酸：5０ｍｌの蒸留水に溶解し、数滴の希ＮａＯＨを添加 リボフラビン：加熱しながら5００ｍｌの蒸留水および数滴のＨＣｌに溶解 残りのビタミンは少量の水に溶解できる。 ＢＡＶＣ培地のｐＨはＫＯＨの添加によりｐＨ４．７に調節した。 グルコースおよび保存溶液は別々に滅菌した。アミノ酸、ビタミンおよび微量要
素保存溶液はバルブを解放して１００℃で２０分滅菌し、続いてオートクレーブ
したＢＡＶＣ培地に加えられた。本文で使用された略号 ：

【００７７】

【表４】

【００７８】寄託 本発明のために使用された以下の微生物は、特許手続きのための微生物寄託の
国際承認についてのブダペスト条約の規定に応じた国際寄託所として承認されて
いるＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓ
ｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）−Ｍａｓｃ
ｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ ｌｂ，３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｆｅ
ｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ、に寄託された。 （寄託番号；寄託日）：ウィリオプシス カリフォルニカ 株３／５７（ＤＳＭ１２８６５）；（０９．０
６．１９９９）チゴサッカロミセス バイリ 株４１２（ＤＳＭ１２８６４）；（０９．０６．１
９９９）

【００７９】参照文献 Ａｎａｉｓｓｉｅ，Ｅ．（１９９２）．免疫無防備状態宿主における日和見真菌
症：癌センターでの経験および総説．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１４：
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ｓＲＮＡの配列：プレプロ毒素はα／βヘテロダイマー蛋白質毒素へ加工される
．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１３：３４１−３５１． Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｍ．Ｊ．＆ Ｆ．Ｎｅｕｈａｕｓｅｎ（１９９４）．酵母チゴ サッカロミセス バイリ およびハンセニアスポラ ウバルムにおけるキラー毒素
分泌二本鎖ＲＮＡマイコウイルス．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：１７６５−１７７２
． Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｍ．Ｊ．＆ Ｆ．Ｒａｄｌｅｒ（１９８７）．サッカロミセス セレビジエ 株２８のキラー毒素のための主レセプターとしての酵母細胞壁のマ
ンノプロテイン．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３３：３３４７−３３５
４． Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｍ．Ｊ．＆ Ｆ．Ｒａｄｌｅｒ（１９８８）．サッカロミセス セレビジエ におけるキラー毒素Ｋ２８のための細胞壁レセプターの分子構造． Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ．１７０：２１９２−２１９６． Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｍ．Ｊ．＆ Ｆ．Ｒａｄｌｅｒ（１９９５）．マイコウイルス
および酵母−キラー毒素は細胞生物学への洞察を可能にする．Ｆｏｒｓｃｈｕｎ ｇｓｍａｇａｚｉｎ ｄｅｒ Ｊｏｈａｎｎｅｓ Ｇｕｔｅｎｂｅｒｇ−Ｕｎｉ ｖｅｒｓｉｔａｔ Ｍａｉｎｚ ２：８６−９６． Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｍ．Ｊ．＆ Ｆ．Ｒａｄｌｅｒ（１９９６）．ｄｓＲＮＡ−ウ
イルスは酵母サッカロミセス中でキラー毒素をコード化している．ＢｉｏＥｎｇ ｉｎｅｅｒｉｎｇ ２：３０−３４． Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｍ．Ｊ．＆ Ｇ．Ｓｃｈｅｒｎｉｋａｕ（１９９７）．サッカ ロミセス セレビジエ のｃＤＮＡに基づいたＫ１／Ｋ２／Ｋ２８三重キラー株の
構築．Ｆｏｏｄ Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３５：２８１−２８
５． Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｍ．Ｊ．＆ Ｐ．Ｃｏｍｐａｉｎ（１９９５）．サッカロミセ ス セレビジエ のキラー毒素耐性ｋｒｅ１２変異体：二次Ｋ１膜レセプターの遺
伝子的および生化学的証拠．Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６４：４３５−
４４３． Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９５）．酵母におけるウイルスＫ２８キラー毒
素遺伝子ｃＤＮＡコピーのクローニングおよび発現．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ ｔ ．２４６：２３６−２４６． Ｓｏｈｍｉｔｔ，Ｍ．Ｊ．，Ｂｒｅｎｄｅｌ，Ｍ．，Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｒ．＆
Ｆ．Ｒａｄｌｅｒ（１９８９）．酵母キラー毒素Ｋ２８によるサッカロミセス セレビジエ におけるＤＮＡ合成阻害．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５ ：１５２９−１５３５． Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｍ．Ｊ．，Ｋｌａｖｅｈｎ，Ｐ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｓｃｈｏ
ｎｉｇ，Ｉ．＆ Ｄ．Ｊ．Ｔｉｐｐｅｒ（１９９６）．酵母Ｋ２８キラー毒素の
作用様式についての細胞周期研究．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４２：２６５５−２
６６２． Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｍ．Ｊ．，Ｐｏｒａｖｏｕ，Ｏ．，Ｔｒｅｎｚ，Ｋ．＆ Ｋ．
Ｒｅｈｆｅｌｄｔ（１９９７）．酵母ハンセニアスポラ ウバルムの抗カンジダ 活性に関与する独特な二本鎖ＲＮＡ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：８８５２−８８５
５． Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｍ．Ｊ．，Ｐｏｒａｖｏｕ，Ｏ．，Ｔｒｅｎｚ，Ｋ．＆ Ｋ．
Ｒｅｈｆｅｌｄｔ（１９９７）．酵母ハンセニアスポラ ウバルムの抗カンジダ 活性に関与する独特な二本鎖ＲＮＡ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：８８５２−８８５
５． Ｓｃｈｒｕｅｎｄｅｒ，Ｊ．，Ｍｅｉｎｈａｒｄｔ，Ｆ．，Ｒｏｈｅ，Ｍ．＆
Ｊ．Ｋａｍｐｅｒ（１９９４）．微生物における線状プラスミド−遺伝原理およ
び応用可能性．ＢｉｏＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０：２９−３９． Ｔｉｐｐｅｒ，Ｄ．Ｊ．＆ Ｍ．Ｊ．Ｓｃｈｍｉｔｔ（１９９１）．酵母ｄｓＲ
ＮＡウイルス：複製およびキラー表現型．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：２
３３１−２３３８． Ｔｒｏｉｌｌｅｔ，Ｎ．，Ｄｕｒｕｓｓｅｌ，Ｃ．，Ｂｉｌｌｅ，Ｊ．，Ｇｌａ
ｕｓｅｒ．Ｍ．Ｐ．＆ Ｊ．Ｐ．Ｃｈａｖｅ（１９９３）．ＨＩＶ−感染患者に
おけるカンジダ アルビカンスのインビトロ感受性とフルコナゾール耐性口咽頭
カンジダ症間の相関．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉ ｓ ．１２：９１１−９１５． Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．Ｍ．，ＭｃＬｅｏｄ，Ａ．Ｈ．＆ Ｖ．Ｊ．Ｈｏｄｇｓｏｎ
（１９９５）．キラー酵母および病原性真菌間の相互作用．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２７：２１３−２２２． Ｗｉｃｋｎｅｒ，Ｒ．Ｂ．（１９９３）．二本鎖ＲＮＡウイルス複製およびパッ
ケージング．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７９７−３８００． Ｗｉｎｇａｒｄ，Ｊ．Ｒ．（１９９５）．腫瘍学患者における病原体としてのＣ ．アルビカンス 以外のカンジダ種の重要性．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ． ２０ ：１１５−１２５．

【００８０】

【最も重要な配列の簡単な説明】

配列ＩＤ番号：１：酵母ウィリオプシス カリフォルニカ株３／５７のＷ
ＣＴ−コード化蛋白質毒素ウィカルチンのＤＮＡ配列および演繹されるアミノ酸
配列。 配列ＩＤ番号：２：酵母Ｚ．バイリのＺＢＴコード化蛋白質毒素チゴシン
のｃＤＮＡ配列および演繹されるアミノ酸配列。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ｗ．カリフォルニカ毒素ウィカルチンおよび酵母Ｓ．セレビジエ のエンド−β−１，３−グルカナーゼＢｇｌ２のＮ−末端アミノ酸配列。亜配列
の唯一の変位（そのほかは同一である）がボールドで示されている（Ｂｇｌ２は
Ｋｌｅｂｌ ＆ Ｔａｎｎｅｒ，１９８９による）。

【図２】 β−Ｄ−グルカン ラミナリン（Ｌ）およびプスツラン（Ｐ）存
在下（２ａ）および不在下（２ｂ）の、感受性酵母Ｓ．セレビジエ１９２．２ｄ
のウィカルチン−処理細胞の殺菌速度論。用いられた毒素は４．２ｘ１０５Ｕ／
ｍｇの比活性、４．０ｘ１０５Ｕ／ｍｌの総活性（ｔｏｔａｌ ａｃｔｉｖｉｔ
ｙ）を持っていた。

【図３】 （ａ、ｂ、ｃ、ｄ）酵母Ｓ．セレビジエのＫｒｅ＋およびＫｒｅ
−株においてウィカルチン感受性／耐性を検出するための寒天拡散試験。ＫＲＥ
１−運搬ベクターｐＰＧＫ［ＫＲＥ１］によるウィカルチン−耐性ｋｒｅ１ゼロ
変異体Ｓ．セレビジエＳＥＹ６２１０［Δｋｒｅ１］の形質転換は完全にウィカ
ルチン感受性を回復させる。

【図４】 （Ａ）マンノプロテイン−セファロースによるアフィニティーク
ロマトグラフィー後、Ｚ．バイリ株４１２（ＤＳＭ１２８６４）により産生およ
び分泌されたチゴシンのゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析。（Ｂ）
精製キラー毒素チゴシンの生物活性を検出するための寒天拡散試験。

【図５】 トランスジェニック植物発生のためのＺＢＴ−またはＷＣＴ−運
搬発現ベクターの構築図。 ［記号：ＲＢ、ＬＢ：アグロバクテリウム ツメファシエンス天然Ｔｉ−プラス
ミドの右および左境界配列；ＣａＭＶ−Ｐ：カリフラワー モザイクウイルス３
５Ｓプロモーター；ＮＯＳ−Ｐ、ＮＯＳ−Ｔ：ノパリン シンターゼ転写プロモ
ーターおよびターミネーター；ｋａｎＲ：大腸菌での選択のためのストレプトコ
ッカス カナマイシン耐性遺伝子；ＮＰＴ−ＩＩ：植物での選択のためのトラン
スポゾンＴｎ５からのネオマイシン ホスホトランスフェラーゼ遺伝子］

【図６】 （Ａ）酵母サッカロミセス セレビジエ中のウィカルチン−コー
ド化毒素遺伝子ＷＣＴの異種発現のためのエピソームベクターｐＳＴＨ２の部分
制限地図。ベクターｐＳＴＨ２は、市販品として入手可能な２μ多コピーベクタ
ーｐＹＸ２４２に基づいて構築され、その中へ株ＤＳＭ１２８６５からのＷＣＴ 遺伝子が９３０ｂｐＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ断片としてクローン化されている。問
題とする毒素遺伝子は酵母ＴＰＩプロモーター転写調節下にあり、従って、Ｓ． セレビジエ 内へ形質転換後、ウィカルチンの強いおよび構成的な発現が可能であ
る。 （Ｂ）構築されたウィカルチン発現ベクターｐＳＴＨ２（レーン１）および基本
ベクターｐＹＸ２４２（レーン２）で形質転換後、Ｓ．セレビジエの濃縮培養上
清のゲル電気泳動による分析。Ｓ．セレビジエで異種的に発現されたウィカルチ
ンは矢印で示されている。 （Ｃ）ウィカルチン−発現酵母ベクターｐＳＴＨ２で形質転換後の酵母Ｓ．セレ
ビジエの細胞外β−１，３−グルカナーゼ活性の検出。エキソ−β−１，３−グ
ルカナーゼ活性を決定するため、ロイシンを含まないＳＣ寒天上で増殖させた酵
母コロニーに０．０４％の４−メチルウムベリフェリル−β−Ｄ−グルコシド（
ＭＵＧ）を含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）を噴霧した。３７
℃で３０分インキュベーション後、寒天プレートをＵＶ光（波長２５４ｎｍ）を
照射した。グルカナーゼ活性はＭＵＧ加水分解による蛍光で検出した。 ［記号：１および４、自身のプロモーター下でウィカルチン−コード化ＷＣＴ遺
伝子を発現するベクター（ｐＥＰ−ＷＣＴ）で形質転換したＳ．セレビジエ；２
、野生型酵母Ｗ．カリフォルニカ３／５７（ＤＳＭ１２８６５）；３、野生型酵
母Ｗ．カリフォルニカ３／１１１；基本ベクターｐＹＸ２４２（毒素遺伝子を含
んでいない）で形質転換したＳ．セレビジエ］

【図７】 分裂酵母シゾサッカロミセス ポムベにおける外来蛋白質（特に
ウィカルチンおよびチゴシン）の異種発現および分泌のためのベクターｐＴＺα
／γの構造図。 ［記号：Ｐｎｍｔ１、Ｔｎｍｔ１、分裂酵母Ｓ．ポムベのチアミン制御ｎｍｔ１ 遺伝子の転写プロモーターおよび転写ターミネーター；Ｓ／Ｐ、発芽酵母Ｓ．セ レビジエ のウイルスＫ２８プレプロ毒素の分泌およびプロセッシング配列；ａｒ ｓ１ 、分裂酵母の染色体１からの自律性複製配列；ｌｅｕ２、ロイシン−原栄養
性Ｓ．ポムベ形質転換体の選択のためのロイシン−２マーカー遺伝子］

【図８】 精製ウィカルチン、クロトリマゾールおよびミコナゾールの生物
活性の比較；感受性指標酵母スポロトリクス種に対するバイオアッセイ（寒天拡
散試験）において、示されているモル量は１２ｍｍの阻害ゾーン直径を生み出す
。

【図９】 アガロースゲル電気泳動（Ａ）およびＤＩＧ−標識ＷＣＴプロー
ブによるサザンハイブリダイゼーション（Ｂ）による、ｐＳＴＨ１（ｐＢＲ３２
２誘導体）内にクローン化した酵母Ｗ．カリフォルニカ３／５７（ＤＳＭ１２８
６５）のウィカルチン−コード化ＷＣＴ遺伝子の検出。 ［記号：Ｍ、ＤＩＧ−標識ＤＮＡサイズ標品ＩＩ；レーン１、ＥｃｏＲＩおよび ＳａｌＩ で制限されたｐＳＴＨ１；レーン２、”スマートラダー”ＤＮＡマーカ
ー］

【図１０】 ＢＡＶＣ培地中での非誘導培養条件下（Ａ）および０．０３％
ラミナリンを補給したＢＡＶＣ培地中での誘導条件下における、酵母Ｗ．カリフ ォルニカ ３／５７（ＤＳＭ１２８６５）のウィカルチン−コード化ＷＣＴ遺伝子
転写誘導のノーザン分析。株ＤＳＭ１２８６５から単離された全ＲＮＡは変性ア
ガロース／ホルムアルデヒドゲル中、一定電圧（７Ｖ／ｃｍ）での電気泳動によ
り分離された。ＲＮＡはウィカルチン−特異的、ＤＩＧ−標識ＤＮＡプローブ（
６３０ｂｐ）に対してナイロン膜上でハイブリダイズされ、化学発光で検出され
た。 ［記号：Ｍ、ＤＩＧ−標識ＲＮＡサイズ標品Ｉ；レーン１−８は単離された全Ｒ
ＮＡの試料採取時間に対応している：レーン１、１０時間；レーン２、１５時間
；レーン３、１９時間；レーン４、２４時間；レーン５、３３時間；レーン６、
３８時間；レーン７、４３時間；レーン８、４８時間］

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ ４Ｂ０６４ 39/395 Ｒ ４Ｂ０６５ 48/00 ４Ｃ０８４ Ａ６１Ｐ 31/10 ４Ｃ０８５ 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/39 ４Ｃ０８７ Ａ６１Ｐ 31/10 16/14 ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 14/39 Ｃ１２Ｎ 1/16 Ａ 16/14 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 1/16 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｍ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｒ 1:865 1:645 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:865） Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＲ，Ｂ Ｙ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＮ，ＪＰ，ＫＲ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＫ，ＴＲ，ＵＡ， ＵＳ，ＹＵ，ＺＡ (72)発明者 テイセン，ズィモネ ドイツ連邦共和国デー−70794 フィルダ ーストラドト−ボンランデン，クロイゼッ カーシュトラーセ 29 (72)発明者 ヴァイラー，フランク ドイツ連邦共和国デー−66111 ザールブ リュッケン，バイアーンシュトラーセ 18 (72)発明者 シュミット，マンフレッド デンマーク国デー−66386 ザイント・イ ングベルト，イン・デン・カストラー・レ ーデーン 14 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA17 CB03 2B150 AC15 AC24 AC37 AD02 AD22 DD12 4B021 MC01 MC02 MK06 MK23 4B024 AA01 AA05 AA08 AA10 AA11 BA10 BA12 BA38 BA67 CA04 DA01 DA12 EA04 FA02 FA06 FA07 FA20 GA11 HA12 4B063 QA01 QA19 QQ02 QQ53 QR32 QR56 QS16 QS25 QS34 4B064 AG30 CA05 CC24 DA02 DA10 DA11 DA13 4B065 AA72X AA72Y AA80X AA89X AB01 AC14 BA02 BB01 CA24 CA29 CA31 CA41 CA43 CA44 CA53 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA01 BA20 BA22 CA53 ZB32 4C085 AA13 AA14 BB31 CC24 EE01 4C087 AA01 BC83 ZB32 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 CA15 DA75 DA83 EA29 EA52 FA73 FA74

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ウィリオプシス カリフォルニカ（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ）および／またはチゴサッカロミセス バイリ（Ｚｙｇ ｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉ ）から得ることができる蛋白質毒
   素。
2. 【請求項２】 ＤＳＭ１２８６４および／またはＤＳＭ１２８６５から得る
   ことができる、請求項１に記載の蛋白質毒素。
3. 【請求項３】 抗真菌および／または殺菌作用を持つ請求項１および２に記
   載の蛋白質毒素。
4. 【請求項４】 グルカナーゼ活性を持つ、請求項１から３の任意の項に記載
   の蛋白質毒素。
5. 【請求項５】 β−１，６−Ｄ−グルカンへ結合し、並びにβ−１，３−Ｄ
   −グルカナーゼおよび／またはβ−１，３−グルカノシルトランスフェラーゼ活
   性を持つ、請求項４に記載の蛋白質毒素。
6. 【請求項６】 配列ＩＤ番号：１または配列ＩＤ番号：２に従ったアミノ酸
   配列またはその機能性変異体、および少なくとも８ヌクレオチドを持つその断片
   を持っている、請求項１−５の任意の項に記載のグルカナーゼおよび／または蛋
   白質毒素をコード化している核酸（ここで配列ＩＤ番号：１または配列ＩＤ番号
   ：２は本請求項の一部である）。
7. 【請求項７】 核酸がＤＮＡまたはＲＮＡ、好適には二本鎖ＤＮＡである、
   請求項６に記載の核酸。
8. 【請求項８】 配列ＩＤ番号：１の塩基位置１から９５１または配列ＩＤ番
   号：２の塩基位置１から７１７に従った核酸配列を持つＤＮＡである、請求項６
   または７に記載の核酸（ここで配列ＩＤ番号：１または配列ＩＤ番号：２は本請
   求項の一部である）。
9. 【請求項９】 一つまたはそれ以上の制御領域（プロモーター、エンハンサ
   ー、ターミネーター）および／または３’−末端ポリ−Ａ配列および／または細
   胞内プロ毒素プロセッシングのために必要であるＫｅｘ２ｐエンドペプチダーゼ
   切断部位および／または一つまたはそれ以上のＮ−グリコシル化可能部位を含む
   、請求項８に記載の核酸。
10. 【請求項１０】 ＤＳＭ１２８６４および／またはＤＳＭ１２８６５から得
    ることができる、請求項８−９の任意の項に記載の核酸。
11. 【請求項１１】 ベクター、好適には発現ベクターまたは遺伝子治療に有効
    であるベクター内に含まれている、請求項６−１０の任意の項に記載の核酸。
12. 【請求項１２】 核酸が化学的に合成されるかまたはプローブにより遺伝子
    ライブラリーから単離される請求項６−１０の任意の項に記載の核酸の製造法。
13. 【請求項１３】 配列ＩＤ番号：１または配列ＩＤ番号：２に従ったアミノ
    酸配列またはその機能性変異体、および少なくとも６個のアミノ酸を持つその断
    片を持っているポリペプチド。
14. 【請求項１４】 請求項６−１１の任意の項に記載の核酸が適切な宿主細胞
    で発現される、請求項１−５および１３に記載のポリペプチドの製造法。
15. 【請求項１５】 請求項１−５および１３の任意の項に記載のポリペプチド
    に対する抗体。
16. 【請求項１６】 哺乳動物が請求項７に記載したポリペプチドで免疫されお
    よび、もし適切であれば、形成された抗体が単離される請求項１５に記載の抗体
    の製造法。
17. 【請求項１７】 請求項６−１０の任意の項に記載の核酸、請求項１−５お
    よび１３の任意の項に記載のポリペプチドまたは請求項１５に記載の抗体および
    、もし適切ならば医薬として受容可能な添加物および／または補助剤から成る薬
    剤製品。
18. 【請求項１８】 表皮、皮膚および皮下皮膚糸状菌症、粘膜の真菌症および
    全身性真菌症、特に好適にはカンジダ真菌症のような真菌症処置のための薬剤製
    品の製造法、ここで請求項６−１０の任意の項に記載の核酸または請求項１−５
    および１３の任意の項に記載のポリペプチドまたは請求項１５に記載の抗体は医
    薬として受容可能な添加物および／または補助剤と一緒に処方される。
19. 【請求項１９】 請求項６−１０の任意の項に記載の核酸または請求項１−
    ５および１３の任意の項に記載のポリペプチドまたは請求項１５に記載の抗体、
    および、もし適切ならば、適切な添加物および／または補助剤を含んでいる診断
    薬。
20. 【請求項２０】 請求項６−１０の任意の項に記載の核酸または請求項１−
    ５および１３の任意の項に記載のポリペプチドまたは請求項１５に記載の抗体は
    医薬として受容可能な担体と組み合わされる、表皮、皮膚および皮下皮膚糸状菌
    症、粘膜の真菌症および全身性真菌症、特に好適にはカンジダ真菌症のような真
    菌症を診断するための診断薬の製造法。
21. 【請求項２１】 請求項６−１０の任意の項に記載の核酸または請求項１−
    ５および１３の任意の項に記載のポリペプチドまたは請求項１５に記載の抗体、
    および、もし適切ならば、適切な添加物および／または補助剤を含んでいる機能
    的相互作用剤を同定するためのアッセイ。
22. 【請求項２２】 機能的相互作用剤を同定するための、請求項６−１０の任
    意の項に記載の核酸または請求項１−５および１３の任意の項に記載のポリペプ
    チドの使用。
23. 【請求項２３】 変異体を発見するための、請求項６−１０の任意の項に記
    載の核酸の使用であって、上記の核酸で遺伝子ライブラリーをスクリーニングし
    、および発見された変異体を単離することから成る使用。
24. 【請求項２４】 食品および動物飼料中の有害な酵母および真菌を制御する
    ための、請求項１−５および１３の任意の項に記載のポリペプチドの使用。
25. 【請求項２５】 ＤＳＭ１２８６４およびＤＳＭ１２８６５を増殖させるた
    めの方法であって、それらを合成Ｂおよび／またはＢＡＶＣ培地中で増殖させる
    ことを含む方法。
26. 【請求項２６】 トランスジェニック植物および植物細胞の発生のための、
    請求項６−１１の任意の項に記載の核酸の使用。