JP2003503704A - ランゲルハンス島及びβ細胞機能不全に関する方法及び組成物 - Google Patents

ランゲルハンス島及びβ細胞機能不全に関する方法及び組成物

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プロティオーム・サイエンシィズ・ピーエルシー
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Abstract

(57)【要約】 インスリン非依存性糖尿病のような疾患における、ランゲルハンス島またはβ細胞機能不全に関する方法及び組成物が開示される。特に、これらの疾患において特異的に発現されるタンパク質が同定される。一つの特徴点として、ランゲルハンス島またはβ細胞機能の特異的なレベルを有する患者から得た関連組織、または上記患者の代表物である関連組織において、少なくとも一つのタンパク質が特異的に発現されるというパラダイムを確立することに基づいて、ランゲルハンス島またはβ細胞機能不全によって特徴付けされる疾患を治療することにおける有用性を測定するために、試薬をスクリーニングする方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インスリン非依存性糖尿病のような疾患における、ランゲルハンス
島及びβ細胞機能不全に関する方法及び組成物に関する。特に本発明は、正常な
状態での発現に対して、インスリン非依存性糖尿病において特異的に発現される
タンパク質を同定し且つそれを記載し、特にランゲルハンス島またはβ細胞機能
不全及び／または重量と関連するタンパク質を同定し且つ記載する。さらに本発
明は、ランゲルハンス島またはβ細胞機能不全及び／または重量の調節に関与す
る遺伝子産物と相互作用する能力を介したタンパク質を同定し且つ記載する。さ
らにまた、本発明は、ランゲルハンス島またはβ細胞機能不全及びインスリン非
依存性糖尿病を治療または予防するための化合物に対する潜在的な分子ターゲッ
トである特異的に発現されるタンパク質の同定のための方法、特に実験的なパラ
ダイムを提供する。さらに本発明は、ランゲルハンス島またはβ細胞機能不全及
びインスリン非依存性糖尿病の予防及び治療のための化合物の同定方法及びその
治療上の使用を提供する。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病は、世界で１億人以上が罹患している最も一般的な代謝性疾患の一つで
ある(King, H.及びZimmet, P. (1988) World Health Statistics Quarterly 41,
190-196; Harris, M.I.等 (1992) Diabetes Care 15, 815-819)。糖尿病の世界
的な発症は、２０１０年までに二倍になると予想され、インド、中国、南米及び
極東のような産業的な発展途上国において、主に増加するものと予想される。
【０００３】 糖尿病には、二つのタイプが存在する。Ｉ型またはインスリン依存性糖尿病（
ＩＤＤＭ）は、膵臓β細胞の進行性の自己免疫破壊の結果であり、全糖尿病人口
の５−１０％を構成する。ＩＩ型糖尿病またはインスリン非依存性糖尿病（ＮＩ
ＤＤＭ）または成人発症型糖尿病は、糖尿病人口の９０−９５％を占める。典型
的にそれは、中年及び高齢の患者で発症するが、若年の患者でも発症することが
あり、一般的に肥満症と関連している。ＮＩＤＤＭは、二つの代謝障害と関連す
る：インスリン抵抗性と不適切なインスリン分泌である。インスリン抵抗性は、
骨格筋及び脂肪組織に影響して減少したグルコースの取り込みを生じ、またグル
コースの上昇した肝臓生産を生ずる。膵臓の病変が、ＮＩＤＤＭの必須の構成成
分である。典型的に初期の病変は、グルコース量に応答するインスリンの過剰生
産であるようであるが、後に第一期のインスリン分泌応答において損失または減
少が存在し、次第に外因性インスリンの投与が必要な程度にインスリン分泌能力
が減少する。家系の研究により、ＮＩＤＤＭの罹患において主要な遺伝学的構成
成分が示されているが、若年の成人発症型糖尿病（ＭＯＤＹ）と称されるＮＩＤ
ＤＭのサブタイプとは無関係であり、可能性のある遺伝子はまだほとんど同定さ
れていない。
【０００４】 インスリン非依存性糖尿病に対する伝統的な治療は、血液グルコースの制御に
焦点が当てられている。しかしながら現在の試薬は一般的に、非糖尿病患者に存
在するものと同程度に血液グルコースの制御を達成できない。さらにＮＩＤＤＭ
患者はしばしば、上昇した血漿トリグリセリドと上昇した血漿コレステロールを
有し、または低い割合のＨＤＬ：ＬＤＬ−コレステロール値を有する。全てのこ
れらの代謝の変化は、心臓血管疾患、失明、ネフロパシー、発作、及び微小血管
疾患といった糖尿病の二次的合併症に対して不利である。
【０００５】 インスリン非依存性糖尿病に対するより効果的な治療に対して、当該技術分野
で極度の必要性が存在し続ける。
【０００６】 糖尿病人口は極端に偏っており、ベータ細胞機能不全とＮＩＤＤＭの発症は複
数の原因を有するようである。部分的に、それは増大したインスリンの必要性に
適合する機能不全と関連し、インスリン抵抗性の結果として生ずる。しかしなが
ら、毒素、ウイルス疾患及び遺伝学的な遺伝的欠損を含む他の因子も、無視する
ことができない。
【０００７】 インスリン抵抗性疾患に関するミューテーションを有する数多くの動物モデル
が存在し、インスリン非依存性糖尿病の研究のためのモデルとして上記動物を利
用する試みがなされている。インスリン抵抗性及びインスリン非依存性糖尿病の
ための最も研究されている動物モデルはマウスであり、それは常染色体劣性ミュ
ーテーションｏｂ／ｏｂ（肥満症）及びｄｂ／ｄｂ（糖尿病）を含む。これらの
ミューテーションは、それぞれ第６染色体及び第４染色体に存在するが、遺伝子
が同じバックグランドの株で発現されている限り、臨床上同じ表現型を導く。ｏ
ｂ遺伝子産物は、脳に脂肪組織上の脂肪貯蔵のシグナルを提供する、脂肪組織に
よって主に生産される１６ｋＤａポリペプチドとして同定されている。循環タン
パク質（レプチンと称される）を生産しないミューテーションを有するマウスは
過食症で肥満症であり、微弱な熱調節と身震いすることのない熱調節を有し、減
少したグルコース不耐症を有してインスリン抵抗性である。ＯＢ遺伝子ミューテ
ーションがＣ５Ｂ１／６バックグランドで存在する場合、マウスは明らかな臨床
上の糖尿病の証拠を有さないが、過度に高インスリン血症でありグルコース不耐
症である。
【０００８】 ｄｂ／ｄｂマウスは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を介する正常なシグナル伝達を有
さないように、レプチンに対するレセプターにおいてミューテーションを有する
。このミューテーションがＣ５７Ｂ１／６バックグランドに存在する場合、ｏｂ
ミューテーションと表現型的に同等となる。しかしながら、ｄｂ／ｄｂミューテ
ーションはＣ５７Ｂ１／Ｋｓマウスバックグランドで正常に発現され、このバッ
クグランドではこのミューテーションは明らかな糖尿病を引き起こす。Ｃ５７Ｂ
Ｉ／６株の野生型マウスと、Ｃ５７Ｂｌ／Ｋｓ株の野生型マウスの間の主要な差
異は、ＢＩ／６マウスがＢｌ／Ｋｓマウスの約２倍のランゲルハンス島細胞重量
を有することであると認識される。かくして、Ｃ５７ＢＩ／６株のマウスは、Ｃ
５７Ｂｌ／Ｋｓ株のマウスより、インスリン抵抗性によって課される膵臓β細胞
ストレスを引き出すことができる。
【０００９】 他のミュータント動物モデルは、ｆａ／ｆａ（脂肪過多）ラット及びＺＤＦ脂
肪過多ラットを含み、これらはｏｂ／ｏｂ及びｄｂ／ｄｂマウスとそれぞれ強力
な相同性を有する。かくしてｆａ／ｆａラットは肥満症であり、インスリン抵抗
性であり、非常に高インスリン血症であり、グルコース不耐症である一方、ＺＤ
Ｆラットは、肥満症であり、インスリン抵抗性であり、高インスリン血症である
が、オスのラットは約６週齢の後に明らかな糖尿病を発症する。引き続き、Zuck
er ｆａ／ｆａラット及びＺＤＦオスラットのランゲルハンス島は、インスリン
抵抗性の場合にインスリン分泌を維持する能力について異なるはずである。同様
に、ＺＤＦオスラット由来のランゲルハンス島は、明らかな糖尿病を発症しない
ＺＤＦメスラット由来のランゲルハンス島とは本質的に異なっているに違いない
。
【００１０】 ＮＺＯマウス、日本ＫＫマウス、及びＧＫラットのような同系交配マウス株は
、インスリン抵抗性、膵臓β細胞機能不全、及び糖尿病のモデルとなる。さらに
、アフリカトゲネズミ及びスナネズミのような砂漠の齧歯類は、その天然の生息
地においてインスリン抵抗性でも糖尿病でもないが、標準的な実験室用の食餌を
与えた場合、明らかな糖尿病となる。
【００１１】 インスリン抵抗性、膵臓β細胞機能不全の発症、及びグルコース不耐性は、高
齢の齧歯類の一般的な特徴であり、上記疾患の発症は、高脂肪含量の食餌を摂取
することによって加速でき、これらの食餌は合成の均質な食餌であっても、高脂
肪含量のヒトの食物（カフェテリアダイエット）の添加若しくはそれによる正常
なラットの食物の置換の結果でも良い。
【００１２】 ヒトインスリン非依存性糖尿病は、二卵性の双子よりも一卵性の双子において
高い割合で非常に一致する。両親との相関では強力な家族的傾向も存在する。か
くして、両親がＮＩＤＤＭを有する子孫は、片親のみがＮＩＤＤＭを有する子孫
より、ＮＩＤＤＭに罹患する危険が高い。
【００１３】 最近のデータにより、出生体重の低さ（妊娠期間に関して）と晩年にインスリ
ン非依存性糖尿病に罹患することの間で有意な相関関係が存在することが示され
ている。これは、子宮における栄養摂取とインスリン非依存性糖尿病の罹患の間
で関係が存在するようであることを示唆する。ヒトＮＩＤＤＭにおけるこの関係
の分子的性質は、定義されてない。しかしながら、ラットにおける研究により、
妊娠したメスのラットが、通常である１５％のタンパク質の食餌よりもむしろ６
％のタンパク質の食餌を摂取したならば、２セットの妊娠したラットは同数の子
孫を生むが、６％のタンパク質の食餌を摂取した母から生まれた子供のラットは
より小さいことが示されている。もしこれらの子供が、インスリン抵抗性を誘導
する高脂肪の食餌を離乳期で後に与えられたならば、それらはインスリン非依存
性糖尿病に罹患するであろう。さらに、６％のタンパク質の食餌を摂取した母か
ら生まれた子供は、１５％のタンパク質の食餌を摂取した母から生まれた子供よ
り、小さなランゲルハンス島細胞重量を有する。
【００１４】 ＮＩＤＤＭの発症の現在の増加のほとんどは、開発途上国において生じている
。上記の国では、妊娠期間に対して小さな赤ちゃんの発症が高いようである。こ
れらの国では、文化交流の間でその伝統的な高い炭水化物の局地的に生育した食
餌から、より西洋スタイルの高脂肪の食餌に変化しているため、患者においてイ
ンスリン抵抗性を発症するより高い圧力が、ランゲルハンス島機能に対して掛か
っている。低い島細胞重量の発症に関連する因子の同定は、インスリン非依存性
糖尿病の発症を予防し、並びに発症前の状態を治療する新規な薬剤の開発を許容
するであろう。
【００１５】 絶対的な膵臓β細胞重量は、出生時または生後まもなくで主に決定される。し
かしながら、膵臓β細胞重量は、例えば妊娠の間といった特定の状況で増大する
。かくして、膵臓β細胞の増殖活性の分子的性質を調べるためのモデルが、妊娠
した動物である。
【００１６】 上述の動物モデルは、膵臓β細胞機能不全またはインスリン非依存性糖尿病に
対する治療の可能性のある新規な薬剤を評価するために、次第に使用されている
ようになっている。しかしながら、酵素活性の個々の変化は、いくつかの動物モ
デルで同定されており、これがどのように薬剤治療によって改変されるかも同定
されているが、β細胞機能不全を示す正常な動物のランゲルハンス島またはβ細
胞におけるタンパク質発現の差異に関する系統的な評価はなされていない。イン
スリン非依存性糖尿病を導くβ細胞機能不全の発症の元となっているものは、こ
れらのタンパク質発現の変化である。ヒト及びイヌやネコといったペット動物に
おけるインスリン非依存性糖尿病の原因となるものは、同じタンパク質発現の変
化である。インスリン非依存性糖尿病と膵臓β細胞機能不全のひどさ及び流行を
考慮して、上記タンパク質の発現レベルを非糖尿病患者のレベルに戻すように調
節することが、上記疾患状態を治療する一つの手段を表すため、疾患の原因とな
るタンパク質の系統的な同定に対する著しい必要性が存在する。
【００１７】 米国特許第5,702,902号(Tartaglia)は、正常な状態の発現に対して、体重異常
状態のmRNAレベルで特異的に発現される遺伝子を同定し記載する。ここで、遺伝
子発現を改変することによって、または特異的に発現される遺伝子の遺伝子産物
（タンパク質）相互作用することによってのいずれかで、体重異常を治療するた
めに治療上使用できる化合物を同定するために、遺伝子発現パターンが使用でき
ることが示唆されている。
【００１８】 インスリン抵抗性疾患のような疾患プロセスの分子的基礎を同定するためのツ
ールとしての、特異的な遺伝子発現の使用は、特異的なタンパク質発現に直接翻
訳される特異的遺伝子mRNA発現に依存する。これはこの場合には該当しない。存
在するタンパク質の量は、該当するmRNAのターンオーバー速度、個々のタンパク
質のターンオーバー速度、結合タンパク質とのタンパク質の相互作用、及びリン
酸化のような翻訳後修飾によって影響されるため、タンパク質発現の変化はずっ
とより複雑である。かくして、タンパク質発現の変化（翻訳後修飾を含む）は、
インスリン非依存性糖尿病を含むインスリン抵抗性疾患の発症の基礎をなす。こ
れらのタンパク質発現の同じ変化は、ヒト及びネコやイヌといったペットの動物
におけるインスリン非依存性糖尿病を含むインスリン抵抗性疾患の原因となるよ
うである。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
インスリン抵抗性の分子的基礎の同定のためのより予測的な方法を見出し、そ
れによってが上記疾患を治療するための試薬を同定するために使用できる分子標
的を規定することが課題である。上記利用可能な治療上のツールから、インスリ
ン抵抗性疾患、特にインスリン非依存性糖尿病のひどさ及び罹患を与えるインス
リン抵抗性疾患を有するいずれかの患者のための最も適切な治療を同定すること
も課題であり、正常なまたはインスリン非抵抗性患者のレベルに、インスリン抵
抗性疾患を有する患者における、上記疾患の原因となるタンパク質の発現レベル
または活性を変化させることは、上記疾患を治療する手段を表すため、上記タン
パク質の系統的な同定のための大きな必要性が存在する。さらに、インスリン抵
抗性状態の全体には複数の原因が存在するため、上記方法体系は、インスリン抵
抗性疾患に罹患しているいずれかの患者を治療するための最も適切で最も有効で
あると介される治療を形成する可能性を与えるであろう。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
広い意味で本発明は、インスリン非依存性糖尿病を、これに制限されることな
く含むランゲルハンス島及びβ細胞機能不全の治療のための方法及び組成物に関
する。特に本発明は、正常な動物における発現に対する、膵臓β細胞機能不全を
示す動物の膵臓β細胞またはランゲルハンス島において特異的に発現されるタン
パク質を同定し且つ記載し、さらに膵臓β細胞重量または機能の改変と関連する
操作に応答して特異的に発現されるタンパク質を同定する。上記特異的に発現さ
れるタンパク質（ＤＥＰ）は、「標的タンパク質」及び／またはフィンガープリ
ントタンパク質を表しても良い。さらに本発明は、ランゲルハンス島及び／また
はβ細胞機能の調節に関与するタンパク質と同語作用する能力を介するパスウェ
イタンパク質と称されるタンパク質を同定し且つ記載する。パスウェイタンパク
質は、標的タンパク質及び／またはフィンガープリントタンパク質の特徴を示し
ても良い。
【００２１】 従って第一の特徴点として、本発明は、以下の工程： (a)少なくとも一つのタンパク質が、特異的なレベルのランゲルハンス島または
β細胞機能を有する患者から得た関連組織、または上記患者の代表的な関連組織
において特異的に発現されるというパラダイムを確立する工程； (b)スクリーニングされる試薬で治療された、減少したランゲルハンス島または
β細胞機能を有する患者から得た関連組織、または上記患者の代表的な関連組織
のサンプルを得る工程； (c)治療された患者から得た組織、または上記患者の代表的な組織における特異
的に発現されたタンパク質の存在、不存在、または発現の度合いを測定する工程
；並びに (d)治療された減少したランゲルハンス島またはβ細胞機能を有する患者におけ
る特異的に発現されたタンパク質の発現、活性または量を変化させる程度に従っ
て、上記試薬を選択または拒絶する工程； を含む、ランゲルハンス島またはβ細胞機能不全によって特徴付けされる疾患の
治療における有用性を決定するための試薬のスクリーニング方法を提供する。
【００２２】 上記パラダイムは、特異的に発現される少なくとも一つのタンパク質を確立す
ることを含んでも良い。しかしながらいくつかの実施態様においては、上記パラ
ダイムは、少なくとも２，３，４，５，６，７，８，９，１０または２０の特異
的に発現されるタンパク質を使用しても良い。
【００２３】 典型的に、より正常なランゲルハンス島またはβ細胞機能を有する患者の発現
に向けて、特異的に発現されるタンパク質の発現を変化する場合に、試薬が選択
される。
【００２４】 さらなる特徴点として本発明は、以下の工程： (a)少なくとも一つのタンパク質が、特異的なレベルのランゲルハンス島または
β細胞機能不全を有する患者から得た関連組織、または上記患者の代表的な関連
組織において特異的に発現されるというパラダイムを確立する工程； (b)特にランゲルハンス島または膵臓β細胞といった組織において、特異的に発
現されるタンパク質を同定する工程；並びに (c)例えばランゲルハンス島またはβ細胞機能不全の治療における使用のための
、ランゲルハンス島またはβ疾患状態における特異的に発現されるタンパク質の
一つ以上の発現及び／または活性及び／または量を、正常な状態に変換する試薬
を選択する工程； を含む、ランゲルハンス島または膵臓β細胞疾患の治療における使用のための試
薬の同定のための方法を提供する。
【００２５】 さらなる特徴点として本発明は、上記方法を使用して試薬を同定する工程と、
上記試薬を製造する工程、及び製薬組成物を提供するために許容可能な担体とそ
れを製剤化する工程を含む、製薬組成物を作製する方法を提供する。
【００２６】 さらなる特徴点として本発明は、ランゲルハンス島またはβ細胞機能不全によ
って特徴づけられる疾患の治療のための医薬の調製のための、上記方法によって
同定された試薬の使用を提供する。これらの疾患は、インスリン非依存性糖尿病
（２型糖尿病）、Ｘ症候群またはインスリン抵抗性症候群または妊娠期間の糖尿
病を含む。
【００２７】 さらなる特徴点として本発明は、上記方法によって同定された上記試薬の治療
上または予防上の有効量を投与することを含む、患者においてランゲルハンス島
または膵臓β細胞機能不全によって特徴づけられる疾患を治療する方法を提供す
る。
【００２８】 さらなる特徴点として本発明は、以下の工程： (a)少なくとも一つのタンパク質が、特異的なレベルのランゲルハンス島または
β細胞機能を有する患者から得た関連組織、または上記患者の代表的な関連組織
において特異的に発現するというパラダイムを確立する工程； (b)上記患者から上記組織のサンプルを得る工程；並びに (c)上記サンプルにおける特異的に発現するタンパク質の存在、不存在または発
現の度合いを測定する工程；並びに (d)上記測定値と臨床上の情報の間の従前の相関関係を参考にして、ランゲルハ
ンス島またはβ細胞機能の性質または度合いについて測定値を関連させる工程；
を含む、ヒトまたは動物患者におけるランゲルハンス島またはβ細胞機能不全の
性質または度合いを測定する方法を提供する。
【００２９】 簡便には、上記方法で使用される患者のサンプルは、組織サンプルまたは体液
サンプルまたは尿であっても良い。この方法は、患者のランゲルハンス島または
β細胞機能不全のタイプを、当該技術分野で入手可能な予防上または治療上の治
療についての各種のタイプと相関させ、それによって治療に対する患者の応答の
可能性を増大することを許容する。
【００３０】 さらなる特徴点として本発明は、糖尿病予備患者におけるインスリン非依存性
糖尿病の罹患を予防するための、ランゲルハンス島またはβ細胞機能不全状態に
おいて特異的に発現される一つ以上のタンパク質の発現を、正常な状態において
見出されるものに戻すであろう試薬の使用による治療の方法を提供する。
【００３１】 さらなる特徴点として本発明は、ランゲルハンス島またはβ細胞機能不全を有
する患者の組織サンプルまたは体液サンプルまたは尿における特異的に発現され
るタンパク質のパターンを使用して、ランゲルハンス島またはβ細胞機能不全状
態を緩和し上記治療の成功をモニターする最も適切で有効な治療を予測する方法
を提供する。
【００３２】 さらなる特徴点として、本発明は、以下の工程： (a)3mm×180mmのアクリルアミドポリマーの非直線状固定化pH勾配（IPG)断片を
準備する工程； (b)尿素(8M)、3-[(コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホナ
ート（CHAPS、2%w/v）、ジチオエリスリトール（DTE、10mM）、pH3.5から10の酸
及び塩基の混合物(2%w/v)、及び微量のBromophenol Blueの水溶液を25ml含むカ
セットに、上記IPG断片を再水和する工程； (c)上記カセットから液体を除き、湿った電極芯、電極、及びサンプルカップを
備えた電気泳動トレーに上記断片を移し、上記断片とカップを低粘度のパラフィ
ン油で覆う工程； (d)上記IPG断片の陰極末端で、サンプルカップに、尿素(8M)、CHAPS(4%w/v)、Tr
is(40mM)、DTE(65mM)、SDS(0.05%w/v)、及び微量のBromophenol Blue中で、関連
生体組織の乾燥粉末化し材料の水溶液の２００マイクログラムを適用する工程； (e)３時間で300から3500Vまで直線状に増加させ、その後さらに３時間3500Vとし
、その後pI依存性最終地点に上記断片中で上記タンパク質が移動するのに十分な
時間5000Vとした電圧で、ゲル上で等電点電気泳動を実施する工程； (f)Tris-HCl(50mM)pH6.8、尿素(6M)、グリセロール(30%v/v)、SDS(2%w/v)及びDT
E(2%w/v)を含む100mlの水溶液で１２分間、トレー内で上記断片を平衡化する工
程； (g)５分間この溶液を、Tris-HCl(50mM)pH6.8、尿素(6M)、グリセロール(30%v/v)
、SDS(2%w/v)、ヨードアセタミド(2.5%w/v)、及び微量のBromophenol Blueを含
む100mlの水溶液によって置換する工程； (h)リーディングバッファーとして、Tris-HCl(0.375M)pH8.8中のTEMED(0.5%w/v)
、過硫酸アンモニウム(0.1%w/v)、及びチオ硫酸ナトリウム(5mM)の存在下で重合
した、アクリルアミド／ピペラジン−ジアクリリル架橋剤(9-16%T/2.6%C)の160
×200×1.5mmの縦勾配スラブゲルを準備する工程； (i)約２時間sec-ブタノールで上記ゲルを浸し、この液を除去し、それを水と置
換する工程； (j)陽極末端から6mmと陰極末端から14mmを除去して、二次元電気泳動のために適
したサイズにIPGゲル断片を切断する工程；並びに (k)リーディングバッファーとして、アガロース(0.5%w/v)及びTris-グリシン-SD
S(25mM-198mM-0.1%w/v)の水溶液でスラブゲルを浸し、７０℃に加熱し、この浸
した溶液を通じてスラブゲル上に上記IPGゲル断片を乗せる工程； (l)8-12℃で５時間40mAの一定電流で、二次元電気泳動を実施する工程；並びに (m)ゲルを洗浄する工程； を含む、特異的なレベルのランゲルハンス島またはβ細胞機能不全を有する患者
から得た関連組織、または上記患者の代表的な関連組織において特異的に発現さ
れるタンパク質で、上述の組織またはそのタンパク質含有抽出物で実施される二
次元ゲル電気泳動によって入手可能であるタンパク質を提供する。
【００３３】 ここに記載され、ランゲルハンス島またはβ細胞から由来するサンプル中に見
出される特異的に発現されるタンパク質の例は、POM1, POM2, POM3, POM4, POM6
, POM6, POM7, POM8, POM9, POM10, POM11, POM12, POM13, POMT1, POMT2, POMT
3, POMT4, POMT5, POMT5, POMT11, POMT12, POMT13, PSEM14及びPSEM15を含む。
【００３４】 別法として、フィンガープリントタンパク質が、ランゲルハンス島及び／また
はβ細胞機能不全の治療のために有用な化合物を同定する方法において使用され
ても良い。ここで使用される「標的タンパク質」は、当該タンパク質の発現の調
節が、インスリン非依存性糖尿病を制限することなく含むランゲルハンス島及び
／またはβ細胞疾患を予防または緩和するように機能する、ランゲルハンス島及
び／またはβ細胞機能に関与する特異的に発現されるタンパク質を指す。
【００３５】 本発明は、二次元電気泳動によるタンパク質の感度検出に結びついた、ランゲ
ルハンス島及び／またはβ細胞構造及び機能、並びにインスリン非依存性糖尿病
の実験的パラダイムの調節に関与する系統的研究ストラテジーに部分的に基づく
。特異的に発現されるタンパク質の同定を補助するために、Genomic Solutions
社から入手可能なもののようなタンパク質のスタンダードマーカのセットを、二
次元電気泳動の前にタンパク質の挿入口に加えても良い。
【００３６】 本発明はさらに、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞重量、並びにランゲル
ハンス島及び／またはβ細胞機能、並びに膵臓インスリン分泌の調節に関連する
工程に関与するタンパク質の発現を調節する化合物の同定のための方法を提供す
る。またさらに本発明は、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞機能不全に罹患
しやすい患者、または上記疾患を示している患者に対して、上記化合物を投与す
ることを含む、インスリン非依存性糖尿病の予防及び／または治療のための方法
を記載する。これらの患者は、インスリン非依存性糖尿病を有するヒト及び動物
を制限することなく含む。これらの患者はまた、低出生体重及び低膵臓β細胞重
量を有する子孫を産む危険を有する、妊娠したヒトまたは動物を含む。
【００３７】 さらに本発明は、各種のランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患の予後及び
診断評価のための方法、並びに上記疾患に対する素因を示す患者の同定のための
方法を記載する。
【００３８】 以下に示される例は、減少したランゲルハンス島及び／またはβ細胞重量に関
連する標的タンパク質、並びにランゲルハンス島及び／またはβ細胞機能不全と
関連するタンパク質を同定するための、本発明の実験的パラダイムの成功した使
用を示す。
【００３９】 定義： ここで使用される「特異的な発現」は、組織タンパク質発現における少なくと
も一つの認識可能な差異を指す。それは、組織タンパク質発現における量的に測
定可能な差異、半量的に見積もり可能な差異、または質的に検出可能な差異であ
っても良い。かくして、特異的に発現されるタンパク質（ここでDEPと称する）
は、正常な状態における組織で強力に発現され、ランゲルハンス島またはβ細胞
機能不全状態の組織においてあまり強力に発現されない若しくは全く発現されな
いものでも良い。逆にそれは、疾患状態における組織において強力に発現され、
正常な状態においてあまり強力に発現されない若しくは全く発現されないもので
も良い。同様に特異的な発現は、非治療組織と治療組織の間の比較において各方
向で見出される。さらに発現は、上記タンパク質が比較の元で二つの状態の間で
認識可能な変化を受けているのであれば、特異的として考慮されても良い。
【００４０】 用語、「パラダイム」は、プロトタイプの例、試験モデル、またはスタンダー
ドを意味する。
【００４１】 特異的な発現タンパク質がスクリーニング方法において使用される場合はいつ
でも、タンパク質の特異的な発現性が事前に測定されるパラダイムを確立する予
備工程を、過去のある時点でなされている必要がある。一度パラダイムが確立さ
れたならば、スクリーニング方法が実施される全ての場合で再確立される必要は
ない。従って用語、「パラダイムの確立」が、構築されなければならない。
【００４２】 「ランゲルハンス島またはβ細胞機能不全」は、これらの細胞タイプの重量が
患者において減少する状態、及び／または上記細胞が正常な細胞と比較して、例
えばインスリンの生産において減少した機能を有する状態を含む。ランゲルハン
ス島またはβ細胞機能不全によって特徴付けされる状態は、インスリン非依存性
糖尿病または２型糖尿病、Ｘ症候群またはインスリン抵抗性症候群または妊娠期
の糖尿病を含む。
【００４３】 「関連組織」は、体内のインスリンの作用に応答する生物学的変化を受けるい
ずれかの組織、またはこの変化によって影響される全ての他の組織を意味する。
【００４４】 「患者の代表的な組織」は、上述の生物学的変化が、研究室の課題のために刺
激できるいずれかの組織を意味し、例えば一次細胞組織、または関連組織から究
極的に由来する細胞系を含む。
【００４５】 用語、「患者」は、ヒト及び動物の患者を含む。
【００４６】 上記に対して称される治療は、一つ以上の試薬または食物の投与、及び／また
は食餌または運動のような他の因子を含むことができる。
【００４７】 特異的に発現されるタンパク質(DEP)は、「フィンガープリントタンパク質」
、「標的タンパク質」または「パスウェイタンパク質」を含む。
【００４８】 ここで使用される用語、「フィンガープリントタンパク質」はDEPを意味し、
その発現が単独でまたは他のDEPと組み合わされて、ランゲルハンス島またはβ
細胞機能不全に罹患してる疑いのある患者の状態をモニターまたは評価するため
に使用できる。これらのタンパク質は、通常組み合わせて、特に４種以上と組み
合わせて使用され、場合により単独でまたはこの目的のための一つまたは二つの
他のタンパク質と共に使用される可能性を排除しない。上記フィンガープリント
タンパク質は、例えばランゲルハンス島またはβ細胞機能不全の特定のタイプを
診断し、それに対する特別の治療を示唆するために使用できる。
【００４９】 ここで使用される用語、「診断」は、患者における上記疾患の存在、不存在ま
たは可能性に関するいずれかの情報の提供を含む。それはさらに、それと関係す
るまたは関係すると経験的に認識される疾患または症状のタイプまたは分類に関
する情報の提供を含む。
【００５０】 ここで使用される用語、「標的タンパク質」はDEPを意味し、そのレベルまた
は活性が、ランゲルハンス島またはβ細胞機能不全によって特徴づけられる疾患
を緩和するための治療によって調節できる。患者における標的タンパク質のレベ
ルまたは活性の調節は、例えば標的タンパク質、それと相互作用する別のタンパ
ク質若しくは遺伝子、例えば上記タンパク質に対する抗体、上記タンパク質の競
合的なインヒビター、または対応する遺伝子の転写若しくは翻訳のプロセスにお
いて作用する試薬を投与することによって達成されても良い。
【００５１】 ランゲルハンス島またはβ細胞機能不全に関してここで使用される用語、「緩
和」は、一つ以上のその非所望の症状または影響を減少するいずれかの形態を意
味する。患者のランゲルハンス島またはβ細胞機能不全のいずれかの改善は、用
語「緩和」の範囲にある。
【００５２】 別法としてまたは加えて、DEPは、ランゲルハンス島またはβ細胞機能不全の
調節に関与する少なくとも一つの他のタンパク質または遺伝子と相互作用できる
。上記他のタンパク質は、ここで「パスウェイタンパク質」（PP)と称される。
この用語は、DEPと相互作用するタンパク質に適用され、DEP自体には適用されな
いが、パスウェイタンパク質が別のDEPであっても良い。
【００５３】 例として、本発明の実施態様が、添付された図面を参考にしてより詳細に記載
されるであろう。
【００５４】
【発明の実施の形態】
インスリン非依存性糖尿病を制限することなく含む、ランゲルハンス島及び／
またはβ細胞疾患の治療のための方法及び組成物。正常な状態における発現に対
して、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患において特異的に発現される、
及び／またはランゲルハンス島及び／またはβ細胞重量及び／または機能の調節
に関連する操作に応答して特異的に発現される、「標的タンパク質」及び／また
はフィンガープリントタンパク質と称されるタンパク質が記載される。さらに、
ランゲルハンス島及び／またはβ細胞重量及び／または機能の調節に関与するタ
ンパク質と相互作用する、「パスウェイタンパク質」と称されるタンパク質が記
載される。上記フィンガープリント標的及びパスウェイタンパク質の同定のため
の方法もまた記載される。
【００５５】 ランゲルハンス島及び／またはβ細胞重量及び／または機能の調節に関与する
タンパク質の発現を調節する化合物の同定のための方法が、以下に記載される。
さらに、インスリン非依存性糖尿病を制限することなく含む、ランゲルハンス島
及び／またはβ細胞疾患状態の治療のための方法が、以下に記載される。
【００５６】 さらに、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患状態の予後及び診断評価の
ための方法、並びに上記疾患に対する素因を示す患者の同定のための方法が、以
下に記載される。
【００５７】 １．特異的に発現するタンパク質、及びパスウェイタンパク質の同定 一つの実施態様として、本発明は、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患
に関与するタンパク質、及び／またはインスリン非依存性糖尿病に関与するタン
パク質の同定のための方法に関する。上記タンパク質は、正常状態における発現
に対して、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患状態において特異的に発現
されるタンパク質を表しても良い。さらに上記タンパク質は、ランゲルハンス島
及び／またはβ細胞重量を増大し、機能を改変することに関連する操作に応答し
て、特異的に発現されるまたは調節されるタンパク質を表しても良い。上記特異
的に発現されるタンパク質は、「標的」または「フィンガープリント」タンパク
質を表しても良い。上記タンパク質の同定のための方法は、セクション１．１に
記載される。上記特異的に発現されるタンパク質のさらなる特徴付けのための方
法、並びに標的及び／またはフィンガープリントタンパク質としての同定のため
の方法は、以下のセクション１．３に示される。
【００５８】 さらに、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患状態、及び／またはインス
リン非依存性糖尿病に関与するパスウェイタンパク質と称されるタンパク質の同
定のための方法が、ここでセクション１．３に記載される。ここで使用されるパ
スウェイタンパク質は、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患状態に関連す
る他のタンパク質と相互作用する能力を示すタンパク質を指す。パスウェイタン
パク質は特異的に発現されても良く、それ故標的またはフィンガープリントタン
パク質の特徴を有しても良い。
【００５９】 ここで使用される「特異的な発現」は、タンパク質発現における質的並びに量
的な差異の両者を指す。かくして特異的に発現されるタンパク質は、正常な状態
に対してランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患状態において、またはコント
ロール条件に対して実験条件において、質的に活性化された発現または完全に不
活性化された発現を有しても良い。上記質的に調節されたタンパク質は、所定の
組織または細胞タイプ内で発現のパターンを示し、それはコントロールまたはラ
ンゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患患者のいずれかで検出可能であり、両者
で検出可能ではない。別法として上記質的に調節されるタンパク質は、ランゲル
ハンス島の一つ以上の細胞タイプで発現パターンを示し、それはコントロールま
たは実験患者のいずれかにおいて検出可能であり、両者で検出可能ではない。こ
こで使用される「検出可能」は、特異的に展示する2D電気泳動のような方法を使
用して検出可能であるタンパク質発現パターンを指す。
【００６０】 別法として、特異的に発現されるタンパク質は、調節された発現を有する、即
ち、正常な状態に対してランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患状態において
、またはコントロール条件に対して実験条件の下で、質的に増大または減少して
も良い。発現が正常な状態に対してランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患状
態において、またはコントロール条件に対して実験条件の下で異なる度合いは、
2D電気泳動ゲルの銀染色のような標準的な特徴付け方法を介して視覚化するのに
十分大きい必要が存する。特異的な発現を視覚化するための他の上記標準的な特
徴付け方法は、当業者に周知である。これらは、分画の連続的なクロマトグラフ
ィーでの分離及びピークの比較、キャピラリー電気永劫と、マイクロチップを含
むマイクロチャネルネットワークを使用する分離を含む。
【００６１】 クロマトグラフィーでの分離は、Pharmaciaの文献に記載された高速液体クロ
マトグラフィーによって実施でき、上記クロマトグラムは、分離の時間に対して
280nmでの光の吸収のプロットの形態で得られる。次いで不完全に分解されたピ
ークを与える物質が、再びクロマトグラフィー等の方法を受ける。
【００６２】 キャピラリー電気泳動は、多くの文献に記載された方法であり、例えばP/ACE
5000システムを使用してBeckmanによって提供される文献"Total CE Solutions"
において記載されている。この方法は、小さなキャピラリーチューブに含まれる
サンプルを通過する電位を提供することに依存する。上記チューブは、負に荷電
したシリケートガラスのような荷電した表面を有する。反対に荷電したイオン（
この場合正イオン）がその表面に引きつけられ、次いで表面と同じ極性（この場
合陰極）の適切な電極に移動する。サンプルのこの電気浸透フロー(EOF)におい
て、正のイオンが最も早く移動し、次いで非荷電物質、その後負に荷電したイオ
ンが移動する。かくして、タンパク質は、その荷電に従って必須に分離される。
【００６３】 ミクロチャネルネットワークは、キャピラリーと幾分類似して機能し、ポリマ
ー性材料のフォトアブレーションによって形成されることができる。この方法に
おいて、例えばポリエチレンテレフタレートまたはポリカーボネートといった適
切なUV吸収特性を有するポリマー上へのバーストを放射する高エネルギー光パル
スを生産するために、UVレーザーが使用される。投射フォトンは閉ざされた空間
を有する化学結合を切断し、内圧を生じて小さな爆発を起こし、溶けた物質の噴
出を生じ、マイクロチャネルを形成する空間を背後に残す。マイクロチャネル物
質は、キャピラリー電気泳動と同様に、EOFに基づく分離を達成する。それはマ
イクロチップ形態に採用可能であり、各チップは固有のサンプルインジェクター
、分離カラム及び電気化学的検出器を有する：J.S.Rossier等, 1999, Electroph
oresis 20: pages 727-731参照。
【００６４】 特異的に発現されるタンパク質は、標的タンパク質及び／またはフィンガープ
リントタンパク質としてさらに記載されても良い。ここで使用される「フィンガ
ープリントタンパク質」は、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患の予後ま
たは診断評価の一部として、その発現パターンが利用できる特異的に発現される
タンパク質、または別法として、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患状態
の治療に有用な化合物を同定するための方法において使用できるタンパク質を指
す。フィンガープリントタンパク質は、標的タンパク質またはパスウェイタンパ
ク質の特徴を有しても良い。
【００６５】 ここで使用される「標的タンパク質」は、上記タンパク質のレベルまたは活性
の調節が、インスリン非依存性糖尿病を制限することなく含むランゲルハンス島
及び／またはβ細胞疾患に関する罹患を妨げるように機能するような、ランゲル
ハンス島及び／またはβ細胞疾患状態、及び／またはインスリン非依存性糖尿病
に関与する特異的に発現されるタンパク質を指す。標的タンパク質は、フィンガ
ープリントタンパク質またはパスウェイタンパク質の特徴を有しても良い。
【００６６】 １．１特異的に発現されるタンパク質の同定のための方法 ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患状態に関与し、及び／またはインス
リン非依存性糖尿病に関与するタンパク質の同定のために、各種の方法を使用で
きる。セクション１．１．１において、患者の世代に対して利用できるいくつか
の実験的パラダイム、並びに上記タンパク質の同定のために使用できるサンプル
が記載される。パラダイムコントロール及び実験患者から得られた物質は、セク
ション１．１．２において以下に議論されるように、特異的に発現されるタンパ
ク質の配列の存在について特徴付けされても良い。
【００６７】 １．１．１特異的に発現されるタンパク質の同定のためのパラダイム ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患状態に関与する特異的に発現される
タンパク質の同定のために利用可能なパラダイムの中では、正常な状態と、イン
スリン非依存性糖尿病、妊娠期の糖尿病、及び減少したグルコース耐性を制限す
ることなく含むランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患状態との間で、特異的
に発現されるタンパク質を分析するようにデザインされたパラダイムが存する。
【００６８】 上記パラダイムの一つの実施態様として、正常な患者と、ランゲルハンス島及
び／またはβ細胞疾患患者から得たランゲルハンス島組織が比較されるであろう
。上記患者は、インスリン非依存性糖尿病、減少したグルコース耐性、妊娠期の
糖尿病、インスリン非依存性糖尿病に関して第一期を有する患者を、それに制限
されることなく含むであろう。それはまた、正常な患者と妊娠した患者の比較、
または正常な患者と、インスリン抵抗性の存在にもかかわらずランゲルハンス島
及び／またはβ細胞疾患の罹患に抵抗状態の患者の比較を含むであろう。適切な
組織は、血液及びランゲルハンス島を制限することなく含むであろう。
【００６９】 さらなるパラダイムの中には、非インスリン糖尿病患者と、ランゲルハンス島
及び／またはβ細胞機能が食物制限または改変、トログリタゾン及びロシグリタ
ゾンのようなインスリン感作薬、メトフォルミン、運動、及びBRL 35135及び268
30のようなβ3-アドレノセプターアゴニストによって（これらに制限されないが
）改良されている患者の比較が含まれるであろう。
【００７０】 ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患状態に関与する特異的に発現される
タンパク質の同定のために利用されても良いさらなるパラダイムとして、ランゲ
ルハンス島及び／またはβ細胞機能不全の遺伝学的モデル、またはβ細胞重量及
び／またはインスリン非依存性糖尿病の改変に関与するであろうタンパク質を分
析するようにデザインされたパラダイムが挙げられる。従って上記パラダイムは
、「遺伝学的ランゲルハンス島及び／またはβ細胞パラダイム」と称される。マ
ウスの場合、例えば上記パラダイムは、ob/ob、db/db、tubまたはfat遺伝子産物
によって直接または間接のいずれかで調節されるタンパク質を同定しても良い。
ラットの場合、上記パラダイムは、fa遺伝子産物によって直接または間接のいず
れかで調節されるタンパク質を同定しても良い。上記パラダイムは、ob/ob、db/
db及びfa遺伝子産物が糖尿病感受性バックグランドにおいて発現される糖尿病条
件を引き起こす、遺伝学的バックグランドによって調節されるタンパク質を同定
しても良い。
【００７１】 第一、第二、及び第三のタイプのパラダイムの間の本質的な違いは、第一のも
のにおいては如何なる治療体制や薬剤によってもパラダイムが確立されるもので
はないことにあるが、それは、正常な被験者（例えば痩せた対照マウス）が疾患
の被験者と比較されているからであり、一方、第二の場合には、この比較は、疾
患の被験者、未処置の、及び処置済みの被験者(例えば肥満の対照マウス、及び
薬剤での処置を行っておいた肥満のマウス)との間での更なる比較により補充さ
れる。従って、例えば痩せたマウスと肥満のマウスとを使用し、治療用の薬剤と
してロシグリタゾンを使用してパラダイムを確立するに際しては、一度に４つの
実験群で行うことが好都合である。そしてＤＥＰは、以下のようにグループ化す
ることができる。
【００７２】 グループ１（「ＯＭ」）：痩せた対照 対 肥満の対照でＤＥＰを比較。但し
、これはグループ２のＤＥＰではない。
【００７３】 グループ２（ＯＭＴ）：痩せた対照 対 肥満の対照でＤＥＰを比較。ここで
のＤＰＥは、処置済肥満 対 肥満対照の比較におけるＤＥＰであるが、痩せた
対照 対 痩せた処置済のものの比較におけるＤＥＰではない。
【００７４】 グループ３（「ＳＥＭ」）：処置済み肥満 対 肥満対照でＤＥＰを比較。但
し、ここでのＤＥＰは、痩せた処置済のもの 対 痩せた対照での比較における
ＤＥＰではない。
【００７５】 上に例示されるこのような１型、２型、又は３型のそれぞれのパラダイムは、
ロシグリタゾンでの事例の場合には特定の治療と関連していることがわかるであ
ろう。他の薬剤「Ｘ」(既知のもの又はこれらから発見されるもの)を使用して、
パラダイムを確立する場合には、ある程度の差が存在することが予想できるであ
ろう。例えば、「ロシグリタゾン-非感受性の」、グループ１のＤＥＰの中には
、更に薬剤「Ｘ」に対して感受性のものが有るかもしれなく、従って、新たなパ
ラダイムにおいてはグループ２であるかもしれない。更に、このＤＥＰを、痩せ
た処置済みのもの 対 痩せた対照を比較して、大きな差異が全くない場合には
、グループ２に属するであろう。
【００７６】 上記パラダイムの一つの実施態様として、試験患者はob/ob、db/db、tub/tub
またはfat/fat実験マウス、並びにC57BI/6及びC57BI/Ksバックグランドの両者に
対する痩せた同腹子コントロールを含んでも良い。試験患者は、fa/fa及びオス
とメスのZDFラットを含むこともできる。膵臓のサンプルが得られ、ランゲルハ
ンス島が外分泌膵臓を含まずに調製されるであろう。以下に提供される例は、正
常な動物に対してランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患動物において特異的
に発現されるタンパク質を同定する上記遺伝学的パラダイムの使用を示す。
【００７７】 さらなる実施態様として、ob/ob、db/db、tub/tub及び／またはfat/fatマウス
、及び／またはfa/fa及びZDFラット、並びに痩せたコントロール動物が、ランゲ
ルハンス島及び／またはβ細胞機能を改良する薬剤で処理されても良い。上記薬
剤は、チアゾリジンジオン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾンまたはトログリタ
ゾンのようなインスリン感作薬、オキサゾリダジオンJTT501、非チアゾリジンジ
オンPPARガンマアクチベーター、PPARガンマとヘテロダイマーを形成するRXRア
クチベーター、メトフォルミン、及びβ3-アドレノセプターアゴニストを制限す
ることなく含む。
【００７８】 さらなる実施態様として、ob/ob、db/db、tub/tub及び／またはfat/fatマウス
、及び／またはfa/fa及び／またはZDFラット、並びに痩せたコントロールは、イ
ンスリン抵抗性状態を悪化する、またはインスリン感受性を改良するのいずれか
の食餌治療を与えられても良い。例えば、痩せた動物またはインスリン抵抗性の
動物のいずれかに、インスリン抵抗性状態を悪化するための高脂肪の食餌を与え
ることができる。
【００７９】 上記パラダイムの一つの実施態様として、C57BI/6及びC57BI/Ks野生型マウス
が、ヒトのスナックフードより成る高脂肪食餌またはカフェテリアの食餌を与え
られるであろう。C56BI/Ksマウスは、C57BI/6マウスより小さいランゲルハンス
島細胞重量を有する。それ故、インスリン分泌に対する需要が、高脂肪またはカ
フェテリアの食餌を摂取することによってインスリン抵抗性の罹患によって増大
する場合、C57BI/Ksマウスはより悪化することとなる。かくしてこのパラダイム
は、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患状態に対する素因に関連するタン
パク質を選択するために使用できる。上記パラダイムは、薬剤治療パラダイムを
取り込むことによってさらに定義できる。
【００８０】 天然の動物の血統の中には、実験室的食餌類（a laboratory chow or other l
aboratory diets）を与えた場合に、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞機能
不全、または非インスリン依存性糖尿病のいずれも示さないものがある。これら
には砂漠の齧歯類、アフリカトゲネズミや、砂漠に住む各種のネズミが含まれて
いる。
【００８１】 天然の食餌を摂取した動物と、研究室の食餌を摂取した動物の比較は、ランゲ
ルハンス島及び／またはβ細胞疾患に関連するタンパク質の同定を可能にする。
【００８２】 ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患状態に関与する特異的に発現される
タンパク質の同定のために利用可能なさらなるパラダイムは、妊娠したマウスま
たはラットに妊娠期間及び／または授乳期間の間で低タンパク質の食餌（典型的
に６％の脂肪）を与え、一方でコントロール動物に通常のタンパク質含量（典型
的に１５％）を含む食餌を与えるパラダイムを含んでも良い。離乳の後、子孫に
高脂肪の食餌を与えても良い。上記後者の子孫は、インスリン非依存性糖尿病に
罹患する。妊娠期間、離乳期及び／または成人の生活の間で各種の食餌を摂取し
たこれらの各種の動物の間での比較は、インスリン非依存性糖尿病の罹患の素因
を形成する変化を制限することなく含む、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞
機能不全と関連する特異的に発現されるタンパク質の同定を可能にする。
【００８３】 ランゲルハンス島またはβ細胞重量が操作されるシステムを含むパラダイムも
また利用できる。上記パラダイムは、妊娠した動物、並びにランゲルハンス島β
細胞重量の増大、またはβ細胞の増殖を生ずることが周知である薬剤で処理され
た動物を含む。上記薬剤は、プロラクチン、グルカゴン様ペプチド−１及びエク
ステンジン−４を含む。
【００８４】 動物全体の研究に加えて、パラダイムは、単離されたランゲルハンス島または
β細胞を、β細胞増殖を刺激する薬剤とin vitroでインキュベートするシステム
を含む。さらに、上記パラダイムは、Rin m5F、Rin 5F、HIT 15、MIN及びBRINS
細胞のようなβ細胞の増殖をin vitroで開始するシステムを含む。
【００８５】 １．１．２パラダイム材料の分析 特異的に発現されるタンパク質を同定するために、１．１．１で上述のような
パラダイムで利用する患者から得たランゲルハンス島及び／または膵臓β細胞を
得る。通常これは、コラゲナーゼのような酵素で膵臓組織の切断を含むであろう
。膵臓細胞の単離のための方法は当該技術分野で周知であり、例えばFACSソーテ
ィングのような手段によってランゲルハンス島組織から単離されたβ細胞を得る
方法である。さらに、ランゲルハンス島またはβ細胞における特異的に発現され
るタンパク質は、循環中に放出されるであろうため、血液及び体液を分析しても
良い。
【００８６】 ランゲルハンス島全体、β細胞、及び他のランゲルハンス島細胞を使用しても
良く、例えば外分泌組織を含む膵臓全体を使用しても良い。ランゲルハンス島の
サブセルラー分画及び単離された細胞もまた使用しても良い。特に有用なサブセ
ルラー分画は、核タンパク質分画を含む。
【００８７】 １．２パスウェイタンパク質の同定のための方法 パスウェイタンパク質の同定のための方法が、ここに記載される。ここで使用
される「パスウェイタンパク質」は、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患
に関与する特異的に発現されるタンパク質と相互作用する能力、及び／またはイ
ンスリン非依存性糖尿病に関連する特異的に発現されるタンパク質と相互作用す
る能力を示すタンパク質を指す。パスウェイタンパク質は特異的に発現されても
良く、それ故標的及び／またはフィンガープリントタンパク質の特徴を有しても
良い。
【００８８】 タンパク質−タンパク質相互作用を検出するのに適したいずれかの方法が、候
補のタンパク質と、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患状態、及び／また
はインスリン非依存性糖尿病の調節において特異的に発現されることが周知であ
るタンパク質の間の相互作用を同定することによって、パスウェイタンパク質を
同定するために使用されても良い。上記特異的に発現されるタンパク質は、細胞
内または細胞外タンパク質であっても良い、上記特異的に発現されるタンパク質
と相互作用するこのタンパク質は、パスウェイ遺伝子産物を表す。
【００８９】 用いることができる伝統的方法の中には、共免疫沈降、架橋、及び勾配又はク
ロマトグラフカラムを通した共精製がある。これらなどの方法を用いてパスウェ
イタンパク質の同定をすることができる。一度同定されると、パスウェイタンパ
ク質は、その対応するパスウェイ遺伝子を同定するために用いることができる。
例えば、パスウェイ遺伝子産物のアミノ酸配列の少なくとも一部は、エドマン分
解法（例えばCreighton (1983) 'Proteins: Structures and Molecular Princip
les', W.H. Freeman & Co., N.Y., pp.34-49参照)を介するような当業者に周知
の方法を使用して確認されても良い。得られたアミノ酸配列は、パスウェイ遺伝
子配列に対するスクリーニングのために使用できるオリゴヌクレオチド混合物の
生産のためのガイドとして使用されても良い。スクリーニングは、例えば標準的
なハイブリダイゼーションまたはPCR法を伴っても良い。オリゴヌクレオチド混
合物の生産及びスクリーニングのための方法は周知である（例えばAusubel, 上
記参照及びPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (1990) Inni
s, M,等 Academic Press Inc., New York参照）。
【００９０】 インビボの、タンパク質相互作用を検出する１つの方法、２種ハイブリッドシ
ステムが、説明のためのみで制限されることなく詳細に記載されている。このシ
ステムの一つのバージョンが記載されており（Chienら、1991、Proc.Natl.Acad.
Sci.USA,88,9578-9582）、それがClontechから市販されている（Palo Alto,Cali
f.）。
【００９１】 要約すると、上記システムの利用には、２つのハイブリッドタンパク質をコー
ドするプラスミドが構築される。一方のプラスミドは、既知のタンパク質、この
場合ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患状態、及び／またはインスリン非
依存性糖尿病の調節に関与することが周知である特異的に発現されるタンパク質
に融合された、転写アクチベータータンパク質のＤＮＡ結合ドメインより成り、
他方のプラスミドは、未知のタンパク質に融合された、同じ転写アクチベーター
タンパク質のアクチベータードメインより成る。未知のタンパク質は、ｃＤＮＡ
ライブラリーの一部としてこのプラスミド内に組換えられたｃＤＮＡによりコー
ドされる。２つのプラスミドは、その調節領域が転写アクチベーター結合部位を
含むレポーター遺伝子（例えばｌａｃＺ）を含む、酵母Saccharomyces cerevisi
aeの株中に形質転換される。ハイブリッドタンパク質単独は、レポーター遺伝子
の転写を活性化することができない：ＤＮＡ結合ドメインハイブリッドは、活性
化機能を提供しないので、活性化できず、活性化ドメインハイブリッドは、アク
チベーターの結合部位の場所を探し当てられないので、活性化できない。２つの
ハイブリッドタンパク質の相互作用は、機能性転写アクチベータータンパク質を
再構築し、その結果、レポーター遺伝子の発現をもたらす。これは、レポーター
遺伝子産物についてのアッセイにより検出される。
【００９２】 トゥーハイブリッドシステムまたは関連する方法体系は、周知の特異的に発現
される「バイト」タンパク質と相互作用するタンパク質について、活性化ドメイ
ンライブラリーをスクリーニングするために使用されても良い。全体のゲノムま
たはcDNA配列は、活性化ドメイン、例えばGAL-4の活性化ドメインをコードするD
NAに翻訳的に融合される。このライブラリー及びDNA結合ドメインに融合したバ
イトタンパク質産物のハイブリッドをコードするプラスミドを、酵母リポーター
株内に共トランスフォームし、生成したトランスフォーマントを、レポーター遺
伝子を発現するものについてスクリーニングする。制限というよりはむしろ例と
して、バイト遺伝子は、GAL4タンパク質のDNA結合ドメインをコードするDNAに翻
訳的に融合されるように、ベクター中にクローン化できる。これらのクローンを
精製し、レポーター遺伝子発現に関与するライブラリープラスミドを単離する。
次いでライブラリープラスミドによってコードされるタンパク質を同定するため
に、DNA配列決定を使用する。
【００９３】 バイトタンパク質と相互作用するタンパク質が検出される細胞系のcDNAライブ
ラリーが、当該技術分野で通常実施される方法を使用して作製できる。ここに記
載される特定のシステムに従って、例えばcDNA断片が、GAL4の活性化ドメインに
翻訳的に融合されるように、ベクター中に挿入できる。このライブラリーが、GA
L4活性化配列を含むプロモーターによって作用されるlacZ遺伝子を含む酵母株内
に、バイト遺伝子GAL4融合プラスミドと共に共トランスフォームできる。バイト
遺伝子産物と相互作用するGAL4活性化ドメインに融合されたcDNAにコードされた
タンパク質は、活性なGAL4タンパク質を再構成し、それによってlacZ遺伝子の発
現に作用する。lacZを発現するコロニーは、X-galの存在下で青色によって検出
できる。次いでcDMAをこれらの株から精製でき、当該技術分野で通常実施される
方法を使用して、バイト遺伝子相互作用タンパク質を生産し単離するために使用
できる。
【００９４】 タンパク質相互作用は、生体分子結合をモニターするためのBiocore（登録商
標）システムを用いてモニターし、分析することができる。Biocore（登録商標
）技術は、方法進展の迅速な評価とこれらの生体分子の精製について、直接の検
出と生体分子結合のモニターを可能にする。標的の生体分子、例えば特徴的に発
現するタンパク質は、センサーの表面に結合し、試料のアリコートがこの表面に
わたされる。さらなるタンパク質が、センサー表面上の第１のタンパク質に結合
するとき（ヒット）、表面に近いマス濃度の変化がある。この濃度の変化はリア
ルタイムで検出され、標識又はタグを前もって導入することなく、標的タンパク
質への、複合体混合物からのネイティブタンパク質の結合をモニターする機会を
提供する。結合タンパク質は、ついでセンサーチップの表面から除去され、従来
法により精製される（Nordhoffら、Nat.Biotech.17(9):884-888、1999）。Bioco
re（登録商標）技術は、タンパク質相互作用の反応速度論、親和性、特異性につ
いての情報を提供することができる。こうしてBiocore（登録商標）技術を、パ
スウェイタンパク質を検出することができる。
【００９５】 一度パスウェイタンパク質を同定して単離すると、それはさらに、例えばセク
ション１．３で以下に記載されるように特徴付けることができる。
【００９６】 １．３特異的に発現されるタンパク質及びパスウェイタンパク質の特徴付け セクション１．１で上述の方法により同定されるもののような特異的に発現さ
れるタンパク質、セクション１．２で上述の方法により同定されるもののような
パスウェイタンパク質、並びに代替的手段によって同定される遺伝子は、例えば
ここに記載されるものような方法を利用してさらに特徴付けされても良い。上記
タンパク質は、「同定されたタンパク質」としてここで称されるであろう。
【００９７】 ここに記載されるもののような分析は、同定されたタンパク質の生物学的機能
に関する情報を提供する。特異的に発現されるタンパク質の生物学的機能の評価
はさらに、標的及び／またはフィンガープリントタンパク質として称されること
を可能にするであろう。
【００９８】 特に、発現されたタンパク質の調節、または上記タンパク質の活性の調節が、
ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患のいずれかを緩和できることを示すさ
らなる特徴を有する特異的に発現されたタンパク質のいずれかが、セクション１
で上述のように「標的タンパク質」と称されるであろう。以下の議論と共に上記
標的タンパク質は、セクション３で以下に議論される化合物発見ストラテジーの
焦点を構成する。さらに上記標的タンパク質及び／または調節化合物は、ランゲ
ルハンス島及び／またはβ細胞疾患、及び／またはインスリン非依存性糖尿病の
治療及び／または予防の一部として使用できる。
【００９９】 上記調節が、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患に正に影響しないこと
を示す特徴を有するが、例えばランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患と相関
するタンパク質「フィンガープリント」パターンに寄与する発現パターンを有す
る特異的に発現されるタンパク質のいずれかが、「フィンガープリントタンパク
質」と称されるであろう。「フィンガープリントタンパク質」は、セクション７
．１で以下に十分に議論されるであろう。標的タンパク質のそれぞれはフィンガ
ープリントタンパク質としても機能し、全てまたは一部のパスウェイタンパク質
であることができることに注意すべきである。
【０１００】 さらに、パスウェイタンパク質は、ここに記載されるもののような方法に従っ
て特徴付けできることに注意すべきである。特異的に発現され、タンパク質発現
の調節、またはタンパク質発現の調節、またはタンパク質活性の調節が、興味あ
るランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患のいずれかを緩和することを示す情
報を提供するパスウェイタンパク質は、「標的タンパク質」と称されるであろう
。上記標的タンパク質は、以下の議論と共に、セクション３で以下に議論される
化合物発見ストラテジーの焦点を構成し、以下のセクション４に記載される治療
方法の一部として使用できる。
【０１０１】 さらに、パスウェイタンパク質の一つ以上の特徴が特異的発現の欠如を明らか
にするが、上記遺伝子の活性または発現の調節が、言うまでもなくランゲルハン
ス島及び／またはβ細胞疾患の兆候を緩和する証拠であることに注意すべきであ
る。上記の場合、これらの遺伝子及び遺伝子産物は、以下のセクション３の化合
物発見ストラテジーの焦点と考慮されるであろう。
【０１０２】 遺伝子発現または遺伝子産物活性が、興味あるランゲルハンス島及び／または
β細胞疾患に正に影響しないことをパスウェイタンパク質の特徴が示すが、その
発現が特異的に発現し、、例えばランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患状態
と相関する遺伝子発現フィンガープリントパターンに寄与する場合、上記パスウ
ェイ遺伝子は、さらにフィンガープリント遺伝子と称されても良い。
【０１０３】 同定されたタンパク質をさらに特徴付けするために、各種の方法が利用できる
。第一に、同定されたタンパク質の対応するヌクレオチド配列が、当業者に周知
の標準法を使用することによって得られても良く、例えば同定されたタンパク質
の生物学的機能に関する情報を提供する一つ以上の周知の配列モチーフに対する
ホモロジーを明らかにするために使用されても良い。
【０１０４】 第二に、同定されたタンパク質の生物学的機能は、関連するin vivo及びin vi
troシステムを使用することによってより直接的に評価されても良い。in vivoシ
ステムは、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患様の症状を天然で示す動物
システム、または上記症状を示すように操作されている動物システムを制限する
ことなく含んでも良い。さらに上記システムは、ランゲルハンス島及び／または
β細胞疾患、及び／またはインスリン非依存性糖尿病のさらなる特徴付けのため
のシステムを含んでも良く、上述のセクション１．１．１及び以下のセクション
２．２．１に記載されたもののような天然で存在する及びトランスジェニック動
物システムを制限することなく含んでも良い。in vitroシステムは、インスリン
を生産し分泌することが周知の細胞タイプを含む細胞ベースのシステムを制限す
ることなく含む。上記細胞は野生型細胞でも良く、または興味あるランゲルハン
ス島及び／またはβ細胞疾患に寄与することが周知の、または寄与する疑いのあ
る修飾を含む非野生型細胞でも良い。上記システムは、以下のセクション２．２
．２に詳細に記載される。
【０１０５】 同定されたタンパク質の生物学的機能をさらに特徴付けするために、これらの
タンパク質の発現が、in vivo及び／またはin vitroシステムで、即ち例えばト
ランスジェニック動物及び／または細胞系における過剰発現または過小発現のい
ずれかで調節されても良く、その後上記システムに対する効果が評価されても良
い。別法として同定されたタンパク質の活性は、興味あるin vivo及び／またはi
n vitroシステムにおける活性のレベルを増大または減少することのいずれかに
よって調節されても良く、その後効果が評価されても良い。
【０１０６】 上記特徴付けを通じて得られた情報は、興味あるタンパク質を含むランゲルハ
ンス島及び／またはβ細胞疾患の治療のための関連する方法を示唆しても良い。
さらに、興味あるタンパク質を含むインスリン非依存性糖尿病の制御のための関
連する方法が、上記特徴付けから得られた情報によって示唆されても良い。例え
ば治療は、タンパク質発現及び／またはタンパク質活性の調節を含んでも良い。
ここに記載されるような特徴付け方法は、上記調節が興味あるタンパク質の発現
または活性の増大または減少を含むことを示しても良い。上記治療方法は、以下
のセクション４に記載される。
【０１０７】 ２．特異的に発現されるタンパク質及びパスウェイタンパク質 上述のセクション１．１に同定されたような特異的に発現されるタンパク質、
並びに上述のセクション１．２に同定されたもののようなパスウェイタンパク質
を制限することなく含む同定されたタンパク質がここに記載される。特に、上記
同定されたタンパク質のアミノ酸配列が記載される。さらに、同定されたタンパ
ク質に対して生産された抗体、並びに同定されたタンパク質をさらに特徴付けす
るための細胞及び動物ベースのモデルが、このセクションにおいて記載される。
【０１０８】 ２．１特異的に発現されるタンパク質またはパスウェイタンパク質に特異的な抗
体 本発明は、一つ以上の特異的に発現されるタンパク質またはパスウェイタンパ
ク質エピトープを特異的に認識可能な抗体の生産のための方法にも関する。その
ような抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、ヒト化
又はキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）’2断片、Ｆａｂ発現ラ
イブラリーにより生産される断片、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、及び上
記いずれかのエピトープ結合断片を制限することなく含むことができる。そのよ
うな抗体は、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾治療法の一部として用いる
ことができ、及び／又は、フィンガープリント、標的、またはパスウェイ遺伝子
タンパク質の異常なレベル又は上記タンパク質の異常な形態の存在について患者
がテストされることができる診断技術の一部として用いることができる。
【０１０９】 特異的に発現されるタンパク質またはパスウェイタンパク質に対する抗体の生
産のために、種々の宿主動物が、特異的に発現されるタンパク質またはパスウェ
イタンパク質、またはその一部の接種により免疫化されることができる。そのよ
うな宿主動物は、ウサギ、マウス及びラットを制限することなく含む。リソレク
チニン、Pluronicポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、
キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、及びＢＣＧ(bacille
Calmette-Fuerin)及びCorynebacterium parvumなどの潜在的に有用なヒトアジ
ュバントなどの活性基質を含む、宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用い
て、免疫反応を増加させることができる。
【０１１０】 ポリクローナル抗体は、標的タンパク質のような抗原、またはその抗原性機能
的誘導体で免疫化された動物の血清から由来する抗体分子の異種集団である。ポ
リクローナル抗体の生産のために、上述のような宿主動物が、上述のようなアジ
ュバントを補った特異的に発現されるタンパク質またはパスウェイタンパク質で
の注射によって免役化されても良い。
【０１１１】 モノクローナル抗体は、特定の抗原に対する抗体の均質な集団であり、培養で
連続的セルラインにより抗体分子の生産を提供するいかなる技術でも、得ること
ができる。これらは、Kohler及びMilstein、1975、Nature、256、495-497;及び
米国特許第４，３７６，１１０号、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術（Kosborら
、1983、Immunology Today 4:72;Coleら、1983、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80;20
26-2030）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Coleら,"Monoclonal Antibodies a
nd Cancer Therapy",Alan R. Liss Inc.,pp-77-96）のハイブリドーマ技術を制
限することなく含む。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、Ｉ
ｇＤ及びそれらのサブクラスを含むいかなる免疫グロブリンクラスでも良い。本
発明のｍＡｂを生産するハイブリドーマは、インビトロでもインビボでも培養す
ることができる。in vivoでのｍＡｂの高い力価の生産は、これを生産の現在好
ましい方法とする。
【０１１２】 さらに、適当な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子を、適当な生物活性
のヒト抗体分子からの遺伝子と共にスプライシングすることにより、キメラ抗体
の生産のために開発された技術（Morrisonら、1984,Proc.Natl.Acad.Sci.81:685
1-6855;Neubergerら、1984,Nature 312:604-608;Takedaら、1985,Nature 314:45
2-454）も用いることができる。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物の種か
ら由来する分子であり、例えばネズミｍＡｂから由来する可変領域とヒト免疫グ
ロブリン定常領域を有する。
【０１１３】 あるいは、一本鎖抗体の生産のために記載された技術は（米国特許第４，９４
６，７７８号；Bird,1988,Science 242:423-426;Hustonら、1988,Proc.Natl.Aca
d.sci.USA 85:5879-5883;及びWardら、1989,Nature 334:544-546）、特異的に発
現されるタンパク質またはパスウェイタンパク質一本鎖抗体を生産するために、
適合させることができる。一本鎖抗体は、アミノ酸橋を介してＦｖ領域の重鎖断
片と軽鎖断片を連結させることにより形成されて、一本鎖ポリペプチドとなる。
【０１１４】 抗体断片は、特異的エピトープを認識するものであるが、既知の技術により生
成されることができる。例えば、そのような断片は、抗体分子のペプシン消化に
より生産されるＦ（ａｂ’）2断片と、Ｆ（ａｂ’）2断片のジスルフィド橋を還
元することにより生成されるＦａｂ断片を制限することなく含む。あるいは、Ｆ
ａｂ発現ライブラリーは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅
速容易な同定を可能にするために構築されることができる（Huseら、1989, Scie
nce 246:1275-1281）。
【０１１５】 ２．２細胞及び動物ベースのモデルシステム ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患のためのモデルとして機能する、細
胞及び動物ベースのシステムがここに記載される。これらのシステムは、各種の
応用で使用されても良い。例えば動物ベースのモデルシステムは、上述のセクシ
ョン１．１．１に記載されたパラダイムの一つによって特異的に発現されるタン
パク質を同定するために使用できる。細胞及び動物ベースのモデルシステムは、
上述のセクション１．３に記載されたように、特異的に発現されるタンパク質及
びパスウェイタンパク質をさらに特徴付けするために使用されても良い。上記さ
らなる特徴付けは、例えば特異的に発現されるタンパク質が標的タンパク質であ
ることを示しても良い。第二に上記アッセイは、以下に記載されるランゲルハン
ス島及び／またはβ細胞疾患の症状を改善可能である化合物を同定するようにデ
ザインされたスクリーニングストラテジーの一部として使用されても良い。かく
して動物及び細胞ベースのモデルは、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患
の治療において有効である薬剤、医薬、治療薬及び介入を同定するために使用さ
れても良い。さらに以下のセクション６に記載されるように、上記動物モデルは
、動物患者におけるＬＤ50及びＥＤ50を測定するために使用されても良く、上記
データは、インスリン非依存性糖尿病の治療を含む、潜在的なランゲルハンス島
及び／またはβ細胞疾患の治療のin vivoの効力を測定するために使用できる。
【０１１６】 ２．２．１動物ベースのシステム ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患の動物をベースとしたモデルシステ
ムは、以下に限定されないが、非組換えおよび操作されたトランスジェニック動
物を含んでも良い。
【０１１７】 ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患の非組換え動物モデルは、例えば、
遺伝モデルを含むことができる。かかる遺伝学的ランゲルハンス島及び／または
β細胞モデルは、例えば、非インスリン依存性糖尿病および／または肥満のマウ
スモデル、例えば常染色体性劣性ｏｂ、ｄｂまたはｔｕｂアレルに関してホモ接
合体のマウスを含むことができる。それはまた、ＺＤＦラットのようなラットモ
デルを含むことができる。
【０１１８】 ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患の非組換え、非遺伝動物モデルは、
例えば、大量の脂肪を含む食餌を常食としたラットまたはマウスを含むことがで
きる。かかる食餌は、脂肪含量（発熱量による）が５０％以上の合成餌とするこ
とができる。あるいは、サラミやバターのような高脂肪含量の人用の食餌を動物
に与えてもよい。このモデルは、低タンパク質の食餌を摂取した妊娠したメスか
ら生まれた低出生体重の子供を利用するのであれば、特に有用である。
【０１１９】 さらに、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患様症状を示す動物モデルは
、例えば、当業者に周知のトランスジェニック動物を産生するための技術に関連
して、セクション２で上記のような標的タンパクの遺伝子配列利用することによ
って操作されてもよい。例えば、標的タンパクの遺伝子配列を、関心の向けられ
た動物のゲノムに導入し過剰発現させるか、あるいは、標的タンパクの内因性遺
伝子配列が存在するのであれば、それらを過剰発現するか、または妨げて、標的
タンパクの遺伝子発現を低発現または不活性化させてもよい。
【０１２０】 標的タンパクの標的遺伝子配列を過剰発現するために、標的遺伝子配列のコー
ド部位を、制御配列にリゲートしてもよく、これは、興味のある細胞タイプおよ
び動物における遺伝子発現を操作することができる。かかる制御領域は、当業者
に周知であり、過度の実験をすることなく利用できる。
【０１２１】 標的タンパクの内因性遺伝子配列の低発現に関しては、その遺伝子配列を単離
し、かつ、興味の向けられた動物のゲノムに再導入された際に、その標的タンパ
クの内因性遺伝子アレルが不活性化されるように操作する。好ましくは、標的タ
ンパクの操作された遺伝子配列は、その操作された標的遺伝子配列の、動物のゲ
ノムへの組み込みの際に、その内因性配列が妨げられるような遺伝子ターゲッテ
ィングを用いて導入される。
【０１２２】 以下に限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ミニブ
タ、ヤギ、およびヒト以外の霊長類、例えばヒヒ、リス、サルおよびチンパンジ
ーを含むあらゆる種の動物を用いて、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患
動物モデル作製してもよい。
【０１２３】 当該技術分野で公知のあらゆる技術を用いて、標的タンパクの標的遺伝子トラ
ンスジーンを動物に導入して、トランスジェニック動物の創始者系統(founder l
ine)を生じることができる。かかる技術は、以下に限定されないが、前核マイク
ロインジェクション(Hoppe,P.C.とWagner,T.E.,1989,US Pat.No.4,873,191)；生
殖細胞系へのレトロウイルス介在性遺伝子輸送（Van der Puttenら,1985,Proc.N
at.,Acad.Sci.,USA 82:6148-6152）；胚幹細胞における遺伝子ターゲッティング
（Thompsonら,1989,Cell 56:313-321）；胚のエレクトロポレーション（Lo,1983
, Mol.Cell Biol.3:1803-1814）；および、精子媒介性遺伝子輸送（Lavitranoら
,1989,Cell 57:717-723）等を含む。かかる技術のレビューについては、Gordon,
1989,Transgenic Animalsm Intl.Rev.Cytol.115:171-229を参照。
【０１２４】 本発明は、その全ての細胞にトランスジーンを有するトランスジェニック動物
、並びに、その全ての細胞ではないがその一部にトランスジーンを有する動物、
すなわちモザイク動物を提供する（例えば、Jakobovits,1994,Curr.Biol.4:761-
763に記載された技術を参照）。トランスジーンは、単一のトランスジーンとし
て、あるいはコンカテマーとして、例えば、ヘッド−ヘッドタンデムまたはヘッ
ド−テイルタンデムに組み込まれてもよい。このトランスジーンは、例えば、La
skoら(Lasko,M.ら,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6232-6236)の教示に従って
、特定の細胞タイプに選択的に導入および活性化されてもよい。かかる細胞タイ
プ特異的活性化に必要な制御配列は、関心の向けられた特定の細胞タイプに依存
し、当業者に自明である。
【０１２５】 標的遺伝子トランスジーンが内因性標的遺伝子の染色体部位に組み込まれるこ
とを望むのであれば、遺伝子ターゲッティングが好ましい。要約すると、かかる
技術を利用する場合には、興味の向けられた内因性標的タンパクの遺伝子に相同
なヌクレオチド配列を含むベクターを、染色体配列との相同的組換えを介して、
内因性標的遺伝子のヌクレオチド配列に組み込みかつその機能を妨げるように設
計する。トランスジーンは、例えばGuらの教示(Gu, H.ら,1994,Science 265:103
-106)に従って、特定の細胞タイプに選択的に導入されて、その細胞タイプのみ
において興味の向けられた内因性遺伝子を不活性化することもできる。かかる細
胞型特異的不活性化に必要な制御配列は、関心の向けられた特定の細胞タイプに
依存し、当業者に自明である。
【０１２６】 トランスジェニック動物が発生したところで、組換え標的遺伝子及びタンパク
質の発現を、定法を用いて検定する。最初のスクリーニングは、サザンブロット
分析またはＰＣＲ技術によって達成してもよく、動物組織を分析して導入遺伝子
の組込が起こったか否かを評価する。トランスジェニック動物の組織中における
導入遺伝子のｍＲＮＡ発現のレベルもまた、これらに限定されるものではないが
、動物から得た組織サンプルのノーザンブロット分析、原位置ハイブリダイゼー
ション分析、及びＲＴ−ＰＣＲを含む技術を利用して評価してもよい。標的タン
パク質発現組織のサンプルもまた、問題とされる導入遺伝子に特異的な抗体を使
用して免疫細胞学的に評価してもよい。
【０１２７】 標的遺伝子ｍＲＮＡまたは標的タンパク質導入遺伝子ペプチド（標的タンパク
質エピトープに対して抗体を使用して免疫細胞学的に検出）を容易に検出可能な
レベルで発現する標的タンパク質トランスジェニック動物は、特徴的なランゲル
ハンス島及び／またはβ細胞疾患様症状を呈する動物を識別するために、更に評
価すべきである。こうした症状には、例えば、肥満、グルコース不耐性、高イン
スリン血症、糖尿病及び／または非インスリン依存性糖尿病が含まれる。更にま
た、トランスジェニック動物内における特定の細胞型を分析し、ランゲルハンス
島及び／またはβ細胞疾患の細胞表現型の特徴について検定してもよい。さらに
、こうした細胞表現型は、特定の細胞タイプのフィンガープリントタンパク質の
発現パターンの評価、並びにランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患を示す動
物における特定の細胞タイプの周知のフィンガープリント発現プロフィールに対
する比較を含んでも良い。こうしたトランスジェニック動物は、ランゲルハンス
島及び／またはβ細胞疾患の適当なモデルとして役立つ。
【０１２８】 標的タンパク質トランスジェニック始祖動物（すなわち、問題とされる細胞ま
たは組織中において標的タンパク質を発現し、更に好ましくはランゲルハンス島
及び／またはβ細胞疾患の症状を呈する動物）が産生されたところで、これらを
交配、同系交配、異系交配、または異種交配して特定動物のコロニーを産生させ
る。こうした交配戦略の例には、これらに限定されるものではないが、一つ以上
の組込部位を有する始祖動物の異系交配をして別々の系を構築すること；別々の
系を同系交配して、各標的遺伝子導入遺伝子の付加的発現の効果によって問題と
される標的タンパク質をより高レベルでトランスジェニックとして発現する化合
物標的タンパク質トランスジェニックを産生すること；異型接合の動物を交配し
て所定の組込部位について同型接合の動物を産生し、これによって発現を増大さ
せると共にＤＮＡ分析による動物のスクリーニングが必要となる可能性を消失さ
せること；別々の同型接合の系を交配して異型接合の化合物または同型接合の系
を産生すること；動物を様々な同系交配遺伝的バックグラウンドに品種改良して
、標的タンパク質の発現及びランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患様症状の
進展に対する対立遺伝子変更の効果を試験できるようにすることが含まれる。こ
うしたアプローチの一つは、標的タンパク質トランスジェニック始祖動物を野生
型株と交配して、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患様症状、例えばグル
コース不耐性、高インスリン血症、非インスリン依存性糖尿病、及び肥満等を呈
するＦ１世代を産生することである。該Ｆ１世代は、その後同系交配され、同型
接合の標的タンパク質トランスジェニック動物が生存可能な場合には同型接合の
系を発生する。
【０１２９】 ２．２．２細胞ベースのアッセイ さらなる実施態様では、標的タンパクをコードする標的遺伝子配列を含みかつ
発現し、そしてさらに、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患に関連する細
胞表現形を示す細胞を、インスリン抵抗性疾患の症状を改善する能力を示す化合
物を同定するために利用することができる。細胞表現形は、ランゲルハンス島及
び／またはβ細胞疾患を改善する能力を示すことができ、例えば、グルコースま
たはグリセルアルデヒド刺激に応答する異常なインスリン放出を含む。
【０１３０】 さらに、興味ある細胞のタンパク質発現のフィンガープリントパターンを分析
して、正常なフィンガープリントパターンと比較しても良い。興味ある細胞につ
いて正常なフィンガープリントパターンに非常に類似するフィンガープリントパ
ターンを生産することを、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患様の細胞表
現型を示す細胞に引き起こす化合物が、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾
患の症状を緩和する能力についてのさらなる試験の候補と考慮されても良い。
【０１３１】 上記のアッセイで使用可能な細胞は、例えばRin m5F, Rin 5F, Hit 15及びBRI
NSインスリノーマ細胞系のような非組換え細胞系を含んでも良い。
【０１３２】 さらに、かかるアッセイに用いられる細胞系統は、組換え、トランスジェニッ
ク細胞系統を含むことができる。例えば、セクション２．２．１で上記の本発明
にかかるランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患動物モデルは、ランゲルハン
ス島及び／またはβ細胞疾患に関連する一以上の細胞タイプを含む細胞系統を生
じるために用いられ、これはこの疾患の細胞培養モデルとして使用することがで
きる。本発明のランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患トランスジェニック動
物から誘導された一次培養物を利用できるが、連続した細胞系統の世代が好まし
い。トランスジェニック動物に由来する連続した細胞系統を誘導するために使用
される技術の例として、Smallら, 1985,Mol.Cell Biol.5:642-648を参照。
【０１３３】 あるいは、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患に関与することが知られ
ているタイプの細胞を、細胞内の標的タンパクの量を増加または減少させること
ができる配列を用いてトランスフェクションしてもよい。例えば、標的タンパク
の遺伝子配列を、関心の向けられた細胞のゲノムに導入し過剰発現させるか、あ
るいは、標的タンパクの内因性遺伝子配列が存在するのであれば、それらを過剰
発現するか、または妨げて、標的タンパク発現を低発現または不活性化させても
よい。
【０１３４】 標的タンパクの遺伝子配列を過剰発現するために、標的遺伝子配列のコード部
位を、制御配列にリゲートしてもよく、これは、興味のある細胞タイプにおける
遺伝子発現を操作することができる。かかる制御領域は、当業者に周知であり、
過度の実験をすることなく利用できる。
【０１３５】 内因性標的タンパクの低発現に関しては、その遺伝子配列を単離し、かつ、興
味の向けられた細胞タイプのゲノムに再導入された際に、その内因性標的遺伝子
アレルが不活性化されるように操作する。好ましくは、操作された標的遺伝子配
列は、その操作された標的遺伝子配列の、細胞のゲノムへの組み込みの際に、そ
の内因性標的配列が妨げられるような遺伝子ターゲッティングを用いて導入され
る。遺伝子ターゲッティングは、セクション２．２．１で上述される。
【０１３６】 標的タンパク遺伝子配列核酸のトランスフェクションを、標準的な技術を用い
て行うことができる。例えば、Ausebel, 1989上記を参照。トランスフェクショ
ンされた細胞は、組換え標的遺伝子配列の存在、標的遺伝子ｍＲＮＡの発現およ
び蓄積、および組換え標的タンパク産生物の存在について調べるべきである。標
的タンパク発現の低減が望ましい場合には、標準的な技術を用いて、内因性標的
遺伝子発現および／または標的タンパク産生の低減が達成されたか否かを調べる
ことができる。
【０１３７】 ３．標的タンパク質と相互作用する化合物についてのスクリーニングアッセイ 以下のアッセイは、標的タンパク質に結合する化合物、標的タンパク質と相互
作用する他の細胞タンパク質に結合する化合物、及び標的タンパク質と他の細胞
タンパク質の相互作用を妨げる化合物を同定するためにデザインされる。上記化
合物は、他の細胞タンパク質を制限することなく含んでも良い。上記細胞タンパ
ク質の同定のための方法は、セクション３．２で以下に記載される。
【０１３８】 化合物は、例えば標的タンパク質膜貫通レセプターの細胞外ドメインを含むＩ
ｇテール化融合ペプチド、Ｄ及び／またはＬ型アミノ酸より成るランダムペプチ
ドライブラリーのメンバー（例えばLam, K.S.等, 1991, Nature 354: 82-84; Ho
ughten, R.等, 1991, Nature 354: 84-86参照）、ホスホペプチド（ランダムな
または部分的に縮重した配向性ホスホペプチドライブラリーのメンバーを制限す
ることなく含む：例えばSongyang, Z.等, 1993, Cell 72: 767-778参照）、抗体
（ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラまたは
一本鎖抗体、並びにＦＡｂ、Ｆ（ａｂ’）2及びＦＡｂ発現ライブラリー断片、
並びにそれらのエピトープ結合断片）を制限することなく含む可溶性ペプチドと
いったペプチド、並びに小さな有機または無機分子を制限することなく含んでも
良い。
【０１３９】 ここに記載されるようなアッセイを介して同定された化合物は、例えば標的タ
ンパク質の生物学的機能を調べるため、及びランゲルハンス島及び／またはβ細
胞疾患を緩和するために有用であろう。例えば、ランゲルハンス島及び／または
β細胞疾患状態が、上記ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患に関与する細
胞または組織における、標的タンパク質発現及び／または標的タンパク質活性の
全体の低いレベルから生じている場合には、標的タンパク質と相互作用する化合
物は、結合した標的タンパク質の活性を促進するまたは増幅するものを含んでも
良い。上記化合物は、標的タンパク質活性のレベルの有効な増大をもたらし、か
くして症状を緩和するであろう。標的遺伝子内のミューテーションが、ランゲル
ハンス島及び／またはβ細胞疾患を導く負の効果を有する異常な標的タンパク質
の生産を導く場合、結合標的タンパク質の活性を阻害する標的タンパク質を結合
する化合物が同定されても良い。例えばセクション３．１から３．３に記載され
た方法によって同定される化合物の有効性を試験するためのアッセイは、セクシ
ョン３．４で以下に記載される。
【０１４０】 ３．１標的タンパク質に結合する化合物についてのin vitroスクリーニングアッ
セイ インビトロシステムは、本発明の標的タンパク質に結合できる化合物を同定す
るようにデザインされることができる。同定された化合物は、例えば野生型及び
／又は変異標的タンパク質の活性をモジュレートすることにおいて有用であり得
、標的タンパク質の生物学的機能を作り上げることにおいて有用であり得、正常
標的タンパク質の相互作用を分断する、又はそれ自身そのような相互作用を分断
する可能性のある化合物を同定するためのスクリーニングにおいて用いられるこ
とができる。
【０１４１】 標的タンパク質に結合する化合物を同定するために用いられるアッセイの原理
は、２つの成分が相互作用し結合し、それにより反応混合物中で除去できる及び
／又は検出できる複合体を形成するために可能にするための条件下かつ十分な時
間、標的タンパク質と試験化合物の反応混合物を調製することを含む。これらの
アッセイは種々の方法で行なうことができる。例えば、そのようなアッセイを行
なうための１つの方法は、固相への標的タンパク質又は試験基質のアンカーリン
グ、及び反応の最後に固相上にアンカリングされた標的タンパク質／試験化合物
複合体の検出を含むであろう。そのような方法の一の実施態様において、標的タ
ンパク質は固体表面上にアンカリングされ、アンカリングされない試験化合物は
直接的又は間接的に標識され得る。
【０１４２】 実際に、マイクロタイタプレートを固体相として都合よく利用することができ
る。固定された成分を、非共有または共有結合によって固定することができる。
非共有結合は、単に固体表面をタンパク溶液で被覆し、かつ乾燥させることによ
って行ってもよい。あるいは、固定化されるべきタンパクに特異的な固定された
抗体、好ましくはモノクローナル抗体を用いて、タンパクを固体表面に固定して
もよい。表面は、あらかじめ調製され、貯蔵されてもよい。
【０１４３】 アッセイを行うために、非固定化成分が、固定された成分を含む被覆された表
面に添加される。反応が終了した後、未反応成分を、形成されたあらゆる複合体
が固体表面に固定されたまま残るような条件下で除く（例えば、洗浄により）。
固体表面に固定された複合体の検出は、多くの手段により行うことができる。先
に非固定化成分が予めラベルされている場合は、表面に固定されたラベルの検出
が複合体の形成を示す。先に非固定化成分が予めラベルされていない場合は、間
接的ラベルが、表面に固定された複合体を検出するために用いられ、例えば、予
め非固定化成分に特異的なラベル化抗体が用いられる（抗体が、ラベルされた抗
Ｉｇ抗体で直接的または間接的にラベルされてもよい）。
【０１４４】 あるいは、反応を液相で行ってもよく、反応生成物を未反応成分から分離し、
複合体を、例えば溶液中に形成されたあらゆる複合体を固定するための標的タン
パクまたはテスト化合物に特異的な固定された抗体、並びに、固定化された複合
体を検出するための可能な複合体の別の成分に特異的なラベルされた抗体を用い
て検出することができる。
【０１４５】 ３．２標的タンパクと相互作用する細胞性タンパクのアッセイ タンパク−タンパク相互作用を検出するのに適したあらゆる方法を、新規の標
的タンパク−細胞性または細胞外性タンパク相互作用を同定するために使用する
ことができる。これらの方法は、パスウェイタンパクの同定のところで、セクシ
ョン１．２で上述したとおりであり、同定された標的タンパクと相互作用するタ
ンパクの同定に関して、ここで利用できる。
【０１４６】 ３．３標的タンパク／細胞性高分子相互作用を妨げる化合物のアッセイ 本発明の標的タンパクは、in vivoにおいて、一以上の細胞性または細胞外性
高分子、例えばタンパクと相互作用しうる。かかる高分子は、以下に限定される
ものではないが、セクション３．２で上記のような方法を介して同定されるタン
パクおよび核酸分子を含みうる。この議論のため、かかる細胞性及び細胞外性高
分子を、“結合パートナー”と称する。かかる相互作用を妨害する化合物は、標
的タンパク、特に変異標的タンパクの活性を制御するのに使用できる。かかる化
合物は、例えばセクション３．１に記載されるように、以下に限定されないが、
抗体、ペプチド等の分子を含む。
【０１４７】 標的タンパクとその細胞性または細胞外性結合パートナーとの間の相互作用を
妨げる化合物を同定するために使用されるアッセイシステムの基本原理は、標的
タンパクと結合パートナーとを含む反応混合物を、これら二つが相互作用し結合
するのに十分な条件下及び時間の下に調製し、かくして複合体を形成することを
含む。阻害活性について化合物を試験するために、反応混合物を、テスト化合物
の存在下及び不在下で調製する。このテスト化合物は、最初から反応混合物に含
まれてもよく、また、標的タンパク及びその細胞性または細胞外性結合パートナ
ーの添加後に加えられてもよい。コントロール反応混合物は、テスト化合物なし
に、またはプラシーボと共にインキュベートされる。標的タンパクと細胞性また
は細胞外性結合パートナーとの間のあらゆる複合体の形成が検出される。コント
ロール反応における複合体の形成は、しかしテスト化合物を含む反応混合物にお
けるものではないが、標的タンパクと相互作用結合パートナーとの相互作用をそ
の化合物が妨げることを意味する。さらに、反応混合物内の複合体形成は、テス
ト化合物と変異標的タンパクとを含む。この比較は、正常な標的タンパクではな
く、変異標的タンパクの相互作用を妨げる化合物を同定したい場合に重要となり
うる。
【０１４８】 標的と結合パートナーとの相互作用を妨げる化合物のアッセイは、異種または
同種のフォーマットにおいて実施することができる。異種アッセイは、標的タン
パクまたは結合パートナーを固体相に結合させ、反応の最後に固体相に結合した
複合体を検出することを含む。同種アッセイでは、反応全体が液相で実施される
。いずれのアプローチにおいても、反応物の添加順序は、テストされる化合物に
ついて異なる情報を得るために変更することができる。例えば、標的タンパクと
結合パートナーとの相互作用を、例えば競合により妨げるテスト化合物は、テス
ト物質の存在下で反応を実施することによって、すなわち、標的タンパクと相互
作用細胞性または細胞外性結合パートナーと同時またはそれよりも前にそのテス
ト物質を反応混合物に加えることによって、同定することができる。あるいは、
予め形成された複合体を妨げるテスト化合物、例えば複合体から成分の一つを置
換するより高い結合定数を備えた化合物は、複合体が形成された後に反応混合物
にそのテスト化合物を添加することによって試験することができる。種々のフォ
ーマットを、以下に簡単に記載する。
【０１４９】 異種アッセイシステムでは、標的タンパクまたは相互作用細胞性または細胞外
性結合パートナーのいずれかが、固体表面に固定されるが、非固定種は、直接ま
たは間接的にラベル化される。実際に、マイクロタイタプレートを、都合よく利
用することができる。固定された種は、非共有または共有結合によって固定され
てもよい。非共有結合は、単に固体表面を標的遺伝子産物または結合パートナー
の溶液で被覆し、かつ乾燥させることによって行ってもよい。あるいは、固定化
されるべき種に特異的な固定された抗体を用いて、その種を固体表面に固定して
もよい。表面は、あらかじめ調製され、貯蔵されてもよい。
【０１５０】 アッセイを行うために、非固定化種のパートナーが、テスト化合物を用いて、
あるいは用いずに被覆された表面に曝される。反応が終了した後、未反応成分を
除き（例えば、洗浄により）、形成されたあらゆる複合体が固体表面に固定され
たまま残る。固体表面に固定された複合体の検出は、多くの手段により行うこと
ができる。非固定化種が予めラベルされている場合は、表面に固定されたラベル
の検出は複合体が形成されたことを示す。非固定化種が予めラベルされていない
場合は、間接的ラベルが、表面に固定された複合体を検出するために用いられ、
例えば、最初に非固定化種に特異的なラベル化抗体が用いられる（抗体が、ラベ
ルされた抗Ｉｇ抗体で直接的または間接的にラベルされてもよい）。反応成分の
添加順序に依存して、複合体形成を阻害、または予め形成された複合体を妨げる
テスト化合物が検出される。
【０１５１】 あるいは、反応を、テスト化合物の存在下または不在下において液相で行って
もよく、反応生成物を未反応成分から分離し、複合体を、例えば溶液中に形成さ
れたあらゆる複合体を固定するための結合成分の一つに特異的な固定された抗体
、並びに、固定化された複合体を検出するための別のパートナーに特異的なラベ
ルされた抗体を用いて検出することができる。液相に対する反応物の添加順序に
依存して、複合体形成を阻害、または予め形成された複合体を妨げるテスト化合
物が検出される。
【０１５２】 本発明の他の実施態様では、同種アッセイを用いることができる。このアプロ
ーチでは、標的タンパクと相互作用細胞性または細胞外性結合パートナーとの予
め形成された複合体が調製され、標的タンパクまたはその結合パートナーのいず
れかがラベルされるが、ラベルにより生成されるシグナルは複合体形成により消
失されてしまう（例えば、イムノアッセイにこのアプローチを用いるRubenstein
による米国特許第４１０９４９６号参照）。予め形成された複合体に由来する種
の一つと競合し、かつ置換するテスト物質の添加は、バックグラウンドの上にシ
グナルの生成をもたらす。このように、標的タンパク／細胞性または細胞外性結
合パートナー相互作用を妨げるテスト物質を同定することができる。
【０１５３】 特定の実施態様では、標的タンパクは、セクション２．１に記載された組換え
ＤＮＡ技術を用いた固定化のために調製することができる。例えば、標的タンパ
ク遺伝子コード領域を、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１のような融合ベクターを用いてグル
タチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に、得られた融合タンパクにおい
てその結合活性が維持されるように、融合させることができる。当該技術分野に
おいて機械的に実施されるセクション２．１で上記の方法を用いて、相互作用細
胞性または細胞外性結合パートナーを精製し、モノクローナル抗体を生成するた
めに使用することができる。この抗体は、例えば、当該技術分野において機械的
に実施される方法により、放射活性同位体125Ｉでラベルすることができる。異
種アッセイでは、例えば、ＧＳＴ−標的タンパク遺伝子融合タンパクを、グルタ
チオン−アガロースビーズに固定することができる。次いで、相互作用および結
合を生じさせるように、相互作用細胞性または細胞外性結合パートナーを、テス
ト化合物の存在下または不在下で添加することができる。反応の最後に、未結合
物質を洗浄し、ラベル化モノクローナル抗体をこのシステムに添加し、複合体形
成成分に結合させることができる。標的タンパクと相互作用細胞性または細胞外
性結合パートナーとの間の相互作用を、グルタチオン−アガロースビーズと結合
して残る放射活性の量を測定することによって検出することができる。成功した
テスト化合物による相互作用の阻害は、測定された放射活性に低減をもたらす。
【０１５４】 あるいは、ＧＳＴ−標的タンパク遺伝子融合タンパクと、相互作用細胞性また
は細胞外性結合パートナーとを、固形グルタチオン−アガロースビーズの存在下
で、液中で混合することができる。このテスト化合物を、種が相互作用する間ま
たはその後に添加することができる。この混合物を、グルタチオン−アガロース
ビーズに添加し、未結合物質を洗浄することができる。標的タンパク／結合パー
トナー相互作用の阻害の程度を、ラベル化抗体を添加し、ビーズに結合した放射
活性を測定することによって検出することができる。
【０１５５】 本発明の他の実施態様では、一方または両方の全長タンパクの代わりに、標的
タンパクおよび／または相互作用細胞性または細胞外性結合パートナー（結合パ
ートナーがタンパクの場合）の結合ドメインに対応するペプチドフラグメントを
用いて、これらと同一の技術を用いることができる。当該技術分野で機械的に用
いられている多数の方法を、結合部位を同定および単離するために使用すること
ができる。これらの方法は、以下に限定されないが、タンパクの一つをコードす
る遺伝子の変異および共免疫沈降アッセイにおける結合の阻害のスクリーニング
を含む。次いで、複合体における第二の種をコードする遺伝子における補償変異
を、選択することができる。各タンパクをコードする遺伝子の配列分析は、相互
作用結合に関与するタンパクの領域に対応する変異を現すであろう。あるいは、
あるタンパクを、このセクションにおいて上述した方法を用いて固体表面に固定
することができ、トリプシンのようなタンパク分解酵素を用いて処理された、そ
のラベル化された結合パートナーと相互作用して結合することができる。洗浄後
、結合ドメインを有する、短い、ラベル化されたペプチドが固形物質と結合して
残り、単離され、アミノ酸配列決定により同定されうる。また、細胞性または細
胞外性結合パートナーをコードする遺伝子が得られたら、短い遺伝子セグメント
を、タンパクのペプチドフラグメントを発現するように処理することができ、こ
れをその後、結合活性について試験し、精製または合成することができる。
【０１５６】 例えば、しかし限定するものではないが、標的タンパクを、このセクションに
おいて上述したように、ＧＳＴ−標的タンパク遺伝子融合タンパクを形成し、か
つ、それをグルタチオン−アガロースビーズに結合させることにより、固形物質
に固定することができる。この相互作用細胞性または細胞外性結合パートナーを
、35Ｓのような放射活性同位体を用いてラベル化し、トリプシンのようなタンパ
ク分解酵素で切断することができる。次いで、切断生成物を、固定されたＧＳＴ
−標的タンパク遺伝子融合タンパクに添加し、結合させることができる。未結合
ペプチドを洗浄した後、細胞性または細胞外性結合パートナー結合ドメインを示
すラベル化された結合物質を溶出し、精製し、周知の方法によりアミノ酸配列に
ついて分析することができる。このように同定されたペプチドを、合成により製
造し、あるいは、組換えＤＮＡ技術を用いて適切な容易なタンパクに融合するこ
とができる。
【０１５７】 ３．４ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患の症状の改善のためのアッセイ 上述のアッセイシステムにおいて同定されるもののような化合物を制限するこ
となく含む結合化合物のいずれかは、例えばインスリン非依存性糖尿病を含んで
も良いランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患の症状を予防または改善する能
力について試験されても良い。ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患の商上
を改善する上記能力を示す化合物の同定のための細胞ベース及び動物モデルベー
スのアッセイが、以下に記載される。
【０１５８】 第一に、セクション２．２．２で上述のような細胞ベースのシステムを、ラン
ゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患の症状を予防または改善するように機能す
る化合物を同定するために使用しても良い。例えば上記細胞システムは、ランゲ
ルハンス島及び／またはβ細胞疾患の症状を改善する能力を示す可能性のある化
合物にさらされても良く、その場合さらされた細胞においてランゲルハンス島及
び／またはβ細胞疾患の症状の上記改善を引き出すのに十分な濃度で且つ十分な
時間、上記化合物にさらされる。さらした後に上記細胞は、一つ以上のランゲル
ハンス島及び／またはβ細胞疾患様の細胞表現型が、より正常な若しくはより野
生型の表現型に、または疾患の症状の低い発生またはひどさを生ずるようである
表現型に類似するように改変されるかどうか測定される。
【０１５９】 さらに、セクション２．２．１において上述されたもののような動物ベースの
ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患システムが、ランゲルハンス島及び／
またはβ細胞疾患様の症状を改善可能な化合物を同定するために使用されても良
い。上記動物モデルは、上記疾患を治療するのに有効である薬剤、医薬、治療薬
、及び介入の同定のための試験物質として使用されても良い。例えば動物モデル
は、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患の症状を予防または改善する能力
を示す可能性のある化合物にさらされても良く、その場合さらされた動物におい
てランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患の症状の上記予防または改善を引き
出すのに十分な濃度で且つ十分な時間、上記化合物にさらされる。さらすことに
対する動物の応答が、インスリン非依存性糖尿病のようなランゲルハンス島及び
／またはβ細胞疾患と関連する疾患の存在を評価することによってモニターされ
ても良い。
【０１６０】 介入に関して、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患様の症状のいずれか
の特徴点を回復するいずれかの治療が、インスリン非依存性糖尿病の治療を含む
ヒトランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患の治療的介入のための候補として
考慮されるはずである。試験薬剤の投与量は、以下のセクション６．１にごろん
される投与量応答曲線から由来することによって決定されても良い。
【０１６１】 同様に、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患の罹患を妨げることができ
るいずれかの治療が、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患の予防の治療的
介入の候補として考慮されるはずである。上記疾患は、ＮＩＤＤＭを制限するこ
となく含む。
【０１６２】 タンパク質発現パターンが、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患様の症
状を改善する化合物の能力を評価するための細胞ベースまたは動物ベースのシス
テムのそれぞれと組み合わされて使用されても良い。例えば一つ以上のフィンガ
ープリントタンパク質の発現パターンがフィンガープリントプロフィールの一部
を形成しても良く、次いでそれが評価などで使用されても良い。フィンガープリ
ントプロフィールは、セクション７．１で以下に記載される。フィンガープリン
トプロフィールは、細胞及び／または動物ベースのモデルシステム内で、ランゲ
ルハンス島及び／またはβ細胞疾患または正常な状態のそれぞれを、周知の状態
について特徴付けしても良い。その後、これらの周知のフィンガープリントプロ
フィールは、試験化合物が上記のフィンガープリントプロフィールを改変し、上
記プロフィールをより所望のフィンガープリントのものに非常に類似するように
引き起こす能力を確認するために比較されても良い。例えば化合物の投与は、ラ
ンゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患のモデルシステムのフィンガープリント
プロフィールを、コントロールシステムに非常に類似するように引き起こしても
良い。別法として、化合物の投与は、コントロールシステムのフィンガープリン
トプロフィールを、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患状態を模倣し始め
るように引き起こしても良く、それによって例えば興味ある化合物をさらに特徴
付けするために使用しても良く、またはさらなる動物モデルの生産において使用
されても良い。
【０１６３】 ４．ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患の治療のための化合物及び方法 ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患の症状を改善する方法及び組成物が
、以下に記載される。ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患は、標的タンパ
ク質の異常なレベルによって、または異常な活性を示す標的タンパク質の存在に
よって、少なくとも部分的に発症されるものである可能性が存する。上述のよう
に、上記標的タンパク質のレベル及び／または活性の減少は、ランゲルハンス島
及び／またはβ細胞疾患様の症状の改善をもたらすであろう。標的遺伝子発現の
レベルまたは標的タンパク質活性のレベルの減少のための方法が、セクション４
．１に記載される。
【０１６４】 別法として、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患は、標的タンパク質発
現のレベルの不存在または減少、あるいは標的タンパク質の活性のレベルの減少
によって、少なくとも部分的に発症されるものである可能性が存する。上述のよ
うに、標的タンパク質遺伝子発現及び／または上記タンパク質の活性のレベルの
増大が、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患様の症状の改善をもたらすで
あろう。標的タンパク質遺伝子発現のレベルまたは標的タンパク質活性のレベル
を増大するための方法は、セクション４．２に記載される。
【０１６５】 ４．１ミュータント標的タンパク質の発現、合成または活性を阻害する化合物 上述のように、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患に関与する標的タン
パク質は、標的タンパク質活性の増大したレベルによって上記疾患を引き起こす
であろう。各種の方法が、上記標的遺伝子及び／またはタンパク質の発現、合成
、または活性を阻害するために使用されても良い。
【０１６６】 例えば、阻害活性を示す、セクション３で上述のアッセイを通じて同定された
もののような化合物を、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患の症状を予防
または改善するために本発明に従って使用しても良い。上述のセクション３で記
載したように、上記分子は、ペプチド（例えば標的タンパク質膜貫通レセプター
の可溶性細胞外部分を表すペプチドのような）、ホスホペプチド、小さな有機ま
たは無機分子、または抗体（例えばポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、
抗イディオタイプ、キメラまたは一本鎖抗体、並びにＦＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２及
びＦＡｂ発現ライブラリー断片、並びにそのエピトープ結合断片を含む）を制限
することなく含んでも良い。上記化合物の有効投与量及び投与の決定のための方
法は、以下のセクション６．１に記載される。阻害抗体法は、以下のセクション
４．１．２にさらに記載される。
【０１６７】 さらに、標的タンパク質遺伝子の発現を阻害するアンチセンス及びリボザイム
分子が、異常な標的タンパク質遺伝子活性を阻害するために本発明に従って使用
されても良い。上記方法は、以下のセクション４．１．１に記載される；三分子
へリックス分子が、異常な標的タンパク質遺伝子活性を阻害するために使用され
ても良い。
【０１６８】 ４．１．１阻害アンチセンス、リボザイム及び三分子へリックスアプローチ ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患の症状を予防または改善する能力を
示す化合物の中では、アンチセンス、リボザイム及び三分子へリックス分子が挙
げられる。上記分子は、野生型、または適切であればミュータント標的タンパク
質遺伝子活性のそれぞれを減少または阻害するようにデザインされても良い。上
記分子の生産及び使用のための方法は、当業者に周知である。
【０１６９】 アンチセンスRNA及びDNA分子は、標的化mRNAにハイブリダイズし、タンパク質
の翻訳を妨げることによって、mRNAの翻訳を直接ブロックするように機能する。
アンチセンスDNAについては、例えば興味ある標的遺伝子ヌクレオチド配列の-10
から+10領域の間である翻訳開始部位から由来するオリゴデオキシリボヌクレオ
チドが好ましい。
【０１７０】 リボザイムは、RNAの特異的切断を触媒することが可能な酵素的RNA分子である
（レビューとして、Rossi, 1994, Current Biology 4: 469-471参照）。リボザ
イムの作用のメカニズムは、相補的な標的RNAに対するリボザイム分子の配列特
異的ハイブリダイゼーションと、その後のエンドヌクレオリティックな切断を含
む。リボザイム分子の組成は、標的タンパク質mRNAに相補的な一つ以上の配列を
含み、mRNA切断に関与する周知の触媒配列を含まなければならない。この配列に
ついては、米国特許第5,093,246号参照。上述のように、標的タンパク質をコー
ドするRNA配列のエンドヌクレアーゼ切断を特異的に且つ有効に触媒する操作さ
れたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子が、本発明の範囲内に入る。
【０１７１】 いずれかの可能性のあるRNA標的内での特異的なリボザイム切断部位は、以下
の配列：GUA、GUU及びGUCの一つを含むリボザイム切断部位に対する興味ある分
子のスキャンによって初めに同定される。一度同定されると、切断部位を含む標
的タンパク質遺伝子の領域に対応する15から20のリボヌクレオチドの短いTNA配
列が、二次構造のような予測される構造的特徴について評価され、上記構造は、
提案されたオリゴヌクレオチド配列を不適切なものにするであろう。候補の配列
の適切性は、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、相補的なオリゴヌクレ
オチドとハイブリダイズする感受性を試験することによっても評価される。
【０１７２】 転写の阻害のための三分子へリックス形成において使用される核酸分子は、一
本鎖でありデオキシヌクレオチドより成るべきである。これらのオリゴヌクレオ
チドの塩基組成は、Hoogsteen塩基ペア規則による三分子へリックス形成を促進
するようにデザインされなけれならず、上記規則は一般的に、二本鎖の中の一方
の鎖に存在するプリンまたはピリミジンのそれぞれのかなりのストレッチを必要
とする。ヌクレオチド配列はピリミジンベースでも良く、それは生じた三分子へ
リックスの３個の会合する鎖を通じてTAT及びCGC+三塩基を生じるであろう。ピ
リミジンリッチな分子は、二本鎖の中の一方の鎖のプリンリッチな領域に対して
相補的な塩基を、上記鎖と平行な向きに提供する。加えて、例えばＧ残基のスト
レッチを含むプリンリッチな核酸分子が選択されても良い。これらの分子は、Ｇ
ＣペアをリッチなDNA二本鎖を有する三分子へリックスを形成し、その場合プリ
ン残基の多数が、標的二本鎖の一方の鎖に存在し、三重鎖の三つの鎖を通じてGG
C三塩基を生じる。
【０１７３】 別法として、三分子へリックス形成のための標的となり得る可能性のある配列
は、「スイッチバック」核酸分子と称されるものを作製することによって増大さ
れても良い。スイッチバック分子は、二本鎖の第一の一方の鎖と塩基ペアを形成
するように、5'-3'の態様で改変し、次いで他方を3'-5'の態様で改変し、二本鎖
の一方の鎖に存在するプリンまたはピリミジンのそれぞれのかなりのストレッチ
に対する必要性を消失させるように合成される。
【０１７４】 アンチセンスRNA及びDNA、リボザイム、及び三分子へリックス分子は、DNA及
びRNA分子の合成について当該技術分野で周知の方法によって調製されても良い
。それらは、例えば固相ホスホロアミダイト化学合成のような、当該技術分野で
周知のオリゴデオキシリボヌクレオチド及びオリゴリボヌクレオチドを化学的に
合成するための方法を含む。別法として、RNA分子はアンチセンスRNA分子をコー
ドするDNA配列のin vitro及びin vivo転写によって生産されても良い。上記DNA
分子は、広範囲のベクター内に取り込まれても良く、上記ベクターは、T7または
SP6ポリメラーゼプロモーターのような適切なRNAポリメラーゼプロモーターを取
り込む。別法として、使用されるプロモーターに依存して構成的にまたは誘導可
能なアンチセンスRNAを合成するアンチセンスcDNA構築物が、細胞系内に安定に
取り込まれても良い。
【０１７５】 DNA分子に対する各種の周知な修飾が、細胞内安定性及び半減期を増大する手
段として導入されても良い。考え得る修飾は、上記分子の隣接配列、または5'及
び／または3'末端へのリボまたはデオキシリボヌクレオチドの添加、あるいはオ
リゴデオキシリボヌクレオチド骨格内へのホスホジエステラーゼ結合よりむしろ
ホスホロチオエートまたは2'-O-メチルの使用を制限することなく含む。
【０１７６】 ４．１．２標的タンパク質の阻害のための抗体 標的タンパク質に特異的であり、且つその活性を妨げる抗体が、標的タンパク
質機能を阻害するために使用されても良い。所望される場合、上記ミュータント
標的産物の活性を妨げるミュータント標的タンパク質に特異的な抗体が使用され
ても良い。上記抗体は、上記タンパク質自体に対して、または上記タンパク質の
一部に対応するペプチドに対して、上述のセクション２．３に記載された標準法
を使用して生産されても良い。上記抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、
Fab断片、一本鎖抗体、キメラ抗体等を制限することなく含む。
【０１７７】 標的遺伝子タンパク質が細胞内に存し、抗体全体が使用される場合、内部化抗
体が好ましいであろう。しかしながら、リポフェクチンまたはリポソームが、細
胞内の標的タンパク質エピトープに結合する抗体またはFab領域の断片を輸送す
るために使用されても良い。抗体の断片が使用される場合、標的タンパク質の結
合ドメインに結合する最小の阻害断片が好ましい。例えば、標的タンパク質に結
合する抗体の可変領域のドメインに対応するアミノ酸配列を有するペプチドが使
用されても良い。上記ペプチドは、化学的に合成されても、当該技術分野で周知
の方法を使用して、組換えDNA法によって生産されても良い（例えばCreighton,
1983, 上記参照；及びSambrook等, 1989, 上記参照を参照）。 別法として、細胞内標的タンパク質エピトープに結合する一本鎖中和抗体が投
与されても良い。上記一本鎖抗体は、例えばMarasco等(Marasco, W.等, 1993, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893)に記載されたもののような方法を
使用することによって、標的細胞集団内に一本鎖抗体をコードするヌクレオチド
配列を発現することによって投与されても良い。
【０１７８】 標的タンパク質が細胞外に存在する場合、または膜貫通タンパク質である場合
、ペプチド投与のために適切であるセクション６で以下に記載される投与方法の
いずれかが、作用部位に阻害標的タンパク質抗体を効率的に投与するために使用
されても良い。
【０１７９】 ４．２標的タンパク質のレベルまたは活性を回復または増大するための方法 ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患を引き起こす標的タンパク質は、ラ
ンゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患部位で過小発現されても良い。別法とし
て、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患の症状の罹患を導く標的タンパク
質の活性が減少されても良い。ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患の症状
が呼ぼうまたは緩和されるレベルに、標的タンパク質のレベルを増大する方法が
、このセクションに記載される。標的タンパク質の活性のレベルは、存在する標
的タンパク質のレベルを増大することによって、または例えば存在する活性な標
的タンパク質のレベルを増大することによって増大されても良い。
【０１８０】 例えば、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患の兆候を緩和するのに十分
なレベルの標的タンパク質が、上記の兆候を示す患者に投与されても良い。以下
に議論される方法のいずれかが、上記投与のための利用されても良い。当業者は
、以下に記載されるもののような方法を使用して、正常な標的タンパク質の有効
な非毒性の投与量の濃度を決定する方法を容易に理解するであろう。
【０１８１】 さらに、患者を、遺伝子置換療法によって治療することもできる。正常な標的
タンパク質遺伝子の一以上の複製または、標的タンパク質遺伝子機能を有する正
常な標的タンパク質の産生を指示する遺伝子の部分を、細胞に挿入してもよく、
アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、及びレトロウィルスベクターを制限する
ことなく含むベクターを、リポソーム等の細胞中にＤＮＡを導入する他の粒子に
加えて、使用する。更にまた、上述のような技術は、ヒト細胞への正常な標的タ
ンパク質遺伝子配列の導入のために利用しても良い。
【０１８２】 正常な標的タンパク質遺伝子配列を含む細胞、好ましくは自系細胞は、その後
患者に、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患の症状の改善が可能な位置に
て導入又は再導入するこことができる。こうした細胞置換技術は、例えば、標的
タンパク質が分泌された細胞外タンパク質である場合に好ましい。
【０１８３】 更に、標的タンパク質に特異的に結合し、結合によって、直接的又は間接的に
標的タンパク質機能の活性化に役立つ抗体を、投与しても良い。こうした抗体は
、ポリクローナル、モノクローナル、FAb断片、一本鎖抗体、キメラ抗体等を制
限することなく含む。上記抗体は、セクション２．３で上述のような標準法を使
用して生産されても良く、タンパク質自体に対して、または上記タンパク質の一
部に対応するタンパク質に対して生産されても良い。上記抗体は、例えばセクシ
ョン４．１．２で上述の方法に従って投与されても良い。
【０１８４】 ５．製薬調製物及び投与の方法 標的タンパク質の発現、合成、及び／または活性に影響する同定された化合物
、核酸分子、及び細胞は、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患を予防また
は治療または改善するための治療上の有効量で患者に投与することができる。治
療上の有効量は、インスリン非依存性糖尿病を含むランゲルハンス島及び／また
はβ細胞疾患の症状の緩和を導くのに十分な化合物の量を指し、または別法とし
て、上記症状の緩和を導くタンパク質の濃度を発現するのに十分な核酸分子の量
を指す。
【０１８５】 ５．１有効投与量 こうした化合物の毒性及び治療有効性は、細胞培養または実験動物における標
準的な製薬手法、例えばＥＤ50（集団の５０％において治療上の有効な投与量）
による決定のため、及びあらゆる副作用のＥＤ50（毒性−ＴＤ50）の測定により
決定可能である。毒性と治療有効性との投薬量比は、治療法指数であり、ＴＤ50 ／ＥＤ50なる比として表すことができる。大きな治療法指数を示す化合物が好ま
しい。毒性の副作用を揺する化合物を使用しても良い一方で、患部組織の部位を
標的としたこうした化合物のデリバリーシステムは、細胞への損害の可能性を最
小限にし、よって副作用が低減されるように注意深く設計するべきである。
【０１８６】 細胞培養検定及び動物実験から得られたデータは、ヒトにおける使用のための
一定範囲の投薬量の処方に利用可能である。こうした化合物の投薬量は、毒性が
僅かまたは全くないＥＤ50を含む循環濃度の範囲内であることが好ましい。該投
薬量は、この範囲内で、利用する投薬形態及び使用する投与経路によって変化し
ても良い。
【０１８７】 ヒトの治療のためには、前記剤の一日当たりの典型的な投薬量は、全て体重７
０kgに基づいて１日当たり０．０１mg乃至４g、好ましくは０．０１乃至４００m
g、更に好ましくは０．１乃至１０mgであって、一回でまたは一日に上限８回で
与えられるが、一日に４回を越えないことが好ましい。
【０１８８】 ５．２製剤及び使用 本発明に従った使用のための製薬組成物は、一つ以上の生理学的に許容可能な
キャリアーまたは賦形剤を使用して従来法において製剤化されても良い。
【０１８９】 かくして、上記化合物及びその生理学的に許容可能な塩及び溶媒は、吸入また
は通気（口または鼻を通じてのいずれか）または経口、口内、非経口及び直腸の
投与によって投与するために製剤化されても良い。
【０１９０】 経口投与のためには、該製薬組成物は、例えば、定法により、結合剤（例えば
プレゼラチン化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキ
シプロピルメチルセルロース）充填剤（例えばラクトース、ミクロクリスタリン
セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えばマグネシウムステ
アレート、タルク、またはシリカ）；崩壊剤（ジャガイモデンプンまたはナトリ
ウムデンプングリコレート）；または湿潤剤（例えばナトリウムラウリルスルフ
ェート）等の製薬的に許容される賦形剤を用いて調製される錠剤、カプセルの形
態をとりうる。錠剤は、当業界において周知の方法により被覆されても良い。経
口投与のための液体調剤は、例えば、溶液、糖液、または懸濁液の形態をとって
よく、あるいは使用前に水または他の好適な媒体と併せるための乾燥製品として
もよい。こうした液体調剤は、懸濁剤（例えばソルビトールシロップ、セルロー
ス誘導体、または水素化食用脂肪）；乳化剤（例えばレシチンまたはアカシア）
；及び保存料（例えばメチルもしくはプロピル=p-ヒドロキシベンゾエート、ま
たはソルビン酸）等の製薬として許容される添加剤を用い、定法によって調製す
ることができる。該調剤はまた、バッファー塩、香料、着色料、及び甘味料を適
宜含有しても良い。
【０１９１】 経口投与のための調剤はまた、活性化合物の制御された放出を与えるために好
適に製剤されうる。
【０１９２】 頬からの投与のためには、該組成物は定法によって製剤された錠剤またはロゼ
ンジの形態をとりうる。
【０１９３】 吸入による投与のためには、本発明に従った使用のための化合物は、簡便のた
め、加圧パックまたは噴霧器から、適当な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメ
タン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素
、または他の適当な気体を使用して放出されるエアロゾルスプレーの形態で送達
される。加圧エアロゾルの場合には、投薬単位は測定量を送達するためのバルブ
を設けることによって決定することができる。吸入または通気において使用する
ための、例えばゼラチン等のカートリッジ及びカプセルは、該化合物の粉末混合
物と、ラクトースまたはデンプンなどの適当な粉末ベースとを包含して製剤され
るとよい。
【０１９４】 該化合物は、注射、例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与向け
に製剤されても良い。注射のための製剤は、単位投薬量形態とされるとよく、例
えばアンプルまたはマルチ投薬容器中で更に保存料を加えたものであって良い。
該組成物は、油性または水性の媒体中における懸濁液、溶液、またはエマルジョ
ン等の形態をとってよく、懸濁、安定化及びまたは分散剤などの製剤化剤を含ん
でも良い。あるいはまた、該活性成分は、好適な媒体、例えば滅菌され、発熱物
質を含まない水等と使用前に併せるための粉末形態としても良い。
【０１９５】 該化合物はまた、坐剤または停留浣腸、例えばココアバターまたは他のグリセ
リド等の従来の坐剤ベースを含有するもの等の結腸組成物中に処方されても良い
。
【０１９６】 前述の製剤に加え、該化合物はまた蓄積調剤として製剤されても良い。こうし
た長時間作用型製剤は、移植（例えば皮下または筋内への）によって、または筋
内注射によって投与しても良い。したがって、例えば、該化合物は好適なポリマ
ー性または疎水性物質（例えば許容されるオイル中のエマルジョンとして）また
はイオン交換樹脂、または微溶性（sparingly soluble）誘導体として、例えば
微溶性塩と共に製剤されても良い。
【０１９７】 該組成物は、所望により、パックまたはディスペンサー装置中としても良く、
これは活性成分を含む一以上の単位投薬量形態を収容するとよい。パックは、例
えば、金属またはプラスチックのホイル、例えばプラスチック包み（blister pa
ck）を含んでも良い。パックまたはディスペンサー装置には、投与のための指示
を添付してあると良い。
【０１９８】 ６．インスリン非依存性糖尿病を含むランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患
の異常性の診断 ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患の診断、ランゲルハンス島及び／ま
たはβ細胞疾患に対する素因の診断のために、並びに例えば臨床試験の間でいず
れかのランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患化合物の効力をモニターするた
めに、並びに上記インスリン抵抗性疾患の治療のための臨床上の評価を受けてい
る患者をモニターするために、各種の方法を使用しても良い。フィンガープリン
トタンパク質を、ランゲルハンス島またはβ細胞疾患の性質を規定するため、上
記疾患の治療の同定及び／または選択において作用させて使用できる。
【０１９９】 上記方法は、全体の動物におけるグルコース／インスリン比の測定、またはグ
ルコース耐性試験の間で尿または血漿中のc-ペプチドの測定のような従来の方法
を含む。
【０２００】 World Health Organisation, the International Diabates Federation及びth
e American Diabates Associationといった団体によって同定される方法及びパ
ラメーターによって、インスリン非依存性糖尿病が検出されても良く、治療の効
力がモニターされても良い。
【０２０１】 上記方法はまた、例えば、セクション１に記載されたフィンガープリントタン
パク質のような試薬を利用し、並びにセクション１．３（ペプチド）及び２．３
（抗体）で上述のような特異的に発現されるタンパク質及びパスウェイタンパク
質に対して生産された抗体を利用しても良い。特に上記薬剤は、(1)標的タンパ
ク質のミューテーションの存在の検出、または(2)正常な状態に対する標的タン
パク質の過剰または過小の存在のそれぞれの検出のために使用されても良い。
【０２０２】 ここに記載される方法は、例えば少なくとも一つの特異的フィンガープリント
タンパク質、またはここに記載される抗フィンガープリントタンパク質抗体試薬
を含む、事前実装診断キットを使用することによって実施されても良く、それは
例えば、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患の異常性を示す患者を診断す
るために臨床上の確立において従来使用されている。
【０２０３】 フィンガープリントタンパク質を発現する細胞タイプまたは組織のいずれかが
、以下に記載される診断において利用されても良い。適切なサンプルタイプの例
は、細胞サンプル、組織サンプル、並びに血液、尿、または血漿のような液体サ
ンプルを含む。
【０２０４】 ここで使用可能な上記方法の中には、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾
患の治療のための臨床試験において化合物の効力をモニターする方法が挙げられ
る。上記化合物は例えば、セクション４で上述のような化合物が存在する。上記
方法は、正常な状態における発現に対して、ランゲルハンス島及び／またはβ細
胞疾患状態において特異的に発現されるタンパク質を、患者サンプル内で検出す
ることを含む。
【０２０５】 臨床試験の間で、例えば単一のフィンガープリントタンパク質の発現、または
別法としてランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患に関与する細胞のフィンガ
ープリントパターンが、試験される化合物の存在または不存在下で側的できる。
化合物の効力は、その後正常状態の対応する周知の発現パターンと、得られた発
現データを比較することが実施される。効力を示す化合物は、単一のフィンガー
プリントタンパク質発現及び／またはフィンガープリントパターンを正常な状態
のものに非常に類似するように改変するものである。
【０２０６】 正常な状態の発現に対して、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患状態で
特異的に発現されるタンパク質の検出は、潜在的なランゲルハンス島及び／また
はβ細胞疾患化合物、並びにインスリン非依存性糖尿病の治療のための化合物を
、臨床試験の間でモニターするために使用できる。臨床試験の間で、例えば特異
的に発現されるタンパク質のレベル及び／または活性が、試験される化合物の存
在下または不存在下で関連細胞及び／または組織中で測定できる。上記化合物の
効力はその後、正常な状態における細胞及び／または組織についての対応する周
知のレベル／活性と、タンパク質レベル及び／または活性データを比較すること
が実施される。効力を示す化合物は、ランゲルハンス島及び／またはβ細胞疾患
に関与する細胞及び／または組織のパターンを、正常な状態のものに非常に類似
して改変するものである。
【０２０７】
【実施例】
実施例１ マウス治療プロトコール 痩せた及び肥満のメスのC57 B1/6J ob/obマウスに、７日間の経口胃管栄養法
によって、BRL 49653、ロシグリタゾンを与えた。この治療は、ob/obマウスにお
ける経口のグルコース耐性とインスリン感受性の顕著な改良を生じたが、痩せた
小さな動物には効果がなかった。非絶食動物を５０％"Hyponovel"及び５０％"Hy
ponorm"で麻酔処理し、二酸化炭素ガスで人道的に殺害した。次いで膵臓を摘出
した。
【０２０８】 ランゲルハンス島の調製 ランゲルハンス島を、1mM CaCl2、4mMグルコースを補い、CO2:O2 (5%:65%))で
平衡化した生理食塩水、pH7.4を使用して、３７℃でコラゲナーゼ切断（コラゲ
ナーゼタイプVI, Sigma, UK）によって単離した。ランゲルハンス島を、双眼顕
微鏡を使用して手で摘出した。ランゲルハンス島を洗浄し、さらに微細切断して
、残余の腺房物質を除去した。
【０２０９】 次いでランゲルハンス島を、液体窒素中で急速に凍結し、凍結して保存した。
【０２１０】 タンパク質の可溶化 分析的2-D-PAGEのため、１２５のランゲルハンス島を尿素(8M)、CHAPS(4%w/v)
、Tris(40mM)、DTE(65mM)、SDS(0.05%w/v)及び微量のブロモフェノールブルーを
含む６０マイクロリットルの溶液と混合した。最終希釈サンプルの計量した部分
を、IPGゲルの陰極末端でサンプルカップ内に搭載した。
【０２１１】 第一次元電気泳動 IPG断片(3.5-10.0 NL IPG 18cm)の非直線的固定化pH勾配を、第一次元として
使用した。それは高い分解能と、格別の再生産性を与え、高いタンパク質搭載量
を可能にした。Geneva University Hospitalの明細書に基づいて、非直線的pH勾
配断片を、Amersham-Pharmacia Biotechnology ABによって調製し、それは商業
的に入手可能である。上記断片は、3mmの幅と180mmの長さを有した。
【０２１２】 IPG断片の水和を、尿素(8M)、CHPS(2%w/v)、DTE(10mM)、Resolyte pH 3.5-10
(2%v/v)及び微量のBromophenol Blueの25ml溶液で、Pharmacia再膨潤カセット中
に一晩で実施した。
【０２１３】 水和カセットが完全に空になり開いてから、上記断片をPharmacia断片トレー
に移した。IPG断片、湿った電極芯、電極及びサンプルカップを所定の位置に配
置した後に、上記断片及びカップを低粘度のパラフィン油で覆った。サンプルを
、ゲルにふれることなくゆっくりと連続的な態様で、IPG断片の陰極末端でカッ
プ中に適用した。
【０２１４】 電圧を３時間で300から3500Vに直線的に増大し、その後さらに３時間3500Vを
適用し、続いて電圧を5000Vに増大した。全部で100kvhの電圧時間を、一晩の稼
働で使用した。
【０２１５】 電気泳動の第二次元 第一次元の稼働の後、IPG断片を平衡化して、タンパク質を再溶解し、-S-S-結
合を還元した。かくして上記断片を、Tris-HCl(50mM)pH6.8、尿素(6M)、グリセ
ロール(30%v/v)、SDS(2%w/v)及びDTE(2%w/v)を含む100mlの溶液で１２分断片ト
レー内で平衡化した。その後SH基をTris-HCl(50mM)pH6.8、尿素(6M)、グリセロ
ール(30%v/v)、SDS(2%w/v)、ヨードアセタミド(2.5%w/v)及び微量のBromophenol
Blueを含む100mlの溶液で５分ブロッキングした。
【０２１６】 第二次元の稼働において、Laemmli-SDS-不連続システムを有する縦方向勾配ス
ラブゲルを、いくつかわずかに修飾して使用し、それは以下のように要約された
： ・ゲルはSDSの存在下で重合されない。これは、アクリルアミドモノマーを含む
ミセルの形成を妨げるようであり、かくして孔のサイズの均一性を増大し、ポリ
アクリルアミドにおける非重合モノマーの濃度を減少する。ゲルランニングバッ
ファーにおいて使用されるSDSは、タンパク質上の必要とされる負の電荷を維持
するのに十分である。 ・ピペラジン−ジアクリリル（PDA)を架橋剤として使用する。これはN末端タン
パク質ブロッケージを減少すると解され、より優れたタンパク質の分解を与え、
ジアミン銀染色バックグランドを減少する。 ・チオ硫酸ナトリウムを添加剤として使用し、ゲルの銀染色におけるバックグラ
ンドを減少する。 ・IPG断片とアガロースの組み合わせは、スタッキングゲルに対する必要性を避
ける。
【０２１７】 ゲルの組成及びサイズは以下の通りであった： サイズ： 160×200×1.5mm 分解ゲル アクリルアミド/PDA(9-16%T/2.6%C) スタッキングゲル： スタッキングなし リーディングバッファー： Tris-HCl(0.375M)pH8.8 トレーリングバッファー： Tris-グリシン−SDS(25mM-198mM-0.1%w/v)pH8.3 添加剤： チオ硫酸ナトリウム(5mM) 重合剤： TEMED(0.05%)APS(0.1%)
【０２１８】 ゲルを、プレートの上部から0.7cmまで注ぎ、約２時間sec-ブタノールで覆っ
た。覆いを除去し、それを水で置換した後、ゲルを一晩放置した。
【０２１９】 平衡化の後、IPG断片を所定のサイズに切断した。陽極末端から6mmと、陰極末
端から14mmを除去した。第二次元ゲルを、約７０℃に加熱したアガロース(0.5%w
/v)とTris-グリシン-SDS(25mM-198mM-0.1%w/v)pH8.3を含む溶液で覆い、IPG断片
をそこに迅速に乗せた。
【０２２０】 ゲルを、40mA/ゲルの一定電流で５時間8-12℃で稼働した。電圧は制限しない
が、100から400Vが必要であった。
【０２２１】 染色 クマシーブリリアントブルー染色より１００倍感度がよい銀染色を使用した（
他に断り書きがある場合を除いて）。かくして2-DGEゲルを、以下のようにアン
モニア性銀染色で染色した：
【０２２２】 全ての工程を、36rpmで軌道上のシェイカーで実施した。 工程１：第二次元の稼働の最後で、ゲルをガラスプレートから取り出し、脱イオ
ン水で５分洗浄した。 工程２：ゲルを１時間エタノール：酢酸：水(40:10:50容量比)に浸した。 工程３：ゲルを２時間または一晩、エタノール：酢酸：水(5:5:90容量比)に浸し
た。 工程４：ゲルを脱イオン水で５分洗浄した。 工程５：ゲルをグルタルアルデヒド(1%v/v)及び酢酸ナトリウム(0.5M)を含む溶
液で３０分浸した。 工程６：ゲルを脱イオン水で１０分３回洗浄した。 工程７：タンパク質の均一で暗い褐色の染色を得るために、ゲルを３０分2,7-ナ
フタレンスルホン酸溶液(0.05%w/v)に二回浸した。 工程８：ゲルを脱イオン水で１５分４回すすいだ。 工程９：ゲルを新たに調製されたアンモニア性硝酸銀溶液で３０分染色した。75
0mlのこの溶液を調製するために、6gの硝酸銀を30mlの脱イオン水に溶解し、そ
れを160mlの水、20mlの濃縮アンモニア(25%)及び1.5mlの水酸化ナトリウム(10N)
を含む溶液に混合した。一過的な褐色の沈殿が形成されても良かった。それが透
明化した後、水を加えて最終容量とした。 工程１０：染色後、ゲルを脱イオン水において４分４回洗浄した。 工程１１：イメージを、クエン酸(0.01%w/v)とホルムアルデヒド(0.1%v/v)の溶
液で５から１０分現像した。 工程１２：わずかなバックグランド染色が出現したら、Tris(5%w/v)及び酢酸(2%
v/v)の溶液で現像を停止した。
【０２２３】 ゲルのスキャン Molecular Dynamics社製のLaser Densitometer (4000×5000ピクセル; 12ビッ
ト／ピクセル)と、Bio-Rad社製のGS-700を、スキャン装置として使用した。これ
らのスキャナーを、"Sparc"ワークステーションの"Macintosh"コンピューターに
接続した。
【０２２４】 "Melanie II"を使用するゲルの定量的イメージ分析 二次元ポリアクリルアミドゲルを、コンピューターによってデジタル化して分
析し、定量的イメージ分析と自動ゲル比較を可能にした。2-D-PAGE法は、1975年
に初めて開発されたため、いくつかのコンピューターシステムが、主にアカデミ
ックな2-D-PAGE関連研究室によって製造されている。この研究では、University
Hospital og Genevaで開発された"Melanie II"が使用された。それは、"Unix（
登録商標）"ワークステーション、並びに"Power Macintosh"及びIBM-適合コンピ
ューターについて利用可能である。
【０２２５】 ob/obb及びやせたマウスのスポット検出、定量化及びマッチング、ゲルイメー
ジ抽出、ズーミング、ワーピング及びプリンティング、並びにゲルのスタッキン
グ及びフリッピングは、"MelView"プログラムで実施した。
【０２２６】 次いでイメージを４種のクラスに分類した：痩せたコントロール、ob/obコン
トロール、痩せた処理種、及びob/ob処理種。各スポットの相対的量(%容量)を使
用する微分分析とスチューデントT検定により、過剰発現及び過小発現ポリペプ
チドの有意な検出が可能であった(p<0.01)。
【０２２７】 予備的2-D-Page 上述の予備的2-DGEを、1000-2000のランゲルハンス島を使用して繰り返した。
第一次元を稼働した後、ストリップをグローブ当たり3mlの各バッファーを使用
して平衡化した。
【０２２８】 タンパク質電気的ブロッティング ポリビニリデンジフルオリド(PVDF)への2-D-PAGEによって分離したタンパク質
のブロッティングにより、複雑な生物学的サンプルから得たタンパク質の同定と
特徴付けが可能である。タンパク質のトランスファーは、真空、毛細管、または
電場のようないくつかの方法を使用して実施できる。垂直バッファータンクまた
は半乾燥法を使用する電気的ブロッティングが好ましい。両者の方法は、3-[シ
クロヘキサミノ]-1-プロパンスルホン酸(CAPS)トランスファーバッファーを使用
できる。グローブを装着し、全てのフィルターペーパーを水中で３分３回、トラ
ンスファーバッファーで３回洗浄しなければならない。これらの二つの工程は、
いずれかのタンパク質またはアミノ酸の混在を避けるために重要である。
【０２２９】 方法は以下のものであった。第二次元の電気泳動の後、ゲルを脱イオン水に３
分浸した。次いでゲルを10mM CAPS pH11を含む溶液で３０分平衡化した。同時に
PVDF膜をメタノールで１分湿らせ、10mM CAPS pH11及びメタノール(10%v/v)を含
む溶液でさらに３０分平衡化した。電気的ブロッティングを、10mM CAPS pH11と
メタノール(20%v/v陽極側；5%v/v陰極側)を含む溶液で、１５℃で３時間1mA/cm2 の一定電流で半乾燥装置で実施した。
【０２３０】 PVDF膜でのタンパク質検出 Amido Black及びクマシーブリリアントブルーR-250を、PVDF膜上のタンパク質
を視覚化するために銀染色の代わりに使用し、その後の分離後の分析と適合的で
ある。かくして別の2-DGE稼働において、電気的トランスファーの後に、PVDF膜
を、Amido Black(0.5%w/v)、イソプロパノール(25%v/v)及び酢酸(10%v/v)を含む
溶液で２分染色した。脱イオン水中のいくつかの浸液により、脱色を実施した。
【０２３１】 別の稼働で、電気的トランスファーの後、PVDF膜を、クマシーブリリアントブ
ルーR-250(0.1%v/v)とメタノール(50&v/v)を含む溶液で１５分染色した。脱色を
、メタノール(40%v/v)と酢酸(10%v/v)を含む溶液で実施した。同じ方法を、ペプ
チドマスフィンガープリントのようなさらなる分離後の分析のために電気的トラ
ンスファーの必要のない、予備的ゲルについて使用した。
【０２３２】 ＰＶＤＦ染色膜を、風乾、または３７℃で１０分加熱プレートでの3mmの厚さ
のプレートでの乾燥のいずれかを実施した。
【０２３３】 スキャン これは上述のように実施した。
【０２３４】 タンパク質の同定 エドマン分解によるアミノ酸配列分析において、アミノ酸誘導体をタンパク質
から一度に一つ連続的に切断した。化学的に接近不可能なアルファ−アミノ基を
有するタンパク質は、この方法では直接配列決定できず、N末端ブロック化と称
される。ブロック化タンパク質を解消する最適な方法は、化学的またはタンパク
質切断によって個々の断片を精製することである。
【０２３５】 繰り返し、１０から１２のエドマン分解サイクルを、各スポットについて実施
した。SWISS-SPOTデータベースにおけるサーチを、周知のタンパク質配列との同
一性を検出するために使用した。Amido Black染色タンパク質を、レーザーブレ
ードで検出し、N末端配列決定を、"Problott"カートリッジを備えたApplied Bio
systems社製のABIモデル473Aまたは477Aミクロシークエンサーを使用して実施し
た。
【０２３６】 内部配列決定のため、興味あるスポットを取り出し、酢酸(100mM)、メタノー
ル(10%v/v)及びPVP-10(1%v/v)を含む溶液に３７℃で２時間浸した。脱イオン水
での３回の洗浄の後、PVDFスポットを小片（約1mm2）に切り取り、リン酸ナトリ
ウム(100mM)pH8.0及びリシルエンドペプチダーゼ（１マイクログラム）を含む溶
液で２５マイクロリットルでインキュベートした。室温で一晩の切断に引き続き
、グアニジン-HCl(28mg)及びDTT(100マイクログラム)を加えた。３７℃で２時間
の還元の後、混合物を、300マイクログラムのヨードアセタミドで室温で３０分
インキュベートした。切断バッファーを除去して放置した。PVDF断片を、イソプ
ロパノール(70%v/v)及びトリフルオロ酢酸(5%w/v)を含む２５マイクロリットル
の溶液で一晩抽出した。この溶出溶液を取り出し、PVDFを６０マイクロリットル
のTFA(0.1%w/v)で二回洗浄した。切断及び溶出溶液を二回の最終洗浄物と共にプ
ールし、この混合物を二次元逆相HPLCによって分離し、配列決定を実施した。
【０２３７】 イムノブロッティング PVDF膜を最初に染色してタンパク質を視覚化し、その後免疫検出を実施した。
これにより、非特異的タンパク質染色で検出されたものに対するECLで検出され
たタンパク質のマッチングが、両イメージのコンピューターでの比較を通じて可
能であった。PVDFの機械的強度もまた、同じ2-Dゲルを異なる抗体について多数
回使用できるように利用した。
【０２３８】 方法全体は、室温で回転オーブン中で実施した。核酸グラスハイブリダイザー
の使用は、容量とコストを最小化した。 ・膜を、PBS(pH7.2)とノンファットドライミルク(5%w/v)の10mlの溶液で３０分
ブロックした。 ・次いで膜をPBS-"Tween"20(0.5%v/v)、ノンファットドライミルク(5%w/v)及び
一次抗体（抗体に依存して1:100以上）を含む10mlの溶液で２時間インキュベー
トした。 ・３回の迅速なリンスを、10mlのPBS-"Tween"20(0.5%v/v)で実施し、次いで膜を
10mlのPBS-"Tween"20(0.5%v/v)で３×１０分洗浄した。 ・膜を、PBS-"Tween"20(0.5%v/v)、ノンファットドライミルク(5%w/v)及び二次
ペルオキシダーゼ接合抗体(1:1000；もし一次抗体がヒツジ抗マウスであれば、
ヤギ抗ヒツジIgGが二次抗体として使用された）を含む10mlの溶液で１時間イン
キュベートした。 ・３回の迅速なリンスを、10mlのPBS-"Tween"20(0.5%v/v)で実施し、次いで膜を
10mlのPBS-"Tween"20(0.5%v/v)で５×１０分洗浄した。 ・最後の洗浄の後、膜をクリーンなガラスプレートに移し、10mlの現像溶液（例
えばAmersham InternationalまたはRoche Diagnostics社製のECL）でカバーした
。 ・過剰な現像液を除き、膜を"Saran"フィルムで巻き、Ｘ線フィルムカセットに
固定してタンパク質を検出した。 ・Ｘ線フィルムを数秒から数分間まで暗所で露光した。
【０２３９】 ペプチドマスフィンガープリント クマシー染色を使用することを除いて、2-DGE法を繰り返した。2-DGEスポット
を、３７℃で４５分50mMの二炭酸アンモニウム中の30%アセトニトリルの１００
マイクロリットルで脱染色した。上清を除き、ゲルスポットを３０分"SpeedVac"
で乾燥した。ゲルスポットを、０．２マイクログラムのブタトリプシンと50mMの
二炭酸ナトリウムを含む２０マイクログラムの溶液で３５℃で２時間再水和し、
再び３０分乾燥した。５０％のアセトニトリルと０．１％のTFAの２０マイクロ
リットルの溶液をスポットに加え、１０分間ソニケートした。サンプルを風乾し
た。次いで4mg/mlのアルファ−シアノ−ヒドロキシケイ皮酸、５０％アセトニト
リル及び０．１％TFAを含む溶液の２マイクロリットルを各ウェルに加え風乾し
た。
【０２４０】 ペプチド混合物を、窒素レーザー(337nm)を備えたマトリックス補助レーザー
脱着／イオン化タイムオブフライトマススペクトロメーター(Perseptive Biosys
tems Voyager Elite MALDI-TOF-MS)によって分析し、反射遅延抽出モードで操作
した。
【０２４１】 ペプチドの同定を、"PeptIdent"(http://www.expasy.ch/sprot/peptident.hym
l)を使用して実施した。それは、pI、相対的分子量、及びペプチドマスフィンガ
ープリントデーターを使用して、タンパク質の同定を可能にする道具である。例
示的に測定された使用者特異的ペプチドマスを、SWISS-PROT/TREMBLデータベー
スの全てのタンパク質について計算された理論的ペプチドと比較した。
【０２４２】 ＭＳ／ＭＳ配列決定 タンパク質の同定が、ペプチドマスフィンガープリント法で成功しなかった場
合、切断スポットの上清を、"ZipTip" C18ペプチドチップ(Millipore)で脱塩し
、50%アセトニトリルと0.1%TFAで溶出した。ペプチドを、MicroMass (UK)社製の
フライトチューブ(Q-TOF)の二つの四極子及び直交時間よりなるタンデムマスス
ペクトロメーターい、ナノフロー(研究室内ナノスプレー)サンプル導入によって
適用した。断片イオンスペクトルを、NOWSEデータベースサーチで解釈した(http
://www.segnet.dl.ac.uk/mowse.html)。
【０２４３】 データマネージメント：マウスSWISS-2-DPAGEデータベース SWISS-2-DPAGEは、全てのデータがコンピュータープログラムによって容易に
検索され、現在利用可能な最も流通し注目されているタンパク質配列データベー
スの一つであるSWISS-PROT Protein Sequence Databaseの物と同様なフォーマッ
トで貯蔵される、注目されている2-D-PAGEデータベースである。SWISS-2-DPAGE
データベースは、各種の2-D-PAGEマップで同定されたタンパク質でデータを集積
する。各SWISS-2-DPAGEエントリーは、一つのタンパク質についてのデータを含
み、マッピング方法、物理化学的及び生理的データ、並びに関連文献、加えてタ
ンパク質位置を示すいくつかの2-D-PAGEイメージを含む。クロスリファレンスは
SWISS-PROTに適用され、後者を通じて他のデータベースに提供される(EMBL, Gen
bank, PROSITE, OMIT等)。上記データベースは、ExPASy World Wide Webサーバ
ー(http://www.expasy.ch/)にセットアップされている。世界的に同じ2-D-PAGE
プロトコールを使用する科学者（第一次元の分離で固定化pH勾配）は、そのイメ
ージをSWISS-2-DPAGEマップと比較することが可能である。
【０２４４】 結果 以下のDEPが見出された： グループ１：POM6, POM7, POM8, POM9及びPOM10の全てが、痩せたコントロール
マウスから得たランゲルハンス島における発現に対して、ob/obコントロールマ
ウスから得たランゲルハンス島における減少した発現を有した。ob/obランゲル
ハンス島における発現は、ロシグリタゾンでの治療によって増大しなかった。
【０２４５】 グループ２：POM(T)1, POM(T)2, POM(T)4の全てが、痩せたコントロールマウス
における発現に対してob/obコントロールマウスから得たランゲルハンス島にお
いて減少した発現を有し、ob/obマウスにおける発現は、ロシグリタゾンでの治
療に引き続き痩せたコントロールマウスにおけるレベルに向かって増大した。PO
M(T)3, POM(T)5, POM(T)11, POM(T)12及びPOM(T)13の全ては、痩せたコントロー
ルマウスにおけるレベルに対して、ob/obコントロールマウスから得たランゲル
ハンス島における増大した発現を有し、ロシグリタゾンでの治療は、痩せたコン
トロールマウスにおけるものに向けて発現を減少した。かくして、これらのマウ
スにおける糖尿病のコントロールを改良するロシグリタゾンでのob/obマウスの
治療は、痩せたマウスにおける発現レベルに向けて、ob/obマウスにおけるこれ
らのタンパク質の発現を回復した。各場合において、ロシグリタゾンでの痩せた
マウスの同様な治療は、発現レベルに効果を有さず、それ故ランゲルハンス島タ
ンパク質発現における改変は、ロシグリタゾンでの治療と関連する改良されたラ
ンゲルハンス島機能に関係しているようである。
【０２４６】 グループ３：二つのタンパク質PSEM14及びPSEM15は、痩せたマウス及びob/obコ
ントロールマウスの間でいずれの特異的な発現も示さなかったが、ロシグリタゾ
ンでの治療は、痩せたマウスとob/obマウスの両者においてこれらのタンパク質
の発現を増大した。
【０２４７】 図面は、DEPの局在を示すために提示される。図１は、痩せたコントロールマ
ウスのランゲルハンス島から得たタンパク質の2Dマップを示す。図２−７及び図
９−１３は、特異的な発現の質と共にDEPの比較可能な発現を示す。比較の目的
のために、図８及び１４は、特異的に発現されないコントロールタンパク質'C12
30)を示す。
【０２４８】
【表１】
【０２４９】
【表２】
【０２５０】 ここで言及される参考文献は、全て参考として明白に取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、DEPを含むスポットを同定する、痩せたコントロール
マウスのランゲルハンス島細胞から得た染色2-DGEゲルのコンピューターイメー
ジを示す。
【図２】 図２は、DEPの比較可能な発現を特異的な発現の定量と共に示
す。
【図３】 図３は、DEPの比較可能な発現を特異的な発現の定量と共に示
す。
【図４】 図４は、DEPの比較可能な発現を特異的な発現の定量と共に示
す。
【図５】 図５は、DEPの比較可能な発現を特異的な発現の定量と共に示
す。
【図６】 図６は、DEPの比較可能な発現を特異的な発現の定量と共に示
す。
【図７】 図７は、DEPの比較可能な発現を特異的な発現の定量と共に示
す。
【図８】 図８は、特異的に発現されないコントロールタンパク質（C123
0）を示す。
【図９】 図９は、DEPの比較可能な発現を特異的な発現の定量と共に示
す。
【図１０】 図１０は、DEPの比較可能な発現を特異的な発現の定量と共
に示す。
【図１１】 図１１は、DEPの比較可能な発現を特異的な発現の定量と共
に示す。
【図１２】 図１２は、DEPの比較可能な発現を特異的な発現の定量と共
に示す。
【図１３】 図１３は、DEPの比較可能な発現を特異的な発現の定量と共
に示す。
【図１４】 図１４は、特異的に発現されないコントロールタンパク質（
C1230）を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 27/26 ３１５Ｈ Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ジャン−シャルル・サンチェス スイス・ＣＨ−1208・ジュネーブ・フラン ク−トマ・42 Ｆターム(参考） 2G045 AA29 BB24 CB17 DA36 FB05 4C084 AA02 AA17 BA01 BA08 BA23 BA44 CA17 CA18 CA59 NA14 ZC352

Claims (56)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 (a)少なくとも一つのタンパク質が、特異的なレベルのラン
    ゲルハンス島またはβ細胞機能を有する患者から得た関連組織、または上記患者
    の代表的な関連組織において特異的に発現されるというパラダイムを確立する工
    程； (b)スクリーニングされる試薬で治療された、減少したランゲルハンス島または
    β細胞機能を有する患者から得た関連組織、または上記患者の代表的な関連組織
    のサンプルを得る工程； (c)治療された患者から得た組織、または上記患者の代表的な組織における特異
    的に発現されたタンパク質の存在、不存在、または発現の度合いを測定する工程
    ；並びに (d)治療された減少したランゲルハンス島またはβ細胞機能を有する患者におけ
    る特異的に発現されたタンパク質の発現、活性または量を変化させる程度に従っ
    て、上記試薬を選択または拒絶する工程； を含む、ランゲルハンス島またはβ細胞機能不全によって特徴付けされる疾患の
    治療における有用性を決定するための試薬のスクリーニング方法。
  2. 【請求項２】 上記試薬が、上記特異的に発現されるタンパク質の発現を、
    より正常なランゲルハンス島またはβ細胞機能を有する患者のものに変換するの
    であれば、上記試薬を選択する、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 上記試薬が、上記タンパク質の発現を、正常な患者のものに
    変換するのであれば、上記試薬を選択する、請求項１または２記載の方法。
  4. 【請求項４】 ランゲルハンス島またはβ細胞機能不全が、ランゲルハンス
    島またはβ細胞重量の減少、及び／またはランゲルハンス島またはβ細胞の生物
    学的活性の減少を導く疾患の結果である、請求項１から３のいずれか一項記載の
    方法。
  5. 【請求項５】 上記パラダイムが、インスリン非依存性糖尿病患者から得た
    組織と、正常な患者から得た組織に基づく、請求項１から４のいずれか一項記載
    の方法。
  6. 【請求項６】 上記関連組織がランゲルハンス島である、請求項１から５の
    いずれか一項記載の方法。
  7. 【請求項７】 上記パラダイムにおいて、タンパク質発現の特異的なレベル
    を有する患者が、正常な患者、及び減少したランゲルハンス島またはβ細胞機能
    を有する患者を含む、請求項１から６のいずれか一項記載の方法。
  8. 【請求項８】 上記パラダイムにおいて、タンパク質発現の特異的なレベル
    を有する患者が、 (a)正常な患者、及び減少したランゲルハンス島またはβ細胞機能を有する患者
    ；並びに (b)上記試薬で治療されていない減少したランゲルハンス島またはβ細胞機能を
    有する患者、及び上記試薬で治療されている減少したランゲルハンス島またはβ
    細胞機能を有する患者； を含む、請求項１から７のいずれか一項記載の方法。
  9. 【請求項９】 上記タンパク質発現の特異的なレベルが、上記試薬で治療さ
    れている正常な患者、及び上記試薬で治療されていない正常な患者では観察され
    ない、請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 上記パラダイムにおいて、タンパク質発現の特異的なレベ
    ルを有する患者が、 (a)上記試薬で治療されている正常な患者、及び上記試薬で治療されていない正
    常な患者；並びに (b)上記試薬で治療されている減少したランゲルハンス島またはβ細胞機能を有
    する患者、及び上記試薬で治療されていない減少したランゲルハンス島またはβ
    細胞機能を有する患者； を含む、請求項１から９のいずれか一項記載の方法。
  11. 【請求項１１】 上記タンパク質発現の特異的なレベルが、正常な患者、及
    び減少したランゲルハンス島またはβ細胞機能を有する患者では観察されず、両
    群の患者が上記試薬で治療されていない、請求項１０記載の方法。
  12. 【請求項１２】 上記パラダイムが、痩せた同腹子と共に、ob/ob、db/db、
    agouti、fat、fa/faのような遺伝学的ミューテーションの結果としてインスリン
    非依存性糖尿病のモデルである動物に基づく、請求項１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 上記パラダイムが、ランゲルハンス島またはβ細胞機能不
    全が食餌療法によって悪化している動物に基づく、請求項１記載の方法。
  14. 【請求項１４】 上記パラダイムが、減少したタンパク質の食餌を摂取した
    妊娠した動物の子孫に基づく、請求項１記載の方法。
  15. 【請求項１５】 離乳後に子孫に摂取された食餌が、さらに高脂肪の食餌で
    ある、請求項１４記載の方法。
  16. 【請求項１６】 上記パラダイムが、通常の研究室の食餌で糖尿病に罹患す
    るが、天然の食餌では正常な血糖値を維持するトゲネズミまたはスナネズミのよ
    うな砂漠の齧歯類に基づく、請求項１記載の方法。
  17. 【請求項１７】 上記パラダイムが、ランゲルハンス島またはβ細胞重量に
    おける性的な選択的差異を有する動物に基づく、請求項１記載の方法。
  18. 【請求項１８】 上記パラダイムが、ランゲルハンス島またはβ細胞重量に
    おける差異を示すC57BI/6及びC57BI/Ksマウスのような緊密に関連した動物に基
    づく、請求項１記載の方法。
  19. 【請求項１９】 特異的なレベルのランゲルハンス島またはβ細胞重量また
    は機能が、妊娠した動物の食餌を改変することによって、または上記パラダイム
    における妊娠した動物と妊娠していない動物を比較することによって誘導される
    、請求項１記載の方法。
  20. 【請求項２０】 上記パラダイムにおいて、ランゲルハンス島またはβ細胞
    機能の特異的なレベルを有する患者が、正常な患者、及びランゲルハンス島また
    はβ細胞機能の減少したレベルを有する患者を含む、請求項１から１９のいずれ
    か一項記載の方法。
  21. 【請求項２１】 ランゲルハンス島またはβ細胞機能の減少したレベルが、
    インスリン非依存性糖尿病（２型糖尿病）、Ｘ症候群（インスリン抵抗性症候群
    ）または妊娠期間の糖尿病の結果である、請求項２０記載の方法。
  22. 【請求項２２】 上記パラダイムにおいて、ランゲルハンス島またはβ細胞
    機能の特異的なレベルを有する患者が、正常な患者、ランゲルハンス島またはβ
    細胞機能の正常なレベルより高いものを有する患者を含む、請求項１から２１の
    いずれか一項記載の方法。
  23. 【請求項２３】 上記患者におけるランゲルハンス島またはβ細胞機能の比
    較的高いレベルが、インスリン感作薬、食事制限、または運動での治療によって
    得られる、請求項２２記載の方法。
  24. 【請求項２４】 上記インスリン感作薬が、チアゾリジンジオンインスリン
    感作薬である、請求項２３記載の方法。
  25. 【請求項２５】 上記チアゾリジンジオンインスリン感作薬が、ロシグリタ
    ゾン(BRL 49653)である、請求項２４記載の方法。
  26. 【請求項２６】 インスリン感作薬が、PPARガンマ核レセプターのアゴニス
    トまたは部分的アゴニストとして機能する非チアゾリジンジオンである、請求項
    ２３記載の方法。
  27. 【請求項２７】 上記インスリン感作薬が、β3-アドレノセプターアゴニス
    トまたはレプチンである、請求項２３記載の方法。
  28. 【請求項２８】 ランゲルハンス島またはβ細胞機能の正常なレベルより高
    いものを有する患者が、妊娠した動物である、請求項２２記載の方法。
  29. 【請求項２９】 上記患者におけるランゲルハンス島またはβ細胞機能の比
    較的高いレベルが、インスリン分泌性ペプチドまたは薬剤の投与によって得られ
    る、請求項２２記載の方法。
  30. 【請求項３０】 上記インスリン分泌性剤が、GLP-1または安定なGLP-1類似
    体またはエキセンジン４である、請求項２９記載の方法。
  31. 【請求項３１】 上記インスリン分泌性剤が、さらにインスリン生産及び／
    またはランゲルハンス島の生成を刺激する、請求項２３または２４記載の方法。
  32. 【請求項３２】 上記パラダイムが、上記関連組織またはそのタンパク質含
    有抽出物で実施される二次元ゲル電気泳動を使用して確立される、請求項１から
    ３１のいずれか一項記載の方法。
  33. 【請求項３３】 さらに、上記方法において同定された特異的に発現される
    タンパク質を単離する工程を含む、請求項１から３２のいずれか一項記載の方法
    。
  34. 【請求項３４】 さらに、上記単離されたタンパク質を特徴付けする工程を
    含む、請求項３３記載の方法。
  35. 【請求項３５】 上記特異的に発現されたタンパク質が、POM6, POM7, POM8
    , POM9, POM10, POMT1, POMT2, POMT3, POMT4, POMT5, POMT11, POMT12, POMT13
    , PSEM14及びPSEM15の一つ以上を含む、請求項１から３４のいずれか一項記載の
    方法。
  36. 【請求項３６】 さらに、上記タンパク質の特異的結合パートナーについて
    のアッセイにおいて上記タンパク質を使用することを含む、請求項３４記載の方
    法。
  37. 【請求項３７】 さらに、上記タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニス
    トについてスクリーニングするアッセイにおいて上記タンパク質を使用すること
    を含む、請求項３４記載の方法。
  38. 【請求項３８】 上記薬剤またはタンパク質が、高スループットスクリーニ
    ング法を使用してスクリーニングされる、請求項１から３７のいずれか一項記載
    の方法。
  39. 【請求項３９】 請求項１から３８のいずれか一項記載の方法を使用して薬
    剤を同定する工程、さらに、上記薬剤を製造する工程、許容可能なキャリアーと
    それを製剤化して製薬組成物を提供する工程を含む、製薬組成物の調製方法。
  40. 【請求項４０】 POM6, POM7, POM8, POM9, POM10, POMT1, POMT2, POMT3,
    POMT4, POMT5, POMT11, POMT12, POMT13, PSEM14及びPSEM15から選択される、医
    学的治療方法における使用のためのタンパク質。
  41. 【請求項４１】 ランゲルハンス島またはβ細胞機能不全によって特徴付け
    される疾患の治療のための医薬の調製のための、請求項１から３８のいずれか一
    項記載の方法によって同定された薬剤の使用。
  42. 【請求項４２】 上記疾患が、インスリン非依存性糖尿病（２型糖尿病）、
    Ｘ症候群（インスリン抵抗性症候群）、または妊娠期間の糖尿病である、請求項
    ４１記載の使用。
  43. 【請求項４３】 上記薬剤が、POM6, POM7, POM8, POM9, POM10, POMT1, PO
    MT2, POMT3, POMT4, POMT5, POMT11, POMT12, POMT13, PSEM14及びPSEM15から選
    択されるタンパク質である、請求項４１または４２記載の使用。
  44. 【請求項４４】 患者に対して、請求項１から３８のいずれか一項記載の方
    法によって同定された上記薬剤の治療上または予防上の有効量を投与することを
    含む、患者におけるランゲルハンス島またはβ細胞機能不全によって特徴付けさ
    れる疾患の治療方法。
  45. 【請求項４５】 上記ランゲルハンス島またはβ細胞機能不全が、インスリ
    ン非依存性糖尿病または２型糖尿病、Ｘ症候群またはインスリン抵抗性症候群、
    あるいは妊娠期間の糖尿病の結果である、請求項４４記載の方法。
  46. 【請求項４６】 (a)少なくとも一つのタンパク質が、特異的なレベルのラ
    ンゲルハンス島またはβ細胞機能を有する患者から得た関連組織、または上記患
    者の代表的な関連組織において特異的に発現するというパラダイムを確立する工
    程； (b)上記患者から上記組織のサンプルを得る工程；並びに (c)上記サンプルにおける特異的に発現するタンパク質の存在、不存在または発
    現の度合いを測定する工程；並びに (d)上記測定値と臨床上の情報の間の従前の相関関係を参考にして、ランゲルハ
    ンス島またはβ細胞機能の性質または度合いについて測定値を関連させる工程；
    を含む、ヒトまたは動物患者におけるランゲルハンス島またはβ細胞機能不全の
    性質または度合いを測定する方法。
  47. 【請求項４７】 上記サンプルが、組織サンプルまたは体液サンプルまたは
    尿である、請求項４６記載の方法。
  48. 【請求項４８】 上記パラダイムにおいて、少なくとも４のタンパク質が特
    異的に発現され、ランゲルハンス島またはβ細胞機能不全の性質または度合いの
    複数のタンパク質のフィンガープリントを提供する、請求項４７または４８記載
    の方法。
  49. 【請求項４９】 さらに、ランゲルハンス島またはβ細胞機能不全を治療す
    るための有効な治療を決定することを含む、請求項４６から４８のいずれか一項
    記載の方法。
  50. 【請求項５０】 ランゲルハンス島またはβ細胞機能不全の状態における一
    つ以上の特異的に発現されるタンパク質の発現を、正常な状態で見出されるもの
    に回復し、糖尿病に罹患する前の患者におけるインスリン非依存性糖尿病の罹患
    を防止する薬剤の使用による治療方法。
  51. 【請求項５１】 ランゲルハンス島またはβ細胞機能不全を有する患者の組
    織サンプルまたは体液サンプルまたは尿中の特異的に発現されるタンパク質のパ
    ターンを使用して、ランゲルハンス島またはβ細胞機能不全の状態を改善する最
    も適切で有効な治療を予測し、上記治療の成功をモニターする方法。
  52. 【請求項５２】 上記ランゲルハンス島またはβ細胞機能不全の状態が、イ
    ンスリン非依存性糖尿病または２型糖尿病である、請求項５１記載の方法。
  53. 【請求項５３】 (a)3mm×180mmのアクリルアミドポリマーの非直線状固定
    化pH勾配（IPG)断片を準備する工程； (b)尿素(8M)、3-[(コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホナ
    ート（CHAPS、2%w/v）、ジチオエリスリトール（DTE、10mM）、pH3.5から10の酸
    及び塩基の混合物(2%w/v)、及び微量のBromophenol Blueの水溶液を25ml含むカ
    セットに、上記IPG断片を再水和する工程； (c)上記カセットから液体を除き、湿った電極芯、電極、及びサンプルカップを
    備えた電気泳動トレーに上記断片を移し、上記断片とカップを低粘度のパラフィ
    ン油で覆う工程； (d)上記IPG断片の陰極末端で、サンプルカップに、尿素(8M)、CHAPS(4%w/v)、Tr
    is(40mM)、DTE(65mM)、SDS(0.05%w/v)、及び微量のBromophenol Blue中で、関連
    生体組織の乾燥粉末化し材料の水溶液の２００マイクログラムを適用する工程； (e)３時間で300から3500Vまで直線状に増加させ、その後さらに３時間3500Vとし
    、その後pI依存性最終地点に上記断片中で上記タンパク質が移動するのに十分な
    時間5000Vとした電圧で、ゲル上で等電点電気泳動を実施する工程； (f)Tris-HCl(50mM)pH6.8、尿素(6M)、グリセロール(30%v/v)、SDS(2%w/v)及びDT
    E(2%w/v)を含む100mlの水溶液で１２分間、トレー内で上記断片を平衡化する工
    程； (g)５分間この溶液を、Tris-HCl(50mM)pH6.8、尿素(6M)、グリセロール(30%v/v)
    、SDS(2%w/v)、ヨードアセタミド(2.5%w/v)、及び微量のBromophenol Blueを含
    む100mlの水溶液によって置換する工程； (h)リーディングバッファーとして、Tris-HCl(0.375M)pH8.8中のTEMED(0.5%w/v)
    、過硫酸アンモニウム(0.1%w/v)、及びチオ硫酸ナトリウム(5mM)の存在下で重合
    した、アクリルアミド／ピペラジン−ジアクリリル架橋剤(9-16%T/2.6%C)の160
    ×200×1.5mmの縦勾配スラブゲルを準備する工程； (i)約２時間sec-ブタノールで上記ゲルを浸し、この液を除去し、それを水と置
    換する工程； (j)陽極末端から6mmと陰極末端から14mmを除去して、二次元電気泳動のために適
    したサイズにIPGゲル断片を切断する工程；並びに (k)リーディングバッファーとして、アガロース(0.5%w/v)及びTris-グリシン-SD
    S(25mM-198mM-0.1%w/v)の水溶液でスラブゲルを浸し、７０℃に加熱し、この浸
    した溶液を通じてスラブゲル上に上記IPGゲル断片を乗せる工程； (l)8-12℃で５時間40mAの一定電流で、二次元電気泳動を実施する工程；並びに (m)ゲルを洗浄する工程； を含む、特異的なレベルのランゲルハンス島またはβ細胞機能不全を有する患者
    から得た関連組織、または上記患者の代表的な関連組織において特異的に発現さ
    れるタンパク質で、上述の組織またはそのタンパク質含有抽出物で実施される二
    次元ゲル電気泳動によって入手可能であるタンパク質。
  54. 【請求項５４】 上記タンパク質が、POM6, POM7, POM8, POM9, POM10, POM
    T1, POMT2, POMT3, POMT4, POMT5, POMT11, POMT12, POMT13, PSEM14及びPSEM15
    から選択される、請求項５３記載のタンパク質。
  55. 【請求項５５】 表２に示された一つ以上の同定特性を有する特異的に発現
    されるタンパク質。
  56. 【請求項５６】 同定特性が、ｐＩ及びＭｗである、請求項５５記載のタン
    パク質。
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