JP2003259893A - 微細自己集合体の製法 - Google Patents
微細自己集合体の製法Info
- Publication number
- JP2003259893A JP2003259893A JP2002061797A JP2002061797A JP2003259893A JP 2003259893 A JP2003259893 A JP 2003259893A JP 2002061797 A JP2002061797 A JP 2002061797A JP 2002061797 A JP2002061797 A JP 2002061797A JP 2003259893 A JP2003259893 A JP 2003259893A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sugar
- group
- formula
- self
- assembly
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/20—Carbocyclic rings
- C07H15/203—Monocyclic carbocyclic rings other than cyclohexane rings; Bicyclic carbocyclic ring systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
-
- D—TEXTILES; PAPER
- D01—NATURAL OR MAN-MADE THREADS OR FIBRES; SPINNING
- D01F—CHEMICAL FEATURES IN THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL FILAMENTS, THREADS, FIBRES, BRISTLES OR RIBBONS; APPARATUS SPECIALLY ADAPTED FOR THE MANUFACTURE OF CARBON FILAMENTS
- D01F9/00—Artificial filaments or the like of other substances; Manufacture thereof; Apparatus specially adapted for the manufacture of carbon filaments
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Textile Engineering (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 自己集合体の表面に存在する糖脂質を酵素
化学的な穏和な条件下で第２の糖を結合させて、新規な
糖鎖を表面に構築する。 【解決手段】 １）下記一般式 【化２】 （式中、Ｘ１はグリコシル基又は２〜２９の単糖が結合
したオリゴ糖残基を表し、Ｒは上記と同様である。）で
表わされる構造を有するＯ−グリコシド型糖脂質から成
る微細自己集合体、２）単糖又はその誘導体、及び３）
糖転移酵素又は糖分解酵素を水中で反応させる。
化学的な穏和な条件下で第２の糖を結合させて、新規な
糖鎖を表面に構築する。 【解決手段】 １）下記一般式 【化２】 （式中、Ｘ１はグリコシル基又は２〜２９の単糖が結合
したオリゴ糖残基を表し、Ｒは上記と同様である。）で
表わされる構造を有するＯ−グリコシド型糖脂質から成
る微細自己集合体、２）単糖又はその誘導体、及び３）
糖転移酵素又は糖分解酵素を水中で反応させる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、糖脂質が自発的
に集合して形成されるナノチューブ及びナノファイバー
のような微細自己集合体に、水溶液中穏和な条件にて、
酵素化学的に更に糖を付加させた微細自己集合体の製法
に関する。
に集合して形成されるナノチューブ及びナノファイバー
のような微細自己集合体に、水溶液中穏和な条件にて、
酵素化学的に更に糖を付加させた微細自己集合体の製法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来の天然植物資源から分離精製したカ
ルダノールを出発原料として合成されたグルコース置換
長鎖アルキルフェノール誘導体であるカルダニルグルコ
シドは、水中において加熱溶解し徐冷することで糖鎖の
水素結合によりナノチューブ状凝集体を形成することが
知られている（G. John, M. Masuda, Y. Okada, K. Yas
e, and T. Shimizu, Adv. Mat., 13, 715 (2001)）。本
発明者らは、このような自己集合体の製造方法（特願２
００１−３６３７６２、特願２００２−３５０３５等）
や糖鎖にオリゴ糖を用いた自己集合体（特願２００２−
４９２３８）を開示している。これらにおいては、糖鎖
として、グルコース、ガラクトース、マンノースなどの
単糖やラクトースなどの多糖類が用いられており、これ
らの凝集体の表面は、均一（同一）の糖で覆われてい
る。
ルダノールを出発原料として合成されたグルコース置換
長鎖アルキルフェノール誘導体であるカルダニルグルコ
シドは、水中において加熱溶解し徐冷することで糖鎖の
水素結合によりナノチューブ状凝集体を形成することが
知られている（G. John, M. Masuda, Y. Okada, K. Yas
e, and T. Shimizu, Adv. Mat., 13, 715 (2001)）。本
発明者らは、このような自己集合体の製造方法（特願２
００１−３６３７６２、特願２００２−３５０３５等）
や糖鎖にオリゴ糖を用いた自己集合体（特願２００２−
４９２３８）を開示している。これらにおいては、糖鎖
として、グルコース、ガラクトース、マンノースなどの
単糖やラクトースなどの多糖類が用いられており、これ
らの凝集体の表面は、均一（同一）の糖で覆われてい
る。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかし、２種類以上の
異なる種類の糖もしくは糖鎖を同時に有するナノチュー
ブ及びナノファイバーは知られていない。従来、固体表
面上への糖鎖の導入、あるいは、既に存在する糖に、別
の糖を導入する方法として、いわゆる固相合成法が知ら
れているが（例えば、眞鍋、伊藤、高分子、４７巻、９
６ページ、１９９８年）、ナノチューブ及びナノファイ
バーのような液晶と結晶の中間の性質を有する自己集合
体に対しては、固相合成による糖鎖の導入、修飾などは
おこなわれておらず、また、この固相合成法は、そのほ
とんどが、有機合成化学的アプローチである。
異なる種類の糖もしくは糖鎖を同時に有するナノチュー
ブ及びナノファイバーは知られていない。従来、固体表
面上への糖鎖の導入、あるいは、既に存在する糖に、別
の糖を導入する方法として、いわゆる固相合成法が知ら
れているが（例えば、眞鍋、伊藤、高分子、４７巻、９
６ページ、１９９８年）、ナノチューブ及びナノファイ
バーのような液晶と結晶の中間の性質を有する自己集合
体に対しては、固相合成による糖鎖の導入、修飾などは
おこなわれておらず、また、この固相合成法は、そのほ
とんどが、有機合成化学的アプローチである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、上述した従来
技術の実状に鑑みてなされたものであり、自己集合体の
表面に存在する糖脂質を酵素化学的な穏和な条件下で第
２の糖を結合させて、新規な糖鎖を表面に構築する方法
を提供する。また、この方法を繰り返すことにより糖鎖
を連続的に導入し、より複雑な糖鎖残基を構築すること
ができる。即ち、本発明は、下記一般式
技術の実状に鑑みてなされたものであり、自己集合体の
表面に存在する糖脂質を酵素化学的な穏和な条件下で第
２の糖を結合させて、新規な糖鎖を表面に構築する方法
を提供する。また、この方法を繰り返すことにより糖鎖
を連続的に導入し、より複雑な糖鎖残基を構築すること
ができる。即ち、本発明は、下記一般式
【化１】
（式中、Ｇは２〜３０の単糖が結合したオリゴ糖残基を
表し、Ｒは炭素数６〜２５の炭化水素基を表す。）で表
わされる構造を有するＯ−グリコシド型糖脂質から成る
微細自己集合体の製法であって、１）下記一般式
表し、Ｒは炭素数６〜２５の炭化水素基を表す。）で表
わされる構造を有するＯ−グリコシド型糖脂質から成る
微細自己集合体の製法であって、１）下記一般式
【化２】
（式中、Ｘ１はグリコシル基又は２〜２９の単糖が結合
したオリゴ糖残基を表し、Ｒは上記と同様である。）で
表わされる構造を有するＯ−グリコシド型糖脂質から成
る微細自己集合体、２）単糖又はその誘導体、及び３）
糖転移酵素又は糖分解酵素を水中で反応させることから
成る微細自己集合体の製法である。
したオリゴ糖残基を表し、Ｒは上記と同様である。）で
表わされる構造を有するＯ−グリコシド型糖脂質から成
る微細自己集合体、２）単糖又はその誘導体、及び３）
糖転移酵素又は糖分解酵素を水中で反応させることから
成る微細自己集合体の製法である。
【０００５】この方法において、１）下記一般式
【化２】
（式中、Ｘ１及びＲは上記と同様である。）で表わされ
る構造を有するＯ−グリコシド型糖脂質から成る微細自
己集合体、２）単糖と核酸の複合体、及び３）糖転移酵
素を水中で反応させてもよい。この糖転移酵素はガラク
トース転移酵素、シアル酸転移酵素、又はフコース転移
酵素であることが好ましく、この反応系が更に蛋白質を
含むことが好ましい。
る構造を有するＯ−グリコシド型糖脂質から成る微細自
己集合体、２）単糖と核酸の複合体、及び３）糖転移酵
素を水中で反応させてもよい。この糖転移酵素はガラク
トース転移酵素、シアル酸転移酵素、又はフコース転移
酵素であることが好ましく、この反応系が更に蛋白質を
含むことが好ましい。
【０００６】また、上記方法において、１）下記一般式
【化２】
（式中、Ｘ１及びＲは上記と同様である。）で表わされ
る構造を有するＯ−グリコシド型糖脂質から成る微細自
己集合体、２）置換されていてもよいアリール基と単糖
残基との結合体、及び３）糖分解酵素を水中で反応させ
てもよい。この糖分解酵素はアルファガラクトシダー
ゼ、ベータガラクトシダーゼ、シアリダーゼ、アルファ
グルコシダーゼ、又はベータグルコシダーゼであること
が好ましい。また、これらの製法において、前記反応を
多段階行うことにより、糖を多段階で導入してもよい。
る構造を有するＯ−グリコシド型糖脂質から成る微細自
己集合体、２）置換されていてもよいアリール基と単糖
残基との結合体、及び３）糖分解酵素を水中で反応させ
てもよい。この糖分解酵素はアルファガラクトシダー
ゼ、ベータガラクトシダーゼ、シアリダーゼ、アルファ
グルコシダーゼ、又はベータグルコシダーゼであること
が好ましい。また、これらの製法において、前記反応を
多段階行うことにより、糖を多段階で導入してもよい。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明で処理の対象となる自己凝
集体を構成する化合物は、下記一般式
集体を構成する化合物は、下記一般式
【化２】
で表わされるＯ−グリコシド型糖脂質である。本発明に
おいては、炭化水素基（Ｒ）は−Ｏ−Ｘ１基に対してｏ
位、ｍ位又はｐ位のいずれにあってもよいが、メタ
（ｍ）位にあることが好ましい。前記一般式（化２）に
おけるＸ１はグリコシル基又は２〜２９の単糖が結合し
たオリゴ糖残基、好ましくはグリコシル基又は２〜４の
単糖が結合したオリゴ糖残基２〜５、より好ましくはグ
リコシル基である。このようなものとしては、例えばグ
ルコピラノース、ガラクトピラノース、マンノピラノー
ス、アロピラノース、アルトロピラノース、グロピラノ
ース、イドピラノース、タロピラノースのようなアルド
ピラノース及び対応するアルドフラノースの還元末端の
水酸基から水素原子を除いた残基、ラクトース、メリビ
オース、セロビオース、及びガラクトシル−α（１→
４）ガラクトースなど市販で入手可能な化合物、又は化
学合成あるいは酵素合成で得られるオリゴ糖などが挙げ
られる。還元末端のアノマー位のグリコシド結合はα−
アノマー及びβ−アノマー及びそれらの混合物のいずれ
であってもよい。
おいては、炭化水素基（Ｒ）は−Ｏ−Ｘ１基に対してｏ
位、ｍ位又はｐ位のいずれにあってもよいが、メタ
（ｍ）位にあることが好ましい。前記一般式（化２）に
おけるＸ１はグリコシル基又は２〜２９の単糖が結合し
たオリゴ糖残基、好ましくはグリコシル基又は２〜４の
単糖が結合したオリゴ糖残基２〜５、より好ましくはグ
リコシル基である。このようなものとしては、例えばグ
ルコピラノース、ガラクトピラノース、マンノピラノー
ス、アロピラノース、アルトロピラノース、グロピラノ
ース、イドピラノース、タロピラノースのようなアルド
ピラノース及び対応するアルドフラノースの還元末端の
水酸基から水素原子を除いた残基、ラクトース、メリビ
オース、セロビオース、及びガラクトシル−α（１→
４）ガラクトースなど市販で入手可能な化合物、又は化
学合成あるいは酵素合成で得られるオリゴ糖などが挙げ
られる。還元末端のアノマー位のグリコシド結合はα−
アノマー及びβ−アノマー及びそれらの混合物のいずれ
であってもよい。
【０００８】一方、前記一般式（化１又は２）における
Ｒは、炭素数が６〜２５、好ましくは１４〜１６、より
好ましくは１５の炭化水素基であり、好ましくは飽和又
は二重結合を１〜５、好ましくは１〜３含む不飽和の脂
肪族炭化水素から成る脂肪族炭化水素である。この炭化
水素は好ましくは直鎖である。このような炭化水素基と
しては、例えば、ドデシル基、トリデシル基、テトラデ
シル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシ
ル基、オクタデシル基や、これらに不飽和結合としてモ
ノエン、ジエン、トリエンなどを含むものが挙げられる
が、原料の入手が容易であるという点で、８−ペンタデ
セニル基、８，１０−ペンタデカジエニル基、８，１
０、１２−ペンタデカトリエニル基が好ましい。
Ｒは、炭素数が６〜２５、好ましくは１４〜１６、より
好ましくは１５の炭化水素基であり、好ましくは飽和又
は二重結合を１〜５、好ましくは１〜３含む不飽和の脂
肪族炭化水素から成る脂肪族炭化水素である。この炭化
水素は好ましくは直鎖である。このような炭化水素基と
しては、例えば、ドデシル基、トリデシル基、テトラデ
シル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシ
ル基、オクタデシル基や、これらに不飽和結合としてモ
ノエン、ジエン、トリエンなどを含むものが挙げられる
が、原料の入手が容易であるという点で、８−ペンタデ
セニル基、８，１０−ペンタデカジエニル基、８，１
０、１２−ペンタデカトリエニル基が好ましい。
【０００９】前記一般式（化２）で表わされるＯ−グリ
コシド型糖脂質は例えば次に示す方法により製造するこ
とができる。水酸基がすべてアセチル基で保護されたオ
リゴ糖を一般式
コシド型糖脂質は例えば次に示す方法により製造するこ
とができる。水酸基がすべてアセチル基で保護されたオ
リゴ糖を一般式
【化３】
（式中、Ｒは前記と同様である。）で表わされる長鎖炭
化水素フェノールに添加し、水酸基部分にグリコシド結
合させ、次に糖残基のアセチル保護基を除去することに
より、糖置換長鎖炭化水素フェノール誘導体を得ること
ができる。アセチル化の手順として下記に一例を示す。
オリゴ糖をドライピリジンに溶解させ、無水酢酸を加
え、室温〜40℃で１時間〜1晩磁気撹拌する。この際、
ジメチルアミノピリジンを反応系に加えておくと反応が
速く進行する。トルエンとエタノール の混合溶媒で５
〜７回共沸させピリジンを除き、残渣をクロロホルムに
溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び水で数回洗
う。濃縮しシリカゲルカラムで精製し、濃縮して乾燥さ
せる。
化水素フェノールに添加し、水酸基部分にグリコシド結
合させ、次に糖残基のアセチル保護基を除去することに
より、糖置換長鎖炭化水素フェノール誘導体を得ること
ができる。アセチル化の手順として下記に一例を示す。
オリゴ糖をドライピリジンに溶解させ、無水酢酸を加
え、室温〜40℃で１時間〜1晩磁気撹拌する。この際、
ジメチルアミノピリジンを反応系に加えておくと反応が
速く進行する。トルエンとエタノール の混合溶媒で５
〜７回共沸させピリジンを除き、残渣をクロロホルムに
溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び水で数回洗
う。濃縮しシリカゲルカラムで精製し、濃縮して乾燥さ
せる。
【００１０】本発明においては微細自己集合体の製法に
特に制限はないが、上記Ｏ−グリコシド型糖脂質を水に
分散後、マントルヒーターを用いて加熱、約20分沸騰
し、室温まで自然冷却、微細自己集合体が出来るまで室
温に放置することにより得ることができる（特願２００
０−２７１１９２、特願２００１−３６３７６２等）。
特に制限はないが、上記Ｏ−グリコシド型糖脂質を水に
分散後、マントルヒーターを用いて加熱、約20分沸騰
し、室温まで自然冷却、微細自己集合体が出来るまで室
温に放置することにより得ることができる（特願２００
０−２７１１９２、特願２００１−３６３７６２等）。
【００１１】次に、本発明の微細自己集合体の合成法の
一例について説明する。まず、上記のようにして微細自
己集合体（基質）を形成させ、この基質をＨＥＰＥＳ緩
衝液やリン酸緩衝液中で、糖転移酵素又は糖加水分解酵
素、好ましくはの糖転移酵素存在下、単糖残基を含むド
ナーを基質に対して過剰量（例えば、基質に対して等重
量〜１００倍重量）用いて、室温〜５０℃、好ましくは
３５℃近辺で、１分〜３０日間、緩やかに浸透又は放置
して反応させる。このＨＥＰＥＳ緩衝液やリン酸緩衝液
の濃度は、好ましくは０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ、より好
ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭであり、ｐＨは、好まし
くは４〜８、より好ましくは６．５〜７．８である。酵
素の量は、基質に対して触媒量もしくは、過剰量（例え
ば、１００倍）であり、これをユニットで表すと、１ｍ
Ｕ〜１０００００００Ｕ、好ましくは１０ｍＵ〜１Ｕで
ある。
一例について説明する。まず、上記のようにして微細自
己集合体（基質）を形成させ、この基質をＨＥＰＥＳ緩
衝液やリン酸緩衝液中で、糖転移酵素又は糖加水分解酵
素、好ましくはの糖転移酵素存在下、単糖残基を含むド
ナーを基質に対して過剰量（例えば、基質に対して等重
量〜１００倍重量）用いて、室温〜５０℃、好ましくは
３５℃近辺で、１分〜３０日間、緩やかに浸透又は放置
して反応させる。このＨＥＰＥＳ緩衝液やリン酸緩衝液
の濃度は、好ましくは０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ、より好
ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭであり、ｐＨは、好まし
くは４〜８、より好ましくは６．５〜７．８である。酵
素の量は、基質に対して触媒量もしくは、過剰量（例え
ば、１００倍）であり、これをユニットで表すと、１ｍ
Ｕ〜１０００００００Ｕ、好ましくは１０ｍＵ〜１Ｕで
ある。
【００１２】この反応は用いる酵素により異なる。それ
ぞれの場合に分けて説明する。 （１）糖転移酵素を用いる場合：水中で、１）上記基
質、２）単糖と核酸の複合体、及び３）糖転移酵素を反
応させる。核酸としてはＵＤＰやＣＭＰなど用いる酵素
の反応性を考慮して選択する。複合体はこの核酸のリン
酸部位と単糖の主に１位の水酸基とが結合した複合体で
あり、リン酸部とナトリウムなどのアルカリ金属とが結
合したものでもよい。また必要に応じて、触媒量（例え
ば、ＵＤＰ−糖に対して１〜１０重量％）のＭｎ
２ ＋（例えば、ＭｎＣｌ２）を添加してもよい。このよ
うな複合体としては、例えば、ＵＤＰ−糖 (例えば、ur
idine 5’-diphosphogalactose)、ＣＭＰ−糖(例えば、
cytidine 5’-monophospho-N-acetylneuraminic acid)
などが挙げられる。糖移転酵素としては、例えば、ガラ
クトース転移酵素(国際生化学連合(IUB)酵素委員会報告
による番号：EC. 2.4.1.22)、シアル酸転移酵素(EC. 2.
4.99.1)、フコース転移酵素(EC. 2.4.1.69)などが挙げ
られる。
ぞれの場合に分けて説明する。 （１）糖転移酵素を用いる場合：水中で、１）上記基
質、２）単糖と核酸の複合体、及び３）糖転移酵素を反
応させる。核酸としてはＵＤＰやＣＭＰなど用いる酵素
の反応性を考慮して選択する。複合体はこの核酸のリン
酸部位と単糖の主に１位の水酸基とが結合した複合体で
あり、リン酸部とナトリウムなどのアルカリ金属とが結
合したものでもよい。また必要に応じて、触媒量（例え
ば、ＵＤＰ−糖に対して１〜１０重量％）のＭｎ
２ ＋（例えば、ＭｎＣｌ２）を添加してもよい。このよ
うな複合体としては、例えば、ＵＤＰ−糖 (例えば、ur
idine 5’-diphosphogalactose)、ＣＭＰ−糖(例えば、
cytidine 5’-monophospho-N-acetylneuraminic acid)
などが挙げられる。糖移転酵素としては、例えば、ガラ
クトース転移酵素(国際生化学連合(IUB)酵素委員会報告
による番号：EC. 2.4.1.22)、シアル酸転移酵素(EC. 2.
4.99.1)、フコース転移酵素(EC. 2.4.1.69)などが挙げ
られる。
【００１３】糖転移酵素を使用するときには、反応の経
過にともない生成するジリン酸誘導体を分解するための
アルカリフォスファターゼのような酵素（その量は、１
ｍＵ〜１００００Ｕ、好ましくは１０ｍＵ〜１０Ｕであ
る。）が必要となる場合がある。さらに、対象とする基
質の糖脂質（例えば、グルコース）に第２の糖を導入す
る場合には、ラクトアルブミンやアルブミンのような共
存蛋白質（通常は、糖転移酵素に対して等モル以上。）
が必要となる場合がある。この蛋白質は、任意成分であ
るが、反応液内において酵素と錯体を形成し、糖供給源
を微細自己集合体表面に存在する糖残基に転移させる働
きをすると考えられ、この蛋白質がないと、転移の効率
が大幅に減少する場合がある（Schanbacher, F. and Eb
ner, k. E., J. Biol. Chem., vol.245, pp5057 (197
0), Brew, K., et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
vol.59, pp491 (1968), Fitzgerald,D.K., et al., J.
Biol. Chem., vol.245, pp2103 (1970), Narimatsu,
H., etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.83, pp4
720 (1986)）。
過にともない生成するジリン酸誘導体を分解するための
アルカリフォスファターゼのような酵素（その量は、１
ｍＵ〜１００００Ｕ、好ましくは１０ｍＵ〜１０Ｕであ
る。）が必要となる場合がある。さらに、対象とする基
質の糖脂質（例えば、グルコース）に第２の糖を導入す
る場合には、ラクトアルブミンやアルブミンのような共
存蛋白質（通常は、糖転移酵素に対して等モル以上。）
が必要となる場合がある。この蛋白質は、任意成分であ
るが、反応液内において酵素と錯体を形成し、糖供給源
を微細自己集合体表面に存在する糖残基に転移させる働
きをすると考えられ、この蛋白質がないと、転移の効率
が大幅に減少する場合がある（Schanbacher, F. and Eb
ner, k. E., J. Biol. Chem., vol.245, pp5057 (197
0), Brew, K., et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
vol.59, pp491 (1968), Fitzgerald,D.K., et al., J.
Biol. Chem., vol.245, pp2103 (1970), Narimatsu,
H., etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.83, pp4
720 (1986)）。
【００１４】（２）糖加水分解酵素を用いる場合：水中
で、１）上記基質、２）置換されていてもよいアリール
基と単糖残基との結合体、及び３）糖分解酵素を水中で
反応させる。アリール基は糖残基と結合することにより
糖残基を活性化させ、糖加水分解酵素の攻撃を受けやす
くするものと考えられ、好ましくはフェニル基である。
この機能を強化するためにこのアリール基は例えばニト
ロ基のような置換基を有していてもよい。このような結
合体として、例えば、4-nitrophenyl 糖 (例えば、4-ni
trophenyl β-D-galactopyranoside)、2-nitrophenyl
糖 (例えば、2-nitrophenyl β-D-galactopyranosid
e)、umbelliferyl 糖 (例えば、umbelliferyl β-D-gal
actopyranoside)のように、糖のアグリコン部分に芳香
族を導入した活性化された糖が挙げられるが、フリーの
糖そのもの、又は、糖−別の糖(例えば、ラクトースな
ど)を用いても反応を行うこともできる。このような結
合体又は糖は糖加水分解酵素により分解され、分解され
た糖残基は基質（先の微細自己集合体）の糖に結合す
る。糖加水分解酵素としては、例えば、アルファガラク
トシダーゼ(EC. 3.2.1.22)、ベータガラクトシダーゼ(E
C. 3.2.1.23)、シアリダーゼ(EC. 3.2.1.18)、アルファ
グルコシダーゼ(EC. 3.2.1.20)、ベータグルコシダーゼ
(EC. 3.2.1.21)などが挙げられる。
で、１）上記基質、２）置換されていてもよいアリール
基と単糖残基との結合体、及び３）糖分解酵素を水中で
反応させる。アリール基は糖残基と結合することにより
糖残基を活性化させ、糖加水分解酵素の攻撃を受けやす
くするものと考えられ、好ましくはフェニル基である。
この機能を強化するためにこのアリール基は例えばニト
ロ基のような置換基を有していてもよい。このような結
合体として、例えば、4-nitrophenyl 糖 (例えば、4-ni
trophenyl β-D-galactopyranoside)、2-nitrophenyl
糖 (例えば、2-nitrophenyl β-D-galactopyranosid
e)、umbelliferyl 糖 (例えば、umbelliferyl β-D-gal
actopyranoside)のように、糖のアグリコン部分に芳香
族を導入した活性化された糖が挙げられるが、フリーの
糖そのもの、又は、糖−別の糖(例えば、ラクトースな
ど)を用いても反応を行うこともできる。このような結
合体又は糖は糖加水分解酵素により分解され、分解され
た糖残基は基質（先の微細自己集合体）の糖に結合す
る。糖加水分解酵素としては、例えば、アルファガラク
トシダーゼ(EC. 3.2.1.22)、ベータガラクトシダーゼ(E
C. 3.2.1.23)、シアリダーゼ(EC. 3.2.1.18)、アルファ
グルコシダーゼ(EC. 3.2.1.20)、ベータグルコシダーゼ
(EC. 3.2.1.21)などが挙げられる。
【００１５】このような酵素反応の好ましい反応時間
は、２４時間〜２４０時間である。酵素及びドナーは、
数回にわたり分割して加えてもよい。また、反応が進行
するに伴い、ｐＨが減少（酸性サイドに傾く）するた
め、０．１Ｎ ＫＯＨやＮａＯＨのような塩基性水溶液
で中和をすることが望ましい。ｐＨは、７．８を越えな
いようにするのが好ましい。反応後の生成物の精製に
は、５００−２００００ｒｐｍで１分〜１時間、遠心分
離する。未反応試薬を除くため、同一の緩衝液又は、蒸
留水などで数回洗浄をおこなう。このようにして、第２
の糖が導入したナノチューブ及びナノファイバーに対し
て、上記の方法を繰り返し行うことにより、既に存在す
る第２の糖に対して第３の糖を導入できる。これを繰り
返して、ｎ個の糖を順次導入し、糖鎖表面修飾ナノチュ
ーブ及びナノファイバーを構築できる。
は、２４時間〜２４０時間である。酵素及びドナーは、
数回にわたり分割して加えてもよい。また、反応が進行
するに伴い、ｐＨが減少（酸性サイドに傾く）するた
め、０．１Ｎ ＫＯＨやＮａＯＨのような塩基性水溶液
で中和をすることが望ましい。ｐＨは、７．８を越えな
いようにするのが好ましい。反応後の生成物の精製に
は、５００−２００００ｒｐｍで１分〜１時間、遠心分
離する。未反応試薬を除くため、同一の緩衝液又は、蒸
留水などで数回洗浄をおこなう。このようにして、第２
の糖が導入したナノチューブ及びナノファイバーに対し
て、上記の方法を繰り返し行うことにより、既に存在す
る第２の糖に対して第３の糖を導入できる。これを繰り
返して、ｎ個の糖を順次導入し、糖鎖表面修飾ナノチュ
ーブ及びナノファイバーを構築できる。
【００１６】糖鎖導入率を調べるためには、酵素反応終
了後、いったん、ナノチューブ及びナノファイバーを
０．１−１．０Ｍトリフルオロ酢酸のような強酸で、各
糖及びアグリコン部分のアルコールとに完全加水分解を
行い（８０〜１００℃、１０分〜５時間）、ここで、脂
溶性のアグリコン由来の長鎖芳香族アルコールを除去
し、水溶性の各構成糖を４−アミノ安息香酸エチルエス
テルのような蛍光発色団又は紫外可視発色団を酢酸−Ｂ
Ｈ３・ピリジン錯体中、５０−１００℃で１０分−３時
間反応させ、蛍光標識した各糖誘導体へと変換する。つ
ぎに、例えば、０．２Ｍホウ酸カリウム緩衝液（ｐＨ
８．９）／アセトニトリル（９３／７，ｖ／ｖ）、又
は、０．０２％ＴＦＡ／アセトニトリル（１：１，ｖ／
ｖ）などを溶離液に用い、逆相カラム（Ｃ−１８など）
で室温〜４０℃にてＨＰＬＣ分析を行うと、ガラクトー
ス、マンノース、グルコースなどが溶出され、それらの
ピーク面積より、各構成糖の割合を求めることができ
る。蛍光によるモニターは、Ｅｘ．３０５ｎｍ，Ｅｍ．
３６０ｎｍで、ＵＶによるモニターは、３０５ｎｍが好
ましい。通常、第２の糖の導入率は、１〜３０％程度で
ある。また、ＨＰＬＣ分析においては、スタンダードと
なる糖を上記と同様の方法により、サンプルと同時に誘
導体へと変換し、検量線を作成することが好ましい。
了後、いったん、ナノチューブ及びナノファイバーを
０．１−１．０Ｍトリフルオロ酢酸のような強酸で、各
糖及びアグリコン部分のアルコールとに完全加水分解を
行い（８０〜１００℃、１０分〜５時間）、ここで、脂
溶性のアグリコン由来の長鎖芳香族アルコールを除去
し、水溶性の各構成糖を４−アミノ安息香酸エチルエス
テルのような蛍光発色団又は紫外可視発色団を酢酸−Ｂ
Ｈ３・ピリジン錯体中、５０−１００℃で１０分−３時
間反応させ、蛍光標識した各糖誘導体へと変換する。つ
ぎに、例えば、０．２Ｍホウ酸カリウム緩衝液（ｐＨ
８．９）／アセトニトリル（９３／７，ｖ／ｖ）、又
は、０．０２％ＴＦＡ／アセトニトリル（１：１，ｖ／
ｖ）などを溶離液に用い、逆相カラム（Ｃ−１８など）
で室温〜４０℃にてＨＰＬＣ分析を行うと、ガラクトー
ス、マンノース、グルコースなどが溶出され、それらの
ピーク面積より、各構成糖の割合を求めることができ
る。蛍光によるモニターは、Ｅｘ．３０５ｎｍ，Ｅｍ．
３６０ｎｍで、ＵＶによるモニターは、３０５ｎｍが好
ましい。通常、第２の糖の導入率は、１〜３０％程度で
ある。また、ＨＰＬＣ分析においては、スタンダードと
なる糖を上記と同様の方法により、サンプルと同時に誘
導体へと変換し、検量線を作成することが好ましい。
【００１７】上記のＨＰＬＣ分析の他、ナノチューブ及
びナノファイバーに対して、新たに導入した糖を分析す
る方法として、蛍光標識したレクチンを利用することも
できる。使用するレクチンには、導入した糖に対応して
認識する標準レクチンが市販されている。例えば、グル
コースに対しては、例えば、concanavalin A由来（以
下、Ｃｏｎ Ａという。）の、ガラクトースに対して
は、Erythrina由来(以下、ECAという。)のレクチンがそ
れぞれ対応する。また、蛍光発色団には、ＦＩＴＣ標
識、ＴＲＩＴＣ標識、ｔｅｘａｓ ｒｅｄなどがあげら
れ、いずれもレクチンに結合したものが市販されてい
る。
びナノファイバーに対して、新たに導入した糖を分析す
る方法として、蛍光標識したレクチンを利用することも
できる。使用するレクチンには、導入した糖に対応して
認識する標準レクチンが市販されている。例えば、グル
コースに対しては、例えば、concanavalin A由来（以
下、Ｃｏｎ Ａという。）の、ガラクトースに対して
は、Erythrina由来(以下、ECAという。)のレクチンがそ
れぞれ対応する。また、蛍光発色団には、ＦＩＴＣ標
識、ＴＲＩＴＣ標識、ｔｅｘａｓ ｒｅｄなどがあげら
れ、いずれもレクチンに結合したものが市販されてい
る。
【００１８】上記蛍光標識したレクチンを用いた、糖残
基の確認は、次のようにしておこなう。上記記載の糖脂
質の自己集合化により形成されるナノチューブ及びナノ
ファイバー（基質）をＨＥＰＥＳ緩衝液やリン酸緩衝液
（いずれも、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ、通常は、１０ｍ
Ｍ〜１００ｍＭが好ましい。また、ｐＨは、４〜８であ
るが、ｐＨ６．５〜７．８が好ましい）中、市販の蛍光
標識レクチンを予想される糖残基に対して、等モル〜１
００倍等量となるよう加える。通常は、数種類のモル等
量の異なるレクチンを用意しておき、最適なものを選択
する。レクチンにＣｏｎ Ａを使用するときには、この
他に、マンガンイオン（通常は、１ｍＭ〜１００ｍＭ）
が必要である。３０分〜２日間、０℃〜４０℃で、ゆっ
くりと浸透させるか、放置して反応させる。通常は、２
０時間、室温下で放置する。反応終了後の「後処理」
は、前記記載の方法と同様である。また、該ファイバー
及びチューブの蛍光標識観察には、蛍光顕微鏡下でおこ
なう。
基の確認は、次のようにしておこなう。上記記載の糖脂
質の自己集合化により形成されるナノチューブ及びナノ
ファイバー（基質）をＨＥＰＥＳ緩衝液やリン酸緩衝液
（いずれも、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ、通常は、１０ｍ
Ｍ〜１００ｍＭが好ましい。また、ｐＨは、４〜８であ
るが、ｐＨ６．５〜７．８が好ましい）中、市販の蛍光
標識レクチンを予想される糖残基に対して、等モル〜１
００倍等量となるよう加える。通常は、数種類のモル等
量の異なるレクチンを用意しておき、最適なものを選択
する。レクチンにＣｏｎ Ａを使用するときには、この
他に、マンガンイオン（通常は、１ｍＭ〜１００ｍＭ）
が必要である。３０分〜２日間、０℃〜４０℃で、ゆっ
くりと浸透させるか、放置して反応させる。通常は、２
０時間、室温下で放置する。反応終了後の「後処理」
は、前記記載の方法と同様である。また、該ファイバー
及びチューブの蛍光標識観察には、蛍光顕微鏡下でおこ
なう。
【００１９】また、対照実験として、糖に対して結合能
を持たないレクチンを用いて、結合しないことの確認も
必要である。さらに、必要であれば、阻害実験もおこな
う。つまり、ナノチューブ及びナノファイバーの表面に
存在する糖と同一の糖を、等モル〜１００倍過剰に加え
ておき、これに、蛍光標識レクチンを加え、該ファイバ
ー及びチューブが標識されないことを確認することが好
ましい。必要に応じて、金コロイド微粒子などのレクチ
ンを用いて、電子顕微鏡下（ＴＥＭ，ＳＥＭなど）で、
直接、糖残基の存在を確認することもできる。実験の手
順は、上記と同様である。また、上記に記載の対照実験
や阻害実験も必要に応じておこなうことが好ましい。
を持たないレクチンを用いて、結合しないことの確認も
必要である。さらに、必要であれば、阻害実験もおこな
う。つまり、ナノチューブ及びナノファイバーの表面に
存在する糖と同一の糖を、等モル〜１００倍過剰に加え
ておき、これに、蛍光標識レクチンを加え、該ファイバ
ー及びチューブが標識されないことを確認することが好
ましい。必要に応じて、金コロイド微粒子などのレクチ
ンを用いて、電子顕微鏡下（ＴＥＭ，ＳＥＭなど）で、
直接、糖残基の存在を確認することもできる。実験の手
順は、上記と同様である。また、上記に記載の対照実験
や阻害実験も必要に応じておこなうことが好ましい。
【００２０】
【発明の効果】本発明のような微細自己集合体の構造
は、４６℃以上の温度及び有機溶媒の存在下では安定で
はなく、４６℃以下の温度で、水の中でのみ安定に存在
し得うる[cf. G. John, M. Masuda, Y. Okada, K. Yas
e, T. Shimizu, Advanced Materials, vol.13, pp715
(2001)]。このことは、仮に、該ナノチューブを修飾し
ようとするのであれば（例えば、該ナノチューブ表面
に、別の糖鎖を導入しようとするのであれば）、有機合
成化学的に種々の試薬を用い、有機溶媒中で糖を導入す
るか、もしくは、該ナノチューブが安定に存在し得る水
溶液中にて、酵素を用いてマイルドに糖を導入するかの
いずれかとなる。前者の場合、上記の理由により操作は
困難である。本発明の方法によれば、自己集合時の水中
もしくは、イオン強度の抑えられた緩衝液中で、有機溶
媒を何ら使用することなく、生体反応に類似するほど穏
和な条件で、酵素化学的に新規な糖もしくは糖鎖を導入
することができる。
は、４６℃以上の温度及び有機溶媒の存在下では安定で
はなく、４６℃以下の温度で、水の中でのみ安定に存在
し得うる[cf. G. John, M. Masuda, Y. Okada, K. Yas
e, T. Shimizu, Advanced Materials, vol.13, pp715
(2001)]。このことは、仮に、該ナノチューブを修飾し
ようとするのであれば（例えば、該ナノチューブ表面
に、別の糖鎖を導入しようとするのであれば）、有機合
成化学的に種々の試薬を用い、有機溶媒中で糖を導入す
るか、もしくは、該ナノチューブが安定に存在し得る水
溶液中にて、酵素を用いてマイルドに糖を導入するかの
いずれかとなる。前者の場合、上記の理由により操作は
困難である。本発明の方法によれば、自己集合時の水中
もしくは、イオン強度の抑えられた緩衝液中で、有機溶
媒を何ら使用することなく、生体反応に類似するほど穏
和な条件で、酵素化学的に新規な糖もしくは糖鎖を導入
することができる。
【００２１】また、本発明の方法によれば、一旦ナノフ
ァイバーのような微細自己集合体を形成させて、その糖
鎖に更に所望の糖鎖を結合させることができる。例え
ば、ＮｅｕＡｃアルファ２−３（又は６）Ｇａｌベータ
１−４ＧｌｃＮＡｃ（Y. Suzuki et al., J. Biol.Che
m., vol.261,pp17057-17061.）のようなインフルエンザ
ウイルスと結合できる天然のリガンド糖鎖をα２→６結
合で結合させることができれば、インフルエンザウイル
スなどの病原性ウイルスを、捕捉・中和できる。更に、
Ｏ−１５７又はそれの生産するベロ毒素と結合するＧａ
ｌアルファ１−４Ｇａｌの構造を有する糖鎖（K. Karls
son et al., J. Biol. Chem., vol.260, pp8545 (198
5).）をα１→４結合で導入できれば、病原性大腸菌O-1
57そのもの、もしくは、それの生産するベロ毒素を効果
的に結合できる。このように、導入する糖鎖として、意
義のある配列を有する糖鎖（これをリガンド糖鎖とい
う）を導入できれば、特定の有害ウイルス、病原性細
菌、毒素などを特異的に結合できるナノチューブ及びナ
ノファイバーを提供することができる。
ァイバーのような微細自己集合体を形成させて、その糖
鎖に更に所望の糖鎖を結合させることができる。例え
ば、ＮｅｕＡｃアルファ２−３（又は６）Ｇａｌベータ
１−４ＧｌｃＮＡｃ（Y. Suzuki et al., J. Biol.Che
m., vol.261,pp17057-17061.）のようなインフルエンザ
ウイルスと結合できる天然のリガンド糖鎖をα２→６結
合で結合させることができれば、インフルエンザウイル
スなどの病原性ウイルスを、捕捉・中和できる。更に、
Ｏ−１５７又はそれの生産するベロ毒素と結合するＧａ
ｌアルファ１−４Ｇａｌの構造を有する糖鎖（K. Karls
son et al., J. Biol. Chem., vol.260, pp8545 (198
5).）をα１→４結合で導入できれば、病原性大腸菌O-1
57そのもの、もしくは、それの生産するベロ毒素を効果
的に結合できる。このように、導入する糖鎖として、意
義のある配列を有する糖鎖（これをリガンド糖鎖とい
う）を導入できれば、特定の有害ウイルス、病原性細
菌、毒素などを特異的に結合できるナノチューブ及びナ
ノファイバーを提供することができる。
【００２２】
【実施例】以下、実施例にて本発明を例証するが、本発
明を限定することを意図するものではない。製造例１ カシューナッツオイルを約４００Ｐａで２回真空蒸留
し、２２０℃から２３５℃の沸点をもつ成分を集めてカ
ルダノールを得た。そのカルダノール１．５２ｇ（５ミ
リモル）を無水塩化メチレン（１０ｍｌ）に溶解させ、
２ｇのモレキュラーシーブ４Ａの存在下、β−Ｄ−グル
コースペンタアセテート３．９ｇ（５ミリモル）と三フ
ッ化ホウ素ジエチルエーテル０．６２ｍｌ（５ミリモ
ル）を加えた。この反応混合物を室温で２４時間かきま
ぜたのち、５％−炭酸水素ナトリウム水溶液中に注ぎ込
んだ。有機相を分別し、炭酸水素ナトリウム水溶液、続
いて水で洗浄したのち、無水硫酸ナトリウム上で乾燥さ
せた。有機溶媒を減圧下で完全に留去し、得られた粗生
成物をエタノールから再結晶させた。得られた生成固体
をヘキサン／酢酸エチル（容積比７／３）混合溶媒を溶
出液としてカラムクロマトグラフイーを行い、白色固体
の１−（Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドテトラアセテー
ト）カルダノール２．３６ｇ（収率７５％）を得た。 この生成物の物理的性質は次のとおりである。 薄層クロマトグラフイーのＲｆ値：Ｒｆ１＝０．４７ 融点：６０℃
明を限定することを意図するものではない。製造例１ カシューナッツオイルを約４００Ｐａで２回真空蒸留
し、２２０℃から２３５℃の沸点をもつ成分を集めてカ
ルダノールを得た。そのカルダノール１．５２ｇ（５ミ
リモル）を無水塩化メチレン（１０ｍｌ）に溶解させ、
２ｇのモレキュラーシーブ４Ａの存在下、β−Ｄ−グル
コースペンタアセテート３．９ｇ（５ミリモル）と三フ
ッ化ホウ素ジエチルエーテル０．６２ｍｌ（５ミリモ
ル）を加えた。この反応混合物を室温で２４時間かきま
ぜたのち、５％−炭酸水素ナトリウム水溶液中に注ぎ込
んだ。有機相を分別し、炭酸水素ナトリウム水溶液、続
いて水で洗浄したのち、無水硫酸ナトリウム上で乾燥さ
せた。有機溶媒を減圧下で完全に留去し、得られた粗生
成物をエタノールから再結晶させた。得られた生成固体
をヘキサン／酢酸エチル（容積比７／３）混合溶媒を溶
出液としてカラムクロマトグラフイーを行い、白色固体
の１−（Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドテトラアセテー
ト）カルダノール２．３６ｇ（収率７５％）を得た。 この生成物の物理的性質は次のとおりである。 薄層クロマトグラフイーのＲｆ値：Ｒｆ１＝０．４７ 融点：６０℃
【００２３】次に、４５質量％のトリメチルアミン水溶
液を４倍体積のメチルアルコールと混合させ、得られた
１−（Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドテトラアセテー
ト）カルダノール（１．２６ｇ、２ミリモル）と２４時
間反応させた。溶媒を減圧下、留去したのち、得られた
シロップ状残査をメチルアルコール／アセトニトリル
（体積比１／２）混合溶媒から結晶化させ、さらに同一
溶媒から再結晶することにより、目的とする脱アセチル
化した１−（Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド）カルダノ
ール（「カルダニルグルコシド」という。）をほぼ定量
的に白色固体０．８８ｇ（収率９５％）として得た。こ
の生成物の物理的性質は次のとおりである。 融点：１３２．５℃ このカルダニルグルコシドに、メタノール（和光純薬）
中、パラジウム（小島化学）の存在下、水素気流下で接
触水添を行い、飽和カルダニルβ-D-グルコピラノシド
を得た。
液を４倍体積のメチルアルコールと混合させ、得られた
１−（Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドテトラアセテー
ト）カルダノール（１．２６ｇ、２ミリモル）と２４時
間反応させた。溶媒を減圧下、留去したのち、得られた
シロップ状残査をメチルアルコール／アセトニトリル
（体積比１／２）混合溶媒から結晶化させ、さらに同一
溶媒から再結晶することにより、目的とする脱アセチル
化した１−（Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド）カルダノ
ール（「カルダニルグルコシド」という。）をほぼ定量
的に白色固体０．８８ｇ（収率９５％）として得た。こ
の生成物の物理的性質は次のとおりである。 融点：１３２．５℃ このカルダニルグルコシドに、メタノール（和光純薬）
中、パラジウム（小島化学）の存在下、水素気流下で接
触水添を行い、飽和カルダニルβ-D-グルコピラノシド
を得た。
【００２４】製造例２
超純水（ミリＱ）１００ｍｌの入った耐圧ガラス製のオ
ートクレーブ（耐圧硝子工業株式会社製、ハイパークラ
スターＴＥＭ−Ｖ１００、容量２００ｍｌ）に製造例１
で得た飽和カルダニルβ-D-グルコピラノシド（２．５
ｍｇ）を加え、Ｎ２ガスを導入して容器中の酸素ガスと
溶存酸素を除去した後、密閉した。攪拌しながら、昇温
速度２℃／分で、１１５℃（分散温度）まで加熱した。
この分散温度における系の加圧圧力は０．１２ＭＰａで
あった。この温度に溶液を２０分間保持（分散時間）、
ヒーターの電源を切り自然に室温まで冷却される条件
（冷却速度１．６℃／分）で室温（２５℃）に放置し
た。この温度で３日間保存した後、液中に綿状の浮遊物
（ナノファイバー）が肉眼で観察された。
ートクレーブ（耐圧硝子工業株式会社製、ハイパークラ
スターＴＥＭ−Ｖ１００、容量２００ｍｌ）に製造例１
で得た飽和カルダニルβ-D-グルコピラノシド（２．５
ｍｇ）を加え、Ｎ２ガスを導入して容器中の酸素ガスと
溶存酸素を除去した後、密閉した。攪拌しながら、昇温
速度２℃／分で、１１５℃（分散温度）まで加熱した。
この分散温度における系の加圧圧力は０．１２ＭＰａで
あった。この温度に溶液を２０分間保持（分散時間）、
ヒーターの電源を切り自然に室温まで冷却される条件
（冷却速度１．６℃／分）で室温（２５℃）に放置し
た。この温度で３日間保存した後、液中に綿状の浮遊物
（ナノファイバー）が肉眼で観察された。
【００２５】実施例１
製造例１で得たナノファイバー３ｍｇを１０ｍＭのＨＥ
ＰＥＳ緩衝液（関東化学製（18356-40)、ｐＨ７．４，
０．４ｍＬ）にけん濁させ、これに、４ｍｇのUDP-α-D
-galactopyranoside 2Na塩（CalBioChem社製(67011
1)）、０．４ｍｇのα−ラクトアルブミン（Sigma製(L5
385)）、１５ｍＵのβ−1,4-galactosyltransferase（C
alBioChem社製(345649)）、５ｍＭのＭｎＣｌ２（関東
化学製(25009-30)）、２Ｕのアルカリフォスファターゼ
（和光純薬製（016-14631)）を加え、２５℃で２４時間
インキュベートした。反応混合液を６４００ｒｐｍで遠
心分離し（約１０分、ミリポア、チビタン使用）、上澄
液を捨て、残さに上記の緩衝液及び試薬をすべて加え、
同温、同時間インキュベートした。これを合計三回繰り
返した。これにより、ナノファイバー表面に存在するグ
ルコース残基にガラクトースを導入した。ここで、UDP-
α-D-galactopyranoside 2Na塩は付加する単糖であるガ
ラクトースの供給源であり、β−1,4-galactosyltransf
eraseは転移酵素であり、α−ラクトアルブミンは反応
液内においてこの酵素と錯体を形成し、ガラクトースを
ナノファイバー表面に存在するグルコース残基に対して
４位に選択的に転移させる働きをすると考えられる。
ＰＥＳ緩衝液（関東化学製（18356-40)、ｐＨ７．４，
０．４ｍＬ）にけん濁させ、これに、４ｍｇのUDP-α-D
-galactopyranoside 2Na塩（CalBioChem社製(67011
1)）、０．４ｍｇのα−ラクトアルブミン（Sigma製(L5
385)）、１５ｍＵのβ−1,4-galactosyltransferase（C
alBioChem社製(345649)）、５ｍＭのＭｎＣｌ２（関東
化学製(25009-30)）、２Ｕのアルカリフォスファターゼ
（和光純薬製（016-14631)）を加え、２５℃で２４時間
インキュベートした。反応混合液を６４００ｒｐｍで遠
心分離し（約１０分、ミリポア、チビタン使用）、上澄
液を捨て、残さに上記の緩衝液及び試薬をすべて加え、
同温、同時間インキュベートした。これを合計三回繰り
返した。これにより、ナノファイバー表面に存在するグ
ルコース残基にガラクトースを導入した。ここで、UDP-
α-D-galactopyranoside 2Na塩は付加する単糖であるガ
ラクトースの供給源であり、β−1,4-galactosyltransf
eraseは転移酵素であり、α−ラクトアルブミンは反応
液内においてこの酵素と錯体を形成し、ガラクトースを
ナノファイバー表面に存在するグルコース残基に対して
４位に選択的に転移させる働きをすると考えられる。
【００２６】次に、ナノファイバー表面に存在するグル
コース残基にガラクトースを導入したことを確認するた
めに、ＡＢＥＥ糖鎖標識化キット（生化学工業製(40087
1)）を用いて、糖導入率を測定した。１０μｌの８Ｍ
ＴＦＡに、上記サンプル３００μｇを加え、１００℃で
３時間加熱した。室温にまで冷却後、６４００ｒｐｍで
遠心分離し（約１０分）、残さを１００℃で加熱乾燥さ
せた。乾固した残さを４０μｌの２−プロパノールに溶
かし、再び減圧濃縮した。その残さに、予めメタノール
に溶解した蛍光標識薬４−アミノベンゾイルエチルエス
テルを１６．８ｍｇとなるように加え、酢酸１７０μ
ｌ，ｐｙｒｉｄｉｎｅ・ＢＨ３ ｃｏｍｐｌｅｘ ３．５
８ｍｇとなるように加え、８０℃で６０分反応させた。
反応後、室温に放置し、それぞれ２００μｌの蒸留水と
クロロホルムを加え、分液し、１０００ｒｐｍで遠心
し、水溶液画分を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）分析に供した。
コース残基にガラクトースを導入したことを確認するた
めに、ＡＢＥＥ糖鎖標識化キット（生化学工業製(40087
1)）を用いて、糖導入率を測定した。１０μｌの８Ｍ
ＴＦＡに、上記サンプル３００μｇを加え、１００℃で
３時間加熱した。室温にまで冷却後、６４００ｒｐｍで
遠心分離し（約１０分）、残さを１００℃で加熱乾燥さ
せた。乾固した残さを４０μｌの２−プロパノールに溶
かし、再び減圧濃縮した。その残さに、予めメタノール
に溶解した蛍光標識薬４−アミノベンゾイルエチルエス
テルを１６．８ｍｇとなるように加え、酢酸１７０μ
ｌ，ｐｙｒｉｄｉｎｅ・ＢＨ３ ｃｏｍｐｌｅｘ ３．５
８ｍｇとなるように加え、８０℃で６０分反応させた。
反応後、室温に放置し、それぞれ２００μｌの蒸留水と
クロロホルムを加え、分液し、１０００ｒｐｍで遠心
し、水溶液画分を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）分析に供した。
【００２７】ＨＰＬＣ分析において、カラムには、Ｈｏ
ｎｅｎｐａｋ Ｃ１８（ホーネン（株）製(800445)、７
５ｍｍ×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．）を用い、４０℃で１．
０ｍｌ／ｍｉｎの流速で、溶出した。Ｅｘ．３０５ｎ
ｍ，Ｅｍ．３６０ｎｍでモニターした。同時に、３０５
ｎｍのＵＶでもモニターした。７％のアセトニトリルを
含む０．２Ｍホウ酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．９）を溶
離液に用いた。その結果を表１に示す。
ｎｅｎｐａｋ Ｃ１８（ホーネン（株）製(800445)、７
５ｍｍ×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．）を用い、４０℃で１．
０ｍｌ／ｍｉｎの流速で、溶出した。Ｅｘ．３０５ｎ
ｍ，Ｅｍ．３６０ｎｍでモニターした。同時に、３０５
ｎｍのＵＶでもモニターした。７％のアセトニトリルを
含む０．２Ｍホウ酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．９）を溶
離液に用いた。その結果を表１に示す。
【表１】
この結果より、このナノファイバーには、６．６％のガ
ラクトースが新たに導入されたことがわかる。残り（９
３．４％）は、もともとナノファイバー表面に存在した
グルコースである。
ラクトースが新たに導入されたことがわかる。残り（９
３．４％）は、もともとナノファイバー表面に存在した
グルコースである。
【００２８】次に、ナノファイバー表面に導入されたガ
ラクトースを直接確認するため、標識したレクチンをガ
ラクトースと結合させて、蛍光顕微鏡により観察した。
蛍光標識したレクチン（Sigma社製(L3391)、ＦＩＴＣ標
識したＥｒｙｔｈｒｉｎａ由来のレクチンで、β−ガラ
クトース残基に対して結合能（アフィニティー）を有す
る蛍光標識された蛋白質）０．１ｍｇをとり、これを
０．５ｍｌの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）緩衝
液に溶解した。次に、上記で作成した該ナノファイバー
を約０．１ｍｇとり、同緩衝液で数回置換し、先の蛍光
レクチン溶液を３００μｌ加えた。混合物を１８時間放
置し、上記と同様にして遠心分離を行い、残さに２００
μｌの同ＨＥＰＥＳ緩衝液を加え、蛍光顕微鏡及び通常
の光学顕微鏡で観察した（図１）。また、グルコース残
基を特異的に認識できる別のＦＩＴＣ標識レクチン（Co
nA、Sigma社製（C7642)）を用い、上記と同様の観察を
行った（図２）。これらから、繊維状の像が観察され、
ナノファイバー表面に存在するグルコース残基にガラク
トースが導入されたことが直接確認された。
ラクトースを直接確認するため、標識したレクチンをガ
ラクトースと結合させて、蛍光顕微鏡により観察した。
蛍光標識したレクチン（Sigma社製(L3391)、ＦＩＴＣ標
識したＥｒｙｔｈｒｉｎａ由来のレクチンで、β−ガラ
クトース残基に対して結合能（アフィニティー）を有す
る蛍光標識された蛋白質）０．１ｍｇをとり、これを
０．５ｍｌの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）緩衝
液に溶解した。次に、上記で作成した該ナノファイバー
を約０．１ｍｇとり、同緩衝液で数回置換し、先の蛍光
レクチン溶液を３００μｌ加えた。混合物を１８時間放
置し、上記と同様にして遠心分離を行い、残さに２００
μｌの同ＨＥＰＥＳ緩衝液を加え、蛍光顕微鏡及び通常
の光学顕微鏡で観察した（図１）。また、グルコース残
基を特異的に認識できる別のＦＩＴＣ標識レクチン（Co
nA、Sigma社製（C7642)）を用い、上記と同様の観察を
行った（図２）。これらから、繊維状の像が観察され、
ナノファイバー表面に存在するグルコース残基にガラク
トースが導入されたことが直接確認された。
【図１】ナノファイバー表面に存在するグルコース残基
に導入されたガラクトースと、蛍光標識したレクチンと
を結合させたものの蛍光顕微鏡写真（縦７５μｍ×横１
００μｍ）を示す図である。
に導入されたガラクトースと、蛍光標識したレクチンと
を結合させたものの蛍光顕微鏡写真（縦７５μｍ×横１
００μｍ）を示す図である。
【図２】ナノファイバー表面に存在するグルコース残基
に導入されたガラクトースと、ＦＩＴＣ標識したレクチ
ンとを結合させたものの蛍光顕微鏡写真（縦７５μｍ×
横１００μｍ）を示す図である。
に導入されたガラクトースと、ＦＩＴＣ標識したレクチ
ンとを結合させたものの蛍光顕微鏡写真（縦７５μｍ×
横１００μｍ）を示す図である。
【手続補正書】
【提出日】平成１５年４月２８日（２００３．４．２
８）
８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【化１】
（式中、Ｇは２〜６の単糖が結合したオリゴ糖残基を表
し、Ｒは炭素数６〜２５の炭化水素基を表し、炭化水素
基（Ｒ）は−Ｏ−Ｇ基に対してメタ位にある。）で表わ
される構造を有するＯ−グリコシド型糖脂質から成る微
細自己集合体の製法であって、１）下記一般式
し、Ｒは炭素数６〜２５の炭化水素基を表し、炭化水素
基（Ｒ）は−Ｏ−Ｇ基に対してメタ位にある。）で表わ
される構造を有するＯ−グリコシド型糖脂質から成る微
細自己集合体の製法であって、１）下記一般式
【化２】
（式中、Ｘ１はグリコシル基又は２〜５の単糖が結合し
たオリゴ糖残基を表し、Ｒは上記と同様であり、炭化水
素基（Ｒ）は−Ｏ−Ｘ１基に対してメタ位にある。）で
表わされる構造を有するＯ−グリコシド型糖脂質から成
る微細自己集合体、２）単糖、及び３）糖転移酵素又は
糖分解酵素を水中で反応させることから成る微細自己集
合体の製法。
たオリゴ糖残基を表し、Ｒは上記と同様であり、炭化水
素基（Ｒ）は−Ｏ−Ｘ１基に対してメタ位にある。）で
表わされる構造を有するＯ−グリコシド型糖脂質から成
る微細自己集合体、２）単糖、及び３）糖転移酵素又は
糖分解酵素を水中で反応させることから成る微細自己集
合体の製法。
【化２】
（式中、Ｘ１及びＲは上記と同様である。）で表わされ
る構造を有するＯ−グリコシド型糖脂質から成る微細自
己集合体、２）単糖と核酸の複合体、及び３）糖転移酵
素を水中で反応させることから成る請求項１に記載の製
法。
る構造を有するＯ−グリコシド型糖脂質から成る微細自
己集合体、２）単糖と核酸の複合体、及び３）糖転移酵
素を水中で反応させることから成る請求項１に記載の製
法。
【化２】
（式中、Ｘ１及びＲは上記と同様である。）で表わされ
る構造を有するＯ−グリコシド型糖脂質から成る微細自
己集合体、２）置換されていてもよいアリール基と単糖
残基との結合体、及び３）糖分解酵素を水中で反応させ
ることから成る請求項１に記載の製法。
る構造を有するＯ−グリコシド型糖脂質から成る微細自
己集合体、２）置換されていてもよいアリール基と単糖
残基との結合体、及び３）糖分解酵素を水中で反応させ
ることから成る請求項１に記載の製法。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 清水 敏美
茨城県つくば市東１−１−１ 独立行政法
人産業技術総合研究所つくばセンター内
(72)発明者 曽 暁雄
茨城県つくば市二の宮１−６−２ 二の宮
ハウス5205
(72)発明者 箕浦 憲彦
茨城県つくば市東１−１−１ 独立行政法
人産業技術総合研究所つくばセンター内
(72)発明者 ジョージ，ジョン
茨城県つくば市東１−１−４ 研究協力セ
ンターＦＢ101
Ｆターム(参考） 4B064 AF41 CA21 CC03 CD09 DA16
Claims (9)
- 【請求項１】 下記一般式 【化１】 （式中、Ｇは２〜３０の単糖が結合したオリゴ糖残基を
表し、Ｒは炭素数６〜２５の炭化水素基を表す。）で表
わされる構造を有するＯ−グリコシド型糖脂質から成る
微細自己集合体の製法であって、１）下記一般式 【化２】 （式中、Ｘ１はグリコシル基又は２〜２９の単糖が結合
したオリゴ糖残基を表し、Ｒは上記と同様である。）で
表わされる構造を有するＯ−グリコシド型糖脂質から成
る微細自己集合体、２）単糖又はその誘導体、及び３）
糖転移酵素又は糖分解酵素を水中で反応させることから
成る微細自己集合体の製法。 - 【請求項２】 １）下記一般式 【化２】 （式中、Ｘ１及びＲは上記と同様である。）で表わされ
る構造を有するＯ−グリコシド型糖脂質から成る微細自
己集合体、２）単糖と核酸の複合体、及び３）糖転移酵
素を水中で反応させることから成る請求項１に記載の製
法。 - 【請求項３】 前記糖転移酵素がガラクトース転移酵
素、シアル酸転移酵素、又はフコース転移酵素である請
求項２に記載の製法。 - 【請求項４】 反応系が更に蛋白質を含む請求項２又は
３に記載の製法。 - 【請求項５】 １）下記一般式 【化２】 （式中、Ｘ１及びＲは上記と同様である。）で表わされ
る構造を有するＯ−グリコシド型糖脂質から成る微細自
己集合体、２）置換されていてもよいアリール基と単糖
残基との結合体、及び３）糖分解酵素を水中で反応させ
ることから成る請求項１に記載の製法。 - 【請求項６】 前記糖分解酵素がアルファガラクトシダ
ーゼ、ベータガラクトシダーゼ、シアリダーゼ、アルフ
ァグルコシダーゼ、又はベータグルコシダーゼである請
求項５に記載の製法。 - 【請求項７】 前記アリール基がフェニル基である請求
項５又は６に記載の製法。 - 【請求項８】 前記反応を多段階行うことから成る請求
項１〜７のいずれか一項に記載の製法。 - 【請求項９】 前記一般式（化１）において、炭化水素
基（Ｒ）が−Ｏ−Ｇ基に対してメタ位にあり、前記一般
式（化２）において、炭化水素基（Ｒ）が−Ｏ−Ｘ１基
に対してメタ位にある請求項１〜８のいずれか一項に記
載の製法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002061797A JP4052553B2 (ja) | 2002-03-07 | 2002-03-07 | 微細自己集合体の製法 |
| PCT/JP2003/002298 WO2003074720A1 (fr) | 2002-03-07 | 2003-02-28 | Procede de production d'un auto-aggregat fin |
| EP03708474A EP1512750A4 (en) | 2002-03-07 | 2003-02-28 | PROCESS FOR PRODUCING A SELF-AGGREGATE END |
| US10/507,576 US20060240527A1 (en) | 2002-03-07 | 2003-02-28 | Process for producing fine self-aggregates |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002061797A JP4052553B2 (ja) | 2002-03-07 | 2002-03-07 | 微細自己集合体の製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003259893A true JP2003259893A (ja) | 2003-09-16 |
| JP4052553B2 JP4052553B2 (ja) | 2008-02-27 |
Family
ID=27784869
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002061797A Expired - Lifetime JP4052553B2 (ja) | 2002-03-07 | 2002-03-07 | 微細自己集合体の製法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20060240527A1 (ja) |
| EP (1) | EP1512750A4 (ja) |
| JP (1) | JP4052553B2 (ja) |
| WO (1) | WO2003074720A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009107683A1 (ja) | 2008-02-25 | 2009-09-03 | 保土谷化学工業株式会社 | 界面活性有機化合物を乳化剤として用いた水系エマルションの調製方法 |
| JP2009291715A (ja) * | 2008-06-05 | 2009-12-17 | Kao Corp | 無機粉の分離促進剤組成物 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09503905A (ja) * | 1993-07-15 | 1997-04-22 | ネオゼ ファーマシューティカルス | 糖組成物の合成方法 |
| JP3598367B2 (ja) * | 2000-09-07 | 2004-12-08 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 中空繊維状有機ナノチューブ及びその製造方法 |
| JP4048289B2 (ja) * | 2002-02-26 | 2008-02-20 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 微細自己集合体 |
-
2002
- 2002-03-07 JP JP2002061797A patent/JP4052553B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-02-28 EP EP03708474A patent/EP1512750A4/en not_active Withdrawn
- 2003-02-28 US US10/507,576 patent/US20060240527A1/en not_active Abandoned
- 2003-02-28 WO PCT/JP2003/002298 patent/WO2003074720A1/ja active Application Filing
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009107683A1 (ja) | 2008-02-25 | 2009-09-03 | 保土谷化学工業株式会社 | 界面活性有機化合物を乳化剤として用いた水系エマルションの調製方法 |
| US8551916B2 (en) | 2008-02-25 | 2013-10-08 | Hodogaya Chemical Co., Ltd. | Method for preparation of aqueous emulsion using interfacially active organic compound as emulsifying agent |
| JP2009291715A (ja) * | 2008-06-05 | 2009-12-17 | Kao Corp | 無機粉の分離促進剤組成物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4052553B2 (ja) | 2008-02-27 |
| WO2003074720A1 (fr) | 2003-09-12 |
| US20060240527A1 (en) | 2006-10-26 |
| EP1512750A4 (en) | 2009-05-13 |
| EP1512750A1 (en) | 2005-03-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Li et al. | Efficient chemoenzymatic synthesis of an N-glycan isomer library | |
| Ban et al. | On‐chip synthesis and label‐free assays of oligosaccharide arrays | |
| JP6602747B2 (ja) | 同位体標識されたグリカンの合成および使用 | |
| Bandara et al. | The chemical synthesis of human milk oligosaccharides: Lacto-N-tetraose (Galβ1→ 3GlcNAcβ1→ 3Galβ1→ 4Glc) | |
| de Paz et al. | Synthesis of a Ley neoglycoconjugate and Ley-functionalized gold glyconanoparticles | |
| Yan et al. | Polymer-supported and chemoenzymatic synthesis of the Neisseria meningitidis pentasaccharide: a methodological comparison | |
| JP4942014B2 (ja) | Ｏ−結合型糖アミノ酸 | |
| Ghirardello et al. | Recent applications of ionic liquid-based tags in glycoscience | |
| Furuike et al. | Chemical and enzymatic synthesis of glycocluster having seven sialyl lewis X arrays using β-cyclodextrin as a key scaffold material | |
| Ishii‐Karakasa et al. | Structural determination of the O‐linked sialyl oligosaccharides liberated from fetuin with endo‐α‐N‐acetylgalactosaminidase‐S by HPLC analysis and 600‐MHz 1H‐NMR spectroscopy | |
| JP4052553B2 (ja) | 微細自己集合体の製法 | |
| Watt et al. | The preparation of deoxy derivatives of mannose-1-phosphate and their substrate specificity towards recombinant GDP-mannose pyrophosphorylase from Salmonella enterica, group B | |
| Dinev et al. | A convenient gram-scale synthesis of uridine diphospho (13C6) glucose | |
| Murata et al. | Enzymic synthesis of 3′-O-and 6′-ON-acetylglucosaminyl-N-acetyllactosaminide glycosides catalyzed by β-N-acetyl-D-hexosaminidase from Nocardia orientalis | |
| Norberg et al. | Reversible derivatization of sugars with carbobenzyloxy groups and use of the derivatives in solution-phase enzymatic oligosaccharide synthesis | |
| JPH1023898A (ja) | Ｎ−アセチルラクトサミン誘導体の新規な製造法 | |
| Hokke et al. | Action of rat liver Galβ1-4GlcNAc α (2-6)-sialyltransferase on Manβ1-4GlcNAcβ-OMe, GalNAcβ1-4GlcNAcβ-OMe, Glcβ1-4GlcNAcβ-OMe and GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-OMe as synthetic substrates | |
| Bårström et al. | New derivatives of reducing oligosaccharides and their use in enzymatic reactions: efficient synthesis of sialyl Lewis a and sialyl dimeric Lewis x glycoconjugates | |
| Hanashima et al. | Synthesis of N-glycan units for assessment of substrate structural requirements of N-acetylglucosaminyltransferase III | |
| Zhang et al. | An Efficient and Concise Synthesis of a β-(1→ 6)-linked D-galactofuranosyl Hexasaccharide | |
| Bojarová et al. | N-Acetylhexosamine triad in one molecule: Chemoenzymatic introduction of 2-acetamido-2-deoxy-β-d-galactopyranosyluronic acid residue into a complex oligosaccharide | |
| Malleron et al. | Chemoenzymatic synthesis of the 3-sulfated Lewisa pentasaccharide | |
| Vilkman et al. | Elongation of both branches of biantennary backbones of oligo-(N-acetyllactosamino) glycans by human serum (1→ 3)-N-acetyl-β-D-glucosaminyltransferase | |
| JP6466321B2 (ja) | 活性化糖鎖誘導体の製造方法及び活性化糖鎖誘導体 | |
| JPWO2004104163A1 (ja) | α−選択的グリコシル化反応方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20031001 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20031127 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20031031 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20031212 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20031225 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20040224 |
|
| A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20040402 |
|
| RD05 | Notification of revocation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7425 Effective date: 20040914 |
|
| RD05 | Notification of revocation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7425 Effective date: 20040922 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20061019 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20061215 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20061220 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20071130 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101214 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4052553 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101214 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101214 Year of fee payment: 3 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |