JP2003502670A - 化学発光結合アッセイを実施するための方法 - Google Patents

化学発光結合アッセイを実施するための方法

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Abstract

(57)【要約】 標的分析物を含むかまたは含むことが疑われる溶液の、レセプター−リガンド結合反応を実施するための方法。この方法は、第一の結合パートナーを常磁性粒子の表面上に結合させる工程、第二の結合パートナーをカルシウム感受性発光化合物に結合体化させる工程；この第一の結合パートナーおよびこの第二の結合パートナーを試験される溶液と接触させる工程、ストレプトアビジンおよびケージされたカルシウム化合物を含む横断ストライプを有する捕獲ストリップに沿って常磁性粒子を固定する工程、この横断ストライプを紫外線のパルスに露出させてケージされたカルシウム化合物からのカルシウムの放出を引き起こす工程、およびカルシウム感受性発光材料によって放出された発光を測定する工程を包含する。この方法は、血液試験に使用され得る。装置がまた、開示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、結合アッセイを実施するための方法に関し、そして特に、医療の点
における（Ｐｏｉｎｔ Ｏｆ Ｃａｒｅ）（ＰＯＣ）デバイスまたは自動分析器
において実施され得る、イムノアッセイ法に関する。
【０００２】 （発明の背景） 種々の体液中の生体分子（分析物）を検出および定量することに対する現在進
行中の必要性は、異なる分析物の広範囲のスペクトルを測定するために適合され
得る、新たな、かつより正確な分析技術の採用をもたらした。これらの検出方法
の多くは、近年、臨床的な診断の分野へ導入されてきた。現在、容易にかつ正確
に決定され得る種々の分析物、および決定のための方法の両方における、広い拡
張が、望まれている。しかし、液体中の低濃度の分析物の存在を検出するため（
特に、分析物が体液中に非常に低濃度で存在し得る場合）の、好都合な、信頼で
きる、危険のない、高感度の、そして技術的にさほど挑戦的ではない方法が、依
然として望まれる。
【０００３】 流体サンプル中の生物学的起源の材料の検出および定量のためのいくつかの方
法が、現在使用されている。生物分析アッセイ（例えば、イムノアッセイおよび
核酸ハイブリダイゼーションアッセイ（これらは、リガンドと、特定の結合対の
１つ以上のメンバーとの間の特異的な結合に基づく））は、目的の分析物（例え
ば、サンプルの化学的構成成分または物質）の存在および量を決定するために、
広く使用される。特に、イムノアッセイは、臨床試験室において広範に使用され
る、検出および定量の方法である。
【０００４】 サンドイッチイムノアッセイの代表的な手順において、特定の抗原に対する抗
体（捕捉抗体として公知）が、固体表面に固定される。調査中のサンプルが、サ
ンプル中の抗原が捕捉抗体に結合することを可能にする条件下で、この固体表面
と接触される。検出抗体として公知である、別の抗体が、添加される。直接的な
イムノアッセイ形式においては、検出抗体は、検出抗体の量が定量されることを
可能にするシグナル生成機構と直接結合体化される。間接的な形式においては、
検出抗体の抗原への結合の後に、検出抗体に対する別の抗体、または検出抗体が
関与する別の特異的結合反応が、利用される。このいわゆる抗検出抗体が、シグ
ナル生成機構と直接結合体化される。この結合反応、および従ってサンプル中の
抗原レベルは、シグナル生成機構により生じるシグナルを定量することによって
、定量される。
【０００５】 いくつかの型の標識材料が、レセプター−リガンド結合アッセイにおいて、シ
グナル生成のために利用されてきた。放射性原子（例えば、125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ
および14Ｃ）が、通常、標識として利用された。イムノアッセイのための放射性
標識は、感受性であるが、これらは、共通して認識される欠点（安全性、および
比較的短い試薬の有効期間を生じるストリンジェントな調節要件が挙げられる）
を被る。いくつかの代替の標識方法は、現在、結合バイオアッセイ（比色定量酵
素反応、蛍光反応および化学発光反応が挙げられる）において利用されている。
標識として通常利用される酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アル
カリホスファターゼ、Ｂ−ガラクトシダーゼおよびグルコースオキシダーゼであ
る。酵素は、非常に安定であり、そして特別の設備および計装を必要としない点
で、放射性標識より優れた利点を有するが、酵素イムノアッセイは、一般に、よ
り遅く、労力がかかり、そして低感度である。発光標識（蛍光標識および化学発
光標識が挙げられる）は、放射性標識または酵素標識の代替として、利用されて
きた。なぜなら、発光標識は、放射性標識の利点である使用の容易さと、酵素の
利点である試薬安定性とを有するからである。蛍光検出は、より広範な種々の酵
素とともに、使用され得る。しかし、特異的シグナルと非特異的シグナルとの間
の区別における従来の蛍光検出の困難性、および従って実際のアッセイ検出限界
に起因して、蛍光アッセイは、放射性標識または酵素標識のいずれかの感度を欠
き、このことは、蛍光アッセイを、研究と臨床的適用との両方に対して、めった
に選択されないアッセイ法にしている。
【０００６】 シグナル生成の標識としての、化学発光反応は、最も高感度であり、そして数
十年間、存在している。ＤＮＡ技術における近年の進歩は、シグナルジェネレー
ターとしてのこれらの標識の利用を拡張させてきたが、化学発光生成物を形成す
る公知の反応の数が制限されているので、発光アッセイ法が、現在、利用されて
いる。また、発光反応は、１つ以上の化学的活性化工程を必要とし、そしてこれ
らの反応の自動化は困難であるが、必要とされる計装は、蛍光ほどには複雑では
ない。種々の形式および大きさの、多数の発光測定器、すなわち照度計が、利用
可能である場合でさえも、発光の自動化は複雑であり、そして結合アッセイを実
施するために完全に自動化された照度計は、少なくとも簡便な小型の分析器にお
いては、利用可能ではない。
【０００７】 結合アッセイにおけるシグナル生成のための標識として利用される、最も通常
の発光方法は、化学発光である。これは、発光シグナル、すなわち、化学発光標
識および生物発光標識を生じるために利用される方法に従って、分類され得る。
生物発光とは、生物学的分子による光の放出をいい、そして真の酵素であり得る
生物発光タンパク質を利用する。例は、ルシフェラーゼ（これは、オキシルシフ
ェリンの放出および発光を伴って、ルシフェリンの酸化を触媒する）および発光
タンパク質（これは、ルシフェリンの酸化を触媒して光を放出するが、酸化され
た物質を放出しない）である。
【０００８】 カルシウム感受性発光タンパク質（エクオリン、オベイン（Ｏｂｅｉｎ）、ニ
ミオプシン（Ｍｎｅｍｉｏｐｓｉｎ）、ベロビン（Ｂｅｒｏｖｉｎ）、フォラシ
ン（Ｐｈｏｌａｓｉｎ）、ルシフェラーゼ、ならびに漂泳生物（Ｐｅｌａｇｌａ
）、ウミホタルおよび貝虫亜網から単離された発光タンパク質が挙げられる）は
、広く研究され、そして結合アッセイにおいて、使用された。さらに、これらの
うちのいくつかの遺伝子がクローニングされ、多量の生成を可能にした。エクオ
リンは、カルシウム感受性発光タンパク質のこの群の、最も通常に研究され、そ
して使用される、メンバーである。
【０００９】 天然のエクオリン（クラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）から単離される）は、精製さ
れ、そして種々のモニタリングシステムにおいて、標識として利用されてきた。
天然のエクオリンは、ＭＷ ２１，０００ダルトンの単一のポリペプチド鎖（ア
ポエクオリンと呼ばれる）からなり、堅固に結合した、１モルずつの腔腸動物ル
シフェリンおよび酸素を含む。この複合体は、カルシウムイオンの非存在下で安
定である。エクオリンはまた、例えば、Ｃｏｒｍｉｅｒ，Ｍ．Ｊ．、米国特許第
５，１６２，２２７号およびＺｅｎｎｏ，Ｓ．ら、米国特許第５，２８８，６２
３号により議論されるように、組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。さらに
、増強された生物発光特性を有する、エクオリンの修飾された形態はまた、Ｐｒ
ａｓｈｅｒ，Ｄ．、米国特許第５，３６０，７２８号により開示されるように、
組換えＤＮＡ手順によって、生成された。
【００１０】 エクオリンの光子放出の機構は、十分に理解されている。エクオリンは、カル
シウムイオンに対する高い親和性を有する。過剰のカルシウムイオンの存在下で
は、エクオリンは、増殖型の「フラッシュ反応」（これは、比較的高い量子収量
で、約１０秒間持続する）の発生を伴う単一の代謝回転事象で、ルシフェリンの
オキシルシフェリンへの酸化を触媒する。ピーク光の発光は、１モルのエクオリ
ンあたり３モルのカルシウムイオンの結合の際に開始されるが、少量の遊離カル
シウムとのエクオリンの結合は、セレンテラジン（ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎ
ｅ）の部分的な酸化を生じ、そしてアポエクオリン、セレンテラミド（ｃｏｅｌ
ｅｎｔｅｒａｍｉｄｅ）、ＣＯおよび光を生じる。
【００１１】 エクオリンは、アトモルのレベルで検出され得、そしてその発光の波長は非常
に狭く、そして市販の照度計を使用して検出され得るので、エクオリンの発光は
、速度、高感度、および低いバックグラウンドを伴う正確さを含む、多くの利点
を示す。従って、エクオリンは、結合アッセイにおいて標識として有用であるこ
とが示された。さらに、エクオリンの、種々の結合剤（例えば、レセプター、ホ
ルモン、レクチン、抗体、抗原、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、および
糖タンパク質）との安定な結合体が開発されており、そして多数のこのような結
合体は、市販されている。
【００１２】 ストレプトアビジンと組み合わせて利用される場合に、エクオリンのビオチン
化誘導体は、マイクロタイタープレートのウェルまたはニトロセルロース膜に固
定された、ナノグラム〜ナノグラム未満の量の標的分析物（タンパク質およびＤ
ＮＡが挙げられる）を検出する能力を示す。エクオリンを使用する、市販の照度
計は、特定の時点でカルシウムを注入するためのインジェクターを備えて設計さ
れる。エクオリンを利用するいくつかの臨床試験アッセイが採用されているが、
照度計は自動化されておらず、そしてカルシウムの溶液のタンクが備えられなけ
ればならない。このことによって、これらの照度計は、専門ではない人物による
使用に対して不都合となる。エクオリンおよび全血を利用する、発光結合アッセ
イは、Ｐａｎｋｒａｔｚら、米国特許第５，８７６，９３５号により開示される
。
【００１３】 生物の細胞において、カルシウム（Ｃａ）は、広範な種々のプロセス（筋収縮
、神経伝達物質放出、イオンチャンネルゲーティング、およびエキソサイトーシ
スのような、生理学的重要性、生化学的重要性および病態生理学的重要性を有す
るプロセス）のための、重要な細胞内二次メッセンジャーである。細胞内カルシ
ウムの迅速な変化および放出を理解および測定する試みは、カルシウムケージン
グ化合物と呼ばれる、あるクラスのカルシウム感受性の化合物の導入を生じた。
カルシウムケージング化合物は、カルシウムでロードされる能力、および刺激の
際にこれらのカルシウムをアンロードする能力を有する。ケーシングされたカル
シウムのアンローディングは、いくつかの方法によって誘導され得、これらの方
法の１つは、光への曝露を介するものである。ケージ化合物からの、カルシウム
の、光により刺激される放出（光分解と呼ばれる）は、通常、代表的にはＵＶの
３５０〜４００ｎｍの領域のスペクトルのレーザーパルスを用いて、１秒より短
い時間にわたる照射によって、なされる。２つの異なるクラスのＣａケージング
化合物が、採用された；ｎｉｔｒ−５およびｎｉｔｒ−７のような、ＢＡＰＴＡ
誘導体、ならびにＤＭ−ニトロフェンおよびニトロフェニル−ＥＧＴＡのような
、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡの誘導体。ＢＡＰＴＡとは、１，２−ビス（オルト−
アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸である。ｎｉｔｒ−７
とは、シス−１−（２−ビス（カルボキシメチル）アミノ−５−（１−ヒドロキ
シ−１−（２−ニトロ−４，５−メチレンジオキシフェニル）メチル）フェノキ
シ）−２−（２−ビス（カルボキシメチル）アミノ−５−メチルフェノキシ）シ
クロペンタンである。ｎｉｔｒ−５とは、１−［２−アミノ−５−（１−ヒドロ
キシ−１−［２−ニトロ−４，５−メチレンジオキシフェニル］メチル）フェノ
キシ］−２−）２’−アミノ−５’メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，
Ｎ’−四酢酸である。ＤＭ−ニトロフェンとは、１−（４，５ジメトキシ−２−
ニトロフェニル）−１，２ジアミノエタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸であり
、そしてニトロフェニル−ＥＧＴＡとはすなわち、ニトロフェニルエチレンビス
（オキシエチレンニトリロ）四酢酸である。後者のクラスは、カルシウムに対す
る既知の高い親和性を有するキレート剤の、感光性誘導体を生成するために、設
計された。米国特許第５，４４６，１８６号および米国特許第４，９８１，９８
５号を参照のこと。ＤＭ−ニトロフェンおよびニトロフェニル−ＥＧＴＡのカル
シウムケージング化合物は、カルシウム選択性という利点を示す。照射の際に、
キレートされたカルシウムは、切断され、ここでその後の切断された残りのもの
は、放出されたカルシウムに対してかなりより低い親和性を有する。従って、多
量のカルシウムが、迅速に放出される。これらの感光性カルシウムケージング化
合物は、市販されている。
【００１４】 感光性カルシウムケージング化合物を利用する結合アッセイ（例えば、イムノ
アッセイまたは核酸結合アッセイ）は、有用である。
【００１５】 （発明の要旨） カルシウムケージング化合物およびカルシウム感受性発光化合物を利用する、
レセプター−リガンド結合アッセイを実施するための方法が、ここで見出された
。
【００１６】 従って、本発明の１つの局面は、溶液中の分析物の存在を検出するための、結
合アッセイを実施するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する
： （ａ）第一の結合パートナーをこの溶液と接触させる工程であって、この第一
の結合パートナーは、カルシウム感受性化学発光材料と結合体化している、工程
； （ｂ）ある期間の後に、この第一の結合パートナーを、捕獲ストリップの細長
マトリックスの片側に沿って所定の方向に移動させる工程であって、これによっ
て、この第一の結合パートナーを、この捕獲ストリップ上に横断するよう位置す
るストライプと接触させ、この横断ストライプには、第二の結合パートナーが固
定され、そしてカルシウムケージング化合物を含む、工程； （ｃ）この第一の結合パートナーがこの横断ストライプ上に固定された第二の
結合パートナーと接触するに十分な期間を許容する工程； （ｄ）この捕獲ストリップの横断ストライプを、紫外線のパルスに露出して、
カルシウムケージング化合物からのカルシウムの放出を引き起こす工程；ならび
に （ｅ）このカルシウム感受性発光材料により放出された発光を測定する工程。
【００１７】 本発明の別の局面は、溶液中の分析物の存在を検出するための、結合アッセイ
を実施するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する： （ａ）この溶液を、結合反応の第一の結合パートナーと接触させる工程であっ
て、この第一の結合パートナーは、固体表面上に固定されており、この固体表面
は、常磁性粒子であり、そしてこの第一の結合パートナーは、カルシウム感受性
発光材料と結合体化している、工程； （ｂ）ある期間の後に、この常磁性粒子を、捕獲ストリップの細長マトリック
スの片側に沿って所定の方向に移動させる工程であって、これによって、この粒
子を、この捕獲ストリップ上に横切って位置する第二の結合パートナーのストラ
イプに接触させ、この捕獲ストリップは、この横断ストライプ上に固定された第
二の結合パートナーを有し、この横断ストライプは、カルシウムケージング化合
物をさらに含む、工程； （ｃ）この常磁性粒子がこの横断ストライプ上に固定された第二の結合パート
ナーと接触するに十分な期間を、許容する工程； （ｄ）この捕獲ストリップの横断ストライプを紫外線のパルスに曝露して、カ
ルシウムケージング化合物からのカルシウムの放出を引き起こす工程；ならびに （ｅ）このカルシウム感受性発光材料により放出される発光を測定する工程。
【００１８】 本発明の好ましい実施形態において、この方法は、抗原を検出および定量する
ためのイムノアッセイ、抗体を検出および定量するためのイムノアッセイ、また
は特定の配列の核酸を検出および定量するための核酸ハイブリダイゼーションア
ッセイである。
【００１９】 別の実施形態において、この溶液は、工程（ａ）においてカルシウム感受性の
化学発光材料と接触される前に、前処理される。特に、カルシウムを除去するた
めに濾過され、このフィルターは、カルシウムの除去のための薬剤を含む。
【００２０】 別の実施形態において、この溶液は、全血であり、この全血は、常磁性粒子と
接触させる前に、濾過によって前処理される。
【００２１】 さらなる実施形態では、発光材料は、カルシウム感受性発光材料、特に、エク
オリン、Ｏｂｅｌｎ、Ｍｎｅｍｉｏｐｓｉｎ、Ｂｅｒｏｖｉｎ、Ｐｈｏｌａｓｉ
ｎ、ルシフェラーゼまたはＰｅｌａｇｉａ、Ｃｙｐｒｉｄｉｎａおよび貝虫亜綱
から単離された発光タンパク質である。
【００２２】 なおさらなる実施形態では、紫外線は、２５０〜４００ｎｍの範囲の光のパル
スの形態であり、そして発光は、光電子増倍管により測定される。特に、カルシ
ウム感受性発光材料は、エクオリンであり、そして光電子増倍管は、４００〜６
００ｎｍの光を検出し、かつ磁界から保護される。
【００２３】 他の実施形態では、細長い捕捉ストリップは、ニトロセルロース、ポリアクリ
ルアミドまたは他の天然ポリマーまたは合成ポリマーから形成され、そして固定
された第２の結合パートナーを有しかつカルシウムケージング化合物が染み込ん
だ横断ストライプを有する。
【００２４】 さらなる実施形態では、このカルシウムケージング化合物は、上記カルシウム
感受性発光材料に対して過剰な化学量論のカルシウムが装填される。好ましくは
、このカルシウムケージング化合物は、ｎｉｔｒ−５、ｎｉｔｒ−７、ＤＭ−ニ
トロフェンまたはニトロフェニル−ＥＧＴＡである。
【００２５】 本発明のさらなる局面は、溶液中の被検物の存在を検出するための結合アッセ
イを行うための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する： （ａ）固体表面上に結合反応の第１の結合パートナーを固定する工程であって
、上記固体表面は、常磁性粒子であり、上記第１の結合パートナーがビオチン化
されている、工程； （ｂ）上記第１の結合パートナーを上記溶液と接触させる工程； （ｃ）第２の結合パートナーと溶液とを接触させる工程であって、上記第２の
結合パートナーは、カルシウム感受性発光材料と結合体化されている、工程； （ｄ）ある期間の後に、上記捕捉ストリップ上を横切って位置するストライプ
と粒子とを接触させるために、捕捉ストリップの細長いマトリックスの片側に沿
う所定の方向に常磁性粒子を固定する工程であって、上記捕捉ストリップは、上
記横断ストライプ上に固定されたストレプトアビジンを有し、上記横断ストライ
プは、カルシウムケージング化合物をさらに含む、工程、 （ｅ）常磁性粒子を上記横断ストライプ上に固定された上記ストレプトアビジ
ンと十分な時間接触させる工程、 （ｆ）上記捕捉ストリップの上記横断ストライプを紫外線のパルスに露出し、
カルシウムケージング化合物からのカルシウムの放出を行う工程；および （ｇ）カルシウム感受性発光材料により放出される発光を測定する工程。
【００２６】 １つの実施形態において、工程（ｂ）および（ｃ）は、同時に行われる。
【００２７】 本発明のなお別の局面は、溶液中の被検物の存在を検出するために結合アッセ
イを行うための方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する： （ａ）上記溶液と第１の結合パートナーとを接触させる工程であって、上記第
１の結合パートナーは、ビオチン化されている、工程； （ｂ）ある期間の後に、第２の結合パートナーと上記溶液とを接触させる工程
であって、上記第２の結合パートナーは、カルシウム感受性発光材料と結合体化
している、工程； （ｃ）さらにある期間の後に、上記捕捉ストリップ上を横切って位置するスト
ライプと結合パートナーとを接触させるために、捕捉ストリップの細長いマトリ
ックスの片側に沿う所定の方向で結合パートナーを固定する工程であって、上記
捕捉ストリップは、上記横断ストライプ上に固定されたストレプトアビジンを有
し、上記横断ストライプは、カルシウムケージング化合物をさらに含む、工程、 （ｄ）結合パートナーを上記横断ストライプ上に固定された上記ストレプトア
ビジンと十分な時間接触させる工程、 （ｅ）上記捕捉ストリップの上記横断ストライプを紫外線のパルスに露出し、
上記カルシウムケージング化合物からのカルシウムの放出を行う工程、および （ｆ）カルシウム感受性発光材料により放出される発光を測定する工程。
【００２８】 １つの実施形態では、工程（ａ）および（ｂ）は、同時に行われる。
【００２９】 さらなる実施形態では、細長い捕捉ストリップは、ストレプトアビジンおよび
カルシウムケージング化合物を染み込ませた横断ストライプを有する。
【００３０】 なおさらなる局面では、本発明は、結合アッセイのための細長い捕捉ストリッ
プを提供し、このストリップは、結合パートナーおよびケージされたカルシウム
化合物を染み込ませたこのストリップの横断区分を有する。
【００３１】 好ましい実施形態では、この捕捉ストリップは、ニトロセルロース、ポリアク
リルアミド、ポリアミドまたは任意のほかの合成ポリマーまたは天然に存在する
ポリマーから形成される。
【００３２】 別の実施形態では、この捕捉ストリップは、ハウジング、特に、単回使用試験
カートリッジとしての支持体内に存在する。
【００３３】 さらなる実施形態では、結合パートナーは、ストレプトアビジンである。
【００３４】 本発明のさらなる実施形態は、プラスチックカートリッジを提供し、このカー
トリッジは、以下を含む： ハウジングであって、このハウジングは、サンプルを受けるための１つのレセ
プタクル、常磁性粒子上に固定されたビオチン化された第１の結合パートナーお
よびカルシウム感受性化学発光材料と結合体した第２の結合パートナーを含むリ
ザーバ、ハウジング内にありかつリザーバに流体連絡する細長い捕捉ストリップ
を含むリザーバを有し、上記捕捉ストリップは、ストレプトアビジンおよびカル
シウムケージング化合物を染み込ませたストッリップの横断区分を有し、上記横
断区分は、光バリアで保護されている、ハウジング。
【００３５】 好ましい実施形態では、レセプタクルとリザーバとの間のフィルター、特に、
カルシウムの除去のための薬剤を含むフィルターが存在する。
【００３６】 さらなる実施形態は、以下を備えるハウジングを含む、結合アッセイを行うた
めの装置を提供する：（ａ）上記プラスチックカートリッジを受けるためのレセ
プタクル；（ｂ）横断ストライプ上の光保護層を除去するための手段；（ｃ）磁
界を提供するための電磁石；（ｅ）捕捉ストリップの予め選択された部分上に光
を照射するための紫外光源、および（ｆ）捕捉ストリップの予め選択された部分
により放出された光を受けるために配置された光電子増倍管。
【００３７】 （発明の詳細な説明） 本発明は、結合反応の結合パートナーの検出および定量化のために使用され得
るが、本明細書中では、好ましいビオチン−ストレプトアビジン反応および常磁
性粒子をさらに使用する抗原の検出および定量化のためのサンドイッチ免疫アッ
セイを特に参照して記載される。
【００３８】 図１は、概して１により示される捕捉ストリップを示す。捕捉ストリップ１は
、細長いマトリックス２を有する。細長いマトリックス２は、それらの上の結合
した免疫複合体を有する常磁性粒子を、磁界の影響かで捕捉ストリップに沿って
通過させる、マトリックス組成物から形成される。このマトリックス化合物の例
としては、ニトロセルロース、ポリアクリルアミド、ポリアミドまたは他の合成
ポリマーまたは天然に存在するポリマーが挙げられる。別の実施形態では、この
マトリックスは、微小流体チャネル、特に捕捉ストリップ中にエッチングされた
チャネルの形態である。この実施形態では、マトリックス組成物は、必要ではな
い。捕捉ストリップは、特に横断ストライプ３の位置では、光の通過を可能にす
るために、クリアな物質から形成されなければならない。このような物質の例と
しては、アクリルポリマー、ポリスチレン、アクリロニトリル−ブタジエン−ス
チレン（ＡＢＳ）、ポリカーボネートおよび他の透明なポリマーが挙げられる。
【００３９】 細長いマトリックス２は、１つの端部に向かって位置付けられる横断ストライ
プ３を有し、このような端部は入口端部４に対して反対側にある。横断ストライ
プ３は、ストレプトアビジンとカルシウム装填されたカルシウムケージング化合
物５または本明細書中に開示されるような他の化合物との両方を含む。
【００４０】 図２は、概して１０により示される免疫アッセイ反応を行うためのプラスチッ
クカートリッジを示す。プラスチックカートリッジ１０は、カートリッジハウジ
ング１１を有する。カートリッジハウジング１１は、フィルター１２を含むサン
プル受容レセプタクル、常磁性粒子１４およびそれらの上の第２の結合パートナ
ーを収納するためのリザーバ１３ならびに粒子経路１５を有する。粒子経路１５
は、リザーバ１３に流体連絡しており、そしてリザーバ１３から捕捉ストリップ
１６へ誘導し、ここでは、経路１５は、捕捉ストリップ１６の細長い経路１７に
沿って、横断ストライプ１８へ延びる。フィルター１２、リザーバ１３および捕
捉ストリップ１６は、全て、プラスチックカートリッジ１０の一部を形成するホ
ルダー１９内に位置付けられる。使用の前、すなわち光源からの光に曝される前
に、少なくとも横断ストライプ１８が、取り除かれる、横断ストライプ１８上の
剥離可能な保護光バリアを有することは理解される。さらに、細長い捕捉ストリ
ップは、横断ストライプ１８から通過する試薬を受けるためのサンプル受容レセ
プタクルの反対の端部で、排出リザーバ２０と連絡している。
【００４１】 図３は、概して３０により示される試験台装置を示す。試験台装置３０は、ハ
ウジング３１を有する。ハウジング３１内には、プラスチックカートリッジ３２
、電磁石３３、紫外光源３４および光電子増倍管３５が存在する。プラスチック
カートリッジ３２は、前に記載されており、そして台装置３０のハウジング３１
のレセプタクル内に設置され得る。電磁石３３は、プラスチックカートリッジ３
２の長さにわたって延びる。電磁石３３は、好ましくは、捕捉ストリッ１６への
細長い経路１７に沿った常磁性ビーズ（粒子）の移動を促進する部分的な所定の
磁界から構成される。紫外光源３４は、前に記載されたプラスチックカートリッ
ジ３２に、そして特に、プラスチックカートリッジ３２の横断ストライプ１８に
、方向付けられる。光電子増倍管３５もまた、横断ストライプ１８に方向付けら
れる。
【００４２】 試験台装置３０は、ディスプレイ３６（これは、代表的には、ＬＣＤディスプ
レイである）をさらに有する。ハウジング３１はまた、適切なコントロールなら
びに関連のコンピューターハードウェアおよび得られる結果の適切な解釈を可能
にするソフトウェアを含む。
【００４３】 使用に際して、抗原を含むサンプル（たとえば、血液）が、フィルター１２の
上に置かれる。標的被検物を含む液体が、リザーバ１３中へフィルター１２を通
過し、ここでは、このサンプルは、その上に固定されたビオチン化された第１の
結合パートナー（捕捉パートナー）およびカルシウム感受性発光標識と結合体化
した第２の結合パートナー（検出パートナー）を有する常磁性粒子と接触する。
さらに、カートリッジが抗原を検出しそして定量するように設計される場合、第
１および第２の結合パートナーが抗体であることは理解される。他方、カートリ
ッジが抗体を検出するために設計される場合、第１の結合パートナーは、抗原で
あり、一方、第２の結合パートナーは抗体である。
【００４４】 次いで、プラスチックチックカートリッジ１０、３２がまだ台内に配置されて
ない場合、このカートリッジは、試験台３０に置かれる。プラスチックカートリ
ッジ１０の捕捉ストリップ１６のうち少なくとも横断ストライプ１８が光から保
護される必要があることは理解される。このような保護は、光を通さない様式で
、試験台３０内で取り除かれる。このような除去は、自動であり得る。
【００４５】 結合反応のための適切な期間の経過後、電磁石３３を使用して磁界が適用され
る。次いで、常磁性粒子および付着した免疫複合体は、粒子経路１５に沿って移
動しそして捕捉ストリップ１６に入る。次いで、この粒子は、横断ストライプ１
８に達するまで、捕捉ストリップ１６に沿って通過する。その時、粒子は、既に
横断ストライプ１８に配置されたストレプトアビジンに、粒子上に固定されたビ
オチン化された結合パートナーを介して結合する。横断ストライプ１８は、さら
にカルシウムケージング化合物を含む。
【００４６】 適切な時間経過後（これは、特に捕捉ストリップ１６の寸法に依存するが、好
都合には、４〜６分であり得る）、紫外光源３４を起動し、そして光のパルスを
横断ストライプ１８上に送る。この光は、カルシウム装填されたカルシウムケー
ジング化合物からのカルシウムの放出（これは、必然的に直ちに生じる）を引き
起こす。このカルシウムは、カルシウム感受性化学発光材料に接触し、次いでこ
れは、４〜１０秒の範囲の短時間、輝く。放出される光は、光電子増倍管３５に
より検出され、そして放出された光の量は、解釈されそしてディスプレイ３６に
表示される。光の放出の速度は、紫外光源のエネルギーに依存する。高エネルギ
ーレベルは、高い放出の速度、すなわち放出された光の鋭いピークを引き起こす
が、放出された光が幅広なバンドであるように、低エネルギーレベルが使用され
ることが好ましい。これは、本明細書中に記載されるように、特にゼロまたはヌ
ル（ｎｕｌｌ）点に対する光電子増倍管の再設定の完了の前に光の放出が開始さ
れた場合、光電子増倍管による光の量のより正確な記録を導く。
【００４７】 本発明の方法に供される、標的被検物を含むかまたは含む恐れのある溶液の供
給源のいくつかの例は、血液または血液製品、唾液、または任意の他の体液であ
る。他の溶液は、試験され得る。
【００４８】 シグナル生成標識としてカルシウム感受性発光材料を使用する結合アッセイに
おいて、カルシウム感受性発光結合体と接触する溶液は、光の放出を生成する瞬
間の前は、カルシウムを有さないべきである。溶液中のカルシウムは、カルシウ
ム感受性発光結合体と反応する。特に、その溶液は、２０ナノモーラー未満のカ
ルシウムを含むべきである。さらに、目的が、全血中の被検物の存在を決定する
ことである場合、血液のサンプルは、結合アッセイの特定のシグナルに干渉し得
る細胞成分およびヘモグロビンを除去するために、通常、前処理されなければな
らない。カルシウムキレート剤中に浸漬されたフィルターは、細胞成分の除去の
機能、および標的被検物を含む溶液からのカルシウムの除去の機能の両方を達成
する。
【００４９】 本明細書中に開示される本発明の方法は、結合アッセイにおいてシグナルを生
成するための任意のカルシウム感受性発光材料を利用し、これには、エクオリン
、ミトロコミン（ｍｉｔｒｏｃｏｍｉｎ）、クリチン（ｃｌｙｔｉｎ）、オベイ
ン、ニミオプシン、ベロビン、ハリスタウリン（ｈａｌｉｓｔａｕｒｉｎ）およ
びフィアリジン（ｐｈｉａｌｉｄｉｎ）が挙げられるが、これらに限定されない
。エクオチン以外のカルシウム感受性発光性の発光タンパク質をを使用する場合
、エクオリンシグナルを検出するための最適の波長である４６９ｎｍ以外は、光
電子増倍管の最適な波長は、それに応じて適応されなければならない。例えば、
波長は、４００〜６００ｎｍであり得る。
【００５０】 カルシウムケージング化合物の光分解は、波長が２５０〜４００ｎｍ内の光を
発生する多くの光源によって達成され得る。そのような光源は、本明細書中にお
いて紫外光源としていわれる。１つのそのような光源は、レーザー光源であり、
これは、３００〜３５０ｎｍの波長において１ミリ秒未満で光を正確に伝達する
ために好都合な供給源である。光が誘発する場合にカルシウムがケージング化合
物から放出される際および１モルのエクオリン当たりに３モルのカルシウムが結
合する際、発光は、約１０秒間持続する青色光のフラッシュで開始される。次い
で、生成された光は、ピーク光および全光子計数の両方として、適切な光電子増
倍管を用いて測定され得る。
【００５１】 本発明の方法は、好ましくは時間分解機構、特に時間分解化学発光を利用する
。本方法において、紫外光源によって放出されるフラッシュとカルシウム感受性
発光材料による発光との間の短い期間が存在する。カルシウム感受性発光材料は
、そのような期間を得るように選択される。光電子増倍管は、紫外光源からのフ
ラッシュ、続くゼロ期間または実質的にゼロの光の後の、迷走光を記録し、次い
でこれは、発光が続く。ゼロの光の期間の後、光電子増倍管上の読取りは、ゼロ
またはヌルの点にリセットされ得、これによって、発光のより正確な読み取りを
可能にする。光のパルスおよび発光との間の期間は短いが、そのような時間は、
光電子増倍管をゼロのベースラインへリセットするのに十分である。
【００５２】 紫外光源は、一般的に、捕獲ストリップから遮蔽されるべきであり、その光は
、例えば、コートされた石英レンズを用いて横断ストライプ上に集中される。本
明細書中に議論されるように、光源の強度は、変化され得るが、１つの実施形態
では、少なくとも１５０ｍＪである。
【００５３】 ネイティブなカルシウム感受性発光性の発光タンパク質は、結合アッセイの実
施に関する本発明の方法における標識として、特に有用である。再生能力または
カルシウムに対するより高い親和性のいずれかに起因して、増強された発光を有
するこれらの発光タンパク質の、他の改変された組換えＤＮＡ由来形態がまた、
本発明の方法に適合している。
【００５４】 エンケージング（ｅｎｃａｓｉｎｇ）化合物（例えば、光感受性リポソーム）
が大規模に研究されているが、陽イオン特異的ケージング化合物の最近の導入は
、本発明の方法を実行する際に特に有用である。最近導入された２つのクラスの
カルシウムケージング化合物（これは、キレート剤の誘導体である）が、特に有
用である。なぜなら、これらは、より安定であり、そしてこれらの誘発機構は十
分に規定されているからである。特に、ＥＤＴＡ（エチレンジニトリロ四酢酸二
ナトリウム塩）およびニトロフェニル−ＥＧＴＡ（エチレンビス（オキシメチレ
ンニトリロ）四酢酸）のＤＭニトロフェン誘導体の分解誘導体は、一旦光誘発さ
れると、カルシウムに対して非常に低い親和性を有する。また、切断化合物の蛍
光波長は、カルシウム感受性発光性の発光タンパク質の波長よりも、かなり異な
り、そして非常に短期間続く。これらの光感受性カルシウムケージング化合物は
、市販される。
【００５５】 横断ストライプ上の検出材料は、ガラスビーズ上に配置されて固定され得、こ
れは、これは広い表面積の検出材料を提供する。
【００５６】 高親和性のビオチン／ストレプトアビジン反応の開発に、アトモルレベルで検
出され得るエクオリンを組み合わせることは、ナノグラム以下の検出レベルで分
析物を測定するための、本発明の方法の非常に高い感度を提供する。さらに、ス
トレプトアビジンの改変形態はまた、本発明の方法に適合性であり、そしてスト
レプトアビジンおよびその誘導体の両方は、捕獲マトリックスストリプの側方の
横断ストリップ上に容易に固定され得る。
【００５７】 結合アッセイを実施するために本発明の方法に従って、結合物（ｂｏｕｎｄ）
の遊離発光標識からの分離は、磁場を適用することによって引起される。磁場に
供された浮遊した磁気粒子に対する力が、この粒子がより強い場の領域、代表的
には磁石の極に向かって移動するよう促すこと、そして、この力の強さが、場の
勾配および場による粒子中に誘導された磁気の両方に依存することが認識される
。従って、迅速な分離のために、強力な分離器およびより高く磁化可能な粒子が
、好ましいようである。さらに、電磁石は、所定の最適化された方向で、いくつ
かの場の勾配を生成し得る。
【００５８】 ０．７〜１．５ミクロンの範囲の微視的磁気粒子は、本発明の方法に適合性で
あり、そして、これらはタンパク質でコートするための広い表面積を提供する場
合、使用され得る（例えば、米国特許第３，９７０，５１８号；同第４，０１８
，８８６号；同第４，２３０，６８５号；同第４，２６７，２３４号；同第４，
４５２，７７３号；同第４，５５４，０８８号；および同第４，６５９，６７８
号に開示される）。しかし、米国特許第５，７３６，３４９号に記載されるよう
に、０．０３〜１０、特に、０．５〜１．０μｍのサイズのより小さいサイズの
常磁気性粒子が、より適している。なぜなら、大きいサイズの磁気材料の粒子は
、磁場を取り除いた後に、残存磁気に起因して互いに付着する傾向があるからあ
である。適切な磁気材料としては、強磁性材料、フェリ磁性材料および超常磁性
材料が挙げられる。他の適切な磁気材料としては、フェライト、灰チタン石、ク
ロマイト、および磁鉛鉱のような酸化物が挙げられる。ニッケル粒子もまた、使
用され得る。
【００５９】 標的分析物保有磁気粒子を試験媒体から分離するために使用される、磁気分離
装置／方法は、磁気粒子の性質およびサイズに依存する。本発明に適したミクロ
ンサイズの粒子は、市販の磁気分離デバイスの手段によって、溶液から容易に除
去される。これらのデバイスは、試験媒体を保持する容器に対して外側に配置さ
れた、単一の比較的安価な永久磁石を使用する。そのような磁気分離器の例は、
Ｓｅｒｏｎｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｎｏｒｗｅｌｌ，Ｍａｓｓ．によって
製造されるＭＡＩＡ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ、ＤＹＮＡＬ，Ｉ
ｎｃ．，Ｇｒｅａｔ Ｎｅｃｋ，Ｎ．Ｙ．によって製造されるＤＹＮＡＬ ＭＰ
Ｃ−１、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇ
ｅ，Ｍａｓｓによって製造されるＢｉｏＭａｇ Ｓｅｐａｒａｔｏｒである。本
発明のために好ましい磁気分離器は、いくつかの整列された場の勾配を有する。
特に、複数の磁石を使用して、常磁性粒子の攪拌を引起し、次いで、捕獲ストリ
ップ上または捕獲ストリップに沿ってこの粒子を容器から連続的に移動させ得る
。この磁石は、独立して操作され得るか、および／または、攪拌、次いで所定の
経路に沿った移動（例えば、捕獲ストリップへ、次いで横断ストライプへ）をも
たらすように調整された順序で操作され得る。磁気粒子の攪拌における磁石の使
用の例は、米国特許第５，８３５，３２９号に開示される。
【００６０】 バイオアッセイを開発する際に、臨床研究室における価値を獲得するために、
このアッセイについて考慮する点が多く存在する。第一つの考慮する点は、分析
物の濃度における変化に対する、シグナル応答である。第二の考慮する点は、こ
のアッセイに関するプロトコールが容易に実行され得ることである。第３の考慮
は、サンプルからサンプルへの干渉における変化である。また、試薬の調製およ
び精製の容易さ、装置の有効性、自動化の容易さ、および目的の材料との相互作
用は、有用なアッセイを開発する際のさならる考慮する点のうちのいくつかであ
る。
【００６１】 結合アッセイを実行するための本発明の方法は、そのような考慮する点に改善
を与える。本発明は、高感度の発光、カルシウム感受性発光材料（特に、エクリ
オン）の有効性、感受性および高い量子収量、手動でカルシウムを注入すること
なく、カルシウムにおける変化に対して応答するようなカルシウム感受性発光材
料の物理的特性、磁場から干渉されることなく、生成された光子を検出し得る光
電子増倍管を用いた市販のルミノメーターの有効性、および注意深い試験という
点を簡便にする固体クロマトグラフィーの捕獲マトリックスの開発を提供する。
より重要なのは、ケージされたカルシウムを励起する波長（２４０〜４００ｎｍ
）と生成された光子を測定するための波長（４５０〜５００ｎｍ）における大き
な差異が、紫外光源からの入射光からの干渉を伴なわずにか、または、媒体の蛍
光に起因して、発光の検出を容易にすることである。従って、本明細書中に記載
されるような時間分解化学発光が、使用される。
【００６２】 カルシウム感受性化学発光標識を利用するレセプター−リガンド結合反応を保
有する本発明は、表面上に固定されたビオチン化された第一の結合パートナーを
有する常磁性粒子、第二の結合パートナーと結合体化された化学発光材料、およ
び本方法の好ましい実施形態のように抗原を検出および定量するための完全なサ
ンドイッチイムノアッセイを実行するためのストレプトアビジンと関連するカル
シウムケージング化合物に関して本明細書中に記載される。しかし、本発明の方
法が、レセプター−リガンド結合反応の標的分析物の場合と同様に、抗体および
核酸を検出する場合に同等に有益であることが、理解される。また、本発明の方
法は、カルシウム感受性発光材料に結合体化され、常磁性粒子上に固定された第
一の結合パートナー、およびカルシウムケージング化合物と共に捕獲ストリップ
の横断ストライプに固定された第二の結合パートナーを用いて実行され得ること
が、理解される。
【００６３】 本発明は、以下の実施例によって示される。
【００６４】 （実施例Ｉ） １０μｌ中の５μｇのエクオリンを、塩化カルシウムを含む緩衝化された１−
（４，５ジメトキシー２−ニトロフェニル）−１，２ジアミノエタン−Ｎ，Ｎ，
Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＤＭ−ＮＰ）の２００μｌ溶液に添加した。この溶液は、
８０ｍＭの４−モルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液および２０ｍ
ＭのＫＣｌを含み、溶液のｐＨを、７．２に調整した。ＤＭ−ＮＰを、カルシウ
ムを用いて７５％までロードした（すなわち、２ｍＭ ＤＭ＿ＮＰ＋１．５ｍＭ
ＣａＣｌ2）。
【００６５】 溶液からの光電子放出を、４７０ｎｍの波長で３０秒間モニターした。得られ
た結果を図４に示し、これは、最小の発光を示した。次いで、溶液を、３４７ｎ
ｍの波長の紫外線を用いて光分解させた。光のパルスは、１００ｍＪであった。
【００６６】 得られた結果を、図５に示し、そして図４および図５の結果を、図６において
組み合わせた。
【００６７】 紫外線のパルスが、エクオリンからの光電子放出を誘発するに十分なカルシウ
ムの放出を引き起こすことが、この結果によって示される。紫外線のパルス前に
（図４）、ケージされたカルシウムは、エクオリンからの発光を誘発しなかった
。発光は、３０秒以内で完了した。
【００６８】 （実施例ＩＩ） 実施例Ｉの手順を、５μｇのエクオリンの溶液を用いて繰り返した。個々の実
験において、１ｍＭのＣａＣｌ2および５００μＭのＣａＣｌ2を添加した。紫外
線のパルスの後の全光子計数を、４７０ｎｍで３０秒間モニターした。
【００６９】 結果を、それぞれ、図７および８に示す。ピークの高さは異なるが、放出され
た光子の全量は、同じである。従って、光子の全量を使用して、この反応をモニ
ターし得る。より制御された条件下で（すなわち、手動添加のこれらの実施例で
はない）、ピーク強度もまた、使用され得る。
【００７０】 標的分析物を含むかまたは含むことが疑われる溶液の、レセプター−リガンド
結合反応を実施するための方法。この方法は、第一の結合パートナーを常磁性粒
子の表面上に結合させる工程、第二の結合パートナーをカルシウム感受性発光化
合物に結合体化させる工程；この第一の結合パートナーおよびこの第二の結合パ
ートナーを試験される溶液と接触させる工程、ストレプトアビジンおよびケージ
されたカルシウム化合物を含む横断ストライプを有する捕獲ストリップに沿って
常磁性粒子を固定する工程、この横断ストライプを紫外線のパルスに露出させて
ケージされたカルシウム化合物からのカルシウムの放出を引き起こす工程、およ
びカルシウム感受性発光材料によって放出された発光を測定する工程を包含する
。この方法は、血液試験に使用され得る。装置がまた、開示される。
【００７１】 本発明は、以下の図面において示される実施形態により例示される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明の捕捉ストリップの概略図である。
【図２】 図２は、本発明のカートリッジの概略図である。
【図３】 図３は、本発明の装置の概略図である。
【図４】 図４は、実施例Ｉにおけるサンプルからの光電子放出のグラフである。
【図５】 図５は、紫外線での光分解後の、実施例Ｉにおけるサンプルからの光電子放出
のグラフである。
【図６】 図６は、図５および６におけるグラフの、組み合わされたグラフである。
【図７】 図７は、実施例ＩＩにおけるサンプルからの光電子放出のグラフである。
【図８】 図８は、実施例ＩＩにおけるサンプルからの光電子放出のグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/66 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 1/68 Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｃ Ｇ０１Ｎ 21/78 33/533 33/533 33/558 33/558 33/58 Ｚ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA13 CA25 CA26 CB07 FA12 FA26 FA27 FA29 FB03 FB07 FB13 GC15 HA10 HA14 2G054 AA07 AB04 CA21 EA02 4B024 AA11 CA01 CA09 CA11 HA11 HA14 4B029 AA07 AA21 AA23 BB15 BB16 BB17 BB20 CC01 CC03 CC08 CC11 CC13 FA12 FA15 4B063 QA05 QQ21 QQ41 QQ61 QQ79 QQ89 QR02 QR48 QR56 QR66 QS32 QS34 QX02

Claims (40)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 溶液中の分析物の存在を検出するための結合アッセイを実施
    するための方法であって、以下の工程： （ａ）第一の結合パートナーを該溶液と接触させる工程であって、該第一の結
    合パートナーは、カルシウム感受性化学発光材料に結合体化されている、工程； （ｂ）ある期間の後に、該第一の結合パートナーを、捕獲ストリップの細長マ
    トリックスの片側に沿う所定の方向で、該第一の結合パートナーが該捕獲ストリ
    ップ上に横に配置されたストライプと接触するように移動させる工程であって、
    該横断ストライプは、第二の結合パートナーを固定し、そしてカルシウムケージ
    ング化合物を含む、工程、 （ｃ）該第一の結合パートナーが該横断ストライプ上に固定された該第二の結
    合パートナーと接触するに十分な期間を許容する工程、 （ｄ）該捕獲ストリップの該横断ストライプを、紫外線のパルスに露出させて
    該ケージされたカルシウム化合物からのカルシウムの放出を引き起こす工程；お
    よび （ｅ）該カルシウム感受性発光材料によって放出された発光を測定する工程、
    を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 溶液中の分析物の存在を検出するための結合アッセイを実施
    するための、請求項１に記載の方法であって、以下の工程： （ａ）該溶液を結合反応の第一の結合パートナーと接触させる工程であって、
    該第一の結合パートナーは、固体表面上に固定され、該固体表面は、常磁性粒子
    であり、そして、該第一の結合パートナーは、カルシウム感受性発光材料に結合
    体化されている、工程； （ｂ）ある期間の後に、該常磁性粒子を、捕獲ストリップの細長マトリックス
    の片側に沿う所定の方向で、該粒子が該捕獲ストリップ上に横に配置された第二
    の結合パートナーのストライプと接触するように移動させる工程であって、該捕
    獲ストリップは、該横断ストライプ上に固定された該第二の結合パートナーを有
    し、該横断ストライプは、カルシウムケージング化合物をさらに含む、工程、 （ｃ）該常磁性粒子が該横断ストライプ上に固定された該第二の結合パートナ
    ーと接触するに十分な期間を許容する工程、 （ｄ）該捕獲ストリップの該横断ストライプを、紫外線のパルスに露出させて
    該カルシウムケージング化合物からのカルシウムの放出を引き起こす工程；およ
    び （ｅ）該カルシウム感受性発光材料によって放出された発光を測定する工程、
    を包含する、方法。
  3. 【請求項３】 請求項２に記載の方法であって、ここで、該方法は、抗原を
    検出および定量するためのイムノアッセイ、抗体を検出および定量するためのイ
    ムノアッセイ、または特定の配列の核酸を検出および定量するための核酸ハイブ
    リダイゼーションアッセイである、方法。
  4. 【請求項４】 工程（ａ）においてカルシウム感受性発光材料と接触させる
    前に、前記溶液が、前処理される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記溶液が、カルシウムを除去するために濾過され、該フィ
    ルターが、カルシウム除去のための薬剤を含む、請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、前記溶
    液が、全血であり、該全血は、前記カルシウム感受性発光材料と接触させる前に
    濾過によって前処理される、方法。
  7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、前記カ
    ルシウム感受性発光材料が、エクオリン、オベイン、ニミオプシン、ベロビン、
    フォラシン、ルシフェラーゼまたは漂泳生物、ウミホタルおよび貝虫亜綱から単
    離された発光タンパク質である、方法。
  8. 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法であって、前記紫
    外線が、２５０〜４００ｎｍの範囲の光の、パルスの形態であり、そして、前記
    発光が、光電子増倍管によって測定される、方法。
  9. 【請求項９】 請求項８に記載の方法であって、ここで、前記カルシウム感
    受性発光材料がエクオリンであり、そして、前記光電子増倍管が、４００〜６０
    ０ｎｍの光を検出しかつ磁場から保護されている、方法。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法であって、ここ
    で、前記細長捕獲ストリップが、ニトロセルロース、ポリアクリルアミド、また
    は任意の他の天然もしくは合成のポリマーから形成される、方法。
  11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の方法であって、前記細長捕獲ストリッ
    プが、固定された第二の結合パートナーを有する横断ストライプを有し、そして
    、カルシウムケージング化合物で含浸されている、方法。
  12. 【請求項１２】 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、こ
    こで、前記カルシウムケージング化合物が、前記カルシウム感受性発光材料に対
    して、過剰な化学量論量のカルシウムでロードされる、方法。
  13. 【請求項１３】 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法であって、こ
    こで、前記カルシウムケージング化合物が、シス−１−（２−ビス（カルボキシ
    メチル）アミノ−５−（１−ヒドロキシ−１−（２−ニトロ−４，５−メチレン
    ジオキシフェニル）メチル）フェノキシ）−２−（２−ビス（カルボキシメチル
    ）アミノ−５−メチルフェノキシ）シクロペンタン、１−［２−アミノ−５−（
    １−ヒドロキシ−１−［２−ニトロ−４，５−メチレンジオキシフェニル］メチ
    ル）フェノキシ］−２−）２’−アミノ−５’メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，
    Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、１−（４，５ジメトキシ−２−ニトロフェニル）−１
    ，２ジアミノエタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、およびニトロフェニル−エ
    チレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸からなる群より選択される、方法
    。
  14. 【請求項１４】 抗原を検出および定量するためのイムノアッセイである、
    請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 抗体を検出および定量するためのイムノアッセイである、
    請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記結合アッセイが、特定の配列の核酸を検出および定量
    するための核酸ハイブリダイゼーションアッセイである、請求項１〜１３のいず
    れか１項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記カルシウム感受性発光材料がエクオリンである、請求
    項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記紫外光源が、２５０〜４００ｎｍの範囲のパルス光を
    放出する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記発光が、光電子増倍管によって測定される、請求項１
    〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法であって、こ
    こで、前記カルシウム感受性発光材料がエクオリンであり、そして、前記光電子
    増倍管が、４００〜６００ｎｍの光を検出しかつ磁場から保護されている、方法
    。
  21. 【請求項２１】 溶液中の分析物の存在を検出するための結合アッセイを実
    施するための方法であって、以下の工程： （ａ）結合反応の第一の結合パートナーを固体表面上に固定する工程であって
    、該固体表面が、常磁性粒子であり、該第一の結合パートナーがビオチン化され
    ている、工程； （ｂ）該第一の結合パートナーを該溶液と接触させる工程； （ｃ）該溶液を第二の結合パートナーと接触させる工程であって、該第二の結
    合パートナーは、カルシウム感受性発光材料に結合体化されている、工程； （ｄ）ある期間の後に、該常磁性粒子を、捕獲ストリップの細長マトリックス
    の片側に沿う所定の方向で、該粒子が該捕獲ストリップ上に横に配置されたスト
    ライプと接触するように移動させる工程であって、該捕獲ストリップは、該横断
    ストライプ上に固定されたストレプトアビジンを有し、該横断ストライプは、カ
    ルシウムケージング化合物をさらに含む、工程、 （ｅ）該常磁性粒子が該横断ストライプ上に固定された該ストレプトアビジン
    と接触するに十分な期間を許容する工程、 （ｆ）該捕獲ストリップの該横断ストライプを、紫外線のパルスに露出させて
    該カルシウムケージング化合物からのカルシウムの放出を引き起こす工程；およ
    び （ｇ）該カルシウム感受性発光材料によって放出された発光を測定する工程、
    を包含する、方法。
  22. 【請求項２２】 工程（ｂ）および（ｃ）が、同時に実行される、請求項２
    １に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 溶液中の分析物の存在を検出するための結合アッセイを実
    施するための方法であって、以下の工程： （ａ）第一の結合パートナーを該溶液と接触させる工程であって、該第一の結
    合パートナーがビオチン化されている、工程； （ｂ）ある期間の後に、該溶液を、第二の結合パートナーと接触させる工程で
    あって、該第二の結合パートナーが、カルシウム感受性発光材料と結合体化され
    ている、工程； （ｃ）さらにある期間の後に、該結合パートナーを、捕獲ストリップの細長マ
    トリックスの片側に沿う所定の方向で、該結合パートナーが該捕獲ストリップ上
    に横に配置されたストライプと接触するように移動させる工程であって、該捕獲
    ストリップは、該横断ストライプ上に固定されたストレプトアビジンを有し、該
    横断ストライプは、カルシウムケージング化合物をさらに含む、工程、 （ｄ）該結合パートナーが該横断ストライプ上に固定された該ストレプトアビ
    ジンと接触するに十分な期間を許容する工程、 （ｅ）該捕獲ストリップの該横断ストライプを、紫外線のパルスに露出させて
    該カルシウムケージング化合物からのカルシウムの放出を引き起こす工程；およ
    び （ｆ）該カルシウム感受性発光材料によって放出された発光を測定する工程、
    を包含する、方法。
  24. 【請求項２４】 工程（ａ）および（ｂ）を同時に実行する、請求項２３に
    記載の方法。
  25. 【請求項２５】 請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法であって、
    前記細長捕獲ストリップが、ストレプトアビジンおよびカルシウムケージング化
    合物が浸透した横断区分を有する、方法。
  26. 【請求項２６】 請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法であって、前
    記紫外線のパルスおよび前記化学発光の検出が、時間分解様式で実行される、方
    法。
  27. 【請求項２７】 請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法であって、紫
    外線のパルスの前に、前記溶液が、２０ナノモル濃度よりも少ないカルシウムを
    含む、方法。
  28. 【請求項２８】 結合アッセイのための細長捕獲ストリップであって、該捕
    獲ストリップが、ストレプトアビジンおよびカルシウムケージング化合物が浸透
    した横断区分を有する、細長捕獲ストリップ。
  29. 【請求項２９】 請求項２８に記載の細長捕獲ストリップであって、ここで
    、該捕獲ストリップは、ニトロセルロース、ポリアクリルアミド、ポリアミド、
    または任意の他の合成もしくは天然に存在するポリマーから形成される、細長捕
    獲ストリップ。
  30. 【請求項３０】 前記捕獲ストリップが、ハウジング内である、請求項２８
    または２９に記載の細長捕獲ストリップ。
  31. 【請求項３１】 前記捕獲ストリップが、単回使用の試験カートリッジとし
    て支持体内に格納される、請求項３０に記載の細長捕獲ストリップ。
  32. 【請求項３２】 請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の細長捕獲ストリ
    ップであって、ここで、カルシウムケージング化合物が、シス−１−（２−ビス
    （カルボキシメチル）アミノ−５−（１−ヒドロキシ−１−（２−ニトロ−４，
    ５−メチレンジオキシフェニル）メチル）フェノキシ）−２−（２−ビス（カル
    ボキシメチル）アミノ−５−メチルフェノキシ）シクロペンタン、１−［２−ア
    ミノ−５−（１−ヒドロキシ−１−［２−ニトロ−４，５−メチレンジオキシフ
    ェニル］メチル）フェノキシ］−２−）２’−アミノ−５’メチルフェノキシ）
    エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、１−（４，５ジメトキシ−２−ニトロフ
    ェニル）−１，２ジアミノエタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、およびニトロ
    フェニル−エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸からなる群より選択
    される、細長捕獲ストリップ。
  33. 【請求項３３】 溶液中の分析物の存在を検出するための結合アッセイを実
    施するためのプラスチックカートリッジであって、以下： サンプルを受けるためのレセプタクルを備えるハウジング、常磁性粒子上に固定
    されたビオチン化された第一の結合パートナーおよびカルシウム感受性化学発光
    材料に結合体化された第二の結合パートナーを備えるレザーバ、該ハウジング内
    でありかつ該レザーバと流体連絡している細長捕獲ストリップを備え、該捕獲ス
    トリップは、カルシウムケージング化合物およびストレプトアビジンで浸透され
    た横断区分を有し、該横断区分は、光バリアで保護されている、 プラスチックカートリッジ。
  34. 【請求項３４】 前記レセプタクルと前記レザーバとの間にフィルターが存
    在する、請求項３３に記載のプラスチックカートリッジ。
  35. 【請求項３５】 カルシウム除去のための薬剤を含むフィルターが存在する
    、請求項３３に記載のプラスチックカートリッジ。
  36. 【請求項３６】 請求項３３〜３５のいずれか１項に記載のプラスチックカ
    ートリッジであって、ここで、前記カルシウム感受性化学発光材料がエクオリン
    、オベイン、ニミオプシン、ベロビン、フォラシン、ルシフェラーゼ、または漂
    泳生物、ウミホタルおよび貝虫亜網から単離された発光タンパク質である、プラ
    スチックカートリッジ。
  37. 【請求項３７】 結合アッセイを実施するための装置であって、（ａ）請求
    項３３〜３６のいずれか１項に記載のプラスチックカートリッジを受けるための
    容器；（ｂ）横断ストライプ上の光保護層を除去するための手段；（ｃ）磁場を
    提供するための電磁石；（ｅ）前記捕獲ストリップの予め選択された部分に光を
    投射するための紫外光源、および（ｆ）該捕獲ストリップの該予め選択された部
    分によって放出される光を受けるにように配置される光電子増倍管、を含むハウ
    ジングを備える、装置。
  38. 【請求項３８】 前記電磁石が、前記プラスチックカートリッジに沿って多
    複数の磁場を投射する、請求項３７に記載の装置。
  39. 【請求項３９】 前記紫外光源が、２５０〜４００ｎｍの範囲の光を提供す
    る、請求項３７または３８に記載の装置。
  40. 【請求項４０】 前記光電子増倍管が、４００〜６００ｎｍの範囲の光を検
    出する、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の装置。
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