JP2003185930A - 光学系の薄層斜光照明法 - Google Patents
光学系の薄層斜光照明法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 顕微鏡と同等の光学系を用いて光を使って物
質や分子の高感度検出と光学顕微鏡における低背景・高
感度観察が可能な薄層斜光照明法を提供する。 【解決手段】 試料における照明光の厚さをｄ、試料に
おける照明光の入射角をθ、対物しンズ後焦点面におけ
る照明光の中心軸からの距離をＸ、照明光の対物レンズ
への入射角をφ、照明光の対物レンズ入射の開き角の半
分をδφとすると、試料における照明光の厚さをｄを与
える式 ｄ＝２ｒ・cosθにおいて、試料への照明光の入
射角θはＸとφによって決まり、試料観察面での照射半
径ｒはδφによって決まる値であることがわかる。従っ
て、照明光の厚さｄを薄くすることは、cosθおよびｒ
を小さくすることにより実現できる。
質や分子の高感度検出と光学顕微鏡における低背景・高
感度観察が可能な薄層斜光照明法を提供する。 【解決手段】 試料における照明光の厚さをｄ、試料に
おける照明光の入射角をθ、対物しンズ後焦点面におけ
る照明光の中心軸からの距離をＸ、照明光の対物レンズ
への入射角をφ、照明光の対物レンズ入射の開き角の半
分をδφとすると、試料における照明光の厚さをｄを与
える式 ｄ＝２ｒ・cosθにおいて、試料への照明光の入
射角θはＸとφによって決まり、試料観察面での照射半
径ｒはδφによって決まる値であることがわかる。従っ
て、照明光の厚さｄを薄くすることは、cosθおよびｒ
を小さくすることにより実現できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、物質や分子を光を
使って高感度検出する顕微鏡と同等の光学系の薄層斜光
照明法に関する。
使って高感度検出する顕微鏡と同等の光学系の薄層斜光
照明法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、物質や分子を光を使って高感度検
出する光学顕微鏡の照明技術は種々のものが提案されて
おり、その内の幾つかを以下に説明する。図９は、蛍光
顕微鏡の照明として、現在一般的に使われている落射照
明方法の概略図である。図に示すように、光源からの光
を、照射光は反射し、蛍光は透過させるダイクロイック
ミラーで反射させて、対物レンズ中央に入射し、試料観
察面を照射するものである。
出する光学顕微鏡の照明技術は種々のものが提案されて
おり、その内の幾つかを以下に説明する。図９は、蛍光
顕微鏡の照明として、現在一般的に使われている落射照
明方法の概略図である。図に示すように、光源からの光
を、照射光は反射し、蛍光は透過させるダイクロイック
ミラーで反射させて、対物レンズ中央に入射し、試料観
察面を照射するものである。
【０００３】また、ガラス表面近傍のみを局所的に照明
する方法として、全反射照明法がある。全反射した際に
生じるエバネッセント光（深さ１００２００ｎｍ程度）
を使って照明するものである。プリズムを使う方法と対
物レンズを使う方法があるが、図１０に対物レンズ型全
反射照明法の概略図を示す。対物レンズの開口数をＮ
Ａ、試料溶液の屈折率をｎとしたとき、開口数（ＮＡ）
がＮＡ＞ｎの式を満たす対物レンズにより全反射照明が
可能となる。この方法は、従来、極く限られた利用のみ
であったが、蛍光色素１分子を蛍光顕微鏡で観察する方
法として有用であることが判明し、最近１分子イメージ
ング用に使用され始めている。
する方法として、全反射照明法がある。全反射した際に
生じるエバネッセント光（深さ１００２００ｎｍ程度）
を使って照明するものである。プリズムを使う方法と対
物レンズを使う方法があるが、図１０に対物レンズ型全
反射照明法の概略図を示す。対物レンズの開口数をＮ
Ａ、試料溶液の屈折率をｎとしたとき、開口数（ＮＡ）
がＮＡ＞ｎの式を満たす対物レンズにより全反射照明が
可能となる。この方法は、従来、極く限られた利用のみ
であったが、蛍光色素１分子を蛍光顕微鏡で観察する方
法として有用であることが判明し、最近１分子イメージ
ング用に使用され始めている。
【０００４】更に、本発明者が提案し、特許第３０９３
1４５号として既に特許されている光照射切り替え方法
の概略を図１１に示す。１は試料溶液、２はカバーガラ
ス、３はオイル、４は対物レンズ（レンズ群）、５は照
射光、６は照射光、７はダイクロイックミラーである。
落射照明から全反射照明の状態への変更を、ミラー等の
光学部品を図１１（Ａ）→１１（Ｂ）→図１１（Ｃ）へ
と移動することのみで実現することができ、余分な光学
系を必要とせず、簡単な原理で照射の切替を行えること
ができる。また、この方法では、入射光位置又は光源位
置（例えば光ファイバーの出射位置）をずらすことによ
っても同等の状態変更を実現することができる。
1４５号として既に特許されている光照射切り替え方法
の概略を図１１に示す。１は試料溶液、２はカバーガラ
ス、３はオイル、４は対物レンズ（レンズ群）、５は照
射光、６は照射光、７はダイクロイックミラーである。
落射照明から全反射照明の状態への変更を、ミラー等の
光学部品を図１１（Ａ）→１１（Ｂ）→図１１（Ｃ）へ
と移動することのみで実現することができ、余分な光学
系を必要とせず、簡単な原理で照射の切替を行えること
ができる。また、この方法では、入射光位置又は光源位
置（例えば光ファイバーの出射位置）をずらすことによ
っても同等の状態変更を実現することができる。
【０００５】また、他の方法として、通常の光学顕微鏡
や落射照明法による蛍光顕微鏡において、セクショニン
グ像や３次元画像を得る方法としては、焦点を連続的に
変化させて得た連続画像からデコンボリューションによ
って計算する方法が用いられている。これは、試料上の
１点から出た光の像が、焦点からはずれた時にどうなる
かを予め知っておくことにより、計算によって元の３次
元像を計算するものであるが、厚みのある試料や、明る
い中にある暗い部分を観察する場合には、この方法では
限界がある。
や落射照明法による蛍光顕微鏡において、セクショニン
グ像や３次元画像を得る方法としては、焦点を連続的に
変化させて得た連続画像からデコンボリューションによ
って計算する方法が用いられている。これは、試料上の
１点から出た光の像が、焦点からはずれた時にどうなる
かを予め知っておくことにより、計算によって元の３次
元像を計算するものであるが、厚みのある試料や、明る
い中にある暗い部分を観察する場合には、この方法では
限界がある。
【０００６】また、他の方法として、セクショニング像
や３次元画像を用いる方法としては、現在、共焦点顕微
鏡法が広く普及している。この方法は、高感度カメラに
比べると感度が劣っており、特に蛍光試料の観察におい
ては、レーザー光を１点に集光して照射するために、蛍
光色素の退色が早くなったり、生物試料に損傷を与える
などの難点がある。
や３次元画像を用いる方法としては、現在、共焦点顕微
鏡法が広く普及している。この方法は、高感度カメラに
比べると感度が劣っており、特に蛍光試料の観察におい
ては、レーザー光を１点に集光して照射するために、蛍
光色素の退色が早くなったり、生物試料に損傷を与える
などの難点がある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】このように、従来の方
法では、厚みのある試料や明るい中にある暗い部分の観
察において、高感度、高Ｓ／Ｎ比を得ることができなか
った。そこで本発明は、顕微鏡と同等の光学系を用いて
光を使って物質や分子を高感度検出することを可能と
し、光学顕微鏡における低背景・高感度観察を可能にす
る光学系の薄層斜光照明法を提供することを目的とす
る。
法では、厚みのある試料や明るい中にある暗い部分の観
察において、高感度、高Ｓ／Ｎ比を得ることができなか
った。そこで本発明は、顕微鏡と同等の光学系を用いて
光を使って物質や分子を高感度検出することを可能と
し、光学顕微鏡における低背景・高感度観察を可能にす
る光学系の薄層斜光照明法を提供することを目的とす
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、この発明の請求項１に係る光学系の薄層斜光照明法
は、対物レンズを用いたレンズ光学系の斜光照明におい
て、試料への照明光入射角度を対物レンズ光軸に垂直に
近い角度にし、照射領域を絞ることにより、薄い層状の
光で試料を照明する構成とした。
に、この発明の請求項１に係る光学系の薄層斜光照明法
は、対物レンズを用いたレンズ光学系の斜光照明におい
て、試料への照明光入射角度を対物レンズ光軸に垂直に
近い角度にし、照射領域を絞ることにより、薄い層状の
光で試料を照明する構成とした。
【０００９】これにより、対物レンズを用いた斜光照明
において、照射領域を絞ることにより、薄い層状の光で
試料を照明することができ、光学顕微鏡においては、低
背景・高感度のセクショニング像や３次元画像を得るこ
とができる。
において、照射領域を絞ることにより、薄い層状の光で
試料を照明することができ、光学顕微鏡においては、低
背景・高感度のセクショニング像や３次元画像を得るこ
とができる。
【００１０】この発明の請求項２に係る光学系の薄層斜
光照明法は、対物レンズを用いたレンズ光学系の斜光照
明において、試料の屈折率よりも閉口数が大きい対物レ
ンズを用い、試料への照明光入射角度をさらに対物レン
ズ光軸に垂直に近い角度にし、照射領域を絞ることによ
り、より薄い層状の光で試料を照明する構成とした。
光照明法は、対物レンズを用いたレンズ光学系の斜光照
明において、試料の屈折率よりも閉口数が大きい対物レ
ンズを用い、試料への照明光入射角度をさらに対物レン
ズ光軸に垂直に近い角度にし、照射領域を絞ることによ
り、より薄い層状の光で試料を照明する構成とした。
【００１１】これにより、閉口数の大きい対物レンズを
用いるほど照明光を薄くでき、試料の屈折率よりも開口
数が大きい対物レンズを用いて、試料への照明光入射角
度を更に光軸に垂直に近くすることで、より薄い光で照
明することができる。
用いるほど照明光を薄くでき、試料の屈折率よりも開口
数が大きい対物レンズを用いて、試料への照明光入射角
度を更に光軸に垂直に近くすることで、より薄い光で照
明することができる。
【００１２】この発明の請求項３に係る光学系の薄層斜
光照明法は、対物レンズを用いたレンズ光学系の斜光照
明において、焦点位置を変えて異なる高さの試料面を観
察する場合に、照明光の対物レンズへの入射角を変える
ことにより、試料観察面における照明光の入射角を一定
に保つように構成した。
光照明法は、対物レンズを用いたレンズ光学系の斜光照
明において、焦点位置を変えて異なる高さの試料面を観
察する場合に、照明光の対物レンズへの入射角を変える
ことにより、試料観察面における照明光の入射角を一定
に保つように構成した。
【００１３】これにより、対物レンズの焦点位置を変え
て、試料観察面のカバーガラス表面からの高さを変えて
も、対物レンズへの照明光の入射角を変えることによ
り、同じ入射角で試料を照明することができる。
て、試料観察面のカバーガラス表面からの高さを変えて
も、対物レンズへの照明光の入射角を変えることによ
り、同じ入射角で試料を照明することができる。
【００１４】この発明の請求項４に係る光学系の薄層斜
光照明法は、カメラ等の受光素子の受光面、あるいは結
像レンズを傾けることにより、試料観察面を傾け、斜光
照明光と試料観察面を平行若しくはほぼ平行にして観察
可能にする構成とした。
光照明法は、カメラ等の受光素子の受光面、あるいは結
像レンズを傾けることにより、試料観察面を傾け、斜光
照明光と試料観察面を平行若しくはほぼ平行にして観察
可能にする構成とした。
【００１５】この発明の請求項５に係る光学系の薄層斜
光照明法は、カメラ等の受光素子の受光面、あるいは結
像レンズを傾けることにより、試料観察面を傾け、斜光
照明光と試料観察面を平行若しくはほぼ平行にして観察
可能にし、試料観察面を傾ける場合に、対物レンズに入
射する照明光の形を細長くし、試料を照明する薄層光を
さらに薄くする構成とした。
光照明法は、カメラ等の受光素子の受光面、あるいは結
像レンズを傾けることにより、試料観察面を傾け、斜光
照明光と試料観察面を平行若しくはほぼ平行にして観察
可能にし、試料観察面を傾ける場合に、対物レンズに入
射する照明光の形を細長くし、試料を照明する薄層光を
さらに薄くする構成とした。
【００１６】これにより、試料観察面を傾けている場合
には、観察視野の大きさは、カバーガラスに平行な面に
よる照明光の断面形状の照明光進行方向の半径には依存
せず、垂直な方向の半径によって決まるので、照明光進
行方向に垂直な方向の半径は大きくし、照明光進行方向
の半径は小さくした細長い形の入射光を用いると、観察
視野を狭めることなく、照明光の厚さを薄くすることが
できる。
には、観察視野の大きさは、カバーガラスに平行な面に
よる照明光の断面形状の照明光進行方向の半径には依存
せず、垂直な方向の半径によって決まるので、照明光進
行方向に垂直な方向の半径は大きくし、照明光進行方向
の半径は小さくした細長い形の入射光を用いると、観察
視野を狭めることなく、照明光の厚さを薄くすることが
できる。
【００１７】この発明の請求項６に係る光学系の薄層斜
光照明法は、複数の入射光の使用や、回転等による入射
位置の移動によって、偏りのない薄層斜光照明を行うよ
うな構成とした。
光照明法は、複数の入射光の使用や、回転等による入射
位置の移動によって、偏りのない薄層斜光照明を行うよ
うな構成とした。
【００１８】この発明の請求項７に係る光学系の薄層斜
光照明法は、上記請求項１乃至請求項６の光学系が蛍光
顕微鏡や暗視野顕微鏡などの光学顕微鏡、対物レンズを
用いたレンズ光学系にも適用可能な構成とした。
光照明法は、上記請求項１乃至請求項６の光学系が蛍光
顕微鏡や暗視野顕微鏡などの光学顕微鏡、対物レンズを
用いたレンズ光学系にも適用可能な構成とした。
【００１９】これにより、光学顕微鏡はもとより各種の
顕微鏡及び光を用いた検出において、低背景の画像及び
低バックグラウンドのシグナルを得ることができる。そ
の結果として、高感度・高いＳ／Ｎ比の画像及びシグナ
ルを得ることができる。
顕微鏡及び光を用いた検出において、低背景の画像及び
低バックグラウンドのシグナルを得ることができる。そ
の結果として、高感度・高いＳ／Ｎ比の画像及びシグナ
ルを得ることができる。
【００２０】この発明の請求項８に係る光学系の薄層斜
光照明法は、蛍光顕微鏡、原子間力顕微鏡、トンネル顕
微鏡、又はフォトトンネル顕微鏡の光学系において、薄
層光照明を用いた顕微鏡観察を、焦点位置を移動させな
がら連続画像を得て、デコンボリューションによってセ
クショニング画像及び３次元画像を得る構成した。
光照明法は、蛍光顕微鏡、原子間力顕微鏡、トンネル顕
微鏡、又はフォトトンネル顕微鏡の光学系において、薄
層光照明を用いた顕微鏡観察を、焦点位置を移動させな
がら連続画像を得て、デコンボリューションによってセ
クショニング画像及び３次元画像を得る構成した。
【００２１】これにより、薄層光照明を用いた顕微鏡観
察から、焦点位置を移動させながら連続画像を得て、デ
コンボリューションによってセクショニング画像及び３
次元画像を得ることができ、背景光が低く高画質であ
る。また、試料の照明が薄い層状領域のみの局所的であ
るので、得られる蛍光像を高感度カメラであるイメージ
ングインテンシファイアーＣＣＤによって観察すること
により、蛍光色素１分子を可視化できる。
察から、焦点位置を移動させながら連続画像を得て、デ
コンボリューションによってセクショニング画像及び３
次元画像を得ることができ、背景光が低く高画質であ
る。また、試料の照明が薄い層状領域のみの局所的であ
るので、得られる蛍光像を高感度カメラであるイメージ
ングインテンシファイアーＣＣＤによって観察すること
により、蛍光色素１分子を可視化できる。
【００２２】
【発明の実施の形態】本発明は、対物レンズを用いたレ
ンズ光学系の斜光照明において、試料を薄い層状の光で
照明することにより、照明光のあたる領域が局所的に制
限されて、背景光を低くすることができ、高感度で高い
Ｓ／Ｎ比の画像およびシグナルを得ることができること
に依拠するものである。光学系としては蛍光顕微鏡や暗
視野顕微鏡などの光学顕微鏡はもとより、対物レンズを
用いたレンズ光学系にも広く適用できるものである。次
に、本発明の実施形態を図１乃至図８に基づいて以下に
詳述する。
ンズ光学系の斜光照明において、試料を薄い層状の光で
照明することにより、照明光のあたる領域が局所的に制
限されて、背景光を低くすることができ、高感度で高い
Ｓ／Ｎ比の画像およびシグナルを得ることができること
に依拠するものである。光学系としては蛍光顕微鏡や暗
視野顕微鏡などの光学顕微鏡はもとより、対物レンズを
用いたレンズ光学系にも広く適用できるものである。次
に、本発明の実施形態を図１乃至図８に基づいて以下に
詳述する。
【００２３】図１に照明光の厚さを求める原理を示す。
図において、試料観察面での照射半径をｒ、試料におけ
る照明光の厚さをｄ、試料における照明光の入射角（又
は、照明光と対物レンズ光軸とのなす角）をθとする
と、
図において、試料観察面での照射半径をｒ、試料におけ
る照明光の厚さをｄ、試料における照明光の入射角（又
は、照明光と対物レンズ光軸とのなす角）をθとする
と、
【数１】ｄ＝２ｒ・cosθ
の関係式により、試料における照明光の厚さｄを求める
ことができる。
ことができる。
【００２４】図２に光学系の対物レンズに関連する部分
拡大図を示す。図において、１は試料媒体（溶液等）、
２はカバーガラス、３はオイル、４は対物レンズ（レン
ズ群）、５は照射光である。光源からの照射光はダイク
ロイックミラー（図示なし）で直角に屈折されて照射光
５となり、オイル３、カバーガラス２を経て試料媒体１
に斜光照明される。
拡大図を示す。図において、１は試料媒体（溶液等）、
２はカバーガラス、３はオイル、４は対物レンズ（レン
ズ群）、５は照射光である。光源からの照射光はダイク
ロイックミラー（図示なし）で直角に屈折されて照射光
５となり、オイル３、カバーガラス２を経て試料媒体１
に斜光照明される。
【００２５】図２において、試料における照明光の厚さ
をｄ、試料における照明光の入射角をθ、対物しンズ後
焦点面における照明光の中心軸からの距離をＸ、照明光
の対物レンズへの入射角をφ、照明光の対物レンズ入射
の開き角の半分をδφとすると、試料における照明光の
厚さｄを与える式 ｄ＝２ｒ・cosθにおいて、試料への
照明光の入射角θはＸとφによって決まり、試料観察面
での照射半径ｒはδφによって決まる値であることがわ
かる。従って、照明光の厚さｄを薄くすることは、cos
θおよびｒを小さくすることにより実現できる。
をｄ、試料における照明光の入射角をθ、対物しンズ後
焦点面における照明光の中心軸からの距離をＸ、照明光
の対物レンズへの入射角をφ、照明光の対物レンズ入射
の開き角の半分をδφとすると、試料における照明光の
厚さｄを与える式 ｄ＝２ｒ・cosθにおいて、試料への
照明光の入射角θはＸとφによって決まり、試料観察面
での照射半径ｒはδφによって決まる値であることがわ
かる。従って、照明光の厚さｄを薄くすることは、cos
θおよびｒを小さくすることにより実現できる。
【００２６】cosθを小さくするには、θを９０度に近
づければ良いが、そのためにＸを大きくする。即ち、対
物レンズの縁に光を入射し、試料において対物レンズ光
軸と垂直に近い角度で斜光照明をおこなう。更に、対物
レンズへの入射角φを調節して、θを９０度近くにす
る。
づければ良いが、そのためにＸを大きくする。即ち、対
物レンズの縁に光を入射し、試料において対物レンズ光
軸と垂直に近い角度で斜光照明をおこなう。更に、対物
レンズへの入射角φを調節して、θを９０度近くにす
る。
【００２７】照射半径ｒを小さくするためには、δφを
小さくすれば良い。その際、ｒを小さくすると観察視野
が狭められるので、観察視野の許す範囲において、ｒを
小さくする必要がある。
小さくすれば良い。その際、ｒを小さくすると観察視野
が狭められるので、観察視野の許す範囲において、ｒを
小さくする必要がある。
【００２８】こうして、対物レンズを用いた斜光照明に
おいて、試料への照明光入射角度を対物レンズ光軸に垂
直に近い角度にし、照射領域を絞ることにより、薄い層
状の光で試料を照明することができる。そして、光学顕
微鏡においては、低背景・高感度のセクショニング像や
３次元画像を得ることができる。
おいて、試料への照明光入射角度を対物レンズ光軸に垂
直に近い角度にし、照射領域を絞ることにより、薄い層
状の光で試料を照明することができる。そして、光学顕
微鏡においては、低背景・高感度のセクショニング像や
３次元画像を得ることができる。
【００２９】また、閉口数の大きい対物レンズを用いる
ほど照明光を薄くできるが、試料の屈折率よりも開口数
が大きい対物レンズを用いて、試料への照明光入射角度
を更に光軸に垂直に近くすることで、より薄い光で照明
することができる。対物レンズの開口数（ＮＡ）が大き
いほど、図２においてＸを大きくすることができ、照明
光の入射角θが大きくなるので、その結果として、照明
光の厚さｄを薄くすることができる。
ほど照明光を薄くできるが、試料の屈折率よりも開口数
が大きい対物レンズを用いて、試料への照明光入射角度
を更に光軸に垂直に近くすることで、より薄い光で照明
することができる。対物レンズの開口数（ＮＡ）が大き
いほど、図２においてＸを大きくすることができ、照明
光の入射角θが大きくなるので、その結果として、照明
光の厚さｄを薄くすることができる。
【００３０】次に、図３を参照して、対物レンズの開口
数ＮＡで決まるＸの最大値をＸNA、試料の屈折率ｎで決
まる全反射が起こるＸの境界値をＸn とすると、閉口数
ＮＡが試料の屈折率ｎよりも大きいレンズでは、図３
（Ａ）に示すように、Ｘを大きくすると全反射が起こり
試料を照明できなくなる。
数ＮＡで決まるＸの最大値をＸNA、試料の屈折率ｎで決
まる全反射が起こるＸの境界値をＸn とすると、閉口数
ＮＡが試料の屈折率ｎよりも大きいレンズでは、図３
（Ａ）に示すように、Ｘを大きくすると全反射が起こり
試料を照明できなくなる。
【００３１】しかし、図３（Ｂ）に示すように、対物レ
ンズへの入射角φを調節することにより、全反射を起こ
すことなく試料を斜光照明することができる。この方法
を用いると、照明光の入射角θを９０度により近い値に
することが可能となり、照明光の厚さｄを更に薄くする
ことができる。
ンズへの入射角φを調節することにより、全反射を起こ
すことなく試料を斜光照明することができる。この方法
を用いると、照明光の入射角θを９０度により近い値に
することが可能となり、照明光の厚さｄを更に薄くする
ことができる。
【００３２】次に、対物レンズの焦点位置を変えて、試
料観察面のカバーガラス表面からの高さＺを変える場合
について図４を参照して説明する。図４（Ａ）は対物レ
ンズへの照明光の入射角φでは、試料観察面のカバーガ
ラス表面からの高さはＺであることを示す。
料観察面のカバーガラス表面からの高さＺを変える場合
について図４を参照して説明する。図４（Ａ）は対物レ
ンズへの照明光の入射角φでは、試料観察面のカバーガ
ラス表面からの高さはＺであることを示す。
【００３３】図４（Ｂ）は対物レンズへの照明光の入射
角が（φ＋△φ）では、試料観察面のカバーガラス表面
からの高さは（Ｚ＋△Ｚ）となることを示す。それ故、
対物レンズの焦点位置を変えても対物レンズへの照明光
の入射角φを変えることにより、同じ入射角θで試料を
照明することができる。
角が（φ＋△φ）では、試料観察面のカバーガラス表面
からの高さは（Ｚ＋△Ｚ）となることを示す。それ故、
対物レンズの焦点位置を変えても対物レンズへの照明光
の入射角φを変えることにより、同じ入射角θで試料を
照明することができる。
【００３４】次に、カメラ等の受光素子の受光面を傾け
る場合、あるいは結像レンズを傾ける場合について図５
を参照して説明する。図５において、１は試料媒体（溶
液等）、２はカバーガラス、３はオイル、４は対物レン
ズ（レンズ群）、５は照射光、８は試料観察面、９は結
像レンズ、１０はカメラ等の受光素子である。図では、
レンズ系を単純化して描いているが、実際には中間にレ
ンズ群が入って構成されている。
る場合、あるいは結像レンズを傾ける場合について図５
を参照して説明する。図５において、１は試料媒体（溶
液等）、２はカバーガラス、３はオイル、４は対物レン
ズ（レンズ群）、５は照射光、８は試料観察面、９は結
像レンズ、１０はカメラ等の受光素子である。図では、
レンズ系を単純化して描いているが、実際には中間にレ
ンズ群が入って構成されている。
【００３５】図５（Ａ）はカメラ等の受光素子１０の受
光面を傾けることにより、試料観察面８を傾け、斜光照
明光５と試料観察面８を平行、若しくはほぼ平行にして
観察することができることを示している。
光面を傾けることにより、試料観察面８を傾け、斜光照
明光５と試料観察面８を平行、若しくはほぼ平行にして
観察することができることを示している。
【００３６】また、図５（Ｂ）は結像レンズ９を傾ける
ことにより、試料観察面８を傾け、斜光照明光５と試料
観察面８を平行もしくはほぼ平行にして観察することが
できることを示している。結像レンズ９を傾ける方法で
は、中間の光学系の変更によっても同等のことを行うこ
とができる。
ことにより、試料観察面８を傾け、斜光照明光５と試料
観察面８を平行もしくはほぼ平行にして観察することが
できることを示している。結像レンズ９を傾ける方法で
は、中間の光学系の変更によっても同等のことを行うこ
とができる。
【００３７】図５（Ａ）の試料観察面８を傾ける場合
に、対物レンズ４に入射する照明光の形を細長くし、試
料を照明する薄層光をさらに薄くすることができる。こ
のことを図６を参照して説明する。符号は上述の例と同
一である。
に、対物レンズ４に入射する照明光の形を細長くし、試
料を照明する薄層光をさらに薄くすることができる。こ
のことを図６を参照して説明する。符号は上述の例と同
一である。
【００３８】図６（Ｂ）は試料領域の照射光を上側から
みた拡大図である。照明光の厚さｄを与える式 ｄ＝２
ｒ・cosθにおける、ｒはカバーガラスに平行な面によ
る照明光の断面形状の、照明光進行方向の半径である。
試料観察面を傾けている場合には、観察視野の大きさは
ｒには依存せず、ｒに垂直な方向の半径ｒ’によって決
まる。従って、ｒ’は大きくし、ｒは小さくした細長い
形の入射光を用いると、観察視野を狭めることなく、照
明光の厚さｄを薄くすることができる。
みた拡大図である。照明光の厚さｄを与える式 ｄ＝２
ｒ・cosθにおける、ｒはカバーガラスに平行な面によ
る照明光の断面形状の、照明光進行方向の半径である。
試料観察面を傾けている場合には、観察視野の大きさは
ｒには依存せず、ｒに垂直な方向の半径ｒ’によって決
まる。従って、ｒ’は大きくし、ｒは小さくした細長い
形の入射光を用いると、観察視野を狭めることなく、照
明光の厚さｄを薄くすることができる。
【００３９】こうして、薄層光照明を用いた顕微鏡観察
から、焦点位置を移動させながら連続画像を得て、デコ
ンボリューションによってセクショニング画像及び３次
元画像を得ることができる。そして、本発明によると従
来法とは違って、背景光が低く高画質であることに加
え、試料の照明が薄い層状領域のみの局所的である。
から、焦点位置を移動させながら連続画像を得て、デコ
ンボリューションによってセクショニング画像及び３次
元画像を得ることができる。そして、本発明によると従
来法とは違って、背景光が低く高画質であることに加
え、試料の照明が薄い層状領域のみの局所的である。
【００４０】それ故に、試料観察面近傍の領域のみをデ
コンボリューションの計算対象とすれば良いという計算
上・画質上ともに大きな利点がある。従って、厚みのあ
る試料の観察、明るい中にある暗い部分の観察、１分子
観察のような高感度観察の、セクショニング画像及び３
次元画像を行うことを可能にする。
コンボリューションの計算対象とすれば良いという計算
上・画質上ともに大きな利点がある。従って、厚みのあ
る試料の観察、明るい中にある暗い部分の観察、１分子
観察のような高感度観察の、セクショニング画像及び３
次元画像を行うことを可能にする。
【００４１】更に、図７のように、複数の入射光または
回転対称な入射光の使用や、回転等による入射位置の移
動によって、偏りのない薄層光照明を行うことができ
る。
回転対称な入射光の使用や、回転等による入射位置の移
動によって、偏りのない薄層光照明を行うことができ
る。
【００４２】次に、本発明を適用して蛍光顕微鏡に薄層
斜光照明法を用いた例を図８に示す。図において、符号
は上述の例と同一物のものには同一符号を付しており、
１１は光学フィルタ、１２はミラー、１３は集光用レン
ズ、Ｒは照明レーザー光可変絞りの内径である。レーザ
ー光を照明光として用い、集光用レンズ１３によって対
物レンズ４の後焦点面にレーザー光を集光し、試料にお
ける照明光を平行光にする。
斜光照明法を用いた例を図８に示す。図において、符号
は上述の例と同一物のものには同一符号を付しており、
１１は光学フィルタ、１２はミラー、１３は集光用レン
ズ、Ｒは照明レーザー光可変絞りの内径である。レーザ
ー光を照明光として用い、集光用レンズ１３によって対
物レンズ４の後焦点面にレーザー光を集光し、試料にお
ける照明光を平行光にする。
【００４３】可変絞り径Ｒを変えて入射開き角δθを変
化させ、照射半径ｒを調節する。ミラー１２と集光用レ
ンズ１３を一体としてｔｘ方向に移動させることによ
り、入射位置Ｘを調節する。次に、ミラー１２へのレー
ザー光の入射位置をｔφ方向に移動すると、集光用レン
ズ１３を通過後の光路の傾きが変化するので、ｔφによ
って対物レンズ４への入射角φを調節する。以上の調節
によって、試料における照明光の層の厚さ ｄ＝２ｒ・c
osθを数ミクロンに設定することができる。
化させ、照射半径ｒを調節する。ミラー１２と集光用レ
ンズ１３を一体としてｔｘ方向に移動させることによ
り、入射位置Ｘを調節する。次に、ミラー１２へのレー
ザー光の入射位置をｔφ方向に移動すると、集光用レン
ズ１３を通過後の光路の傾きが変化するので、ｔφによ
って対物レンズ４への入射角φを調節する。以上の調節
によって、試料における照明光の層の厚さ ｄ＝２ｒ・c
osθを数ミクロンに設定することができる。
【００４４】実施例を挙げると、油浸１００倍 ＮＡ１.
４の対物レンズを用い、試料観察面における照射領域の
直径２ｒ＝３０μｍの時、試料における入射角θ＝８０
°でｄ＝５μｍ、入射角θ＝８４°でｄ＝３μｍとな
る。油浸６０倍 ＮＡ１.４の対物レンズを用い、試料観
察面における照射領域の直径２ｒ＝４５μｍの時、試料
における入射角θ＝８６°でｄ＝３μｍとなる。
４の対物レンズを用い、試料観察面における照射領域の
直径２ｒ＝３０μｍの時、試料における入射角θ＝８０
°でｄ＝５μｍ、入射角θ＝８４°でｄ＝３μｍとな
る。油浸６０倍 ＮＡ１.４の対物レンズを用い、試料観
察面における照射領域の直径２ｒ＝４５μｍの時、試料
における入射角θ＝８６°でｄ＝３μｍとなる。
【００４５】こうして、薄層斜光照明によって得られる
蛍光像を、高感度カメラであるイメージングインテンシ
ファイアーＣＣＤによって観察することにより、蛍光色
素１分子を可視化できる。
蛍光像を、高感度カメラであるイメージングインテンシ
ファイアーＣＣＤによって観察することにより、蛍光色
素１分子を可視化できる。
【００４６】また、他の適用例として、蛍光顕微鏡にお
いて、試料観察面を傾け、照明光を細長くし、高ＮＡ対
物しンズを用いて、薄層照明光を薄くする例を説明す
る。図８の蛍光顕微鏡において、図５の結像レンズを傾
ける方法により試料観察面を傾け、図６の細長い照明光
を使う方法を用いる。
いて、試料観察面を傾け、照明光を細長くし、高ＮＡ対
物しンズを用いて、薄層照明光を薄くする例を説明す
る。図８の蛍光顕微鏡において、図５の結像レンズを傾
ける方法により試料観察面を傾け、図６の細長い照明光
を使う方法を用いる。
【００４７】カバーガラスでの照明光の断面形状は、短
径２ｒ＝３０μｍ、長径２ｒ’＝1００μｍにする。こ
のようにすれば、１辺１００μｍの観察視野を得ること
ができ、観察視野を狭めることなく、照明光の厚みを薄
くできる。
径２ｒ＝３０μｍ、長径２ｒ’＝1００μｍにする。こ
のようにすれば、１辺１００μｍの観察視野を得ること
ができ、観察視野を狭めることなく、照明光の厚みを薄
くできる。
【００４８】式 ｄ＝２ｒ・c±sθから、試料における
照明光の層の厚さｄは、油浸６０倍ＮＡ１.４の対物レ
ンズを用いると、２ｒ＝３０μｍ、試料における照明光
の入射角θ＝８６°でｄ＝２μｍとなる。但し、厚さｄ
が光の波長（可視光で０.４〜０.７μｍ）に近くなるた
め、回折現象により光の層の上下に光の広がりが見られ
始める。
照明光の層の厚さｄは、油浸６０倍ＮＡ１.４の対物レ
ンズを用いると、２ｒ＝３０μｍ、試料における照明光
の入射角θ＝８６°でｄ＝２μｍとなる。但し、厚さｄ
が光の波長（可視光で０.４〜０.７μｍ）に近くなるた
め、回折現象により光の層の上下に光の広がりが見られ
始める。
【００４９】更に、ＮＡの大きい油浸６０倍 ＮＡ１.４
５の対物レンズを用いると、試料における入射角θ＝８
７°、即ち、カバーガラスとのなす角が３°となり、照
明光とカバーガラスとがほとんど平行になる。このよう
に平行に近づけることにより、結像レンズを傾けること
による画質への影響が無視できるようになる。光の厚さ
ｄに関しては、理論的には２μｍより薄くなるが、回折
光による厚みの広がりも強くなる。
５の対物レンズを用いると、試料における入射角θ＝８
７°、即ち、カバーガラスとのなす角が３°となり、照
明光とカバーガラスとがほとんど平行になる。このよう
に平行に近づけることにより、結像レンズを傾けること
による画質への影響が無視できるようになる。光の厚さ
ｄに関しては、理論的には２μｍより薄くなるが、回折
光による厚みの広がりも強くなる。
【００５０】本発明の光学系の薄層斜光照明と従来の斜
光照明法による照明光の厚みを実測比較すると、図１２
に示すように、例えば開口数ＮＡ＝１.４の対物レンズ
を用いた場合、従来の斜光照明法による照明光の厚みの
約半分の厚みが得られた。
光照明法による照明光の厚みを実測比較すると、図１２
に示すように、例えば開口数ＮＡ＝１.４の対物レンズ
を用いた場合、従来の斜光照明法による照明光の厚みの
約半分の厚みが得られた。
【００５１】本発明の薄層斜光照明法を用いた蛍光顕微
鏡観察によって、細胞内においても明瞭な１分子イメー
ジングが実現した。その結果、分子１個の動きや変化を
直接観察できるようになった。それと共に、分子１個の
蛍光強度を得ることによって、蛍光強度から細胞内にお
ける分子数を定量することも実現できた。更に、分子数
の定量から細胞内における分子間相互作用の結合分子数
と結合の強さを求めることを実現できた。
鏡観察によって、細胞内においても明瞭な１分子イメー
ジングが実現した。その結果、分子１個の動きや変化を
直接観察できるようになった。それと共に、分子１個の
蛍光強度を得ることによって、蛍光強度から細胞内にお
ける分子数を定量することも実現できた。更に、分子数
の定量から細胞内における分子間相互作用の結合分子数
と結合の強さを求めることを実現できた。
【００５２】現在、ナノテクノロジーのバイオへの応用
が強い興味を集めているが、１分子レベルの高感度検出
を可能にする本発明の薄層斜光照明法は、この分野にお
ける重要な要素技術になるものと考えられる。また、顕
微鏡技術としても、新しい顕微鏡法として発展すること
が期待される。
が強い興味を集めているが、１分子レベルの高感度検出
を可能にする本発明の薄層斜光照明法は、この分野にお
ける重要な要素技術になるものと考えられる。また、顕
微鏡技術としても、新しい顕微鏡法として発展すること
が期待される。
【００５３】
【発明の効果】以上のように、本発明の光学系の薄層斜
光照明法は、対物レンズを用いた斜光照明において、薄
い層状の光で試料を照明することにより、光学顕微鏡は
もとより各種の顕微鏡及び光を用いた検出において、低
背景の画像及び低バックグラウンドのシグナルを得るこ
とができる。その結果として、高感度・高いＳ／Ｎ比の
画像及びシグナルを得ることができる。
光照明法は、対物レンズを用いた斜光照明において、薄
い層状の光で試料を照明することにより、光学顕微鏡は
もとより各種の顕微鏡及び光を用いた検出において、低
背景の画像及び低バックグラウンドのシグナルを得るこ
とができる。その結果として、高感度・高いＳ／Ｎ比の
画像及びシグナルを得ることができる。
【００５４】また、薄層光照明を用いた顕微鏡観察か
ら、焦点位置を移動させながら連続画像を得て、デコン
ボリューションによってセクショニング画像及び３次元
画像を得ることができ、背景光が低く高画質である。ま
た、試料の照明が薄い層状領域のみの局所的であるの
で、得られる蛍光像を高感度カメラで観察することによ
り、蛍光色素１分子を可視化できると共に、分子１個の
蛍光強度を得ることによって、蛍光強度から細胞内にお
ける分子数を定量することも実現できる。更に、分子数
の定量から細胞内における分子間相互作用の結合分子数
と結合の強さを求めることを実現できる。
ら、焦点位置を移動させながら連続画像を得て、デコン
ボリューションによってセクショニング画像及び３次元
画像を得ることができ、背景光が低く高画質である。ま
た、試料の照明が薄い層状領域のみの局所的であるの
で、得られる蛍光像を高感度カメラで観察することによ
り、蛍光色素１分子を可視化できると共に、分子１個の
蛍光強度を得ることによって、蛍光強度から細胞内にお
ける分子数を定量することも実現できる。更に、分子数
の定量から細胞内における分子間相互作用の結合分子数
と結合の強さを求めることを実現できる。
【図１】本発明の照明光の厚さを求める原理図。
【図２】光学系の対物レンズに関連する部分拡大図。
【図３】対物レンズへの入射角を調節方法の概略図。
【図４】対物レンズの焦点位置を変える方法の概略図。
【図５】受光素子の受光面あるいは結像レンズを傾ける
方法の概略図。
方法の概略図。
【図６】対物レンズに入射する照明光の形を細長くする
方法の概略図。
方法の概略図。
【図７】複数の入射光または回転対称な入射光を使用す
る方法の概略図。
る方法の概略図。
【図８】蛍光顕微鏡の薄層斜光照明法の概略図。
【図９】蛍光顕微鏡の落射照明法の概略図。
【図１０】対物レンズ型全反射照明法の概略図。
【図１１】光照射切り替え方法の概略図。
【図１２】本発明方法と従来方法の照明光の厚めの比較
表。
表。
１ 試料媒体（溶液等）
２ カバーガラス
３ オイル
４ 対物レンズ（レンズ群）
５，６ 照射光
７ ダイクロイックミラー
８ 試料観察面
９ 結像レンズ
１０ 受光素子
１１ 光学フィルタ
１２ ミラー
１３ 集光用レンズ
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA16 CA09 EA01 FA02
GA02 GA03 GB02 GB03 HA01
HA02 JA02 KA09 LA02 LA03
MA01
2H052 AA09 AA13 AB02 AB15 AC04
AC09 AC27 AC34 AD31 AD34
AF14
Claims (8)
- 【請求項１】 対物レンズを用いたレンズ光学系の斜光
照明において、試料への照明光入射角度を対物レンズ光
軸に垂直に近い角度にし、照射領域を絞ることにより、
薄い層状の光で試料を照明することを特徴とする光学系
の薄層斜光照明法。 - 【請求項２】 試料の屈折率よりも閉口数が大きい対物
レンズを用いて、試料への照明光入射角度をさらに光軸
に垂直に近くし、より薄い光で試料を照明することを特
徴とする請求項１記載の光学系の薄層斜光照明法。 - 【請求項３】 対物レンズを用いたレンズ光学系の斜光
照明において、焦点位置を変えて異なる高さの試料面を
観察する場合に、照明光の対物レンズへの入射角を変え
ることにより、試料観察面における照明光の入射角を一
定に保つことを特徴とする光学系の薄層斜光照明法。 - 【請求項４】 カメラ等の受光素子の受光面、あるいは
結像レンズを傾けることにより、試料観察面を傾け、斜
光照明光と試料観察面を平行若しくはほぼ平行にして観
察可能にすることを特徴とする光学系の薄層斜光照明
法。 - 【請求項５】 試料観察面を傾ける場合に、対物レンズ
に入射する照明光の形を細長くし、試料を照明する薄層
光をさらに薄くすることを特徴とする請求項４記載の光
学系の薄層斜光照明法。 - 【請求項６】 複数の入射光の使用や、回転等による入
射位置の移動によって、偏りのない薄層斜光照明を行う
ことを特徴とする光学系の薄層斜光照明法。 - 【請求項７】 光学系が蛍光顕微鏡や暗視野顕微鏡など
の光学顕微鏡、対物レンズを用いたレンズ光学系である
ことを特徴とする請求項１乃至請求項６記載の光学系の
薄層斜光照明法。 - 【請求項８】 薄層光照明を用いた顕微鏡観察におい
て、焦点位置を移動させながら連続画像を得て、デコン
ボリューションによってセクショニング画像及び３次元
画像を得ることを特徴とする請求項７記載の光学系の薄
層斜光照明法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001380967A JP3828799B2 (ja) | 2001-12-14 | 2001-12-14 | 光学系の薄層斜光照明法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001380967A JP3828799B2 (ja) | 2001-12-14 | 2001-12-14 | 光学系の薄層斜光照明法 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003185930A true JP2003185930A (ja) | 2003-07-03 |
| JP2003185930A5 JP2003185930A5 (ja) | 2004-07-08 |
| JP3828799B2 JP3828799B2 (ja) | 2006-10-04 |
Family
ID=27591794
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001380967A Expired - Lifetime JP3828799B2 (ja) | 2001-12-14 | 2001-12-14 | 光学系の薄層斜光照明法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3828799B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006251209A (ja) * | 2005-03-09 | 2006-09-21 | Research Organization Of Information & Systems | 顕微鏡 |
| JP2006251208A (ja) * | 2005-03-09 | 2006-09-21 | Research Organization Of Information & Systems | 薄層斜光照明装置および顕微鏡 |
| WO2009080210A2 (de) * | 2007-12-20 | 2009-07-02 | Carl Zeiss Microimaging Gmbh | Mikroskop mit lichtblatt-beleuchtung |
| WO2014163159A1 (ja) | 2013-04-05 | 2014-10-09 | 独立行政法人理化学研究所 | 顕微鏡、焦準器具、流体保持器具、及び光学ユニット |
-
2001
- 2001-12-14 JP JP2001380967A patent/JP3828799B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006251209A (ja) * | 2005-03-09 | 2006-09-21 | Research Organization Of Information & Systems | 顕微鏡 |
| JP2006251208A (ja) * | 2005-03-09 | 2006-09-21 | Research Organization Of Information & Systems | 薄層斜光照明装置および顕微鏡 |
| JP4707089B2 (ja) * | 2005-03-09 | 2011-06-22 | 大学共同利用機関法人情報・システム研究機構 | 薄層斜光照明装置および顕微鏡 |
| WO2009080210A2 (de) * | 2007-12-20 | 2009-07-02 | Carl Zeiss Microimaging Gmbh | Mikroskop mit lichtblatt-beleuchtung |
| WO2009080210A3 (de) * | 2007-12-20 | 2009-08-20 | Zeiss Carl Microimaging Gmbh | Mikroskop mit lichtblatt-beleuchtung |
| US10054780B2 (en) | 2007-12-20 | 2018-08-21 | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Microscope |
| JP2014202967A (ja) * | 2013-04-05 | 2014-10-27 | 独立行政法人理化学研究所 | 顕微鏡、焦準器具、流体保持器具、及び光学ユニット |
| US9880378B2 (en) | 2013-04-05 | 2018-01-30 | Riken | Microscope, focusing unit, fluid holding unit, and optical unit |
| WO2014163159A1 (ja) | 2013-04-05 | 2014-10-09 | 独立行政法人理化学研究所 | 顕微鏡、焦準器具、流体保持器具、及び光学ユニット |
| US10222601B2 (en) | 2013-04-05 | 2019-03-05 | Riken | Microscope, focusing unit, fluid holding unit, and optical unit |
| DE202014011312U1 (de) | 2013-04-05 | 2019-05-09 | Riken | Mikroskop, Fokussierungseinheit, Flüssigkeitshalteeinheit und optische Einheit |
| DE202014011332U1 (de) | 2013-04-05 | 2019-06-06 | Riken | Mikroskop, Fokussierungseinheit, Flüssigkeitshalteeinheit und optische Einheit |
| EP3657229A2 (en) | 2013-04-05 | 2020-05-27 | Riken | Microscope, focusing unit, fluid holding unit, and optical unit |
| US10712547B2 (en) | 2013-04-05 | 2020-07-14 | Riken | Microscope, focusing unit, fluid holding unit, and optical unit |
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