JP2003159076A - Ｐｃｒ用プライマーおよびｐｃｒ用プライマーの塩基配列決定法 - Google Patents
Ｐｃｒ用プライマーおよびｐｃｒ用プライマーの塩基配列決定法Info
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＰＣＲの際、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮ
Ａ断片のアデニン付加が起こるが、アデニン付加を反応
条件を変えることなく、ピークを単一にするように起こ
させること。 【解決手段】 ５’末端にアンカー配列を持たせ、アン
カー配列の５’末端にＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔのいずれかの塩基
を持つＰＣＲ用プライマーを４種類用意し、それぞれＰ
ＣＲを各プライマーについて、アデニン付加効率を求
め、アデニン付加の起こりやすいアンカー配列をスクリ
ーニングしてアデニン付加の起こりやすいアンカー配列
を求め、求めたアンカー配列をもつプライマーを用いて
ＰＣＲを行う。
Ａ断片のアデニン付加が起こるが、アデニン付加を反応
条件を変えることなく、ピークを単一にするように起こ
させること。 【解決手段】 ５’末端にアンカー配列を持たせ、アン
カー配列の５’末端にＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔのいずれかの塩基
を持つＰＣＲ用プライマーを４種類用意し、それぞれＰ
ＣＲを各プライマーについて、アデニン付加効率を求
め、アデニン付加の起こりやすいアンカー配列をスクリ
ーニングしてアデニン付加の起こりやすいアンカー配列
を求め、求めたアンカー配列をもつプライマーを用いて
ＰＣＲを行う。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＰＣＲ用プライマ
ーおよびＰＣＲ用プライマーの塩基配列決定法に関し、
特に、ターミナルトランスフェラーゼ活性を持つ耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲ時におけるアデニン
の付加反応に好適な、ＰＣＲ用プライマーおよびＰＣＲ
用プライマーの配列決定法に関する。
ーおよびＰＣＲ用プライマーの塩基配列決定法に関し、
特に、ターミナルトランスフェラーゼ活性を持つ耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲ時におけるアデニン
の付加反応に好適な、ＰＣＲ用プライマーおよびＰＣＲ
用プライマーの配列決定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡあるいはＲＮＡを検出するには、
検体から得られたＤＮＡやＲＮＡの配列を増幅してから
検出することが一般的であり、そのためにＰＣＲ増幅が
行われるのが一般的である。ＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片
を検出するには、ＤＮＡ断片に放射性同位標識や化学発
光、蛍光による標識を行い、ゲル電気泳動などでサンプ
ルを分離した後標識物を検出する。最近ＤＮＡ断片にイ
ンターカレートする蛍光体や合成ＤＮＡの末端蛍光標識
が可能となり、よく用いられるようになってきている。
インターカレートする蛍光体を用いる場合には、アガロ
ースゲルで電気泳動したＤＮＡ断片を、エチジウムブロ
マイドやアクリジンオレンジ等のインターカレーターで
標識して検出する。
検体から得られたＤＮＡやＲＮＡの配列を増幅してから
検出することが一般的であり、そのためにＰＣＲ増幅が
行われるのが一般的である。ＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片
を検出するには、ＤＮＡ断片に放射性同位標識や化学発
光、蛍光による標識を行い、ゲル電気泳動などでサンプ
ルを分離した後標識物を検出する。最近ＤＮＡ断片にイ
ンターカレートする蛍光体や合成ＤＮＡの末端蛍光標識
が可能となり、よく用いられるようになってきている。
インターカレートする蛍光体を用いる場合には、アガロ
ースゲルで電気泳動したＤＮＡ断片を、エチジウムブロ
マイドやアクリジンオレンジ等のインターカレーターで
標識して検出する。
【０００３】より正確な断片長の測定には、末端蛍光標
識したＤＮＡ断片をポリアクリルアミドゲルで電気泳動
して検出する。正確な断片長の測定が必要な方法とし
て、ＲＴ−ＰＣＲ（Revers Transcriptase-PCR, Nature
Biotechnology, 1999, 17, 720-722,）、ＦＤＤ（Fluo
rescent Differential Display, FEBS Letters,1994, 3
51, 231-236）、ＡＴＡＣ−ＰＣＲ（Adaptor-Tagged co
mpetitive-PCR, NucleicAcids Research, 1997, 25, 46
94-4696）、ＳＳＣＰ（Single Strand Conformation Po
lymorism, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 27
66-2770）などが挙げられる。これらは、ＰＣＲ後に増
幅産物を蛍光式ＤＮＡシークエンサーで分析する。
識したＤＮＡ断片をポリアクリルアミドゲルで電気泳動
して検出する。正確な断片長の測定が必要な方法とし
て、ＲＴ−ＰＣＲ（Revers Transcriptase-PCR, Nature
Biotechnology, 1999, 17, 720-722,）、ＦＤＤ（Fluo
rescent Differential Display, FEBS Letters,1994, 3
51, 231-236）、ＡＴＡＣ−ＰＣＲ（Adaptor-Tagged co
mpetitive-PCR, NucleicAcids Research, 1997, 25, 46
94-4696）、ＳＳＣＰ（Single Strand Conformation Po
lymorism, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 27
66-2770）などが挙げられる。これらは、ＰＣＲ後に増
幅産物を蛍光式ＤＮＡシークエンサーで分析する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】現在提案されているＰ
ＣＲと電気泳動に基づいたＤＮＡ断片増幅・検出につい
て紹介したが、実用面では種々の問題がある。ＰＣＲ時
にＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ断片へのアデニンの
付加反応が起こり、付加の起こった断片と付加の起こら
なかった断片によって２つのピークが検出される。アデ
ニン付加の起こる確率は試料ＤＮＡやＰＣＲ条件で変動
する。このためピーク割れにより標的ＤＮＡ断片のピー
ク面積を求めるといった分析が困難になっている。
ＣＲと電気泳動に基づいたＤＮＡ断片増幅・検出につい
て紹介したが、実用面では種々の問題がある。ＰＣＲ時
にＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ断片へのアデニンの
付加反応が起こり、付加の起こった断片と付加の起こら
なかった断片によって２つのピークが検出される。アデ
ニン付加の起こる確率は試料ＤＮＡやＰＣＲ条件で変動
する。このためピーク割れにより標的ＤＮＡ断片のピー
ク面積を求めるといった分析が困難になっている。
【０００５】診断目的のＳＳＣＰ解析に於いては、ピー
ク面積を求めて定量的な解析を行うことにより、従来法
では判断できないＬＯＨ（Loss of Heterozygosity）の
検出が可能となっている（K.Sugano, Y.Nakashima, K.Y
amaguchi, N.Fukayama, M.Maekawa, H.Ohkura, T.Kakiz
oe and T.Sekiya, Genes, Chomosomes & Cancer, 1996,
15, 157-164, Sensitive Detection of Loss of Heter
ozygosity in the TP53 Gene in Pancreatic Adenocarc
inoma by Fluorescence-Based Single StrandConformat
ion Polymorphism Analysis Using Blunt-End DNA Frag
ments）。しかし、高精度な診断を行うためには、本来
のピーク面積に対する隣接するピークの面積の割合を１
０％以内に抑える必要がある。
ク面積を求めて定量的な解析を行うことにより、従来法
では判断できないＬＯＨ（Loss of Heterozygosity）の
検出が可能となっている（K.Sugano, Y.Nakashima, K.Y
amaguchi, N.Fukayama, M.Maekawa, H.Ohkura, T.Kakiz
oe and T.Sekiya, Genes, Chomosomes & Cancer, 1996,
15, 157-164, Sensitive Detection of Loss of Heter
ozygosity in the TP53 Gene in Pancreatic Adenocarc
inoma by Fluorescence-Based Single StrandConformat
ion Polymorphism Analysis Using Blunt-End DNA Frag
ments）。しかし、高精度な診断を行うためには、本来
のピーク面積に対する隣接するピークの面積の割合を１
０％以内に抑える必要がある。
【０００６】ピーク割れを防ぐには付加したアデニンを
取り除くか、積極的に付加を起こして付加を１００％と
する２つの方法が考えられる。付加を取り除く方法で
は、ＰＣＲ後に除去のための酵素処理を行わなければな
らない（F.Ginot, I.Bordelais, S.Nguyen and G.Gyapa
y, Nucleic Acids Research, 1996, 24540-541）。一
方、付加を積極的に起こすためには、反応液中のＭｇ2+
イオンの濃度を調製したり、反応条件を変えることが必
要であるが、アデニン付加したＰＣＲ産物を安定して得
ることは難しいのが現状である。また、鋳型ＤＮＡ断片
の５’末端近傍の配列によってアデニンの付加効率が変
化するという報告（V.L.Magnuson, D.S.Ally, S.J.Nyla
nd, Z.E.Karanjawala, J.B.Rayman, J.I.Knapp, A.L.Lo
we, S.Ghoshand F.S.Collins, Biotechniqes, 1996, 2
1, 700-709）があるが、その配列は一般的ではないし、
配列の決定方法についての提案はない。鋳型ＤＮＡ５’
末端の配列によって、アデニン付加効率を変化させる方
法はテーリングと呼ばれている（M.J.Brownstein, J.D.
Carpten and J.R.Smith、 Biotechniques, 1996, 20, 1
004-1010）。本発明の目的は、リバースプライマーテー
リングに於いて、どのような標的ＤＮＡ断片を増幅する
ＰＣＲ用プライマーに対しても一般的にアデニン付加を
高効率で起こす配列をデザインし、簡便に電気泳動分析
可能なＤＮＡ断片を増幅できるプライマー配列を提供す
ることにある。
取り除くか、積極的に付加を起こして付加を１００％と
する２つの方法が考えられる。付加を取り除く方法で
は、ＰＣＲ後に除去のための酵素処理を行わなければな
らない（F.Ginot, I.Bordelais, S.Nguyen and G.Gyapa
y, Nucleic Acids Research, 1996, 24540-541）。一
方、付加を積極的に起こすためには、反応液中のＭｇ2+
イオンの濃度を調製したり、反応条件を変えることが必
要であるが、アデニン付加したＰＣＲ産物を安定して得
ることは難しいのが現状である。また、鋳型ＤＮＡ断片
の５’末端近傍の配列によってアデニンの付加効率が変
化するという報告（V.L.Magnuson, D.S.Ally, S.J.Nyla
nd, Z.E.Karanjawala, J.B.Rayman, J.I.Knapp, A.L.Lo
we, S.Ghoshand F.S.Collins, Biotechniqes, 1996, 2
1, 700-709）があるが、その配列は一般的ではないし、
配列の決定方法についての提案はない。鋳型ＤＮＡ５’
末端の配列によって、アデニン付加効率を変化させる方
法はテーリングと呼ばれている（M.J.Brownstein, J.D.
Carpten and J.R.Smith、 Biotechniques, 1996, 20, 1
004-1010）。本発明の目的は、リバースプライマーテー
リングに於いて、どのような標的ＤＮＡ断片を増幅する
ＰＣＲ用プライマーに対しても一般的にアデニン付加を
高効率で起こす配列をデザインし、簡便に電気泳動分析
可能なＤＮＡ断片を増幅できるプライマー配列を提供す
ることにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明では、リバースプライマーの５’末端にアデ
ニン付加を高効率で起こす配列をデザインしたアンカー
配列をもつＰＣＲ用プライマーを用いる。アンカー配列
とは、標的遺伝子に相補的なプライマー配列の５’末端
に位置し、標的ＤＮＡ配列と相補的でない配列である。
アンカー配列はＰＣＲの１サイクル目に於いては標的配
列にハイブリダイズせず、反対側の相補鎖合成が進行し
た場合にのみハイブリダイズする。従ってアンカー配列
は、ＰＣＲの２サイクル目以降に於いてハイブリダイズ
し、増幅断片は標的配列とアンカー配列を有する断片と
なる。アンカー配列は標的ＤＮＡ配列と無関係に設計で
きるため、アデニン付加を高効率で起こすことができる
配列を選ぶことができる。ＰＣＲでのアデニンの付加反
応はプライマー５’末端の塩基種によりアデニンの付加
効率が異なることが知られており、５’末端の５塩基程
度でアデニンの付加効率が決定されている。
に、本発明では、リバースプライマーの５’末端にアデ
ニン付加を高効率で起こす配列をデザインしたアンカー
配列をもつＰＣＲ用プライマーを用いる。アンカー配列
とは、標的遺伝子に相補的なプライマー配列の５’末端
に位置し、標的ＤＮＡ配列と相補的でない配列である。
アンカー配列はＰＣＲの１サイクル目に於いては標的配
列にハイブリダイズせず、反対側の相補鎖合成が進行し
た場合にのみハイブリダイズする。従ってアンカー配列
は、ＰＣＲの２サイクル目以降に於いてハイブリダイズ
し、増幅断片は標的配列とアンカー配列を有する断片と
なる。アンカー配列は標的ＤＮＡ配列と無関係に設計で
きるため、アデニン付加を高効率で起こすことができる
配列を選ぶことができる。ＰＣＲでのアデニンの付加反
応はプライマー５’末端の塩基種によりアデニンの付加
効率が異なることが知られており、５’末端の５塩基程
度でアデニンの付加効率が決定されている。
【０００８】本発明では２〜５塩基からなるアンカー配
列のうちの１塩基だけを変化させたアンカー配列を持つ
プライマーを４種類用意し、ＰＣＲを行わせる。ＰＣＲ
の結果について４種類のアンカー配列のアデニン付加効
率を測定することにより、アデニン付加しやすいアンカ
ー配列をスクリーニングする。５’末端から１塩基目の
アンカー配列で最も付加が起こる配列を決め、次に、ア
ンカー配列の５’末端から２塩基目を変化させた４種類
のプライマーを合成する。１塩基目と同様にＰＣＲを行
い、５’末端から２塩基目の配列でアデニン付加が起こ
りやすい塩基種を決める。この作業を繰り返し、アデニ
ン付加の起こりやすい２〜５塩基からなるアンカー配列
を決める。
列のうちの１塩基だけを変化させたアンカー配列を持つ
プライマーを４種類用意し、ＰＣＲを行わせる。ＰＣＲ
の結果について４種類のアンカー配列のアデニン付加効
率を測定することにより、アデニン付加しやすいアンカ
ー配列をスクリーニングする。５’末端から１塩基目の
アンカー配列で最も付加が起こる配列を決め、次に、ア
ンカー配列の５’末端から２塩基目を変化させた４種類
のプライマーを合成する。１塩基目と同様にＰＣＲを行
い、５’末端から２塩基目の配列でアデニン付加が起こ
りやすい塩基種を決める。この作業を繰り返し、アデニ
ン付加の起こりやすい２〜５塩基からなるアンカー配列
を決める。
【０００９】上述した方法で求めたアデニン付加の起こ
りやすいアンカー配列を有するプライマーを用いてＰＣ
Ｒを行う。その結果、アデニン付加が起こった増幅産物
が優先的に得られる。アデニン付加が起こらなかった増
幅産物の割合が、アデニン付加の起こった増幅産物に対
して１０％以下であれば、定量的解析が要求される診断
に使用することが可能となる。
りやすいアンカー配列を有するプライマーを用いてＰＣ
Ｒを行う。その結果、アデニン付加が起こった増幅産物
が優先的に得られる。アデニン付加が起こらなかった増
幅産物の割合が、アデニン付加の起こった増幅産物に対
して１０％以下であれば、定量的解析が要求される診断
に使用することが可能となる。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下本発明を実施例を用いて説明
する。
する。
【００１１】（実施例１）図１は本発明によるアンカー
配列を有するＰＣＲ用プライマーを用いたＰＣＲと、そ
の結果の産物の態様および産物を電気泳動して標識の蛍
光強度でアンカー配列を有するＰＣＲ用プライマーを評
価することを模式的に示す図である。１は試料ＤＮＡで
ある。２はＰＣＲ用フォワードプライマー、４はＰＣＲ
用リバースプライマーである。それぞれのプライマー
は、試料ＤＮＡ１を二つの一本鎖１−１と１−２とに変
性させたときに、それぞれに相補である１２〜２０塩基
の塩基長を持つものとされる。フォワードプライマー２
の５’末端は蛍光標識Ｆで標識されている。リバースプ
ライマー４の５’末端にはアンカー配列３を接続したも
のとする。ここで、アンカー配列３は２〜５塩基の塩基
長とされ、標的ＤＮＡ配列とは相補的でない配列とされ
る。従って、アンカー配列３を含めたリバースプライマ
ー４の塩基長は１４〜２５塩基となる。
配列を有するＰＣＲ用プライマーを用いたＰＣＲと、そ
の結果の産物の態様および産物を電気泳動して標識の蛍
光強度でアンカー配列を有するＰＣＲ用プライマーを評
価することを模式的に示す図である。１は試料ＤＮＡで
ある。２はＰＣＲ用フォワードプライマー、４はＰＣＲ
用リバースプライマーである。それぞれのプライマー
は、試料ＤＮＡ１を二つの一本鎖１−１と１−２とに変
性させたときに、それぞれに相補である１２〜２０塩基
の塩基長を持つものとされる。フォワードプライマー２
の５’末端は蛍光標識Ｆで標識されている。リバースプ
ライマー４の５’末端にはアンカー配列３を接続したも
のとする。ここで、アンカー配列３は２〜５塩基の塩基
長とされ、標的ＤＮＡ配列とは相補的でない配列とされ
る。従って、アンカー配列３を含めたリバースプライマ
ー４の塩基長は１４〜２５塩基となる。
【００１２】このようなプライマーを用意して、ターミ
ナルトランスフェラーゼ活性を持つ耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼを用いてＰＣＲを行うと、プライマー２、４がそ
れぞれ矢印に示すように伸長される。先にも述べたよう
に、ＰＣＲの２サイクル目以降に於いては、増幅断片は
標的配列とアンカー配列を有する断片となり、これを標
的ＤＮＡとしてフォワードプライマー２の伸長反応が起
こる。この際、ＰＣＲ産物の３’末端にアデニン付加が
起こらなかった断片５とアデニン付加が起こった断片６
が増幅される。付加されたアデニンを図ではまるで囲っ
たＡで表示している。
ナルトランスフェラーゼ活性を持つ耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼを用いてＰＣＲを行うと、プライマー２、４がそ
れぞれ矢印に示すように伸長される。先にも述べたよう
に、ＰＣＲの２サイクル目以降に於いては、増幅断片は
標的配列とアンカー配列を有する断片となり、これを標
的ＤＮＡとしてフォワードプライマー２の伸長反応が起
こる。この際、ＰＣＲ産物の３’末端にアデニン付加が
起こらなかった断片５とアデニン付加が起こった断片６
が増幅される。付加されたアデニンを図ではまるで囲っ
たＡで表示している。
【００１３】このようにして得られたＰＣＲ産物を電気
泳動して分析すると、エレクトロフェログラム９に示す
ように、アデニン付加が起こった断片６に由来するピー
ク８とアデニン付加が起こらなかった断片５に由来する
ピーク７が検出される。ここで、横軸は塩基長であり、
ピーク８とピーク７の塩基長は付加されたアデニンがあ
るかないかのアデニン１塩基分しか違わないが、図を分
かりやすくするためにそれぞれのピークを離して表示し
た。アンカー配列３の５’末端がアデニンの付加反応を
促進する塩基となっていれば、アデニン付加が起こった
断片６に由来するピーク８を、アデニン付加の起こらな
かった断片５に由来するピーク７に対して十分に大きく
することができ、分析の精度が向上する。実施例１で
は、出芽酵母野生株から抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを
作製し、試料ＤＮＡ１として用いた。また、ＰＣＲ用フ
ォワードプライマー２として、（配列１）を持ち、５’
末端を蛍光体ＨＥＸで標識したフォワードＰＣＲ用プラ
イマーを用いた。（配列１） ５’−ＨＥＸ−ａｇａａｇａｇｇｇｃ ｔｃｃａａｔｔ
ｔｃｔ ｃ−３’ 一方、ＰＣＲ用リバースプライマー４のうち試料ＤＮＡ
に対して相補である部分の配列が（配列２）であるＰＣ
Ｒ用プライマーを用いた。（配列２） ５’−ｇｔｇａｇｃａａｔａ ｃａｃａａａａｔｔｇ
ｔａ−３’ 上記のプライマーペアを用いて出芽酵母野生株由来の試
料ＤＮＡ１のＰＣＲを行うと、１８７ｂｐの長さのＰＣ
Ｒ産物が増幅される。Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒
造）を用いて、９４°Ｃで３０秒、６０°Ｃで６０秒、
７２°Ｃで３０秒からなるサイクルを２５回繰りかえ
し、その後７２°Ｃで２分間保温する条件でＰＣＲを行
った。ＰＣＲ産物を３．５％ポリアクリルアミドゲルを
用いて電気泳動分析した。得られた泳動データは電気泳
動装置付属のソフトウェアでベースライン補正を行い、
エレクトロフェログラムを作製した。
泳動して分析すると、エレクトロフェログラム９に示す
ように、アデニン付加が起こった断片６に由来するピー
ク８とアデニン付加が起こらなかった断片５に由来する
ピーク７が検出される。ここで、横軸は塩基長であり、
ピーク８とピーク７の塩基長は付加されたアデニンがあ
るかないかのアデニン１塩基分しか違わないが、図を分
かりやすくするためにそれぞれのピークを離して表示し
た。アンカー配列３の５’末端がアデニンの付加反応を
促進する塩基となっていれば、アデニン付加が起こった
断片６に由来するピーク８を、アデニン付加の起こらな
かった断片５に由来するピーク７に対して十分に大きく
することができ、分析の精度が向上する。実施例１で
は、出芽酵母野生株から抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを
作製し、試料ＤＮＡ１として用いた。また、ＰＣＲ用フ
ォワードプライマー２として、（配列１）を持ち、５’
末端を蛍光体ＨＥＸで標識したフォワードＰＣＲ用プラ
イマーを用いた。（配列１） ５’−ＨＥＸ−ａｇａａｇａｇｇｇｃ ｔｃｃａａｔｔ
ｔｃｔ ｃ−３’ 一方、ＰＣＲ用リバースプライマー４のうち試料ＤＮＡ
に対して相補である部分の配列が（配列２）であるＰＣ
Ｒ用プライマーを用いた。（配列２） ５’−ｇｔｇａｇｃａａｔａ ｃａｃａａａａｔｔｇ
ｔａ−３’ 上記のプライマーペアを用いて出芽酵母野生株由来の試
料ＤＮＡ１のＰＣＲを行うと、１８７ｂｐの長さのＰＣ
Ｒ産物が増幅される。Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒
造）を用いて、９４°Ｃで３０秒、６０°Ｃで６０秒、
７２°Ｃで３０秒からなるサイクルを２５回繰りかえ
し、その後７２°Ｃで２分間保温する条件でＰＣＲを行
った。ＰＣＲ産物を３．５％ポリアクリルアミドゲルを
用いて電気泳動分析した。得られた泳動データは電気泳
動装置付属のソフトウェアでベースライン補正を行い、
エレクトロフェログラムを作製した。
【００１４】図２（Ａ）はアンカー配列を持たないリバ
ースプライマーによるＰＣＲにおける増幅産物のエレク
トロフェログラム１０を示し、図２（Ｂ）はアンカー配
列を持つリバースプライマーによるＰＣＲにおける増幅
産物のエレクトロフェログラム１３を示す。図２（Ａ）
のエレクトロフェログラム１０では、アデニン付加が起
こった断片６によるピーク１１とアデニン付加が起こら
なかった断片５によるピーク１２とを比較して分かるよ
うに、ピーク１１の方がピーク１２より小さい。また、
両者のピークの比率は１：４程度である。一方図２
（Ｂ）のエレクトロフェログラム１３では、アデニン付
加が起こった断片６によるピーク１１とアデニン付加が
起こらなかった断片５によるピーク１２とを比較して分
かるように、ピーク１１の方がピーク１２より圧倒的に
大きい。すなわち、本実施例によるＰＣＲでは、アンカ
ー配列を持つリバースプライマーによるアデニンの付加
反応が促進され、アデニン付加の起こらなかった断片５
は、アデニン付加の起こった断片６の１０％以下に抑止
されたことが分かる。図３（Ａ）−（Ｄ）は本発明によ
るアデニンの付加反応を促進するアンカー配列のスクリ
ーニング法の概念をフローチャートで示したものであ
る。図１で説明したように、試料ＤＮＡ１と、これを一
本鎖にしたときのそれぞれを鋳型としてＰＣＲを行うた
めのＰＣＲ用フォワードプライマー２とＰＣＲ用リバー
スプライマー４とを用意する。ＰＣＲ用フォワードプラ
イマー２は標的ＤＮＡ断片を増幅するため、標的配列に
相補的な配列を持ち、蛍光体Ｆで標識されている。ＰＣ
Ｒ用リバースプライマー４は標的配列に相補である配列
４と、標的配列に相補でない４塩基からなるアンカー配
列３−１，３−２，３−３および３−４とから構成され
ている。
ースプライマーによるＰＣＲにおける増幅産物のエレク
トロフェログラム１０を示し、図２（Ｂ）はアンカー配
列を持つリバースプライマーによるＰＣＲにおける増幅
産物のエレクトロフェログラム１３を示す。図２（Ａ）
のエレクトロフェログラム１０では、アデニン付加が起
こった断片６によるピーク１１とアデニン付加が起こら
なかった断片５によるピーク１２とを比較して分かるよ
うに、ピーク１１の方がピーク１２より小さい。また、
両者のピークの比率は１：４程度である。一方図２
（Ｂ）のエレクトロフェログラム１３では、アデニン付
加が起こった断片６によるピーク１１とアデニン付加が
起こらなかった断片５によるピーク１２とを比較して分
かるように、ピーク１１の方がピーク１２より圧倒的に
大きい。すなわち、本実施例によるＰＣＲでは、アンカ
ー配列を持つリバースプライマーによるアデニンの付加
反応が促進され、アデニン付加の起こらなかった断片５
は、アデニン付加の起こった断片６の１０％以下に抑止
されたことが分かる。図３（Ａ）−（Ｄ）は本発明によ
るアデニンの付加反応を促進するアンカー配列のスクリ
ーニング法の概念をフローチャートで示したものであ
る。図１で説明したように、試料ＤＮＡ１と、これを一
本鎖にしたときのそれぞれを鋳型としてＰＣＲを行うた
めのＰＣＲ用フォワードプライマー２とＰＣＲ用リバー
スプライマー４とを用意する。ＰＣＲ用フォワードプラ
イマー２は標的ＤＮＡ断片を増幅するため、標的配列に
相補的な配列を持ち、蛍光体Ｆで標識されている。ＰＣ
Ｒ用リバースプライマー４は標的配列に相補である配列
４と、標的配列に相補でない４塩基からなるアンカー配
列３−１，３−２，３−３および３−４とから構成され
ている。
【００１５】ここで、アンカー配列３−１，３−２，３
−３および３−４の５’末端に注目して明らかなよう
に、５’末端がそれぞれＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの４種類の塩基
とされている。なお、ＮＮＮの塩基配列はＡ，Ｃ，Ｇ，
Ｔ全ての組み合わせからなる６４（＝４×４×４）種類
の塩基配列ということになる。３−１，３−２，３−３
および３−４は６４種類のオリゴヌクレオチドの混合物
であるが、実質的には５'末端がそれぞれＡ、Ｃ、Ｇ、
Ｔの塩基である４種類のオリゴヌクレオチドとして扱う
ことができる。図３（Ａ）では、アンカー配列３−１の
５’末端がＡとされたＰＣＲ用リバースプライマーによ
って図１と同様にしてＰＣＲを行い、その結果、アデニ
ン付加の起こらなかったＤＮＡ断片５と、アデニン付加
の起こったＤＮＡ断片６とが得られてエレクトロフェロ
グラム９に示すように、アデニンが付加しなかった増幅
ＤＮＡ断片５に由来するピーク７の面積とアデニンが付
加した増幅ＤＮＡ断片６に由来するピーク８の面積を区
別して検出できる。６４種類のオリゴヌクレオチドの内
の１つは標的ＤＮＡ断片と相補な配列を持つものとなり
うるが、残りの６３種類は非相補であるので、実質的に
は非相補なアンカー配列として扱って良い。その結果、
末端に塩基Ａを持つアンカー配列を持つ折後ヌクレオチ
ドとしてピーク面積を計算する。図３（Ｂ）−（Ｄ）で
も同様にして、アデニンが付加しなかった増幅ＤＮＡ断
片５に由来するピーク７の面積とアデニンが付加した増
幅ＤＮＡ断片６に由来するピーク８の面積を区別して検
出できる。
−３および３−４の５’末端に注目して明らかなよう
に、５’末端がそれぞれＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの４種類の塩基
とされている。なお、ＮＮＮの塩基配列はＡ，Ｃ，Ｇ，
Ｔ全ての組み合わせからなる６４（＝４×４×４）種類
の塩基配列ということになる。３−１，３−２，３−３
および３−４は６４種類のオリゴヌクレオチドの混合物
であるが、実質的には５'末端がそれぞれＡ、Ｃ、Ｇ、
Ｔの塩基である４種類のオリゴヌクレオチドとして扱う
ことができる。図３（Ａ）では、アンカー配列３−１の
５’末端がＡとされたＰＣＲ用リバースプライマーによ
って図１と同様にしてＰＣＲを行い、その結果、アデニ
ン付加の起こらなかったＤＮＡ断片５と、アデニン付加
の起こったＤＮＡ断片６とが得られてエレクトロフェロ
グラム９に示すように、アデニンが付加しなかった増幅
ＤＮＡ断片５に由来するピーク７の面積とアデニンが付
加した増幅ＤＮＡ断片６に由来するピーク８の面積を区
別して検出できる。６４種類のオリゴヌクレオチドの内
の１つは標的ＤＮＡ断片と相補な配列を持つものとなり
うるが、残りの６３種類は非相補であるので、実質的に
は非相補なアンカー配列として扱って良い。その結果、
末端に塩基Ａを持つアンカー配列を持つ折後ヌクレオチ
ドとしてピーク面積を計算する。図３（Ｂ）−（Ｄ）で
も同様にして、アデニンが付加しなかった増幅ＤＮＡ断
片５に由来するピーク７の面積とアデニンが付加した増
幅ＤＮＡ断片６に由来するピーク８の面積を区別して検
出できる。
【００１６】アデニンが付加しなかった増幅ＤＮＡ断片
５に由来するピーク７の面積Ｓとアデニンが付加した増
幅ＤＮＡ断片６に由来するピーク８のピーク面積ＳAを
求め、ピーク面積の割合からアデニンの付加反応の効率
（ＳA／（ＳA＋Ｓ））を算出する。高アデニン付加効率
を与えるＰＣＲ用リバースプライマーの５’末端の塩基
をアンカー配列として採用する。
５に由来するピーク７の面積Ｓとアデニンが付加した増
幅ＤＮＡ断片６に由来するピーク８のピーク面積ＳAを
求め、ピーク面積の割合からアデニンの付加反応の効率
（ＳA／（ＳA＋Ｓ））を算出する。高アデニン付加効率
を与えるＰＣＲ用リバースプライマーの５’末端の塩基
をアンカー配列として採用する。
【００１７】図４（Ａ）−（Ｄ）に、４種類のアンカー
配列３−１，３−２，３−３および３−４を持ったＰＣ
Ｒ用リバースプライマーを使用したＰＣＲ産物について
の電気泳動結果の具体例をエレクトロフェログラム４
１、４２、４３および４４で示す。各エレクトロフェロ
グラムからアデニンが付加した増幅ＤＮＡ断片６に由来
するピークの面積ＳAおよびアデニンが付加しなかった
増幅ＤＮＡ断片５に由来するピーク面積Ｓを求め、各Ｐ
ＣＲ用リバースプライマーについてアデニン付加効率
（ＳA／（ＳA＋Ｓ））を求めた結果を比較するグラフ４
５を図５に示す。図の場合、グラフ中の（ｃ）のアンカ
ー配列が最も高いアデニンの付加効率を与えたため、
（ｃ）のアンカー配列を選定した。（ｃ）のアンカー配
列は塩基Ｇであったため、アンカー配列の５’末端の塩
基はＧを採用した。
配列３−１，３−２，３−３および３−４を持ったＰＣ
Ｒ用リバースプライマーを使用したＰＣＲ産物について
の電気泳動結果の具体例をエレクトロフェログラム４
１、４２、４３および４４で示す。各エレクトロフェロ
グラムからアデニンが付加した増幅ＤＮＡ断片６に由来
するピークの面積ＳAおよびアデニンが付加しなかった
増幅ＤＮＡ断片５に由来するピーク面積Ｓを求め、各Ｐ
ＣＲ用リバースプライマーについてアデニン付加効率
（ＳA／（ＳA＋Ｓ））を求めた結果を比較するグラフ４
５を図５に示す。図の場合、グラフ中の（ｃ）のアンカ
ー配列が最も高いアデニンの付加効率を与えたため、
（ｃ）のアンカー配列を選定した。（ｃ）のアンカー配
列は塩基Ｇであったため、アンカー配列の５’末端の塩
基はＧを採用した。
【００１８】以上のように、アンカー配列のうちの５’
末端の１塩基を４種類の塩基としたアンカープライマー
を用い、４種類のうち最も効果の高いアンカー配列を、
まず、選定する。次いで、アンカー配列のうちの５’末
端を選定した塩基とするとともに、５’末端から二つ目
の１塩基を４種類の塩基としたアンカープライマーを用
い、４種類のうち最も効果の高いアンカー配列を選定す
る。この操作を繰り返してスクリーニングをしていけ
ば、例えば、４つの塩基からなるアンカー配列３の全て
の塩基を決定することができる。
末端の１塩基を４種類の塩基としたアンカープライマー
を用い、４種類のうち最も効果の高いアンカー配列を、
まず、選定する。次いで、アンカー配列のうちの５’末
端を選定した塩基とするとともに、５’末端から二つ目
の１塩基を４種類の塩基としたアンカープライマーを用
い、４種類のうち最も効果の高いアンカー配列を選定す
る。この操作を繰り返してスクリーニングをしていけ
ば、例えば、４つの塩基からなるアンカー配列３の全て
の塩基を決定することができる。
【００１９】図６に、図３に続くアンカー配列の５’末
端から２番目の塩基の決定の流れを示す。まず、５’末
端の塩基がＧとされたアンカー配列３−５，３−６，３
−７および３−８を持つＰＣＲ用リバースプライマーを
用意する。ＰＣＲ用リバースプライマーのアンカー配列
３−５，３−６，３−７および３−８の塩基配列におい
てＮはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの混合塩基である。従って、図６
におけるＰＣＲ用リバースプライマーのアンカー配列３
−５，３−６，３−７および３−８のＮＮの塩基配列は
Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ全ての組み合わせからなる１６（＝４×
４）種類の塩基配列ということになる。用意した４種類
のアンカー配列３−５，３−６，３−７および３−８を
持つＰＣＲ用リバースプライマーと蛍光標識したＰＣＲ
用フォワードプライマー２の組み合わせで標的ＤＮＡを
ＰＣＲにより増幅する。増幅ＤＮＡ断片をゲル電気泳動
で分析し、アデニンが付加しなかったＤＮＡ断片５とア
デニンが付加したＤＮＡ断片６とのピーク面積を求め、
最も効果の高いアンカー配列を５’末端の二つの塩基種
として選定する。
端から２番目の塩基の決定の流れを示す。まず、５’末
端の塩基がＧとされたアンカー配列３−５，３−６，３
−７および３−８を持つＰＣＲ用リバースプライマーを
用意する。ＰＣＲ用リバースプライマーのアンカー配列
３−５，３−６，３−７および３−８の塩基配列におい
てＮはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの混合塩基である。従って、図６
におけるＰＣＲ用リバースプライマーのアンカー配列３
−５，３−６，３−７および３−８のＮＮの塩基配列は
Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ全ての組み合わせからなる１６（＝４×
４）種類の塩基配列ということになる。用意した４種類
のアンカー配列３−５，３−６，３−７および３−８を
持つＰＣＲ用リバースプライマーと蛍光標識したＰＣＲ
用フォワードプライマー２の組み合わせで標的ＤＮＡを
ＰＣＲにより増幅する。増幅ＤＮＡ断片をゲル電気泳動
で分析し、アデニンが付加しなかったＤＮＡ断片５とア
デニンが付加したＤＮＡ断片６とのピーク面積を求め、
最も効果の高いアンカー配列を５’末端の二つの塩基種
として選定する。
【００２０】図７に、４種類のアンカー配列３−５，３
−６，３−７および３−８を持ったＰＣＲ用リバースプ
ライマーを使用したＰＣＲ産物についての電気泳動結果
の具体例をエレクトロフェログラム８０、８１、８２お
よび８３に示す。各エレクトロフェログラムからアデニ
ンが付加した増幅ＤＮＡ断片６に由来するピークの面積
ＳAおよびアデニンが付加しなかった増幅ＤＮＡ断片５
に由来するピーク面積Ｓを求め、各ＰＣＲ用リバースプ
ライマーについてアデニン付加効率（ＳA／（ＳA＋
Ｓ））を求めた結果を比較するグラフ８４を図８に示
す。図の場合、グラフ中の（ｃ）のアンカー配列が最も
高いアデニンの付加効率を与えたため、（ｃ）のアンカ
ー配列を選定した。（ｃ）のアンカー配列は塩基Ｇであ
ったため、アンカー配列の５’末端から２塩基目の塩基
としてＧを採用した。すなわち、アンカー配列は５’末
端から２塩基目までの塩基はＧＧとするのが良いことが
示された。なお、図８に於いては、最も効果の低かった
（ｂ）のアンカー配列以外の（ａ）、（ｄ）についても
検討した結果以下のことが分かった。図８（ａ）、
（ｄ）ともにアデニンの付加効率は図８（Ｃ）とそれほ
ど遜色はないが、（ｄ）については図７に示すエレクト
ロフェログラム８３に於いて、アデニンが付加しなかっ
た増幅産物５由来のピークとアデニンが付加した増幅産
物６由来のピークを分離して検出してしまうため、採用
しないこととした。（ａ）については図７に示すエレク
トロフェログラム８０のピークはアデニンが付加しなか
った増幅産物５由来のピークとアデニンが付加した増幅
産物６由来のピークとが、図７に示すエレクトロフェロ
グラム８２のピークと同一ピークと認識されたため、採
用することとした。（ａ）のアンカー配列の塩基はＡで
あるため、アンカー配列の５’末端から２塩基目の塩基
としてＡを採用した。すなわち、アンカー配列は５’末
端から２塩基目までの塩基はＧＡとするのが良いことが
示された。この結果、本実施例では、アンカー配列は
５’末端から２塩基目までの塩基はＧＧまたはＧＡとす
るのが良いことが示されたことになる。図９に、図６に
続く５’末端から３番目の塩基の決定の流れを示す。こ
の例では、アンカー配列の５’末端から２塩基目までの
塩基はＧＧとした場合について述べるが、これをＧＡと
したときはＧＧをＧＡと読み替えれば良い。まず、５’
末端からの二つの塩基がＧＧとされたアンカー配列３−
９，３−１０，３−１１および３−１２を持つＰＣＲ用
リバースプライマーを用意する。ＰＣＲ用リバースプラ
イマーのアンカー配列３−９，３−１０，３−１１およ
び３−１２の塩基配列においてＮはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの塩
基である。従って、図９におけるＰＣＲ用リバースプラ
イマーのアンカー配列３−９，３−１０，３−１１およ
び３−１２のＮの塩基配列はＡ，Ｃ，Ｇ，Ｔの４種類の
塩基配列ということになる。用意した４種類のアンカー
配列３−９，３−１０，３−１１および３−１２を持つ
ＰＣＲ用リバースプライマーと蛍光標識したＰＣＲ用フ
ォワードプライマー２の組み合わせで標的ＤＮＡをＰＣ
Ｒにより増幅する。増幅ＤＮＡ断片をゲル電気泳動で分
析し、アデニンが付加しなかったＤＮＡ断片５とアデニ
ンが付加したＤＮＡ断片６とのピーク面積を求め、最も
効果の高いアンカー配列を５’末端の三つの塩基種とし
て選定する。
−６，３−７および３−８を持ったＰＣＲ用リバースプ
ライマーを使用したＰＣＲ産物についての電気泳動結果
の具体例をエレクトロフェログラム８０、８１、８２お
よび８３に示す。各エレクトロフェログラムからアデニ
ンが付加した増幅ＤＮＡ断片６に由来するピークの面積
ＳAおよびアデニンが付加しなかった増幅ＤＮＡ断片５
に由来するピーク面積Ｓを求め、各ＰＣＲ用リバースプ
ライマーについてアデニン付加効率（ＳA／（ＳA＋
Ｓ））を求めた結果を比較するグラフ８４を図８に示
す。図の場合、グラフ中の（ｃ）のアンカー配列が最も
高いアデニンの付加効率を与えたため、（ｃ）のアンカ
ー配列を選定した。（ｃ）のアンカー配列は塩基Ｇであ
ったため、アンカー配列の５’末端から２塩基目の塩基
としてＧを採用した。すなわち、アンカー配列は５’末
端から２塩基目までの塩基はＧＧとするのが良いことが
示された。なお、図８に於いては、最も効果の低かった
（ｂ）のアンカー配列以外の（ａ）、（ｄ）についても
検討した結果以下のことが分かった。図８（ａ）、
（ｄ）ともにアデニンの付加効率は図８（Ｃ）とそれほ
ど遜色はないが、（ｄ）については図７に示すエレクト
ロフェログラム８３に於いて、アデニンが付加しなかっ
た増幅産物５由来のピークとアデニンが付加した増幅産
物６由来のピークを分離して検出してしまうため、採用
しないこととした。（ａ）については図７に示すエレク
トロフェログラム８０のピークはアデニンが付加しなか
った増幅産物５由来のピークとアデニンが付加した増幅
産物６由来のピークとが、図７に示すエレクトロフェロ
グラム８２のピークと同一ピークと認識されたため、採
用することとした。（ａ）のアンカー配列の塩基はＡで
あるため、アンカー配列の５’末端から２塩基目の塩基
としてＡを採用した。すなわち、アンカー配列は５’末
端から２塩基目までの塩基はＧＡとするのが良いことが
示された。この結果、本実施例では、アンカー配列は
５’末端から２塩基目までの塩基はＧＧまたはＧＡとす
るのが良いことが示されたことになる。図９に、図６に
続く５’末端から３番目の塩基の決定の流れを示す。こ
の例では、アンカー配列の５’末端から２塩基目までの
塩基はＧＧとした場合について述べるが、これをＧＡと
したときはＧＧをＧＡと読み替えれば良い。まず、５’
末端からの二つの塩基がＧＧとされたアンカー配列３−
９，３−１０，３−１１および３−１２を持つＰＣＲ用
リバースプライマーを用意する。ＰＣＲ用リバースプラ
イマーのアンカー配列３−９，３−１０，３−１１およ
び３−１２の塩基配列においてＮはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの塩
基である。従って、図９におけるＰＣＲ用リバースプラ
イマーのアンカー配列３−９，３−１０，３−１１およ
び３−１２のＮの塩基配列はＡ，Ｃ，Ｇ，Ｔの４種類の
塩基配列ということになる。用意した４種類のアンカー
配列３−９，３−１０，３−１１および３−１２を持つ
ＰＣＲ用リバースプライマーと蛍光標識したＰＣＲ用フ
ォワードプライマー２の組み合わせで標的ＤＮＡをＰＣ
Ｒにより増幅する。増幅ＤＮＡ断片をゲル電気泳動で分
析し、アデニンが付加しなかったＤＮＡ断片５とアデニ
ンが付加したＤＮＡ断片６とのピーク面積を求め、最も
効果の高いアンカー配列を５’末端の三つの塩基種とし
て選定する。
【００２１】図１０に４種類のアンカー配列３−９，３
−１０，３−１１および３−１２を持つＰＣＲ用リバー
スプライマーを用いてＰＣＲを行った増幅産物を電気泳
動して得たエレクトロフェログラムである。各エレクト
ロフェログラムから各ＰＣＲ用リバースプライマーにつ
いてアデニン付加効率を求める。
−１０，３−１１および３−１２を持つＰＣＲ用リバー
スプライマーを用いてＰＣＲを行った増幅産物を電気泳
動して得たエレクトロフェログラムである。各エレクト
ロフェログラムから各ＰＣＲ用リバースプライマーにつ
いてアデニン付加効率を求める。
【００２２】図１１は４種類のアンカー配列３−９，３
−１０，３−１１および３−１２を持つＰＣＲ用リバー
スプライマーを用いてＰＣＲを行った増幅産物について
のアデニン付加効率を比較したグラフ９０を示す。先の
例と同様に、最も効果の高いアンカー配列を５’末端か
ら３塩基目の塩基種として選定することになるが、実施
例１の場合、３塩基目のスクリーニングの結果アデニン
付加効率に差はなく、どのアンカー配列を持つＰＣＲ用
リバースプライマーでもアデニン付加が起こった断片し
か検出されなかった。従って、３塩基目の選定は行う必
要がないことになる。
−１０，３−１１および３−１２を持つＰＣＲ用リバー
スプライマーを用いてＰＣＲを行った増幅産物について
のアデニン付加効率を比較したグラフ９０を示す。先の
例と同様に、最も効果の高いアンカー配列を５’末端か
ら３塩基目の塩基種として選定することになるが、実施
例１の場合、３塩基目のスクリーニングの結果アデニン
付加効率に差はなく、どのアンカー配列を持つＰＣＲ用
リバースプライマーでもアデニン付加が起こった断片し
か検出されなかった。従って、３塩基目の選定は行う必
要がないことになる。
【００２３】このように、本実施例では、５’末端から
２塩基目までの塩基によりアデニン付加効率を必要な値
にできるアンカー配列を決定できる。従って、必ずしも
アンカー配列を４塩基とする必要はない。すなわち、実
施例１では、アンカー配列は５’末端にＧＡあるいはＧ
Ｇの配列を有するアンカー配列とすれば良いことが分か
った。一般的には、５塩基以上スクリーニングを行うと
アデニン付加効率の差は小さくなるため、実用上、アン
カー配列の長さは５塩基程度とすれば十分である。
２塩基目までの塩基によりアデニン付加効率を必要な値
にできるアンカー配列を決定できる。従って、必ずしも
アンカー配列を４塩基とする必要はない。すなわち、実
施例１では、アンカー配列は５’末端にＧＡあるいはＧ
Ｇの配列を有するアンカー配列とすれば良いことが分か
った。一般的には、５塩基以上スクリーニングを行うと
アデニン付加効率の差は小さくなるため、実用上、アン
カー配列の長さは５塩基程度とすれば十分である。
【００２４】図１２（Ａ），（Ｂ）に、本実施例により
決定されたアンカー配列をもつＰＣＲ用リバースプライ
マーの構造を模式的に示す。アンカー配列をもつＰＣＲ
用リバースプライマー９１は標的ＤＮＡにハイブリダイ
ズする配列部分９５と、配列９５の５’末端側に隣接
し、標的ＤＮＡと非相補なアンカー配列９４から構成さ
れている。アンカー配列の５’末端２塩基はＧＡの塩基
配列もしくはＧＧの塩基配列となっている。
決定されたアンカー配列をもつＰＣＲ用リバースプライ
マーの構造を模式的に示す。アンカー配列をもつＰＣＲ
用リバースプライマー９１は標的ＤＮＡにハイブリダイ
ズする配列部分９５と、配列９５の５’末端側に隣接
し、標的ＤＮＡと非相補なアンカー配列９４から構成さ
れている。アンカー配列の５’末端２塩基はＧＡの塩基
配列もしくはＧＧの塩基配列となっている。
【００２５】アンカー配列を３塩基とするときは、前述
したように、アンカー配列は合計４×４×４＝６４通り
の配列がありうるが、実施例１では３回のスクリーニン
グで６４通りの配列から高いアデニン付加効率を与える
アンカー配列を決定することができた。以上のように高
アデニン付加効率を与えるアンカー配列を決定し、決定
したアンカー配列を標的ＤＮＡに相補な配列の５’末端
側に持つようにＰＣＲ用リバースプライマーの塩基配列
を決定した。本実施例のように高アデニン付加効率を与
えるアンカー配列を持つプライマーを用いたＰＣＲを行
い、増幅産物を電気泳動により検出する解析方法ではア
デニン付加した増幅産物のピークだけを検出することが
でき、高い分解能の解析結果を得ることができる。
したように、アンカー配列は合計４×４×４＝６４通り
の配列がありうるが、実施例１では３回のスクリーニン
グで６４通りの配列から高いアデニン付加効率を与える
アンカー配列を決定することができた。以上のように高
アデニン付加効率を与えるアンカー配列を決定し、決定
したアンカー配列を標的ＤＮＡに相補な配列の５’末端
側に持つようにＰＣＲ用リバースプライマーの塩基配列
を決定した。本実施例のように高アデニン付加効率を与
えるアンカー配列を持つプライマーを用いたＰＣＲを行
い、増幅産物を電気泳動により検出する解析方法ではア
デニン付加した増幅産物のピークだけを検出することが
でき、高い分解能の解析結果を得ることができる。
【００２６】（実施例２）本発明はＳＳＣＰに適用でき
る。図３−図１１を参照しながら説明したのと同様にし
て、標的ＤＮＡを、蛍光標識したＰＣＲ用フォワードプ
ライマーとアデニン付加を高効率で起こす組み合わせの
塩基を５’末端側に配列されたアンカー配列を持つＰＣ
Ｒ用リバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣ
Ｒによってアデニン付加の起こった断片とアデニン付加
の起こらなかった断片が増幅される。ＰＣＲ産物を熱変
性、急冷した後に、１０％グリセロールを含む６％ポリ
アクリルアミドゲルをＳＳＣＰ用電気泳動ゲルとして用
いて電気泳動する。電気泳動バッファーは１０％グリセ
ロールを含む１×ＴＢＥバッファーを用いた。
る。図３−図１１を参照しながら説明したのと同様にし
て、標的ＤＮＡを、蛍光標識したＰＣＲ用フォワードプ
ライマーとアデニン付加を高効率で起こす組み合わせの
塩基を５’末端側に配列されたアンカー配列を持つＰＣ
Ｒ用リバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣ
Ｒによってアデニン付加の起こった断片とアデニン付加
の起こらなかった断片が増幅される。ＰＣＲ産物を熱変
性、急冷した後に、１０％グリセロールを含む６％ポリ
アクリルアミドゲルをＳＳＣＰ用電気泳動ゲルとして用
いて電気泳動する。電気泳動バッファーは１０％グリセ
ロールを含む１×ＴＢＥバッファーを用いた。
【００２７】図１３（Ａ）、（Ｂ）はアデニン付加のＳ
ＳＣＰにおける影響を評価した一例であり、図２に対応
する図である。図１３（Ａ）はアンカー配列を持たない
リバースプライマーによるＰＣＲにおける増幅産物の解
析結果のエレクトロフェログラム１４０を示し、図１３
（Ｂ）はアンカー配列を持つリバースプライマーによる
ＰＣＲにおける増幅産物の解析結果のエレクトロフェロ
グラム１４１を示す。図１３（Ａ）のエレクトロフェロ
グラム１４０では、父性由来のＤＮＡから増幅されアデ
ニン付加が起こった断片に由来するピーク１４２と、ア
デニン付加が起こらなかった断片に由来するピーク１４
３と、母性由来のＤＮＡから増幅されアデニン付加が起
こった断片に由来するピーク１４４と、アデニン付加が
起こらなかった断片に由来するピーク１４５が検出され
る。エレクトロフェログラム１４０ではアデニン付加の
起こらなかった断片とアデニン付加の起こった断片が
３：１であり、アデニン付加した断片が１０％以上混じ
っている。一方、図１３（Ｂ）のエレクトロフェログラ
ム１４１では、父性由来のＤＮＡから増幅されアデニン
付加の起こった断片に由来するピーク１４２と、母性由
来のＤＮＡから増幅されアデニン付加の起こったピーク
１４４が検出されている。図から分かるように、エレク
トロフェログラム１４１では、アデニン付加の起こらな
かった断片はほとんど検出されていない。
ＳＣＰにおける影響を評価した一例であり、図２に対応
する図である。図１３（Ａ）はアンカー配列を持たない
リバースプライマーによるＰＣＲにおける増幅産物の解
析結果のエレクトロフェログラム１４０を示し、図１３
（Ｂ）はアンカー配列を持つリバースプライマーによる
ＰＣＲにおける増幅産物の解析結果のエレクトロフェロ
グラム１４１を示す。図１３（Ａ）のエレクトロフェロ
グラム１４０では、父性由来のＤＮＡから増幅されアデ
ニン付加が起こった断片に由来するピーク１４２と、ア
デニン付加が起こらなかった断片に由来するピーク１４
３と、母性由来のＤＮＡから増幅されアデニン付加が起
こった断片に由来するピーク１４４と、アデニン付加が
起こらなかった断片に由来するピーク１４５が検出され
る。エレクトロフェログラム１４０ではアデニン付加の
起こらなかった断片とアデニン付加の起こった断片が
３：１であり、アデニン付加した断片が１０％以上混じ
っている。一方、図１３（Ｂ）のエレクトロフェログラ
ム１４１では、父性由来のＤＮＡから増幅されアデニン
付加の起こった断片に由来するピーク１４２と、母性由
来のＤＮＡから増幅されアデニン付加の起こったピーク
１４４が検出されている。図から分かるように、エレク
トロフェログラム１４１では、アデニン付加の起こらな
かった断片はほとんど検出されていない。
【００２８】図１３（Ａ）、（Ｂ）から分かるように、
アンカー配列を持つリバースプライマーによりアデニン
の付加反応を促進することにより、ＰＣＲ産物をアデニ
ン付加の起こらなかった断片とアデニン付加の起こった
断片の混合物からアデニン付加の起こらなかった断片を
除外したものとすることができる。この結果、ＳＳＣＰ
による診断をより高精度なものにできる。 （実施例３）本発明はマルチプレックスＰＣＲにも適用
することができる。実施例１と同様、蛍光標識したＰＣ
Ｒ用フォワードプライマーとアンカー配列を持つＰＣＲ
用リバースプライマーを用いて標的ＤＮＡをＲＣＲ増幅
する。実施例１では１つの反応チューブにて１つの標的
ＤＮＡを増幅することを前提として説明したが、マルチ
プレックスＰＣＲでは１つの反応チューブにて複数の標
的ＤＮＡを同時に増幅し、ＰＣＲ産物を電気泳動分離し
て同時に検出することができる。アンカー配列は標的Ｄ
ＮＡの配列とは相補でないという条件を満たせば良く、
標的ＤＮＡの配列とは無関係に設計できるため、全ての
ＰＣＲ用リバースプライマーに対して同じアンカー配列
を使用できる。
アンカー配列を持つリバースプライマーによりアデニン
の付加反応を促進することにより、ＰＣＲ産物をアデニ
ン付加の起こらなかった断片とアデニン付加の起こった
断片の混合物からアデニン付加の起こらなかった断片を
除外したものとすることができる。この結果、ＳＳＣＰ
による診断をより高精度なものにできる。 （実施例３）本発明はマルチプレックスＰＣＲにも適用
することができる。実施例１と同様、蛍光標識したＰＣ
Ｒ用フォワードプライマーとアンカー配列を持つＰＣＲ
用リバースプライマーを用いて標的ＤＮＡをＲＣＲ増幅
する。実施例１では１つの反応チューブにて１つの標的
ＤＮＡを増幅することを前提として説明したが、マルチ
プレックスＰＣＲでは１つの反応チューブにて複数の標
的ＤＮＡを同時に増幅し、ＰＣＲ産物を電気泳動分離し
て同時に検出することができる。アンカー配列は標的Ｄ
ＮＡの配列とは相補でないという条件を満たせば良く、
標的ＤＮＡの配列とは無関係に設計できるため、全ての
ＰＣＲ用リバースプライマーに対して同じアンカー配列
を使用できる。
【００２９】図１４（Ａ）は標的ＤＮＡを蛍光標識した
ＰＣＲ用フォワードプライマー群とアンカー配列を持た
ないＰＣＲ用リバースプライマー群を用いてＰＣＲを行
い、ＰＣＲ産物を電気泳動分析した場合のエレクトロフ
ェログラム１５０を示す図であり、図１４（Ｂ）は標的
ＤＮＡを蛍光標識したＰＣＲ用フォワードプライマー群
とアンカー配列を持つＰＣＲ用リバースプライマー群を
用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を電気泳動分析した場
合のエレクトロフェログラム１５１を示す図である。図
１４（Ａ）に示すように、アデニン付加効率を促進する
アンカー配列を用いずにマルチプレックスＰＣＲを行っ
た場合、エレクトロフェログラム１５０では、ピークが
近接し、定量的解析が困難になる場合がある。しかし、
図１４（Ｂ）に示すように、アデニン付加効率を促進す
るアンカー配列を持つＰＣＲ用プライマーを用いてマル
チプレックスＰＣＲを行うと、エレクトロフェログラム
１５１のように、ピークの近接が緩和される。このた
め、高度なマルチプレックス化が可能となる。実施例３
では、アデニン付加が起こらなかった断片由来のピーク
が検出されないため、高度なマルチプレックス化が可能
となる。
ＰＣＲ用フォワードプライマー群とアンカー配列を持た
ないＰＣＲ用リバースプライマー群を用いてＰＣＲを行
い、ＰＣＲ産物を電気泳動分析した場合のエレクトロフ
ェログラム１５０を示す図であり、図１４（Ｂ）は標的
ＤＮＡを蛍光標識したＰＣＲ用フォワードプライマー群
とアンカー配列を持つＰＣＲ用リバースプライマー群を
用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を電気泳動分析した場
合のエレクトロフェログラム１５１を示す図である。図
１４（Ａ）に示すように、アデニン付加効率を促進する
アンカー配列を用いずにマルチプレックスＰＣＲを行っ
た場合、エレクトロフェログラム１５０では、ピークが
近接し、定量的解析が困難になる場合がある。しかし、
図１４（Ｂ）に示すように、アデニン付加効率を促進す
るアンカー配列を持つＰＣＲ用プライマーを用いてマル
チプレックスＰＣＲを行うと、エレクトロフェログラム
１５１のように、ピークの近接が緩和される。このた
め、高度なマルチプレックス化が可能となる。実施例３
では、アデニン付加が起こらなかった断片由来のピーク
が検出されないため、高度なマルチプレックス化が可能
となる。
【００３０】（アンカー配列を求めるソフトウェアの実
施例）ＰＣＲに用いるプライマー配列を決める段階に於
いて、簡便にアンカー配列を持つＰＣＲ用プライマーの
塩基配列を設計できるソフトウェアがあると有用であ
る。図１５に、そのために工夫されたソフトウェアのフ
ローチャートの実施例を示す。ステップ１０１では、ア
ンカー配列を持つＰＣＲ用リバースプライマー１からア
ンカー配列を持つＰＣＲ用リバースプライマーｎについ
て、図３−図１１で説明した手順でＰＣＲを行う。ステ
ップ１０２では、ステップ１０１で行われたＰＣＲの産
物から、それぞれのアンカー配列を持つＰＣＲ用リバー
スプライマーについて、アデニン付加効率を計算する。
ステップ１０３では、ステップ１０２の結果から、アデ
ニン付加効率を比較し、より高いアデニン付加効率を与
えるアンカー配列を持つＰＣＲ用リバースプライマーを
判断し、選択する。ステップ１０４では、ステップ１０
３の結果から、高アデニン付加効率を与えるアンカー配
列をファイルに格納しておく。ここで、注目すべきなの
は、ステップ１０３では、より高いアデニン付加効率を
与えるアンカー配列を持つＰＣＲ用リバースプライマー
を選択するが、本ソフトウェアは、任意の標的ＤＮＡに
適用するためのアンカー配列を選択するためのものであ
るから、選択されたアンカー配列を持つＰＣＲ用リバー
スプライマーから、アンカー配列のみを切り出してファ
イルに格納することである。ここで、ステップ１０４ま
では、本ソフトウェアにとっては、いわば、準備段階と
も言うべきものであって、標的ＤＮＡに対するＰＣＲ用
プライマーの決定の処理はステップ１０５以降である。
ステップ１１１では、標的ＤＮＡの配列を導入する。ス
テップ１１２では標的ＤＮＡの増幅領域を決定する。ス
テップ１１３では、標的ＤＮＡの増幅領域の配列に対応
して、従来法に従い適当なＴｍ値を持ち、プライマー内
あるいはプライマー間で二次構造を形成しないようなＰ
ＣＲ用フォワードプライマーとＰＣＲ用リバースプライ
マーの塩基配列を設計する。次に、ステップ１１４で
は、ステップ１０４までで予め準備されファイルに格納
されているアンカー配列の一つ（アンカー配列の候補）
を取り出して、ステップ１１３で設計されたＰＣＲ用リ
バースプライマーの５'末端に結合してアンカー配列を
持つＰＣＲ用リバースプライマーを仮決定する。ステッ
プ１１５では、アンカー配列を付け加えた結果ステップ
１１３で二次構造を形成しないように設計されたＰＣＲ
用リバースプライマーが、二次構造を形成するものとな
ったか否かを評価して、もし、二次構造やプライマーダ
イマーを形成するものとなった場合には、別のアンカー
配列の候補を選択して、別のアンカー配列を持つＰＣＲ
用リバースプライマーを仮決定する。二次構造を形成す
るものとなっていなければ、ステップ１１７で、この仮
決定されたものをアンカー配列を持つＰＣＲ用リバース
プライマーとして決定する。ステップ１１５で、３２回
以上二次構造を形成するアンカー配列と判定されたと
き、すなわち、ステップ1１６がＹｅｓとなったとき
は、ステップ１１２に戻り、標的ＤＮＡの増幅領域を決
定し直したうえで上述したようにしてアンカー配列を持
つＰＣＲ用リバースプライマーとして決定する。なお、
本実施例の場合では、アンカー配列が５’末端側のＧＡ
に続く２塩基全てのアンカー配列について調べることで
１６回、５’末端側のＧＧに続く２塩基全てのアンカー
配列について調べることで１６回のチェックが行われる
が、これら全ての場合で二次構造を形成する場合にはス
テップ１１２に戻ることにした。
施例）ＰＣＲに用いるプライマー配列を決める段階に於
いて、簡便にアンカー配列を持つＰＣＲ用プライマーの
塩基配列を設計できるソフトウェアがあると有用であ
る。図１５に、そのために工夫されたソフトウェアのフ
ローチャートの実施例を示す。ステップ１０１では、ア
ンカー配列を持つＰＣＲ用リバースプライマー１からア
ンカー配列を持つＰＣＲ用リバースプライマーｎについ
て、図３−図１１で説明した手順でＰＣＲを行う。ステ
ップ１０２では、ステップ１０１で行われたＰＣＲの産
物から、それぞれのアンカー配列を持つＰＣＲ用リバー
スプライマーについて、アデニン付加効率を計算する。
ステップ１０３では、ステップ１０２の結果から、アデ
ニン付加効率を比較し、より高いアデニン付加効率を与
えるアンカー配列を持つＰＣＲ用リバースプライマーを
判断し、選択する。ステップ１０４では、ステップ１０
３の結果から、高アデニン付加効率を与えるアンカー配
列をファイルに格納しておく。ここで、注目すべきなの
は、ステップ１０３では、より高いアデニン付加効率を
与えるアンカー配列を持つＰＣＲ用リバースプライマー
を選択するが、本ソフトウェアは、任意の標的ＤＮＡに
適用するためのアンカー配列を選択するためのものであ
るから、選択されたアンカー配列を持つＰＣＲ用リバー
スプライマーから、アンカー配列のみを切り出してファ
イルに格納することである。ここで、ステップ１０４ま
では、本ソフトウェアにとっては、いわば、準備段階と
も言うべきものであって、標的ＤＮＡに対するＰＣＲ用
プライマーの決定の処理はステップ１０５以降である。
ステップ１１１では、標的ＤＮＡの配列を導入する。ス
テップ１１２では標的ＤＮＡの増幅領域を決定する。ス
テップ１１３では、標的ＤＮＡの増幅領域の配列に対応
して、従来法に従い適当なＴｍ値を持ち、プライマー内
あるいはプライマー間で二次構造を形成しないようなＰ
ＣＲ用フォワードプライマーとＰＣＲ用リバースプライ
マーの塩基配列を設計する。次に、ステップ１１４で
は、ステップ１０４までで予め準備されファイルに格納
されているアンカー配列の一つ（アンカー配列の候補）
を取り出して、ステップ１１３で設計されたＰＣＲ用リ
バースプライマーの５'末端に結合してアンカー配列を
持つＰＣＲ用リバースプライマーを仮決定する。ステッ
プ１１５では、アンカー配列を付け加えた結果ステップ
１１３で二次構造を形成しないように設計されたＰＣＲ
用リバースプライマーが、二次構造を形成するものとな
ったか否かを評価して、もし、二次構造やプライマーダ
イマーを形成するものとなった場合には、別のアンカー
配列の候補を選択して、別のアンカー配列を持つＰＣＲ
用リバースプライマーを仮決定する。二次構造を形成す
るものとなっていなければ、ステップ１１７で、この仮
決定されたものをアンカー配列を持つＰＣＲ用リバース
プライマーとして決定する。ステップ１１５で、３２回
以上二次構造を形成するアンカー配列と判定されたと
き、すなわち、ステップ1１６がＹｅｓとなったとき
は、ステップ１１２に戻り、標的ＤＮＡの増幅領域を決
定し直したうえで上述したようにしてアンカー配列を持
つＰＣＲ用リバースプライマーとして決定する。なお、
本実施例の場合では、アンカー配列が５’末端側のＧＡ
に続く２塩基全てのアンカー配列について調べることで
１６回、５’末端側のＧＧに続く２塩基全てのアンカー
配列について調べることで１６回のチェックが行われる
が、これら全ての場合で二次構造を形成する場合にはス
テップ１１２に戻ることにした。
【００３１】以上のようにソフトウェアを用いると、複
数のアンカー配列から高アデニン付加効率を与えるアン
カー配列を簡単に決定できる。また、高アデニン付加効
率を与えるアンカー配列をファイルに格納しておくこと
ができ、さまざまなプライマーに対してアンカー配列候
補として選択できる。アンカー配列を付け加えたプライ
マーが二次構造を形成するかどうかをチェックすること
で、アンカー配列を持つＰＣＲ用プライマーを簡単に設
計し、塩基配列を決定できる。ユーザーから標的ＤＮＡ
配列と増幅産物のおおよその塩基長の情報を得て、アン
カー配列を持つＰＣＲ用プライマーをデザインするサー
ビスも可能である。
数のアンカー配列から高アデニン付加効率を与えるアン
カー配列を簡単に決定できる。また、高アデニン付加効
率を与えるアンカー配列をファイルに格納しておくこと
ができ、さまざまなプライマーに対してアンカー配列候
補として選択できる。アンカー配列を付け加えたプライ
マーが二次構造を形成するかどうかをチェックすること
で、アンカー配列を持つＰＣＲ用プライマーを簡単に設
計し、塩基配列を決定できる。ユーザーから標的ＤＮＡ
配列と増幅産物のおおよその塩基長の情報を得て、アン
カー配列を持つＰＣＲ用プライマーをデザインするサー
ビスも可能である。
【００３２】（その他）上述の実施例においては、ＰＣ
Ｒ用フォワードプライマーを蛍光標識することを前提と
してＰＣＲ用リバースプライマーにアンカー配列を付け
加えるものとして説明したが、逆にＰＣＲ用リバースプ
ライマーを蛍光標識するものとした場合にも本発明が適
用できることは言うまでもない。この場合、ＰＣＲ用フ
ォワードプライマーの５'末端にアンカー配列を付け加
えれば良いのである。ＰＣＲ用フォワードプライマーと
ＰＣＲ用リバースプライマー両方にアンカー配列を付け
加えても良い。
Ｒ用フォワードプライマーを蛍光標識することを前提と
してＰＣＲ用リバースプライマーにアンカー配列を付け
加えるものとして説明したが、逆にＰＣＲ用リバースプ
ライマーを蛍光標識するものとした場合にも本発明が適
用できることは言うまでもない。この場合、ＰＣＲ用フ
ォワードプライマーの５'末端にアンカー配列を付け加
えれば良いのである。ＰＣＲ用フォワードプライマーと
ＰＣＲ用リバースプライマー両方にアンカー配列を付け
加えても良い。
【００３３】
【発明の効果】標的ＤＮＡ配列に対するＰＣＲで増幅し
たＤＮＡ断片の末端に付加するアデニンを高効率で付加
させることができ、高分解能の解析が可能となる。
たＤＮＡ断片の末端に付加するアデニンを高効率で付加
させることができ、高分解能の解析が可能となる。
【配列表】
<110> HITACH、LTD.
<120> Primer for PCR and Method for Determination of base sequence of Pr
imer for PCR
<130> NT01P1010
<160> 2
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward DNA primer which is used in PCR and hybridizes with DNA fr
agment originated from yeast gene.
<400> 1
agaagagggc tccaatttct c 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> base sequence of a part of reverse DNA primer which is used in PCR
and the base sequence of a part of reverse DNA primer hybridizes with D
NA fragment originated from yeast gene.
<400> 2
gtgagcaata cacaaaattg ta 22
配列表フリーテキスト
（１）配列番号１の配列に関する他の関連する情報の記
載 酵母遺伝子（ＹＧＲ２８１Ｗ）を増幅するフォワードプ
ライマー。 （２）配列番号２の配列に関する他の関連する情報の記
載 酵母遺伝子（ＹＧＲ２８１Ｗ）を増幅するリバースプラ
イマーの酵母遺伝子（ＹＧＲ２８１Ｗ）に相補な配列。
載 酵母遺伝子（ＹＧＲ２８１Ｗ）を増幅するフォワードプ
ライマー。 （２）配列番号２の配列に関する他の関連する情報の記
載 酵母遺伝子（ＹＧＲ２８１Ｗ）を増幅するリバースプラ
イマーの酵母遺伝子（ＹＧＲ２８１Ｗ）に相補な配列。
【図１】本発明によるアンカー配列を有するＰＣＲ用プ
ライマーを用いたＰＣＲと、その結果の産物の態様およ
び産物を電気泳動して標識の蛍光強度でアンカー配列を
有するＰＣＲ用プライマーを評価することを模式的に示
す図。
ライマーを用いたＰＣＲと、その結果の産物の態様およ
び産物を電気泳動して標識の蛍光強度でアンカー配列を
有するＰＣＲ用プライマーを評価することを模式的に示
す図。
【図２】（Ａ）はアンカー配列を持たないリバースプラ
イマーによるＰＣＲにおける増幅産物のエレクトロフェ
ログラムを示し、（Ｂ）はアンカー配列を持つリバース
プライマーによるＰＣＲにおける増幅産物のエレクトロ
フェログラムを示す図。
イマーによるＰＣＲにおける増幅産物のエレクトロフェ
ログラムを示し、（Ｂ）はアンカー配列を持つリバース
プライマーによるＰＣＲにおける増幅産物のエレクトロ
フェログラムを示す図。
【図３】（Ａ）−（Ｄ）は本発明によるアデニンの付加
反応を促進するアンカー配列のスクリーニング法の概念
を示すフローチャート。
反応を促進するアンカー配列のスクリーニング法の概念
を示すフローチャート。
【図４】（Ａ）−（Ｄ）は４種類のアンカー配列を持っ
たＰＣＲ用リバースプライマーを使用したＰＣＲ産物に
ついての電気泳動結果の具体例を示すエレクトロフェロ
グラム。
たＰＣＲ用リバースプライマーを使用したＰＣＲ産物に
ついての電気泳動結果の具体例を示すエレクトロフェロ
グラム。
【図５】４種類のアンカー配列を持ったＰＣＲ用リバー
スプライマーを使用したＰＣＲ産物についての電気泳動
結果のアデニン付加効率（ＳA／（ＳA＋Ｓ））を求めた
結果を比較するグラフ。
スプライマーを使用したＰＣＲ産物についての電気泳動
結果のアデニン付加効率（ＳA／（ＳA＋Ｓ））を求めた
結果を比較するグラフ。
【図６】図３に続くアンカー配列の５’末端から２番目
の塩基の決定の流れを示す図。
の塩基の決定の流れを示す図。
【図７】４種類のアンカー配列を持ったＰＣＲ用リバー
スプライマーを使用したＰＣＲ産物についての電気泳動
結果の具体例を示すエレクトロフェログラム。
スプライマーを使用したＰＣＲ産物についての電気泳動
結果の具体例を示すエレクトロフェログラム。
【図８】４種類のアンカー配列を持ったＰＣＲ用リバー
スプライマーを使用したＰＣＲ産物についての電気泳動
結果のアデニン付加効率（ＳA／（ＳA＋Ｓ））を求めた
結果を比較するグラフ。
スプライマーを使用したＰＣＲ産物についての電気泳動
結果のアデニン付加効率（ＳA／（ＳA＋Ｓ））を求めた
結果を比較するグラフ。
【図９】図６に続くアンカー配列の５’末端から３番目
の塩基の決定の流れを示す図。
の塩基の決定の流れを示す図。
【図１０】４種類のアンカー配列を持つＰＣＲ用リバー
スプライマーを用いてＰＣＲを行った増幅産物を電気泳
動して得たエレクトロフェログラム。
スプライマーを用いてＰＣＲを行った増幅産物を電気泳
動して得たエレクトロフェログラム。
【図１１】４種類のアンカー配列を持つＰＣＲ用リバー
スプライマーを用いてＰＣＲを行った増幅産物について
のアデニン付加効率を比較したグラフ。
スプライマーを用いてＰＣＲを行った増幅産物について
のアデニン付加効率を比較したグラフ。
【図１２】（Ａ），（Ｂ）は本実施例により決定された
アンカー配列をもつＰＣＲ用リバースプライマーの構造
を模式的に示す図。
アンカー配列をもつＰＣＲ用リバースプライマーの構造
を模式的に示す図。
【図１３】（Ａ）、（Ｂ）はアデニン付加のＳＳＣＰに
おける影響を評価した一例であり、（Ａ）はアンカー配
列を持たないリバースプライマーによるＰＣＲにおける
増幅産物の解析結果のエレクトロフェログラムを示し、
（Ｂ）はアンカー配列を持つリバースプライマーによる
ＰＣＲにおける増幅産物の解析結果のエレクトロフェロ
グラムを示す図。
おける影響を評価した一例であり、（Ａ）はアンカー配
列を持たないリバースプライマーによるＰＣＲにおける
増幅産物の解析結果のエレクトロフェログラムを示し、
（Ｂ）はアンカー配列を持つリバースプライマーによる
ＰＣＲにおける増幅産物の解析結果のエレクトロフェロ
グラムを示す図。
【図１４】（Ａ）は標的ＤＮＡを蛍光標識したＰＣＲ用
フォワードプライマー群とアンカー配列を持たないＰＣ
Ｒ用リバースプライマー群を用いてＰＣＲを行い、ＰＣ
Ｒ産物を電気泳動分析した場合のエレクトロフェログラ
ムを示し、（Ｂ）は標的ＤＮＡを蛍光標識したＰＣＲ用
フォワードプライマー群とアンカー配列を持つＰＣＲ用
リバースプライマー群を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産
物を電気泳動分析した場合のエレクトロフェログラムを
示す図。
フォワードプライマー群とアンカー配列を持たないＰＣ
Ｒ用リバースプライマー群を用いてＰＣＲを行い、ＰＣ
Ｒ産物を電気泳動分析した場合のエレクトロフェログラ
ムを示し、（Ｂ）は標的ＤＮＡを蛍光標識したＰＣＲ用
フォワードプライマー群とアンカー配列を持つＰＣＲ用
リバースプライマー群を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産
物を電気泳動分析した場合のエレクトロフェログラムを
示す図。
【図１５】簡便にアンカー配列を持つＰＣＲ用プライマ
ーの塩基配列を設計できるソフトウェアの実施例を示す
図。
ーの塩基配列を設計できるソフトウェアの実施例を示す
図。
（実施例１）
１：試料ＤＮＡ、１−１，１−２：試料ＤＮＡ１の二つ
の一本鎖、２：ＰＣＲ用フォワードプライマー、３：ア
ンカー配列、４：ＰＣＲ用リバースプライマー、Ｆ：蛍
光標識、５：ＰＣＲ産物の３’末端にアデニン付加が起
こらなかった断片、６：ＰＣＲ産物の３’末端にアデニ
ン付加が起こった断片、７，１２：アデニン付加が起こ
らなかった断片５に由来するピーク、８，１１：アデニ
ン付加が起こった断片６に由来するピーク、９，１０，
１３，４１，４２，４３，４４，８０，８１，８２，８
３，８５，８６，８７，８８，１４０，１４１，１５
０，１５１：エレクトロフェログラム、４５，８４，９
０：グラフ、９１：アンカー配列を持つリバースプライ
マー、９２：ＧＡの塩基配列、９３：ＧＧの塩基配列、
９４：アンカー配列、９５：リバースプライマー、１０
１−１０５及び１１１−１１６：処理ステップ、１４
２：父性由来のＤＮＡから増幅されアデニン付加の起こ
った断片に由来するピーク、１４３：父性由来のＤＮＡ
から増幅されアデニン付加の起こらなかった断片に由来
するピーク、１４４：母性由来のＤＮＡから増幅されア
デニン付加が起こった断片に由来するピーク、１４５：
母性由来のＤＮＡから増幅されアデニン付加が起こらな
かった断片に由来するピーク。
の一本鎖、２：ＰＣＲ用フォワードプライマー、３：ア
ンカー配列、４：ＰＣＲ用リバースプライマー、Ｆ：蛍
光標識、５：ＰＣＲ産物の３’末端にアデニン付加が起
こらなかった断片、６：ＰＣＲ産物の３’末端にアデニ
ン付加が起こった断片、７，１２：アデニン付加が起こ
らなかった断片５に由来するピーク、８，１１：アデニ
ン付加が起こった断片６に由来するピーク、９，１０，
１３，４１，４２，４３，４４，８０，８１，８２，８
３，８５，８６，８７，８８，１４０，１４１，１５
０，１５１：エレクトロフェログラム、４５，８４，９
０：グラフ、９１：アンカー配列を持つリバースプライ
マー、９２：ＧＡの塩基配列、９３：ＧＧの塩基配列、
９４：アンカー配列、９５：リバースプライマー、１０
１−１０５及び１１１−１１６：処理ステップ、１４
２：父性由来のＤＮＡから増幅されアデニン付加の起こ
った断片に由来するピーク、１４３：父性由来のＤＮＡ
から増幅されアデニン付加の起こらなかった断片に由来
するピーク、１４４：母性由来のＤＮＡから増幅されア
デニン付加が起こった断片に由来するピーク、１４５：
母性由来のＤＮＡから増幅されアデニン付加が起こらな
かった断片に由来するピーク。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 入江 隆史
東京都国分寺市東恋ケ窪一丁目280番地
株式会社日立製作所中央研究所内
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA11 HA19
4B063 QA01 QA13 QA18 QQ42 QQ52
QR08 QR42 QR62 QS16 QS25
QS39 QX02
Claims (9)
- 【請求項１】標的ＤＮＡの一本鎖の一つに相補な所定の
塩基長の第１の配列と、該第１の配列の５’末端側に隣
接して設けられ５’末端側にＧＡ又はＧＧ配列を有し、
前記標的ＤＮＡの一本鎖に非相補な第２の配列とを有す
ることを特徴とするＰＣＲ用プライマー。 - 【請求項２】標的ＤＮＡの一本鎖の一つに相補な所定の
塩基長の第１の配列と、該第１の配列の５’末端側に隣
接して設けられ５’末端側にＧＡ又はＧＧ配列を有し、
前記標的ＤＮＡに非相補な第２の配列とを有する第１の
ＰＣＲ用プライマーと標的ＤＮＡの他の一本鎖の一つに
相補な所定の塩基長の第３の配列を有する第２のＰＣＲ
用プライマーとにより標的ＤＮＡのＰＣＲ増幅を行うこ
とを特徴とするＰＣＲ増幅の実行方法。 - 【請求項３】前記第１の配列の塩基長が１２〜２０であ
り、第２の配列の塩基長が２〜５である請求項１記載の
ＰＣＲ用プライマー。 - 【請求項４】前記第１のＰＣＲ用プライマーまたは第２
のＰＣＲ用プライマーの両方または第１のＰＣＲ用プラ
イマーが蛍光標識されている請求項２記載のＰＣＲ増幅
の実行方法。 - 【請求項５】標的ＤＮＡの一本鎖の一つに相補な所定の
塩基長の第１の配列と、該第１の配列の５’末端側に隣
接して設けられ５’末端側にＧＡ又はＧＧ配列を有し、
前記標的ＤＮＡに非相補な第２の配列とを有する第１の
ＰＣＲ用プライマーと標的ＤＮＡの他の一本鎖の一つに
相補な所定の塩基長の第３の配列を有する第２のＰＣＲ
用プライマーとを用い、ターミナルトランスフェラーゼ
活性を持つ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ増
幅を行う工程と、増幅されたＤＮＡ断片を、電気泳動に
より検出する工程とを有することを特徴とするＤＮＡ断
片の解析方法。 - 【請求項６】標的ＤＮＡの一本鎖の一つに相補な所定の
塩基長の第１の配列と、該第１の配列の５’末端側に隣
接して設けられ該一本鎖に非相補な所定の塩基長の第２
の配列を備える構造とするとともに、該第２の配列の
５’末端の１塩基の種類が異なる４種類のプライマーを
用意してＰＣＲを行い、ＰＣＲで得られた増幅産物の結
果を解析してアデニン付加効率を求め、アデニン付加の
起こり易い前記第２の配列を決定することを特徴とする
プライマーの塩基配列決定方法。 - 【請求項７】前記第２の配列の５’末端の１塩基を選定
した後、選定された塩基を５’末端に持ち、５’末端よ
り１塩基だけ３’側の１塩基について、塩基の種類が異
なる４種類のプライマーを用意してＰＣＲを行い、ＰＣ
Ｒで得られた増幅産物の結果を解析してアデニン付加効
率を求め、５’末端より１塩基だけ３’側の１塩基の決
定を行い、必要なら、さらに、１塩基３'側の１塩基に
ついても同様に塩基の種類が異なる４種類のプライマー
を用意してＰＣＲを行い、ＰＣＲで得られた増幅産物の
結果を解析してアデニン付加率を求め、順次アデニン付
加の起こり易い前記第２の配列を決定する請求項６に記
載のプライマーの塩基配列決定方法。 - 【請求項８】ＤＮＡの一本鎖の一つに相補な所定の塩基
長の第１の配列と、該第１の配列の５’末端側に隣接し
て設けられ該一本鎖に非相補な所定の塩基長の第２の配
列を備える構造とするとともに、該第２の配列の５’末
端の１塩基の種類が異なる４種類のプライマーを用意し
てＰＣＲを行い、ＰＣＲで得られた増幅産物の結果を解
析してアデニン付加効率を求め、アデニン付加の起こり
易い前記第２の配列を決定することによりアデニン付加
の起こり易い第２の配列を予め準備しておき、標的ＤＮ
Ａが与えられたとき、該標的ＤＮＡの一本鎖の一つに相
補な所定の塩基長の第１の配列と予め準備された第２の
配列との組み合わせからなるプライマーが安定な二次構
造を取るか否かをチェックする機能を有することを特徴
とするプライマーの塩基配列決定方法。 - 【請求項９】請求項８に記載のプライマーの塩基配列決
定法を用いて、与えられた標的ＤＮＡに対して、アデニ
ン付加の起こりやすい非相補な塩基配列を探索し、該非
相補な塩基配列を有するプライマーの塩基配列をデザイ
ンして、該プライマーの塩基配列を提供することを特徴
とするサービス。
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| JP2001360321A JP3779600B2 (ja) | 2001-11-27 | 2001-11-27 | Ｐｃｒ用プライマーおよびｐｃｒ用プライマーの塩基配列決定法 |
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|---|---|---|---|
| JP2001360321A JP3779600B2 (ja) | 2001-11-27 | 2001-11-27 | Ｐｃｒ用プライマーおよびｐｃｒ用プライマーの塩基配列決定法 |
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