JP2003304876A - 変異アルカリプロテアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【解決手段】バチルス属由来の特定なアミノ酸配列と９
０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有する高アルカ
リプロテアーゼについて、特定なアミノ酸配列の２１１
位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基を他のアミノ
酸残基に置換した変異アルカリプロテアーゼ；これをコ
ードする遺伝子。 【効果】 本発明の変異アルカリプロテアーゼは、酸化
剤配合の衣料用洗剤、自動食器洗浄機用洗剤中などでも
安定に保存され、充分な効力を発揮できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、洗剤用酵素として
有用な変異アルカリプロテアーゼに関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】洗剤用
のアルカリプロテアーゼは、洗浄力の向上に不可欠な成
分であり、工業用酵素として最も生産量の多いプロテア
ーゼの中で重要な役割を果たしてきている。現在用いら
れている洗剤用アルカリプロテアーゼは、バチルス属細
菌に由来し、ズブチリシンファミリーに属するものであ
るが、中でも最適反応ｐＨを１１以上に有している高ア
ルカリプロテアーゼ（ClassI−Ｓ２に分類され（Siezen
ら, Protein Eng., 4, 719-737, 1991）、更にズブチリ
シンに分類されるアルカリプロテアーゼの中でhighalka
line proteaseとして細分される（SiezenとLeunissen,
Protein Sci., 6, 501-523,1997））であるサビナー
ゼ、カンナーゼ（ノボザイム）、マキサカル（ジェネン
コア）、ブラップ（ヘンケル）及びＫＡＰ（花王）等が
近年その主力となっている。

【０００３】ところが、これらの高アルカリプロテアー
ゼを含むズブチリシンは、洗浄剤に配合されることもあ
る酸化剤に対して非常に感受性が高いという問題があっ
た。これに対しては、酸化剤に対する感受性が、酵素の
活性中心の一つである２２１位（ズブチリシンＢＰＮ’
におけるアミノ酸番号）のセリン残基に隣接する２２２
位のメチオニンが酸化されることに基づくものであるこ
とが解明され（Stauffer and Etson, J. Biol. Chem.,
244, 5333-5338, 1969）、２２２位のメチオニン残基を
非酸化性のアミノ酸残基に置換した酸化剤耐性能を有す
る変異ズブチリシンが開発され（特願昭５９−１２９９
２８号）、デュラザイム（ノボザイム）、マキサぺム
（ジェネンコア）といった酵素が上市されている。

【０００４】しかしながら、このようにズブチリシンの
２２２位のメチオニンを他のアミノ酸に置換した場合に
は、当該位置が活性中心に隣接することから比活性が極
端に低下するという新たな問題が生じており（Estell
ら, J. Biol. Chem., 260, 6518-6521, 1985）、酸化剤
耐性能を有し且つある程度の比活性を保持する酵素は、
未だ見出されていないのが現状である。

【０００５】従って、本発明は、比活性が極端に低下す
ることなく、酸化剤耐性を有する変異アルカリプロテア
ーゼを提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、日本にお
ける酸化剤の洗剤への配合量が欧米諸国に比べ低濃度で
あるためズブチリシンの２２２位のメチオニンを他のア
ミノ酸に置換しなくても、ある程度の酸化剤耐性が獲得
できれば、洗剤中での保存安定性等を増強できると考
え、高アルカリプロテアーゼの特性を維持しつつ新たに
酸化剤耐性が獲得された酵素の探索を行った結果、特定
のアミノ酸配列を有する高アルカリプロテアーゼの特定
位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異
体が、比活性の著しい低下を伴うことなく酸化剤耐性を
有していることを見出した。

【０００７】すなわち本発明は、配列番号１に示すアミ
ノ酸配列と９０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有
する高アルカリプロテアーゼについて、配列番号１の２
１１位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基を他のア
ミノ酸残基に置換した変異アルカリプロテアーゼ、及び
それをコードする遺伝子を提供するものである。

【０００８】また本発明は、該遺伝子を含有するベクタ
ー、該ベクターを含有する形質転換体を提供するもので
ある。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明の変異アルカリプロテアー
ゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上
の相同性を有する高アルカリプロテアーゼを変異の対象
となるプロテアーゼ（以下、「親アルカリプロテアー
ゼ」ともいう）とし、当該配列番号１の２１１位又はこ
れに相当する位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に
置換してなるものであり、これらは野生型の変異体或い
は人為的に変異を施した変異体であってもよい。

【００１０】親アルカリプロテアーゼである配列番号１
に示すアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアルカ
リプロテアーゼとしては、野生型又は野生型の変異体で
あってもよく、その性質としては、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミド電気泳動法による分子量が２８〜３１ｋＤａで
あることが好ましく、等電点電気泳動法による等電点が
ｐH８．５以上であることが好ましく、カゼインを基質
とした場合に最適反応ｐＨがｐＨ１０．５〜１２．５、
最適反応温度が４０〜６０℃であることが好ましい。ま
た、セリンプロテアーゼの阻害剤であるＰＭＳＦやＤＦ
Ｐにより失活し、過酸化水素のような酸化剤に対し感受
性が高いことが好ましい。特に、ＳＤＳ−ポリアクリル
アミド電気泳動法による分子量が２８−３０ｋＤａ、等
電点電気泳動法による等電点がｐＨ１０．５以上、カゼ
インを基質とした場合に最適反応ｐＨがｐＨ１２．３付
近、最適反応温度が５５℃であり、更にセリンプロテア
ーゼの阻害剤であるＰＭＳＦやＤＦＰにより失活し、過
酸化水素のような酸化剤に対して特定の条件下において
速やかに失活する高アルカリプロテアーゼであるのが好
ましい。

【００１１】親アルカリプロテアーゼである「配列番号
１で示されるアミノ酸配列を有する高アルカリプロテア
ーゼ」としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列を
有するＫ−１６（ＫＡＰ）［バチルス エスピー ＫＳ
Ｍ−Ｋ１６（ＦＥＲＭ ＢＰ−３３７６）由来、Hakama
daら, J. Ferment. Bioeng., 78, 105-108, 1994］が挙
げられ、これと９０％以上の相同性を有する高アルカリ
プロテアーゼとしては、更に９５％以上、特に９７％以
上の相同性を有するものが好ましく、例えばＮｏ．２２
１（バチルス エスピー ２２１由来、Takamiら,Biosc
i. Biotechnol.Biochem., 56, 1455-1460, 1992）、サ
ビナーゼ（バチルス レンタス由来、Betzelら,J. Mol.
Biol., 223, 427-445, 1992）、ＰＢ９２（バチルス
エスピーＰＢ９２由来、Laanら, Appl.Environ. Microb
iol., 57, 901-909, 1991）等のＳｉｅｚｅｎらにより
Ｃｌａｓｓ Ｉ−Ｓ２、さらにズブチリシンの中でhigh
alkaline proteaseに細分されるズブチリシン亜種等が
挙げられる。尚、アミノ酸配列の相同性はＧＥＮＥＴＹ
Ｘ−ＷＩＮのマキシマムマッチングやサーチホモロジー
等のプログラム（ソフトウェア開発）により計算するこ
とができる。

【００１２】上記配列番号１で示される親アルカリプロ
テアーゼの２１１位におけるアミノ酸残基はロイシンで
あり、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上
の相同性を有する親アルカリプロテアーゼにおいては、
配列番号１の２１１位に相当する位置のアミノ酸残基
は、ロイシン、プロリン、アルギニン、リジンのいずれ
かであるものが好ましく、特にロイシンであるものが好
ましい。

【００１３】従って、配列番号１で示されるアミノ酸配
列と９０％以上の相同性を有する親アルカリプロテアー
ゼの中で好ましいものとしては、上述した酵素学的性質
を有するもの（段落〔００１０〕）及び／又は配列番号
１に示すアミノ酸配列と好ましくは９５％以上、より好
ましくは９７％以上の相同性を示すものであって、更に
配列番号１の２１１位に相当する位置のアミノ酸残基が
上記（段落〔００１２〕）のものであるプロテアーゼが
挙げられ、特に当該酵素学的性質を有し（段落〔００１
０〕）、配列番号１に示すアミノ酸配列と好ましくは９
５％以上、より好ましくは９７％以上の相同性を示すも
のであり、且つ配列番号１の２１１位に相当する位置の
アミノ酸残基が上記（段落〔００１２〕）のものである
プロテアーゼが好ましい。

【００１４】そして、本発明の変異アルカリプロテアー
ゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するプロ
テアーゼを親アルカリプロテアーゼとする場合には、当
該２１１位のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換したも
のであり、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％
以上の相同性を有するプロテアーゼ（配列番号１で示さ
れるアルカリプロテアーゼを除く）を親アルカリプロテ
アーゼとする場合には、配列番号１の２１１位に相当す
る位置のいずれかのアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換
したものである。

【００１５】斯かる他のアミノ酸残基としては、グルタ
ミン酸、バリン、アスパラギン酸、セリン、イソロイシ
ン、システイン、ヒスチジン、メチオニン、スレオニ
ン、グルタミン、アスパラギン、チロシン、トリプトフ
ァン、アラニン及びフェニルアラニンから選ばれたもの
であるが、好ましくはグルタミン酸、バリン、アスパラ
ギン酸、セリン、イソロイシン、システイン、ヒスチジ
ンであり、特にグルタミン酸、バリン、アスパラギン酸
であるのが好ましい。

【００１６】また、「相当する位置のアミノ酸残基」を
特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法
等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較
し、各アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列中に存在す
る保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えることにより
行うことができる。プロテアーゼのアミノ酸配列をこの
ような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中に
ある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各プ
ロテアーゼにおける配列中の位置を決めることが可能で
ある（図１）。相同位置は、三次元構造中で同位置に存
在すると考えられ、対象のプロテアーゼの特異的機能に
関して類似した効果を有することが推定できる。

【００１７】配列番号１に示す高アルカリプロテアーゼ
（Ｋ−１６（ＫＡＰ））の２１１位に相当する位置及び
アミノ酸番号の具体例を、例えば前述したプロテアーゼ
Ｎｏ．２２１、サビナーゼ、プロテアーゼＰＢ９２につ
いて示せば、Ｎｏ．２２１では、２１１位（ロイシ
ン）、サビナーゼでは２１１位（ロイシン）、ＰＢ９２
では２１１位（ロイシン）である。

【００１８】また、本発明の変異アルカリプロテアーゼ
には、上記２１１位又はこれに相当する位置のいずれか
のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換したもののみなら
ず、アルカリプロテアーゼ活性を失わない限り、該アミ
ノ酸配列中の他の位置において１〜数個のアミノ酸残基
が欠失、置換又は付加されたものも包含する。

【００１９】本発明変異アルカリプロテアーゼの製造
は、親アルカリプロテアーゼに対して目的の変異を導入
すればよく、例えば以下の方法により行われる。すなわ
ち、クローニングにより取得された親アルカリプロテア
ーゼ（例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列を有す
るアルカリプロテアーゼ）をコードする遺伝子（配列番
号２）に対して置換（以下、「変異」ともいう）を施
し、得られた変異遺伝子を含むプラスミドを用いて適当
な宿主菌を形質転換し、組換え菌を培養することで培養
物から本発明変異アルカリプロテアーゼを採取すること
ができる。尚、野生型高アルカリプロテアーゼをコード
する遺伝子のクローニングは、ショットガン法、ＰＣＲ
法など一般的な方法により得ることができる。

【００２０】親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝
子に変異を導入する方法としては、エラープロンＰＣＲ
法や部位特異的変異法などを用いることができる。例え
ば市販されているSite-Directed Mutagenesis System M
utan-Super Express Km kit(Takara)等を使用できる。
変異を導入した遺伝子は、宿主菌体内で複製維持が可能
であり、当該遺伝子を安定に保持できるベクターに組込
まれ、この組換えプラスミドを用いて宿主菌を形質転換
すればよい。

【００２１】ここで用いることのできるベクターとして
は、大腸菌を宿主菌とする場合、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３
２２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト本社）等が挙げら
れ、枯草菌を宿主菌とする場合、ｐＵＢ１１０、ｐＨＳ
Ｐ６４（Sumitomoら, Biosci. Biotechnol. Biochem.,
59, 2172-2175, 1995）、ｐＨＡ６４（特願平８−３２
３０５０号）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。

【００２２】宿主菌を形質転換するには、プロトプラス
ト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法
等を用いることができる。宿主菌としてはバチルス属
（枯草菌）等のグラム陽性細菌、大腸菌等のグラム陰性
細菌、ストレプトマイセス属等の放線菌、サッカロマイ
セス属等の酵母あるいはアスペルギルス属等のカビを用
いることができる。

【００２３】得られた形質転換株は、資化しうる炭素
源、窒素源、生育や酵素生産に必要な金属塩、ビタミ
ン、ミネラル等を含む培地を用いて適当な条件下で培養
すればよく、得られた培養物から一般的な方法により当
該酵素変異体を採取、精製を行い、凍結乾燥、噴霧乾
燥、結晶化等により必要な形態を得ることができる。

【００２４】かくして得られる本発明の変異アルカリプ
ロテアーゼは、親アルカリプロテアーゼに対して比活性
が極端に低下することなく酸化剤耐性が増強されてい
る。ここで、「比活性が極端に低下することなく」と
は、親アルカリプロテアーゼの相対比活性を１００％と
した場合に、相対比活性が４．０％以下にはならないこ
とをいい、「酸化剤耐性が増強される」とは、当該変異
アルカリプロテアーゼを適当量の過酸化水素を含む５０
ｍMホウ酸緩衝液（ｐH10）中に添加し、３０℃、１５分
間恒温した後、過剰な過酸化水素を除去し、合成基質法
により残存活性を測定した場合、同様に処理した親アル
カリプロテアーゼの残存活性に比べ高い値を示すことを
いう。そして、斯かる変異アルカリプロテアーゼは、段
落〔００１０〕に記載の親アルカリプロテアーゼの性質
を保持しているものが特に好ましい。

【００２５】

【実施例】実施例１ 高アルカリプロテアーゼ遺伝子の
変異体の作製 Ｋ−１６プロテアーゼをコードする遺伝子（配列番号
２）を組込んだプラスミドｐＨＹ６４１６［ｐＨＹ３０
０ＰＬＫにバチルス エスピー ＫＳＭ−６４株由来の
アルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域（Sumito
moら, Biosci. Biotechnol. Biochem., 59, 2172-2175,
1995）とその下流にＫ−１６をコードする構造遺伝子
を結合させたプラスミド］を鋳型にし、プロモーター領
域からＫ−１６プロテアーゼをコードする遺伝子に対し
エラープロンＰＣＲ法を用いてランダム変異を導入し
た。変異処理を施した遺伝子をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ
で処理し、同様に処理しておいたｐＨＹ３００ＰＬＫへ
組込んだ。これらの組換えプラスミドを用いて枯草菌Ba
cillussubtilis ISW1214 株を形質転換した（ChangとCo
hen, Mol. Gen. Genet., 168,111-115, 1979）。形質転
換株を３％ポリペプトンＳ（日本製薬）、０．５％酵母
エキス（Ｄｉｆｃｏ）、１％魚肉エキス（和光純薬）、
０．１５％リン酸２カリウム、０．０２％硫酸マグネシ
ウム７水和物、４％マルトース、１５μｇ／ｍＬテトラ
サイクリン（Ｓｉｇｍａ）から成る液体培地（ＰＭ培
地）で３０℃、４８時間、好気的に振盪培養を行った。
培養上清のプロテアーゼを用いて酸化剤耐性試験を行
い、野生型酵素より酸化剤耐性能の向上した変異体を生
産している形質転換株を選抜した。

【００２６】実施例２ 変異点の確認 実施例１で取得した酸化剤耐性が増強した高アルカリプ
ロテアーゼ変異体をコードする遺伝子の塩基配列を決定
するために選抜された形質転換株からHigh pure plasmi
d isolation kit（ロッシュ：suspension bufferにはリ
ゾチームを添加した）を用いてプラスミドを回収した。
適当なプライマー、BigDye DNA Sequencing kit（アプ
ライド バイオシステム）並びにＤＮＡシークエンサー
（３７７型、アプライド バイオシステム）を用いて塩
基配列を決定した。その結果、酸化剤耐性が増強した変
異体は、配列番号１に示すアミノ酸配列において２１１
位のロイシンがセリンに置換されていることが明らかに
なった。

【００２７】実施例３ 部位特異的変異法 次に、２１１位のロイシンをセリン以外のアミノ酸に置
換するために部位特異的変異を行った。部位特異的変異
の導入方法はＯＤＡ法（Hashimoto-Gotoh ら,Gene, 15
2, 271-276, 1995）を基にしてSite-directedMutagenes
is System Mutan-Super Express Km kit（Takara）のプ
ロトコールに準じて行った。鋳型ＤＮＡとしてプラスミ
ドｐＨＹ６４１６を用いた。また、プラスミドｐＨＹ６
４１６の約１．９ｋｂを増幅できるリン酸化プライマー
を用いて、ＰＣＲは２回に分けて行った。１回目のＰＣ
Ｒは、プライマー１（配列番号３）と変異導入用のプラ
イマー２〜１５（配列番号４−１７）を用い、反応条件
は、９４℃において２分間鋳型を変性させた後、９４℃
で１分間、５５℃で１分間、７２℃で3分間を１サイク
ルとしてこれを３０サイクル行った。HighPure PCR Pro
duct Purificationkit （ロッシュ）を用いて約１．９
ｋｂの増幅ＰＣＲ産物を精製した。得られた精製ＰＣＲ
産物をプライマーの代わりに添加して２回目ＰＣＲを行
った。反応条件は、９４℃において２分間鋳型を編成さ
せた後、９４℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で７
分間を１サイクルとしてこれを２８サイクル行った。得
られたＰＣＲ産物を精製し、DNALigation kit ver. 2
（Takara）にて自己閉環させた反応溶液でBacillus sub
tilis ANA-1（Leeら,Appl. Environ. Microbiol., 60,
3764-3773, 1994）を形質転換した。Ｋ１６プロテアー
ゼの２１１位を各種アミノ酸に改変した遺伝子を導入し
たプラスミドを保持する形質転換株は、ＰＭ培地にて培
養を行った。

【００２８】実施例４ 変異体の精製 各変異体の培養液を遠心分離（８０００×ｇ、１５分
間、５℃）し、得られた上清液を脱イオン水にて希釈し
た後、予め１ｍＭ塩化カルシウムを含む５０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて平衡化しておいたＳｕｐ
ｅｒＱカラム（２．５×８ｃｍ；東ソー）へ添着した。
全ての変異体は非吸着画分として得られ、これを限外濾
過（ＹＭ３メンブレン；アミコン）により加水濃縮をお
こなった。得られた濃縮液を予め１ｍＭ塩化カルシウム
を含む１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．５）にて平衡化
しておいたＣＭ−Ｂｉｏ−ＧｅｌＡカラム（１．５×１
０ｃｍ；バイオラッド）へ添着した。同緩衝液でカラム
を洗浄後、１００ｍＭまでの塩化カリウムによる濃度勾
配溶出法により、吸着したタンパク質を溶出した。プロ
テアーゼ活性画分は５０ｍＭ塩化カリウムの濃度付近に
溶出し、これを集めて限外濾過（ＹＭ３メンブレン）に
より加水濃縮を行った。得られた各変異体はＳＤＳ−電
気泳動により、分子量約２９ｋＤａの均一なタンパク質
であった。以上の精製により得られた各変異体の野生型
酵素に対する相対比活性を表１に示した。

【００２９】実施例５ 変異体の酸化剤耐性評価 精製した各変異体及び野生型酵素を０．０５〜１．０％
の過酸化水素が含まれる５０ｍMホウ酸緩衝液（ｐH１
０）中にて３０℃、１５分間恒温した。その後、過剰の
過酸化水素を除去するためにカタラーゼを添加した。こ
の反応液の一部を用いて合成基質法による活性測定を行
った。尚、過酸化水素を添加せずに同様の処理を行った
各酵素の残存活性値を１００％とし、過酸化水素添加系
における残存活性をその相対値として示した。表２に示
すように高濃度の過酸化水素の存在下においてもそれぞ
れの変異体の残存活性は野生型酵素のそれを大きく上回
っており、酸化剤耐性の増強が認められた。

【００３０】一連の活性測定に用いた合成基質法は以下
のように行った。即ち、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ９．０）、２ｍＭ塩化カルシウム、２．５ｍＭ合成基
質（N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide: Sig
ma）から成る反応液を３０℃、５分間恒温した後、酵素
液を加え１０分間反応を行った（全量０．５ｍＬ）。反
応停止には５％(w/v)クエン酸を２ｍＬ加え、攪拌後、
４２０ｎｍにおける吸光度を測定した。酵素１単位（un
it）は、上記反応条件下において１分間に１μmolのp-n
itroanilineを生成する量とした。

【００３１】

【表１】

【００３２】

【表２】

【００３３】

【発明の効果】本発明の変異アルカリプロテアーゼは、
酸化剤に対して安定であることから、酸化剤配合の衣料
用洗剤、自動食器洗浄機用洗剤中などでも安定に保存さ
れ、充分な効力を発揮できる。

【００３４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KAO CORPORATION <120> Mutant alkali protease <130> P01841404 <160> 17 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 269 <212> PRT <213> Bacillus sp. KSM-K16 <400> 1 AlaGln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala 1 5 10 15 HisAsn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 ThrGly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser 35 40 45 PheVal Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr 50 55 60 HisVal Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu 65 70 75 80 GlyVal Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala 85 90 95 SerGly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala 100 105 110 GlyAsn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser 115 120 125 ProSer Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly 130 135 140 ValLeu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser 145 150 155 160 TyrPro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln 165 170 175 AsnAsn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile 180 185 190 ValAla Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr 195 200 205 AlaSer Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val 210 215 220 AlaAla Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile 225 230 235 240 ArgAsn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Gly Leu Gly Asn Thr Asn Leu 245 250 255 TyrGly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg 260 265 <210> 2 <211> 807 <212> DNA <213> Bacillus sp. KSM-K16 <220> <221> CDS <222> (1)..(807) <400> 2 gcg caa tca gtg cca tgg gga att agc cgt gta caa gcccca gct gcc 48 Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln AlaPro Ala Ala 1 5 10 15 cat aac cgt gga ttg aca ggt tct ggt gta aaa gtt gctgtc ctc gat 96 His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val AlaVal Leu Asp 20 25 30 acg ggt att tcc acc cat cca gac tta aat att cgc ggtggt gct agc 144 Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg GlyGly Ala Ser 35 40 45 ttt gtg cca gga gaa cca tcc act caa gat gga aat ggacat ggc acg 192 Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn GlyHis Gly Thr 50 55 60 cat gtg gca ggg acg att gct gct tta aac aat tcg attggc gtt ctg 240 His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser IleGly Val Leu 65 70 75 80 ggc gta gca ccg agc gcg gaa cta tac gct gta aaa gtatta ggc gcg 288 Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys ValLeu Gly Ala 85 90 95 agc ggt tca ggt tcg gtc agc tcg att gcc caa gga ttggaa tgg gca 336 Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly LeuGlu Trp Ala 100 105 110 ggg aac aat ggc atg cac gtt gcg aat ttg agt tta ggaagc ccg tcg 384 Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu GlySer Pro Ser 115 120 125 ccg agt gca aca ctt gag caa gct gtt aat agc gct acttct aga ggc 432 Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala ThrSer Arg Gly 130 135 140 gtt ctt gtc gta gca gca tct ggt aat tca ggt gca ggctca atc agc 480 Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala GlySer Ile Ser 145 150 155 160 tat ccg gcc cgt tat gcg aac gca atg gca gtc gga gcgact gac caa 528 Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly AlaThr Asp Gln 165 170 175 aac aac aac cgc gct agc ttt tca cag tat gga gct gggctt gac att 576 Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala GlyLeu Asp Ile 180 185 190 gtc gcg cca ggt gtc aat gtg cag agc aca tac cca ggttca aca tat 624 Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro GlySer Thr Tyr 195 200 205 gcc agc tta aac ggt aca tcg atg gct act cct cat gttgca ggt gta 672 Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His ValAla Gly Val 210 215 220 gca gcc ctt gtt aaa caa aag aat cca tct tgg tcc aatgta caa atc 720 Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser AsnVal Gln Ile 225 230 235 240 cgc aat cat cta aag aat acg gca acg ggt tta gga aacacg aac ttg 768 Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Gly Leu Gly AsnThr Asn Leu 245 250 255 tat gga agc ggg ctt gtc aat gca gaa gcg gca acacgc 807 Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg 260 265 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 ctggaatgag tttgcttaac tttacc 26 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 tcgatgtacc gttcatgctg gcatatgttg 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 tcgatgtacc gtttgcgctg gcatatgttg 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 tcgatgtacc gttaaagctg gcatatgttg 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 tcgatgtacc gttatagctg gcatatgttg 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 tcgatgtacc gttctcgctg gcatatgttg 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 tcgatgtacc gttatcgctg gcatatgttg 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 tcgatgtacc gttacagctg gcatatgttg 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 tcgatgtacc gttcaagctg gcatatgttg 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 tcgatgtacc gttgtggctg gcatatgttg 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 tcgatgtacc gttttggctg gcatatgttg 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 tcgatgtacc gttttagctg gcatatgttg 30 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 15 tcgatgtacc gttatggctg gcatatgttg 30 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 16 tcgatgtacc gttattgctg gcatatgttg 30 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 17 tcgatgtacc gtttacgctg gcatatgttg 30

【図面の簡単な説明】

【図１】配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以
上の相同性を有するプロテアーゼのアミノ酸配列を整列
させた図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/54 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 佐伯 勝久 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 小林 徹 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA14 CA04 DA07 EA04 GA11 HA12 4B050 CC04 DD02 LL04 4B065 AA15Y AA19X AB01 AC14 CA33 CA57

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に示すアミノ酸配列と９０％
   以上の相同性をもつアミノ酸配列を有する高アルカリプ
   ロテアーゼについて、配列番号１の２１１位又はこれに
   相当する位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換
   した変異アルカリプロテアーゼ。
2. 【請求項２】 他のアミノ酸残基が、グルタミン酸、バ
   リン、アスパラギン酸、セリン、イソロイシン、システ
   イン、ヒスチジン、メチオニン、スレオニン、グルタミ
   ン、アスパラギン、チロシン、トリプトファン、アラニ
   ン及びフェニルアラニンから選ばれたものである請求項
   １記載の変異アルカリプロテアーゼ。
3. 【請求項３】 請求項１又は２記載の変異アルカリプロ
   テアーゼをコードする遺伝子。
4. 【請求項４】 請求項３記載の遺伝子を含有する組換え
   ベクター。
5. 【請求項５】 請求項４記載の組換えベクターを含有す
   る形質転換体。
6. 【請求項６】 宿主が微生物である請求項５記載の形質
   転換体。