JP2003501075A

JP2003501075A - フィブリノーゲン断片に対する活性を有するペプチド、その類似体、抗体、及び使用

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Publication number: JP2003501075A
Application number: JP2001502456A
Authority: JP
Inventors: ウィリアム・トーマス・メルヴィン; ウィリアム・ダグラス・トンプソン; クリスティーナ・モーリーン・スターク
Original assignee: University of Aberdeen
Current assignee: University of Aberdeen
Priority date: 1999-06-07
Filing date: 2000-06-07
Publication date: 2003-01-14
Also published as: GB9912994D0; AU767383B2; CA2376078A1; EP1185554A1; WO2000075175A1; US6787141B1; AU5235200A

Abstract

(57)【要約】フィブリン分解産物は、細胞増殖及び新脈管形成を刺激する。本発明は、細胞レセプターに対するフィブリン断片Eの結合の調節、及び上記活性の調節において有用な、ペプチド、類似体及び抗体を提供する。具体的には、CRAHSFGSPRPLPVV （配列番号１）、SRAHSFGSPRPLPVV （配列番号２）、CRAHSFVSPRPLPVV （配列番号３）、及びQPDPHLMMWKLPGFP （配列番号４）、またはフィブリン断片E活性を調節可能であるこれらの断片から選択されるペプチド、並びに前記ペプチドまたは断片の変異体であり、上記ペプチドまたは断片に対して１，２，３または４のアミノ酸置換、挿入または欠失を有し、フィブリン断片E活性を調節可能である変異体ペプチドが提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、フィブリン断片Ｅのモジュレーターまたは模倣体として機能する化
合物、及びその使用に広く関する。

【０００２】

【従来の技術】

イントロダクション慢性炎症の基本的病理、治癒及び回復：フィブリノーゲンは、血液凝固形成に関与する主要な循環血漿タンパク質であ
る。例えば傷害または炎症による、凝固酵素カスケードの活性化は、各可溶性フ
ィブリノーゲン分子から二つの小さなフィブリノペプチド（Ａ及びＢ）を切断し
、フィブリンモノマーを与えるトロンビンへのプロトロンビンの変換を引き起こ
す。モノマーの交差結合は、固体のフィブリンを与える凝固システムの最終工程
である。全血は血小板を含み、傷において血液凝固物を形成し、異常な動脈及び
静脈においては血栓と称される：炎症滲出物は血小板を含まず、フィブリン単独
を形成する。

【０００３】フィブリンの沈着及び分解は、罹患している疾患病因に関わらず、身体のいず
れかの部位における急性及び慢性炎症の病理の主要な特徴である。このプロセス
は、治癒中の傷害、形成中の血栓、進行性のアテローム性動脈硬化プラーク、及
びあるタイプのガンの増殖中の端部を含む他のタイプの病理学的病変において、
組織学的なレベルで明らかである。フィブリンメッシュは、細胞内殖のための仮
のマトリックスを提供し、炎症細胞（マクロファージ）、新生小血管（毛管芽）
、結合組織細胞（線維芽細胞）、及び表皮（鱗状上皮）による傷の治癒において
段階的に侵襲される。アテローム性動脈硬化症の主体である大動脈の場合、ルー
メン表面の上皮と、血管壁の平滑筋細胞が、フィブリンメッシュを侵襲する。プ
ラスミノーゲンアクチベーターの分泌は、プラスミン分解を介するフィブリン下
層の制御された溶解を提供する一般的な因子であり、フィブリン分解産物を放出
する。フィブリン分解産物は、断片Ｄ及びＥと称される二つの分子の組み合わせ
より成る。最終的に存在するフィブリンは、新生細胞及び新生組織を形成するマ
トリックスにより置換される。これらの基本的特徴は、多くのタイプのヒト及び
動物疾患に適用される。

【０００４】フィブリン分解産物：フィブリンは細胞増殖に関与する多くの病理に共通の因子であるが、一般的に
、その主たる機能は、細胞移動を支持する不活性な物理的マトリックスを提供す
ることであると推定されている。しかしながら、フィブリノペプチド及びフィブ
リン分解産物が、特に指向的な細胞移動の現象である細胞走性の可溶製メディエ
ーターとして生物学的活性を有するというある時期の証拠が存在している(1)。
フィブリン分解産物は、慢性炎症の全ての部位に共通な主要な病理的増殖因子で
あることが提案されている。脈管形成性増殖因子の検出のためのin vivo試験モ
デルとしてチキン漿尿膜を使用して、フィブリン分解産物が脈管形成性であり(2
)、コラーゲン合成に対して刺激効果を有し(3)、及び特にフィブリン断片Eが活
性成分である(4)ことが示唆されている。

【０００５】フィブリンの沈着及び溶解は、血管再狭窄、ガン、アテローム性動脈硬化症、
リューマチ性関節炎、糖尿病、及び腎臓疾患を含むヒトの疾患の広範囲のスペク
トルに関連していると解される。

【０００６】米国特許第5 981 697号は、フィブリノーゲン断片E1、E2及びE3を結合する抗
体の生産を記載する。Bach等 (1998) J Biol Chem 273 pp30719-30728は、内皮
細胞VE-カドヘリンとフィブリノーゲンβ15-42配列の相互作用を記載する。Lee
等 (1999), Molecules and Cells 9(1) 7-13は、フィブリン及びフィブリノーゲ
ンの断片Eによる、マクロファージにおけるIL-6の生産の刺激を記載する。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】

フィブリン断片Eに対する抗体の生産は以前に記載されており、上記抗体は、
ポリクローナルラット及びウサギ抗Eブロッキング抗血清の両者に共通に、クロ
ーンの結合を選択するためにランダムなエピトープディスプレーのFdファージ組
み合わせライブラリーを使用して得られた(32)。本発明において発明者らは、フ
ィブリン分解産物によって誘導される細胞増殖の誘導を調節する数多くの化合物
を特徴付けした。本発明者らはさらに、例えばチキン線維芽細胞から得た細胞膜
のSDS-PAGEのリガンドブロッキングを使用して、約66kDaのサイズの細胞膜構成
成分にフィブリン断片Eが結合することを示した。断片Ｅについての特異的な結
合部位の存在は、その結合のアゴニスト及びアンタゴニストが、その結合を調節
してその効果を調節するために使用できるという可能性を生じる。上記効果は、
細胞増殖、脈管形成、線維形成、及びコラーゲン合成の誘導を含む。ここに開示
されるもののような上記アゴニスト及びアンタゴニストはまた、例えばそれ自体
細胞刺激に対する調節効果を有しても良い。上記調節は、アテローム性動脈硬化
症において、特に血管形成後の再狭窄においてみられる細胞増殖のコントロール
において非常に有用であろう。以下に記載される方法を使用して、本発明者らは
、細胞増殖のFDP誘導性の刺激を調節する数多くの化合物を同定した。好ましく
は、上記変異体は、フィブリン断片E活性を維持する。

【０００８】

【課題を解決するための手段】

従って本発明は、以下のものより成る群から選択される配列： CRAHSFGSPRPLPVV （配列番号１） SRAHSFGSPRPLPVV （配列番号２） CRAHSFVSPRPLPVV （配列番号３） QPDPHLMMWKLPGFP （配列番号４）またはフィブリン断片E活性を調節可能であるこれらの断片を含むペプチドを提
供する。

【０００９】上述のように、フィブリン断片E活性は、以下の活性の少なくとも一つを指す
：細胞増殖、脈管形成、線維形成、及びコラーゲン合成の誘導。

【００１０】本発明のさらなる特徴点として、上記ペプチドの機能的な変異体が提供され、
上記変異体は、１から４、好ましくは１から３、より好ましくは１または２の、
置換、挿入及び欠失を含むアミノ酸変異を含む。好ましくは上記変異体は、フィ
ブリン断片E活性を調節する能力を維持する。

【００１１】本発明の別の特徴点として、上述の本発明に従ったペプチドのアミノ酸配列を
有する第一の部分と、第一の部分に天然では連続していないアミノ酸配列を含む
、第一の部分のNまたはC末端に結合した第二の部分とを含む融合ペプチドが提供
される。上記異種ペプチド融合物はまた、本発明のペプチドとしてここで参照さ
れる。

【００１２】さらなる特徴点として本発明は、モノマー状またはオリゴマー状形態のいずれ
かの、本発明のペプチドを結合するまたは本発明のペプチドの活性を調節する物
質の同定のためのアッセイ方法を提供する。

【００１３】本発明のさらなる特徴点として、本発明のペプチドの「類似体」が提供される
。類似体は例えば、断片Eレセプターに対するフィブリン例えば断片EといったFD
Pの結合を完全に阻害する能力といった、フィブリン断片E活性を有する非ペプチ
ド化合物である。新規である限り、類似体は本発明のさらなる特徴点である。類
似体は、ここに記載される方法のいずれかによって生産されても良く、例えば当
該技術分野で周知のコンビナトリアル化学的ライブラリーを使用して生産されて
も良い。上記ライブラリーの例は、Newton GR, Exp. Opin. Ther. Patents (199
7) 7(10): 1183-1194にレビューされている。従って、用語「化学的ライブラリ
ー」がここで使用される場合、当業者はその意味を理解できるであろう。

【００１４】本発明はまた、本発明のペプチドまたは類似体に選択的に結合可能な抗体及び
その結合断片を提供する。

【００１５】さらなる特徴点として、本発明は、製薬学的に許容可能なキャリアーまたは希
釈液と共に、本発明に従ったペプチド、類似体または抗体を含む製薬組成物を提
供する。

【００１６】本発明のペプチド、類似体または抗体、及び組成物は、多くの目的のため使用
されても良い。それらはまた、フィブリン断片Eに対するレセプター、及びフィ
ブリン分解産物による細胞増殖の活性化を調べるための研究試薬としても有用で
ある。それらはまた、細胞増殖、特に脈管形成の阻害のようなフィブリン断片E
活性を調節する上で有用であろう。

【００１７】かくして本発明の好ましい特徴点として、本発明の類似体または抗体が、フィ
ブリン断片E活性を調節する方法において使用されても良く、上記方法は、本発
明のペプチドの有効量を導入することを含む。本発明の方法は、in vitroまたは
in vivoで実施されても良い。それがin vivoで実施される場合、本発明は、ヒト
または動物の身体の治療の方法、特にガン、または例えば血管形成術に引き続く
血管細胞の再増殖によって引き起こされる再狭窄を含む他の増殖性疾患の治療に
おける使用を見出すであろう。

【００１８】

【発明の実施の形態】

ペプチド本発明の「ペプチド」は、その断片、及び上記配列の変異体、及び上述の断片
、並びに上記ペプチドの異種融合物を含むように解されるべきである。

【００１９】用語、「含む」は「含む」を意味し、ペプチドが全体としてフィブリン断片E
結合部位に結合する能力を維持する範囲で、-及び／またはC-末端でさらなるア
ミノ酸配列、または他の化学分子の存在を許容する。

【００２０】いずれかの異種融合物配列を除く本発明のペプチド（上述の配列番号１−４の
断片、及び上述の本発明の他の配列を含む）は、５から１５のような３から１５
、例えば５から８、５から１０、８から１５または８から１１のアミノ酸長を有
することが好ましい。

【００２１】それ自体フィブリン断片E結合部位に結合する活性を有さない、異種融合配列
の存在は、企図される機能に従って変化するであろう。上記機能は、膜を横切っ
てトランスロケーションする能力、ペプチドの精製または同定を可能にするエピ
トープ能力等を含む。大雑把に言って、異種融合配列は、４から１００または１
０から５０といった４から５００の、例えば１０から３０のアミノ酸長であろう
。

【００２２】第二のペプチド部分は、融合物の企図される目的を考慮して、当業者によって
選択されるいずれかの配列であっても良い。例えば第二の部分は、細胞における
ペプチドの同定及び／またはその回収を可能にするT7タグ、HAタグまたはmycタ
グのような検出可能なタグを含んでも良い。第二の部分はまた、融合物を発現し
ている宿主細胞から上記ペプチドの発現に向けたシグナル配列であっても良い。
これは、本発明のペプチドの組換え生産について有用であろう。

【００２３】第二の部分は、全体の構造に影響する分子タグを含んでも良い。短いペプチド
配列を含むαへリックスの形成を補助する数多くのへリックス開始剤が、当該技
術分野で周知である。

【００２４】好ましい実施態様として、第二のペプチド部分は、真核生物細胞の膜を通じて
ペプチドを放出可能な膜トランスロケーション配列である。上記ペプチドの例は
、HSV-1 VP22タンパク質(Elliot等, 1997)、HIV Tatタンパク質（例えば）1-72
、37-72または48-60残基；Fawell等, 1994)、またはDrosophila melanogasterア
ンテナペディアタンパク質から由来する配列、例えばArg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-
Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lysの１６アミノ酸ペプチド配列を含む
。

【００２５】トランスロケーションペプチドが、異種融合物のN末端またはC末端に存在して
も良い。文脈が他の断り書きを必要としなければ、本発明にペプチドに関する以
下の記述は、上述の融合ペプチドをも含む。

【００２６】変異体ペプチド上述のペプチド１−４の特定のアミノ酸残基は、フィブリン断片E結合部位に
結合するペプチドの能力を有意に損失することなく置換されても良い。かくして
これらのペプチドのアミノ酸が置換されて、上述の範囲内で本発明のさらなる特
徴点を形成する変異体ペプチドを提供しても良い。

【００２７】置換は、例えば以下の表に従った保存的置換を含んでも良く、ここで表中の第
二の欄の同じブロック、好ましくは第三の欄の同じ列に存在するアミノ酸は、互
いに置換されても良い。

【表１】

【００２８】別法として、いずれかのアミノ酸が、小さな脂肪族アミノ酸、好ましくはグリ
シンまたはアラニンによって置換されても良い。

【００２９】さらに、欠失及び挿入もまたなされても良い。挿入は好ましくは、グリシンま
たはアラニンのような小さな脂肪族アミノ酸の挿入であるが、他の挿入も排除さ
れない。

【００３０】変異体ペプチドは、本発明のペプチドについてここに記載される方法のいずれ
かによって修飾されても良い。これは例えば、N末端配列に対して「リバース」
なC末端、合成アミノ酸、修飾側鎖、及びラベリングを含む。

【００３１】本発明のペプチドの生産方法及び使用が記載される場合、文脈が明確に他の断
り書きを示さなければ、本発明の変異体ペプチドについても参考とされると解さ
れよう。

【００３２】別の特徴点として、本発明のペプチドは、ペプチド（または本発明のペプチド
の混合物）のマルチコピーを含む分子の形態で提供されても良い。例えば、リジ
ンの側鎖のアミノ基が、アミノ酸のカルボキシ末端に対する結合点として使用さ
れても良い。かくして二つのアミノ酸が、カルボニル結合を介してリジンに結合
されても良く、これにより一回以上分枝する分枝構造が導かれても良い。例とし
て、本発明の４のコピーのペプチドが、PeP₄-Lys₂-Lys-X構造のMAPのような上記
マルチ抗原ペプチド(MAP)に結合しても良く、ここでPePは本発明のペプチドであ
り（任意に異種融合物形態である）、Lysはリジンであり、XはPep₄-MAPペプチド
の合成のための樹脂のような固相に対するMAPコアの結合する提供し、合成が完
成すると支持体から除去されても良いβ-アラニンのような末端基である。

【００３３】本発明のペプチドの直線状マルチマーもまた提供されても良い。

【００３４】他のマルチペプチド構造は、以下に記載されるMAPコアを使用して得られても
良い：Lu等, 1991, Mol Immunol, 28, 623-30; Briand等, 1992, J Immunol Met
hods, 156, 255-65; Ahborg, 1995, J Immunol Methods, 179, 269-75。

【００３５】本発明のペプチドのマルチマーは、ここで議論される真核生物細胞の膜を通じ
て輸送するためのトランスロケーションペプチドに融合されても良い。トランス
ロケーションペプチドは、マルチマーのN末端またはC末端に融合されても良く、
またはマルチマーの内部の中間位置で取り込まれても良い。

【００３６】本発明のマルチマーが提供される場合、それらは本発明の異なるペプチドを含
んでも良く、または同じペプチドのマルチマーであっても良い。

【００３７】ペプチドの生産と修飾反対に特定されている場合を除き、ここに記載されるペプチド配列は、従来の
一文字コードで-末端からC-末端の向きで示される。本発明のペプチドのアミノ
酸配列は、天然に存在しないアミノ酸を含むように、またはin vivoで化合物の
安定性を増大するように修飾されても良い。化合物が合成法によって生産される
場合、上記アミノ酸は生産の間で取り込まれても良い。化合物はまた、以下の合
成生産または組換え生産のいずれかに引き続き修飾されても良い。

【００３８】本発明のペプチドは、当該技術分野で広く利用可能な方法を使用して、合成的
にまたは組換え的に生産されても良い。合成生産は一般的に、反応容器に個々の
ここのアミノ酸残基を工程ごとに加えて、所望の配列のペプチドを生産すること
を含む。

【００３９】本発明のペプチドは、D-アミノ酸を使用して合成的に生産されても良い。上記
の場合アミノ酸は、CからNの向きに逆の配列で結合されるであろう。これは、上
記ペプチドを生産するための当該技術分野で簡便なものである。

【００４０】数多くのアミノ酸の側鎖修飾が当該技術分野で周知であり、本発明のペプチド
の側鎖になされても良い。上記修飾は、例えばアルデヒドでの反応とその後のNa
BH₄での還元による還元アルキル化によるアミノ基の修飾、メチルアセトイミダ
ートでのアミド化、または無水酢酸でのアシル化を含む。

【００４１】アルギニン残基のグアニジノ基は、2,3-ブタンジオンまたはグリオキサルのよ
うな試薬での複素環縮重産物の形成によって修飾されても良い。スルフィドリル
基は、カルボキシメチル化のような方法によって修飾されても良く、トリ婦とフ
ァン残基は、インドール環の酸化またはアルキル化によって修飾されても良く、
ヒスチジン残基のイミダゾール環は、アルキル化によって修飾されても良い。

【００４２】カルボキシ末端及びいずれかの他のカルボキシ側鎖は、例えばC_1-6アルキルエ
ーテルといったエステル基の形成でブロックされても良い。

【００４３】上述のアミノ酸の修飾の例は、それが全てではない。当業者は、当該技術分野
で本質的に周知の化学反応を使用することが所望される場合、アミノ酸側鎖を修
飾しても良い。

【００４４】発現ベクター、核酸、及び宿主細胞別の特徴点として、本発明は、本発明のペプチドをコードする核酸を提供する
。本発明のポリヌクレオチドは、組換え複製ベクター内に取り込まれることがで
きる。上記ベクターは、適合可能な宿主細胞において核酸を複製するために使用
されても良い。。かくしてさらなる実施態様として、本発明は、本発明のポリヌ
クレオチドを複製可能なベクターに取り込ませること、上記ベクターを適合可能
な宿主細胞に導入することを、上記ベクターの複製をもたらす条件下で上記宿主
細胞を生育させることによる、本発明のポリヌクレオチドの生産方法を提供する
。上記ベクターは、上記宿主細胞から回収しても良い。適切な宿主細胞は、発現
ベクターと結びつけて以下に記載される。

【００４５】好ましくはベクター中の本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞によってコー
ド配列の発現を提供可能なコントロール配列に機能的に結合される、即ち上記ベ
クターは発現ベクターである。

【００４６】用語、「機能的に結合される」は、記載される構成成分が、その企図される態
様でそれらに機能を与える関係にある並列を意味する。コード配列に「機能的に
結合した」コントロール配列は、コード配列の発現が、コントロール配列と適合
可能な条件下で達成されるようにライゲートされる。

【００４７】上記ベクターは、本発明のペプチドの発現を与えるために適切な宿主細胞内に
トランスフォームされても良い。かくしてさらなる特徴点として、本発明は、上
記ペプチドをコードするコード配列のベクターによる発現を提供する条件下で、
上述の発現ベクターでトランスフォームまたはトランスフェクトされた宿主細胞
を培養すること、及び発現されたペプチドを回収することを含む、本発明に従っ
たペプチドを調製する方法を提供する。

【００４８】上記ベクターは、複製のためのオリジン、任意に上記ポリペプチドの発現のた
めのプロモーター、及び任意に上記プロモーターのレギュレーターを備えた、プ
ラスミド、ウイルスまたはファージベクターであっても良い。上記ベクターは例
えば、細菌プラスミドの場合アンピシリン耐性遺伝子、または哺乳動物ベクター
の場合ネオマイシン耐性遺伝子といった、一つ以上の選択マーカー遺伝子を含ん
でも良い。ベクターは、例えばRNAの生産のためにin vitroで使用されても良く
、または宿主細胞をトランスフェクトまたはトランスフォームするために使用さ
れても良い。

【００４９】本発明のさらなる実施態様は、本発明のポリヌクレオチドの複製及び発現のた
めのベクターでトランスフォームまたはトランスフェクトされた宿主細胞を提供
する。上記細胞は、上記ベクターと適合可能であるように選択され、例えば細菌
、酵母、昆虫または哺乳動物であっても良い。

【００５０】プロモーター及び他の発現調節シグナルが、発現ベクターのデザインについて
宿主細胞と適合可能なように選択されても良い。例えば酵母プロモーターは、S.
cerevisiae GAL4及びADHプロモーター、S. pombe nmtl及びadhプロモーターを
含む。哺乳動物プロモーターは、カドミウムのような重金属に対する応答に含ま
れるメタロチオネインプロモーターを含む。ウイルスプロモーターは、SV40ラー
ジＴ抗原プロモーター、レトロウイルスLTRプロモーター、及びアデノウイルス
プロモーターを含む。全てのこれらのプロモーターは、当該技術分野で容易に入
手可能である。

【００５１】上記ベクターは、例えば治療方法において、in vivoで使用するように適合さ
れても良い。治療における使用に適したベクターは、アデノウイルスベクター、
レトロウイルスベクター、及びアルファウイルスベクターを含む。上記ベクタ
ーは、ベクターの複製を欠失することによって、数多くの修飾によって治療での
使用のための適合される。参考文献として例えば、レトロウイルスベクターの記
載についてWO95/14091、及びアルファウイルスベクターの記載についてWO95/079
94が挙げられる。両文献の開示は、参考としてここに取り込まれる。

【００５２】治療における使用のためのベクターは一般的に、ベクターを含むパックされた
ウイルス粒子の形態で投与され、上記粒子は、例えば腫瘍または他の増殖中の細
胞といった、フィブリン断片E活性の部位に輸送される。

【００５３】本発明のペプチドの生産のためのベクター、または遺伝子治療における使用の
ためのベクターは、本発明のミニ遺伝子配列を有するベクターを含む。

【００５４】さらなる詳細については、例えばMolecular Cloning: a Laboratory Manual:
第２版, Sambrook等, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照。例
えば核酸構築物の調製、ミュータジェネシス、シークエンシング、細胞内へのDN
Aの導入、及び遺伝子発現、並びにタンパク質の分析といった核酸の操作のため
の多くの周知の技術及びプロトコールが、Current Protocols in Molecular Bio
logy, Ausubel等編, John Wiley & Sons, 1992に詳細に記載されている。

【００５５】抗体本発明に従ったペプチドまたは類似体は、免疫原として、さもなければ特異的
な抗体を入手するために使用されても良い。苦体は、ペプチドまたは類似体の精
製及び他の操作、診断スクリーニング、及び治療の手段において有用である。こ
れはさらに以下に議論される。

【００５６】本発明のペプチドまたは類似体の提供は、特異的な態様でレセプターと相互作
用するフィブリン断片Eの部分を結合する抗体の生産を可能にする。かくして本
発明は、本発明のペプチド若しくは類似体、または上記部分に特異的に結合でき
る抗体を提供する。上記抗体は、本発明のペプチドまたは類似体のエピトープを
使用して生産されても良い。

【００５７】本発明の別の特徴は、レセプターに対するフィブリン断片Eの結合を妨げる抗
断片E抗体の生産である。フィブリン断片Eの細胞増殖活性をブロックするポリク
ローナル抗体は、ウサギにおける断片Eの全体の注射によって生産できる。フィ
ブリン分解産物の混合した場合、細胞増殖活性が破壊される(17)。

【００５８】例えばコード核酸からの発現によって組換え的に生産された本発明の精製ペプ
チドまたはその変異体は、当該技術分野で標準的である方法を使用して抗体を生
産するために使用されても良い。抗体、及び抗体の抗原結合断片を含むペプチド
またが類似体は、以下にさらに記載されるように使用されても良い。

【００５９】抗体を生産する方法は、上記タンパク質またはその断片での動物（例えば、ヒ
ト、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、またはサル）の免疫化を含
む。抗体は、当該技術分野で周知の各種の方法のいずれかを使用して免疫化され
た動物から得られても良く、好ましくは興味ある抗原（ラベルされても良い）に
対する抗体の結合を使用してスクリーニングされても良い。

【００６０】例えば、ウエスタンブロット法または免役沈降が使用できる(Armitage等, 199
2, Nature 357: 80-82)。抗体は、ポリクローナルでもモノクローナルでも良い
。

【００６１】抗体の修飾抗体は、数多くの方法で修飾されても良い。実際に用語「抗体」は、必要とさ
れる特異性を有する結合ドメインを有するいずれかの特異的な結合物質を包含す
るように考慮されるべきである。かくして、この用語は、抗体断片、誘導体、機
能的同等物、及び抗体のホモローグを包含し、天然であれ合成であれイムノグロ
ブリン結合ドメインを含むいずれかのペプチドを含む。それ故、別のペプチドと
融合した、イムノグロブリン結合ドメインを含むキメラ分子または同等物が含ま
れる。キメラ抗体のクローニング及び発現は、EP-A-0120694及びEP-A-0125023に
記載されている。抗体全体の断片が、抗原を結合する機能を実行できることが示
されている。結合断片の例は、(i)VL、VH、CL及びCH1ドメインよりなるFab断片
；(ii)VH及びCH1ドメインよりなるFd断片；(iii)一本鎖抗体のVl及びVHドメイン
よりなるFv断片；(iv)VHドメインよりなるdAb断片(Ward, E.S.等, Nature 341,
544-546 (1989))；(v)単離されたCDR領域；(vi)二つの結合したFab断片を含む二
価断片であるF(ab')₂断片；(vii)一本鎖FV分子(scFv)、ここではVHドメインとVL
ドメインが抗原結合部位を形成するように会合させるペプチドリンカーによって
結合されている(Bird等, Science, 242, 423-426, 1988; Huston等, PNAS USA,
85, 5879-5883, 1988)；(viii)二特異性一本鎖Fvダイマー(PCT/US92/09965)並び
に(ix)遺伝子融合物によって構築された多価または多特異性断片である「ディア
ボディ」(WO94/13804; P Holliger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6
448, 1993)である。

【００６２】ディアボディはペプチドのマルチマーであり、各ペプチドがイムノグロブリン
軽鎖の結合領域を含む第一のドメインと、イムノグロブリン重鎖の結合領域を含
む第二のドメインとを含み、二つのドメインが結合し（例えばペプチドリンカー
によって）ているが、抗原結合部位を形成するように互いに会合できない：抗原
結合部位は、マルチマー内の一つのペプチドの第一のドメインを、マルチマー内
の別のペプチドの第二のドメインと会合することによって形成される(WO94/1380
4)。

【００６３】動物を免疫化するための別法または補助法として、適切な結合特異性を有する
抗体が、例えば表面に機能的なイムノグロブリン結合ドメインを展示するラムダ
バクテリオファージまたは繊維状バクテリオファージを使用して、発現されたイ
ムノグロブリン可変ドメインの組換え生産ライブラリーから得られても良い；例
えばWO92/01047参照。

【００６４】抗体に対するペプチド及び類似体の結合抗体を検出するためのイムノアッセイは、当該技術分野で周知であり、一般的
に以下の工程を含む： (a)上記タンパク質に対して、抗体によって結合可能なエピトープを含むペプチ
ドを提供する工程； (b)抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で、上記ペプチドと生物学的サ
ンプルをインキュベートする工程； (c)上記ペプチドを含む抗体−抗原複合体を形成するかどうか測定する工程。

【００６５】本発明のペプチドまたは類似体は、検出可能なラベルでラベルされても良い。
検出可能なラベルは、上記ペプチドまたは類似体を検出することを許容するいず
れかの適切なラベルであっても良い。適切なラベルは、例えば¹²⁵Ｉといった放
射性同位元素、酵素、抗体、ポリヌクレオチドおよびビオチンのようなリンカー
を含む。本発明のラベルされたペプチドまたは類似体は、サンプル中の本発明の
ペプチドまたは類似体の量を測定するために、イムノアッセイのような診断方法
において使用されても良い。本発明のペプチド若しくは類似体またはラベルされ
たペプチド若しくは類似体はまた、標準的なプロトコールを使用して、動物及び
ヒトにおける上記ペプチドまたは類似体に対する免疫反応性を検出のための、血
清学的または細胞介在免疫アッセイにおいて使用されても良い。

【００６６】本発明のペプチドもしくは類似体またはラベルされたペプチド若しくは類似体
またはそれらの断片はまた、例えばイムノアッセイウェルまたはディップスティ
ックの表面といった固相に固定されても良い。

【００６７】上記ラベル化及び／または固定化ペプチドまたは類似体は、適切な試薬、コン
トロール、説明書等と共に、適切な容器内でキット中に実装されても良い。

【００６８】上記ペプチドまたは類似体及びキットは、イムノアッセイによって、サンプル
中に存在する上記ペプチド若しくは類似体、またはその活性部分若しくは断片に
対する抗体の検出方法において使用されても良い。

【００６９】抗体の使用ペプチドに対して生産された抗体は、変異体ペプチド及び次いでそのコード遺
伝子の同定及び／または単離において使用できる。かくして本発明は、フィブリ
ン分解産物結合エピトープまたはその変異体（上記記載）を同定または単離する
方法を提供し、上記方法は、上記フィブリン分解産物結合エピトープペプチドま
たはその変異体を結合可能、または好ましくは上記ペプチドに対する結合特異性
を有する抗体（例えば抗体全体またはその断片）の抗原結合ドメインを含むペプ
チドで、候補のペプチドをスクリーニングすることを含む。フィブリン分解産物
結合エピトープペプチドまたはそのミュータント若しくは誘導体を結合し、好ま
しくはそれに特異的である抗体の抗原結合ドメインを含む抗体及びペプチドのよ
うな特異的結合メンバー、及びその使用とそれらを利用する方法は、本発明のさ
らなる特徴点を表す。

【００７０】スクリーニングのための候補のペプチドは、例えば興味ある動物から由来する
核酸を使用して作製された発現ライブラリーの産物であっても良く、または天然
のソースからの精製法の産物であっても良い。類似体は、ここに記載される方法
のいずれかによって生産されても良く、例えば当該技術分野で周知であるコンビ
ナトリアル化学的ライブラリーを使用して由来しても良い。上記ライブラリーの
例は、Newton GR, Exp. Opin. Ther. Patents (1997) 7(10): 1183-1194にレビ
ューされている。

【００７１】抗体を結合することが見出されたペプチドが単離されても良く、次いでアミノ
酸シークエンシングにかけられても良い。いずれかの適切な方法が、全体的また
は部分的のいずれかのペプチドを配列決定するために使用されても良い（例えば
上記ペプチドの断片が配列決定されても良い）。アミノ酸配列情報は、候補の核
酸に対するハイブリダイゼーションにおけるプローブまたはプライマーとして使
用するための一つ以上のオリゴヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチドの縮重
プール）をデザインすることによって、またはさらに以下に議論されるコンピュ
ーター配列データベースをサーチすることによって、上記ペプチドをコードする
核酸を入手するために使用されても良い。

【００７２】サンプルとの抗体の反応性は、いずれかの適切な手段によって測定されても良
い。個々のレセプター分子でのタギングは一つの可能性である。レセプター分子
は、検出可能な、好ましくは測定可能なシグナルを直接または間接に生産しても
良い。レポーター分子の結合は直接でも間接でも良く、例えばペプチド結合によ
って共有結合で、または非共有結合で実施されても良い。ペプチド結合を介した
結合は、抗体及びレポーター分子をコードする遺伝子融合物の組換え発現の結果
として存在しても良い。

【００７３】結合を測定する態様は、本発明の特徴点ではなく、当業者はその嗜好及び一般
的知見に従って適切な態様を選択できる。

【００７４】本発明に従った抗体は、例えば議論されたような細胞または細胞溶解物を含む
試験サンプルにおける、ペプチドまたは類似体の存在のスクリーニングにおいて
使用されても良く、例えばコード核酸からの発現によるペプチドの生産に引き続
き、本発明に従ったペプチドまたは類似体の精製及び／または単離において使用
されても良い。

【００７５】抗体は、それらが結合するペプチドまたは類似体の活性を調節しても良く、も
し上記ペプチドまたは類似体が患者における有害な効果を有するのであれば、治
療（予防を含む）の用途において有用であろう。

【００７６】抗体は、例えば試験サンプルにおける特定の物質の存在を測定するための、抗
体の使用のための説明書を含んでも良いキットにおいて提供されても良い。ラベ
リング分子、バッファー溶液、希釈液等のような一つ以上の他の試薬が含まれて
も良い。試薬は、密封バイアルのような外部環境からそれらを保護する容器内で
提供されても良い。

【００７７】模倣体の開発本発明に従ったペプチド、類似体または抗体は、それに結合する、またはその
活性若しくは機能を調節する分子のためにスクリーニングにおいて使用されても
良い。いくつかの分子は、治療（おそらく予防を含む）の用途において有用であ
ろう。

【００７８】例えばフィブリン断片Eといったフィブリン分解産物によって誘導される細胞
増殖の刺激は、例えば再狭窄または腫瘍細胞において見出される非制御的な細胞
増殖を阻害可能な治療薬の開発のためのターゲットを提供する。

【００７９】数多くのアッセイフォーマットが、WO94/10307及びWO96/10425に記載されてい
る。本発明のペプチド、類似体または抗体の提供は、同様な効果を発揮できる新
規な化合物のための抗スループットスクリーニングアッセイのデザインにおいて
所望される上記アッセイのためのコントロール試薬を提供する。本発明のペプチ
ド、類似体または抗体はさらに、フィブリン断片E結合部位を標的化する製薬化
合物の合理的な薬剤デザインの基礎を提供する。

【００８０】本発明のペプチド、類似体または抗体は、模倣体を開発するために使用されて
も良い。これは、上記ペプチド、類似体または抗体を合成するのが困難または高
価である場合、またはそれが特定の投与方法に不適切である場合、例えばペプチ
ドが消化管のプロテアーゼによって迅速に分解されるため、経口組成物のために
活性剤として不適切である場合に所望されるであろう。模倣体のデザイン、合成
及び試験は、ターゲット特性のために数多くのペプチドまたは類似体をランダム
にスクリーニングすることを避けるために使用されても良い。

【００８１】所望のターゲット特性を有するペプチド、類似体または抗体からの模倣体のデ
ザインでは、いくつかの工程が共通に実施される。第一に、ターゲット特性を測
定するために必須及び／または重要であるペプチド、類似体または抗体の特定の
部分が決定される。ペプチドの場合、これは例えば各残基を順番に置換すること
によって、ペプチド中のアミノ酸残基を系統的に変化させることによって実施で
きる。ペプチドの活性領域を構成するこれらの部分または残基は、「ファルマコ
フォア」として周知である。

【００８２】一度ファルマコフォアが見出されると、その構造は例えばX線回折データ及びN
MRといったスペクトル測定法で広範囲のソースから得られたデータを使用して、
例えば立体化学、結合、サイズ及び／または電荷といった物理的特性に従ってモ
デル化される。コンピューター分析、相同性マッピング（原子間の結合よりむし
ろ、ファルマコフォアの電荷及び／または大きさをモデル化する）、及び他の方
法が、このモデル化法において使用できる。次いで、ファルマコフォアを模倣す
る化学基を接合できるテンプレート分子が選択される。テンプレート分子、及び
それに接合される化学基は、模倣体の合成が容易であり、薬理学的に許容可能で
ある可能性があり、且つin vivoで分解しない一方で、リードペプチド、類似体
または抗体の生物学的活性を維持するように従来法で選択されても良い。別法と
してファルマコフォアは、模倣体を同定するために構造のコンピューターデータ
ベースのサーチの基礎を形成するように使用できる。ここに記載されたいずれか
のアプローチによって見出された模倣体は、それらがターゲット特性を有するか
どうか、またはその度合いはどの程度かを調べるためにスクリーニングできる。
次いでさらなる最適化及び／または修飾を実施して、in vivoまたは臨床試験の
ための一つ以上の最終模倣体に到達できる。

【００８３】上述の方法及び当該技術分野で利用可能な他の方法によって入手可能な模倣体
が、本発明のさらなる特徴点を形成する。

【００８４】組成物本発明のペプチド、類似体または抗体は、実質的に単離された形態で存在して
も良い。上記ペプチド、類似体または抗体は、それらの企図される目的を妨げず
、実質的に単離されたものと同様に考慮されるキャリアーまたは希釈液と混合さ
れても良い。本発明のペプチド、類似体または抗体はまた、実質的に精製形態で
存在しても良く、その場合それは一般的に、調製物中のペプチド、類似体または
抗体の９０％以上、例えば９５％、９８％または９９％が、本発明のペプチド、
類似体または抗体である調製物中に、上記ペプチド、類似体または抗体を含む。

【００８５】本発明のペプチドまたは類似体は、塩の形態で製剤化されても良い。治療にお
いて従来でも使用できる本発明のペプチドまたは類似体の塩は、例えばアルカリ
金属（例えばナトリウム）塩、アルカリ土類金属（例えばマグネシウム）塩、ア
ンモニア塩、及びＮＲ₄（式中ＲはＣ_1-4アルキル）塩から由来する、生理学的に
許容可能な塩基の塩を含む。

【００８６】本発明の融合ポリペプチドを含むペプチド、類似体、または抗体は、製薬組成
物内に製剤化されても良い。上記組成物は、製薬学的に許容可能なキャリアーま
たは希釈液と共に、上記ペプチド、類似体または抗体を含む。製薬学的に許容可
能なキャリアーまたは希釈液は、経口、または全身性（例えば筋肉内若しくは静
脈内）の投与のために適した製剤において使用されるものを含む。上記製剤は簡
便に単位投与量形態で提供されても良く、薬学の技術分野で周知である方法のい
ずれかによって調製されても良い。上記方法は、一つ以上の補助成分を構成する
キャリアーと活性成分の会合をもたらす工程を含む。一般的に上記製剤は、液体
キャリアーまたは均質に分割された固体キャリアーまたは両者と活性成分の会合
を均一に且つ完全にもたらし、次いで必要であれば産物を成型することによって
調製される。

【００８７】例えば全身性の投与に適した製剤は、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、及び製
剤を企図される受容者の血液と等張性にする溶液を含む水性及び非水性の滅菌注
射溶液；並びに懸濁剤及び増粘剤を含んでも良い水性及び非水性の滅菌懸濁液、
並びに血液構成成分または一つ以上の器官に上記ペプチド、類似体または抗体を
標的化するようにデザインされたリポソームまたは他のミクロ粒子システムを含
む。

【００８８】適切なリポソームは、例えば正に荷電した脂質(N[1-(2,3-ジオレイルオキシ)
プロピル]-N,N,N-トリエチルアンモニウム(DOTMA))を含むもの、ジオレイルホス
ファチジルアンモニウム(DOPE)を含むもの、及び3β[N-(n',N'-ジメチルアミノ
エタン)-カルバモイル]コレステロール(DC-Chol)を含むものを含む。

【００８９】組成物は、本発明のペプチド、類似体または抗体の所望量を含んでも良い。部
分的にこれは、企図される製剤及び企図される使用に依存するであろう。一般的
なガイドラインとして、上記組成物は、約１％から約９９％、例えば１０％から
９０％の本発明のペプチド、類似体または抗体を含んでも良い。

【００９０】上記組成物は、一つ以上の、例えば二つまたは三つの本発明のペプチド、類似
体または抗体の混合物を含んでも良い。

【００９１】本発明のペプチド、類似体または抗体はまた、組み合わせた抗増殖効果を提供
するために、細胞増殖を阻害可能な第二の試薬と組み合わせて使用されても良い
。かくして上記組成物はまた、他の製薬学的に活性な成分、特に細胞毒性剤及び
／または細胞静止剤を含んでも良い。

【００９２】別法として、本発明のペプチド、類似体または抗体は、細胞毒性または細胞静
止薬とは別個の組成物であるが、同時にまたは連続的に患者に輸送されても良い
。「連続的に」は、上記ペプチド、類似体または抗体、あるいは上記試薬を最初
に輸送し、他方を二つの試薬が共に増大した効果が標的増殖細胞で達成するよう
な期間内で輸送することを意味する。一方または両方の試薬が、例えば静脈点滴
を通じて一定期間に亘って輸送される場合、上記試薬の投与の期間は連続的また
はオーバーラップしても良い。

【００９３】ヒトまたは動物の身体の治療方法において使用される場合、上記ペプチド、類
似体または抗体、及び上記試薬は、同じ部位または異なる部位で患者に投与され
ても良い。

【００９４】かくして本発明は、in vitroまたはin vivoで、増殖中の細胞、例えば腫瘍細
胞の治療において別個にまたは同時に使用するための、本発明のペプチド、類似
体または抗体、及び細胞毒性または細胞静止剤を提供する。

【００９５】 in vitroでの使用が企図される場合、これはex-vivo、例えば治療後に患者内
に再移植されても良い患者から得た骨髄の治療を含むであろう。

【００９６】本発明はさらに、増殖中の細胞の治療のための医薬の製造のための、本発明の
ペプチド、類似体または抗体の使用を提供し、ここで上記細胞は、細胞毒性また
は細胞静止剤で別個にまたは同時に治療される。

【００９７】以下のものを含む数多くの細胞毒性剤及び／または細胞静止剤が、当該技術分
野で周知である（例えばThe Merck Index, 第１２版, 1996に掲載されている）
：アルカノイド、例えばエトポシド及び他のトポイソメラーゼインヒビター、パ
クリタキセル、ビンブラスチン、及びビンクリスチン；アルキル化剤、例えばア
ルキルスルホナート（例えばブスルファン）、アジリジン、エチレンイミン、及
びメチルメラミン（例えばトリエチレンメラミン及びトリエチレンホスホルアミ
ド）、窒素マスタード（例えばシクロホスファミド、メルファラン及びウラシル
マスタード）、ニトロソウレア等；抗生物質及び類似体、例えばアクチノマイシン、アントラマイシン、ドクソル
ビシン、ピューロマイシン等；代謝拮抗剤、例えば葉酸類似体（例えばメトトレキセート）、プリン類似体（
例えば6-メルカプトプリンおよびチオグアニジン）及びピリミジン類似体（例え
ばフルオロウラシル）；白金錯体、例えばシスプラチン；並びに例えばヒドロキシウレアを含む他の抗新生物化合物。

【００９８】さらに、細胞毒性または細胞静止化合物は、免疫調節化合物またはホルモン類
似体化合物であっても良い。前者の例は、インターフェロンα、β及びγ、並び
にIL-2のようなインターロイキンを含む。後者の例は、抗アンドロゲン、抗エス
トロゲン（例えばタモキシフェン）、アロマターゼインヒビター、エストロゲン
類似体、LHRH類似体（例えばブセレリン）等を含む。

【００９９】細胞静止化合物はまた、バチマスタートのようなマトリックスメタロプロテイ
ナーゼインヒビターのような抗転移剤を含む。

【０１００】治療の方法本発明のペプチド、類似体または抗体はまた、数多くの疾患、特に細胞の非制
御的な増殖が一部を担っている疾患を治療する方法において使用されても良い。
非制御的な細胞増殖が治療される疾患は、血管再狭窄、ガン、アテローム性動脈
硬化症、リューマチ性関節炎、糖尿病、及び腎臓疾患、及び乾癬を含む。

【０１０１】新脈管形成及び傷の治癒フィブリンの沈着及び溶解は、プラスミノーゲン及びフィブリノーゲンノック
アウトマウスモデルにおける治癒の以上によって示されるように、必須の特徴で
ある(5,6)。本発明者らは、マウス切開損傷モデルにおいて、単純な傷の抽出物
における新脈管形成活性のピークが３日目で生じ、５日目の傷の血管密度のピー
クに先行する(7)ことを示し、新脈管形成活性の大部分がフィブリン断片Eに寄与
する(8)ことを示唆した。それ故本発明の化合物は、傷の治癒と関連して治療に
おける使用が見出されても良い。

【０１０２】血管再狭窄臨床上重要な血管形成術後の再狭窄の可能性は一般的に、血管形成部位での血
液凝固の量によってかなりの度合いで予測されると解されている。抗トロンビン
薬であるヒルジンは、実験的に男性において再狭窄を減少することに部分的に成
功している(9)が、これがPAR-1トロンビンレセプターを介した平滑筋細胞増殖の
指向的なトロンビン刺激の凝固減少または予防に寄与しているかは不明確である
(10)。しかしながら、PAR-1ノックアウトマウスが正常であり、正常な傷の治癒
を有することは明らかであり(11)、脈管内膜過形成が、ウサギにおける頸動脈損
傷に引き続き、アンチセンストロンビンレセプターオリゴデオキシヌクレオチド
によって阻害されないことは明らかである(12)。トロンビン及びプラスミンの両
者に依存するが、トロンビンレセプター依存性ではない別の候補が、フィブリン
断片Eである。フィブリン分解産物は、血管損傷部位を含む治癒及び修復部位、
並びにヒトアテローム性動脈硬化プラークの増殖タイプの抽出物において豊富で
ある。本発明者らは、フィブリン断片Eが、培養物中の大動脈媒体外殖片からの
平滑筋細胞増殖及び外殖を刺激することを示した(13)。これは、トロンビンが不
活性である血清リッチな培養物において生じる。それ故上記ペプチド、類似体及
び抗体は、再狭窄の治療及び予防における使用が見出される。

【０１０３】アテローム性動脈硬化症凝固システムの異常と冠状動脈の血栓症との間の関連は、急性凝固の観点のみ
ならず、ヒト集団における心臓血管梗塞形成の危険の観点でも十分に確立されて
いる。多くの予測的な研究において、フィブリノーゲン、第VIIa因子、及びフィ
ブリン分解産物(Dダイマーアッセイ)のような凝固因子の血漿レベルまたは活性
が、心臓血管梗塞形成、並びに発作及び進行性末梢血管疾患のような他の血管現
象についての予期される危険因子であることが示されている(14,15,16)。喫煙の
ための危険のかなりの割合が、上昇したフィブリノーゲンに寄与している。アテ
ローム性動脈硬化症の急性の病変を有するこの危険因子の相互作用の態様、つま
り動脈壁内のアテローム性動脈硬化プラークは、説明されないままであるが、プ
ラークの脂質コアと混合したフィブリンの蓄積の最終結果であり、マイナーな及
びメジャーな最終結果における蓄積したトロンビンの形成が十分に確立されてい
る。

【０１０４】アテローム性動脈硬化症のメジャーな病理的特徴は、動脈壁の平滑筋細胞によ
るフィブリン及び脂質の蓄積に対する応答である。平滑筋細胞増殖は、血管形成
術後の再狭窄のより急性病変であるため、プラーク形成における鍵となる現象で
あると長く認識されている(17)。アテローム性動脈硬化症病変は、いくつかのタ
イプに分割でき、最も早期のものはゼラチン状病変として考慮され、それは繊維
質プラークの前駆体である。早期のゼラチン質病変はほとんど脂質を含まないが
、顕著な量のフィブリン関連抗原(FRA)を含む(18)。より進行した病変では、フ
ィブリンが層状に沈着し、繰り返される血栓のエピソードを示唆する(19)。全て
の病変において、FRAは主にフィブリノーゲンではなく架橋したフィブリンから
由来し、フィブリンの連続した沈着と溶解を示唆する(20)。

【０１０５】ヒトの検死及び外科的物質から得た病変の活性タイプから得た最も内部の可溶
性抽出物は、in vivoのチキン絨毛尿膜試験モデルにおいて細胞増殖を刺激する
ことが本発明者らによって示されている(21)。この研究は、刺激抽出物の短いシ
リーズについて、活性の大きさが抗フィブリン（フィブリノーゲン）抗体を含む
アフィニティーカラムを通じてそれぞれ通過させることによって除去されること
を示すことに拡張した(22)。選択的な除去は、結合特異的抗断片E抗体で再び達
成されるが、結合抗断片D抗体では達成されなかった。

【０１０６】リューマチ性関節炎リューマチ性関節炎の原因は未知であるが、免疫系によって由来することが周
知である。これは、パンヌスと称される繊維血管内部成長によって組織されるよ
うになるフィブリンの沈着と、炎症細胞において豊富な膜の形成を伴う結合組織
の骨膜の結合のエピソード的炎症を原因とする。これは、結合部表面を切断して
段階的に破壊し、痛みと静止化を引き起こすタンパク質溶解酵素を放出する結合
部軟骨に拡大する。抗炎症薬は症状を緩和するが、有意には疾患の進行を停止し
ない。急性エピソードの間のパンヌス拡大の予防は、非常に有利となるであろう
。

【０１０７】糖尿病性網膜症糖尿病性網膜症は、糖尿病を微弱にしか制御できない身体のいずれかの場所と
して眼の内部の微小血液供給管の狭窄化を原因とする。それは、網膜の虚血領域
に応答して漏れやすい新生血管の増殖を特徴とする。繊維状血管増殖と収縮の組
み合わせは、ガラス体に関与し、網膜を歪曲して破壊する。フィブリンの沈着と
分解は、正常な治癒と修復のこの不利な現象に貢献するであろう。

【０１０８】腎臓疾患：急性の且つ病巣糸球体腎炎は、関連する炎症細胞を有する糸球体中の
免疫複合体とフィブリンの両者の沈着によって特徴付けされる。多くの場合で、
糸球体腎炎と腎機能不全での機能の永久の損失を導く合理的な細胞増殖が存在す
る。抗炎症剤は、細胞増殖を阻害する薬剤を補うであろう。

【０１０９】腫瘍成長と転移 1mmより大きく成長し、周囲の正常組織を侵襲するいずれかのタイプの悪性の
侵襲性の上皮腫瘍について、新たな血液の供給の循環について絶対的な必要性が
存在する。腫瘍新脈管形成の現象は、治療上の抗ガン介入についての標的を提供
する。これらの新規な小毛細血管は漏れやすく、フィブリノーゲンを含む血漿タ
ンパク質が、腫瘍の端部で隣接する結合組織において豊富である。フィブリンが
傷害において最も侵襲性の腫瘍を取り囲む間質の移動端で沈着するとかつて解さ
れていた(23)が、現在では、多くの腫瘍タイプが、これを生じるための完全なセ
ットの前凝血因子を展示しないと解されている。しかしながら、肺の燕麦細胞ガ
ン及び腎臓の明細胞ガンといった二つの主要な例外が存在する(24,25)。これら
の二つの腫瘍タイプは共通であり、非常に血管性であり、フィブリン沈着を示し
、一度起源の部位から転移によって拡散が生じると治療するのが困難である。生
存者においていくつかの控えめな改良が、凝固を阻害する薬剤であるワツファリ
ンでの燕麦細胞ガンを有する末期疾患患者の試験において示されている(23)。上
記薬剤の一つの問題は、著しい出血の非常に現実の危険のため、完全な阻害が達
成できない点である。腫瘍成長に寄与しないが、腫瘍新脈管形成に寄与するフィ
ブリンE刺激の阻害は、化学療法及び放射線療法による現在の部分的に有効な治
療に有用な付属物となるであろう。標的として使用されても良い他の腫瘍細胞は
、肺（小細胞肺を含む）、腸（大腸）、胸部、卵巣、前立腺、胃、肝臓、膵臓、
及び皮膚腫瘍、並びに白血病のような固体の腫瘍の細胞を含む。

【０１１０】手術のためのフィブリン接着剤：フィブリン分解産物によって引き起こされる細
胞増殖を促進または阻害するためのフィブリン接着剤の修飾は、本発明によって
提供されるフィブリンEの相互作用の部位のプロモーターまたはインヒビターを
調製しそれと混合することによって達成できる。これらの接着剤は、縫合が実践
的ではない場合に、広範囲の手術についてますます使用される。

【０１１１】全てのこれらの例の疾患において、臨床上の目的は、開始原因を妨げることで
あるが、これはしばしば不可能である。新脈管形成及び細胞増殖の選択的な阻害
は、非常に所望されるであろう。同時に、正常な炎症応答の他の特徴、及び血液
凝固とフィブリン溶解の妨害を避けることが好ましいであろう。

【０１１２】しかしながら、一つの部位での臨床上の操作は、他の部位での臨床上の問題と
衝突するであろう。例えば、腫瘍成長を阻害するための抗脈管形成剤の全身性の
投与は、治癒中の皮膚の損傷または胃の消化性潰瘍の正常な治癒及び修復に負に
影響するであろう。

【０１１３】考え得る制限の範囲は、非所望の副作用に対する治療の成功の治療上の限界に
依存する。短期的治療及び局在した治療は、いくつかの問題に対する回答を与え
るが、全てというわけではない。それ故、二次的な損傷の危険で他の部位及び疾
患での予防状または治療上の治療を使用することが考慮される。それ故、細胞増
殖及び／または新脈管形成インヒビターが興味ある部位または全身性で使用され
る治療が開発されても良いが、新脈管形成及び正常な細胞増殖応答を刺激する局
所的な保護的FDP誘導化細胞増殖及び／または新脈管形成アゴニストが、他の部
位で提供される。全身性及び局所的な投与の組み合わせが、実行可能となり有効
となるであろう。

【０１１４】一般的に上記方法は、本発明のペプチド、類似体または抗体（またはそれらの
組成物）の有効量を、治療の必要のある患者に投与することを含むであろう。本
発明の化合物の投与の適切な経路は、経口または非経口を含み、企図される使用
及び医師の判断に部分的に依存するであろう。小さなペプチドは経口的に投与さ
れても良いが、非経口の投与が一般的にある環境では簡便であろう。

【０１１５】患者に投与される本発明のペプチド、類似体または抗体の量は、患者の状態及
び治療される状態を考慮して、究極的に医師の判断で決定される。

【０１１６】投与は、例えば点滴の形態で連続的に、または不連続の間隔で、例えば一日二
回、毎日、毎週または毎月で投与されても良い。上述の範囲の皮膚における活性
剤の濃縮を達成するために、投与は局所的に投与されても良い。

【０１１７】本発明のペプチド、類似体または抗体が、細胞毒性剤または細胞静止剤と組み
合わされて投与される場合、上記薬剤の投与量は、製造者の説明書に従って決定
されるであろう。

【０１１８】ペプチド、類似体または抗体は、その有効性を増大し、正常細胞に対する効果
を避けるために、各種のメカニズムによって腫瘍細胞に選択的に輸送されても良
い。上記メカニズムは、VEGFレセプターまたはCEAのような、標的細胞に対して
レセプターまたは抗体と特異的に相互作用する分子に対して、ペプチド、類似体
または抗体をカップリングすることを含む。別法として、本発明の遺伝子治療ベ
クター発現ペプチドは、胎児肝細胞において活性であるプロモーターのような、
腫瘍細胞において選択的に活性化されるプロモーターを有する発現システムを含
んでも良い。

【０１１９】さらなる実施態様として、本発明のペプチド、類似体または抗体は、新脈管形
成法の間で患者の動脈内に導入されるステント内に取り込まれても良い。これは
、本発明のペプチド、類似体または抗体が再狭窄を治療するためである。上記ス
テントは、動脈の狭窄によって引き起こされる心臓疾患を治療するために動脈内
に配置されたままであるようにする、上記方法の間に膨張するプラスチックのよ
うな重合性物質で任意に被膜された、ステンレススチールより通常なる中空金属
チューブである。この方法の問題は再狭窄の発生であり、即ち心臓血管細胞が内
部に成長する傾向を有し、さらなる治療が最終的に必要とされる。本発明のペプ
チド、類似体または抗体でステントを被膜することによって、上記ペプチド、類
似体または抗体は、心臓血管組織内に局所的に輸送され、FDPによる細胞増殖の
刺激を阻害することによって細胞の局所的再成長を妨げるであろう。

【０１２０】本発明のペプチド、類似体または抗体は、当該技術において本質的に周知であ
る従来の態様によって上記ステントを被膜しても、上記ステント内に取り込まれ
ても良い。例えば上記ペプチド、類似体または抗体は、上記ステント材料と適合
可能な製薬学的に許容可能なキャリアーと混合されて、上記ステントの表面また
は内部を被膜しても良い。上記ステント内部に取り込まれることが企図される場
合、上記ステントは重合構造にセルを与える空間を含むことが望ましい。上記ス
テントがメッシュの形態で存在する場合、上記ペプチド、類似体または抗体は、
メッシュ鎖の間の空間内に含まれる適切な持続放出キャリアー内に取り込まれて
も良い。持続放出製剤は、当該技術分野で数多くの異なる目的について広く入手
可能である；これらは、移植に引きつついて身体内部に遅延して溶解する製薬学
的に許容可能なポリマーに基づく製剤を含む。

【０１２１】数多くの冠状動脈ステントが、FDAによって米国での臨床上の使用のため是認
されている。これらは、Cordis Corporation (Johnson & Johnson Intervention
al Systemの子会社)によって製造されたPalmaz-Schatzステント、及びCook Card
iology (Bloomington, IN, USA)によって製造されたGianturco-Roubin II (GR-I
I)ステントのようなバルーン膨張ステントを含む。例えばWallstent (Medivent-
Schneider, Switzerland)といった自己膨張ステントもまた、当該技術分野で使
用される。一般的にこれらのステントは、約0.1mm（例えば0.07から1.5mm）の直
径のワイヤーよりなり、3-5mmの直径に膨張するようにデザインされ、約10から2
0mmの長さである。

【０１２２】本発明のステントをコートするペプチドの提供について挙げられるステントコ
ーティングの例として、ヘパリン被膜Palmaz-Schatzステント(Serruys等, Circu
lation, 1996, 93; 412-422)及び血小板糖タンパク質IIa/IIIaレセプター抗体ポ
リマー被膜ステント(Aggarwal等, Circulation, 1996, 94; 3311-3317)を含む。

【０１２３】さらなるガイドラインとして、当業者は、"Coronary Artery Stents", an ACC
Expert Consensus Document (Pepine等, J. Am. Coll. Cardiol., 1996, 28; 7
82-794)を参照することができる。

【０１２４】以下の実施例は、本発明を説明する。

【０１２５】

【実施例】

実施例１フィブリン断片Eは、66kDa細胞膜構成成分に結合する i)フィブリン断片Eのジゴキシゲニンラベリング 8.18mlのDMSOに溶解した327mgのジゴキシゲニンエステルを、1mlのリン酸緩衝
生理食塩水(PBS)中の1mgのフィブリン断片Eに加え、室温で２時間インキュベー
トした。次いでこれをPBSに対して透析し(1lで３回交換）、非反応エステルとDN
SOを除去した。ラベル化タンパク質の検出を、ヒツジで生産した抗ジゴキシゲニ
ンアルカリホスファターゼ(Boehringer)を使用して実施した。

【０１２６】 ii)リガンドブロットチキン線維芽細胞、Cos7、マウス3T3及びヒト胚肺細胞(HEL)を、飽和まで25cm ² フラスコ(Nunc)で培養した（約3×10⁶細胞）。次いで細胞を２％EDTAを有するP
BSを使用して上記フラスコから浮き出させ、ゴムポリスマンでわずかに断片化し
た。細胞を3000rpmで５分遠心分離し、低張性ショック溶液に懸濁し、３０分ソ
ニケートし、遠心分離して1mlのPBSに再懸濁した。次いで100mlの細胞を、ゲル
ローディング色素を含む35mlのSDS(8%SDS、40%グリセロール、12.5% 0.5MTris-
グリシンバッファーpH6.8、及び10mgのブロモフェノールブルー)に加え、９５℃
で５分加熱した。

【０１２７】ローディング色素中の50mlの細胞を、勾配ポリアクリルアミドゲル(3-20%)に
適用し、色素がゲルのベースに到達するまで５時間電気泳動した。次いで上記ゲ
ルを、SDSを除去するための0.5%Triton X-100を含むTris緩衝食塩水で数回洗浄
した。次いでゲルを、Ttisグリシンバッファー(25mM Tris及び192mMグリシン)に
おいてBio-Radブロッティングシステムを使用してPVDF膜(Millipore)にブロット
した。

【０１２８】ブロッティング膜を、Tris緩衝食塩水(TBS)中の5%ウシ血清アルブミンを使用
してブロックした。次いでブロットをジゴキシゲニンラベル化フィブリン断片E(
100mlのTBS中に100mg)で３７℃で一晩インキュベートした。上記膜をTBS 0.5% T
ween 20で１０分間三回洗浄し、アルカリホスファターゼに接合したヒツジ抗ジ
ゴキシゲニン抗体で１時間インキュベートした。膜を再びTBSで３回洗浄し、引
き続き二炭酸ナトリウムバッファー(NaHCO₃ 100mM, MgCl₂ 10mM)中のニトロブル
ーテトラゾリウム、ブロモ-クロロ-インドリル-ホスファートで発色させて、レ
セプター含有バンドの位置を視覚化した。各細胞タイプについて、バンドは約66
kDaと同定された。この発見を確認するために、以下のようにフィブリン断片Eで
以前にチャレンジされた細胞を使用して、膜イムノブロット実験を実施した。

【０１２９】 iii)膜イムノブロットチキン線維芽細胞、Cos7、マウス3T3及びヒト胚肺細胞(HEL)を、飽和まで25cm ² フラスコ(Nunc)で培養した（約3×10⁶細胞）。100mgのジゴキシゲニンラベル化
フィブリン断片Eを細胞に加え、３７℃でインキュベートした。細胞をPBSですす
ぎ、２％EDTAを有するPBSを使用して上記フラスコから浮き出させ、ゴムポリス
マンでわずかに断片化した。細胞を3000rpmで５分遠心分離し、低張性ショック
溶液に１５分懸濁し、遠心分離して1mlのPBSに再懸濁した。次いで100mlの細胞
を、ゲルローディング色素を含む35mlのSDS(8%SDS、40%グリセロール、12.5% 0.
5MTris-グリシンバッファーpH6.8、及び10mgのブロモフェノールブルー)に加え
、９５℃で５分加熱した。

【０１３０】ローディング色素中の50mlの細胞を、勾配ポリアクリルアミドゲル(3-20%)に
適用し、色素がゲルのベースに到達するまで５時間電気泳動した。次いで上記ゲ
ルを、SDSを除去するための0.5%Triton X-100を含むTris緩衝食塩水で数回洗浄
した。次いでゲルを、Ttisグリシンバッファー(25mM Tris及び192mMグリシン)に
おいてBio-Radブロッティングシステムを使用してPVDF膜(Millipore)にブロット
した。

【０１３１】ブロッティング膜を、Tris緩衝食塩水(TBS)中の5%ウシ血清アルブミンを使用
してブロックした。次いでブロットをウサギ抗フィブリノーゲン抗体(Dako)で３
７℃で一晩インキュベートした。上記膜をTBS 0.5% Tween 20で１０分間三回洗
浄し、アルカリホスファターゼに接合したヤギ抗ウサギ抗体で１時間インキュベ
ートした。膜を再びTBSで３回洗浄し、引き続き二炭酸ナトリウムバッファー(Na
HCO₃ 100mM, MgCl₂ 10mM)中のニトロブルーテトラゾリウム(NBT)、ブロモ-クロ
ロ-インドリル-ホスファート(BCIP)で発色させた。これは、約122kDaのバンドを
生じ、それは66kDaの膜断片に結合した断片E(55kD)と一致する。レセプターに対
する結合のさらなる証拠を与えた。

【０１３２】 iv)細胞免疫組織化学チキン線維芽細胞を、飽和まで25cm²フラスコ(Nunc)で培養した（約3×10⁶細
胞）。細胞をPBSで洗浄し、次いでトリプシン処理し、10%胎児ウシ血清を含むダ
ルベッコ修飾培地のml当たり３×１０⁵細胞に希釈した。50mlの細胞懸濁物を、N
unc培養ウェルスライドの各ウェルに配置した。細胞をインキュベートして接着
させ、パッセージから回収した。ジゴキシゲニンラベル化フィブリン断片Eを、m
l当たり8mgの最終濃度で加えた。コントロールウェルは、非接合ジゴキシゲニン
及びPBSを含んだ。

【０１３３】細胞を２時間後PBSですすぎ、次いでTBSで３回、引き続き滅菌水で１回洗浄し
た。次いで細胞を、抗ジゴキシゲニンアルカリホスファターゼで２時間インキュ
ベートした。次いでスライドをTBSで三回洗浄し、二炭酸バッファーpH9.8中のNB
T及びBCIPで発色した。スライドを風乾し、染色膜の観察のため顕微鏡下に乗せ
た。細胞は、フィブリン断片Eを結合することが示された。

【０１３４】 v)細胞結合アッセイチキン線維芽細胞、Cos7、マウス3T3及びヒト胚肺細胞(HEL)を、飽和まで25cm ² フラスコ(Nunc)で培養した（約3×10⁶細胞）。細胞をトリプシン処理し、1.3×
10⁵細胞/mlの濃度で再懸濁した。200μlのこの細胞懸濁液を、96穴培養プレート
(Nunc)の各ウェルに加えた。細胞を３７℃で一晩インキュベートし、接着させて
回収した。次いで細胞を、ジゴキシゲニンコントロール、PBSコントロール、及
びジゴキシゲニンラベル化断片E試験物の３種のセクションに分割した。増大す
る濃度のジゴキシゲニン及びジゴキシゲニンラベル化フィブリン断片Eを、ウェ
ル当たり0-30mgで与えた。プレートを培養条件まで３７℃で６時間インキュベー
トした。

【０１３５】プレートから培地を除き、PBSで三回洗浄した。次いで細胞を、ヒツジ抗ジゴ
キシゲニンアルカリホスファターゼで２時間インキュベートし、二炭酸バッファ
ーpH9.8中のp-ニトロフェニルホスファートで発色させた。プレートを、405nmで
Titertek Multiscanプレートリーダーで読み取った。細胞タイプのそれぞれにつ
いて、高い吸光度をコントロール調製物と比較して測定し、細胞に対するジゴキ
シゲニンラベル化フィブリン断片Eの結合が示された。

【０１３６】フィブリン断片Eが試験された細胞タイプのそれぞれに結合するという結果は
、66kDaのフィブリン断片E特異的レセプターが細胞膜上に存在することを示唆す
る。

【０１３７】実施例２フィブリン断片Eに対する抗体は、FDP誘導性細胞増殖刺激をブロックする i)ポリクローナル抗体生産以下の免疫化プロトコールを使用して、フィブリン断片Eに対してポリクロー
ナル抗体を生産した。ウサギ及びラットを、フィブリノーゲン断片Eのトロンビン処理によって調製
されたフィブリン断片E(Diagnostica Stago)で免疫化した。0.5mlのPBS中の50mg
のフィブリン断片Eを、0.5mlのフロイント完全アジュバントと混合した。ウサギ
を筋肉内で、ラットを腹膜内で免疫化した。次いで動物を、不完全フロイントア
ジュバントにおいてフィブリン断片Eのみを含むことが示された50mgの長いフィ
ブリン消化で、４及び８週後で追加免役した。次いで動物を採血し、フィブリン
切断産物のブロットに対する反応性について血清を試験した。

【０１３８】 ii)CAM細胞増殖アッセイ以前に記載されたように、チキン絨毛尿膜(CAM)を使用して、細胞増殖を測定
した(4,29,30)。使用されたアッセイは、各CAMの全体の「ドロップ化」領域に対
する液体形態で適用した１８時間後の、コントロール及び試験物質にさらした後
の、VAM中のDNA合成の定量的測定に基づく(4,29)。このアッセイは、CAM血管に
おける変化の測定である(30)。

【０１３９】ウサギ及びラット抗血清を、活性なフィブリン分解産物と混合した。これらを
、ポジティブコントロール（フィブリン分解産物）及びネガティブコントロール
（抗体単独）と共にチキンCAMに適用した。CAMをトリチウム化チミジンの取り込
みについて加工した。その結果、フィブリン分解産物は活性であり、フィブリン
断片Eに対するラット及びウサギ抗血清は上記活性を除去することが示された。

【０１４０】実施例３ペプチドの同定本発明者らは、フィブリン断片Eの活性をブロック可能なポリクローナル抗血
清を使用して、Fdファージにおいて調製されたペプチドライブラリーをスクリー
ニングした。

【０１４１】 i)ファージライブラリーラット及びウサギポリクローナル抗体を、以前に記載されたように精製ヒトフ
ィブリン断片Eに対して生産した(4)。全ての二次抗体は、商業的な供給元から購
入した(Sigma Chemicals)。Scott & Smith (1990) (27)によって記載された２×
１０８クローンの１５アミノ酸ペプチド遺伝子VIIIライブラリーのサンプルを、
George Smith (University of Missouri Columbia, USA)からファージ懸濁液と
して得た。20mlのこのファージ懸濁液をlog中期のK91細胞に感染させ、ODが約０
．９に到達したときに、それをIPTGで誘導し、6.6×10⁹のテトラサイクリン耐性
トランスダクトの形成を生じた。20mgのテトラサイクリン/mlを含む１リットル
の２×TY培地で攪拌しながら３７℃で２４時間生育させることによって、これら
を増幅した。ファージの沈降の前に、最初に培養物を４℃で8000RPMで１０分回転させ、細
菌を除去した。上清を維持し、PEG 6000 20%(w/v), 0.5モルのNaClを加え、〜４
％(w/v)の最終PEG濃度を生じた。次いで培養物を氷上で１時間冷却し、10000RPM
で４℃で２０分遠心分離した。ファージを10mlのTris緩衝食塩水に再懸濁した。

【０１４２】 ii)ファージの選択ライブラリーからのファージの選択を、Parmley & Smith (1988) (9)のバイオ
パンニング法に基づく方法を使用して実施した。1:200から1:1000の希釈物でPBS
中の各ポリクローナル抗体の1mlを、60mmペトリ皿(Nunc)に加え、室温で一晩軌
道インキュベーターでインキュベートし、抗体を接着させた。翌日5mlのブロッ
キング溶液(PBS, 0.5% Tween, 5% スキムミルク)を各皿に加え、ポリクローナル
抗体によって接着されていない部位をブロックした。次いで皿を、室温で１時間
軌道インキュベーター中でインキュベートし、PBST(PBS), 0.5% Tween)で５回洗
浄した。

【０１４３】 100μlの遺伝子VIIIライブラリーを各皿に加え、皿を軌道インキュベーターに
おいて室温で１時間インキュベートした。次いで非結合ファージを注ぎ流して、
皿をPBS-Tweenで５回洗浄した。固定化ポリクローナルに結合したままであるフ
ァージを、800μl 0.1M HCl (pH2.2グリシン含む)の添加によって抗体から回収
し、室温で１５分インキュベートした。48μlの非緩衝Trisベースを各皿に加え
、酸を中和した。

【０１４４】第１ラウンドのバイオパンニングのため、各皿の内容物を3mlの培養物のログ
中期大腸菌K91に加え、室温で１０分インキュベートした。2mlのLB培地(1lの水
中に10gトリプトン, 5g酵母抽出物、10g NaCl、pH7.5)を各培養物に加えた。テ
トラサイクリンもまた0.2mg/mlの濃度で加え、培養物を３７℃(225RPM)で４０分
インキュベートした。さらなるテトラサイクリンを20mg/mlの最終濃度で加え、
培養物を３７℃(225RPM)で16-20時間生育させた。ファージの侵入及び排出力価
を、LBアガー皿でのプレーティングとインキュベーションにより測定した。

【０１４５】第２ラウンドの増幅を、バイオパンニングの第１ラウンドから回収された100
μlのファージをブロック化ポリクローナルに対して使用することを除いて、第
１ラウンドと同様に実施した。第３ラウンドのバイオパンニングも、バイオパン
ニングの第２ラウンドから回収された100μlのファージをブロック化ポリクロー
ナルに対して使用することを除いて、第１ラウンドと同様に実施した。

【０１４６】第２及び３ラウンドの間、ファージが添加されていないK91細胞よりなるネガ
ティブコントロールを、K91ストックが、別の手段、即ちプラスミドトランスフ
ァーによってテトラサイクリン耐性を獲得していないことを示すために使用した
。第４ラウンドの増幅を、バイオパンニングの第２ラウンドから回収された100
μlのファージを、異なる種から得たポリクローナルに対して使用することを除
いて、第３ラウンドと同様に実施した。即ち、ウサギポリクローナルに対するバ
イオパンニングの第３ラウンドの後に回収されたファージを、ラットポリクロー
ナルに対して使用し、ラットポリクローナルに対するバイオパンニングの第３ラ
ウンドの後に回収されたファージを、ウサギポリクローナルに対して使用した。
これは、同じ抗原に対する２種の異なる種において生産された異なるポリクロー
ナルの均質性を調べ、標的エピトープを共有していないものを拒絶するためであ
った。

【０１４７】 iii)反応性クローンの試験一セットのウェルを被膜するためにラット抗フィブリンEポリクローナルの1:2
00希釈物を使用するELISAでの第４ラウンドの排出と、ウサギ抗フィブリンEポリ
クローナルの1:200希釈物で被膜された第２ラウンドの排出から、反応性クロー
ンを同定した。選択されたファージクローンのサンプルを、それぞれPAGEにかけ
、選択工程の基礎である存在する抗E抗血清でイムノブロットした。６０の選択
された反応性クローンを、1-20、21-40及び41-60の３群に組み合わせ、サンプル
をフロイント完全アジュバントと混合し、ラット及びウサギを免疫化するために
使用した。生成した新たな抗血清を、選択されたファージクローンタンパク質及
びヒトFDPのPAGEのイムノブロットによって初めに試験した。21から40、及び41
から60に対して生産されたポリクローナル抗血清は、イムノブロット上の断片E
を検出する。対照的に、1から20に対して生産されたポリクローナル抗血清は検
出しない。

【０１４８】次いでウサギ抗血清を、チキンCAMモデルに対するヒトFDPの刺激活性をブロッ
クする能力について試験した。使用されるアッセイは、各CAMの全体の「ドロッ
プ化」領域に対する液体形態の適用の１８時間後の、コントロール及び試験物質
に対してさらした後、CAMにおけるDNA合成の定量的測定に基づく(4,29)。このア
ッセイは、CAM血管における変化の測定である。ウサギの比較的短い期間の免疫
化によって生産された抗ファージ抗血清を1/2希釈で使用し、使用の前に1/10に
希釈した約1.95mg/mlの濃度で使用するFDPと混合した。フィルター濾過の後、0.
3mlを各CAMドロップ化表面に加えた。

【０１４９】 iv)FDP新脈管形成活性のブロックの測定図１は、ウサギ抗ファージ1-20は、混合の後FDPの刺激活性をブロックすると
思われないが、ウサギ抗ファージ21-40及び41-60は、上記刺激を阻害する一つの
実験を示す。繰り返し実験は、同様な阻害を有する後者の二つの抗体に対してさ
らに２回実施した。抗体単独及びバッファー単独のコントロールは効果を有さな
い。

【０１５０】 v)個々のクローンの試験個々のクローン41-60に対して生産された抗体を、チキンCAMアッセイを使用す
る阻害活性について試験した。クローン42、43、44及び45に対して生産された抗
体は、阻害性であることが見出された（図２、３）、対照的に、例えばクローン
49（図３）及び53に対する抗体は阻害性ではなかった。

【０１５１】 vii)個々のペプチドの配列決定クローン45及び49からアミノ酸配列を得た。クローン45抗血清によって認識さ
れるペプチドは、ファージライブラリーの再スクリーニングによって得た。以下
の４種のペプチド配列が、クローン45について得られた： CRAHSFGSPRPLPVV （配列番号１） SRAHSFGSPRPLPVV （配列番号２） CRAHSFVSPRPLPVV （配列番号３） QPDPHLMMWKLPGFP （配列番号４）。

【０１５２】１種の配列が、クローン49について得られた： ALSKRPVGRPRVCTG （配列番号５）。

【０１５３】実施例４： i)クローン45のアミノ酸配列に対応するペプチドは、細胞増殖を阻害する。配列番号１に対応するペプチドを合成し、WTM110と名付けた。WTM110を、上述
のチキンCAMアッセイを使用して、FDP誘導性細胞刺激の調節について試験した。
その結果が図４に示されている。7.5μg/mlで、細胞増殖の阻害はほとんど存在
しない。しかしながら、15μg/mlに濃度を上昇すると、コントロールレベルに対
して減少した細胞増殖の阻害が示された。

【０１５４】 ii)WTM110に対して生産された抗体は、細胞増殖を阻害する。 WTM110に対して抗体を生産し、上述のチキンCAMアッセイで使用した。図５に
示されるように、抗WTM110抗血清の存在下で、FDPによる細胞増殖の刺激は阻害
された。

【０１５５】各ファージDNA挿入物の分析から由来する、最終に選択されたエピトープに対
する配列情報を、分子上の活性部位の検出、及びブロッキング抗体の不朽化だけ
でなく、大量の短いペプチド及び短いペプチド類似体の合成のために使用できる
。これらを、ヒト断片Eに対する競合的ブロッキング活性について試験できる。
上記ペプチド及び類似体は、凝固またはフィブリン溶解を妨げる付随する危険な
く、広範囲の病理においてin vivoでフィブリン断片Eの細胞刺激効果をブロック
するための、長期的な治療薬の可能性を有する(30)。我々の以前の研究により、
フィブリンEに対するブロッキング抗血清の混合物が、実験的なマウス傷害抽出
物(31)と、ヒトアテローム性動脈硬化プラークの増殖タイプの抽出物(21)の新脈
管形成効果を阻害するであろうことが示されている。我々はまだ、in vivoでの
阻害を試験していない。例えば傷の治癒を阻害するためのin vivoでの持続輸送
は、多種のポリクローナル抗血清よりも、小さいペプチドの投与によって容易に
達成されるはずである。

【０１５６】各ファージDNA挿入物の分析から由来する、最終に選択されたエピトープに対
する配列情報は、分子上の結合部位の部分の位置決定に使用されている。上記配
列情報はまた、大量の短いペプチドを合成するためにも使用できる。これらを、
ヒト断片Eに対する競合的ブロッキング活性について試験できる。上記ペプチド
は、治療薬の可能性を有する。

【０１５７】上記タンパク質分子のいくつかの短い断片に制限されるものであっても、活性
部位の位置の知見は、生物学的活性に影響するかもしれない、フィブリンの周知
の分枝構造内の非免疫原性隣接領域のさらなる試験を可能にする。上記領域の合
成ペプチド及び類似体は、薬剤の可能性を有するさらなる実験試薬を提供するで
あろう。

【０１５８】

【参考文献】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、刺激性FDPと３種の異なるウサギ抗ファージ抗体との
混合物の効果を説明する。

【図２】図２は、FDPの刺激効果を破壊する、選択されたファージクロ
ーン42、43及び44に対する抗ファージ抗体の混合物の効果を説明する。対数変換
データでのスチューデントｔ検定は、FDPによるバッファーのみのコントロール
群軍と比較して、DNA合成における顕著な増大(P<0.05)を示す。３種の抗ファー
ジ群は、FDP群とは顕著に異なるが、コントロール群とは異ならない。

【図３】図３は、刺激性FDPと選択されるファージクロン45及び49に対
する抗ファージ抗体の混合物の効果を説明する。FDPの刺激効果は、抗ファージ4
5(P<0.05)によって阻害されるが、抗ファージ49では阻害されなかった。

【図４】図４は、ペプチドWTM10が、FDPの刺激効果を阻害することを説
明する。

【図５】図５は、ＷＴＭに対して生産された抗体が、FDPの刺激効果を
破壊することを説明する。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年７月１２日（２００１．７．１２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項２９】請求項１から１１のいずれか一項記載のペプチドをコード
する約１５から５０の間のヌクレオチドの配列より必須になる核酸プライマー。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年７月１８日（２００１．７．１８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００３７】ペプチドの生産と修飾反対に特定されている場合を除き、ここに記載されるペプチド配列は、従来の
一文字コードでN-末端からC-末端の向きで示される。本発明のペプチドのアミノ
酸配列は、天然に存在しないアミノ酸を含むように、またはin vivoで化合物の
安定性を増大するように修飾されても良い。化合物が合成法によって生産される
場合、上記アミノ酸は生産の間で取り込まれても良い。化合物はまた、以下の合
成生産または組換え生産のいずれかに引き続き修飾されても良い。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００４４】発現ベクター、核酸、及び宿主細胞別の特徴点として、本発明は、本発明のペプチドをコードする核酸を提供する
。例えば、上記核酸は、約１５から５０の間のヌクレオチドより必須になる核酸
プライマーであっても良い。本発明のポリヌクレオチドは、組換え複製ベクター
内に取り込まれることができる。上記ベクターは、適合可能な宿主細胞において
核酸を複製するために使用されても良い。。かくしてさらなる実施態様として、
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを複製可能なベクターに取り込ませること
、上記ベクターを適合可能な宿主細胞に導入することを、上記ベクターの複製を
もたらす条件下で上記宿主細胞を生育させることによる、本発明のポリヌクレオ
チドの生産方法を提供する。上記ベクターは、上記宿主細胞から回収しても良い
。適切な宿主細胞は、発現ベクターと結びつけて以下に記載される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 9/10 １０１４Ｃ０８５ 9/00 13/12 ４Ｃ０９７ 9/10 １０１ 17/06 ４Ｈ０４５ 13/12 19/02 17/06 29/00 １０１ 19/02 35/00 29/00 １０１Ｃ０７Ｋ 14/47 ＺＣＣ 35/00 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 ＺＣＣ 19/00 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 21/08 5/06 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ 21/08 ＥＣ１２Ｑ 1/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者クリスティーナ・モーリーン・スタークイギリス・ＡＢ39・２ＵＪ・ストーンヘイヴン・バラス・ザ・オールド・スクール（番地なし) Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA02 CA07 CA20 DA02 DA06 EA03 FA02 FA18 GA11 HA11 4B063 QA05 QQ21 QQ41 QQ61 QQ79 QQ89 QR77 QS32 QS36 QX02 QX10 4B064 AG01 AG27 CA01 CA02 CA19 CA20 CC01 CC24 DA01 DA13 4B065 AA26X AA58X AA72X AA87X AA90X AA93Y AB01 AC14 AC20 BA02 BA24 BA30 CA43 CA44 CA46 4C084 BA18 CA59 MA24 MA52 MA66 NA14 ZA361 ZA451 ZA811 ZA891 ZA961 ZB151 ZB261 ZC351 4C085 AA13 AA14 BB11 CC05 DD22 DD23 EE01 EE06 FF24 GG01 GG08 4C097 AA15 BB01 CC03 DD09 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA76 EA20 EA50 FA20 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の群： CRAHSFGSPRPLPVV （配列番号１） SRAHSFGSPRPLPVV （配列番号２） CRAHSFVSPRPLPVV （配列番号３）、及び QPDPHLMMWKLPGFP （配列番号４）またはフィブリン断片E活性を調節可能であるこれらの断片から選択されるペプ
チド。
【請求項２】請求項１記載のペプチドまたは断片の変異体であり、上記ペ
プチドまたは断片に対して１，２，３または４のアミノ酸置換、挿入または欠失
を有し、フィブリン断片E活性を調節可能である変異体ペプチド。
【請求項３】上記活性が、細胞増殖または新脈管形成の刺激である、請求
項１または２記載のペプチドまたは断片。
【請求項４】請求項１から３のいずれか一項記載のペプチドのアミノ酸配
列を有する第一の部分と、第一の部分に天然では連続していないアミノ酸配列を
含む、第一の部分のNまたはC末端に結合した第二の部分とを含み、前記第二の部
分が膜トランスロケーション配列を含む融合ペプチド。
【請求項５】請求項１から４のいずれか一項記載のペプチドをコードする
単離された核酸。
【請求項６】請求項１から４のいずれか一項記載のペプチドに選択的に結
合可能な抗体またはその断片。
【請求項７】モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または抗血清で
ある、請求項６記載の抗体。
【請求項８】請求項６記載の抗体または結合断片を提供する工程；推定のモジュレーター化合物と上記抗体または結合断片を接触させる工程；並び
に上記抗体または結合断片が、上記化合物に選択的に結合できるか測定する工程；
を含む、フィブリン断片E活性を調節可能な、ペプチドまたはその類似体である
化合物を同定する方法。
【請求項９】上記化合物が、発現ライブラリーまたは化学的ライブラリー
の形態で提供される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】さらに、フィブリン断片E誘導性細胞増殖及び／または新
脈管形成を調節する、上記モジュレーターの能力を試験する工程を含む、請求項
８または９記載の方法。
【請求項１１】請求項８から１０のいずれか一項記載の方法に従って、上
記モジュレーターを同定する工程を含む、モジュレーターを生産する方法。
【請求項１２】請求項８から１０のいずれか一項記載の方法によって同定
された、フィブリン断片E活性のモジュレーター。
【請求項１３】フィブリン断片Eレセプターの活性部位を同定する方法に
おける、請求項６記載の抗体または結合断片の使用。
【請求項１４】製薬学的に許容可能なキャリアーまたは希釈液と合わせて
、請求項１から４のいずれか一項記載のペプチドまたはその断片、あるいは請求
項１２記載のモジュレーターを含む組成物。
【請求項１５】請求項１から４のいずれか一項記載のペプチドまたはその
断片、請求項１２記載のモジュレーター、あるいは請求項１４記載の組成物を含
む冠状動脈ステント。
【請求項１６】請求項１から４のいずれか一項記載のペプチド、請求項１
２記載のモジュレーター、あるいは請求項１４記載の組成物と、細胞を接触させ
ることを含む、フィブリン分解産物によって誘導される細胞増殖の刺激を阻害す
る方法。
【請求項１７】上記活性が、細胞増殖または新脈管形成の刺激である、請
求項８記載の方法。
【請求項１８】ヒトまたは動物の身体の治療の方法における使用のための
、請求項１から４のいずれか一項記載のペプチド、請求項１２記載のモジュレー
ター、あるいは請求項１４記載の組成物。
【請求項１９】細胞増殖の阻害のための医薬の調製における、請求項１か
ら４のいずれか一項記載のペプチド、請求項１２記載のモジュレーター、あるい
は請求項１４記載の組成物の使用。
【請求項２０】プロモーターに機能的に結合した、請求項５記載の単離さ
れた核酸を含む発現ベクター。
【請求項２１】請求項１９記載のベクターを有する宿主細胞。
【請求項２２】請求項１から４のいずれか一項記載のペプチドをコードす
る約１５から５０の間のヌクレオチドの配列より必須になる核酸プライマー。