JP2003500169A - 滅菌方法 - Google Patents

滅菌方法

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JP2003500169A JP2000620963A JP2000620963A JP2003500169A JP 2003500169 A JP2003500169 A JP 2003500169A JP 2000620963 A JP2000620963 A JP 2000620963A JP 2000620963 A JP2000620963 A JP 2000620963A JP 2003500169 A JP2003500169 A JP 2003500169A
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スラチャイ スパッタポン
マイケル アール． スコット
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Abstract

(57)【要約】 物体を滅菌する方法、ならびに該方法から得られた滅菌された物体が開示される。該方法は、高次構造が変化したタンパク質（例えば、プリオン）を非感染性にする条件下で、再利用しようとする物体（例えば、医療機器）をポリカチオンデンドリマーと接触させることを含む。該デンドリマーを含む消毒薬またはサージカルスクラブ組成物、およびポリカチオンデンドリマーで処理されたゼラチンカプセルもまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 政府助成 本研究は、その一部が、米国立衛生研究所からの助成金NS14069、AG08967、AG
02132、AG10770、およびK08 NS02048-02により助成されている。政府は、本研究
において一定の権利を有し得る。
【０００２】 発明の分野 本発明は、一般に、物質を滅菌する方法、特に、感染性プリオンを不活化する
方法に関する。
【０００３】 発明の背景 物質を滅菌する多数の方法が知られている。多くの方法が、病原体を殺傷また
は不活化する温度まで物質を加熱することを必要とする。他の方法は、病原体を
殺傷または不活化する化合物に物質を曝露することを必要とする。この病原体は
化合物により接触される。さらに他の方法は、物質中の病原体を不活化、破壊、
または殺傷するのに十分な時間、十分な量の特定の種類の放射線を物質に照射す
ることを必要とする。これらの方法は、一般に、物質中または物質上に存在する
細菌を殺傷することと、ウイルスを不活化することに指向されている。滅菌法は
、細菌の殺傷またはウイルスの不活化にかなり有効であり得るが、一般に、多く
の致死性疾患の原因である可能性がある病原性タンパク質（例えば、プリオン）
を不活化しない。
【０００４】 高次構造が変化したタンパク質に関連する疾患はかなり多く存在する。例えば
、アルツハイマー病は、APP、Aβペプチド、α1-アンチキモトリプシン、tau、
および非Aβ成分に関連している。これらの疾患の多くは神経疾患である。しか
しながら、II型糖尿病がアミリンに関連し、多発性骨髄腫プラズマ細胞疾患がIg
GL鎖に関連している。疾患発症と正常タンパク質から高次構造が変化したタンパ
ク質への移行との関係は、いくつかの例で、例えば、プリオン病とPrPSCとの関
係により非常に綿密に調べられている。
【０００５】 プリオン病は、遺伝性、散発性、および感染性の形態で起こり得る一群の致死
性神経変性疾患である（Prusiner、S．B．Scrapie prions、Annu．Rev．Microbi
ol．、43、345-374（1989））。これらの疾患は、ヒトおよび様々な他の動物で
起こる（Prusiner、S．B．Prions、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 95、13363-133
83（1998））。プリオンは感染性タンパク質である。PrPCと表すプリオンタンパ
ク質（PrP）の正常細胞形態には3つのαヘリックスが含まれ、βシートはほとん
どない。対照的に、PrPSCと表すプリオンタンパク質にはβシート構造がたくさ
んある。中枢神経系（CNS）にPrPSCが蓄積することにより、ニューロン空胞形成
および星状神経膠細胞グリオーシスを伴って神経機能障害が進行する。
【０００６】 ヒトプリオン病として、クールー（Gajdusek、D．C．、Gibbs、C．J．、Jr．
およびAlpers、M．Experimental Transmission of a kuru-like syndrome to ch
impanzees．Nature 209、794-796（1966））、クロイツフェルト・ヤコブ病（CJ
D）（Gibbs、C．J．、Jr．ら、Creutzfeldt-Jakob disease（spongiform enceph
alopathy）：transmission to the chimpanzee．Science 161、388-389（1968）
）、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病（GSS）および致死性家族
性不眠症（FFI）（Goldfarb、L．G．ら、Fatal familial insomnia and familia
l Creutzfeldt-Jakob disease：disease phenotype determined by a DNA polym
orphism．Science 258、806-808（1992）；Medori、R．ら、Fatal familial ins
omnia：a second kindred with mutation of prion protein gene at codon 178
．Neurology 42、669-670（1992））、ならびにイギリスおよびフランスで発生
した新しい形態のヒトプリオン病である新変異型CJD（nvCJD）（Will、R．G．ら
、A new variant of Creutzfeldt-Jakob disease in the UK．Lancet 347、921-
925（1996）；Cousens、S．N．、Vynnycky、E．、Zeidler、M．、Will、R．G．
およびSmith、P．G．Predicting the CJD epidemic in humans．Nature 385、19
7-198（1997）；Will、R．G．ら、Deaths from variant Creutzfeldt-Jakob dis
ease．Lancet 353、979（1999））が挙げられる。いくつかの方面の証拠により
、nvCJDの大発生とウシ海綿状脳症（BSE）の先行する流行との間に関連があるこ
とが示唆された（Will、R．G．ら、A new variant of Creutzfeldt-Jakob disea
se in the UK．Lancet 347、921-925（1996）；Bruce、M．E．ら、Transmission
to mice indicate that ‘new variant'CJD is caused by the BSE agent．Nat
ure 389、498-501（1997）；Hill、A．F．ら、The same prion strain causes v
CJD and BSE．Nature 389、448-450（1997）；Lasmezas、C．I．ら、BSE transm
ission to macaques．Nature 381、743-744（1996））。あまりにも初期の段階
なので、イギリスおよび他の場所で最終的に発生する可能性のあるnvCJD症例数
を予想することはできないが（Cousens、S．N．、Vynnycky、E．、Zeidler、M．
、Will、R．G．およびSmith、P．G．Predicting the CJD epidemic in humans．
Nature 385、197-198（1997））、プリオン病に有効な治療剤が緊急に必要とさ
れることは明らかである。残念なことに、アンホテリシン、硫酸化ポリアニオン
、コンゴレッド色素、およびアンスラサイクリン抗生物質を含む多数の化合物が
見込みのある治療薬として報告されているが（Ingrosso、L．、Ladogana、A．お
よびPocchiari、M．Congo red prolongs the incubation period in scrapie-in
fected hamsters．J．Virol．69、506-508（1995）；Tagliavini、F．ら、Effec
tiveness of anthracycline against experimental prion disease in Syrian h
amsters．Science 276、1119-1122（1997）；Masullo、C．、Macchi、G．、Xi、
Y．G．、およびPocchiari、M．Failure to ameliorate Creutzfeldt-Jakob dise
ase with amphotericin B therapy．J．Infect．Dis．165、784-785（1992）；L
adogana、A．ら、Sulphate polyanions prolong the incubation period of scr
apie-infected hamsters．J．Gen．Virol．73、661-665（1992））、これらの全
てがプリオン増殖を妨げる能力を少ししか示さず、どれも既存のプリオン形態を
感染宿主から除去しなかった。
【０００７】 哺乳動物のPrP遺伝子は、可溶性の非疾患形態であるPrPCであり、不溶性の疾
患形態であるPrPSCに変換することができるタンパク質を発現する。PrPCは1コピ
ーの宿主遺伝子によりコードされ（Basler、Oeschら（1986）Cell 46：417-428
）、PrPCが発現されると、一般にニューロン外面に見出される。多くの方面の証
拠が、プリオン病は、正常形態のプリオンタンパク質（PrPC）から異常形態（Pr
PSC）へ変化することにより起こることを示している。これらの2つの形態のアミ
ノ酸配列には検出可能な差違がない。しかしながら、PrPSCは、PrPCと比較して
βシート含有量が多く、αへリックス含有量が少ない高次構造を有する（Pan、B
aldwinら（1993）Proc Natl Acad Sci USA 90：10962-10966；Safar、Rollerら
（1993）J Biol Chem 268：20276-20284）。感染したヒトおよび動物の脳に異常
なPrPSC形態が存在することは、プリオン病の唯一の疾患特異的診断マーカーで
ある。
【０００８】 PrPSCは、プリオン病（海綿状脳症）の伝染および発生に重要な役割を果たし
、ニューロン変性における重要な要因である（Prusiner（1997）「神経系疾患の
分子遺伝学の基礎（The Molecular and Genetic Basis of Neurological Diseas
e）」、第2版：103-143）。動物の最もありふれたプリオン病は、ヒツジおよび
ヤギのスクレイピー、ならびにウシのウシ海綿状脳症（BSE）である（Wilesmith
およびWells（1991）Curr Top Microbiol Immunol 172：21-38）。4種類のヒト
プリオン病（1）クールー、（2）クロイツフェルト・ヤコブ病（CJD）、（3）ゲ
ルストマン・ストロイスラー・シャインカー病（GSS）、（4）致死性家族性不眠
症（FFI）が同定されている（Gajdusek（1977）Science 197：943-960：Medori
、Tritschlerら（1992）N Engl J Med 326：444-449）。最初に、遺伝性ヒトプ
リオン病の発表が難問を提起した。この難問は、その後、PrPが細胞遺伝子に由
来することにより説明されている。
【０００９】 正常可溶性タンパク質から高次構造が変化したタンパク質への組み立ておよび
誤った組み立ては、様々な他の疾患における原因プロセスであると考えられる。
構造的な高次構造の変化は、正常に可溶性であり、かつ機能的なタンパク質から
、定義された不溶性状態への変換に必要とされる。このような不溶性タンパク質
の例として、アルツハイマー病および脳アミロイド血管障害（CAA）のアミロイ
ド斑におけるAβペプチド；パーキンソン病のレーヴィ体におけるα-シヌクレイ
ン沈着物、前頭側頭型痴呆およびピック病の神経原線維変化におけるtau；筋萎
縮性側索硬化症のスーパーオキシドジスムターゼ；ハンチントン病のハンチング
チン（huntingtin）；およびクロイツフェルト・ヤコブ病（CJD）のプリオンが
挙げられる（概説については、Glennerら（1989）J．Neurol．Sci．94：1-28；H
aanら（1990）Clin．Neurol．Neurosurg．92（4）：305-310を参照のこと）。
【００１０】 多くの場合、これらの非常に不溶性のタンパク質は、枝分かれのない線維（ひ
だのあるβシート高次構造の共通する特徴を有する）からなる凝集体を形成する
。CNSでは、アミロイドが、脳血管および脳脊髄膜血管（脳血管性沈着物）なら
びに脳実質（斑）に存在することがある。ヒトおよび動物モデルでの神経病理学
的研究により、アミロイド沈着物に隣接する細胞はその正常機能が破壊されてい
ることが分かった（Mandybur（1989）Acta Neuropathol．78：329-331；Kawaiら
（1993）Brain Res．623：142-6；Martinら（1994）Am．J．Pathol．145：1348-
1381；Kalariaら（1995）Neuroreport 6：477-80；Masliahら（1996）J．Neuros
ci．16：5795-5811）。さらに、他の研究により、アミロイド線維は神経変性を
実際に開始できることが分かった（Lendonら（1997）J．Am．Med．Assoc．277：
825-31；Yankner（1996）Nat．Med．2：850-2；Selkoe（1996）J．Biol．Chem．
271：18295-8；Hardy（1997）Trends Neurosci 20：154-9）。
【００１１】 ADとCAAの主要なアミロイド成分は、アミロイドβタンパク質（Aβ）である。
Aβペプチド（2つの推定分泌酵素によりアミロイドβ前駆体タンパク質（APP）
から生じる）は、正常なCNSおよび血管に低レベルで存在する。2つの主要な変異
体であるAβ1-40およびAβ1-42が、APPの選択的カルボキシ末端の短縮により生
成される（Selkoeら（1988）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85：7341-7345；Selk
oe（1993）Trends Neurosci 16：403-409）。ADおよびCAAのアミロイド沈着物に
含まれる、これら2つのペプチドのうちAβ1-42はAβ1-40より線維を生成し、豊
富にある。前記のAD症例におけるアミロイド沈着物に加えて、ほとんどのAD症例
が血管壁におけるアミロイド沈着とも関連している（Hardy（1997）、前記；Haa
nら（1990）、前記；Terryら、前記；Vinters（1987）、前記；Itohら（1993）
、前記；Yamadaら（1993）、前記；Greenbergら（1993）、前記；Levyら（1990
）、前記）。これらの血管病変は、AD無しで存在し得るCAAの顕著な特徴である
。
【００１２】 ヒトトランスサイレチン（TTR）は、大部分がβシート構造の4つ同じ単位から
なる正常な血漿タンパク質であり、ホルモンチロキシンのトランスポーターとし
て働く。アミロイド線維へのTTRの異常な自己集合は、2つの形態のヒト疾患（す
なわち、老人性全身性アミロイドーシス（SSA）および家族性アミロイド多発神
経障害（FAP））を引き起こす（Kelly（1996）Curr Opin Strut Biol 6（1）：1
1-7）。FAPにおけるアミロイド形成の原因はTTR遺伝子の点変異である。SSAの原
因は未知である。この臨床診断は、インサイチューで生検材料におけるアミロイ
ド沈着物を検出することにより組織学的に確立されている。
【００１３】 現在まで、インビボでのTTRからアミロイドへの変換機構はほとんど知られて
いない。しかしながら、いくつかの研究室が、正常なヒトTTRを部分的に変性す
ることによりアミロイド変換をインビトロで刺激できることを証明している（Mc
Cutchen、Colonら（1993）Biochemistry 32（45）：12119-27；McCutchenおよび
Kelly（1993）Biochem Biophys Res Commun 197（2）415-21）。この高次構造変
化の機構は、直線状のβシート構造のアミロイド線維に重合する単量体高次構造
中間体を必要とする（Lai、Colonら（1996）Biochemistry 35（20）：6470-82）
。このプロセスは、チロキシンまたはトリヨードフェノールなどの安定化分子と
結合させることにより弱めることができる（Miroy、Laiら（1996）Proc Natl Ac
ad Sci USA 93（26）：15051-6）。
【００１４】 老人斑が形成される正確な機構と、斑形成と疾患に関連する神経変性プロセス
の関係は十分に分かっていない。アルツハイマー病患者およびプリオン病患者の
脳におけるアミロイド線維は、ある細胞の炎症を活性化することが知られている
。例えば、初代小神経膠細胞培養物およびTHP-1単球細胞株は、線維性β-アミロ
イドおよびプリオンペプチドにより刺激されて、同じチロシンキナーゼに依存す
る炎症シグナル伝達カスケードを活性化する。β-アミロイドおよびプリオン線
維により誘発されるシグナル応答は、神経変性の部分的な原因である神経毒性産
物の産生を引き起こす。C．K．コンブズ（Combs）ら、J Neurosci 19：928-39（
1999）。
【００１５】 高次構造が変化したタンパク質に関連する研究の取り組みが進んでいるが、こ
のようなタンパク質の感染を避けるために物質を滅菌する取り組みは遅れをとっ
ている。本発明は、高次構造が変化したタンパク質（例えば、プリオン）を含む
物質を滅菌する手段を提供する。
【００１６】 発明の要約 通常の滅菌手順と、高次構造が変化したタンパク質（例えば、プリオン）を非
感染性にすることができるポリカチオンデンドリマーの使用とを組み合わせるこ
とにより、任意の種類の物体を滅菌することができる方法が開示される。該方法
は、特に、血液または脳組織と接触して使用され、血液または脳組織と接触され
る医療機器（例えば、外科用器具およびカテーテル）を滅菌するのに有用である
。該方法により滅菌される物体はまた本発明の一部であり、プリオンに感染した
可能性のある（すなわち、「狂牛病」と知られるBSEと診断されていない）ウシ
から抽出されたゼラチンから作られるカプセルを含む。水溶液またはアルコール
溶液中で該ポリカチオンデンドリマーを従来の抗菌剤および抗ウイルス剤と混合
して、消毒薬またはサージカルスクラブを作製することができる。本発明で使用
するための分枝ポリカチオンとして、ポリプロピレンイミン、ポリエチレンイミ
ン（PEI）ポリ（4'-アザ-4'-メチルヘプタメチレン-D-グルカルアミド（glucara
mide））、ポリアミドアミン、ならびにこれらの化合物の適切な断片および／ま
たは変異体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】 本発明の一局面は、物体を、疾患に関連するタンパク質を非感染性にする能力
により特徴付けられる組成物で処理する方法である。
【００１８】 本発明の利点は、長期間にわたって熱に曝露すること（例えば、100℃〜200℃
で1〜10時間）などの極端な条件を必要とすることなく、プリオンなどのタンパ
ク質を非感染性にすることができることである。
【００１９】 本発明の特徴は、該組成物が、非常に低濃度（例えば、1％〜0.001％）のポリ
カチオンデンドリマーを含みながら有用であり得ることである。
【００２０】 本発明の別の局面は、ウシゼラチンで作られたカプセルにプリオンがないと証
明できることである。
【００２１】 本発明の別の局面は、ポリカチオンデンドリマーで処理された細胞培養物から
生成された薬物にプリオンがないと証明できることである。
【００２２】 本発明のさらに別の局面は、血液または脳組織に曝露した後に再利用する医療
機器にプリオンがないと証明できることである。
【００２３】 本発明のさらに別の局面は、標準的な温度および圧力でポリカチオンデンドリ
マーと接触させることにより、病院、手術室、およびそれらの中にある装置およ
び機器にプリオンがないと証明できることである。動物における不溶性タンパク
質沈着物形成を治療するための薬学的組成物は、治療有効量の分枝ポリカチオン
と、薬学的に許容される賦形剤を含む。一態様では、該分枝ポリカチオンは分枝
ポリマーであり、少なくとも1つの分枝が正に荷電しており、該分枝ポリマーは
複数の荷電した分枝を有してもよい。該分枝は同じ化学構造を有してもよいし、
一分子内で構造が異なってもよい。このような薬学的組成物に使用することがで
きるポリマーの例として、ポリプロピレンイミン、ポリエチレンイミン（PEI）
、ポリ（4'-アザ-4'-メチルヘプタメチレン-D-グルカルアミド）、ポリアミドア
ミン、ならびにこれらの薬学的に有効な変異体または断片が挙げられる。薬学的
組成物の一態様では、該組成物はまた、鎮痛剤、抗菌剤、抗炎症剤、抗発ガン剤
、抗ウイルス剤などの第2の治療剤を含む。
【００２４】 本発明はまた、細胞に由来するタンパク質の疾患関連高次構造が消滅する速度
を速めるのに十分な時間、細胞を分枝ポリカチオンと接触させることにより、細
胞に由来するタンパク質の疾患関連高次構造の消滅を促す方法を提供する。この
分枝ポリカチオンは、インビボまたはエクスビボで、ヒト、ウシ、ヒツジ、シカ
、イヌ、ネコ、ヤギ、ニワトリ、およびシチメンチョウを含む被検体に投与する
ことができる。このような疾患関連タンパク質の例として、PrPSC、APP、Aβペ
プチド、α1-アンチキモトリプシンが挙げられる。従って、該方法は、ウシ海綿
状脳症、クロイツフェルト・ヤコブ病、致死性家族性不眠症、ゲルストマン・ス
トロイスラー・シャインカー病（GSS）、クールー、スクレイピー、アルツハイ
マー病、前頭側頭型痴呆、ハンチントン病、ALS、ピック病、パーキンソン病、I
I型糖尿病、多発性骨髄腫、家族性アミロイド多発神経障害、甲状腺髄様ガン、
慢性腎不全、鬱血性心不全、老人性心臓・全身性アミロイドーシス、慢性炎症、
アテローム性動脈硬化症、および家族性アミロイドーシスに罹患した被検体に有
用である。該分枝ポリカチオンは、被検体に無毒な量（例えば、0.001mg〜1mg／
kg体重／日の投与量）で被検体に投与することができる。該ポリカチオンは単回
用量の形で投与してもよいし、被検体に繰り返し投与してもよい。該分枝ポリカ
チオンはまた、これらのタンパク質の疾患高次構造の形成を妨げるために予防的
に投与してもよい。
【００２５】 本発明はまた、高次構造が変化したタンパク質の消滅を促す治療有効量の分枝
カチオンを含む、動物における不溶性タンパク質沈着物の形成を妨げるための食
品組成物を提供する。該食品は、肉（例えば、牛肉またはラム）などの固形食品
、食用酢および油などの流動食品、ならびにステーキソースおよびケチャップな
どの調味料を含む任意の食品でよい。該分枝ポリカチオンは、高次構造が変化し
たタンパク質を消滅させるのに十分な時間、摂取前に食品に接触させることがで
きる。
【００２６】 本発明はまた、動物に分枝ポリカチオンを含む動物飼料を与えることにより、
家畜が、高次構造が変化したタンパク質に関連する疾患にかからないようにする
方法を提供する。分枝ポリカチオンを含む飼料を人工的に製造して、動物に直接
与えてもよく、分枝ポリカチオンを天然の食物供給源に添加してもよい（例えば
、動物飼料は草であり、分枝ポリカチオンは草に噴霧されるか、植物肥料により
草に添加されてもよい）。本発明の本態様の一局面は、動物に分枝ポリカチオン
を含む食物を与えることにより、汚染食品の摂取により引き起こされる疾患を予
防する方法である。
【００２７】 本発明はまた、高次構造が変化したタンパク質を破壊するのに十分な時間、pH
5またはそれ未満で、高次構造が変化したタンパク質の消滅を促す化合物と肉を
接触させることにより、肉食品に由来するタンパク質の疾患関連高次構造の消滅
を促す方法を提供する。
【００２８】 本発明の利点は、ポリカチオンデンドリマー（pH5またはそれ未満に保たれる
ことが好ましい）を加えることしか必要としない方法により、高次構造が変化し
たタンパク質（例えば、プリオン）を非感染性にすることができることである。
【００２９】 本発明の別の局面は、ポリカチオンデンドリマーを含む、石鹸、サージカルス
クラブ、洗浄剤などである。
【００３０】 本発明の利点は、ポリカチオンデンドリマーを含む組成物を使用して、外科用
器具、ナイフ、および／または食肉解体処理作業員が使用する他の道具もしくは
装置特に、プリオンに感染した可能性のあるウシまたは他の動物の解体に使用す
るものに存在する可能性のあるプリオンを不活化できることである。
【００３１】 本発明の特徴は、ポリカチオンデンドリマーが非常に低い濃度（例えば、1％
〜0.001％またはそれ未満）で存在する場合、本発明の組成物がプリオンの活性
化に有効であり得ることである。
【００３２】 本発明のこれらのおよび他の局面、利点、および特徴は、以下でさらに十分に
説明される化合物およびアッセイ法の詳細を読めば、当業者に明らかになるであ
ろう。
【００３３】 好ましい態様の詳細な説明 本発明の方法、目的、および組成物を説明する前に、本発明は、説明する特定
の段階、装置、または成分に制限されず、従って、もちろん変更があってもよい
ことを理解しなければならない。本明細書で使用する用語は特定の態様を説明す
るためだけに使用され、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ制限
されるので、制限することが意図されないことも理解しなければならない。
【００３４】 特に定めのない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、
本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されているものと同じ意味を
有する。本明細書に記載の方法および材料に類似する、または等価な任意の方法
および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法
および材料を以下で説明する。本明細書で述べた全ての刊行物は、刊行物が引用
されている方法および／または材料を開示および説明するために参照として本明
細書に組み入れられる。
【００３５】 本明細書で述べた刊行物は、本願の出願日前の開示のために単に提供される。
本明細書から、先行発明によって本発明がこのような刊行物に先行する権利がな
いことが許されると解釈すべきではない。さらに、提供された刊行物の日付は実
際の発行日とは異なることがあり、実際の発行日を別途に確認する必要があり得
る。
【００３６】 定義 「洗浄剤」という用語は、水の表面張力を低下させる任意の物質を意味するた
めに用いられる。洗浄剤は、油-水の界面で集まり、乳化作用を発揮し、それに
より、固体の除去を助ける界面活性剤（例えば、一般的な脂肪酸ナトリウム石鹸
）でもよい。洗浄剤は、化学作用の形態によってアニオン洗浄剤、カチオン洗浄
剤、またはモニオン（monionic）洗浄剤でもよい。洗浄剤として、しばしば「ビ
ルダー」により助けられる直鎖アルキルスルホネート（LAS）が挙げられる。LAS
は、好ましくは微生物により容易に分解される（生分解性）アルキルベンゼンス
ルホネートABSである。LASは、一般に、10〜30個の炭素原子を含む直鎖アルキル
である。洗浄剤は液体でも固体の形態でもよい。
【００３７】 「高次構造が変化したタンパク質」という用語は、疾患に関連した3次元高次
構造を有する任意のタンパク質を述べるために本明細書で用いられる。高次構造
が変化したタンパク質は疾患を引き起こす可能性があり、疾患の症状の要因でも
あり、他の要因の結果として現れてもよい。高次構造が変化したタンパク質は、
同じアミノ酸配列を有するが別の高次構造をとって現れる可能性がある。一般に
、疾患に関連しない他の「緩やかな」高次構造と比較して、形成された高次構造
が変化したタンパク質は高次構造が「圧縮」されている。以下は、疾患と関連タ
ンパク質の限定しない表である。これらの関連タンパク質は2つまたはそれ以上
の異なる高次構造を組み立て、少なくとも1つの高次構造が、高次構造が変化し
たタンパク質の一例である。
【００３８】 「酸」という用語は、（a）酸味；（b）リトマス色素を赤色にする；（c）あ
る特定の金属と反応して塩を形成する；（d）ある特定の塩基またはアルカリと
反応して塩を形成する、のうち1つまたは複数の特徴を有する任意の化合物また
は化合物群を述べるために用いられる。酸は水素を含み、水中ではイオン化して
H3O＋イオン（H＋とも書かれ、ヒドロニウムイオンまたは単に水素イオンと呼ば
れる）が形成される。酢酸または炭酸などの弱酸を使用してもよいし、塩酸、硝
酸、および硫酸などの強酸を使用してもよい。本発明の組成物では、酸は、5.5
またはそれ未満、より好ましくは4またはそれ未満、さらにより好ましくは3.5±
1のpHを得るような濃度で存在することが好ましい。
【００３９】 「滅菌する」、「滅菌状態にする」という用語などは、何かを非感染性にする
か、または何かを疾患を引き起こすことができないようにすることを意味するた
めに本明細書で用いられる。詳細に述べると、この用語は、タンパク質を非感染
性にするか、または疾患もしくは疾患の症状を引き起こすことができないように
することを意味する。さらに詳細に述べると、この用語は、高次構造が変化した
タンパク質（例えば、プリオンとして知られるPrPSc）を、疾患または疾患の症
状を引き起こすことができないようにすることを意味する。
【００４０】 「有効な用量」または「有効な量」は、所望の滅菌結果を得るのに十分な化合
物の量を意味する。これは、滅菌される物体または物質の種類および存在する可
能性のある感染性タンパク質の量または濃度などの要因によって変化する。本発
明のポリカチオン、またはより詳細には本発明のポリカチオンデンドリマー化合
物は、滅菌される物質1mlまたは1mgあたりデンドリマー1〜500μgの範囲の量で
物質と混合することができる。ある期間にわたって処理された物質が感染しない
ように、結果として生じる組成物が、高次構造が変化したタンパク質の感染性を
低下させるのに有効である場合、この濃度は十分である。滅菌するために必要と
される有効な用量または濃度の範囲はかなり変化する場合がある。なぜなら、（
1）物質の中には、変化したタンパク質の濃度が他より高いものもあるから、（2
）物質の中には、他より頻繁に感染するものもあるから、（3）タンパク質ごと
に感染性の程度が異なるからである。かなりの量の物質を処理するために必要と
される用量は、処理が行われるpHと、化合物が望ましい低いpH（例えば、5.0ま
たはそれ未満）レベルで物質と接触して維持される時間の合計に基づいて、いく
らか変化してもよいことも指摘される。
【００４１】 本明細書で使用する「LD50」という用語は、処置された全実験動物の50％を死
に至らしめる作用物質の用量である。これは通常、経口投与、非経口投与などの
侵襲的投与を意味するが、作用物質の局所塗布などの侵襲的でない投与法を用い
て毒性を与えてもよい。
【００４２】 「アミン末端」という用語は、第1級アミン、第2級アミン、および第3級アミ
ンを含む。
【００４３】 「PrPタンパク質」、「PrP」などの用語は本明細書で同義に用いられ、ヒトお
よび動物において疾患（海綿状脳症）を引き起こすことが知られる感染性粒子形
態PrPScと、適切な条件下で感染性PrPSc形態に変換される非感染性形態PrPCの両
方を意味するものとする。
【００４４】 「プリオン」、「プリオンタンパク質」、「PrPScタンパク質」などの用語は
、PrPタンパク質の感染性PrPSc形態を意味するために本明細書で同義に用いられ
、「タンパク質（protein）」と「感染（infection）」という言葉の短縮形であ
る。粒子は、限定しないが主として、PrP遺伝子によりコードされるPrPSc分子か
らなる。プリオンは、細菌、ウイルス、およびウイロイドとは異なる。既知のプ
リオンは動物に感染して、ヒツジおよびヤギ神経系の伝染性変性疾患であるスク
レイピー、ならびにウシ海綿状脳症（BSE）（または「狂牛病」）、およびネコ
のネコ海綿状脳症を引き起こす。ヒトに罹患することが知られている4つのプリ
オン病は、（1）クールー、（2）クロイツフェルト・ヤコブ病（CJD）、（3）ゲ
ルストマン・ストロイスラー・シャインカー病（GSS）、および（4）致死性家族
性不眠症（FFI）である。本明細書で使用する「プリオン」は、使用される任意
の動物、特にヒトおよび家畜において、これらの疾患または他の疾患の全てまた
はいずれかを引き起こす全形態のプリオンを含む。
【００４５】 「PrP遺伝子」という用語は、既知の多型および病原性変異を含むタンパク質
を発現する遺伝物質を述べるために本明細書で用いられる。「PrP遺伝子」とい
う用語は、一般に、任意の形態のプリオンタンパク質をコードする任意の種の任
意の遺伝子を意味する。一般に知られているいくつかのPrP配列は、このような
配列を開示および説明するために参照として本明細書に組み入れられる、ガブリ
エル（Gabriel）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89：9097-9101（1992）およ
び米国特許第5,565,186号に記載されている。PrP遺伝子は、本明細書で述べられ
る「宿主」および「試験」動物、ならびにその任意および全ての多型および変異
を含む任意の動物に由来してよく、この用語は、まだ発見されていない他のPrP
遺伝子を含むことが理解される。このような遺伝子により発現されるタンパク質
は、PrPC（非疾患）形態またはPrPSc（疾患）形態のいずれかをとることができ
る。
【００４６】 「標準化プリオン調製物」、「プリオン調製物」、「調製物」などの用語は、
プリオン病の徴候を示す哺乳動物の脳組織から得られた組成物（例えば、脳ホモ
ジネート）を述べるために本明細書で同義に用いられる。この哺乳動物は、（1
）本明細書に記載の外来遺伝子を含んでもよく、（2）切断された内因性プリオ
ンタンパク質遺伝子を有してもよく、（3）遺伝的に異なる種に由来する多数の
プリオンタンパク質遺伝子を有してもよく、および／または（4）切断された内
因性プリオンタンパク質遺伝子と、遺伝的に異なる種に由来するプリオンタンパ
ク質遺伝子とのハイブリッドでもよい。1〜4の様々な組み合わせ（例えば、1と2
）が可能である。標準化プリオン調製物が得られる哺乳動物は、プリオン接種の
結果として、および／または遺伝的に変化した構造（例えば、高コピー数のプリ
オンタンパク質遺伝子）の疾患を発症したために、CNS機能障害の臨床徴候を示
す。標準化プリオン調製物および標準化プリオン調製物を作製する方法は、1999
年6月1日に発行された米国特許第5,908,969号および1998年11月25日に出願され
た米国特許出願第09／199,523号に説明および開示されている。これらの両方と
も、標準化プリオン調製物を開示および説明するために、その全体が参照として
本明細書に組み入れられる。
【００４７】 本明細書で使用する「アルツハイマー病」（本明細書では「AD」と略す）とい
う用語は、主として海馬および大脳皮質におけるアミロイドβタンパク質を含む
老人斑の形成と、学習および記憶の両方の障害に関連する疾患を意味する。本明
細書で使用する「AD」は、ADならびにAD型病理の両方を含むことが意図される。
【００４８】 本明細書で使用する「AD型病理」という用語は、CNS変化（海馬および大脳皮
質におけるアミロイドβタンパク質を含む老人斑の形成を含むが、これに限定さ
れない）の組み合わせを意味する。このようなAD型病理として、APPの異常な発
現および／または沈着、APPの過剰発現、異常APP遺伝子産物の発現、ならびに他
のADに関連する現象に関連する障害が挙げられるが、必ずしもこれらに限定され
ない。例示的なAD型病理として、APPの過剰発現に関連するダウン症候群に関連
するAD型病理が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００４９】 本明細書で使用する「アルツハイマー病に関連する現象」という用語は、ADに
関連する構造的、分子的、または機能的現象、特に、動物モデルにおいて容易に
評価することができる現象を意味する。このような現象として、アミロイド沈着
、神経病理発症、学習および記憶の障害、ならびに他のADに関連する特徴が挙げ
られるが、これらに限定されない。
【００５０】 本明細書で使用する「脳アミロイド血管障害」（本明細書では「CAA」と略す
）という用語は、脳実質性出血により悪化することがある、脳血管内のアミロイ
ド沈着の形成に関連する疾患を意味する。CAAはまた、脳卒中のリスクの増加、
ならびに小脳出血およびクモ膜下出血を生じる危険性の増加に関連している（Vi
nters（1987）Strole 18：311-324；Haanら（1994）Dementia 5：210-213；Itoh
ら（1993）J．Neurol．Sci．116：135-414）。CAAはまた、出血発症前の痴呆に
関連していることがある。CAAに関連する血管アミロイド沈着物はAD無しで存在
することがあるが、ADと関連している場合が多い。
【００５１】 本明細書で使用する「脳アミロイド血管障害に関連する現象」という用語は、
CAAに関連する分子的、構造的、または機能的現象、特に、動物モデルにおいて
容易に評価することができる現象を意味する。このような現象として、アミロイ
ド沈着、脳実質性出血、および他のCAAに関連する特徴が挙げられるが、これら
に限定されない。
【００５２】 本明細書で使用する「β-アミロイド沈着物」という用語は、Aβならびに他の
物質からなる脳中の沈着物を意味する。
【００５３】 本明細書で使用する略語として以下が挙げられる。 CNS：中枢神経系 BSE：ウシ海綿状脳症 CJD：クロイツフェルト・ヤコブ病 FFI：致死性家族性不眠症 GSS：ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病 AD：アルツハイマー病 CAA：脳アミロイド血管障害 Hu：ヒト HuPrP：ヒトプリオンタンパク質 Mo：マウス MoPrP：マウスプリオンタンパク質 SHa：シリアンハムスター SHaPrP：シリアンハムスタープリオンタンパク質 PAMAM：ポリアミドアミドデンドリマー PEI：ポリエチレンイミン PPI：ポリプロピレンイミン PrPSc：プリオンタンパク質のスクレイピーアイソフォーム PrPC：細胞に含まれる通常のプリオンタンパク質正常アイソフォーム PrP27-30またはPrPSc27-30：PrPScの処理またはプロテアーゼに耐性の形態 MoPrPSc：マウスプリオンタンパク質のスクレイピーアイソフォーム N2a：本研究で用いられた樹立神経芽細胞腫細胞株 ScN2a：長期にわたってスクレイピーに感染させた神経芽細胞腫細胞株 ALS：筋萎縮性側索硬化症 HD：ハンチントン病 FTD：前頭側頭型痴呆 SOD：スーパーオキシドジスムターゼ
【００５４】 本発明の一般的な局面 本発明は、高次構造が変化したタンパク質を非感染性にするのに有効であるこ
とが見出された化合物からなる組成物を含む。該組成物は、好ましくは、分枝ポ
リカチオンが溶解している無毒の弱酸（例えば、酢酸）からなる低pH溶液である
。本発明の好ましい組成物は、分枝ポリカチオン、抗菌化合物、抗真菌化合物、
および抗ウイルス化合物からなる水溶液またはアルコール溶液の形態である。該
組成物は、滅菌しようとする物質にコーティングされるか、滅菌しようとする物
質と混合されるか、滅菌しようとする物質に注入されるか、または滅菌しようと
する物質に接触される。該組成物は、滅菌される物質1mlまたは1mgあたりポリカ
チオン1μgまたはそれ以上の量で、分枝ポリカチオンが低pH（例えば5またはそ
れ未満、好ましくは3.5±1）で維持されるように用いられる。該組成物は、物質
上または物質中に存在する高次構造が変化したタンパク質を破壊（例えば、加水
分解）するか、または非感染性にするのに十分な時間（例えば、1時間〜1週間）
、通常温度（例えば、15℃〜30℃）で所望のpH範囲に維持される。本発明の好ま
しい組成物は消滅および滅菌に有用であり、ポリカチオンデンドリマー、洗浄剤
、およびpHを約3.5±1にする酸からなってもよい。
【００５５】 プリオンを消滅させるデンドリマー化合物 デンドリマーは、特徴的な星状構造のために「スターバースト」または「スタ
ー」ポリマーとしても知られる分枝化合物である（図1を参照のこと）。本発明
のデンドリマーは、ABn単量体（n≧2、好ましくはn＝2または3）から作られた構
造を有するポリマーである。このようなデンドリマーは非常に枝分かれしており
、3つの異なる構造的特徴：（1）コア、（2）複数の周辺末端基（3）コアと末端
基を連結する分枝単位を有する。デンドリマーはカチオン性でもよく（全世代デ
ンドリマー（full generation dendrimer））、アニオン性でもよい（半世代デ
ンドリマー（half generation dendrimer））。一般的な合成、物理特性、およ
びデンドリマーの用途についての総説については、例えば、トマリア（Tomalia
）ら、Angew．Chem．Int．Ed．Engl．、29：138-175（1990）；Y．キム（Kim）
およびC．ジメーマン（Zimmerman）、Curr Opin Chem Biol、2：733-7421（1997
）を参照のこと。
【００５６】 好ましい態様では、本発明の滅菌組成物はカチオンデンドリマーを含み、好ま
しくは、このカチオンデンドリマーは低pH溶媒（例えば、酢酸）に溶解される。
適切なデンドリマーの例は、D．A．トマリア（Tomalia）らへの米国特許第4,507
,466号、同第4,558,120号、同第4,568,737号、同第4,587,329号、同第4,631,337
号、同第4,694,064号、同第4,713,975号、同第4,737,550号、同第4,871,779号、
および同第4,857,599号に開示されている。これらは、このような化合物を開示
および説明するために参照として本明細書に組み入れられる。デンドリマーは、
一般的に、pKa5.7の第3級アミンを有する。選択的に、デンドリマーは、第3級ア
ミンのいくつかを除去するために化学処理されてもよく、熱処理されてもよい。
他の適切なカチオンとして、ポリプロピレンイミン、ポリエチレンイミン（PEI
）（pKa5.9の第3級アミンを有する）、およびポリ（4'-アザ-4'-メチルヘプタメ
チレン-D-グルカルアミド（pKa6.0の第3級アミンを有する）が挙げられる。カチ
オンデンドリマーは、0.0001％以上、好ましくは0.01％以上、より好ましくは約
1％の濃度で低pH溶媒（例えば、食用酢）に溶解されることが好ましい。
【００５７】 好ましくは、本発明で使用するためのデンドリマーはポリアミドアミン（以下
「PAMAM」）である。PAMAMデンドリマーは、ポリアミドアミン基がタンパク質の
ペプチド結合に似ているので特に生体適合性がある。
【００５８】 デンドリマーは、世代（図1の世代0、1、および2を参照のこと）と呼ばれる層
をなして調製され、これによって、特定の分子量を有する。全世代PAMAMデンド
リマーはアミン末端基を有し、カチオン性であるが、半世代デンドリマーはカル
ボキシル末端を有する。従って、全世代PAMAMデンドリマーが本発明での使用に
好ましい。PAMAMデンドリマーは様々な分子量を有して調製されてもよく、世代0
〜10について以下の表1に記載するような特定の値を有してもよい。 （表Ａ） PAMAMデンドリマーおよびその分子量の表（エチレンジアミンコア，
アミン末端）
【００５９】 表Aに示すように、PAMAMデンドリマー（世代0〜10）の末端アミン基の数は4〜
4,096であり、分子量は517〜934,720である。PAMAMデンドリマーは、Aldrichま
たはDendritechから市販されている。ポリエチレンイミンもしくはポリプロピレ
ンイミンデンドリマー、またはアミン末端デンドリマーの4倍形態（quaternized
form）は、デンドリマーを作成する方法を説明および開示するために参照とし
て本明細書に組み入れられるトマリア（Tomalia）ら、Angew．Chem．Int．Ed．E
ngl．、29：138-175（1990）に記載のように調製することができる。
【００６０】 滅菌組成物 本明細書に示される実施例により、高分枝ポリカチオン（例えば、デンドリマ
ー化合物）は、スクレイピー感染細胞中のPrPScタンパク質沈着物の程度および
分布に影響を及ぼすことが分かる。低pH環境において、かつ比較的低い非細胞毒
性のレベルでデンドリマーが存在すると、細胞および脳ホモジネートにおける検
出可能なPrPScが著しく減少する。従って、本発明は、タンパク質の感染性の程
度を低減、阻害、または軽減するための組成物を含む。本発明の組成物は、高次
構造が変化したタンパク質を破壊することができる任意の化合物（例えば、ポリ
カチオンデンドリマー）を低pH環境において溶解した溶液、懸濁液、または混合
物である。
【００６１】 滅菌製剤 本発明の滅菌組成物は、好ましくは、製剤の0.0001％〜10％の濃度で高分枝ポ
リカチオン（例えば、ポリカチオンデンドリマー）を含む。以下の方法および賦
形剤は単なる例示であり、いかようにも限定しない。
【００６２】 製剤に化合物（例えば、高分枝ポリカチオン化合物）を含むことに加えて、化
合物を低pH環境で維持することが重要である。任意の数の既知の酸または酸の混
合物を本発明と共に用いることができる。カチオン混合物に添加することができ
る市販の生成物の限定しない例を以下に記載する。これらの製剤における各成分
のパーセント量は異なってもよい。一般に、溶媒成分（例えば、水またはアルコ
ール）は40％〜100％の量で存在し、最後に列挙した成分は0.5％〜5％の範囲で
存在する。他の成分は、1％〜60％、より一般的には5％〜20％の範囲の量で存在
する。どの場合でも、本発明のポリカチオン化合物は、約0.01％〜5％、好まし
くは0.1％〜2％、より好ましくは約1％の量で添加される。添加される量は、所
望の効果を得るために必要とされる量である。
【００６３】 本明細書に示される開示と他の情報（例えば、米国特許第5,767,054号、同第6
,007,831号、同第5,830,488号、同第5,968,539号、同第5,416,075号、同第5,296
,158号、ならびにこれらに引用される特許および刊行物に開示される情報）を用
いることにより、当業者は、無数の本発明の他の製剤を作製することができる。
さらに、このような製剤は、このような刊行物に記載のように使用することがで
き、任意の適切な容器またはディスペンサー装置（例えば、米国特許第5,992,69
8号に開示されるもの）に入れることができる。
【００６４】 細胞培養物と共に使用される本発明の製剤は、無毒であるという利点を有する
。例えば、本発明の製剤の溶液の非経口投与は、好ましくは、0.1mg／マウスの
投与量（40mg／Kgで1未満のLD50である）で無毒である。当業者に周知の種類の
様々な栄養製剤および／または注射可能な製剤を使用して、細胞培養物を処理す
るための製剤を調製することができる。
【００６５】 所望の結果を得るためにpH環境をさらに小さくすることが場合によって望まし
いことが当業者に理解されると思われる。これは、任意の望ましい酸を添加する
ことにより達成することができる。所望であれば、処理が完了した後（すなわち
、十分な量の任意の存在する高次構造が変化したタンパク質が破壊された後）、
pHを通常レベルに上げることができる。
【００６６】 高次構造が変化したタンパク質を含む組成物を滅菌するのに有効な化合物は、
細胞培養アッセイ法および器官ホモジネートアッセイ法により決定される。これ
らの各アッセイ法を以下で詳細に説明する。
【００６７】 ScN2a細胞に基づくアッセイ法 pSPOX発現プラスミド（Scott、M．R．、Kohler、R．、Foster、D．およびPrus
iner、S．B．Chimeric prion protein expression in cultured cells and tran
sgenic mice．Protein Sci．1、986-997（1992））によるScN2a細胞のトランス
フェクションを最適化する取り組みがなされた。これらの結果に関連して、Supe
rFect試薬（Qiagen（登録商標））を使用するトランスフェクションプロトコー
ルが評価された。SuperFectによるトランスフェクションの後、エピトープタグ
された（MHM2）PrPSc（Scott、M．R．、Kohler、R．、Foster、D．およびPrusin
er、S．B．Chimeric prion protein expression in cultured cells and transg
enic mice．Protein Sci．1、986-997（1992））はScN2a細胞において検出でき
ないが、DNA送達のためにカチオンリポソーム法を使用した場合、MHM2 PrPScは
効率的に形成されたことが見出された。綿密な調査により、プロテアーゼ消化前
では、SuperFectによりトランスフェクトされた試料は、トランスフェクトされ
ていない試料のバックグラウンドパターンに見られないMHM2バンドを発現したこ
とが明らかになった。3F4モノクローナル抗体はMoPrPと反応しないが、マウスSc
N2a細胞のウエスタンブロット上で強いバックグラウンド染色を示す。トランス
フェクトされていない試料と比較して、20〜30kDa領域で強い免疫染色が観察さ
れた。これらの観察により、本発明者らは、SuperFectトランスフェクション試
薬を用いてMHM2 PrPが首尾よく発現されたが、SuperFectによりMHM2 PrPCからプ
ロテアーゼ耐性MHM2 PrPScへの変換が阻害されたと結論を下した。
【００６８】 この見かけの阻害を調べるために、ウエスタンブロットを、内因性MOPrPScを
検出するRO73ポリクローナル抗血清で再プローブした。MOPrPScが存在すること
はScN2a細胞におけるプリオン感染を示している（Butler、D．A．ら、Scrapie-i
nfected murine neuroblastoma cells produce protease-resistant prion prot
eins．J．Virol．62、1558-1564（1988））。驚くべきことに、SuperFect処理さ
れたScN2a細胞は、検出可能な量のMOPrPScをもはや含んでいないことが見出され
た（これはウエスタンブロットでも確認された）。SuperFectが、長期にわたっ
て感染させたScN2a細胞における既存のPrPScのレベルを低減させた機構を調べる
ために、プラスミドDNAの非存在下で様々な濃度のSuperFectに曝露されたScN2a
細胞における内因性PrPScを測定した。これらの結果により、SuperFect（分枝ポ
リカチオン）処理により、ScN2a細胞に由来するPrPScが用量依存的に消失したこ
とが分かった。3時間の曝露で95％より多い既存のPrPScを排除するために必要と
されるSuperFectの濃度は、約150μg／mlであることが見出された。処理時間も
また、SuperFectがScN2a細胞からPrPScを除去する能力に影響を及ぼした。150μ
g／ml SuperFectの10分間の曝露はPrPScレベルに影響を及ぼさなかったが、7.5
μg／ml SuperFectは、t1／2＝8時間で全ての検出可能なPrPScを排除した。
【００６９】 SuperFectは、PAMAMデンドリマーの熱誘導分解から得られた分枝ポリアミンの
混合物である（Tang、M．X．、Redemann、C．T．およびSzoka、F．C．J．In vit
ro gene delivery by degraded polyamidoamine dendrimers．Bioconjug．Chem
．7、703-714（1996））。この構造と、他のいくつかの分枝ポリマーおよび非分
枝ポリマーがScN2a細胞からPrPScを排除する能力の知見（表1）。調べられた分
枝ポリマーとして、様々なPEI調製物、ならびに未処理PAMAMおよびPPIデンドリ
マーが挙げられる。デンドリマーは、同一分散構造（homodisperse structure）
の連続的で明確な「世代」の合成を可能にする、反復発散増殖技術（repetitive
divergent growth technique）により製造される（図1）。PAMAMおよびPPIデン
ドリマーがScN2a細胞からPrPScを排除する効力は、世代が増すごとに増加する。
PrPScの排除に関して最も強い化合物はPAMAM世代4.0およびPPI世代4.0であった
が、PAMAM世代1.0はPrPScを排除する能力をほとんど示さなかった（表1）。同様
に、PEIの高MW画分は低MW PEIより強力であった。
【００７０】 前記データから、試験された3種類全ての分枝ポリアミンについて、分子サイ
ズの増加は、PrPScを排除する力の増加と一致したことが明らかである。この傾
向が、より大きい分子上のアミノ基の表面密度の増加が直接原因となるものであ
ったかを調べるために、PAMAM-OH世代4.0を試験した。これは、表面上のアミノ
基を水酸基に取り替えた以外はPAMAM世代4.0に似ているデンドリマーである。PA
MAM世代4.0とは異なり、PAMAM-OH世代4.0は、試験された最も高い濃度（10mg／m
l）でさえもPrPScレベルを低減させなかった。このことから、アミノ基はPAMAM
によるPrPScの排除に必要とされることが証明された（表1）。
【００７１】 分枝構造が、PrPScを消滅させるポリアミンの能力に寄与することを評価する
取り組みでは、線状分子であるポリ（L）リジンおよび線状PEIもまた試験した。
これらの線状化合物は両方とも、ほぼ同じ平均分子量を有する分枝PEIの調製物
より強力ではなかった（表1）。このことから、分枝分子構造は、ポリアミンがP
rPScを排除する能力を最適化することが証明された（この分枝構造により表面ア
ミノ基の密度が高くなるためであると思われる）。
【００７２】 ポリアミンによるPrPSc排除のキネティクス 前記の結果により、数時間の処理内でScN2a細胞からPrPScを消滅させる分枝ポ
リアミンの強い能力が証明される。ScN2a細胞に対して細胞毒性があるかを、基
準として細胞増殖、形態、およびトリパンブルー染色により測定される生存率を
用いて調べることにより、プリオン病を治療するための治療剤として働くこれら
の化合物の有用性を試験した。7.5μg／mlまでの濃度で1週間曝露した後、これ
らの化合物はどれもScN2a細胞に対して細胞毒性がなかった。分枝ポリアミンが
、細胞生存率に影響を及ぼすことなくScN2a細胞のスクレイピー感染を治癒でき
るかを調べるために、プリオン消滅のキネティクスを、非細胞毒性濃度（7.5μg
／ml）の異なる3種類の分枝ポリアミンの存在下で調べた。ScN2a細胞を、様々な
時間、SuperFect、PEI、またはPAMAM世代4.0に曝露した。PrPSc排除のキネティ
クスをウエスタンブロッティングにより評価した。3種類全ての化合物が、8〜16
時間の処理後にPrPScレベルを実質的に減少させ、3種類の化合物のうちPEIは最
も速くPrPScを除去するように見えた（t1／2＝4時間）。
【００７３】 神経芽細胞腫細胞のスクレイピー感染の治癒 前記の結果は、非細胞毒性条件下でScN2a細胞におけるPrPSc蓄積を逆転できる
ことを示す。低レベルの分枝ポリアミン（1.5μg／ml）への長期間の曝露がPrPS c を排除するのに十分であることも見出された。これらの発見に基づいて、この
プロトコールを用いて、分枝ポリアミン曝露後のPrPScレベルの著しい低減が化
合物の除去後に持続するかを調べた。ScN2a細胞を1.5μg／mlのSuperFectに1週
間曝露した後、PrPScはベースラインレベルの1％未満まで低減したが、次いで、
ポリアミンの非存在下でさらに3週間培養した後、ベースラインレベルの約5％ま
で戻った。対照的に、1.5μg／mlのPEIまたはPAMAM世代4.0に1週間曝露した後、
PrPScは完全に排除されたが、ポリアミンの非存在下で3週間培養した後でも戻ら
なかった。さらに集中した1過程の1.8μg／mlのSuperFectによる9日間の処理も
また、ScN2a細胞のスクレイピー感染を完全に治癒した。これは、SuperFectを除
去した後、1ヶ月間、PrPScが存在しなかったことにより証明された。
【００７４】 ポリアミンが酸性区画内で作用する証拠 前記の結果により、培養ScN2a細胞からスクレイピープリオンを急速に消滅さ
せる強い活性が分枝ポリアミンにあることが分かった。これらの結果に基づいて
、これらの化合物が作用する機構を調べた。ScN2a細胞からPrPScを除去する化合
物の全てが、エンドソームを通過することが知られている（Boussif、O．ら、A
versatile vector for gene and oligonuleotide transfer into cells in cult
ure and in vivo：polyethyleneimine．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92、7297-
7301（1995）；Haensler、J．およびSzoka、F．C．J．Polyamidoamine cascade
polymers mediate efficient transfection of cells in culture．Bioconjug．
Chem．4、372-379（1993））。PrPCは、カベオラ様ドメイン（CLD）またはラフ
トにおいてPrPScに変換され（Gorodinsky、A．およびHarris、D．A．Glycolipid
-anchored proteins in neuroblastoma cells from detergent-resistant compl
exes without caveolin．J．Cell．Biol．129、619-627（1995）；Taraboulos、
A．ら、Cholesterol depletion and modification of COOH-terminal targeting
sequence of the prion protein inhibits formation of the scrapie isoform
．J．Cell．Biol．129、121-132（1995）；Vey、M．ら、Subcelluar colocaliza
tion of the cellular and scrapie proteins in caveolae-like membranous do
mains．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93．14945-14949（1996）；Kaneko、K．ら
、COOH-terminal sequence of the cellular prion protein directs subcellua
r trafficking and controls conversion into the scrapie isoform．Proc．Na
tl．Acad．Sci．USA 94、2333-2338（1997））、次いで、エンドサイトーシス経
路に取り込まれるので（Caughey、B．、Raymond、G．J．、Ernst、D．およびRac
e、R．E．N-terminal truncation of the scrapie-associated from of PrP by
lysosomal protease（s）；implications regarding the site of conversion o
f PrP to the protease-resistant state．J．Virol．65、6597-6603（1991）；
Borchelt、D．R．、Taraboulos、A．およびPrusiner、S．B．Evidence for synt
hesis of scrapie prion proteins in the endocytic pathway．J．Biol．Chem
．267、16188-16199（1992））、ポリアミンは、エンドソームまたはリソソーム
中でPrPScに作用すると推定される。ポリアミンがPrPScを排除する能力に対する
、リソソーム作用剤であるクロロキンおよびNH4Clによる前処理の影響を調べる
ことにより、この推測を調べた。これらのリソソーム作用剤はエンドソームをア
ルカリ化し、ScN2a細胞に投与した場合、PrPScレベルに影響を及ぼさない（Tara
boulos、A．、Raeber、A．J．、Borchelt、D．R．、Serban、D．およびPrusiner
、S．B．Synthesis and trafficking of prion proteins in cultured cells．M
ol．Biol．Cell．3、851-863（1992））。得られた実験結果により、PEIがPrPSc を排除する能力を100μMのクロロキンはブロックするが、30μMのNH4Clはブロッ
クしないことが分かった。同様の結果がSuperfectおよびPAMAM世代4.0を用いて
得られた。NH4ClがPrPScレベルに影響を及ぼさなかったことは簡単に説明できな
いが、分枝ポリアミンがPrPScを除去する能力をクロロキンが弱めた能力は、こ
れらの薬剤がエンドソームまたはリソソーム中で作用するという考えと一致して
いる。
【００７５】 器官ホモジネートアッセイ法 細胞培養物を用いた前記の結果により、酸性環境において分枝ポリアミンが、
PrPScまたは別の細胞成分のいずれかと間接的に相互作用することにより、PrPSc をエンドソーム／リソソームに存在するヒドロラーゼ感受性にすることができる
可能性を調べた。ポリアミンがPrPScをプロテアーゼ感受性にする能力に対するp
Hの影響を調べるために、インビトロ分解アッセイ法を開発した。スクレイピー
に感染したマウス脳の粗ホモジネートを、Superfectの存在下または非存在下で
広範囲のpH値に曝露し、次いで、ウエスタンブロッティングの前にプロテイナー
ゼKで処理した。PrPScは、Superfectの非存在下ではpH範囲（3.6〜9.6）全体に
わたってプロテアーゼ加水分解に耐性のままであったが、pH4.0またはそれ未満
で分枝ポリアミンを添加すると、PrPScはプロテアーゼによりほぼ完全に分解さ
れた。
【００７６】 ポリアミン添加は、インビトロでの消滅に劇的な効果があることを示し、この
消滅はpH4.0またはそれ未満で最適化された。これらの結果により、ポリアミン
は酸性区画においてPrPScに作用することが分かった。インビトロ分解アッセイ
法が、分枝ポリアミンが培養細胞からのPrPScの消滅を促す機構の妥当に近いも
のであることを証明するために、構造活性解析を、培養細胞で試験した該化合物
のいくつかを用いて行った。培養ScN2a細胞におけるPrPScの消滅（表1）と、イ
ンビトロで酸性pHでPrPScをプロテアーゼ感受性にする能力との優れた相関が見
出された。とりわけ、PAMAM-OH世代4.0はPrPScをプロテアーゼ感受性にしなかっ
たが、培養ScN2a細胞において観察された効力（表1）から予想されるように、PA
MAM世代4.0はおよびPPI世代4.0はSuperfectよりもさらに強い活性をインビトロ
で示した。
【００７７】 作用機構 本明細書で述べられた結果により、ある特定の分枝ポリアミンは、用量依存的
および時間依存的にScN2a細胞からPrPScを急速に排除することが分かる。これら
の化合物は、完全に非細胞毒性の濃度で培養細胞からプリオンを除去する強い能
力を示す。この細胞は、治療的レベルの分枝ポリアミンの存在下で無期限に培養
状態で維持することができる。さらに、ScN2a細胞を、これらの化合物に約1週間
曝露した場合、PrPScは検出不可能なレベルにまで低減し、ポリアミンを除去し
た後、少なくとも1ヶ月間、このレベルのままであった。
【００７８】 分枝ポリアミンによるPrPSc排除の正確な機構を解明することは重要な目的で
ある。多数の可能性のあるシナリオがあるが、いくつかの可能性は既に除外され
ている場合がある。除外された1つの可能性は、プリオンタンパク質のリフォー
ルディングを媒介するシャペロン（例えば、熱ショックタンパク質）の誘導によ
りポリアミンが作用することであった。なぜなら、前記の結果は、この現象をイ
ンビトロで再現することが可能であったことを示しているからである。さらに、
ポリアミンは、リフォールディングを促進しようとする他の推定治療剤より優れ
ているように見える。すなわち、ジメチルスルホキシド（DMSO）およびグリセロ
ールは、非常に高い濃度で直接的な「化学シャペロン」として働き、新たなPrPS c の形成を阻害するが（Tatzelt、J．、Prusiner、S．B．およびWelch、W．J．Ch
emical chaperones interfere with the formation of scrapie prion protein
．EMBO J．15、6363-6373（1996））、これらの化合物は既存のPrPScレベルを低
減することができない。さらに、ポリアミンは、これらの薬剤より非常に低い濃
度でPrPSc形成を疎外する。ポリアミンが急速にPrPScを消滅する能力はまた、他
の潜在的なプリオン治療剤の活性と対照をなしている。硫酸化ポリアニオンは、
直接PrPCに結合することによりScN2a細胞におけるPrPSc蓄積を阻害することがで
きるが（Gabizon、R．、Meiner、Z．、Halimi、M．およびBen-Sasson、S．A．He
parin-like molecules bind differentially to prion-proteins and change th
ier intracelluar metabolic fate．J．Cell．Physiol．157、（1993）；Caughe
y、B．、Brown、K．、Raymond、G．K．、Katzenstein、G．E．およびThresher、
W．Binding of the protease-sensitive form of PrP（prion protein） to sul
fated glycosaminoglycan and Congo red．J．Virol．68、2135-2141（1994））
、分枝ポリアミンは既存のPrPScを消滅させることができるので、この作用機構
は、PrPSc結合とデノボ合成阻害を伴うものではない。
【００７９】 除外することができる別の可能性のある機構はエンドソームの破裂である。本
発明者らの実験におけるScN2a細胞からのPrPSc消滅に有効であった分枝ポリアミ
ンであるPEI、SuperFect、およびPAMAMはまた、酸性環境において膨張し、エン
ドソームを破裂させることができる強いリソソーム作用性の浸透圧剤である（Bo
ussif、O．ら、A versatile versatile vector for gene and oligonuleotide t
ransfer into cells in culture and in vivo：polyethyleneimine．Proc．Natl
．Acad．Sci．U．S．A．92、7297-7301（1995）；Haensler、J．およびSzoka、F
．C．J．Polyamidoamine cascade polymers mediate efficient transfection o
f cells in culture．Bioconjug．Chem．4、372-379（1993））。このことは、
分枝ポリアミンが、エンドソームを破裂させ、PrPScをサイトゾル分解プロセス
に曝露することにより、ScN2a細胞からPrPScを消滅させることを示唆している可
能性がある。しかしながら、リソソーム作用性のエンドソームを破裂させる薬剤
であるNH4Cl、クロロキン、およびモネンジンは、ScN2a細胞においてPrPSc形成
を妨げないことが知られている（Taraboulos、A．、Raeber、A．J．、Borchelt
、D．R．、Serban、D．およびPrusiner、S．B．Synthesis and trafficking of
prion proteins in cultured cells．Mol．Biol．Cell．3、851-863（1992））
。さらに、前記の結果はまた、クロロキンが、PrPScを消滅させる分枝ポリアミ
ンの能力を妨げることと、ポリアミンが、細胞膜の非存在下、酸性pHで、インビ
トロでPrPScを消滅できることを示している。これらの観察を総合すると、分枝
ポリアミンがPrPScを除去する機構としてエンドソームの破裂が除外される。
【００８０】 任意の特定の作用機構に拘束されるものではないが、分枝ポリアミンは、PrPS c を破壊するためにインタクトなエンドソームまたはリソソームの酸性環境を必
要とするように思われる。試験したポリマーの構造活性プロフィールにより、最
も活性な化合物が、密に圧縮され一定の間隔があいたアミノ基を有することが明
らかになっている。このことから、これらの化合物は、一定の間隔があいた負の
電荷を有するリガンドに結合する可能性があることが示唆される。いくつかのシ
ナリオにはまだ可能性が残っている。（1）分枝ポリアミンは、露出した負に荷
電した部分を有するアミロイドとして配置されたPrPScに直接結合し、酸条件下
で高次構造変化を誘導する可能性がある。（2）酸によるPrP27-30の処理により
濁度が減少し、αへリックス含有量が増加する。このことから、このような条件
はPrPScを単量体に解離する可能性があることが示唆される（Safar、J．、Rolle
r、P．P．、Gajdusek、D．C．およびGibbs、C．J．、Jr．Scrapie amyloid（pri
on）protein has the conformational characteristics of an aggregated molt
en globule folding intermediate．）。従って、ポリアミンは、酸性条件下で
存在するPrPScの平衡アンフォールティング中間体に結合する可能性がある。（3
）または、ポリアミンは、PrPScに結合する潜在性の負に荷電した成分（プロテ
アーゼ耐性に必須であるが、PrPScが酸により誘導されて高次構造を変化した場
合しか放出されない）を隔離する可能性がある。このような成分は、エンドソー
ムまたはリソソーム内でPrPScのシャペロンとして働く可能性がある。（4）最後
に、もう1つの可能性は、ポリアミンが、PrPScの高次構造変化を誘導することが
できるエンドソーム因子またはリソソーム因子を活性化することである。分枝ポ
リアミンがPrPScを破壊する正確な機構を決定するために、さらに研究が必要さ
れることは明らかである。
【００８１】 アッセイ法の一般的な適用 本明細書に記載したインビトロアッセイ法は、一般に、食品に存在する高次構
造が変化したタンパク質を効果的に消滅させ、それにより、タンパク質の蓄積に
より発生すると思われる多数の変性疾患を予防する化合物の調査に適用すること
ができる。インビボ脳モホジネートアッセイ法は、プロテアーゼが酸性条件下で
タンパク質を加水分解するリソソームをシュミレーションすることにより、PrPS c 分解を誘導する様々なポリアミンの効力を迅速に評価することが可能である。
【００８２】 PrPScを消滅させる化合物を試験するためにスクレイピー感染脳モホジネート
を使用したインビトロアッセイ法を改良して、任意の高次構造が変化したタンパ
ク質を消滅させる化合物をアッセイすることができる。このアッセイ法は、高次
構造が変化したタンパク質が最も高い濃度で存在する器官または組織をホモジネ
ートすることにより行われる。次いで、ホモジネートのpHを5.0未満、好ましく
は4.0またはそれ未満に下げる。例えば、膵臓組織をホモジネートして、II型糖
尿病に関連するアミリンを消滅させる化合物を試験するためのアッセイ法を作成
することができる。ホモジネートされた腎臓を使用して、β2-ミクログロブリン
を消滅させる化合物を試験することができ、ホモジネートされた心臓または血管
組織を使用して、心房性ナトリウム利尿因子を消滅させる化合物を試験すること
ができる。他の高次構造が変化したタンパク質を消滅させる他の化合物を試験す
るためにホモジネートすることができる他の器官および組織の種類が、当業者に
理解されよう。
【００８３】 前記のインビトロアッセイ法を使用して潜在的な薬物をスクリーニングするこ
とに加えて、このアッセイ法により見出された化合物（例えば、分枝ポリアミン
）により、あるタンパク質から高次構造が変化したタンパク質への（例えば、Pr
PCからPrPScへの）変換を調べるための新たなツールが得られる。分枝ポリアミ
ンがPrPScをタンパク質分解に対して耐性にする機構はまだ証明されていない。
分枝ポリアミンとPrPScとの相互作用が可逆的であるかどうかは分かっていない
。さらに、本発明者らは、分枝ポリアミンが、タンパク質を不可逆的に変性させ
ることなくPrPScを可溶化できるかどうかを分かっていない。分枝ポリアミンがP
rPScと反応する機構が何であっても、カオトロープ（chaotrope）ならびに変性
界面活性剤および変性溶媒を用いて見出された機構とは異なると思われる（Prus
iner、S．B．、Groth、D．、Serban、A．、Stahl、N．およびGabizon、R．Attem
pts to restore scrapie prion infectivity after exposure to protein denat
urants．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90、2793-2797（1993））。
【００８４】 本明細書に説明および開示したアッセイ法を用いて、非細胞毒性条件下で培養
細胞からのPrPSc消滅を媒介する、ある特定の分枝ポリアミンが見出されている
。これらの化合物は、存在する高次構造が変化したタンパク質を無効にするため
に広範囲の低pH食品に添加されるという魅力的な可能性をもたらす。見出された
化合物は、PrPScを分解するためにタンパク質分解の正常な細胞経路を刺激する
ことにより作用するので、このクラスの化合物はまた、異常にフォールディング
された野生型タンパク質または変異体タンパク質が蓄積する他の変性疾患および
遺伝性疾患の治療に価値があると思われる。このようなアプローチは、アルツハ
イマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型痴呆、成人発症型
糖尿病、およびアミロイドーシスを含む、1つまたは複数のありふれた変性疾患
に有効な治療剤を開発することにメリットがある可能性がある（Beyreuther、K
．およびMasters、C．L．Serpents on the road to dementia and death．Accum
ulating evidence from several studies points to the normal function of p
resenilin 1 and suggests how the mutant protein contributes to depositio
n of amyloid plaques in Alzheimer's disease．Nature Medicine 3、723-725
（1997）；Masters、C．L．およびBeyreuther、K．Alzheimer's disease．BMJ 3
16、446-448（1998）；Selkoe、D．J．The cell biology of beta-amyloid prec
ursor protein and presenilin in Alzheimer's disease．Trends in Cell Biol
．8、447-453（1998）；Selkoe、D．J．Translating cell biology into therap
eutic advances in Alzheimer's disease．Nature 399、A23-31（1999）；Wong
、P．C．ら、An adverse property of a familical ALS-linked SOD1 mutation
causes motor neuron disease characterized by vacuolar degeneration of mi
tochondria．Neuron 14、1105-1116（1995）；Spillantini、M．G．、Crowther
、R．A．、Jakes、R．、Hasegawa、M．およびGoedert、M．a-Synuclein in fila
mentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson's disease and dementia
with Lewy bodies．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 95、6469-6473（1998）；Hutt
on、Mら、Association of missense and 5'-splice-site mutations in tau wit
h the inherited dementia FTDP-17．Nature 393、702-705（1998）；Stone、M
．J．Amyloidosis：a final common pathway for protein deposition in tissu
es．Blood 75、531-545（1990））。分枝ポリアミンは異常タンパク質の蓄積が
病気の特徴である様々な遺伝性疾患にも有効であるかまだ証明されていない。こ
れらの遺伝病として、遺伝型のプリオン病、アルツハイマー病、パーキンソン病
、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型痴呆、ピック病、およびアミロイドーシス、
ならびにトリプレットリピート病（ハンチントン病、脊髄小脳性運動失調、およ
び筋緊張性ジストロフィーを含む）が挙げられる（Fu、Y．H．ら、An unstable
triplet repeat in a gene related to myotonic muscular dystrophy．Science
255、1256-1259（1992）；Group、T．H．s．D．C．R．A novel gene containin
g a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's d
isease chromosomes．Cell 72、971-983（1993））。本発明のアッセイ法により
同定された化合物（例えば、分枝ポリアミン）は、これらの遺伝病（検出可能な
神経機能障害または全身性機能障害が発症する何十年も前に保因者を同定できる
ことが多い）の発症の予防または遅延に有用である。
【００８５】 本発明は、驚くべきことに、いくつかの樹枝状ポリカチオン（スターバースト
デンドリマーであるSuperfect（商標）（QIAGEN（登録商標）、Valencia、CA）
、ポリアミドアミド（PAMAM）、および高分枝ポチカチオンポリエチレンイミン
（PEI）を含む）により、スクレイピーに感染した培養神経芽細胞腫細胞からPrP Sc が排除されることが見出されたことに基づいている。これらの高分枝ポリカチ
オン化合物により、プリオン病および他の変性疾患（アミロイドーシスを含む）
と闘うための新規のクラスの治療剤が得られる。PrPSc除去は、樹枝状ポリマー
の濃度と曝露の長さの両方に依存する。樹枝状ポリマーは、細胞毒性でない濃度
でPrPScを消滅させることができた。熱分解されたスターバーストPAMAMデンドリ
マーまたはPEIに繰り返し曝露することにより、PrPScレベルは著しく低減し、化
合物を除去した後でさえも1ヶ月間、持続した。樹枝状ポリカチオンは精製PrPSc をインビトロで破壊するように見えず、従って、一般化された機構により作用す
るかもしれない。樹枝状ポリカチオンは、プリオン病および不溶性タンパク質沈
着物を伴う他の疾患（例えば、アミロイドーシス）の治療剤として使用すること
ができる、あるクラスの化合物である。
【００８６】 実施例 以下の実施例は、本発明をどのように作成および使用するかを完璧に当業者に
開示および説明するために示されるが、本発明者らが発明とみなすものの範囲を
制限すると意図されず、以下の実験が実施される全ての実験または唯一の実験で
あることを示すと意図されない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関
する精度を保証する取り組みがなされたが、いくらかの実験の誤差および偏差が
占めるはずである。特に定めのない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子
量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧であるか、または大気圧に近い。
【００８７】 方法および材料 化学製品 高分子量PEIをFlukaから購入した。DOTAPカチオン性脂質をBoehringer Mannhe
imから購入し、SuperFectトランスフェクション試薬をQIAGEN（登録商標）から
購入した。他の全ての化合物をSigma-Aldrichから購入した。全ての試験化合物
を、3mg／mlの保存濃度で水に溶解し、Millipore 0.22mmフィルターに通して濾
過した。
【００８８】 培養細胞 ScN2a細胞の保存培養物を、10％FBS、10％Glutamax（Gibco BRL）、100Uペニ
シリン、および100mg／mlストレプトマイシンを含むMEM中で維持した（DMEを追
加した）。試験化合物を添加する直前に、ディッシュを新鮮な補足DME培地で2回
洗浄した。試験化合物に曝露した後にディッシュから培地を除去し、100mM NaCl
、0.5％NP-40、および0.5％デオキシコール酸ナトリウムを含む20mM Tris（pH8.
0）0.25〜1mlで溶解することにより細胞を収集して、1mg／mlの総タンパク質濃
度（BCAアッセイ法により測定）を得た。2000rpmで5分間の遠心分離により核を
溶解物から除去した。プロテイナーゼKで処理しない試料については、40μlの全
溶解物（40μgの総タンパク質に相当する）を、等量の2×SDS還元サンプルバッ
ファーと混合した。プロテイナーゼK消化のために、20μg／mlプロテイナーゼK
（Boehringer Mannheim）（総タンパク質：酵素比＝50：1）を添加し、試料を37
℃で1時間インキュベートした。タンパク質分解消化を、Pefablocを最終濃度5mM
まで添加することにより停止した。試料1mlを100,000×g、4℃で1時間、遠心分
離し、上清を捨て、ペレットを、SDS-PAGE用の還元SDSサンプルバッファー80μl
に再懸濁した。
【００８９】 脳ホモジネート サイズが連続して小さくなる注射針（18〜22ゲージ）に通して繰り返し押し出
すことにより、RMLスクレイピー罹患CD-1マウスに由来する脳ホモジネート（10
％（w／v）滅菌水溶液）を調製した。核および破片を、1000×gで5分間、遠心分
離することにより除去した。ビシンコニン酸（bicinchnoninic acid）（BCA）タ
ンパク質アッセイ法（Pierce）を用いてタンパク質濃度を測定した。ホモジネー
トを、1％NP-40に溶解して1mg／mlタンパク質に調整した。反応のために、ポリ
アミン保存溶液（3mg／ml）10mlを添加して、または添加せずに、ホモジネート0
.5mlを1.0Mの緩衝液（酢酸ナトリウム（pH3〜6）およびTris酢酸（pH7〜10））2
5mlと一定に振盪しながら37℃で2時間インキュベートした。各試料の最終pH値を
、較正されたpH電極（Radiometer Copenhagen）を用いて直接測定した。インキ
ュベーション後に、各試料を、等量の0.2M HEPES（pH7.5）（0.3M NaClおよび4
％Sarkosylを含む）で中和した。プロテイナーゼKを、最終濃度が20μg／mlにな
るように添加し、試料を37℃で1時間インキュベートした。Pefablocを最終濃度5
μMまで添加することにより、タンパク質分解消化を停止した。消化された脳ホ
モジネート10μlを等量の2×SDSサンプルバッファーと混合し、SDS-PAGE、続い
てウエスタンブロッティングにより解析した。
【００９０】 ウエスタンブロッティング 電気泳動の後、以前に述べられたように（Scott、M．ら、Trangenic mice exp
ressing hamster prion protein produce species-specific scrapie infectivi
ty and amyloid plaques．Cell 59、847-857（1989））、ウエスタンブロッティ
ングを行った。試料を5分間煮沸し、Beckman超遠心分離機において14,000rpmで1
分間遠心分離することにより清澄化した。SDS-PAGEを1.5mmの12％ポリアクリル
アミドゲルで行った（Laemmli、U．K．Cleavage of structural proteins durin
g the assembly of the head of bacteriophage T-4．Nature 227、680-685（19
70））。膜を、PBST（カルシウムおよびマグネシウムを含まず、0.1％Tween 20
を含むPBS）に溶解した5％脱脂乳タンパク質でブロッキングした。ブロッキング
された膜を、PBSTで1：5000に希釈した一次RO73ポリクローナル抗体（MoPrP検出
用）（Serban、D．、Taraboulos、A．、DeArmond、S．J．およびPrusiner、S．B
．Rapid detection of Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prion protein
s．Neurology 40、110-117（1990））または3F4モノクローナル抗体（MHM2 PrP
検出用）（Kascsak、R．J．ら、Mouse polyclonal and monoclonal antibody to
scrapie-associated fibril proteins．J．Virol．61、3688-3693（1987））と
4℃で一晩インキュベートした。一次抗体でインキュベーションした後、膜をPBS
Tで3×10分間洗浄し、PBSTで1：5000に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標
識二次抗体（Amersham Life Sciences）と4℃で30〜60分間インキュベートし、
再度、PBSTで3×10分間洗浄した。ECL試薬（Amersham）で1分間、化学発光法に
より発色させた後、ブロットをプラスチックカバーで密封し、ECL Hypermaxフィ
ルム（Amersham）に曝露した。フィルムを、Konicaフィルム現象処理機で自動的
に現像した。
【００９１】 実施例1A 分枝ポリアミンは新生PrPScの形成を阻害し既存のPrPSc消滅を誘導する ウエスタンブロットを、新たに発現されたMHM2 PrPを認識する3F4モノクロー
ナル抗体でプローブした。ScN2a細胞をSuperFectに3時間曝露し、SuperFectを除
去した3日後に収集した。消化されていない対照試料と、部分的にタンパク質分
解した試料の両方をゲル上で泳動させた。これらの試料を別々のレーン1〜6で泳
動させた。対照試料と部分的にタンパク質分解した試料をそれぞれ以下のような
6レーンで泳動させた。レーン1：DOTAPによるトランスフェクション；レーン2：
30μg／ml SuperFect、5μg pSPOX MHM2；レーン3：75μg／ml SuperFect、5μg
pSPOX MHM2；レーン4：150μg／ml SuperFect、5μg pSPOX MHM2；レーン5：15
0μg／ml SuperFect、10μg pSPOX MHM2；レーン6：トランスフェクション試薬
もDNAも添加せず。これらの研究では40μlの未消化脳ホモジネートを使用したが
、プロテイナーゼKで部分的に消化した試料を、SDS-PAGE前に25倍に濃縮した。
消化物1mlを、100,000×gで4℃で1時間遠心分離し、ペレットを、SDS-PAGE、続
くウエスタンブロッティングの前にSDSサンプルバッファー80μlに懸濁した。タ
ンパク質標準の移動に基づく見かけの分子量は、34.2kDa、28.3kDa、および19.9
kDaである。
【００９２】 予想されたように、対照レーン1〜6の全てが複数のバンドを示している。しか
しながら、部分的にタンパク質分解した試料についてはレーン1だけが複数のバ
ンドを示している。意外なことに、部分的に消化した試料であるレーン2〜5の全
てがバンドを示さず、部分的に消化したレーン6には予想されたようにバンドが
ない。これらの結果により、SuperFectの使用がPrPSc消滅に効果があることが分
かる。
【００９３】 実施例1B 前記で述べたブロットから抗体を除去し、標識R073に曝露し、再度発色させた
。実施例1で使用した抗体3F4はPrPCに結合するが、PrPScに結合しない。しかし
ながら、R073はPrPScとPrPCに結合する。レーン1、2、およびレーン3は減少した
量のPrPScを示し、レーン4および5は検出可能なPrPScを示さない。
【００９４】 実施例2A 未消化対照1〜4と、前記のように部分的にタンパク質分解した試料をゲル上で
泳動させた。レーンは以下のとおりであった。レーン1：SuperFectなし；レーン
2：30μg／ml SuperFect；レーン3：75μg／ml SuperFect；レーン4：150μg／m
l SuperFect。ScN2a細胞をSuperFectに3時間曝露し、SuperFectを除去した3日後
に収集した。タンパク質標準の移動に基づく見かけの分子量は、33.9、28.8、お
よび20.5kDaである。各試料を同じ期間の後に試験したので、これらの結果によ
り、SuperFectにはPrPSc除去に用量依存的な効果があることが分かる。レーン1
、2、および3は減少した量のPrPScを示し、レーン4は検出可能なPrPScを示さな
い。
【００９５】 実施例2B SuperFectの時間依存的な効果を調べるために、3つの異なるパネル（それぞれ
4レーン）を調製し、以下のように泳動させた。ScN2a細胞を、7.5μg／mlのSupe
rFect（レーン1〜4）、PEI（平均分子量約60,000）（レーン5〜8）、またはPAMA
M世代4.0（レーン9〜12）に曝露した。各ポリアミンの曝露時間は、0時間（レー
ン1、5、および9）、4時間（レーン2、6、および10）、8時間（レーン3、7、お
よび11）、16時間（レーン4、8、および12）である。全ての試料を部分的にタン
パク質分解して、PrPScを測定した。タンパク質標準の移動に基づく見かけの分
子量は、38kDa、26kDa、および15kDaである。3つの各パネルのレーンは減少した
量のPrPScを示す。
【００９６】 実施例3 この実施例では、4つのパネルA、B、C、およびDを作成した（各パネルには3つ
の対（対照および試験）レーンがある）。ScN2a細胞を、1.5μg／mlの（A）Supe
rFect、（B）PEI（平均分子量約60,000）、（C）PAMAM世代4.0、または（D）添
加なしに曝露した。細胞を、添加前（レーン1）、試験化合物に1週間連続して曝
露した直後（レーン2）、および試験化合物を除去した3週間後（レーン3）に収
集した。マイナス（-）の記号は未消化対照試料を表し、プラス（＋）の記号は
、部分的にタンパク質分解した試料を表す。タンパク質標準の移動に基づく見か
けの分子量は、33.9kDa、28.8kDa、および20.5kDaである。パネルAの試験レーン
3は3週間後にわずかなPrPScを示し、パネルBおよびCの試験レーン3は検出可能な
PrPScを示さなかったが、パネルDの全レーンにはPrPScが存在していた。
【００９７】 実施例4A クロロキンの添加がPrPScレベルに影響を及ぼすことを証明するために、4つ別
々のゲル上で泳動させた。レーン1（対照）および3（クロロキン添加）はPrPSc
の明瞭なバンドを示すが、レーン2および4（クロロキン添加なし）は、かろうじ
て検出可能な量のPrPScを示している。4つのレーンを以下のように調製した。Sc
N2a細胞を、対照培地（レーン1）、7.5μg／ml PEI（平均分子量約60,000）（レ
ーン2）、PEI＋100μMクロロキン（レーン3）、PEI＋30μM NH4Cl（レーン4）で
処理した。クロロキンおよびNH4Clを、PEIを添加する1時間前に添加した。細胞
を、PEIを添加した16時間後に収集した。示した全試料を部分的にタンパク質分
解して、PrPScを測定した。タンパク質標準の移動に基づく見かけの分子量は、3
8kDa、26kDa、および15kDaである。
【００９８】 実施例4B SuperFectを添加した8レーン（＋SF）と、SuperFectを添加しない8レーン（-S
F）を調製した。各グループのレーン1〜8のpHは3.6、4、5、6、7、8、9、および
9.6に調節された。広範なpH条件下での粗マウス脳ホモジネートとSuperFectとの
インビトロ混合を、方法で述べたように行った（測定された各試料の最終pHをレ
ーンの上に示す）。60μg／ml SuperFectの添加を「＋SF」と示し、添加しない
対照を「-SF」と示す。示した全試料を部分的にタンパク質分解して、PrPScを測
定した。タンパク質標準の移動に基づく見かけの分子量は30kDaおよび27kDaであ
る。-SFグループの全レーンはPrPScが存在することを示した。＋SFグループのレ
ーン3〜8はPrPScを示した。しかしながら、レーン1および2（それぞれ、3.6およ
び4.0のpHレベル）は、非常にわずかに検出可能なPrPScを示した。これらの結果
により、分枝ポリカチオン（例えば、SuperFect）がPrPScを消滅させる能力はpH
に依存することが分かる。
【００９９】 実施例5 16の異なるレーンを記載のように調製した。レーン1および2は対照レーンであ
り、レーン3〜16のそれぞれには表1で試験したような異なる化合物が含まれた。
試験化合物は全てポリアミンであった。従って、これらの結果により、様々なポ
リアミンにより脳ホモジネートからPrPScがインビトロで除去されることが分か
る。試料をpH3.6でポリアミンとインキュベートし、方法に記載のように処理し
た。各ポリアミンを60μg／mlの濃度で試験した。レーン1および2：対照；レー
ン3：ポリ（L）リジン；レーン4：PAMAM世代0.0；レーン5：PAMAM世代1.0；レー
ン6：PAMAM世代2.0；レーン7：PAMAM世代3.0；レーン8：PAMAM世代4.0；レーン9
：PAMAM-OH世代4.0；レーン10：PPI世代2.0；レーン11：PPI世代4.0；レーン12
：線状PEI；レーン13：高MW PEI；レーン14：低MW PEI；レーン15：平均MW PEI
；レーン16：SuperFect。示した全試料を部分的にタンパク質分解して、PrPScを
測定した。タンパク質標準の移動に基づく見かけの分子量は30kDaおよび27kDaで
ある。表1。ポリマー化合物によるPrPScの除去。IC50＝16時間の曝露後にScN2a
細胞においてPrPScを対照レベルの50％まで低減させるのに必要とされる、おお
よそのポリマー濃度。全ての化合物を5つの異なる濃度で試験した。PrPScレベル
を、ウエスタンブロットシグナルの濃度測定により測定した。
【表１】 （表1は使用した化合物の特徴に関する情報を含むが、レーン1〜16に直接対応し
ないことに留意のこと）
【０１００】 レーン7、8、11、および13は、最もよい結果（すなわち、これらの条件下でPr
PScを消滅させる最もよい能力）を示した。詳細に述べると、レーン8のPAMAM世
代4.0は、これらの条件下でPrPScを消滅させる最もよい能力を示したが、PAMAM-
OH世代4.0は、PrPScを消滅させるほとんど検出できない能力を示し、対照と同等
であった。
【０１０１】 実施例6 デンドリマー化合物によるPrPSc発現細胞のトランスフェクション 化合物がPrPSc形成を抑制する能力について、PrPScを発現するニューロン由来
細胞を調べた。
【０１０２】トランスフェクション研究 N2a細胞およびScN2a細胞の保存培養物を、10％FBS、10％Glutamax（Gibco BRL
）、100Uペニシリン、および100μg／mlストレプトマイシンを含むMEM中で維持
した。トランスフェクションの1日前に、シングルコンフルエントな100mmディッ
シュからの細胞をトリプシン処理し、DME＋10％FBS、10％Glutamax、100Uペニシ
リン、および100μg／mlストレプトマイシンを含む10個の別々の60mmディッシュ
に分けた（DMEを追加した）。トランスフェクションの直前に、これらのディッ
シュを補足DME培地4mlで2回洗浄し、次いで、水切りした。
【０１０３】 DOTAPによるトランスフェクションのために、トランスフェクションの日に、1
5μgのpSPOX MHM2を滅菌Hepes緩衝食塩水（HBS）150μlに再懸濁した。次いで、
このDNA溶液を、Falcon2059チューブ内で、HBSに溶解した等量の333μg／ml DOT
AP（Boehringer Mannheim）と混合し、DNA／脂質複合体を形成するために室温で
10分間インキュベートした。混合物に補足DME（2.5ml）を添加し、次いで、これ
を水切りした細胞単層にピペットで移した。翌日、DNA／脂質を含む培地を除去
し、新鮮な補足DMEと交換した。細胞を3日後に収集した。
【０１０４】 Superfect（商標）によるトランスフェクション／曝露のために、DNAを含む、
または含まないSuperfect（商標）を、各実験に必要とされる特定の濃度になる
ようにFalcon2059チューブ内で1mlの補足DMEに添加した。この混合物をピペット
内で2回上下させ、次いで、水切りした細胞単層上に移した。示した時間で曝露
した後、Superfect（商標）を含む培地を除去し、新鮮な補足DMEと交換した。Su
perfect（商標）を除去した後、細胞を指定した時間で収集した。
【０１０５】 PPI（DAB-Am-8、ポリプロピレンイミンオクタアミンデンドリマー世代2.0 Ald
rich 46,072-9）、未処理PAMAM（スターバースト（PAMAM）デンドリマー、世代4
. Aldrich 41,244-9）、PEI（Sigma）、ポリ（L）リジン（Sigma）、およびポリ
（D）リジン（Sigma）への曝露を、Superfect（商標）について前記したように
行った。
【０１０６】処理細胞からのタンパク質の単離 100mM NaCl、0.5％NP-40、および0.5％デオキシコール酸ナトリウムを含む20m
M Tris（pH8.0）1.2mlで溶解することにより、細胞を収集した。2000rpmで5分間
の遠心分離により核を溶解物から除去した。この溶解物のタンパク質濃度は、通
常、0.5mg／mlである（BCA法により測定される）。プロテイナーゼKで処理しな
い試料については、40μlの全溶解物（20μgの総タンパク質に相当する）を、40
μlの2×SDSサンプルバッファーと混合した。プロテイナーゼK消化のために、溶
解物1mlを20μg／mlプロテイナーゼK（総タンパク質：酵素比＝25：1）と37℃で
1時間インキュベートした。タンパク質分解消化を、0.5M PMSF無水エタノール溶
液8μlを添加することにより停止した。次いで、試料を、100,000×gで4℃で75
分間、Beckman TLA-45ローター内で遠心分離した。1×SDSサンプルバッファー80
μl中で繰り返しピペッティングすることにより、ペレットを再懸濁した。この
試料全部（消化前の0.5mg総タンパク質に相当する）をSDS-PAGEのためにロード
した。
【０１０７】ウエスタンブロット解析 プロテイナーゼK消化の前後に、DOTAPによるトランスフェクションに由来する
、モノクローナル抗体3F4免疫反応性PrPバンドを検出した。ScN2a細胞においてP
rPScを発現させるために使用した構築物はキメラ構築物であるMHM2であり、108
位および111位で野生型（wt）MoPrPとは異なる（Scottら（1992）Protein Sci．
1：986-997）。これらの位置での、シリハンハムスター（SHa）PrP配列に由来す
る対応する残基（それぞれ109位および112位）による置換は、3F4に対するエピ
トープを生じさせる（Kascsakら（1987）J．Virol．61：3688-3693）。3F4は、S
cN2a細胞中の内因性野生型 MoPrPを認識せず、従って、ウエスタンブロットによ
る特異的な外来遺伝子検出を容易にする。
【０１０８】 電気泳動後、以前に述べられたように（Scottら（1989）Cell 59：847-857）
、ウエスタンブロッティングを行った。試料を5分間煮沸し、Beckman超遠心分離
機において14,000rpmで1分間遠心分離することにより清澄化した。SDS-PAGEを1.
5mmの12％ポリアクリルアミドゲルで行った（Laemmli（1970）Nature 227、661-
665）。膜を、PBST（カルシウムおよびマグネシウムを含まず、0.1％Tween 20を
含むPBS）に溶解した5％脱脂乳タンパク質で室温で1時間ブロッキングした。ブ
ロッキングされた膜を、PBSTで1：5000に希釈した一次RO73ポリクローナル抗体
または3F4モノクローナル抗体と4℃で一晩インキュベートした。
【０１０９】 一次抗体でインキュベーションした後、膜をPBSTで3×10分間洗浄し、PBSTで1
：5000に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体（Amersham Life Sc
iences）と室温で25分間インキュベートし、再度、PBSTで3×10分間洗浄した。E
CL試薬（Amersham）で1分間、化学発光法により発色させた後、ブロットをプラ
スチックカバーで密封し、ECL Hypermaxフィルム（Amersham）に曝露した。フィ
ルムを、Konicaフィルム現象処理機で自動的に現像した。
【０１１０】 DOTAPによりトランスフェクトされた細胞とは対照的に、様々な濃度のSuperfe
ct（商標）とDNAでトランスフェクトされたScN2a細胞は、プロテアーゼ耐性MHM2
を含んでいるようには見えなかった。非常に綿密な調査により、プロテアーゼ消
化前に、Superfect（商標）によりトランスフェクトされた試料は、対照試料の
バックグラウンドパターンには見られないMHM2バンドを発現することが明らかに
なった。これらの観察から、MHM2 PrPは、Superfect（商標）トランスフェクシ
ョン試薬を用いて首尾よく発現されたが、MHM2 PrPCからプロテアーゼ耐性MHM2
PrPScへの変換がSuperfect（商標）により阻害されたことが分かる。
【０１１１】 Superfect（商標）がScN2a細胞における既存のPrPScのレベルに影響を及ぼす
かを調べるために、3F4抗体でプローブされたウエスタンブロットを、内因性MoP
rPを認識することができるポリクローナル抗体RO73で再プローブした。注目に値
することであるが、Superfect（商標）により、ScN2a細胞に由来する既存のMoPr
PScが用量依存的に消失した。Superfect（商標）処理後に、PrPScを、核画分、
ペレット、上清、または培地において検出することができなかった。3時間の曝
露で既存のPrPScを完全に除去するために必要とされるSuperfect（商標）濃度は
300μg／mlであったが、同じ時間枠内で新たなMHM PrPScの形成を妨げるには30
μg／mlが十分であった。
【０１１２】 曝露の長さが、ScN2a細胞からPrPScを除去するSuperfect（商標）の能力に劇
的に影響を及ぼした。150μg／mlのSuperfect（商標）に対する3時間の曝露によ
りScN2a細胞におけるPrPScレベルは著しく低下したが、同じ用量のSuperfect（
商標）に対する10分間の曝露によりPrPScレベルは影響しなかった。ScN2a細胞を
2μg／mlのSuperfect（商標）に1週間連続して曝露した場合、PrPScは完全に消
失した。
【０１１３】 試験した条件は、細胞に対して毒性があるように見られなかった。3時間の150
μg／ml Superfect（商標）も、1週間連続した2μg／ml Superfect（商標）も、
位相差顕微鏡により判断される、細胞形態、生存率、または増殖における明らか
な変化を引き起こさなかった。
【０１１４】 実施例7 Superfect（商標）に繰り返し曝露することによるPrPScの排除 Superfect（商標）に曝露した後にPrPScレベルが低減する期間を調べ、この低
減は、Superfect（商標）を除去した後、長期間、持続できることが分かった。S
cN2a細胞を単回用量の150μg／ml Superfect（商標）に3時間曝露した後、PrPSc レベルは1週間低いままであったが、Superfect（商標）無しで培養して3週間後
、ベースラインレベルの近くまで戻った。
【０１１５】 対照的に、ScN2a細胞を、4回用量のSuperfect（商標）に16日間にわたって曝
露した場合、Superfect（商標）に最後に曝露した4週間後、ほとんどPrPScを検
出することができなかった。この結果は、Superfect（商標）に長期に曝露する
ことにより、培養細胞のスクレイピー感染を長期にわたって治癒できるという期
待を抱かせる。
【０１１６】 実施例8 Superfect（商標）はPrPScを直接破壊しない デンドリマーであるSuperfect（商標）を用いて、Superfect（商標）が粗脳モ
ホジネート中のPrPScまたは精製PrP27-30ロッドに対して同様の阻害効果を発揮
できるかを調べた。サイズが連続して小さくなる注射針（18〜22ゲージ）に通し
て繰り返し押し出すことにより、正常シリアンハムスターおよびスクレイピー感
染シリアンハムスターに由来する脳ホモジネート（10％（w／v）滅菌PBS溶液）
を調製した。核および破片を、1000×gで10分間、遠心分離することにより除去
した。ビシンコニン酸（BCA）タンパク質アッセイ法（Pierce）を用いてタンパ
ク質濃度を測定した。ホモジネートをPBSで10mg／mlタンパク質に調整し、50μl
を、100mM NaCl、1mM EDTA、0.55％デオキシコール酸ナトリウム、0.55％Triton
X-100、および50mM Tris-HCl（pH7.5）を含む溶解緩衝液450μlに添加した。次
いで、この混合物を、0〜300μg／ml Superfect（商標）と37℃で3時間インキュ
ベートし、次いで、Beckman超遠心分離機において14,000rpmで10分間、遠心分離
した。ペレットを、Superfect（商標）を含まない溶解緩衝液450μlに再懸濁し
た。プロテイナーゼK（Boehringer Mannheim）を、最終濃度が20μg／mlになる
ように添加した。従って、総タンパク質／酵素の比は50：1であった。試料を37
℃で1時間インキュベートした。0.5M PMSFエタノール溶液8μlを添加することに
より、タンパク質分解消化を停止した。次いで、試料を、100,000×g、4℃で75
分間、Beckman TLA-45ローター内で遠心分離した。未消化試料（10μl）を、等
量の2×SDSサンプルバッファーと混合した。消化試料については、ペレットを、
1×SDSサンプルバッファー100μl中で繰り返しピペッティングすることにより再
懸濁した。各試料20μl（プロテイナーゼK消化前の総タンパク質100μgに等しい
）をSDS-PAGEのためにロードした。
【０１１７】 PrP27-30ロッドはスクレイピー感染シリアンハムスターの脳から精製され、以
前に述べられている（Prusinerら、（1983）Cell 35：349-358）。精製されたロ
ッド（3.5μg／ml）を、補足DME100μlに溶解した900μg／ml Superfect（商標
）と共に、または伴わずにインキュベートした。37℃で16時間後、懸濁液を100,
000×g、4℃で遠心分離した。ペレットを、1mg／ml BSA、100mM NaCl、1mM EDTA
、0.55％デオキシコール酸ナトリウム、0.55％Triton X-100、および50mM Tris-
HCl（pH7.5）を含む緩衝液500μlに再懸濁した。プロテイナーゼKを、最終濃度
が20μg／mlになるように添加した。試料を37℃で1時間インキュベートした。0.
5M Pefabloc（Boehringer Mannheim）8μlを添加することにより、タンパク質分
解消化を停止した。次いで、試料を、100,000×g、4℃で75分間、遠心分離した
。未消化試料（50μl）を、等量の2×SDSサンプルバッファーと混合した。消化
試料については、ペレットを、1×SDSサンプルバッファー100μl中で繰り返しピ
ペッティングすることにより再懸濁した。各試料40μlをSDS-PAGEのためにロー
ドした。
【０１１８】 Superfect（商標）を、スクレイピー罹患シリアンハムスターの粗ホモジネー
トまたは精製シリアンハムスターPrP27-30と混合した場合、プロテイナーゼK耐
性のPrPScレベルには著しい変化はなかった。これらの結果により、Superfect（
商標）によるScN2a細胞からのPrPSc除去は、インタクトな細胞機構の存在に依存
していることが示唆される。
【０１１９】 実施例9 他の樹枝状ポリカチオンによるPrPScレベルの消滅 Superfect（商標）化合物は、熱分解されたPAMAMスターバーストデンドリマー
の高分子量成分であり、非常に枝分かれのあるカチオン性の単分散ポリマーであ
る（Tangら、（1996）Bioconjugate Chem．7：703-714）。他の潜在的に有用な
抗プリオン治療剤を同定するために、本発明者らは、ScN2a細胞からPrPScを消滅
させる能力について、3種類の異なる樹枝状ポリカチオンと2種類の線状カチオン
ポリマーをスクリーニングした。試験したこれらの樹枝状高分枝のうち、ポリエ
チレンイミン（PEI）が最も強力であり、10μg／mlの濃度で使用した場合、3時
間後にPrPScの大部分をScN2a細胞から除去した。未処理PAMAMは、Superfect（商
標）に匹敵する効力を示し、50μg／mlの濃度で使用した場合、検出可能なPrPSc の約半分を除去した。対照的に、デンドリマーポリプロピレンイミン（PPI）、
ポリ（L）リジン、および線状ポリカチオンであるポリ（D）リジンは、10〜50μ
g／mlの濃度でPrPScレベルを低減しなかった。これらの結果により、PrPScを消
滅させるには分枝ポリマー構造が必要とされることが証明される。さらに、ScN2
a細胞を、1.5μg／mlの濃度のPEIまたは未処理PAMAMに1週間曝露すると、PrPSc
は完全に除去され、スクレイピーに感染した細胞は効果的に治癒される。
【０１２０】 本発明を特定の態様を参照して説明したが、本発明の真の精神および範囲から
逸脱することなく様々な変更が可能であり、等価物での代用が可能であることは
当業者に理解されるはずである。さらに、特定の状況、材料、物質の組成物、プ
ロセス、プロセスの1つまたは複数の段階を、本発明の目的、精神および範囲に
合わせるように、多くの変更を加えることができる。このような全ての変更は、
添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 反復発散増殖技術を用いて作成された同一分散構造の明確な「世
代」を示すデンドリマー分子の模式図を示す。この特定の図は、PAMAM世代2.0（
エチレンジアミンコア）の図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/785 Ａ６１Ｋ 31/785 ４Ｃ０８７ 35/12 35/12 35/66 35/66 38/00 45/00 45/00 47/42 47/42 Ａ６１Ｌ 2/16 Ｚ Ａ６１Ｌ 2/16 Ａ６１Ｐ 31/00 Ａ６１Ｐ 31/00 31/04 31/04 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ０９／４４７，４５６ (32)優先日 平成11年11月22日(1999．11．22) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／４９４，８１４ (32)優先日 平成12年１月31日(2000．1．31) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 スパッタポン スラチャイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 サン フランシスコ バッキンガム ウェイ ＃702 225 (72)発明者 スコット マイケル アール． アメリカ合衆国 カリフォルニア州 サン フランシスコ クレイトン ストリート ＃９ 1200 Ｆターム(参考） 2B150 DA20 4C058 AA22 BB07 CC02 CC03 CC06 JJ08 JJ27 JJ29 4C076 AA53 BB01 CC26 CC34 EE42 FF04 FF27 FF68 4C084 AA02 AA18 AA27 BA44 BA50 CA59 MA02 MA37 MA52 NA05 NA10 NA14 ZB352 ZC542 4C086 AA01 FA03 MA02 MA16 MA37 MA52 NA05 NA10 NA14 ZB35 ZC54 4C087 AA01 AA02 BB65 BC30 CA12 MA02 MA16 MA37 MA52 NA05 NA10 NA14 ZB35 ZC54

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 pH5またはそれ未満で物体を分枝ポリカチオンからなる組成
    物と接触させる段階と、 高次構造が変化したタンパク質を非感染性にするのに十分な時間、組成物を物
    体と接触したままにする段階を含む、物体を滅菌する方法。
  2. 【請求項２】 物体から組成物を除去することをさらに含む、請求項1に記
    載の方法。
  3. 【請求項３】 分枝ポリカチオンが、ポリプロピレンイミン、ポリエチレン
    イミン（PEI）、ポリ（4'-アザ-4'-メチルヘプタメチレン-D-グルカルアミド（g
    lucaramide））、ポリアミドアミン、およびこれらの変異体または断片からなる
    群より選択されるポリカチオンデンドリマーである、請求項1に記載の方法。
  4. 【請求項４】 物体が細胞培養物である、請求項1に記載の方法。
  5. 【請求項５】 物体がウシ由来製品である、請求項1に記載の方法。
  6. 【請求項６】 1重量％〜99.99重量％の量の水と、 0.001重量％〜10重量％の量のポリカチオンデンドリマーを含む、組成物。
  7. 【請求項７】 組成物が、治療有効量の分枝ポリカチオンと薬学的に許容さ
    れる賦形剤を含む薬学的組成物である、請求項6に記載の組成物。
  8. 【請求項８】 洗浄剤、抗菌化合物、抗ウイルス化合物、および抗真菌化合
    物からなる群より選択される第2の化合物をさらに含む、請求項6に記載の組成物
    。
  9. 【請求項９】 ウシから抽出されたゼラチンと、 分枝ポリカチオンを含む、化合物を経口投与するためのカプセル。
  10. 【請求項１０】 医薬品を産生するように遺伝子操作された細胞と、 細胞栄養剤と、 分枝ポリカチオンを含む、細胞培養物。
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