JP2003503063A

JP2003503063A - サイクリックａｍｐホスホジエステラーゼイソ型およびその使用方法

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Publication number: JP2003503063A
Application number: JP2001506843A
Authority: JP
Inventors: シャオナン・シン; アクセル・ウンターベック; インヘ・フ
Original assignee: Memory Pharmaceuticals Corp
Current assignee: Memory Pharmaceuticals Corp
Priority date: 1999-06-25
Filing date: 2000-06-23
Publication date: 2003-01-28
Also published as: MXPA02000293A; EP1190070A1; AU781519B2; AU5886400A; CA2377484A1; WO2001000851A1; US20040185465A1; US6656717B1

Abstract

(57)【要約】ヒトおよびラットのｃＡＭＰホスホジエステラーゼイソ型（ＰＤＥ４Ｄと称する）並びにそのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）が開示される。また、疾患を検出する手段として、本発明のポリペプチドレベルの変化を検出するために本発明のポリペプチドをコードする核酸配列中の変異を同定する診断アッセイに本発明のポリペプチドを利用する方法、およびニューロン中のサイクリックＡＭＰを上昇させ、それによって長期記憶の喪失などの神経学的疾患を完全に予防しないまでも治療する手段として、本明細書に開示したＰＤＥ４Ｄ（ＰＤＥ４Ｄ６と称する）に対する潜在的なモデュレーター、とりわけインヒビターをスクリーニングする方法も開示される。本明細書に開示するポリペプチドを発現するトランスジェニック動物もまた記載される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、新規に同定されたポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドによって
コードされるポリペプチド、該ポリヌクレオチドおよび該ポリペプチドの使用、
および該ポリヌクレオチドおよび該ポリペプチドの製造に関する。さらに詳細に
は、本発明のポリペプチドは、哺乳動物、とりわけヒト、ラットおよびマウスに
由来し、とりわけ脳、たとえば海馬や他の記憶に関連する領域から得られたｃＡ
ＭＰ（環状アデノシン５'−一リン酸）ホスホジエステラーゼおよびその断片で
ある。ヒトおよびラットの両イソ型を本明細書で詳細に開示する。本発明による
方法は、該ポリペプチドの診断アッセイにおける使用、および潜在的な治療剤の
スクリーニングのための使用、並びに他の潜在的な使用を開示するものである。

【０００２】（背景技術）ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、種々の環状ヌクレオシド一リン酸（ｃＡ
ＭＰを含む）の加水分解を触媒する酵素のファミリーである。これら環状ヌクレ
オチドは細胞内で二次メッセンジャーとして作用することがわかっており、二次
メッセンジャーは種々のホルモンや神経伝達物質が結合した細胞表面レセプター
からインパルスを運ぶ。ホスホジエステラーゼの作用は、これら環状ヌクレオチ
ドのメッセンジャーとしての役割が完了したときに該環状ヌクレオチドを分解す
ることである（それによって細胞内での環状ヌクレオチドレベルを制御し、環状
ヌクレオチドのホメオスタシスを保持する）。

【０００３】そのようなホスホジエステラーゼの幾つかの異なるファミリーが同定されてお
り、主たるファミリーはＰＤＥ４と呼ばれ、種々の動力学特性によって区別され
る（ｃＡＭＰに対する低いミカエリス定数およびある種の薬剤に対する感受性な
ど）［Wangら、Expression, Purification and Characterization of human cAM
P-Specific Phosphodiesterase (PDE4) Subtypes A, B, C and D, Biochem. Bio
phys. Res. Comm., 234, 320-324 (1997)を参照］。ＰＤＥは明確な生化学的特
性を有することがわかっているので、様々な異なる形態の制御を受けるであろう
ことが考えられる。

【０００４】本発明に従って開示するホスホジエステラーゼは、哺乳動物においてイソ酵素
（同じ酵素ポリペプチドの異なる分子形態）の形態で存在する。これらホスホジ
エステラーゼ（ＰＤＥ４Ｄと称する）は細胞のサイトゾルに局在し、いかなる既
知の膜構造とも結合していない。ＰＤＥ４Ｄイソ酵素はｃＡＭＰを特異的に分解
し、抗鬱剤（たとえば、ロリプラム）などの医薬のための共通する標的である。
また、ＰＤＥ４イソ酵素のインヒビターは強力な抗炎症剤であり、喘息治療薬と
しても有用である。

【０００５】（発明の開示）（発明が解決しようとする技術的課題）過去において、そのようなタンパク質は一般に非常に低濃度で存在するうえ精
製に際して不安定な傾向を示したことから、その単離は困難であることが判明し
ている［Salanovaら、Heterologous Expression and Purification of Recombin
ant Rolipram-Sensitive Cyclic AMP-Specific Phosphodiesterases, Methods:
A Comparison to Methods in Enzymology 14, 55-64 (1998)を参照］。

【０００６】ＰＤＥ４のイソ酵素のクローニングは、哺乳動物が４つまでのＰＤＥ４遺伝子
を有し、これはラット、マウスおよびヒトに当てはまることを示した。さらに、
そのような各遺伝子は幾つかの異なるタンパク質変異体をコードすることがわか
った。それゆえ、各ＰＤＥ４遺伝子は少なくとも２つまたはそれ以上のポリペプ
チドをコードすることがわかった。この多様なＰＤＥ４の形態の生理的役割は、
組換えＤＮＡ技術の到来およびこれら酵素の様々なポリペプチド形態をクローニ
ングするｃＤＮＡの使用により理解され始めている。そのような方法は、たとえ
ば抗炎症活性を有する薬剤のスクリーニングを首尾よく行ううえで必須である。

【０００７】（その解決方法）本発明は、ホスホジエステラーゼ活性を有するかまたは有せず、全体の配列の
一部に新規なアミノ酸配列を有する、新規なポリペプチドに関する。本発明はま
た、そのようなポリペプチドをコードする新規なｃＤＮＡクローン、およびゲノ
ム内に含まれそのような新規なポリペプチド配列をコードするＤＮＡの配列に関
する。本発明はまた、本明細書に開示する新規なポリペプチドの発現を可能にするポ
リヌクレオチドを含む新規な細胞および細胞株に関する。

【０００８】本発明の一つの目的は、そのような細胞株の製造方法であって、本発明の新規
なＤＮＡ配列を、本明細書に開示する新規な配列を含むポリペプチドを発現する
細胞に細胞を形質転換するのに用いることのできるベクターに導入することによ
る方法を提供することである。そのようなポリペプチドは、しばしばホスホジエ
ステラーゼ活性を有し、形質転換した細胞内のｃＡＭＰレベルに影響を及ぼして
ｃＡＭＰレベルがそのような細胞内のホスホジエステラーゼレベルの指標を提供
するであろう。

【０００９】本発明の目的はさらに、本明細書に開示した新規なＤＮＡを含むそのようなベ
クター、およびそのような新規なＤＮＡによってコードされたポリペプチドを発
現しうる遺伝的に形質転換した細胞を提供することである。脳ではニューロン内のｃＡＭＰレベルが、記憶、とりわけ長期記憶の優良性と
関係があると思われる。それゆえ、ＰＤＥ４ＤはｃＡＭＰを分解するので、この
酵素のレベルは動物、たとえばヒトにおいて記憶に影響を及ぼすであろう。

【００１０】それゆえ、本発明の他の目的は、本明細書に開示した新規ポリペプチドのレベ
ルを、疾患状態またはそのような疾患状態に対する罹病性の存在（とりわけ、そ
のような疾患状態が記憶、とりわけ長期記憶の喪失が関与するものである場合）
を決定するための手段としてモニターすることである。それゆえ、本発明のさらに他の目的は、細胞、とりわけ脳細胞中に存在する新
規なＤＮＡ配列を提供することであり、そのような新規なＤＮＡ配列は該ＤＮＡ
配列中の変異の存在を明らかにすることのできるプローブのための標的として役
立てることができ、それによって、かかる変異の存在は本明細書に開示する新規
なホスホジエステラーゼの過剰なまたは過小な活性の可能な原因を示すものとな
る。

【００１１】本発明のさらなる目的はまた、本明細書に開示するホスホジエステラーゼポリ
ペプチドの作用を阻害する能力について潜在的な化学薬剤（小さい分子であるか
またはそうでない分子）をスクリーニングする手段として本明細書に開示する形
質転換した細胞を用いる方法を提供することであり、それによって、疾患、たと
えば記憶、とりわけ長期記憶の障害の治療のための新規な治療剤、または、おそ
らく既に存在する疾患に付随する二次的な状態などのそのような状態に先立って
用いる予防剤を提供することである。

【００１２】最後に、本発明のさらなる目的は、ゲノム中に本発明のＰＤＥ４Ｄ６のヒトイ
ソ型をコードする遺伝子が１またはそれ以上のコピーにて挿入されたトランスジ
ェニック動物、とりわけトランスジェニックマウスであって、特に該遺伝子が対
応イソ型をコードするマウス遺伝子を置換しているもの、さらにはそのようなヒ
ト化の効果が該マウスでのヒトＰＤＥ４Ｄ６イソ型の過剰産生であるものを提供
することである。本発明はまた、ＰＤＥ４Ｄ６イソ型の遺伝子が非機能性になっ
てＰＤＥ４Ｄ６ホスホジエステラーゼを産生できない「ノックアウト」動物、と
りわけ「ノックアウト」マウスの製造にも関する。それゆえ、そのようなマウス
は、本発明に従って開示されるＰＤＥ４Ｄ６イソ型の過剰産生または産生されな
いことの効果を調べる手段を提供する。

【００１３】本発明は、ヒトおよびラットについてそれぞれ配列番号２および４に示す新規
なアミノ酸配列を含むオリゴペプチドおよびポリペプチド、およびそのようなポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド、たとえば配列番号１および３にそれ
ぞれ示すポリヌクレオチド配列、並びにそのようなポリペプチドのセグメント、
断片、アナログおよび誘導体に関する。

【００１４】配列番号２または４のポリペプチドに言及するときの「断片」、「誘導体」お
よび「アナログ」なる語は、そのようなポリペプチドと本質的に同じ生物学的機
能または活性（抗体と反応する能力を含む）を保持しているポリペプチドを意味
する。それゆえ、アナログにはプロタンパク質部分が開裂して活性な成熟ポリペ
プチドを産生することにより活性化されうるプロタンパク質が含まれる。そのよ
うな断片、誘導体およびアナログは、天然ポリペプチドの活性が保持されるよう
に配列番号２および４のポリペプチドに対して充分な類似性を有していなければ
ならない。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成
ポリペプチドであってよいが、組換えポリペプチドが好ましい。

【００１５】配列番号２および４のポリペプチドの断片、誘導体またはアナログは、（i）
１またはそれ以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは
保存アミノ酸残基）で置換されており、そのように置換されたアミノ酸残基が遺
伝暗号によってコードされているかまたはコードされていないものであるもので
あるか、または（ii）１またはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を有するもので
あるか、または（iii）成熟ポリペプチドが他の化合物、たとえば該ポリペプチ
ドの半減期を長くする化合物（たとえば、ポリエチレングリコール）に融合した
ものであるか、または（iv）一般に形質転換細胞などの細胞からの分泌を受ける
ように遺伝子工学により製造した形態のタンパク質を製造する目的で、リーダー
配列や分泌配列または成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製に用
いる配列などのさらなるアミノ酸配列を成熟ポリペプチドに融合したものであっ
てよい。そのような断片、誘導体およびアナログは、本明細書の教示に基づいて
当業者の範囲内にあると思われる。

【００１６】本発明のポリペプチドは好ましくは単離された形態で提供され、均一となるま
で精製してよく、最も一般的には当業者によく知られた多くのそのような発現系
のいずれかを用いて組換え発現により製造されるであろう。「単離された」なる語は、材料がその元の環境（それが天然に存在する場合に
は天然の環境）から取り出されることを意味する。たとえば、生きた動物に存在
する天然のポリペプチドは単離されないが、天然の系で幾つかのまたは全ての共
存する材料から分離した同ポリペプチドは単離される。そのようなポリペプチド
は組成物の一部になるであろうし、そのような組成物がその天然環境の一部では
ない点で単離されうるであろう。

【００１７】本発明のポリペプチドは、配列番号２および４のポリペプチド（とりわけ成熟
ポリペプチド）、並びにこれらポリペプチドに対して様々な程度の配列ホモロジ
ーを有する（そのようなオリゴペプチドまたはポリペプチドが、配列番号５の新
規な１５−ｍｅｒ配列に相同である配列を含む限りにおいて）ポリペプチドを包
含する。本発明のポリペプチドの断片または部分は、ペプチド合成によって対応の完全
長ポリペプチドを製造するために用いることができる。それゆえ、これら断片は
完全長ポリペプチドを製造するための中間体として用いることができる。本発明
のポリヌクレオチドの断片または部分は、本発明の完全長ポリヌクレオチドを合
成するために用いることができる。

【００１８】さらに詳細には、本発明のポリペプチドは、配列番号２および４のＮ末端の１
５アミノ酸（Ｎ末端１５−ｍｅｒ）の配列を有し配列番号５としても示す少なく
とも１５のアミノ酸の切れ目のない配列（以下、「新規な１５−ｍｅｒ（配列番
号５）」または一般的に用いるときは単に「１５−ｍｅｒ」という）を含む、単
離したポリペプチドおよびその断片を包含する。

【００１９】本発明に従って開示した新規な１５−ｍｅｒを含むそのようなポリペプチドお
よびその断片に加えて、１５−ｍｅｒ（すなわち、長さが１５アミノ酸残基の切
れ目のない配列）を含むポリペプチドおよびその断片であって、そのような１５
−ｍｅｒが本明細書に開示した新規な１５−ｍｅｒに対するホモロジーを示すも
のもまた本発明の範囲内で開示される。それゆえ、本発明の範囲内のポリペプチ
ドおよびその断片は、１５−ｍｅｒアミノ酸配列（すなわち、１５の中断しない
アミノ酸の切れ目のないストレッチ）であって、該１５−ｍｅｒが本発明の新規
な１５−ｍｅｒ（配列番号５）に対して少なくとも６５％の同一性、好ましくは
８０％の配列同一性、最も好ましくは９５％の配列同一性を示すものを包含する
であろう。最も好ましくは、そのようなポリペプチドおよびその断片は新規な１
５−ｍｅｒ（配列番号５）を包含するであろう（たとえば、１５−ｍｅｒの残基
５はＡｓｎまたはＰｈｅであってよい）。

【００２０】本発明に従えば、配列に言及するときの「パーセント同一性」または「パーセ
ント同一」なる語は、比較すべき配列（「比較配列」）を記載したまたは特許請
求した配列（「参照配列」）とアラインメントさせた後に比較配列を参照配列と
比較することを意味する。ついで、パーセント同一性を以下の式に従って決定す
る：パーセント同一性＝１００［１−（Ｃ／Ｒ）］（上記式中、Ｃは参照配列と比較配列との間でアラインメントした長さにわたっ
ての参照配列と比較配列との間の差異の数であり、その際、（i）比較配列中に
アラインメントした対応塩基またはアミノ酸を有しない参照配列中の各塩基また
はアミノ酸、および（ii）参照配列中の各ギャップ、および（iii）比較配列中
のアラインメントした塩基またはアミノ酸とは異なる参照配列中のアラインメン
トした各塩基またはアミノ酸は差異を構成する；Ｒは比較配列とアラインメント
した長さにわたる参照配列中の塩基またはアミノ酸の数であり、参照配列中に導
入したギャップも一つの塩基またはアミノ酸として計算する）。

【００２１】上記のようにして計算したパーセント同一性が特定の最小パーセント同一性に
等しいかまたはそれ以上となる比較配列と参照配列との間のアラインメントが存
在するならば、たとえ上記のようにして計算したパーセント同一性が特定の最小
パーセント同一性よりも小さくなるアラインメントが存在したとしても、当該比
較配列は参照配列に対して当該特定の最小パーセント同一性を有する。上記のパーセント同一性またはパーセントホモロジーに関する記載は、ヌクレ
オチド配列およびアミノ酸配列に対して同じように適用することを意図するもの
である。

【００２２】本発明の範囲内のポリペプチドおよびその断片およびセグメントは、とりわけ
長さが配列番号２および４と同様であるかまたはその非常に大きな断片である場
合に、酵素活性、一般にホスホジエステラーゼ活性を有する。そのようなホスホ
ジエステラーゼはまた、その構造の一部として配列番号５の新規な１５−ｍｅｒ
に対するホモロジーまたは配列同一性を有するアミノ酸配列を含むであろう。そ
れゆえ、本発明の範囲内のホスホジエステラーゼは、一般に新規な１５−ｍｅｒ
（配列番号５）に対して少なくとも６５％の配列同一性、好ましくは８０％の配
列同一性、および最も好ましくは９５％または９７％の配列同一性を有するアミ
ノ酸の少なくとも一つの連続した配列を含み、そのようなホスホジエステラーゼ
の好ましい態様はそのアミノ酸配列内に新規な１５−ｍｅｒ（配列番号５）を含
むであろう。

【００２３】本発明の範囲内のポリペプチドおよびその断片またはセグメントはまた、本明
細書に開示した新規な１５−ｍｅｒ（配列番号５）の全１５アミノ酸未満のアミ
ノ酸の切れ目のないストレッチを含んでいてよい。それゆえ、本発明の範囲内の
ポリペプチドおよびその断片はまた、わずかに１０のアミノ酸の切れ目のない配
列（１０−ｍｅｒ）を含んでいてよく、該１０−ｍｅｒは本明細書に開示した新
規な１５−ｍｅｒ（配列番号５）内に完全に含まれる切れ目のない１０−ｍｅｒ
と同一である。好ましくは該ポリペプチドおよびその断片は、少なくとも１２−
ｍｅｒ、すなわち本発明により開示した新規な１５−ｍｅｒ内の切れ目のない配
列としても認められる１２のアミノ酸の切れ目のない配列を含むであろう。さら
に、最も好ましくは、ポリペプチドおよびその断片は、本明細書に開示した新規
な１５−ｍｅｒ（配列番号５）と同一の１５アミノ酸の切れ目のない配列を少な
くとも一つその配列内に含み、そのような１５−ｍｅｒは本発明の新規な１５−
ｍｅｒ（配列番号５）に対して１００％の配列同一性を示すであろう。

【００２４】本発明のポリペプチド（およびポリヌクレオチド）に関して使用する「セグメ
ント」なる語は、より大きな配列の部分集合である配列（すなわち、より大きな
配列内の残基の連続した切れ目のない配列）をいう。それゆえ、たとえば、配列
番号５の１５残基（本明細書において「新規な１５−ｍｅｒ」という）は各１０
残基の全部で６のセグメント（たとえば、１−１０、２−１１、３−１２、４−
１３、５−１４、および６−１５）を含むことができる。

【００２５】従って、配列番号５の新規な１５−ｍｅｒ内の部分集合のセグメントとして、
本発明のポリペプチドは配列番号５と少なくとも６５％同一、好ましくは８０％
同一、さらに好ましくは９５％同一、最も好ましくは１００％同一の配列を有す
る１５アミノ酸のセグメントを含むポリペプチドを包含する。別の態様において、本発明のポリペプチドは配列番号５内のセグメントを含む
ポリペプチドを包含し、該セグメントは少なくとも１０のアミノ酸、好ましくは
１２のアミノ酸、さらに好ましくは１４のアミノ酸、最も好ましくは１５のアミ
ノ酸（最後のものは配列番号５に等しい）を含む。

【００２６】さらに、本発明のポリペプチドおよびその断片は、いかなる種の動物の細胞ま
たは組織でも見出すことができるが、哺乳動物からの細胞、とりわけヒトの細胞
で見出されるのが好ましいであろう。いかなる所定の動物においてであれ、本発
明の範囲内のポリペプチドおよびその断片は、様々な組織、とりわけ神経系、特
に脳、たとえば海馬領域で見出すことができる。

【００２７】本発明はまた、新規なポリヌクレオチド、とりわけ動物の細胞で見出されるｍ
ＲＮＡに由来する新規なｃＤＮＡであって本発明のポリペプチドをコードするも
のをも包含する。本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡの形態かまたはＤＮＡの形
態であってよく、ＤＮＡとしてはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡが含
まれる。ＤＮＡは二本鎖であっても一本鎖であってもよく、一本鎖である場合は
コード鎖であっても非コード（アンチセンス）鎖であってもよい。成熟ポリペプ
チドをコードするコード配列は配列番号１または３に示すコード配列と同一であ
ってよく、または異なるコード配列であってよいが、該コード配列は遺伝暗号の
重複または縮重の結果として配列番号１または３のＤＮＡと同じ成熟ポリペプチ
ドをコードするものである。

【００２８】本発明のために用いる「ポリヌクレオチド」なる語は、該ポリペプチドのコー
ド配列のみを含むポリヌクレオチド、並びにさらなるコード配列および／または
非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本発明のポリヌクレオチド（配列番号１および３）は、ポリペプチドのアミノ
酸配列をコードするのに利用できるオープンリーディングフレームを含む。配列
番号１の配列については、配列番号２のポリペプチドをコードするオープンリー
ディングフレーム（ＯＲＦ）はヌクレオチド３５７−１９９１（ヌクレオチド１
９１２−１９１４は「ｔａａ」終止コドンを表す）であり、一方、ラットのイソ
型については、配列番号３の配列はヌクレオチド３３２−１８８２（ヌクレオチ
ド１８８３−１８８５は「ｔａａ」終止コドンを表す）にオープンリーディング
フレームを含む。

【００２９】本発明はさらに、配列番号２および４のアミノ酸配列を有するポリペプチドの
断片、アナログおよび誘導体をコードするそのようなポリヌクレオチドの変異体
に関する。ポリヌクレオチドの変異体はポリヌクレオチドの天然に存在するアレ
ル変異体であってよいし、またはポリヌクレオチドの天然に存在しない変異体で
あってよい。それゆえ、本発明は、上記に開示したポリヌクレオチドの全てをコードするポ
リヌクレオチドおよびその断片を包含するが、それらポリヌクレオチド内に配列
番号５の新規な１５−ｍｅｒの近接なホモログ、たとえば配列番号５の新規な１
５−ｍｅｒに対して少なくとも６５％の配列同一性を有する１５−ｍｅｒなどが
導入されていることを条件とする。本発明はまた、本明細書に開示した新規な１
５−ｍｅｒポリペプチド（配列番号５）をコードする新規なオリゴヌクレオチド
配列をも包含する。

【００３０】そのようなポリヌクレオチドは、配列番号１および３に示すコード配列の天然
に存在するアレル変異体であるコード配列を有していてよい。当該技術分野で知
られているように、アレル変異体は別の形のポリヌクレオチド配列であって、コ
ードされたポリペプチドの機能を実質的に変更することのない１またはそれ以上
のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有するものである。

【００３１】本発明はまた、成熟ポリペプチドのコード配列が、同じ読取り枠で宿主細胞か
らのポリペプチドの発現および分泌を助けるポリヌクレオチド配列、たとえば細
胞からのポリペプチドの輸送を制御する分泌配列やポリペプチドの細胞膜への結
合を容易にする膜貫通アンカーとして機能するリーダー配列に融合しているポリ
ヌクレオチドを包含する。リーダー配列を有するポリペプチドはプロタンパク質
であり、リーダー配列は宿主細胞によって開裂されてポリペプチドの成熟形を形
成する。ポリペプチドはまた、成熟タンパク質に加えてＮ−末端アミノ酸残基の
付加を有するプロタンパク質をコードしていてよい。プロ配列を有する成熟タン
パク質はプロタンパク質であり、タンパク質の不活性形である。プロ配列が開裂
されると活性な成熟タンパク質が残る。

【００３２】それゆえ、本発明のポリヌクレオチドは、たとえば、成熟タンパク質、プロ配
列を有するタンパク質、膜貫通アンカーを有するタンパク質、またはプロ配列、
プレ配列（リーダー配列）および膜貫通アンカーを有するポリペプチドをコード
していてよい。本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にする
マーカー配列にインフレームで融合したコード配列を有していてよい。マーカー
配列は、細菌宿主である場合にマーカーに融合した成熟ポリペプチドを精製する
ためにヘキサヒスチジンタグ（ｐＱＥ−９ベクターにより提供できる）であって
よいし、または、マーカー配列は、たとえば、哺乳動物宿主細胞、たとえばＣＯ
Ｓ−７細胞を用いる場合に赤血球凝集素（ＨＡ）タグであってよい。ＨＡタグは
、インフルエンザの赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する（
Wilson, I.ら、Cell, 37: 767 (1984)）。

【００３３】本明細書において「遺伝子」なる語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮ
Ａのセグメントを意味する。遺伝子は、コード領域に先行する領域および後続す
る領域（リーダーおよびトレーラー）並びに個々のコードセグメント（エクソン
）間の介在配列（イントロン）を含む。もちろん、ｃＤＮＡは対応イントロンを
欠失しているであろう。

【００３４】本発明の完全長ポリヌクレオチドの断片は、完全長ｃＤＮＡを単離するため、
および該遺伝子に対して高い配列類似性または同様の生物学的活性を有する他の
ｃＤＮＡを単離するためのｃＤＮＡライブラリーのためのハイブリダイゼーショ
ンプローブとして用いることができる。このタイプのプローブは少なくとも３０
塩基を有するのが好ましく、配列番号５に開示する新規な１５−ｍｅｒをコード
する配列に相同であろう。そのようなプローブはまた４５またはそれ以上の塩基
を有していてよく、この場合も配列番号５の新規な１５−ｍｅｒまたは本発明の
範囲内のその変異体をコードする配列に相同な配列を含むであろう。遺伝暗号の
縮重のため、多くのそのような配列が本明細書に開示する新規な１５−ｍｅｒを
コードする配列に相同であると認められるであろう。そのような配列のセットは
また、それ自体、新規な１５−ｍｅｒ（配列番号５）に相同なアミノ酸配列をコ
ードする配列を含むであろう。

【００３５】本発明のポリヌクレオチド、とりわけ本明細書に開示する新規な１５−ｍｅｒ
（配列番号５）をコードするポリヌクレオチドはまた、とりわけ疾患状態におい
て生じる変異が過剰量の細胞内ホスホジエステラーゼ活性と関係する場合に、該
配列の可能な変異の研究のための部位としても利用できる。それゆえ、新規な１
５−ｍｅｒをコードするポリヌクレオチド配列は、疾患のリスクにあると思われ
るかまたはそのような疾患を患っている可能性のある動物のゲノムをプローブす
るのに用いることのできる、おそらく３０〜４５ヌクレオチドまたはそれより長
いプローブを開発するための指標として機能する。このことは、そのような疾患
がそのような動物、たとえばラットやマウス、とりわけヒトの細胞内のｃＡＭＰ
レベルの変化に関与している場合、さらには、そのような変化が脳のニューロン
内、とりわけ長期記憶などの記憶に関連する脳の領域、たとえば海馬領域で生じ
ている場合に当てはまる。それゆえ、そのようなヌクレオチドのストレッチは、
そのような疾患、とりわけ記憶、特に長期記憶の喪失が関与する疾患の可能な原
因を特定するプローブの結合部位として機能するであろう。

【００３６】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクター
で遺伝子操作した宿主細胞（とりわけ、そのような細胞がＰＤＥ−４Ｄ、特にＰ
ＤＥ−４Ｄ６の活性をアッセイするのに用いることのできる細胞株となる場合）
、および組換え法による本発明のポリペプチドの製造にも関する。

【００３７】宿主細胞、好ましくはスポドプテラ（Spodoptera）種の昆虫細胞、特にＳＦ９
細胞を本発明のベクター（たとえば、クローニングベクターまたは発現ベクター
であってよい）、とりわけバキュロウイルスで遺伝子操作（形質導入または形質
転換またはトランスフェクション）する。そのようなベクターとしては、プラス
ミド、ウイルスなどが挙げられる。このようにして遺伝子操作した細胞を、プロ
モーターを活性化するため、形質転換体を選択するため、あるいは本発明の遺伝
子を増幅するために適当に改変した通常の栄養培地で培養する。温度やｐＨなど
の培養条件は、発現のために選択した宿主細胞で従来用いられているものであり
、当業者には明らかであろう。

【００３８】本発明のポリヌクレオチドは組換え法によりポリペプチドを製造するのに用い
ることができる。それゆえ、たとえば、ポリヌクレオチドはポリペプチドを発現
させるための様々な発現ベクターのいずれかに含まれていてよい。そのようなベ
クターとしては、染色体配列、非染色体配列および合成ＤＮＡ配列が挙げられ、
たとえば、ＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイ
ルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮＡとの組み合せから得られた
ベクター、ウイルスＤＮＡ、たとえばワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏
痘ウイルス、および偽狂犬病ウイルスが挙げられる。しかしながら、宿主細胞内
で複製および生存できる限り、いかなる他のベクターも用いることができる。

【００３９】適当なＤＮＡ配列のベクター中への挿入は様々な方法により行うことができる
。一般に、ＤＮＡ配列は当該技術分野で知られた方法により適当な制限エンドヌ
クレアーゼ部位に挿入される。そのような方法および他の方法は当業者の範囲内
であると思われる。発現ベクター中のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を指令する適当な発現制御配列
（プロモーター）に作動可能に連結される。そのようなプロモーターの代表例と
しては、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌のｌａｃまたはｔｒｐプロ
モーター、ファージラムダのＰ_Ｌプロモーター、原核細胞または真核細胞または
それらのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモー
ターが挙げられる。発現ベクターはまた、翻訳を開始するためのリボソーム結合
部位および転写ターミネーターをも含む。ベクターはまた、発現を増幅するため
の適当な配列をも含んでいてよい。

【００４０】さらに、発現ベクターは、形質転換した宿主細胞の選択のための表現型特性を
提供する１またはそれ以上の選択マーカー、たとえば真核細胞の培養ではジヒド
ロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、または大腸菌ではテトラサイクリ
ンまたはアンピシリン耐性の遺伝子を含んでいるのが好ましい。上記に記載した適当なＤＮＡ配列および適当なプロモーター配列または制御配
列を含むベクターを用いて適当な宿主細胞を形質転換し、宿主細胞にタンパク質
を発現させる。そのような形質転換は永久的なものであるため、さらなる試験に
用いることのできる細胞株を生じる。そのような試験に用いる細胞株は、一般に
、変化するホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ４Ｄ）活性の指標としてｃＡＭＰレベ
ルをモニターする哺乳動物細胞であろう。

【００４１】適当な宿主細胞の代表例としては、細菌細胞、たとえば大腸菌、ストレプトミ
セス（Streptomyces）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimuri
um）；真菌細胞、たとえば酵母；昆虫細胞、たとえばドロソフィラ（Drosophila
）Ｓ２およびスポドプテラＳｆ９（および他の昆虫発現系）；動物細胞、たとえ
ばＣＨＯ、ＣＯＳまたはバウズ（Bowes）黒色腫；アデノウイルス；植物細胞な
どが挙げられる。適当な宿主細胞の選択は、本明細書の教示に基づいて当業者の
知見の範囲内であると思われる。

【００４２】さらに詳細には、本発明は上記に広く記載した１またはそれ以上の配列を含む
組換え構築物をも包含する。そのような構築物は、プラスミドまたはウイルスベ
クターなどのベクターを含み（とりわけバキュロウイルス／ＳＦ９ベクター／発
現系を用いる場合）、該ベクター中には本発明の配列が順方向または逆方向で挿
入されている。本発明の好ましい態様において、そのような構築物はさらに、本
発明の配列に作動可能に連結した、たとえばプロモーターを含む制御配列を含む
。多数の適当なベクターおよびプロモーターが当業者に知られており、市販され
ている。以下のプロモーターは例として挙げるものである：細菌性のもの：ｐＱ
Ｅ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Qiagen）、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓ
ｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＢＳＫＳ、ｐ
ＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Stratagene）；ｐＴＲ
Ｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（
Pharmacia）；真核細胞性のもの：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４
、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Stratagene）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶ
Ｌ（Pharmacia）。しかしながら、宿主細胞内で複製および生存できる限り、い
かなる他のプラスミドまたはベクターも用いることができる。

【００４３】プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベ
クターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて所望の遺伝子から選択
することができる。２つの適当なベクターは、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７
である。個々の名前の細菌プロモーターとしては、ｌａｃ１、ｌａｃＺ、Ｔ３、
Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰ_Ｒ、Ｐ_Ｌおよびｔｒｐが挙げられる。真核細胞プロモー
ターとしては、ＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４
０、レトロウイルスからのＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン１が挙げられ
る。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者のレベルの範囲内であ
る。

【００４４】さらなる態様において、本発明は上記構築物を含有する宿主細胞に関する。宿
主細胞は高等真核細胞、たとえば哺乳動物細胞、または低級真核細胞、たとえば
酵母であってよいし、または宿主細胞は原核細胞、たとえば細菌細胞であってよ
い。宿主細胞中への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、
ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーシ
ョンにより行うことができる（Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Met
hods in Molecular Biology, (1986)）。好ましい態様では、昆虫細胞、とりわ
けスポドプテラ・フルジペルダからのＳＦ９細胞からの発現を利用する。宿主細胞中の構築物は、常法により用いて組換え配列によりコードされる遺伝
子産物を産生させることができる。別法として、本発明のポリペプチドは通常の
ペプチド合成機により合成して製造することができる。

【００４５】成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌または他の細胞中、適当なプロ
モーターの制御下で発現させることができる。本発明のＤＮＡ構築物から得たＲ
ＮＡを用い、そのようなタンパク質を製造するために無細胞翻訳系も用いること
ができる。原核宿主細胞および真核宿主細胞で使用する適当なクローニングベク
ターおよび発現ベクターは、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Ma
nual、第２版、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク(1989)、Wuら、
Methods in Gene Biotechnology (ＣＲＣプレス、ニューヨーク、ニューヨーク
、1997)、Recombinant Gene Expression Protocols, in Methods in Molecular
Biology, Vol. 62, (Tuan編、ヒューマナ・プレス、トトワ、ニュージャージー
、1997)、およびCurrent Protocols in Molecular Biology, (Ausabelら編)、ジ
ョン・ウィリー・アンド・サンズ、ニューヨーク(1994-1999)（その全体を参照
のため本明細書に引用する）に記載されている。

【００４６】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、ベク
ターにエンハンサー配列を挿入することにより増大する。エンハンサーは通常、
約１０〜３００ｂｐのシス作動性のＤＮＡ配列であり、プロモーターに作用して
その転写を増大させる。例としては、複製起点の１００〜２７０ｂｐ後期側にあ
るＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサ
ー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエ
ンハンサーが挙げられる。

【００４７】一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製起点お
よび選択マーカーの領域、たとえば、大腸菌およびサッカロミセス・セレビシエ
（S. cerevisiae）Ｔｒｐ１遺伝子由来のアンピシリン耐性遺伝子、下流の構造
配列の転写を指令する高度発現遺伝子に由来するプロモーターを含んでいるであ
ろう。そのようなプロモーターは、とりわけ解糖系酵素、たとえば３−ホスホグ
リセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、α−因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショ
ックタンパク質をコードするオペロンに由来するものであってよい。異種の構造
配列を翻訳開始および終止配列と適当な相にあるように並べることができ、好ま
しくは翻訳タンパク質をペリプラスム間隙または細胞外環境に分泌するのを指令
することのできるリーダー配列を並べることができる。場合によっては、異種配
列は、所望の特性、たとえば発現された組換え産物の安定性または簡単化された
精製を付与するＮ−末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードしていてよ
い。

【００４８】バキュロウイルスをベースにした発現系の使用は、本明細書に開示した組換え
体を生成するのに好ましく便利な方法である。バキュロウイルスは、主として昆
虫に感染するＤＮＡウイルスの大きなファミリーを代表する。原型はオートグラ
ファ・カリフォルニカ（Autograph californica）に由来する核多角体病ウイル
ス（ＡｃＭＮＰＶ）であり、これは幾つかの鱗翅種に感染する。バキュロウイル
ス系の一つの利点は、組換えバキュロウイルスがインビボで産生できることであ
る。移送プラスミドとともに同時トランスフェクションした後、大抵の子孫は野
生型を示す傾向があり、その後の処理の大部分はスクリーニングが関与したもの
となる。プラークの同定を助けるため、欠失変異を利用した特別の系を利用でき
る。

【００４９】非限定的な例として、組換えＡｃＭＮＰＶ誘導体（ＢａｃＰＡＫ６と呼ばれる
）が文献に報告されており、これはカプシド遺伝子（ウイルスの生存に必須であ
る）をコードするポリヘドリン遺伝子の上流（かつＯＲＦ１６２９内にある）の
制限ヌクレアーゼＢｓｕ３６１の標的部位を含む。Ｂｓｆ３６１はゲノム内のど
こも切断せず、ＢａｃＰＡＫ６の消化はＯＲＦ１６２９部分を欠失させ、それに
よってウイルスは生存できなくなる。それゆえ、Ｂｓｕ３６１切断ＢａｃＰＡＫ
６ＤＮＡのような系を含むプロトコールを用いると子孫のほとんどは生存できな
いものとなり、移送プラスミドと消化したＢａｃＰＡＫ６との同時トランスフェ
クション後に得られる子孫のみが組換え体である。なぜなら、外来ＤＮＡを含む
移送プラスミドはＢｓｕ３６１部位に挿入され、それによって組換え体を該酵素
に対して耐性にするからである［KittsおよびPossee, A method for producing
baculovirus expression vectors at high frequency, BioTechniques, 14, 810
-817(1993)］。一般的な手順としては、KingおよびPossee, The Baculovirus Ex
pression System: A Laboratory Guide, チャップマン・アンド・ホール、ニュ
ーヨーク(１９９２)およびRecombinant Gene Expression Protocols, in Method
s in Molecular Biology, Vol. 62, (Tuan編、ヒューマナ・プレス、トトワ、ニ
ュージャージー、１９９７)、第１９章、２３５〜２４６頁を参照。

【００５０】ロリプラムなどの公知のインヒビターが本発明のＰＤＥ−４Ｄ６（バキュロウ
イルス／ＳＦ９昆虫細胞発現系で発現させた本発明の組換えＰＤＥ−４Ｄ６を使
用）に及ぼす効果を図１に示す。ロリプラムは、そのような酵素のよく知られた
インヒビターである（たとえば、Liviら、"Cloning and Expression of cDNA fo
r a human low K_M rolipram sensitive cyclic AMP phosphodiesterase", Molec
ular and Cellular Biol., 10, 2678-2686 (1990)を参照）。それゆえ、本発明
のＰＤＥ−４Ｄ６は他のＰＤＥ４酵素がそうであるようにロリプラムに対して感
受性である。本発明のＰＤＥ−４Ｄ６へのロリプラムの結合を図２に示す。図３
に示す実験結果は、哺乳動物細胞中での本発明のＰＤＥ−４Ｄ６の発現が明らか
にこれら細胞中のｃＡＭＰレベルを下げることを明瞭に示している。

【００５１】適当な宿主細胞株を形質転換し、適当な細胞密度まで増殖させた後、選択した
プロモーターを適当な手段（たとえば、温度シフトまたは化学的誘導）により誘
導させ、細胞をさらに培養する。細胞を典型的に遠心分離により回収し、物理的または化学的手段により破砕し
、得られる粗製の抽出物をさらに精製するため保持する。タンパク質の発現に用いた微生物菌体は、凍結−解凍サイクル、超音波処理、
機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を含む常法により破砕することができ、そ
のような方法は当業者にはよく知られている。

【００５２】組換えタンパク質を発現させるため、種々の哺乳動物細胞培養系も用いること
ができる。哺乳動物細胞発現系の例としては、サル腎臓繊維芽細胞のＣＯＳ−７
株（Gluzman, Cell, 23: 175 (1981)に記載されている）、および両立しうるベ
クターを発現できる他の細胞株、たとえば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ細胞（本
明細書に開示の方法に使用）、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株が挙げられる。哺乳
動物細胞発現系は、複製起点、適当なプロモーターおよびエンハンサーを含んで
おり、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよ
びアクセプター部位、転写終止配列、および５'フランキング非転写配列をも含
んでいるであろう。ＳＶ４０スプライスに由来するＤＮＡ配列およびポリアデニ
ル化部位は、必要とされる非転写の遺伝子配列を提供するのに用いることができ
る。

【００５３】本明細書に開示する本発明はまた、本発明の新規なポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドの１またはそれ以上のコピーをそのゲノム内に含むトランスジ
ェニック動物に関する。本発明のトランスジェニック動物は、そのゲノム内に本
発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの複数のコピーを含んでいて
よいし、またはそのようなポリペプチドをコードする遺伝子を１コピーだけ含ん
でいてよいが、該遺伝子は該トランスジェニック動物の細胞の幾つかまたは全て
において該ポリペプチドの過剰発現を指令するプロモーターに連結していなけれ
ばならない。本発明のトランスジェニック動物は、好ましくは哺乳動物、最も好
ましくはマウスであろう。

【００５４】本発明はまた、ゲノムが機能性のＰＤＥ４Ｄ６イソ型またはその機能性のアナ
ログを発現する遺伝子を欠いているトランスジェニック動物にも関し、そのよう
な動物は一般に「ノックアウト」動物、とりわけ「ノックアウトマウス」と呼ば
れる。本発明はまた、本来非ヒトイソ型をコードする哺乳動物遺伝子の代わりに本明
細書に開示するＰＤＥ４Ｄ６のヒトイソ型をコードする１またはそれ以上の遺伝
子をゲノムに含むトランスジェニック非ヒト動物にも関する。最も好ましくは、
該動物はマウスであろう。

【００５５】そのようなトランスジェニック動物を製造する方法は当業者の範囲内であり、
本明細書では詳細に記載することはしない［Wuら、Methods in Gene Biotechnol
ogy, CRC 1997, pp. 339-366; Jacenko, O., Strategies in Generating Transg
enic Animals, in Recombinant Gene Expression Protocols, Vol. 62 of Metho
ds in Molecular Biology、ヒューマナ・プレス、１９９７、３９９〜４２４頁
を参照］。

【００５６】組換え細胞培養液からのポリペプチドの回収および精製は、硫酸アンモニウム
またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィ
ー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー
、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフ
ィーおよびレシチンクロマトグラフィーを含む方法により行うことができる。成
熟タンパク質の立体配置を完成するうえで必要ならタンパク質の再生工程を用い
ることができる。最後に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終的な精
製工程に用いることができる［Salanovaら、Heterologous Expression and Puri
fication of Recombinant Rolipram-Sensitive Cyclic AMP-Specific Phosphodi
esterases, in Methods: A Companion to Methods in Enzymology 14: 55-64 (1
998)を参照］。

【００５７】本発明のポリペプチドは、天然に精製した産物であるか、または化学的な合成
手順の産物であるか、または組換え法により原核または真核宿主細胞から（たと
えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞の培養により）産生させ
てよい。組換え製造手順に用いた宿主細胞に依存して、本発明のポリペプチドは
糖付加されていてもよいし、糖付加されていなくてもよい。本発明のポリペプチ
ドはまた、開始のメチオニンアミノ酸残基を含んでいてよい。

【００５８】本発明の完全長のポリペプチドを、バキュロウイルス発現系を用いて昆虫細胞
から容易にクローニングした。そのような発現は、当該技術分野でよく知られた
方法を用い［Wangら、Expression, Purification, and Characterization of Hu
man cAMP-Specific Phosphodiesterase (PDE4) Subtypes A, B, C, and D, Bioc
hem. Biophys. Res. Comm. 234, 320-324 (1997)を参照］、とりわけWangらにお
けるようにＳＦ９細胞を用いて容易に行えた。ついで、組換えＳＰＤ４Ｄ６酵素
をインビトロアッセイに利用できる。本発明はまた、化合物をスクリーニングして本明細書に開示する本発明のＰＤ
Ｅ４Ｄ（ＰＤＥ４Ｄ６と称する）とｃＡＭＰとの相互作用を阻止する化合物（ア
ンタゴニスト）を同定する方法を提供する。そのような反応は、当該細胞内のサ
イクリックＡＭＰレベルの増大およびその結果としての生理的変化という結果と
なる。

【００５９】本発明の方法を適用するうえで、本明細書に開示するＰＤＥ４Ｄ６イソ型が単
に一般的なホスホジエステラーゼなのではなく、モニターすべき生理反応に関与
する特別のイソ型であることに留意すべきである。それゆえ、所定の細胞は一般
に１セットのイソ型を有しているであろうが、本発明の方法および開示の目的は
本発明のイソ型（本明細書に開示するＰＤＥ４Ｄ６イソ型）のレベルを記憶と相
関させる手段として神経細胞中のそのようなイソ型のレベルをモニターすること
である。それゆえ、本発明のイソ型は、記憶に関連することが知られている脳の
領域中の細胞からの高度に選択されたイソ型である。

【００６０】本発明はまた、ＰＤＥ４Ｄ、とりわけＰＤＥ４Ｄ６イソ型に特異的な潜在的な
アンタゴニストを同定するアッセイにも関する。そのようなアッセイの一例では
、本発明のＰＤＥ４Ｄ（すなわちＰＤＥ４Ｄ６イソ型）および潜在的なアンタゴ
ニスト（すなわち、インヒビター）を競合阻害アッセイのための適当な条件下で
混合する。他の阻害物質は細胞内に入り、本発明のポリペプチドをコードする配
列の近傍のＤＮＡに直接結合し、その発現を低下させることによってｃＡＭＰの
細胞内レベルを上昇させる。潜在的なアンタゴニストとしては、小さな化学的な化合物、または幾つかの場
合には本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体が挙げられる。そのような
抗体は、本発明のポリペプチドおよびその断片の検出手段として有用である。

【００６１】本発明の他の潜在的なアンタゴニストまたはインヒビターは、アンチセンス法
を用いて調製したアンチセンス構築物である。アンチセンス法は、アンチセンス
ＤＮＡまたはＲＮＡの三重ヘリックスの形成により遺伝子発現を制御するのに用
いることができ、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡの両方法ともポリヌクレオチ
ドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づいている。たとえば、本発明の成熟ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５'コード部分を用い、長さが約
１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドをデザインする。

【００６２】ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的となるよ
うにデザインし（三重らせん、Leeら、Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Coo
neyら、Science, 241: 456 (1988);およびDervanら、Science, 251: 1360 (1991
)を参照）、それによってＰＤＥ４Ｄイソ型の転写および産生ができないように
する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリ
ダイズして該ｍＲＮＡ分子のＰＤＥ４Ｄポリペプチドへの翻訳を阻止する（アン
チセンス、Okano, J. Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as
Antisense Inhibitors of Gene Expression、ＣＲＣプレス、ボカラトン、フロ
リダ（１９８８））。上記に記載したオリゴヌクレオチドはまた細胞に送達して
、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがインビボで発現されてＰＤＥ４Ｄ、とりわ
けＰＤＥ４Ｄ６の産生を阻止するようにすることができる。

【００６３】インヒビターかまたはアクチベーターかの潜在的なモデュレーターとしては、
ポリペプチドの触媒部位に結合および占拠し、それによって該触媒部位が基質に
接近できないようにすることによって正常な生物学的活性が阻止されるようにす
る小さな分子が挙げられる。小さな分子の例としては、これに限られるものでは
ないが、小さな化学的な化合物、とりわけ環状ヌクレオチド様構造を有する化合
物が挙げられる。他の潜在的なモデュレーターはペプチドおよびペプチドアナロ
グである。そのようなモデュレーターは、インヒビターあるいはアクチベーター
のいずれであっても、上記ですでに記載したノックアウトマウス、および本来そ
のようなアナログをコードするマウス遺伝子の代わりに本明細書に開示するＰＤ
Ｅ４Ｄ６のヒトイソ型をコードするヒト遺伝子を有するヒト化マウスの両者を用
いてインビボでアッセイすることができる。

【００６４】本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の診断手段としての
使用にも関する。変異した形態の遺伝子の検出は、たとえばｃＡＭＰ分解活性の
増大した変異ＰＤＥ４Ｄポリペプチドの発現の結果としての疾患または疾患に対
する罹病性の診断を可能とするであろう。

【００６５】本発明の遺伝子に変異を有する個体は、種々の方法によりＤＮＡレベルで検出
することができる。診断のための核酸は、血液、尿、唾液、組織生検および剖検
材料を含む（これらに限られるものではない）患者の細胞から得ることができる
。ゲノムＤＮＡは検出のために直接用いることもできるし、分析に先立ってＰＣ
Ｒ（Saikiら、Nature, 324: 163-166 (1986)）を用いて酵素的に増幅させること
もできる。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを同様の目的に用いることができる。一例とし
て、ＳＰＤ４Ｄ６の新規な１５−ｍｅｒをコードする核酸に相補的なＰＣＲプラ
イマーを用いて変異を同定および分析することができる。たとえば、増幅した生
成物のサイズを正常な遺伝子型と比較した変化により欠失および挿入を検出する
ことができる。点変異は、増幅したＤＮＡを放射性標識ＲＮＡあるいは放射性標
識アンチセンスＤＮＡ配列にハイブリダイズさせることにより同定できる。完全
にマッチした配列とミスマッチした二本鎖とは、ＲＮアーゼＡ消化または融解温
度の差異により区別できる。

【００６６】参照遺伝子と変異を有する遺伝子との間の配列の差異は、直接ＤＮＡシークエ
ンシング法により明らかにできる。さらに、クローニングしたＤＮＡセグメント
を特定のＤＮＡセグメントを検出するためのプローブとして用いることができる
。この方法の感度はＰＣＲと組み合せたときに非常に良好となる。たとえば、シ
ークエンシングプライマーを二本鎖ＰＣＲ産物、または改変ＰＣＲによって得ら
れた一本鎖鋳型分子とともに用いる。配列の決定は、放射性標識ヌクレオチドを
用いた常法または蛍光タグを用いた自動シークエンシング法により行う。

【００６７】ＤＮＡ配列の差異に基づく遺伝子試験は、変性剤を用いたまたは用いないゲル
中でのＤＮＡ断片の電気泳動移動度における変化を検出することにより達成でき
る。小さな配列の欠失および挿入は、高解像ゲル電気泳動により視覚化すること
ができる。異なる配列のＤＮＡ断片は、変性ホルムアミド勾配ゲル上で識別する
ことができ、異なるＤＮＡ断片の移動度は、その比融解温度および部分融解温度
に従ってゲル中の異なる位置で遅れる（たとえば、Myersら、Science, 230: 124
2 (1985)を参照）。

【００６８】それゆえ、本発明の方法は、罹患した動物における疾患、またはそのリスクに
ある動物における疾患に対する罹病性を診断する方法であって、該動物からのニ
ューロンのゲノムにおける変異を決定することを含み、該変異が配列番号５の１
５−ｍｅｒをコードするヌクレオチド配列に生じることを特徴とする方法を提供
する。そのような動物は好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトであり、決定
すべき疾患は一次または二次状態として記憶の喪失、とりわけ長期記憶の喪失を
含むものである。

【００６９】さらに、特定の位置での配列変化もまた、ＲＮアーゼおよびＳ１保護法または
化学的開裂法などのヌクレアーゼ保護アッセイ（たとえば、Cottonら、PNAS, US
A, 85: 4397-4401 (1985)）により明らかにすることができ、これらは本発明の
方法の範囲内に包含される。それゆえ、特定のＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ
保護、化学的開裂、直接ＤＮＡシークエンシングまたは制限酵素の使用（たとえ
ば、制限断片長多型（ＲＦＬＰ））およびゲノムＤＮＡのサザーンブロッティン
グにより行うことができる。より従来型のゲル電気泳動やＤＮＡシークエンシングに加えて、変異はまたイ
ンシトゥ分析によっても検出できる。

【００７０】本発明の配列はまた染色体の同定においても有用である。本発明の新規な１５
−ｍｅｒをコードするポリヌクレオチドおよびそのホモログは、個々のヒト染色
体上の特定の位置に特異的にターゲティングし、ハイブリダイズすることができ
る。さらに、最近では、たとえばヒトゲノムプロジェクトの一部として染色体上
の特定の部位を同定する必要性が存在する。それゆえ、ｃＤＮＡからＰＣＲプラ
イマー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製することによって配列を染色体上に
マッピングすることができる。

【００７１】中期染色体の広がり（spread）に対するｃＤＮＡの蛍光インシトゥハイブリダ
イゼーション（ＦＩＳＨ）も同様に染色体上の正確な位置を１工程で明らかにす
るのに用いることができる。この方法は、少なくとも５０〜６０塩基を有するｃ
ＤＮＡとともに用いることができる。この方法の概要についてはVermaら、Human
Chromosomes: a Manual of Basic Techniques、パーガモン・プレス、ニューヨ
ーク（１９８８）を参照。ＰＤＥ遺伝子（ＰＤＥ４Ｄを含む）の染色体上の位置
は当業者には知られている。

【００７２】配列が染色体上の正確な位置にマッピングされたら、染色体上での配列の物理
的な位置を遺伝地図のデータと相関させることができる。そのようなデータは、
たとえば、V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man（ジョンズ・ホプキン
ス・ユニバーシティー・ウエルチ・メディカル・ライブラリーからオンラインで
入手できる）に記載されている。ついで、同じ染色体領域にマッピングされた疾
患と遺伝子との間の関係を連鎖分析（物理的に近接する遺伝子の同時遺伝）によ
り同定する。

【００７３】次に、罹患した個体と罹患していない個体との間でｃＤＮＡまたはゲノム配列
の差異を決定する必要がある。もしも変異が罹患した個体の何人かまたは全員で
観察されるが正常な個体では観察されないなら、その変異は当該疾患の原因であ
る可能性が高い。物理的マッピングおよび遺伝子マッピング法の現在の解析度では、疾患と関連
する染色体領域に正確に位置決定されるｃＤＮＡは５０〜５００の潜在的な原因
遺伝子のうちの一つである（これは１メガ塩基のマッピング解析度および２０ｋ
ｂあたり１遺伝子との想定に立ったものである）。

【００７４】本発明のポリペプチド、その断片または誘導体、またはアナログ、またはそれ
らを発現する細胞はまた、該ポリペプチドに対する抗体を製造するための免疫原
としても用いることができる。これら抗体は、たとえばポリクローナル抗体また
はモノクローナル抗体であってよい。本発明はまた、キメラ抗体、一本鎖抗体、
およびヒト化抗体、並びにＦａｂフラグメント、またはＦａｂ発現ライブラリー
の生成物を包含する。そのような抗体およびフラグメントを製造するために当該
技術分野で知られた種々の方法を用いることができる。

【００７５】本発明の配列に対応するポリペプチドに対して産生される抗体は、該ポリペプ
チドの動物への直接注射、または動物、好ましくは非ヒトへの該ポリペプチドの
投与によって得ることができる。このようにして得られた抗体は該ポリペプチド
自体に結合するであろう。このようにして、該ポリペプチドの断片のみをコード
する配列でさえも天然のポリペプチドの全体に結合する抗体を産生するのに用い
ることができる。そのような抗体は、ついで該ポリペプチドを発現する組織から
該ポリペプチドを単離するのに用いることができる。

【００７６】モノクローナル抗体の調製のためには、連続的な細胞株培養によって抗体を産
生できるいかなる方法も用いることができる。例としては、ハイブリドーマ法（
KohlerおよびMilstein, 1975, Nature, 256: 495-497）、トリオーマ法、ヒトＢ
細胞ハイブリドーマ法（Kozborら、1983, Immunology Today 4: 72）、およびヒ
トモノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Coleら、19
85, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.
77-96）が挙げられる。

【００７７】一本鎖抗体の製造のために記載された方法（米国特許第４,９４６,７７８号）
を、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する抗体を製造するべく採用するこ
とができる。トランスジェニックマウスもまた、本発明の免疫原性ポリペプチド
産物に対するヒト化抗体を発現させるべく用いることができる。そのような抗体は、本明細書に開示したポリペプチドの異常型、とりわけ配列
が本発明に従って開示する新規な１５−ｍｅｒ（配列番号５）に認められるもの
（該配列は記憶に関与することが知られている海馬領域の細胞において認められ
るＰＤＥ４Ｄ酵素に特有のものである）と異なるものの存在を検出するアッセイ
に用いることができる。

【００７８】すでに記載したように、脳においてニューロン内のｃＡＭＰレベルは記憶、と
りわけ長期記憶の優良性に関係していると思われる。それゆえ、ＰＤＥ４Ｄはｃ
ＡＭＰを分解するので、該酵素のレベルは動物、たとえばヒトにおいて記憶に影
響を及ぼしうるであろう。簡単に説明すると、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ（
ＰＤＥ）を阻害する化合物はｃＡＭＰの細胞内レベルを上昇させ、このことが今
度は転写因子（ｃＡＭＰ応答結合タンパク質）をリン酸化するプロテインキナー
ゼを活性化させ、ついで該転写因子がＤＮＡプロモーター配列に結合して長期記
憶に重要な遺伝子を活性化する。そのような遺伝子が活性になればなるほど長期
記憶は良くなる。それゆえ、ホスホジエステラーゼを阻害することによって長期
記憶を向上させることができる。

【００７９】本発明はまた、ｃＡＭＰレベルの変化が関与する疾患状態にあるまたはそのリ
スクにあると思われる動物において本発明の新規なポリペプチドの存在または不
在を決定することによって、実際のまたは潜在的なそのような疾患状態を調べる
手段をも提供する。それゆえ、本発明の方法は、動物において疾患を診断する方
法、または疾患のリスクにある動物において該疾患に対する罹病性を診断する方
法であって、該疾患は、たとえば本発明によるホスホジエステラーゼ（すなわち
、配列番号５の新規な１５−ｍｅｒに相同な配列をその構造中に含むもの）の過
剰発現に関連するものである方法を提供する。該方法は、該動物（好ましくは哺
乳動物、最も好ましくはヒト）からの細胞内の該ホスホジエステラーゼ活性のレ
ベルを決定することを含む。そのようにして決定すべき疾患状態は、その一次作
用または二次作用として記憶の喪失、とりわけ長期記憶の喪失をしばしば含んで
おり、試験すべき細胞は一般にニューロン、とりわけ脳のニューロン、たとえば
海馬領域のニューロンであろう。

【００８０】本発明の方法はまた、記憶、とりわけ長期記憶の喪失を治療するのに有効な潜
在的な治療剤、または記憶、とりわけ長期記憶を保存するのに有効な潜在的な治
療剤、またはおそらく脳、とりわけ海馬のニューロンのｃＡＭＰホスホジエステ
ラーゼ、特に本明細書に開示するＰＤＥ４Ｄ６活性を活性化してそのような細胞
内でのｃＡＭＰレベルを低下させることによって、記憶、とりわけ長期記憶の喪
失を引き起こすうえで役割を果たしている潜在的な治療剤の開発を容易にするこ
とにも関する。

【００８１】この目的を達成するため、本発明はＰＤＥ４Ｄのイソ型、とりわけ本明細書に
開示するＰＤＥ４Ｄイソ型を阻害する能力について小さな化合物をスクリーニン
グする手段を提供する。そのようなスクリーニングは、まず適当なＤＮＡを細胞
内に挿入して本発明のポリペプチドを発現する細胞株を生成することにより、培
養した全細胞にてインビトロで都合よく行う。

【００８２】本明細書に開示した方法を用い、本発明の新規なホスホジエステラーゼをコー
ドするポリヌクレオチドを適当なベクター内に挿入し、該ベクターを適当な宿主
細胞、たとえばＣＨＯ細胞にトランスフェクションして安定な細胞株を生成する
ことができる。そのような細胞でのｃＡＭＰレベル、それゆえ、そのような細胞
でのＰＤＥ４Ｄホスホジエステラーゼ活性のレベルを、ホスホジエステラーゼ活
性に対する種々の化学薬剤の効果をモニターするのに用いることができる。

【００８３】さらに詳細には、本発明のＰＤＥ４Ｄイソ型などのホスホジエステラーゼを安
定に発現するＣＨＯ細胞をｃＡＭＰのアッセイに容易に利用することができる［
Ponら、Characterization of CHO-K1 Cells Stably Expressing PDE-IV Enzymes
, Cell Biochemistry and Biophysics 29: 159-178 (1988)を参照］（この開示
を参照のため本明細書に引用する）。そのような細胞は、組換えの完全長ｃＡＭ
Ｐホスホジエステラーゼを容易に発現することが示された。

【００８４】培地中の潜在的なＰＤＥ阻害物質の存在に応答した全細胞サイクリックＡＭＰ
の測定は記載されている［Ponら、(1988)］。簡単に説明すると、ＰＤＥイソ型
を発現するＣＨＯ細胞を、トリス（ｐＨ７.５）緩衝液（５０ｍＭトリス、１ｍ
ＭＥＤＴＡ）を含有する氷冷溶液中で１０秒間超音波処理することにより溶解
し、プロテアーゼインヒビターを２００μＭのβ−メルカプトエタノールととも
に加える。１００,０００ｇ、４℃にて９０分間遠心分離するとホスホジエステ
ラーゼ活性を含む可溶性フラクションおよび粒状のフラクションが得られる。つ
いで、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７.５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＥＤ
ＴＡおよび１００ｎＭの^３Ｈ−ｃＡＭＰを含有し（最終容量は１００μＬ）、ス
クリーニングすべきインヒビターを種々の濃度で含有する溶液中でホスホジエス
テラーゼ活性を測定する。３０℃にて１０分までインキュベートした後、１８ｍ
ＭのＺｎＳＯ_４を含有する約５０μＬのＰＤＥシンチレーション近似アッセイ（
ＳＰＡ）ビーズ（Amershamから）を加えて反応を停止させた。ついで、シンチレ
ーションカウントは^３Ｈ−ｃＡＭＰの加水分解の量を与えた。これはｃＡＭＰの
インビトロアッセイを表す。

【００８５】同様にして、ホスホジエステラーゼイソ型の潜在的な阻害剤を含む培地中で細
胞を増殖させ、細胞を阻害培地から取り出した後に細胞のｃＡＭＰを同様にして
測定することができる。このことが必要なのは、溶解細胞でのアッセイとは対照
的に全細胞でアッセイしたときにはｃＡＭＰホスホジエステラーゼが活性の差異
を呈することをPonらが見出しているからである。

【００８６】ホスホジエステラーゼ阻害活性のためのスクリーニング法の全体は、本発明の
ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現する細胞を、活性化
するかまたは阻害するかの潜在的なホスホジエステラーゼ修飾活性を有する化学
物質に接触させ、ついで該暴露後に該細胞内での全環状アデノシン一リン酸（ｃ
ＡＭＰ）のレベルを測定することを含み、その際、該暴露後の該細胞内でのｃＡ
ＭＰレベルの変化はそのような修飾活性の指標となるものである。

【００８７】さらに詳細には、ｃＡＭＰレベルの上昇は試験した物質による阻害活性を示す
ものであり、一方、ｃＡＭＰレベルの低下は試験した物質による活性化作用を示
すものである。それゆえ、本明細書に開示した本発明の新規なポリペプチドを本明細書に開示
した方法とともに用いれば、記憶の喪失、とりわけ長期記憶の喪失の効果を軽減
し、あるいは可能なら該効果を完全に予防する能力について潜在的な物質をスク
リーニングするための直截的な方法となる。

【００８８】実施例１５'ＲＡＣＥ法を用いたラットおよびヒトＰＤＥ４Ｄ６ｃＤＮＡの単離ジーンバンクからのラットＰＤＥ４Ｄ２配列（受託番号ｕ０９４５６）および
ジーンバンクからのヒトＰＤＥ４Ｄ配列（受託番号ｕ７９５７１）に基づき、３
つのネステッドリバースプライマーをデザインした。これらプライマーの配列は
以下のとおりであった。ラット：ＲａｔＰＤＥ４ＤＲ１：５'−ＡＴＧＣＡＧＡＧＧＣＣＧＧＴＴＧＣＣＡＧＡＣＡＧＣＴＣＣＧＣＴＡＴ
ＴＣＧＧ−３'（配列番号６）ＲａｔＰＤＥ４ＤＲ２：５'−ＴＧＧＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＴＴＣＣＴＧＣＴＣＴＧＴＴＴＴＡＡＣＣ−
３'（配列番号７）ＲａｔＰＤＥ４ＤＲ３：５'−ＧＴＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＴＧＣＡＴＣＡＡＣＴＴＣＴＴＧＡＣＣ
−３'（配列番号８）

【００８９】ヒトのプライマー配列は以下のとおりである。ＨｕＰＤＥ４ＤＲ１：５'−ＣＣＧＧＴＴＡＣＣＡＧＡＣＡＡＣＴＣＴＧＣ−３'（配列番号９）ＨｕＰＤＥ４ＤＲ２：５'−ＴＧＧＣＡＡＧＧＡＣＡＴＣＴＴＣＴＴＧＴＴＣＡ−３'（配列番号１０）ＨｕＰＤＥ４ＤＲ３：５'−ＧＡＣＴＣＣＡＣＴＧＡＴＣＴＧＡＧＡＣＡＴＴＧ
ＧＴＣＴ−３'（配列番号１１）

【００９０】ラットおよびヒトの脳組織から５'末端で新規なＰＤＥ４ＤｃＤＮＡイソ型を
探究するため、５'ＲＡＣＥキット（GIBCO-BRL）を用いてポリメラーゼ連鎖反応
を行った。ラット海馬ＣＡ１領域からの全ＲＮＡおよびヒト海馬からのｍＲＮＡ
（Clontech）を鋳型として用いた。１μｇのＲＮＡ試料を用いて逆転写を行った
。第一鎖ｃＤＮＡ合成のために用いたプライマーは、ｒａｔＰＤＥ４ＤＲ１（配
列番号６）およびｈｕＰＤＥ４ＤＲ１（配列番号９）であった。逆転写反応はSu
perscript IIRT（GIBCO-BRL）を用いて４２℃にて１時間行った。５'ＲＡＣＥキ
ットの標準プロトコールに従ってｃＤＮＡを精製し、ポリ（Ｃ）でテーリングし
た。

【００９１】ポリ（Ｃ）でテーリングしたｃＤＮＡ試料をＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（GIB
CO-BRL）とともにＰＣＲに用いた。ＰＣＲ反応に用いたプライマーは、フォアウ
ォードアンカープライマー（GIBCO-BRL）およびラットまたはヒトのリバースプ
ライマー（ＲａｔＰＤＥ４ＤＲ２（配列番号７）またはＨｕＰＤＥ４ＤＲ２（配
列番号１０））であった。ＰＣＲ反応からの生成物を１０００×に希釈し、フォ
アウォードプライマーＵＡＰ（GIBCO-BRL）およびｒａｔＰＤＥ４ＤＲ３（配列
番号８）またはｈｕＰＤＥ４ＤＲ３（配列番号１１）ネステッドリバースプライ
マーを用いた２回目のＰＣＲ反応に供した。ＰＣＲ生成物をＴＡクローニングシ
ステム（Invitrogen）を用いてサブクローニングし、シークエンシングした。本
発明者らはまた、ラットの全脳Marathonma ｃＤＮＡ（Clontech）を５'ＲＡＣＥ
のための鋳型として用い、同一の新規なＰＤＥ４Ｄイソ型を単離した。

【００９２】ラットおよびヒトＰＤＥ４Ｄ６の完全長クローニング逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて完全長の新規なラットおよびヒトＰＤ
Ｅ４Ｄ６をコードするｃＤＮＡを単離した。ラット海馬ＣＡ１およびヒト海馬Ｒ
ＮＡを鋳型として用いた。逆転写に用いたプライマーは以下のとおりであった。
ラットリバースプライマー：５'ＡＧＧＴＧＴＧＡＣＡＧＣＣＴＴＴＡＣＡＣＴＧＴＴＡＣＧＴ３'（配列番号
１２）ヒトリバースプライマー：５'ＧＣＡＣＴＧＴＴＡＣＧＴＧＴＣＡＧＧＡＧＡＡ３'（配列番号１３）

【００９３】以下のプライマーを用い、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用い
て３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。ラットフォアウォードプライマーＲａｔＰＤＥ４ＤＦＳ（配列番号１４）：５'−ＧＡＣＡＣＡＴＡＡＴＣＴＡＴＣＡＡＡＡＡＴＧＣＣＴＧＡＡＧＣ−３' ラットリバースプライマーＲａｔＰＤＥ４ＤＦＡ（配列番号１５）：５'ＧＡＣＡＧＣＣＴＴＴＡＣＡＣＴＧＴＴＡＣＧＴＧＴＣＡＧＧ３' ヒトフォアウォードプライマーＨｕＰＤＥ４ＤＦＳ（配列番号１６）：５'−ＴＡＣＡＴＡＴＡＡＴＣＡＡＴＣＡＡＡＡＡＴＧＣＣＴＧＡＡＧＣＡＡ−
３' ヒトリバースプライマーＨｕＰＤＥ４ＤＦＡ（配列番号１７）：５'ＣＴＧＴＴＡＣＧＴＧＴＣＡＧＧＡＧＡＡＣＧＡＴＣＡ３' ＰＣＲ生成物をｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩベクター（Invitrogen）にサブクロ
ーニングし、シークエンシングした。

【００９４】ノーザンブロット分析ラットおよびヒトの複数の組織ｍＲＮＡブロット（Clontech）を、６×ＳＳＣ
、５×デンハルト溶液（０.５％ＳＤＳ、０.２％変性サケ精子ＤＮＡ、および５
０％ホルムアミド）を含む緩衝液中、６８℃にて２時間プレハイブリダイズさせ
た。ラットおよびヒトのＰＤＥ４Ｄ６ｃＤＮＡクローンのＮ末端２００塩基対
をＰＣＲにより増幅し、プローブに用いた。このｃＤＮＡクローンの領域はＰＤ
Ｅ４Ｄ６の新規な配列を表す。ラットフォアウォードプライマーおよびリバース
プライマーの配列はそれぞれ以下のとおりである。５'−ＴＧＧＡＡＡＧＡＣＧＧＣＴＧＧＡＴＧＧＧ−３'（配列番号１８）５'−ＴＧＴＡＧＣＣＣＣＡＡＧＡＣＡＣＴＧＡＣＡＡ−３'（配列番号１９）

【００９５】ヒトフォアウォードおよびリバースプライマーの配列は以下のとおりである。
５'−ＴＧＧＧＡＡＧＡＣＧＧＣＴＧＧＡＴＧＧＧ−３'（配列番号：２０）５'−ＡＴＧＴＡＧＣＣＣＣＡＡＧＡＣＡＣＴＧＡＣＡＧＴ−３'（配列番号２１
）ＰＣＲ生成物をＴＡクローニングベクター（Invitrogen）にサブクローニング
した。プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＶで線状にし、標準手順を用いてＳＰ６ＲＮ
Ａポリメラーゼおよび^３２Ｐ−ＵＴＰで転写した。約１０^７ｃｐｍの^３２Ｐ−標
識リボプローブが、ノーザンブロットと１０ｍｌのプレハイブリダイゼーション
緩衝液中、６８℃にて一夜、ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、
ブロットを１×ＳＳＣ緩衝液で６８℃にて３回、各２０分間洗浄し、ついでＸ線
フィルム（Kodak）に暴露した。

【００９６】抗血清の産生本発明の新規な１５−ｍｅｒ（ラットおよびヒトイソ型の両者について）に対
する抗血清は容易に調製できる。ＰＤＥ４Ｄファミリーの保存された触媒ドメイ
ンに対する抗血清もまた調製できる。ペプチドを合成し、ＫＬＨタンパク質にコ
ンジュゲートし、ウサギポリクローナル抗血清の調製に用いた（Research Genet
ics Inc.）。

【００９７】実施例２ラットおよびヒトＰＤＥ４Ｄ６の発現ついで、実施例１で得たＰＣＲ生成物を、標準的な分子生物学手順を用い、上
記と同様にしてバキュロウイルス発現系（Invitrogen、サンジエゴ、カリフォル
ニアからのpBlueBacHis2）にライゲーションにより挿入した。ついで、ＳＦ９細胞を発現ベクター（線状のＡｃＭＮＰＶＤＮＡを含む）（
これもInvitrogenから）とともにコトランスフェクションした。続いて細胞培養
、組換えウイルスの精製およびウイルスの滴定の工程を標準法により行う［O'Re
illy, D. R. (1997), Use of Baculovirus Expression Protocols, in Methods
in Molecular Biology, Vol. 62、ヒューマナ・プレス、ニュージャージー］。
ついで、組換えウイルスで約５のＭＯＩにて感染させる前に細胞を１ｍｌ当たり
約２百万細胞の密度まで増殖させる。ついで、細胞を少なくとも３日間培養する
。

【００９８】ついで、培地をプールし、遠心分離してペレットを得、これをＰＢＳで１回洗
浄し、ついで溶解緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.５、１０ｍＭの
２−メルカプトエタノール、１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルクロ
ライド）および１％ＮＰ−４０）に１千万細胞当たり１ｍｌにて（全部で約１０
億の細胞）再浮遊させる。ついで、細胞を超音波処理し、ホモジネートを１０^４ｇにて２０分間遠心分離し、その後、上澄み液（少なくとも２ｍｇのＰＤＥ４Ｄ
６タンパク質を含有する）を回収し、ＮｉＮＴＡ樹脂（Qiagen、チャッツワース
、カリフォルニア）と５：２（ｖ／ｖ）の比で混合する（樹脂はすでに２０ｍＭ
のトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、５００ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール
、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１０％（ｖ／ｖ）のグリセリンからな
る平衡緩衝液で平衡化してあった。混合物を攪拌しながら４℃にて３０分間イン
キュベートし、樹脂をカラムに充填する）。

【００９９】カラムを溶出液の２８０ｎｍでの吸光度が＜０.０１となるまで平衡緩衝液で
洗浄し、ついで溶出液の２８０ｎｍでの吸光度が＜０.０１となるまで２容量の
洗浄緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、１ＭのＫＣｌ、１０ｍＭ
のイミダゾール、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１０％（ｖ／ｖ）のグ
リセリン）で洗浄する。ついで、組換えＰＤＥ４Ｄ６を溶出緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ
８.５、１００ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭのイミダゾール、１０ｍＭの２−メル
カプトエタノール、１０％（ｖ／ｖ）のグリセリン）で溶出する。

【０１００】その後の分析のためフラクション（各１ｍｌ）を回収する。ヒト血清アルブミ
ンを標準として用いたＢｉｏＲａｄ法を用い、フラクションをタンパク質につい
てアッセイする。さらに、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動をフラクシ
ョンに対して行う。これらフラクションはまた、ウエスタンブロッティング、お
よびＣ末端オリゴペプチドを用いてＰＤＥ４Ｄタンパク質に対してすでに利用で
きる抗体（Wangら、1997）（ウサギでの免疫のためにＫＬＨにコンジュゲートし
たもの）を用いてもアッセイする。

【０１０１】酵素活性を標準法によりアッセイする［AmershamのＰＤＥ[^３Ｈ]ｃＡＭＰＳ
ＰＡ（シンチレーション近似アッセイ）エンザイムアッセイキット。この場合、
酵素活性は、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７.５、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭの
ＥＤＴＡ、および適当な濃度の[^３Ｈ]ｃＡＭＰ（キットの指定による）を最終容
量１００μＬ（酵素溶液の様々な試料（すなわち、カラムフラクション）を用い
て）で含有する反応混合物で測定する］。ついで、酵素を含有するこれら反応混
合物を９６ウエルプレート中、３０℃にて１０分間インキュベートする。５０μ
ＬのＳＰＡビーズ（１８ｍＭのＺｎＳＯ_４を含有）を加えて反応を停止させる。
加水分解された[^３Ｈ]ｃＡＭＰの量をシンチレーションカウンターを用いて測定
する。

【０１０２】このアッセイはまた、開示したｃＡＭＰホスホジエステラーゼに対する潜在的
なモデュレーターの適当な希釈液を反応混合物中でインキュベートすることによ
り、かかる潜在的なモデュレーターをスクリーニングするのにも用いる。もちろ
ん、そのようなモデュレーターは、ホスホジエステラーゼのインヒビターかまた
はアクチベーターのいずれかであってよい。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】バキュロウイルス／ＳＦ９昆虫発現系を用いた組換えＰＤＥ−４
Ｄ６の発現の結果を示す。ホスホジエステラーゼ活性の測定を、無細胞系にて組
換え酵素とともに所定濃度のホスホジエステラーゼインヒビター、ロリプラムの
存在下にインキュベートした後のｃＡＭＰ加水分解産物（５'−ＡＭＰ）の増大
を測定することにより行った。ロリプラムに対する感受性は、ＰＤＥ４クラスの
ホスホジエステラーゼのよく知られかつ区別される特性である。

【図２】発現された組換えＰＤＥ−４Ｄ６への^３Ｈ−ロリプラムの結合を
示す。所定濃度の標識ロリプラムを組換えＰＤＥ−４Ｄ６を含有する昆虫溶解液
とともにインキュベートし、ガラス繊維フィルター上での速やかな濾過後にロリ
プラムの結合を測定した。ここで、ＲＢＳはロリプラム結合部位を表し、Ｋ_ｄは
解離定数である。

【図３】哺乳動物細胞中での組換えＰＤＥ−４Ｄ６の発現はｃＡＭＰレベ
ルを下げることを示す。ここで、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を
ＰＤＥ−４Ｄ６およびＣＲＥ−ルシフェラーゼリポーター系（ｃＡＭＰレベルに
応答する）でトランスフェクションした。ｃＡＭＰの基礎レベルは下がり、ＰＤ
Ｅ−４インヒビターとインキュベートするとＣＲＥ−ルシフェラーゼリポーター
遺伝子の活性の増大によって検出されるようにｃＡＭＰの蓄積が増大される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｂ０６５ 1/21 9/16 Ｃ４Ｈ０４５ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 9/16 1/34 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 Ａ 1/34 Ｃ１２Ｐ 21/08 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ // Ｃ１２Ｐ 21/08 33/50 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｍ 33/50 33/566 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者アクセル・ウンターベックアメリカ合衆国06443コネチカット州マディソン、ワイルドウッド・アベニュー205 番 (72)発明者インヘ・フアメリカ合衆国92130カリフォルニア州サンディエゴ、ビア・ニーブ12716番Ｆターム(参考） 2G045 AA29 AA40 CA25 CB01 CB03 CB07 CB17 DA12 DA13 DA14 DA36 FB01 FB03 4B024 AA01 AA11 BA11 BA43 CA04 CA09 CA11 DA01 DA02 DA05 DA11 EA01 EA02 EA03 EA04 FA02 GA02 GA11 HA01 HA03 HA14 HA15 4B050 CC01 CC03 DD11 EE10 LL01 LL03 4B063 QA01 QA08 QA18 QA19 QQ01 QQ05 QQ13 QQ32 QQ42 QQ52 QR08 QR12 QR33 QR42 QR55 QR57 QR59 QR62 QR74 QR80 QS05 QS25 QS26 QS34 QS36 QX02 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA87X AA90Y AB01 AB02 BA01 BA08 CA25 CA31 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA17 CA40 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号５と少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を有する
セグメントを含む単離ポリペプチド。
【請求項２】該セグメントが配列番号５と少なくとも８０％同一である、
請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】該セグメントが配列番号５と少なくとも９５％同一である、
請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項４】該セグメントが配列番号５の配列である、請求項１に記載の
単離ポリペプチド。
【請求項５】配列番号５のセグメントを含み、少なくとも１０のアミノ酸
を含む、単離ポリペプチド。
【請求項６】該セグメントが少なくとも１２のアミノ酸を含む、請求項５
に記載の単離ポリペプチド。
【請求項７】該セグメントが少なくとも１４のアミノ酸を含む、請求項６
に記載の単離ポリペプチド。
【請求項８】該セグメントが少なくとも１５のアミノ酸を含む、請求項７
に記載の単離ポリペプチド。
【請求項９】請求項１、２、３、４、５、６、７および８に記載のポリペ
プチドよりなる群から選ばれたポリペプチドを含むホスホジエステラーゼ。
【請求項１０】請求項１、２、３、４、５、６、７および８に記載のポリ
ペプチドよりなる群から選ばれた単離ポリペプチド。
【請求項１１】該ポリペプチドが精製されている、請求項１０に記載の単
離ポリペプチド。
【請求項１２】配列番号５の少なくとも１２のアミノ酸残基のセグメント
を含む単離１５−ｍｅｒ。
【請求項１３】該セグメントが配列番号５の少なくとも１４のアミノ酸残
基を含む、請求項１２に記載の単離１５−ｍｅｒ。
【請求項１４】請求項１、２、３、４、５、６、７および８に記載のポリ
ペプチドよりなる群から選ばれたポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチ
ド。
【請求項１５】該ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１４に記載の
ポリヌクレオチド。
【請求項１６】該ＤＮＡがｃＤＮＡである、請求項１５に記載のポリヌク
レオチド。
【請求項１７】該ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１４に記載の
ポリヌクレオチド。
【請求項１８】請求項１５に記載のポリヌクレオチドの相補鎖。
【請求項１９】ポリペプチドが請求項１、２、３、４、５、６、７または
８に記載のセグメントを含む場合にのみ該ポリペプチドに特異的な抗体。
【請求項２０】該抗体がモノクローナル抗体である、請求項１９に記載の
抗体。
【請求項２１】請求項１５に記載のポリヌクレオチドをベクターに挿入す
ることを含む、組換えベクターの製造方法。
【請求項２２】請求項１５に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクタ
ー。
【請求項２３】請求項１４に記載のポリヌクレオチドを含む組換え細胞。
【請求項２４】請求項２３に記載の組換え細胞から該ポリヌクレオチドに
よってコードされるポリペプチドを発現させることを含む、ポリペプチドの製造
方法。
【請求項２５】請求項９に記載のホスホジエステラーゼの過剰発現と関係
のある疾患に罹患した動物における該疾患の診断、または該疾患のリスクにある
動物における該疾患に対する罹病性を診断する方法であって、該動物からの細胞
中の該ホスホジエステラーゼ活性のレベルを決定することを含む方法。
【請求項２６】該動物がヒトである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】該細胞がニューロンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】該疾患が記憶の喪失が関与するものである、請求項２５に
記載の方法。
【請求項２９】該記憶の喪失が長期記憶の喪失である、請求項２８に記載
の方法。
【請求項３０】疾患に罹患した動物における該疾患の診断、または該疾患
のリスクにある動物における該疾患に対する罹病性を診断する方法であって、該
動物からのニューロンのゲノム中の変異を決定することを含み、該変異が配列番
号５の１５−ｍｅｒをコードするヌクレオチド配列に生じたものであることを特
徴とする方法。
【請求項３１】該動物がヒトである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】該疾患が記憶の喪失が関与するものである、請求項３０に
記載の方法。
【請求項３３】該記憶の喪失が長期記憶の喪失である、請求項３２に記載
の方法。
【請求項３４】ホスホジエステラーゼ修飾活性について化学物質をスクリ
ーニングする方法であって、請求項１０に記載のポリヌクレオチドによってコー
ドされるポリペプチドを発現する細胞を、潜在的なホスホジエステラーゼ阻害活
性を有する化学物質と接触させ、ついで該暴露後に該細胞で全環状アデノシン一
リン酸（ｃＡＭＰ）のレベルを測定することを含み、その際、該暴露後の該細胞
でのｃＡＭＰレベルの変化がそのような修飾活性の指標であることを特徴とする
方法。
【請求項３５】該修飾活性が阻害活性である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】ゲノム中に請求項１５に記載のポリヌクレオチドの１また
はそれ以上のコピーを含むトランスジェニック動物。
【請求項３７】該動物が非トランスジェニック動物に比べて該ポリヌクレ
オチドの発現産物を過剰産生する、請求項３６に記載のトランスジェニック動物
。
【請求項３８】該動物がマウスである、請求項３７に記載のトランスジェ
ニック動物。
【請求項３９】ゲノムが機能性のＰＤＥ４Ｄ６イソ型またはその機能性の
アナログを発現する遺伝子を欠くトランスジェニック動物。
【請求項４０】該動物がマウスである、請求項３９に記載のトランスジェ
ニック動物。
【請求項４１】ゲノムが、本来は哺乳動物のＰＤＥ４Ｄ６イソ型をコード
する遺伝子の代わりにＰＤＥ４Ｄ６のヒトイソ型をコードする１またはそれ以上
の遺伝子を含む、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４２】該動物がマウスである、請求項４１に記載のトランスジェ
ニック動物。