JP2003199596A - 硫酸化フカンオリゴ糖 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ガゴメ（Ｋｊｅｌｌｍａｎｉｅｌｌａ ｃｒ
ａｓｓｉｆｏｌｉａ）などのコンブ目海藻由来である新
規な硫酸化多糖を分解する硫酸化フカン分解酵素を、硫
酸化フカンに作用させて得られる、構造が均一な低分子
化物及びその製造方法を提供すること。 【解決手段】 硫酸化フカン分解酵素を用いて、コンブ
目海藻由来の新規な硫酸化多糖を分解し、糖鎖工学用試
薬として利用できる、構造の均一な硫酸化フカンオリゴ
糖、該硫酸化フカンオリゴ糖を製造する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【本発明の属する技術分野】本発明は糖鎖工学分野にお
いて有用な硫酸化フカンオリゴ糖、及びその製造方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】褐藻類には何種類もの硫酸化多糖が含ま
れている。これらの多糖はフコイダンあるいはフコイジ
ンと総称されることが多いが、その構造は由来となる海
藻により異なることが多い。例えば、ヒバマタ、マコン
ブ、オキナワモズク、モズク、ワカメメカブそれぞれか
ら抽出される硫酸化多糖は異なる構造を持つ（例えば、
非特許文献１参照。）。そのため、硫酸化多糖を酵素的
に分解してそのオリゴ糖を得たりその構造を決定したり
するにはそれぞれを分解する酵素を取得する必要があ
る。

【０００３】硫酸化多糖の分子種としては、硫酸化フカ
ン（例えば、特許文献１参照。）、硫酸化フコグルクロ
ノマンナン（例えば、特許文献２参照。）、硫酸化フコ
ガラクタン（例えば、特許文献３参照。）等、またそれ
らの他にも何種類もの分子種（例えば、特許文献４参
照。）が報告されている。硫酸化フカン画分には強い抗
凝血活性（例えば、特許文献１参照。）、硫酸化フコグ
ルクロノマンナン画分には癌細胞に対するアポトーシス
誘導活性（例えば、特許文献５参照。）が報告されてい
るなど、硫酸化多糖は一般に何らかの生物活性を持つこ
とが多い。

【０００４】硫酸化多糖を医薬品として開発する場合、
その構造を決定する必要が生じるが、その硫酸化多糖を
分解する酵素を用いれば構造を決定する際に非常に有利
である。しかしながら褐藻類の硫酸化多糖を分解する酵
素は市販されておらず、しかも褐藻類の硫酸化多糖は海
藻の種によって異なることが多いため、１種類の硫酸化
多糖の構造を決めるにはその硫酸化多糖を特異的に分解
する分解酵素が必要となる。コンブ目海藻由来の硫酸化
多糖の構造が研究されているが、多くの分子種のうち数
種類の構造が判明しているに過ぎない（例えば、特許文
献６、７、非特許文献２、３、４参照。）。

【０００５】

【特許文献１】国際公開第９９／４１２８８号パンフレ
ット

【特許文献２】国際公開第９６／３４００４号パンフレ
ット

【特許文献３】国際公開第００／５０４６４号パンフレ
ット

【特許文献４】国際公開第０１／８１５６０号パンフレ
ット

【特許文献５】国際公開第９７／２６８９６号パンフレ
ット

【特許文献６】特開平７−２１５９９０号公報

【特許文献７】特開平８−９２３０３号公報

【非特許文献１】酒井武、外１名、「バイオサイエンス
とインダストリー」、２００２年６月、第６０巻、第６
号、ｐ．３７７−３８０

【非特許文献２】柴田英之、外６名、「薬理と治療」、
１９９８年８月、第２６巻、第８号、ｐ．１２１１−１
２１５

【非特許文献３】田幸正邦、外４名、「応用糖質科
学」、１９９６年２月、第４３巻、第２号、ｐ．１４３
−１４８

【非特許文献４】ナガオカ（Ｎａｇａｏｋａ，Ｍ．）、
外８名、「グリココンジュゲート・ジャーナル（Ｇｌｙ
ｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊｏｕｒｎａｌ）」、第１６
巻、ｐ．１９−２６

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】以上のことから、コン
ブ目海藻由来の新規な硫酸化多糖を分解する酵素、すな
わち硫酸化フカンを特異的に分解する酵素を使用して酵
素的に製造した構造が均一な硫酸化フカンオリゴ糖が求
められていた。すなわち、本発明の目的は、コンブ目海
藻由来の新規な硫酸化多糖を分解する硫酸化フカン分解
酵素を硫酸化フカンに作用させて得られる低分子化物及
びその製造方法を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明の第１の発明は、
下記の理化学的性質を有することを特徴とする硫酸化フ
カン又はその塩に関する。 （１）構成糖：フコースを含有し、（２）下記一般式
（Ｉ）で表される硫酸化糖を構成糖の必須成分とする：

【化１５】 （式中、ＲはＨ又はＳＯ_３Ｈであって、Ｒの少なくとも
１つはＳＯ_３Ｈであり、ｎは１以上の整数である）、
（３）Alteromonas sp. SN-1009由来の硫酸化フカン分
解酵素により低分子化され、下記一般式（ＩＩ）、（Ｉ
ＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）、（ＸＶ）、（ＸＶ
Ｉ）で表される化合物より選択される１種類以上の化合
物が生成する：

【化１６】

【化１７】

【化１８】

【化１９】

【化２０】

【化２１】 （全式中、ＲはＨ又はＳＯ_３Ｈであり、Ｒの少なくとも
１つはＳＯ_３Ｈである。）

【０００８】本発明の第２の発明は、下記一般式（Ｉ）
中、ｎが１〜５であることを特徴とする硫酸化フカンオ
リゴ糖に関する。

【化２２】 （式中、ＲはＨ又はＳＯ_３Ｈであり、Ｒの少なくとも１
つはＳＯ_３Ｈである。）

【０００９】本発明の第３の発明は、本発明の第１また
は第２の発明の硫酸化フカンにAlteromonas sp. SN-10
09由来の硫酸化フカン分解酵素を作用させてその分解物
を採取することを特徴とする硫酸化フカンオリゴ糖の調
製方法に関する。本発明の第３の発明において、上記硫
酸化フカンはガゴメ（Kjellmaniella crassifolia）、
マコンブ（Laminaria japonica）、あるいはレッソニア
ニグレッセンス（Lessonia nigrescens）由来であっ
てもよい。

【００１０】本発明の第４の発明は、本発明の第３の発
明の方法で調製される硫酸化フカンオリゴ糖に関する。

【００１１】本発明の第５の発明は、下記一般式（Ｉ
Ｉ）、（ＩＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）、（Ｘ
Ｖ）、（ＸＶＩ）から選択される化学構造を有する硫酸
化フカンオリゴ糖またはその塩に関する。

【化２３】

【化２４】

【化２５】

【化２６】

【化２７】

【化２８】 （全式中、ＲはＨ又はＳＯ_３Ｈであり、Ｒの少なくとも
１つはＳＯ_３Ｈである。）

【００１２】すなわち、本発明者らは鋭意研究の結果、
硫酸化フカン分解酵素を用いて、コンブ目海藻由来の新
規な硫酸化多糖を分解し、糖鎖工学用試薬として利用で
きる、構造の均一な硫酸化フカンオリゴ糖を製造する方
法を見出し、また、それらのオリゴ糖の構造を決定し本
発明を完成させた。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下本発明に関して具体的に説明
する。

【００１４】本発明において、特に限定はされないが例
えば、コンブ目海藻由来の硫酸化フカンを使用すること
ができる。該多糖は硫酸基とフコースを主要構成成分と
する。また、コンブ目海藻由来の硫酸化フカンの主鎖は
一般の糖よりも酸に対して弱いＬ−フコースからなるた
め、加熱や酸処理により容易に低分子化することができ
る。

【００１５】本発明において、前述の特徴を備えた硫酸
化フカンを使用することができる。その由来は特に限定
されるものではないが、例えば、ガゴメ（Kjellmaniell
a crassifolia）、マコンブ（Laminaria japonica）、
あるいはレッソニア ニグレッセンス（Lessonia nigre
scens）等コンブ目の海藻は硫酸化フカンの含有量が多
く原料として好適である。

【００１６】本発明の硫酸化フカン分解酵素とは、硫酸
化フカン及び硫酸化フカンオリゴ糖などに作用してフコ
ースとフコースの間のα−Ｌ−フコシル結合をエンド的
に加水分解し、還元性末端にＬ−フコースを持つオリゴ
糖を生成させる。本発明の硫酸化フカンオリゴ糖とは、
硫酸化フカンに本発明の硫酸化フカン分解酵素を作用さ
せて得られるオリゴ糖であり、還元性末端糖がＬ−フコ
ースである。

【００１７】本発明で使用する硫酸化フカンを製造する
際にはまず、褐藻類の水溶性画分抽出液を得る。その際
硫酸化フカンの低分子化を防ぐためには、ｐＨは４〜
９、温度は１００℃以下が好ましい。また、上記抽出液
中のアミノ酸や低分子性の色素等は限外ろ過により効率
良く除去できる。疎水性物質の除去には活性炭処理等も
有効である。

【００１８】このようにして褐藻類の硫酸化多糖画分を
得ることができる。該画分を硫酸化フカン画分として例
えば本発明の硫酸化フカン分解酵素の基質として使用可
能である。該画分を陰イオン交換カラムにより分離すれ
ばより純度の高い硫酸化フカンを得ることもできる。上
記の硫酸化多糖画分も陰イオン交換カラムで精製した硫
酸化フカンもともに本発明の硫酸化フカンオリゴ糖製造
時の原料として使用できる。

【００１９】本発明の硫酸化フカンの主骨格は、下記一
般式（Ｉ）に表される。下記一般式において、ｎは１以
上の整数であり、例えば１〜２０，０００の範囲、さら
に好ましくは１〜１０，０００の範囲のものが本発明の
硫酸化フカンに含まれる。また、本発明の硫酸化フカン
には、上記範囲であれば、下記一般式（Ｉ）が連続的に
繰り返した構造を持つもの、及び他の構造が介在して、
非連続的に下記一般式（Ｉ）が含有される構造を持つも
ののいずれもが含まれる。

【化２９】 （式中、ＲはＨ又はＳＯ_３Ｈであり、Ｒの少なくとも１
つはＳＯ_３Ｈである。）

【００２０】本発明で用いる硫酸化フカン分解酵素を生
産する菌株は、バージーズ マニュアル オブ ディタ
ーミネィティブ バクテリオロジー（Bergey's Manual
of Determinative Bacteriology）、第９巻（１９９
４）に記載の基本分類によればアルテロモナス属細菌に
分類される。しかしながらアルテロモナス属細菌は近年
分類の再編成が行われており、細菌学的性質のみで分類
するのは適当ではない。そこで、本菌株の１６Ｓ ｒＤ
ＮＡの塩基配列を決定し、既知の細菌と相同性を比較し
たところ最も相同性が高い細菌はThalassomonas属であ
った。しかしながらその遺伝距離は０．０５(change/av
erage nucleotide position)以上であり、同属とは判定
できなかった。そこで、本発明者らは、１６Ｓ ｒＤＮ
Ａ配列の相同性から、本菌株は既知の属に属さない新属
の細菌であると断定し、本菌株をフカノバクター リィ
ティカス ＳＮ−１００９と命名した。本明細書におい
て、アルテロモナス ｓｐ．ＳＮ−１００９（Alteromo
nas sp. SN-1009）は、フカノバクター リィティカス
ＳＮ−１００９と同じものである。

【００２１】なお、上記菌株はAlteromonas sp. SN-10
09として、〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東
１−１−１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所
特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−５７４７とし
て、平成８年２月１３日（原寄託日）より寄託され、ブ
タベスト条約に基づき平成８年１１月１５日（移管日）
より国際寄託されている。配列表の配列番号１に本菌株
の１６Ｓ ｒＤＮＡの配列を示す。

【００２２】従って、１６Ｓ ｒＤＮＡの配列より、フ
カノバクター リィティカス ＳＮ−１００９と同属と
判断される細菌を培養して本発明に使用する硫酸化フカ
ン分解酵素を製造することができる。また、本発明にお
いては、上記Alteromonas sp. SN-1009株の他にAltero
monas sp. SN-1009株の自然的又は人工的変異株、その
他アルテロモナス属、フカノバクター属に属する菌種等
であって、本発明に使用する硫酸化フカン分解酵素生産
能を有する微生物を利用することができる。本発明で用
いる硫酸化フカン分解酵素は、上記微生物より実施例１
記載の方法で取得することができる。

【００２３】本発明の硫酸化フカンオリゴ糖は、硫酸化
フカン分解酵素を硫酸化フカン含有物に作用させること
によって調製することができる。硫酸化フカン含有物と
しては、例えば硫酸化フカンの部分精製品、褐藻類由来
の硫酸化フコース含有多糖画分、褐藻類の水性溶媒抽出
物、若しくは褐藻類藻体が好適に使用できる。

【００２４】本発明の硫酸化フカンオリゴ糖を調製する
にあたり、硫酸化フカン、若しくは硫酸化フカン含有物
の溶解は通常の方法で行えばよく、溶解液中の本発明の
硫酸化フカン、若しくは該硫酸化フカン含有物はその最
高溶解濃度でもよいが、通常はその操作性、反応に使用
する本発明の硫酸化フカン分解酵素の量を考慮して選定
すればよい。硫酸化フカンの溶解液としては、水、緩衝
液等より目的に応じて選択すればよい。溶解液のｐＨは
通常中性付近で、酵素反応は通常３０℃付近で行う。反
応に使用する本発明の硫酸化フカン分解酵素の配合比率
や使用量、反応液の組成、反応時間等を調整することに
よって、硫酸化フカンオリゴ糖の分子量を調整すること
もできる。上記の様にして得られた本発明の硫酸化フカ
ンオリゴ糖を分子量分画あるいは陰イオン交換カラムに
より分画することによって、更に均一な分子量あるいは
均一な荷電密度分布の本発明の硫酸化フカンオリゴ糖を
調製することができる。分子量分画は通常よく使用され
ている方法を適用することができ、例えばゲルろ過法や
分子量分画膜を使用すればよい。低分子化物は、必要に
応じて更にイオン交換樹脂処理、活性炭処理等の精製操
作を行ってもよく、必要に応じて脱塩処理、無菌処理、
凍結乾燥処理をすることもできる。この方法により、後
述するごとく、ＮＭＲ分析により構造決定可能な均一な
構造の本発明の硫酸化フカンオリゴ糖を得ることができ
る。

【００２５】本発明の硫酸化フカンオリゴ糖としては、
特に限定はされないが例えば、下記一般式（ＩＩ）、
（ＩＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）、（ＸＶ）、
（ＸＶＩ）から選択される化学構造を有する硫酸化フカ
ンオリゴ糖またはその塩が例示される。

【化３０】

【化３１】

【化３２】

【化３３】

【化３４】

【化３５】 （全式中、ＲはＨ又はＳＯ_３Ｈであり、Ｒの少なくとも
１つはＳＯ_３Ｈである。）

【００２６】本発明の硫酸化フカンオリゴ糖は、硫酸基
を分子中に有しており、該基は種々の塩基と反応し、塩
を形成する。本発明の硫酸化フカンオリゴ糖は、塩にな
った状態が安定であり、通常ナトリウム及び／又はカリ
ウム及び／又はカルシウム等の塩の形態で提供される。
これらの物質の塩はダウエックス５０Ｗ等の陽イオン交
換樹脂を利用することによって遊離の本発明の硫酸化フ
カンオリゴ糖に導くことが可能である。また、これら
は、必要に応じ公知慣用の塩交換を行い所望の種々の塩
に交換することができる。

【００２７】本発明の硫酸化フカンオリゴ糖の塩として
は、薬学的に許容される塩を用いることができ、例えば
ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウム、
マグネシウム、亜鉛等のアルカリ土類金属、アンモニウ
ム等の塩が挙げられる。

【００２８】また、本発明の硫酸化フカンオリゴ糖は糖
鎖工学用試薬として使用することができる。例えば、特
公平５−６５１０８号公報記載の方法により２−アミノ
ピリジル化（ＰＡ化）を行い、該オリゴ糖のＰＡ−化物
を調製すれば、硫酸化フカンオリゴ糖の蛍光標識標準物
質として使用できるなど糖鎖工学用試薬として極めて有
用な物質を提供することができる。

【００２９】

【実施例】以下に本発明を実施例をもって具体的に示す
が、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるもの
ではない。本実施例において硫酸化フカンオリゴ糖の分
子量は、質量分析結果から算出された平均分子量であ
る。

【００３０】参考例１ ガゴメ由来フコイダンの調製 養殖した乾燥ガゴメ２ｋｇを穴径１ｍｍのスクリーンを
装着させたカッターミル（増幸産業社製）で破砕し、２
０リットルの８０％エタノール中に懸濁後２５℃で３時
間攪拌し、ろ紙でろ過した。得られた残さを４０リット
ルの１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む３０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し、９５℃で２時間処理後、
穴径１０６μｍのステンレス製ふるいでろ過した。得ら
れたろ液に２００ｇの活性炭、４．５リットルのエタノ
ール、１２，０００Ｕのアルギン酸リアーゼＫ（ナガセ
生化学工業社製）を添加し、２５℃で２０時間攪拌後、
遠心分離した。得られた上清を排除分子量１０万のホロ
ファイバーを装着させた限外ろ過機で４リットルに濃縮
後、遠心分離により不溶物を除去し５℃で２４時間放置
した。生じた沈殿を遠心分離により除去し、得られた上
清を限外ろ過機により１００ｍＭ塩化ナトリウムに溶媒
置換した。この溶液を４℃以下に冷却後、塩酸によりｐ
Ｈを２．０とし、生じた沈殿を遠心分離により除去し
た。得られた上清のｐＨを水酸化ナトリウムにより８．
０とし、４リットルに濃縮後、限外ろ過機により２０ｍ
Ｍ塩化ナトリウムに溶媒置換した。この溶液中の不溶物
を遠心分離により除去後、凍結乾燥し、ガゴメ由来フコ
イダンの乾燥物７６ｇを得た。

【００３１】参考例２ 硫酸化フカン画分の調製 参考例１記載のフコイダン乾燥物７ｇを、５０ｍＭ塩化
ナトリウムと１０％エタノールを含む２０ｍＭイミダゾ
ール塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）７００ｍｌに溶解し、遠
心分離により不溶物を除去した。得られた上清を、同緩
衝液で平衡化したＤＥＡＥ―セルロファインＡ−８００
カラム（１１．４×４８ｃｍ）にかけ、同緩衝液で洗浄
後、５０ｍＭから１．９５Ｍの塩化ナトリウム濃度勾配
により溶出させた。溶出液は２５０ｍｌずつ分取した。
各フラクションの総糖量をフェノール硫酸法により、ウ
ロン酸量をカルバゾール硫酸法により測定した。溶出順
に、フラクション４３−４９、５０−５５、５６−６７
の画分をまとめ、それぞれを電気透析により脱塩後凍結
乾燥し、フラクション４３−４９から３４０ｍｇ、５０
−５５から８７０ｍｇ、５６−６７から２．６４ｇの乾
燥物を得た。フラクション５６−６７から得た画分を硫
酸化フカン画分とした。

【００３２】参考例３ 硫酸化フカン分解酵素活性測
定方法 １２μｌの２．５％の硫酸化フカン画分溶液と、６０μ
ｌの５０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
と、９μｌの４Ｍ塩化ナトリウムと、６μｌの１Ｍ塩化
カルシウムと、２１μｌの水と、１２μｌの本発明の硫
酸化フカン分解酵素溶液とを混合し、３０℃で３時間反
応させた後、反応液を１００℃で１０分間処理し、遠心
分離後１００μｌをＨＰＬＣにより分析し、低分子化の
程度を測定した。対照として、硫酸化フカン分解酵素溶
液の代わりに、その酵素溶液を溶解している緩衝液を用
いて反応させたもの及び硫酸化フカン画分の代わりに水
を用いて反応させたものを同様にＨＰＬＣで分析した。

【００３３】１単位の硫酸化フカン分解酵素活性は上記
反応系において１分間に１μｍｏｌの硫酸化フカンのフ
コシル結合を切断する酵素量とした。硫酸化フカン分解
酵素活性は下記式により求めた。 ｛（１２×１０００×２．５／１００）／ＭＧ｝×
｛（ＭＧ／Ｍ）−１｝×｛１／（１８０×０．０１
２）｝＝Ｕ／ｍｌ １２×１０００×２．５／１００：添加した硫酸化フカ
ン画分（μｇ） ＭＧ：基質硫酸化フカンの平均分子量 Ｍ：反応生成物の平均分子量 （ＭＧ／Ｍ）−１：１分子の硫酸化フカンが酵素により
切断された部位の数 １８０：反応時間（分） ０．０１２：酵素液量（ｍｌ）

【００３４】なお、ＨＰＬＣ条件は下記によった。 装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製） カラム：ＯＨｐａｋ ＳＢ−８０６ＨＱ（８×３００ｍ
ｍ、昭和電工社製） 溶離液：５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭの塩
化ナトリウム 検出：視差屈折率検出器（Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−７１、
昭和電工社製） 流速：１ｍｌ／分 カラム温度：２５℃

【００３５】反応生成物の平均分子量の測定のために、
市販の分子量既知のプルラン（ＳＴＡＮＤＡＲＤ Ｐ−
８２、昭和電工社製）を上記のＨＰＬＣ分析と同条件で
分析し、プルランの分子量と保持時間との関係を曲線に
表し、上記反応生成物の分子量測定のための標準曲線と
した。また、蛋白質の定量は、酵素液の２８０ｎｍの吸
光度を測定することにより行った。その際１ｍｇ／ｍｌ
の蛋白質溶液の吸光度を１．０として計算した。

【００３６】実施例１ 硫酸化フカン分解酵素の調製 フカノバクター リィティカス ＳＮ−１００９を参考
例１の方法で調製したフコイダン０．２％とペプトン
０．３％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）
ｐＨ８．２からなる培地４ｍｌを１２０℃、２０分間オ
ートクレーブ処理した培地に接種し、２５℃で２４時間
培養して種培養液とした。グルコース ０．２５％、ペ
プトン １％、酵母エキス ０．０５％及び消泡剤（Ｋ
Ｍ７０、信越化学工業製）を含む人工海水ｐＨ８．２か
らなる培地６００ｍｌを２リットルの三角フラスコに入
れ、１２０℃、２０分間オートクレーブ処理した培地に
上記の種培養物を接種した、２５℃で２０時間培養した
ものを、ペプトン １％、酵母エキス ０．０２％及び
消泡剤（ＫＭ７０、信越化学工業製）を含む人工海水ｐ
Ｈ８．２からなる培地２０リットルを３０リットルのジ
ャーファーメンターに入れ、１２０℃、２０分間オート
クレーブ処理した培地に、参考例１の方法で調製したフ
コイダンを１００℃、２０分間処理したものを混合し、
上記の種培養物を接種した。培養は２５℃で２８時間行
った。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養
上清を得た。

【００３７】得られた培養上清を排除分子量１万のホロ
ファイバーを装着させた限外ろ過装置により濃縮後、１
０ｍＭ 塩化カルシウム及び１５０ｍＭ 塩化ナトリウ
ムを含む２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に
溶媒置換し、遠心分離して上清を得た。

【００３８】得られた上清を同じ緩衝液で平衡化した２
リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラ
ムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、１５０ｍＭから４００
ｍＭ塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、溶出液
を６３ｍｌずつに分画し、活性画分を集めた。

【００３９】得られた活性画分を排除分子量１万のホロ
ファイバーを装着させた限外ろ過装置により濃縮後、１
０ｍＭ 塩化カルシウム及び１００ｍＭ 塩化ナトリウ
ムを含む２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に
溶媒置換した。この酵素溶液を同じ緩衝液で平衡化した
２００ｍｌ ＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカ
ラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、１００ｍＭから３０
０ｍＭ塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、溶出
液を１９ｍｌずつに分画し、活性画分を集めた。

【００４０】得られた活性画分を排除分子量１万の限外
ろ過膜を装着させた限外ろ過装置により濃縮後、４Ｍと
なるように塩化ナトリウムを添加し、１００ｍＭ 塩化
カルシウム及び４Ｍ 塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したフェニル
セファロースＣＬ−４Ｂのカラムにかけ、同じ緩衝液で
洗浄後、４Ｍから１Ｍ 塩化ナトリウムの濃度勾配によ
り溶出させ、溶出液を９．４ｍｌずつに分画した。こう
して硫酸化フカン分解酵素の精製物を得た。

【００４１】実施例２ 硫酸化フカン分解酵素を用いた
硫酸化フカンオリゴ糖の調製、精製、及び構造解析 （１）調製 養殖したガゴメ乾燥物２００ｇを１０リットルの４５ｍ
Ｍ 塩化カルシウムと５００ｍＭ 塩化ナトリウムと９
％ エタノールを含む１８ｍＭ イミダゾール塩酸緩衝
液（ｐＨ７．０）にひたし、硫酸化フカン分解酵素を３
０Ｕ添加し、室温で２日間攪拌後、ろ紙でろ過し排除分
子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機を
用いて、低分子画分を回収し硫酸化フカンオリゴ糖画分
１とした。

【００４２】（２）精製 実施例２−（１）で得られた硫酸化フカンオリゴ糖画分
１を脱塩装置（マイクロアシライザー Ｇ３、旭化成工
業製）により脱塩後、ロータリーエバポレーターで濃縮
した。この硫酸化フカンオリゴ糖溶液１に１０ｍＭとな
るようにイミダゾールを、３００ｍＭとなるように塩化
ナトリウムを添加し、３００ｍＭ 塩化ナトリウムを含
む１０ｍＭ イミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）
で平衡化した１リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ
−８００のカラムにかけ、同じ緩衝液で充分洗浄後、３
００ｍＭから１２００ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配
により溶出させた。溶出させたフラクションは総て、総
糖量をフェノール−硫酸法で、総ウロン酸量をカルバゾ
ール−硫酸法で測定した。その結果、溶出フラクション
の中には少なくとも４個の明瞭なピークが存在していた
のでそれぞれのピーク部分について質量分析を行った。
また、各ピークの糖組成を調べたところフコースのみ
で、ウロン酸を含まなかった。糖組成から考えられる各
質量のオリゴ糖は表１に示すような組成のものと考えら
れた。

【００４３】

【表１】

【００４４】次に各ピークを形成するフラクションを集
め、それぞれをエバポレーターにより濃縮後、下記の条
件で精製した。 カラム：ＹＭＣ Ｐａｃｋ ＰｏｌｙａｍｉｎｅＩＩ
（２０×２５０ｍｍ、ＹＭＣ社製） 流速：８ｍｌ／分 カラム温度：３０℃ 平衡化溶液：１０％のアセトニトリルを含む０．５Ｍ
リン酸２水素ナトリウム 溶出溶液：１０％のアセトニトリルを含む０．５Ｍ リ
ン酸２水素ナトリウムから１０％のアセトニトリルを含
む１．５Ｍ リン酸２水素ナトリウムの濃度勾配によ
る。但し、ピーク番号１−（４）に関しては、１０％の
アセトニトリルを含む７８７．５ｍＭ リン酸２水素ナ
トリウムから１０％のアセトニトリルを含む１４６２．
５ｍＭ リン酸２水素ナトリウムの濃度勾配による。 分取：１本あたり４ｍｌ 検出：フェノール硫酸法による

【００４５】上記のカラムクロマトグラフィーにより分
取したフラクションについて質量分析を行ったところ、
ピーク番号１−（１）からは質量１９１４の物質が、ピ
ーク番号１−（２）からは質量２２６４の物質が、ピー
ク番号１−（３）からは質量２３６６の物質が、ピーク
番号１−（４）からは質量３４６０の物質がそれぞれ主
ピークとして得られた。各ピーク部分を集め、１０％
エタノールで平衡化させたセルロファインＧＣＬ−２５
のカラムにかけ、１０％ エタノールで溶出して脱塩し
た。こうして本発明の硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）
〜（４）を得た。

【００４６】（３）構造解析 実施例２−（２）で得られた本発明の硫酸化フカンオリ
ゴ糖１−（１）〜（４）について、２−アミノピリジン
を用いた蛍光標識法により還元末端糖及び糖組成の分析
を行ったところ、オリゴ糖１−（１）〜（４）の還元性
末端糖及び糖組成は総てフコースであった。次に、硫酸
含量（塩化バリウムを用いた比濁法による）、ウロン酸
含量（カルバゾール−硫酸法による）を測定した。ま
た、ＪＮＭα−５００型核磁気共鳴装置（日本電子社
製）を用いてＮＭＲ分析を行った。分析試料は定法によ
り重水で置換後、構造解析を行った。構成糖の結合様式
は、^１Ｈ−検出異種核検出法であるＨＭＢＣ法を用いて
行った。^１Ｈ−ＮＭＲの帰属にはＤＱＦ−ＣＯＳＹ法及
びＨＯＨＡＨＡ法を^１３Ｃ−ＮＭＲの帰属にはＨＳＱＣ
法を用いた。

【００４７】以下にオリゴ糖１−（１）〜（４）の物性
を示す。 （ａ）オリゴ糖１−（１）の物性 質量分析及びＮＭＲ分析の帰属の結果を以下に示し、本
発明の硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）の^１Ｈ−ＮＭＲ
スペクトルを図１に、^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図２
に、マススペクトルを図３にそれぞれ示した。図１、図
２において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト
値（ｐｐｍ）を示す。また、図３において、縦軸は相対
強度を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。 分子量；１９１４ ＭＳ ｍ／ｚ ４５５．０［Ｍ−４Ｎａ^＋］^４−、６１
４．８［Ｍ−３Ｎａ^＋］ ^３−、９３３．８［Ｍ−２Ｎａ
^＋］^{２− １} Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表２
及び表３に示す。

【００４８】

【表２】

【００４９】

【表３】

【００５０】糖組成 Ｌ−フコースのみ（６分子） 硫酸基 １０分子 ナトリウム １０分子 なお、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲにおけるピーク
の帰属の番号は下記式（ＩＶ）の通りである。

【００５１】

【化３６】

【００５２】（ｂ）オリゴ糖１−（２）の物性 質量分析及びＮＭＲ分析の帰属の結果を以下に示し、本
発明の硫酸化フカンオリゴ糖１−（２）の^１Ｈ−ＮＭＲ
スペクトルを図４に、^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図５
に、マススペクトルを図６にそれぞれ示した。図４、図
５において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト
値（ｐｐｍ）を示す。また、図６において、縦軸は相対
強度を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。 分子量；２２６４ ＭＳ ｍ／ｚ ３５４．２［Ｍ−６Ｎａ^＋］^６−、４２
９．８［Ｍ−５Ｎａ^＋］ ^５−、５４３．０［Ｍ−４Ｎａ
^＋］^４−、７３１．６［Ｍ−３Ｎａ^＋］^{３− １} Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表
４、表５に示す。

【００５３】

【表４】

【００５４】

【表５】

【００５５】糖組成 Ｌ−フコースのみ（７分子） 硫酸基 １２分子 ナトリウム １２分子 なお、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲにおけるピーク
の帰属の番号は下記式（Ｖ）の通りである。

【００５６】

【化３７】

【００５７】上記式（Ｖ）の硫酸化糖について、国際公
開第００／６２７８５号パンフレット、実施例１−
（２）記載の方法で、ＨＧＦ産生誘導活性を調べたとこ
ろ、当該活性が確認できた。

【００５８】（ｃ）オリゴ糖１−（３）の物性 質量分析の結果を以下に示し、本発明の硫酸化フカンオ
リゴ糖１−（３）の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図７に、
^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図８に、マススペクトルを
図９にそれぞれ示した。図７、図８において縦軸はシグ
ナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。
また、図９において、縦軸は相対強度を、横軸は、ｍ／
ｚ値を示す。 分子量；２３６６ ＭＳ ｍ／ｚ ３７１．４［Ｍ−６Ｎａ^＋］^６−、４５
０．３［Ｍ−５Ｎａ^＋］ ^５−、５６８．６［Ｍ−４Ｎａ
^＋］^４−、７６５．７［Ｍ−３Ｎａ^＋］^{３− １} Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表６
及び表７に示す。

【００５９】

【表６】

【００６０】

【表７】

【００６１】糖組成 Ｌ−フコースのみ（７分子） 硫酸基 １３分子 ナトリウム １３分子 なお、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲにおけるシグナ
ルの帰属の番号は下記式（VI）の通りである。

【００６２】

【化３８】

【００６３】（ｄ）オリゴ糖１−（４）の物性 質量分析の結果を以下に示し、本発明の硫酸化フカンオ
リゴ糖１−（４）の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１０
に、^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図１１に、マススペク
トルを図１２にそれぞれ示した。図１０、図１１におい
て縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐ
ｍ）を示す。また、図１２において、縦軸は相対強度
を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。 分子量；３４６０ ＭＳ ｍ／ｚ ４０９．６［Ｍ−８Ｎａ^＋］^８−、４７
１．４［Ｍ−７Ｎａ^＋］ ^７−、５５３．８［Ｍ−６Ｎａ
^＋］^６−、６６９．３［Ｍ−５Ｎａ^＋］^５−、８４２．
３［Ｍ−４Ｎａ^＋］^４−、１１３０．８［Ｍ−３Ｎ
ａ^＋］^{３− １} Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表８
〜表１０に示す。

【００６４】

【表８】

【００６５】

【表９】

【００６６】

【表１０】

【００６７】糖組成 Ｌ−フコースのみ（１１分子） 硫酸基 １８分子 ナトリウム １８分子 なお、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲにおけるシグナ
ルの帰属の番号は下記式（VII）の通りである。

【００６８】

【化３９】

【００６９】実施例３ 硫酸化フカン分解酵素を用いた
硫酸化フカンオリゴ糖の調製、精製、及び構造解析 （１）調製 養殖したガゴメ乾燥物を穴径１ｍｍのスクリーンを装着
させたカッターミル（増幸産業製）を用いてチップとし
た。２５０ｇのガゴメチップを５リットルの８０％エタ
ノールに懸濁し、室温で２時間攪拌後、ろ過した。この
８０％ エタノール洗浄を４回繰り返しガゴメチップ洗
浄物を得た。ガゴメチップ洗浄物 ２５０ｇを５リット
ルの１２５ｍＭ 塩化カルシウムと２５０ｍＭ 塩化ナ
トリウムと１０％ エタノールを含む１７ｍＭ イミダ
ゾール塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、室温で２４
時間攪拌後、ろ過、遠心分離して、ガゴメフコイダン溶
液を得た。この抽出液１リットルに、硫酸化フカン分解
酵素を１０Ｕ添加し室温で３日間攪拌後、ろ紙でろ過
し、ろ液を遠心分離して上清を得、排除分子量１万のホ
ロファイバーを装着させた限外ろ過機を用いて、低分子
画分を回収し硫酸化フカンオリゴ糖画分２とした。

【００７０】（２）精製 実施例３−（１）で得られた硫酸化フカンオリゴ糖画分
２を、１００ｍＭ 塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ イ
ミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化した１
リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラ
ムにかけ、同じ緩衝液で充分洗浄後、１００ｍＭから１
Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。溶出
させたフラクションは総て、総糖量をフェノール−硫酸
法で、総ウロン酸量をカルバゾール−硫酸法で測定し
た。その結果、溶出フラクションは２個のピークを形成
したのでそれぞれのピーク部分について質量分析を行っ
た。また、各ピークの糖組成を調べたところフコースの
みで、ウロン酸を含まなかった。糖組成から考えられる
各質量のオリゴ糖は表１１に示すような組成のものと考
えられた。

【００７１】

【表１１】

【００７２】次に各ピークを形成するフラクションを集
め、それぞれをエバポレーターにより濃縮後、実施例２
−（２）と同じ条件で精製した。ＹＭＣ パック ポリ
アミンII カラムを用いたクロマトグラフィーにより分
取したフラクションについて質量分析を行ったところ、
ピーク番号２−（１）からは、質量１９１４及び２０１
６の物質が、ピーク番号２−（２）からは質量３１１０
の物質がそれぞれ主要ピークとして得られた。これら、
質量１９１４、２０１６、及び３１１０の物質を含むピ
ーク近辺のフラクションを集め、１０％エタノールで平
衡化させたセルロファインＧＣＬ−２５のカラムにか
け、１０％エタノールで溶出して脱塩した。こうして本
発明の硫酸化フカンオリゴ糖２−（１）−１、２−
（１）−２、及び２−（２）を得た。

【００７３】（３）構造解析 実施例３−（２）で得られた本発明の硫酸化フカンオリ
ゴ糖２−（１）−１、２−（１）−２、及び２−（２）
について、２−アミノピリジンを用いた蛍光標識法によ
り還元性末端糖及び糖組成の分析を行ったところ、還元
性末端糖及び糖組成は総てフコースであった。次に、硫
酸含量（塩化バリウムを用いた比濁法による）、ウロン
酸含量（カルバゾール−硫酸法による）を測定した。ま
た、ＪＮＭ α−５００型核磁気共鳴装置（日本電子社
製）を用いてＮＭＲ分析を行った。構成糖の結合様式
は、^１Ｈ−検出異種核検出法であるＨＭＢＣ法を用いて
行った。^１Ｈ−ＮＭＲの帰属にはＤＱＦ−ＣＯＳＹ法及
びＨＯＨＡＨＡ法を、^１３Ｃ−ＮＭＲの帰属にはＨＳＱ
Ｃ法を用いた。以下に本発明の硫酸化フカンオリゴ糖２
−（１）−１、２−（１）−２、及び２−（２）の物性
を示す。

【００７４】（ａ）硫酸化フカンオリゴ糖２−（１）−
１の物性 上記分析の結果、硫酸化フカンオリゴ糖２−（１）−１
は本発明の硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）と同じ物質
であると判明した。

【００７５】（ｂ）硫酸化フカンオリゴ糖２−（１）−
２の物性 質量分析及びＮＭＲ分析の帰属の結果を以下に示し、^１
Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１３に、^１３Ｃ−ＮＭＲスペ
クトルを図１４に、マススペクトルを図１５にそれぞれ
示した。図１３、図１４において縦軸はシグナルの強度
を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図１
５において、縦軸は相対強度を、横軸は、ｍ／ｚ値を示
す。 分子量；２０１６ ＭＳ ｍ／ｚ 313.1 [M-6Na⁺]^6-, 380.3 [M-5Na⁺]^5-, 4
81.1 [M-4Na⁺]^4-, 649.1[M-3Na⁺]^3-, 985.0 [M-2Na⁺]^{2- １} Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表１
２及び表１３に示す。

【００７６】

【表１２】

【００７７】

【表１３】

【００７８】糖組成 Ｌ−フコースのみ（６分子） 硫酸基 １１分子 ナトリウム １１分子 なお、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲにおけるシグナ
ルの帰属の番号は下記式（VIII）の通りである。

【００７９】

【化４０】

【００８０】（ｃ）オリゴ糖２−（２）の物性 質量分析の結果を以下に示し、本発明の硫酸化フカンオ
リゴ糖２−（２）の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１６
に、^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図１７に、マススペク
トルを図１８にそれぞれ示した。図１６、図１７におい
て縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐ
ｍ）を示す。また、図１８において、縦軸は相対強度
を、横軸は、ｍ／ｚ値を示す。 分子量；３１１１ ＭＳ ｍ／ｚ ３６５．８［Ｍ−８Ｎａ^＋］^８−、４２
１．４［Ｍ−７Ｎａ^＋］ ^７−、４９５．２［Ｍ−６Ｎａ
^＋］^６−、５９９．１［Ｍ−５Ｎａ^＋］^５−、７５５．
０［Ｍ−４Ｎａ^＋］^４−、１０１３．７［Ｍ−３Ｎ
ａ^＋］^{３− １} Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表１
４〜表１６に示す。

【００８１】

【表１４】

【００８２】

【表１５】

【００８３】

【表１６】

【００８４】糖組成 Ｌ−フコースのみ（１０分子） 硫酸基 １６分子 ナトリウム １６分子 なお、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲにおけるシグナ
ルの帰属の番号は下記式（IX）の通りである。

【００８５】

【化４１】

【００８６】実施例４ 硫酸化フカン分解酵素を用いた
マコンブ硫酸化フカンオリゴ糖の調製、精製、及び構造
解析 （１）調製 養殖したマコンブの乾燥物を穴径１ｍｍのスクリーンを
装着させたカッターミル（増幸産業製）を用いてチップ
とした。５００ｇのマコンブチップを４．５リットルの
８０％エタノールに懸濁し、室温で２４時間攪拌後、ろ
過した。この８０％エタノール洗浄を３回繰り返し、マ
コンブチップ洗浄物を得た。得られた洗浄物全量を、５
０ｍＭ塩化カルシウム、２００ｍＭの塩化ナトリウム、
及び１０％のエタノールを含む１０リットルの５０ｍＭ
のイミダゾール−塩酸緩衝液ｐＨ８．０に懸濁し、そこ
に、硫酸化フカン分解酵素を２Ｕ添加し、室温で５日間
攪拌後、ろ紙でろ過し、ろ液を遠心分離して、上清を
得、排除分子量１万のホロファイバーを装着させた限外
ろ過機を用いて、低分子画分を回収しマコンブ硫酸化フ
カンオリゴ糖画分１とした。 （２）精製 上記（１）で得られたマコンブ硫酸化フカンオリゴ糖画
分1に１０％エタノールを加えて下記の平衡化用緩衝液
と導電率を同じにし、２００ｍMの塩化ナトリウム及び
１０％のエタノールを含む２０ｍMのイミダゾール−塩
酸緩衝液（ｐH6.5）で平衡化した５００ｍｌのDEAE-セ
ルロファインA-800のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄
後、２００ｍMから１．２Mの塩化ナトリウムの濃度勾配
により溶出させた。溶出には４．５リットルの緩衝液を
使用し、分取は１本あたり５０ｍｌとした。溶出させた
フラクションは総べて、総糖量をフェノール−硫酸法
で、総ウロン酸量をカルバゾール−硫酸法で測定した。
その結果、溶出フラクションは３個のピークを形成し
た。２つめのピーク近辺のフラクション（４４−４８）
を集め、エヴァポレーターにより４０ｍｌに濃縮後、１
０％エタノールにより平衡化させた４．１×９０ｃｍの
セルロファインGCL-25のカラムにかけ、１０％エタノー
ルで溶出させた。溶出させたフラクションは総べて、総
糖量をフェノール−硫酸法で測定した。糖が検出された
画分を集め、エヴァポレーターにより８．４ｍｌに濃縮
後、下記の条件で精製した。 カラム：YMC Pack Polyamine II （２０×２５０ｍｍ、
YMC社製） 流速：８ｍｌ／分 カラム温度：３０℃ 平衡化溶液：１０％のアセトニトリルを含む８７５ｍＭ
のリン酸２水素ナトリウム 溶出：１０％のアセトニトリルを含む８７５ｍＭのリン
酸２水素ナトリウムから１０％のアセトニトリルを含む
１．４Ｍのリン酸２水素ナトリウムの濃度勾配による 分取：１本あたり４ｍｌ 検出：フェノール−硫酸法による

【００８７】上記のカラムクロマトグラフィーにより分
取したフラクション（３回分、フラクションナンバー５
０−５９近辺）を集め、排除分子量３５００の透析チュ
ーブを用いて１０％エタノールに対して透析し、エヴァ
ポレーターで約４０ｍｌに濃縮後、１０％エタノールで
平衡化したセルロファインＧＣＬ−２５のカラムにか
け、１０％エタノールで溶出させた。溶出させたフラク
ションは総べて、総糖量をフェノール−硫酸法で測定し
た。主要ピークの近辺を集め、再度同様にセルロファイ
ンＧＣＬ−２５により精製した。本溶出画分の主要ピー
クを集め、スピードバックで濃縮後、凍結乾燥し、マコ
ンブ硫酸化フカンオリゴ糖１を得た。

【００８８】（３）構造解析 実施例２に記載の方法でオリゴ糖の構造解析を行ったと
ころ、マコンブ硫酸化フカンオリゴ糖１の構造は、実施
例２に記載の硫酸化フカンオリゴ糖１−（３）と同じで
あることがわかった。

【００８９】実施例５ レッソニア ニグレッセンス硫
酸化フカンオリゴ糖の調製、精製および構造解析 （１）調製 参考例１に記載の方法により、レッソニア ニグレッセ
ンスの乾燥チップからレッソニア ニグレッセンス由来
フコイダンを調製した。すなわち、１０ｇのレッソニア
ニグレッセンス由来フコイダンを５０ｍＭ塩化カルシ
ウム、３００ｍＭの塩化ナトリウム、及び１０％のエタ
ノールを含む２リットルの５０ｍＭのイミダゾール−塩
酸緩衝液ｐＨ８．０に溶解し、そこに、硫酸化フカン分
解酵素を１Ｕ添加し、室温で４０時間攪拌後、排除分子
量１万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機を用い
て、低分子画分を回収しレッソニア ニグレッセンス硫
酸化フカンオリゴ糖画分１とした。

【００９０】（２）精製 上記（１）で得られたレッソニア ニグレッセンス硫酸
化フカンオリゴ糖画分1を２００ｍMの塩化ナトリウム及
び１０％のエタノールを含む１０ｍMのイミダゾール−
塩酸緩衝液（ｐH6.０）で平衡化した１０００ｍｌのDEA
E-セルロファインA-800のカラムにかけ、同じ緩衝液で
洗浄後、２００ｍMから７００ｍMの塩化ナトリウムの濃
度勾配により溶出させた。溶出には５リットルの緩衝液
を使用し、分取は１本あたり５６ｍｌとした。溶出させ
たフラクションは総べて、総糖量をフェノール−硫酸法
で、総ウロン酸量をカルバゾール−硫酸法で測定した。
その結果、溶出フラクションは７個のピークを形成し
た。それぞれのピーク近辺のフラクションを集め、エヴ
ァポレーターにより４０ｍｌに濃縮後、（以下それらを
レッソニア ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−
（１）から１−（７）とする。）１０％エタノールによ
り平衡化させた４．１×９０ｃｍのセルロファインGCL-
25のカラムにかけ、１０％エタノールで溶出させた。溶
出させたフラクションは総べて、総糖量をフェノール−
硫酸法で測定した。糖が検出された画分を集め、エバポ
レーターにより濃縮後、下記の条件で精製した。 カラム：YMC Pack Polyamine II （２０×２５０ｍｍ、
YMC社製） 流速：８ｍｌ／分 カラム温度：３０℃ 平衡化溶液：レッソニア ニグレッセンス硫酸化フカン
オリゴ糖１−（１）、（２）、（３）の場合は１０％の
アセトニトリルを含む９０ｍＭのリン酸２水素ナトリウ
ム。レッソニア ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖
１−（４）、（５）の場合は１０％のアセトニトリルを
含む６３０ｍＭのリン酸２水素ナトリウム。レッソニア
ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（６）の場
合は１０％のアセトニトリルを含む７２０ｍＭのリン酸
２水素ナトリウム。レッソニアニグレッセンス硫酸化フ
カンオリゴ糖１−（７）の場合は１０％のアセトニトリ
ルを含む９００ｍＭのリン酸２水素ナトリウム

【００９１】溶出：レッソニア ニグレッセンス硫酸化
フカンオリゴ糖１−（１）、（２）、（３）の場合は１
０％のアセトニトリルを含む９０ｍＭのリン酸２水素ナ
トリウムから１０％のアセトニトリルを含む９００ｍＭ
のリン酸２水素ナトリウムの濃度勾配による。レッソニ
ア ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（４）、
（５）の場合は１０％のアセトニトリルを含む６３０ｍ
Ｍのリン酸２水素ナトリウムから１０％のアセトニトリ
ルを含む１２６０ｍＭのリン酸２水素ナトリウムの濃度
勾配による。レッソニア ニグレッセンス硫酸化フカン
オリゴ糖１−（６）の場合は１０％のアセトニトリルを
含む７２０ｍＭのリン酸２水素ナトリウムから１０％の
アセトニトリルを含む１４４０ｍＭのリン酸２水素ナト
リウムの濃度勾配による。レッソニア ニグレッセンス
硫酸化フカンオリゴ糖１−（７）の場合は１０％のアセ
トニトリルを含む９００ｍＭのリン酸２水素ナトリウム
から１０％のアセトニトリルを含む１６２０ｍＭのリン
酸２水素ナトリウムの濃度勾配による。

【００９２】分取：１本あたり４ｍｌ 検出：フェノール−硫酸法による

【００９３】レッソニア ニグレッセンス硫酸化フカン
オリゴ糖１−（１）から１−（７）の上記のカラムクロ
マトグラフィーにより分取したフラクションにおいて、
それぞれの糖溶出画分を集め、エヴァポレーターで約４
０ｍｌに濃縮後、１０％エタノールで平衡化したセルロ
ファインＧＣＬ−２５のカラムにかけ、１０％エタノー
ルで溶出させた。溶出させたフラクションは総べて、総
糖量をフェノール−硫酸法で測定した。主要ピークの近
辺を集め、再度同様にセルロファインＧＣＬ−２５によ
り精製した。但し、レッソニア ニグレッセンス硫酸化
フカンオリゴ糖１−（７）に関しては、２種の主要ピー
クが認められたので、それぞれのピークをレッソニア
ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（７）−１及
び１−（７）−２とした。それぞれの溶出画分の主要ピ
ークを集め、スピードバックで濃縮後、凍結乾燥し、レ
ッソニア ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−
（１）から１−（７）−２を得た。

【００９４】（３）構造解析 実施例２に記載の方法でオリゴ糖の構造解析を行った。
以下に、レッソニア ニグレッセンス硫酸化フカンオリ
ゴ糖１−（１）から１−（７）−２の物性を示す。

【００９５】（ａ）レッソニア ニグレッセンス硫酸化
フカンオリゴ糖１−（１）の物性 質量分析及びＮＭＲ分析の帰属の結果を以下に示し、^１
Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１９に、^１３Ｃ−ＮＭＲスペ
クトルを図２０に、マススペクトルを図２１にそれぞれ
示した。図１９、図２０において縦軸はシグナルの強度
を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図２
１において、縦軸は相対強度を、横軸は、ｍ／ｚ値を示
す。 分子量；７１８ ＭＳ ｍ／ｚ ２１６．５［Ｍ−３Ｎａ^＋］^３−，３
３６．０［Ｍ−２Ｎａ^＋］^２−，６９５．０［Ｍ−Ｎａ
^＋］^{− １} Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表１
７に示す。

【００９６】

【表１７】

【００９７】糖組成 Ｌ−フコースのみ（２分子） 硫酸基 ４分子 ナトリウム ４分子 なお、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲにおけるシグナ
ルの帰属の番号は下記式（X）の通りである。

【００９８】

【化４２】

【００９９】（ｂ）レッソニア ニグレッセンス硫酸化
フカンオリゴ糖１−（２）の物性 質量分析及びＮＭＲ分析の帰属の結果を以下に示し、^１
Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２２に、^１３Ｃ−ＮＭＲスペ
クトルを図２３に、マススペクトルを図２４にそれぞれ
示した。図２２、図２３において縦軸はシグナルの強度
を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図２
４において、縦軸は相対強度を、横軸は、ｍ／ｚ値を示
す。 分子量；９６６ ＭＳ ｍ／ｚ ４５９．９［Ｍ−２Ｎａ^＋］^２−，９
４２．９［Ｍ−Ｎａ^＋］ ^{− １} Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表１
８に示す。

【０１００】

【表１８】

【０１０１】糖組成 Ｌ−フコースのみ（３分子） 硫酸基 ５分子 ナトリウム ５分子 なお、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲにおけるシグナ
ルの帰属の番号は下記式（XI）の通りである。

【０１０２】

【化４３】

【０１０３】（ｃ）レッソニア ニグレッセンス硫酸化
フカンオリゴ糖１−（３）の物性 質量分析及びＮＭＲ分析の帰属の結果を以下に示し、^１
Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２５に、^１３Ｃ−ＮＭＲスペ
クトルを図２６に、マススペクトルを図２７にそれぞれ
示した。図２５、図２６において縦軸はシグナルの強度
を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図２
７において、縦軸は相対強度を、横軸は、ｍ／ｚ値を示
す。 分子量；１０６８ ＭＳ ｍ／ｚ ３３２．９［Ｍ−３Ｎａ^＋］^３−，５
１１．０［Ｍ−２Ｎａ^＋］^２−，１０４５．０［Ｍ−Ｎ
ａ^＋］^{− １} Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を表１
９に示す。

【０１０４】

【表１９】

【０１０５】糖組成 Ｌ−フコースのみ（３分子） 硫酸基 ６分子 ナトリウム ６分子 なお、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲにおけるシグナ
ルの帰属の番号は下記式（XII）の通りである。

【０１０６】

【化４４】

【０１０７】（ｄ）レッソニア ニグレッセンス硫酸化
フカンオリゴ糖１−（４）の物性 実施例２に記載の方法で構造解析を行ったところ、レッ
ソニア ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−
（４）の構造は、実施例２に記載の硫酸化フカンオリゴ
糖１−（２）と同じであることがわかった。

【０１０８】（ｅ）レッソニア ニグレッセンス硫酸化
フカンオリゴ糖１−（５）の物性 実施例２に記載の方法で構造解析を行ったところ、レッ
ソニア ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−
（５）の構造は、実施例２に記載の硫酸化フカンオリゴ
糖１−（３）と同じであることがわかった。

【０１０９】（ｆ）レッソニア ニグレッセンス硫酸化
フカンオリゴ糖１−（６）の物性 本発明のレッソニア ニグレッセンス硫酸化フカンオリ
ゴ糖１−（６）の質量分析の結果を以下に示す。 分子量；３４６１ ＭＳ ｍ／ｚ ３６１．５［Ｍ−９Ｎａ^＋］^９−，４０
９．６２［Ｍ−８Ｎａ^＋］^８−，４７１．４２［Ｍ−７
Ｎａ^＋］^７−，５５３．８１［Ｍ−６Ｎａ^＋］^{６ −}，６
６９．３１［Ｍ−５Ｎａ^＋］^５−，８４２．３２［Ｍ−
４Ｎａ^＋］^４−，１１３０．８３［Ｍ−３Ｎａ^＋］^３− 糖組成 Ｌ−フコースのみ（１１分子） 硫酸基 １８分子 ナトリウム １８分子

【０１１０】（ｇ）レッソニア ニグレッセンス硫酸化
フカンオリゴ糖１−（７）−１の物性本発明のレッソニ
ア ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（７）−
１の質量分析の結果を以下に示す。 分子量；４６５９ ＭＳ ｍ／ｚ ４４２．８２［Ｍ−１０Ｎａ^＋］
^１０−，４９４．７２［Ｍ−９Ｎａ^＋］^９−，５５９．
３２［Ｍ−８Ｎａ^＋］^８−，６４２．６２［Ｍ−７Ｎａ
^＋］^７−，７５３．５２［Ｍ−６Ｎａ^＋］^６−，９０
８．８２［Ｍ−５Ｎａ^＋］^５−，１１４１．４３［Ｍ−
４Ｎａ^＋］^４− 糖組成 Ｌ−フコースのみ（１５分子） 硫酸基 ２４分子 ナトリウム ２４分子

【０１１１】（ｈ）レッソニア ニグレッセンス硫酸化
フカンオリゴ糖１−（７）−２の物性本発明のレッソニ
ア ニグレッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（７）−
２の質量分析の結果を以下に示す。 分子量；３５６４ ＭＳ ｍ／ｚ ３７３．１２［Ｍ−９Ｎａ^＋］^９−，
４２２．５２［Ｍ−８Ｎａ^＋］^８−，４８６．３２［Ｍ
−７Ｎａ^＋］^７−，５７１．０１［Ｍ−６Ｎ
ａ^＋］^６−，６８９．６１［Ｍ−５Ｎａ^＋］^５−，８６
８．０２［Ｍ−４Ｎａ^＋］^{４ −}，１１６４．９３［Ｍ−
３Ｎａ^＋］^３− 糖組成 Ｌ−フコースのみ（１１分子） 硫酸基 １９分子 ナトリウム １９分子

【０１１２】実施例６ 硫酸化フカン分解酵素を用いた
硫酸化フカンオリゴ糖の調製、精製、及び構造解析 （１）調製 参考例１記載の養殖したガゴメ由来フコイダン１０ｇを
４．８リットルの１２５ｍＭ 塩化カルシウムと２５０
ｍＭ 塩化ナトリウムと１０％ エタノールを含む１７
ｍＭ イミダゾール塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解
後、硫酸化フカン分解酵素を１０Ｕ添加し、室温で７２
時間攪拌して、ガゴメフコイダンオリゴ糖溶液を得た。
排除分子量１万のホロファイバーを装着させた限外ろ過
機を用いて、低分子画分を回収し硫酸化フカンオリゴ糖
画分３とした。

【０１１３】（２）分析 上記（１）で得られた硫酸化フカンオリゴ糖画分３を１
００ｍＭ 塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ イミダゾー
ル−塩酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化した１リットル
のＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにか
け、同じ緩衝液で充分洗浄後、１００ｍＭから１Ｍの塩
化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。溶出させた
フラクションは総て、総糖量をフェノール−硫酸法で、
総ウロン酸量をカルバゾール−硫酸法で測定した。その
結果、溶出フラクションは２個のピークを形成したので
それぞれのピーク部分について質量分析を行った。ま
た、その糖組成を調べたところフコースのみで、ウロン
酸を含まなかった。糖組成から考えられる各質量のオリ
ゴ糖は表２０に示すような組成のものと考えられた。

【０１１４】

【表２０】

【０１１５】硫酸化フカンオリゴ糖画分３には上表に示
すような種々の硫酸化フカンオリゴ糖が入っていること
が判明した。

【０１１６】実施例７ 硫酸化フカン分解酵素を用いた
硫酸化フカンオリゴ糖の調製、精製、構造解析及び生理
活性 （１）実施例２−（２）で得られたＤＥＡＥ−セルロフ
ァインの４個の明瞭なピークの他に、それらよりも高い
塩濃度で溶出される幅広いピークも認められたのでオリ
ゴ糖４として採取し、実施例２と同様の方法でＮＭＲ分
析を行った。その結果、硫酸化フカンオリゴ糖１−
（２）とほぼ同じスペクトルが得られた。この結果か
ら、オリゴ糖４はオリゴ糖１−（２）が数分子結合した
構造を持つことが強く示唆された。そこで、オリゴ糖４
を実施例１記載の硫酸化フカン分解酵素により分解し、
分解物をＨＰＬＣにより分析したところ、反応生成物の
多くが硫酸化フカンオリゴ糖１−（２）と同じ位置に溶
出されてきた。プルランを標準物質としたゲル濾過法に
より、上記オリゴ糖４の分子量を測定したところ、オリ
ゴ糖４の分子量はオリゴ糖１−（２）の３倍程度である
ことが判明した。

【０１１７】また、７糖残基の繰り返しの結合位置は、
オリゴ糖４の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを詳細に検討する
ことにより、式（ＩＶ）中のＦ６のフコースの３位にα
−（１→３）結合でつながっていることが明らかとなっ
た。

【０１１８】さらに上記方法に準じ、硫酸化多糖の分解
物中より、（Ｉ）で表される硫酸化糖の１〜５量体、す
なわち下記一般式（Ｉ）においてｎ＝１〜５で表される
硫酸化糖を得た。

【化４５】 （式中、ＲはＨ又はＳＯ_３Ｈであり、Ｒの少なくとも１
つはＳＯ_３Ｈである。）

【０１１９】以上のことから、ガゴメ昆布のような褐藻
類から得られた硫酸化フカン含有多糖を、硫酸化フカン
分解酵素で処理することにより低分子化され、上記一般
式で表される硫酸化糖を構成糖の必須成分とする硫酸化
多糖が得られることが確認できた。また、該硫酸化多糖
の分子量をゲル濾過法を用いて、測定したところ、抽出
条件がｐＨ６〜８、９５℃ 約２時間の場合は、平均分
子量は約２０万であった。

【０１２０】（２）上記（１）で得られた硫酸化糖につ
いて、生理活性を調べた。その結果、式（Ｉ）で示され
る硫酸化糖は、国際公開第００／６２７８５号パンフレ
ット、実施例１−（２）記載の方法で、ＨＧＦ産生誘導
活性を調べたところ、当該活性が確認できた。また、式
（Ｉ）の硫酸化糖について、国際公開第９９／４１２８
８号パンフレット、実施例８ならびに実施例９記載の方
法で保湿性を調べたところ、非常に有用であることが確
認できた。

【０１２１】

【発明の効果】本発明により硫酸化フカン分解酵素を使
用した糖鎖工学用試薬として有用な様々な分子量の硫酸
化フカンオリゴ糖の製造方法が提供される。また、構造
が解明された種々の硫酸化フカンオリゴ糖が提供され
る。

【０１２２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TAKARA BIO INC. <120> Sulfated fucan oligosaccharide <130> 185585 <160> 1 <210> 1 <211> 1506 <212> DNA <213> Fucanobacter lyticus <400> 1 agagtttgat cctggctcag attgaacgct ggcggcaggc ttaacacatg caagtcgagc 60 ggaaacgaga atagcttgct attcggcgtc gagcggcgga cgggtgagta atgcttggga 120 atatgcctaa tggtggggga caacagttgg aaacgactgc taataccgca taatgtctac 180 ggaccaaagg aggggattct tcggaacctt tcgccatttg attagcccaa gtgagattag 240 ctagtaggta aggtaatggc ttacctaggc gacgatctct agctggtttg agaggatgat 300 cagccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat 360 tgcacaatgg gcgaaagcct gatgcagcca tgccgcgtgt gtgaagaagg ccttcgggtt 420 gtaaagcact ttcagcgagg aggaaagggt gtagattaat actctgcatc tgtgacgtta 480 ctcgcagaag aagcaccggc taacttcgtg ccagcagccg cggtaatacg aggggtgcaa 540 gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg tgcgtaggtg gtttgttaag caagatgtga 600 aagccccggg ctcaacctgg gaactgcatt ttgaactggc aaactagagt tttgtagagg 660 gtagtggaat ttccagtgta gcggtgaaat gcgtagagat tggaaggaac atcagtggcg 720 aaggcggcta cctggacaga gactgacact gaggcacgaa agcgtgggga gcaaacagga 780 ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgtcaact agccgtctgt agacttgatc 840 tgtgggtggc gtagctaacg cgctaagttg accgcctggg gagtacggcc gcaaggttaa 900 aactcaaatg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgatgc 960 aacgcgaaga accttaccat cccttgacat cctactaagt tactagagat agtttcgtgc 1020 cttcgggaaa gtagtgacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgttg tgaaatgttg 1080 ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccccta tccttatttg ctagcgcgta atggcgagaa 1140 ctctaaggag actgccggtg ataaaccgga ggaaggtggg gacgacgtca agtcatcatg 1200 gcccttacgg gatgggctac acacgtgcta caatggcaag tacagagggc agcaataccg 1260 cgaggtggag cgaatcccac aaagcttgtc gtagtccgga ttggagtctg caactcgact 1320 ccatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgtag atcagaatgc tacggtgaat acgttcccgg 1380 gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtgggttg caaaagaagt ggctagttta 1440 acccttcggg gaggacggtc accactttgt gattcatgac tggggtgaag tcgtaacaag 1500 gtagcc 1506

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖
１−（１）の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。

【図２】 本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖
１−（１）の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図であ
る。

【図３】 本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖
１−（１）の質量分析（マス）スペクトルを示す図であ
る。

【図４】 本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖
１−（２）の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。

【図５】 本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖
１−（２）の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図であ
る。

【図６】 本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖
１−（２）の質量分析（マス）スペクトルを示す図であ
る。

【図７】 本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖
１−（３）の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。

【図８】 本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖
１−（３）の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図であ
る。

【図９】 本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖
１−（３）の質量分析（マス）スペクトルを示す図であ
る。

【図１０】 本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ
糖１−（４）の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図であ
る。

【図１１】 本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ
糖１−（４）の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図であ
る。

【図１２】 本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ
糖１−（４）の質量分析（マス）スペクトルを示す図で
ある。

【図１３】 本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ
糖２−（１）−２の ^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図で
ある。

【図１４】 本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ
糖２−（１）−２の ^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図
である。

【図１５】 本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ
糖２−（１）−２の質量分析（マス）スペクトルを示す
図である。

【図１６】 本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ
糖２−（２）の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図であ
る。

【図１７】 本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ
糖２−（２）の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図であ
る。

【図１８】 本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ
糖２−（２）の質量分析（マス）スペクトルを示す図で
ある。

【図１９】 本発明により得られるレッソニア ニグレ
ッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）の^１Ｈ−ＮＭ
Ｒスペクトルを示す図である。

【図２０】 本発明により得られるレッソニア ニグレ
ッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）の^１３Ｃ−Ｎ
ＭＲスペクトルを示す図である。

【図２１】 本発明により得られるレッソニア ニグレ
ッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（１）の質量分析
（マス）スペクトルを示す図である。

【図２２】 本発明により得られるレッソニア ニグレ
ッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（２）の^１Ｈ−ＮＭ
Ｒスペクトルを示す図である。

【図２３】 本発明により得られるレッソニア ニグレ
ッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（２）の^１３Ｃ−Ｎ
ＭＲスペクトルを示す図である。

【図２４】 本発明により得られるレッソニア ニグレ
ッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（２）の質量分析
（マス）スペクトルを示す図である。

【図２５】 本発明により得られるレッソニア ニグレ
ッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（３）の^１Ｈ−ＮＭ
Ｒスペクトルを示す図である。

【図２６】 本発明により得られるレッソニア ニグレ
ッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（３）の^１３Ｃ−Ｎ
ＭＲスペクトルを示す図である。

【図２７】 本発明により得られるレッソニア ニグレ
ッセンス硫酸化フカンオリゴ糖１−（３）の質量分析
（マス）スペクトルを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 児島 薫 青森県弘前市富士見町８−14 (72)発明者 嶋中 一夫 大阪府高槻市寺谷町14番20号 (72)発明者 猪飼 勝重 滋賀県甲賀郡甲南町希望ヶ丘本町９−421 −45 (72)発明者 加藤 郁之進 京都府宇治市南陵町１−１−150 Ｆターム(参考） 4B064 AF04 AF11 CA21 CB07 CC03 CC06 CC07 CD02 CD06 CE07 CE11 DA01 DA05 4C057 AA02 CC05 DD03 GG02 4C090 AA01 AA04 BA52 BB11 BB34 BB36 BB54 BB84 BC20 BD35 CA43 DA23

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の理化学的性質を有することを特徴と
   する硫酸化フカン又はその塩： （１）構成糖：フコースを含有し、（２）下記一般式
   （Ｉ）で表される硫酸化糖を構成糖の必須成分とする： 【化１】 （式中、ＲはＨ又はＳＯ_３Ｈであって、Ｒの少なくとも
   １つはＳＯ_３Ｈであり、ｎは１以上の整数である）、
   （３）Alteromonas sp. SN-1009由来の硫酸化フカン分
   解酵素により低分子化され、下記一般式（ＩＩ）、（Ｉ
   ＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）、（ＸＶ）、（ＸＶ
   Ｉ）で表される化合物より選択される１種類以上の化合
   物が生成する： 【化２】 【化３】 【化４】 【化５】 【化６】 【化７】 （全式中、ＲはＨ又はＳＯ_３Ｈであり、Ｒの少なくとも
   １つはＳＯ_３Ｈである。）
2. 【請求項２】下記一般式（Ｉ）中、ｎが１〜５であるこ
   とを特徴とする硫酸化フカンオリゴ糖。 【化８】 （式中、ＲはＨ又はＳＯ_３Ｈであり、Ｒの少なくとも１
   つはＳＯ_３Ｈである。）
3. 【請求項３】請求項１または２記載の硫酸化フカンにAl
   teromonas sp. SN-1009由来の硫酸化フカン分解酵素を
   作用させてその分解物を採取することを特徴とする硫酸
   化フカンオリゴ糖の調製方法。
4. 【請求項４】硫酸化フカンがガゴメ（Kjellmaniella cr
   assifolia）、マコンブ（Laminaria japonica）、ある
   いはレッソニア ニグレッセンス（Lessonianigrescen
   s）由来である請求項３記載の硫酸化フカンオリゴ糖の
   調製方法。
5. 【請求項５】請求項３記載の方法で調製される硫酸化フ
   カンオリゴ糖。
6. 【請求項６】下記一般式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＸＩ
   ＩＩ）、（ＸＩＶ）、（ＸＶ）、（ＸＶＩ）から選択さ
   れる化学構造を有する硫酸化フカンオリゴ糖またはその
   塩： 【化９】 【化１０】 【化１１】 【化１２】 【化１３】 【化１４】 （全式中、ＲはＨ又はＳＯ_３Ｈであり、Ｒの少なくとも
   １つはＳＯ_３Ｈである。）