JP2003304876A - 変異アルカリプロテアーゼ - Google Patents
変異アルカリプロテアーゼInfo
- Publication number
- JP2003304876A JP2003304876A JP2002112242A JP2002112242A JP2003304876A JP 2003304876 A JP2003304876 A JP 2003304876A JP 2002112242 A JP2002112242 A JP 2002112242A JP 2002112242 A JP2002112242 A JP 2002112242A JP 2003304876 A JP2003304876 A JP 2003304876A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- alkaline protease
- ala
- gly
- ser
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
0%以上の相同性をもつアミノ酸配列を有する高アルカ
リプロテアーゼについて、特定なアミノ酸配列の211
位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基を他のアミノ
酸残基に置換した変異アルカリプロテアーゼ;これをコ
ードする遺伝子。 【効果】 本発明の変異アルカリプロテアーゼは、酸化
剤配合の衣料用洗剤、自動食器洗浄機用洗剤中などでも
安定に保存され、充分な効力を発揮できる。
Description
有用な変異アルカリプロテアーゼに関する。
のアルカリプロテアーゼは、洗浄力の向上に不可欠な成
分であり、工業用酵素として最も生産量の多いプロテア
ーゼの中で重要な役割を果たしてきている。現在用いら
れている洗剤用アルカリプロテアーゼは、バチルス属細
菌に由来し、ズブチリシンファミリーに属するものであ
るが、中でも最適反応pHを11以上に有している高ア
ルカリプロテアーゼ(ClassI−S2に分類され(Siezen
ら, Protein Eng., 4, 719-737, 1991)、更にズブチリ
シンに分類されるアルカリプロテアーゼの中でhighalka
line proteaseとして細分される(SiezenとLeunissen,
Protein Sci., 6, 501-523,1997))であるサビナー
ゼ、カンナーゼ(ノボザイム)、マキサカル(ジェネン
コア)、ブラップ(ヘンケル)及びKAP(花王)等が
近年その主力となっている。
ゼを含むズブチリシンは、洗浄剤に配合されることもあ
る酸化剤に対して非常に感受性が高いという問題があっ
た。これに対しては、酸化剤に対する感受性が、酵素の
活性中心の一つである221位(ズブチリシンBPN’
におけるアミノ酸番号)のセリン残基に隣接する222
位のメチオニンが酸化されることに基づくものであるこ
とが解明され(Stauffer and Etson, J. Biol. Chem.,
244, 5333-5338, 1969)、222位のメチオニン残基を
非酸化性のアミノ酸残基に置換した酸化剤耐性能を有す
る変異ズブチリシンが開発され(特願昭59−1299
28号)、デュラザイム(ノボザイム)、マキサぺム
(ジェネンコア)といった酵素が上市されている。
222位のメチオニンを他のアミノ酸に置換した場合に
は、当該位置が活性中心に隣接することから比活性が極
端に低下するという新たな問題が生じており(Estell
ら, J. Biol. Chem., 260, 6518-6521, 1985)、酸化剤
耐性能を有し且つある程度の比活性を保持する酵素は、
未だ見出されていないのが現状である。
ることなく、酸化剤耐性を有する変異アルカリプロテア
ーゼを提供することを目的とする。
ける酸化剤の洗剤への配合量が欧米諸国に比べ低濃度で
あるためズブチリシンの222位のメチオニンを他のア
ミノ酸に置換しなくても、ある程度の酸化剤耐性が獲得
できれば、洗剤中での保存安定性等を増強できると考
え、高アルカリプロテアーゼの特性を維持しつつ新たに
酸化剤耐性が獲得された酵素の探索を行った結果、特定
のアミノ酸配列を有する高アルカリプロテアーゼの特定
位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異
体が、比活性の著しい低下を伴うことなく酸化剤耐性を
有していることを見出した。
ノ酸配列と90%以上の相同性をもつアミノ酸配列を有
する高アルカリプロテアーゼについて、配列番号1の2
11位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基を他のア
ミノ酸残基に置換した変異アルカリプロテアーゼ、及び
それをコードする遺伝子を提供するものである。
ー、該ベクターを含有する形質転換体を提供するもので
ある。
ゼは、配列番号1で示されるアミノ酸配列と90%以上
の相同性を有する高アルカリプロテアーゼを変異の対象
となるプロテアーゼ(以下、「親アルカリプロテアー
ゼ」ともいう)とし、当該配列番号1の211位又はこ
れに相当する位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に
置換してなるものであり、これらは野生型の変異体或い
は人為的に変異を施した変異体であってもよい。
に示すアミノ酸配列と90%以上の相同性を示すアルカ
リプロテアーゼとしては、野生型又は野生型の変異体で
あってもよく、その性質としては、SDS−ポリアクリ
ルアミド電気泳動法による分子量が28〜31kDaで
あることが好ましく、等電点電気泳動法による等電点が
pH8.5以上であることが好ましく、カゼインを基質
とした場合に最適反応pHがpH10.5〜12.5、
最適反応温度が40〜60℃であることが好ましい。ま
た、セリンプロテアーゼの阻害剤であるPMSFやDF
Pにより失活し、過酸化水素のような酸化剤に対し感受
性が高いことが好ましい。特に、SDS−ポリアクリル
アミド電気泳動法による分子量が28−30kDa、等
電点電気泳動法による等電点がpH10.5以上、カゼ
インを基質とした場合に最適反応pHがpH12.3付
近、最適反応温度が55℃であり、更にセリンプロテア
ーゼの阻害剤であるPMSFやDFPにより失活し、過
酸化水素のような酸化剤に対して特定の条件下において
速やかに失活する高アルカリプロテアーゼであるのが好
ましい。
1で示されるアミノ酸配列を有する高アルカリプロテア
ーゼ」としては、配列番号1に示されるアミノ酸配列を
有するK−16(KAP)[バチルス エスピー KS
M−K16(FERM BP−3376)由来、Hakama
daら, J. Ferment. Bioeng., 78, 105-108, 1994]が挙
げられ、これと90%以上の相同性を有する高アルカリ
プロテアーゼとしては、更に95%以上、特に97%以
上の相同性を有するものが好ましく、例えばNo.22
1(バチルス エスピー 221由来、Takamiら,Biosc
i. Biotechnol.Biochem., 56, 1455-1460, 1992)、サ
ビナーゼ(バチルス レンタス由来、Betzelら,J. Mol.
Biol., 223, 427-445, 1992)、PB92(バチルス
エスピーPB92由来、Laanら, Appl.Environ. Microb
iol., 57, 901-909, 1991)等のSiezenらにより
Class I−S2、さらにズブチリシンの中でhigh
alkaline proteaseに細分されるズブチリシン亜種等が
挙げられる。尚、アミノ酸配列の相同性はGENETY
X−WINのマキシマムマッチングやサーチホモロジー
等のプログラム(ソフトウェア開発)により計算するこ
とができる。
テアーゼの211位におけるアミノ酸残基はロイシンで
あり、配列番号1で示されるアミノ酸配列と90%以上
の相同性を有する親アルカリプロテアーゼにおいては、
配列番号1の211位に相当する位置のアミノ酸残基
は、ロイシン、プロリン、アルギニン、リジンのいずれ
かであるものが好ましく、特にロイシンであるものが好
ましい。
列と90%以上の相同性を有する親アルカリプロテアー
ゼの中で好ましいものとしては、上述した酵素学的性質
を有するもの(段落〔0010〕)及び/又は配列番号
1に示すアミノ酸配列と好ましくは95%以上、より好
ましくは97%以上の相同性を示すものであって、更に
配列番号1の211位に相当する位置のアミノ酸残基が
上記(段落〔0012〕)のものであるプロテアーゼが
挙げられ、特に当該酵素学的性質を有し(段落〔001
0〕)、配列番号1に示すアミノ酸配列と好ましくは9
5%以上、より好ましくは97%以上の相同性を示すも
のであり、且つ配列番号1の211位に相当する位置の
アミノ酸残基が上記(段落〔0012〕)のものである
プロテアーゼが好ましい。
ゼは、配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するプロ
テアーゼを親アルカリプロテアーゼとする場合には、当
該211位のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換したも
のであり、配列番号1で示されるアミノ酸配列と90%
以上の相同性を有するプロテアーゼ(配列番号1で示さ
れるアルカリプロテアーゼを除く)を親アルカリプロテ
アーゼとする場合には、配列番号1の211位に相当す
る位置のいずれかのアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換
したものである。
ミン酸、バリン、アスパラギン酸、セリン、イソロイシ
ン、システイン、ヒスチジン、メチオニン、スレオニ
ン、グルタミン、アスパラギン、チロシン、トリプトフ
ァン、アラニン及びフェニルアラニンから選ばれたもの
であるが、好ましくはグルタミン酸、バリン、アスパラ
ギン酸、セリン、イソロイシン、システイン、ヒスチジ
ンであり、特にグルタミン酸、バリン、アスパラギン酸
であるのが好ましい。
特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法
等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較
し、各アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列中に存在す
る保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えることにより
行うことができる。プロテアーゼのアミノ酸配列をこの
ような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中に
ある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各プ
ロテアーゼにおける配列中の位置を決めることが可能で
ある(図1)。相同位置は、三次元構造中で同位置に存
在すると考えられ、対象のプロテアーゼの特異的機能に
関して類似した効果を有することが推定できる。
(K−16(KAP))の211位に相当する位置及び
アミノ酸番号の具体例を、例えば前述したプロテアーゼ
No.221、サビナーゼ、プロテアーゼPB92につ
いて示せば、No.221では、211位(ロイシ
ン)、サビナーゼでは211位(ロイシン)、PB92
では211位(ロイシン)である。
には、上記211位又はこれに相当する位置のいずれか
のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換したもののみなら
ず、アルカリプロテアーゼ活性を失わない限り、該アミ
ノ酸配列中の他の位置において1〜数個のアミノ酸残基
が欠失、置換又は付加されたものも包含する。
は、親アルカリプロテアーゼに対して目的の変異を導入
すればよく、例えば以下の方法により行われる。すなわ
ち、クローニングにより取得された親アルカリプロテア
ーゼ(例えば配列番号1で示されるアミノ酸配列を有す
るアルカリプロテアーゼ)をコードする遺伝子(配列番
号2)に対して置換(以下、「変異」ともいう)を施
し、得られた変異遺伝子を含むプラスミドを用いて適当
な宿主菌を形質転換し、組換え菌を培養することで培養
物から本発明変異アルカリプロテアーゼを採取すること
ができる。尚、野生型高アルカリプロテアーゼをコード
する遺伝子のクローニングは、ショットガン法、PCR
法など一般的な方法により得ることができる。
子に変異を導入する方法としては、エラープロンPCR
法や部位特異的変異法などを用いることができる。例え
ば市販されているSite-Directed Mutagenesis System M
utan-Super Express Km kit(Takara)等を使用できる。
変異を導入した遺伝子は、宿主菌体内で複製維持が可能
であり、当該遺伝子を安定に保持できるベクターに組込
まれ、この組換えプラスミドを用いて宿主菌を形質転換
すればよい。
は、大腸菌を宿主菌とする場合、pUC18、pBR3
22、pHY300PLK(ヤクルト本社)等が挙げら
れ、枯草菌を宿主菌とする場合、pUB110、pHS
P64(Sumitomoら, Biosci. Biotechnol. Biochem.,
59, 2172-2175, 1995)、pHA64(特願平8−32
3050号)、pHY300PLK等が挙げられる。
ト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法
等を用いることができる。宿主菌としてはバチルス属
(枯草菌)等のグラム陽性細菌、大腸菌等のグラム陰性
細菌、ストレプトマイセス属等の放線菌、サッカロマイ
セス属等の酵母あるいはアスペルギルス属等のカビを用
いることができる。
源、窒素源、生育や酵素生産に必要な金属塩、ビタミ
ン、ミネラル等を含む培地を用いて適当な条件下で培養
すればよく、得られた培養物から一般的な方法により当
該酵素変異体を採取、精製を行い、凍結乾燥、噴霧乾
燥、結晶化等により必要な形態を得ることができる。
ロテアーゼは、親アルカリプロテアーゼに対して比活性
が極端に低下することなく酸化剤耐性が増強されてい
る。ここで、「比活性が極端に低下することなく」と
は、親アルカリプロテアーゼの相対比活性を100%と
した場合に、相対比活性が4.0%以下にはならないこ
とをいい、「酸化剤耐性が増強される」とは、当該変異
アルカリプロテアーゼを適当量の過酸化水素を含む50
mMホウ酸緩衝液(pH10)中に添加し、30℃、15分
間恒温した後、過剰な過酸化水素を除去し、合成基質法
により残存活性を測定した場合、同様に処理した親アル
カリプロテアーゼの残存活性に比べ高い値を示すことを
いう。そして、斯かる変異アルカリプロテアーゼは、段
落〔0010〕に記載の親アルカリプロテアーゼの性質
を保持しているものが特に好ましい。
変異体の作製 K−16プロテアーゼをコードする遺伝子(配列番号
2)を組込んだプラスミドpHY6416[pHY30
0PLKにバチルス エスピー KSM−64株由来の
アルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域(Sumito
moら, Biosci. Biotechnol. Biochem., 59, 2172-2175,
1995)とその下流にK−16をコードする構造遺伝子
を結合させたプラスミド]を鋳型にし、プロモーター領
域からK−16プロテアーゼをコードする遺伝子に対し
エラープロンPCR法を用いてランダム変異を導入し
た。変異処理を施した遺伝子をEcoRIとBamHI
で処理し、同様に処理しておいたpHY300PLKへ
組込んだ。これらの組換えプラスミドを用いて枯草菌Ba
cillussubtilis ISW1214 株を形質転換した(ChangとCo
hen, Mol. Gen. Genet., 168,111-115, 1979)。形質転
換株を3%ポリペプトンS(日本製薬)、0.5%酵母
エキス(Difco)、1%魚肉エキス(和光純薬)、
0.15%リン酸2カリウム、0.02%硫酸マグネシ
ウム7水和物、4%マルトース、15μg/mLテトラ
サイクリン(Sigma)から成る液体培地(PM培
地)で30℃、48時間、好気的に振盪培養を行った。
培養上清のプロテアーゼを用いて酸化剤耐性試験を行
い、野生型酵素より酸化剤耐性能の向上した変異体を生
産している形質転換株を選抜した。
ロテアーゼ変異体をコードする遺伝子の塩基配列を決定
するために選抜された形質転換株からHigh pure plasmi
d isolation kit(ロッシュ:suspension bufferにはリ
ゾチームを添加した)を用いてプラスミドを回収した。
適当なプライマー、BigDye DNA Sequencing kit(アプ
ライド バイオシステム)並びにDNAシークエンサー
(377型、アプライド バイオシステム)を用いて塩
基配列を決定した。その結果、酸化剤耐性が増強した変
異体は、配列番号1に示すアミノ酸配列において211
位のロイシンがセリンに置換されていることが明らかに
なった。
換するために部位特異的変異を行った。部位特異的変異
の導入方法はODA法(Hashimoto-Gotoh ら,Gene, 15
2, 271-276, 1995)を基にしてSite-directedMutagenes
is System Mutan-Super Express Km kit(Takara)のプ
ロトコールに準じて行った。鋳型DNAとしてプラスミ
ドpHY6416を用いた。また、プラスミドpHY6
416の約1.9kbを増幅できるリン酸化プライマー
を用いて、PCRは2回に分けて行った。1回目のPC
Rは、プライマー1(配列番号3)と変異導入用のプラ
イマー2〜15(配列番号4−17)を用い、反応条件
は、94℃において2分間鋳型を変性させた後、94℃
で1分間、55℃で1分間、72℃で3分間を1サイク
ルとしてこれを30サイクル行った。HighPure PCR Pro
duct Purificationkit (ロッシュ)を用いて約1.9
kbの増幅PCR産物を精製した。得られた精製PCR
産物をプライマーの代わりに添加して2回目PCRを行
った。反応条件は、94℃において2分間鋳型を編成さ
せた後、94℃で1分間、50℃で1分間、72℃で7
分間を1サイクルとしてこれを28サイクル行った。得
られたPCR産物を精製し、DNALigation kit ver. 2
(Takara)にて自己閉環させた反応溶液でBacillus sub
tilis ANA-1(Leeら,Appl. Environ. Microbiol., 60,
3764-3773, 1994)を形質転換した。K16プロテアー
ゼの211位を各種アミノ酸に改変した遺伝子を導入し
たプラスミドを保持する形質転換株は、PM培地にて培
養を行った。
間、5℃)し、得られた上清液を脱イオン水にて希釈し
た後、予め1mM塩化カルシウムを含む50mMトリス
塩酸緩衝液(pH8.0)にて平衡化しておいたSup
erQカラム(2.5×8cm;東ソー)へ添着した。
全ての変異体は非吸着画分として得られ、これを限外濾
過(YM3メンブレン;アミコン)により加水濃縮をお
こなった。得られた濃縮液を予め1mM塩化カルシウム
を含む10mMホウ酸緩衝液(pH9.5)にて平衡化
しておいたCM−Bio−GelAカラム(1.5×1
0cm;バイオラッド)へ添着した。同緩衝液でカラム
を洗浄後、100mMまでの塩化カリウムによる濃度勾
配溶出法により、吸着したタンパク質を溶出した。プロ
テアーゼ活性画分は50mM塩化カリウムの濃度付近に
溶出し、これを集めて限外濾過(YM3メンブレン)に
より加水濃縮を行った。得られた各変異体はSDS−電
気泳動により、分子量約29kDaの均一なタンパク質
であった。以上の精製により得られた各変異体の野生型
酵素に対する相対比活性を表1に示した。
の過酸化水素が含まれる50mMホウ酸緩衝液(pH1
0)中にて30℃、15分間恒温した。その後、過剰の
過酸化水素を除去するためにカタラーゼを添加した。こ
の反応液の一部を用いて合成基質法による活性測定を行
った。尚、過酸化水素を添加せずに同様の処理を行った
各酵素の残存活性値を100%とし、過酸化水素添加系
における残存活性をその相対値として示した。表2に示
すように高濃度の過酸化水素の存在下においてもそれぞ
れの変異体の残存活性は野生型酵素のそれを大きく上回
っており、酸化剤耐性の増強が認められた。
のように行った。即ち、50mMトリス塩酸緩衝液(p
H9.0)、2mM塩化カルシウム、2.5mM合成基
質(N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide: Sig
ma)から成る反応液を30℃、5分間恒温した後、酵素
液を加え10分間反応を行った(全量0.5mL)。反
応停止には5%(w/v)クエン酸を2mL加え、攪拌後、
420nmにおける吸光度を測定した。酵素1単位(un
it)は、上記反応条件下において1分間に1μmolのp-n
itroanilineを生成する量とした。
酸化剤に対して安定であることから、酸化剤配合の衣料
用洗剤、自動食器洗浄機用洗剤中などでも安定に保存さ
れ、充分な効力を発揮できる。
上の相同性を有するプロテアーゼのアミノ酸配列を整列
させた図である。
Claims (6)
- 【請求項1】 配列番号1に示すアミノ酸配列と90%
以上の相同性をもつアミノ酸配列を有する高アルカリプ
ロテアーゼについて、配列番号1の211位又はこれに
相当する位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換
した変異アルカリプロテアーゼ。 - 【請求項2】 他のアミノ酸残基が、グルタミン酸、バ
リン、アスパラギン酸、セリン、イソロイシン、システ
イン、ヒスチジン、メチオニン、スレオニン、グルタミ
ン、アスパラギン、チロシン、トリプトファン、アラニ
ン及びフェニルアラニンから選ばれたものである請求項
1記載の変異アルカリプロテアーゼ。 - 【請求項3】 請求項1又は2記載の変異アルカリプロ
テアーゼをコードする遺伝子。 - 【請求項4】 請求項3記載の遺伝子を含有する組換え
ベクター。 - 【請求項5】 請求項4記載の組換えベクターを含有す
る形質転換体。 - 【請求項6】 宿主が微生物である請求項5記載の形質
転換体。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2002112242A JP4348047B2 (ja) | 2002-04-15 | 2002-04-15 | 変異アルカリプロテアーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2002112242A JP4348047B2 (ja) | 2002-04-15 | 2002-04-15 | 変異アルカリプロテアーゼ |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2003304876A true JP2003304876A (ja) | 2003-10-28 |
JP4348047B2 JP4348047B2 (ja) | 2009-10-21 |
Family
ID=29394802
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002112242A Expired - Fee Related JP4348047B2 (ja) | 2002-04-15 | 2002-04-15 | 変異アルカリプロテアーゼ |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4348047B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11891590B2 (en) | 2018-01-16 | 2024-02-06 | Kao Corporation | Detergent for corneum-derived stains, and method for evaluating ability to degrade corneum-derived stains |
DE112020007244T5 (de) | 2020-05-28 | 2023-03-09 | Mitsubishi Electric Corporation | Halbleitereinrichtung, verfahren zum herstellen derselben, sowie elektrischer stromrichter |
-
2002
- 2002-04-15 JP JP2002112242A patent/JP4348047B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP4348047B2 (ja) | 2009-10-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3335623B2 (ja) | ズブチリシン変異体 | |
KR20220148187A (ko) | 성능-증진된 프로테아제 변이체 ⅶ | |
US20020102702A1 (en) | Protease variants and compositions | |
JP2015502141A (ja) | 性能強化され、かつ耐熱性のプロテアーゼ変異体 | |
US6803222B2 (en) | Alkaline proteases | |
JP4225721B2 (ja) | アルカリプロテアーゼ | |
JP4496192B2 (ja) | アルカリプロテアーゼ | |
EP0416967B1 (en) | Novel alkaline protease | |
JP2002218989A (ja) | アルカリプロテアーゼ | |
JP2003304876A (ja) | 変異アルカリプロテアーゼ | |
US6849440B2 (en) | Proteases from gram-positive organisms | |
JP2009159978A (ja) | アルカリプロテアーゼ | |
US6794179B2 (en) | Proteases from gram positive organisms | |
JP2004008085A (ja) | 変異アルカリプロテアーゼ | |
US7098021B2 (en) | Proteases from gram positive organisms | |
US6762039B2 (en) | Bacillus subtillis with an inactivated cysteine protease-1 | |
US6528255B1 (en) | Proteases from gram positive organisms | |
JP2004313043A (ja) | アルカリプロテアーゼ | |
Maeda et al. | Purification and characterization of a new metal protease which hydrolyzes the cyclic decapeptide, gramicidin S | |
Saeki et al. | Nucleotide and deduced amino acid sequences of a new subtilisin from an alkaliphilic Bacillus isolate | |
US20030157645A1 (en) | Subtilisin variants with improved characteristics | |
JP4324365B2 (ja) | アルカリプロテアーゼ | |
JP4054577B2 (ja) | アルカリプロテアーゼ生産菌 | |
US6489108B1 (en) | Proteases from gram positive organisms | |
WO2023090461A1 (ja) | タンパク質脱アミド酵素 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20041207 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080819 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081020 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090106 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090309 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090714 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090717 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120724 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120724 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130724 Year of fee payment: 4 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |