JP2003102482A - 遺伝子、タンパク質、組み換え体および水素生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 新規ヒドロゲナーゼ遺伝子、該ヒドロゲナー
ゼ遺伝子によってコードされる新規ヒドロゲナーゼ、ヒ
ドロゲナーゼ遺伝子を導入した組み換え体を利用する水
素の効率的生産方法等を提供する。 【解決手段】 Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｒａｐｕ
ｔｒｉｆｉｃｕｍ由来の特定の塩基配列を有する新規ヒ
ドロゲナーゼ遺伝子。上記遺伝子の塩基配列がコードす
るアミノ酸配列を有するタンパク質（ヒドロゲナー
ゼ）。上記遺伝子を宿主に導入した組み換え体を用いて
水素源材料の分解を行い、水素ガスを高効率に得る水素
生産方法等。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、 Clostridium pa
raputrificum Ｍ株由来の新規ヒドロゲナーゼ遺伝子、
該ヒドロゲナーゼ遺伝子とそのプロモーター領域とを含
む新規遺伝子、これらの遺伝子によってコードされる新
規ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ遺伝子を導入した組
み換え体、及びこの組み換え体を利用する水素の効率的
生産方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】化石燃料に変わるクリーンなエネルギー
物質として、単位密度当たりのエネルギー量が高く、燃
焼後に公害物質を生じない水素ガスの利用が期待されて
おり、この点から、水素ガスの効率的生産方法が研究・
開発されている。

【０００３】従来の水素ガス生産方法の研究としては、
化学的又は電気的な手段を利用する方法が主流である。
しかしこれらの方法では、何らかの意味で化石燃料によ
るエネルギー供給が必要不可欠であり、化石燃料に変わ
るクリーンなエネルギー物質としての水素ガス利用の本
来の目的に反する。そして実際に、公害物質の発生等の
環境汚染や、地球温暖化等をを引き起こす恐れがある。

【０００４】そこで、化石燃料に依存しない微生物学的
な水素ガス生産方法が注目される。水素を生産する微生
物としては、らん藻や緑藻（例えばクロレラ）などの藻
類と細菌に分けられる。細菌においては、主に光合成細
菌と嫌気性細菌とが水素生産に利用可能な水素ガス発生
反応を触媒する能力を有している。嫌気性細菌が糖類か
ら水素を生産することは周知の事実であり、これを利用
して野生株の嫌気性細菌を用いた水素生産を行う場合も
ある。

【０００５】一般的な嫌気性細菌であるクロストリジウ
ム（Clostridium ）属の細菌において、グルコース，キ
チン等の糖類を水素，有機酸等に変換する際に、１モル
のグルコースからは理論的には４モルの水素が発生する
（Ｃ_６ Ｈ_１２Ｏ_６ ＋２Ｈ _２ Ｏ→２ＣＨ_３ ＣＯＯ
Ｈ＋２ＣＯ_２ ＋４Ｈ_２ ）筈であるが、実際には１〜
２モルの水素ガス発生にとどまっている事が知られてい
る。そのため、より高効率に水素ガスを生産できる微生
物が求められている。

【０００６】細菌も含めて、微生物による水素ガス発生
機構は、ヒドロゲナーゼが関与する機構とニトロゲナー
ゼが関与する機構との２つに大別される。水素生産反応
を触媒する酵素であるヒドロゲナーゼは多くの微生物に
存在するため、ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が注
目されている。

【０００７】例えば、嫌気性微生物もしくは嫌気性細菌
由来のヒドロゲナーゼ遺伝子の研究として、Microbiolo
gy Vol.141 (Pt 1), pp.171-180, 1995 、Microbiology
Vol.30, pp.9697-9704,1991 、T. Bacteriol. Vol.178
(9), pp.2668-2675, 1996等が報告されている。

【０００８】

【発明の解決しようとする課題】しかしながら、今まで
のところ、十分に高効率な水素ガス生産能を有する酵素
を発現させるヒドロゲナーゼ遺伝子は報告されていな
い。そこで本発明は、このようなヒドロゲナーゼ遺伝子
と、この遺伝子を強く発現させる優れたプロモーター
と、これらによって発現されるヒドロゲナーゼと、前記
ヒドロゲナーゼ遺伝子を導入した組み換え体と、これら
の組み換え体を利用した高効率な水素ガス生産方法とを
提供することを、解決すべき課題とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】（第１発明の構成）上記
課題を解決するための本願第１発明（請求項１に記載の
発明）の構成は、配列番号１に示す塩基配列における塩
基番号４６６〜２２１１の塩基配列を有する、遺伝子で
ある。

【００１０】（第２発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第２発明（請求項２に記載の発明）の構成は、
配列番号１に示す塩基配列における塩基番号４６６〜２
２１１の塩基配列と相補的な塩基配列のＤＮＡに対して
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ヒドロ
ゲナーゼ遺伝子として機能し得る、遺伝子である。

【００１１】（第３発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第３発明（請求項３に記載の発明）の構成は、
前記第１発明又は第２発明に係る遺伝子の上流に、配列
番号１に示す塩基配列における塩基番号１〜４６５のプ
ロモータ領域を連結した、遺伝子である。

【００１２】（第４発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第４発明（請求項４に記載の発明）の構成は、
第１発明又は第２発明に係る遺伝子によってコードされ
るアミノ酸配列を有する、タンパク質である。

【００１３】（第５発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第５発明（請求項５に記載の発明）の構成は、
配列番号１に示すアミノ酸番号１〜５８２のアミノ酸配
列を有する、タンパク質である。

【００１４】（第６発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第６発明（請求項６に記載の発明）の構成は、
配列番号１に示すアミノ酸番号１〜５８２のアミノ酸配
列において１個〜５個のアミノ酸が置換、欠失又は付加
されたアミノ酸配列を有し、ヒドロゲナーゼ活性を示
す、タンパク質である。

【００１５】（第７発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第７発明（請求項７に記載の発明）の構成は、
第１発明〜第３発明のいずれかに係る遺伝子を宿主に導
入した、組み換え体である。

【００１６】（第８発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第８発明（請求項８に記載の発明）の構成は、
前記第７発明に係る宿主が、絶対嫌気性細菌，通性嫌気
性細菌及び好気性細菌を含む原核細胞、又は真核細胞で
ある、組み換え体である。

【００１７】（第９発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第９発明（請求項９に記載の発明）の構成は、
前記第７発明に係る宿主が Clostridium paraputrific
um Ｍ株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６３９０）である、組み換
え体である。

【００１８】（第１０発明の構成）上記課題を解決する
ための本願第１０発明（請求項１０に記載の発明）の構
成は、第７発明〜第９発明のいずれかに係る組み換え体
を用いて水素源材料の分解を行い、水素ガスを高効率に
得る、水素生産方法である。

【００１９】（第１１発明の構成）上記課題を解決する
ための本願第１１発明（請求項１１に記載の発明）の構
成は、前記第１０発明に係る水素源材料がキチン質材料
又はデンプン質材料である、水素生産方法である。

【００２０】

【発明の作用・効果】（第１発明の作用・効果）第１発
明の遺伝子は、 Clostridium paraputrificum Ｍ株に
由来する新規なヒドロゲナーゼ遺伝子である。第１発明
によって、十分に高効率な水素ガス生産能を有するヒド
ロゲナーゼをコードする遺伝子が提供される。

【００２１】（第２発明の作用・効果）第２発明の遺伝
子に対しても、第１発明の遺伝子と同等の作用・効果を
期待することができる。

【００２２】（第３発明の作用・効果）第３発明に記載
したプロモータ領域は、ヒドロゲナーゼ遺伝子の上流に
連結された時、ヒドロゲナーゼ遺伝子の転写を強く促進
する効果があるものと考えられる。

【００２３】（第４発明の作用・効果）第１発明又は第
２発明の遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を有
するタンパク質は、優れたヒドロゲナーゼ活性を示す。

【００２４】（第５発明の作用・効果）配列番号１に示
すアミノ酸番号１〜５８２のアミノ酸配列を有するタン
パク質は、優れたヒドロゲナーゼ活性を示す。

【００２５】（第６発明の作用・効果）第６発明のタン
パク質に対しても、第５発明のタンパク質と同等の作用
・効果を期待することができる。

【００２６】（第７発明の作用・効果）第７発明の組み
換え体は、適当な水素源材料を投与した時、高効率な水
素ガス生産能力を発揮する。後述の実施例によれば、天
然型のC. paraputrificum Ｍ株の水素ガス生産能力に
対して、このＭ株を宿主とする第７発明の組み換え体
は、水素ガス生産能力が最大で約１．８倍増大した。

【００２７】（第８発明の作用・効果）組み換え体の宿
主としては、例えばヒドロゲナーゼにより水素ガスの生
産が可能な各種の原核細胞（細菌）や真核細胞を好まし
く例示できる。細菌としては、絶対嫌気性細菌、通性嫌
気性細菌及び好気性細菌に属する特定のものが好ましく
利用可能である。らん藻や緑藻も好ましく利用可能であ
る。

【００２８】（第９発明の作用・効果）組み換え体の宿
主としては、 Clostridium paraputrificum Ｍ株を、
特に好ましく例示できる。

【００２９】（第１０発明の作用・効果）第７発明〜第
９発明の組み換え体を用いて適宜な水素源材料の分解を
行い、水素ガスを高効率に得ることができる。

【００３０】（第１１発明の作用・効果）上記第１０発
明に係る水素源材料の種類は限定されないが、例えばキ
チン質材料又はデンプン質材料を好ましく例示できる。
これらの材料は、例えばエビ殻，カニ殻，トウモロコシ
屑等として廃棄物処理が問題になっている材料であるた
め、水素ガス生産と廃棄物処理とを同時に達成できる可
能性がある。

【００３１】

【発明の実施の形態】次に、第１発明〜第１１発明の実
施の形態について説明する。以下において単に「本発
明」と言うときは、第１発明〜第１１発明を一括して指
している。

【００３２】〔ヒドロゲナーゼ遺伝子〕本発明に係るヒ
ドロゲナーゼ遺伝子は、好ましくは、C. paraputrific
um Ｍ株に由来する新規なヒドロゲナーゼ遺伝子であ
る。上記したC. paraputrificumＭ株は、ＦＥＲＭＰ−
１６３９０として、既に経済産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所に寄託されている。

【００３３】上記の遺伝子がヒドロゲナーゼ遺伝子であ
ると判断される第１の根拠は、同じClostridium 属細菌
の既知のヒドロゲナーゼ遺伝子（即ち、C. acetobutyl
icum由来のヒドロゲナーゼ遺伝子、C. pasteurianum由
来のヒドロゲナーゼ遺伝子、C. perfringens 由来のヒ
ドロゲナーゼ遺伝子、及び、C. thermocellum由来のヒ
ドロゲナーゼ遺伝子）と対比して、アミノ酸レベルで約
７０％の相同性を示す点である。

【００３４】上記の遺伝子がヒドロゲナーゼ遺伝子であ
ると判断される第２の根拠は、後述の実施例に示すよう
に、この遺伝子を導入したC. paraputrificumＭ株の水
素ガス生産能力が顕著に向上した事実である。

【００３５】本発明に係るヒドロゲナーゼ遺伝子として
は、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号４６６
〜２２１１の塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。
又、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号４６６
〜２２１１の塩基配列と相補的な塩基配列のＤＮＡに対
してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ヒ
ドロゲナーゼ遺伝子として機能し得る遺伝子も挙げられ
る。

【００３６】〔プロモータ領域〕上記C. paraputrific
umＭ株のゲノムＤＮＡにおいて、ヒドロゲナーゼ遺伝子
の上流には、このヒドロゲナーゼ遺伝子の転写を強く促
進するプロモータ領域が見出された。このプロモータ領
域は、具体的には、配列番号１に示す塩基配列における
塩基番号１〜５６４の塩基配列領域である。

【００３７】本発明に係るヒドロゲナーゼ遺伝子を適宜
な宿主細胞に導入する際、ヒドロゲナーゼ遺伝子の上流
に上記プロモータ領域を連結しておくと、ヒドロゲナー
ゼ遺伝子の転写が促進され、ヒドロゲナーゼの発現が強
化される。

【００３８】〔ヒドロゲナーゼ〕本発明に係るヒドロゲ
ナーゼは、上記各種のヒドロゲナーゼ遺伝子によってコ
ードされるものであり、優れたヒドロゲナーゼ活性を示
す。

【００３９】本発明に係るヒドロゲナーゼとしては、配
列番号１に示す塩基配列における塩基番号４６６〜２２
１１の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタ
ンパク質が挙げられる。又、配列番号１に示す塩基配列
における塩基番号４６６〜２２１１の塩基配列と相補的
な塩基配列のＤＮＡに対してストリンジェントな条件下
でハイブリダイズし、ヒドロゲナーゼ遺伝子として機能
し得る遺伝子によってコードされるタンパク質も挙げら
れる。更に、配列番号１に示すアミノ酸番号１〜５８２
のアミノ酸配列を有するタンパク質も挙げられる。配列
番号１に示すアミノ酸番号１〜５８２のアミノ酸配列に
おいて１個〜５個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され
たアミノ酸配列を有し、ヒドロゲナーゼ活性を示すタン
パク質も挙げられる。

【００４０】〔組み換え体〕本発明に係る組み換え体
は、適宜に選ばれた宿主生物に対して上記いずれかのヒ
ドロゲナーゼ遺伝子を導入したもの、あるいは、ヒドロ
ゲナーゼ遺伝子の上流に上記プロモータ領域を連結した
遺伝子を導入したものである。宿主生物の種類はヒトを
除いて限定されないが、当該生物の代謝経路においても
ともとヒドロゲナーゼが関与する水素ガス発生機構を備
えている宿主が好ましい。

【００４１】宿主としては、特に細菌が好ましい。絶対
嫌気性細菌では、C. pasteurianum、 Megasohaera el
sdenii ＬＣ１、C. acetobutyricum、Methanobacteri
umthermoautotrophicum ΔＨ（以上はフェレドキシンを
持つタイプである。）等が例示され、更に、 Desulfovi
brio vulgaris Hildenborough 、Desulfovibriogigas
、 Desulfovibrio vulgaris Miyazaki Ｆ、 Desulf
ovibrio desulfuricans Norway、 Desulfovibrio d
esulfuricans ＡＴＣＣ２７７７４（以上はチトクロム
を持つタイプである。）等が例示される。

【００４２】通性嫌気性細菌では、 Proteus mirabili
s Ｓ５０３、 Escherichia coliＭＲＥ６００等が例
示される。好気性細菌では、 Alcaligenes eutrophus
Ｈ−１６、Nocardia opaca 、Paracoccus denitrific
ans 等が例示される。特に好ましい宿主の一例として、
C. paraputrificumＭ株が挙げられる。

【００４３】組み換え体の作製に当たり、ヒドロゲナー
ゼ遺伝子又はその上流に前記プロモータ領域を連結した
遺伝子は、そのまま宿主細胞に導入することもできる
し、宿主細胞との適合性を考慮した適宜なベクターに組
み込んで導入することもできる。これらの遺伝子又は組
み換えベクターの宿主細胞への導入に当たり、公知の各
種の遺伝子導入法、例えばカルシウム処理法、遺伝子注
入（トランスフェクション）法、パーティクルガン法、
エレクトロポレーション法等を任意に利用することがで
きる。

【００４４】上記の組み換えベクターには、例えばプロ
モーター領域、ターミネーター領域等の他、抗生物質耐
性遺伝子等の選抜用の各種マーカー遺伝子等を含ませる
ことができる。ベクターの好ましい具体例として、大腸
菌とC. perfringens 間のシャトルベクターであるｐＪ
ＩＲ７５１，ｐＪＩＲ７５０，ｐＪＩＲ４１８等を挙げ
ることができる。

【００４５】〔水素生産方法〕本発明に係る水素生産方
法は、上記いずれかの組み換え体を用いて適宜な水素源
材料の分解を行い、水素ガスを高効率に得ることを内容
とする。水素源材料の種類は限定されないが、キチン質
材料又はデンプン質材料（例えばエビ殻，カニ殻，トウ
モロコシ屑等の廃棄物）を例示することができる。

【００４６】

【実施例】（実施例１：染色体ＤＮＡの調製及びライブ
ラリーの作製）C. paraputrificum Ｍ株を用いて、以
下のようにして染色体ＤＮＡの調製と、ＤＮＡライブラ
リーの作製とを行った。

【００４７】炭素源をグルコースとして調製した、以下
の組成のＧＳ改変培地１００ｍＬにて、Ｍ株を一晩、３
７°Ｃで培養させた。

【００４８】ＧＳ改変培地組成（１Ｌあたり）： 酵母エキス４．５ｇ ポリペプトン１．０ｇ リン酸二水素カリウム３．０ｇ リン酸水素二カリウム５．８ｇ 硫酸アンモニウム２．６ｇ Ｌ−システイン塩酸塩１．０ｇ MOPS１０．０ｇ 炭酸ナトリウム２．５ｇ １％レサズリン０．００１ｇ。

【００４９】培養後の菌体を遠心分離（２０００×ｇ，
５分間）した後、その菌体をグルコース・リゾチーム溶
液〔５０ｍＭグルコース、１０ｍＭ EDTA（エチレンジ
アミン四酢酸二水素二ナトリウム二水和物）、２５ｍＭ
Tris- ＨＣｌ（ｐＨ８．０）［トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン塩酸緩衝液］、４ｍｇ／ｍＬリゾチー
ム〕４ｍＬで懸濁させ、１０％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ溶液８
ｍＬを加え穏やかに混ぜた。その後、Sigma 社製のプロ
テイナーゼＫ１０ｍｇを加え５５°Ｃ、１５分反応した
後、２倍量の９９．５％冷エタノール２４ｍＬを加えて
ＤＮＡを沈殿させ、ＴＥ溶液（１０ｍＭ Tris-ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）、１ｍＭ EDTA 、ｐＨ８．０）６ｍＬに
溶解させた。

【００５０】冷蔵庫で静置後、フェノール抽出〔フェノ
ール-Tris-ＨＣｌ、ｐＨ８．０（０．１％オキシン含
有）〕、クロロホルム抽出〔クロロホルム- イソアミル
アルコール（２４：１）〕し、２倍量の９９．５％冷エ
タノール１２ｍＬを加えて、染色体ＤＮＡをガラス棒で
巻取り、ＴＥ溶液１ｍＬに溶解させた。

【００５１】この染色体ＤＮＡ１００μｇを用いて制限
酵素 EcoＲ１による部分分解を３７°Ｃで行い、GFX PC
R DNA and Gel Band Purification Kit （アマシャムフ
ァルマシアバイオテク製）を用いて１０，０００〜２
０，０００塩基対にあたるＤＮＡ断片を回収した。シャ
ロミド（ニッポンジーン製；アンピシリン耐性）１μｇ
を EcoＲ１にて完全分解し、染色体ＤＮＡの部分分解物
をライゲーションキットver2. （宝酒造製）を用いて連
結させた（以下、この操作をライゲーションと略す
る）。

【００５２】ライゲーションさせた溶液を Gigapack II
I Gold Packaging Extract （Stratagene製）によりフ
ァージにパッケージングさせた。これを大腸菌ＤＨ５α
に感染させることにより、本菌の遺伝子ライブラリーを
作製した。形質転換株は５０μｇ／ｍＬ（終濃度）のア
ンピシリンを含むＬＢ寒天培地（Sigma 社：BROTH EZMi
x ２０．６ｇおよび水１Ｌ（液体培地）、寒天培地の場
合寒天を１．５％となるように添加）で３７°Ｃにて２
０時間培養することにより、アンピシリン耐性を有する
大腸菌として得られた。ライゲーション、パッケージン
グ、大腸菌ＤＨ５αへの感染は、メーカーが推奨する方
法に従った。

【００５３】（実施例２：ＰＣＲ法によるヒドロゲナー
ゼ遺伝子の部分増幅)既知のクロストリジウム属のヒド
ロゲナーゼ遺伝子で高度に保存されているアミノ酸配列
領域をもとに、２種のプライマーを合成し、実施例１で
調製した染色体ＤＮＡを鋳型にして、ＰＣＲ法によりヒ
ドロゲナーゼ遺伝子の高度に保存されているアミノ酸配
列領域を一部増幅させた。上記の２種のプライマーはそ
れぞれ、hyd-forward : 5'-TTYGGNGCNGAYATGACNATHATGG
ARGA-3' （配列表の配列番号２に示す）と、hyd-revers
e : 5'-CANCCNCCNKGRCANGCCATNACYTC-3' （配列表の配
列番号３に示す）である。これらはいずれもミックスプ
ライマーである。

【００５４】ＰＣＲは、LA PCR Kit ver.2.1を用い、９
４°Ｃで６０秒を１サイクル、９４°Ｃで３０秒、４０
°Ｃで３０秒、７２°Ｃで１８０秒を３０サイクル、７
２°Ｃで１０分を１サイクルで行った。反応液の組成
は、鋳型ＤＮＡ１μＬ、hyd-forward ５μＬ、hyd-reve
rse ５μＬ、dNTP Mixture５μＬ、10xLA PCR bufferII
（Ｍｇ^２＋plus）５μＬ、全量５０μＬになるように滅
菌水を加えた。

【００５５】得られたＰＣＲ産物の長さは約７００塩基
対であり、これをpT7Blue (R) （Novagen 社；アンピシ
リン耐性）にライゲーションした。この溶液を用いて大
腸菌XL1-Blue （TOYOBO）を常法に従い形質転換させ、
５０μｇ／ｍＬ（終濃度）のアンピシリンを含むＬＢ寒
天培地でコロニーを形成したものを選択し、QIAprepSpi
n Miniprep Kit （QIAGEN社製）を用いてプラスミドを
抽出した。

【００５６】得られたプラスミドをアガロース電気泳動
法により分離して、先の約７００塩基対のＰＣＲ産物が
pT7Blue (R) に挿入されたプラスミドを保有する菌株を
得た。これをpHYD-pcrとした。このプラスミドの塩基配
列をLI-COR社のＤＮＡシークエンサーモデル４０００Ｌ
を用いて解析した結果、既知のクロストリジウム属のヒ
ドロゲナーゼ遺伝子と相同性が見られた。塩基配列の決
定に用いたシークエンス反応は、Thermo sequence cycl
e sequencing kit（USB 社製）を用いた。

【００５７】（実施例３：完全なヒドロゲナーゼ遺伝子
のクローニング）実施例２で用いたプライマーを用い
て、７００塩基対からなるDIG ラベルされたＤＮＡプロ
ーブを作製した（ロシュ・ダイアグノスティックス社、
DIG DNA labeling kitを使用）。実施例１で作製した遺
伝子ライブラリーから、コロニーハイブリダイゼーショ
ン法を用いて完全なヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ
断片を保持するクローンを得た。コロニーハイブリダイ
ゼーション法は、以下のようである。

【００５８】実施例１で作製した遺伝子ライブラリー
（プラスミドを保持した大腸菌）を５０μｇ／ｍＬ（終
濃度）のアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上に生育さ
せ、これをナイロン膜（アマシャム ファルマシア バ
イオテク社；ハイボンド−Ｎ＋）に写し取り、アルカリ
処理によりＤＮＡを膜に固定化させた。この後のハイブ
リダイゼーション、検出の操作は、Molecularcloning
に記載されているサザンハイブリダイゼーション法と同
様に行った。DIG detection kit （ロシュ・ダイアグノ
スティックス社）を用いてＭ株の遺伝子ライブラリーの
中から前記プローブと相同性を有するものを選択した。
これを５０μｇ／ｍＬ（終濃度）のアンピシリンを含む
ＬＢ培地で２０時間培養しQTAprep Spin Miniprep Kit
（QIAGEN社）を用いてプラスミドを抽出した。このpHYD
101 とした。図１に、ヒドロゲナーゼ遺伝子の制限酵素
地図を示す。

【００５９】（実施例４：ヒドロゲナーゼ遺伝子および
調節遺伝子領域の同定）pHYD101 のプラスミドの塩基配
列を、 L1-COR 社のＤＮＡシークエンサーモデル4000L
を用いて解析した。シークエンス反応は、Thermo seque
nase cycle sequencing kit （USB社）を用いた。この
結果、挿入断片約１０，０００塩基対中のSpeI、XbaI断
片、2347塩基対に新規なヒドロゲナーゼ遺伝子および調
節遺伝子が存在することが同定された。本発明の調節遺
伝子は、大腸菌の -35領域、及び-10領域とコンセンサ
スな領域をコンピュータ検索等で検索することで推定可
能であり、通常は開始コドンの上流５００塩基対内に存
在することから、本発明の調節遺伝子は配列表の配列番
号１における塩基番号１〜４６５に存在すると考えられ
る。

【００６０】新規なヒドロゲナーゼ遺伝子は、１７４９
塩基対からなり、アミノ酸５８２をコードし、推定分子
量６４，５６０であった。このヒドロゲナーゼ遺伝子と
コードされるヒドロゲナーゼとの配列を、配列表の配列
番号１に示す。

【００６１】（実施例５：ヒドロゲナーゼ遺伝子含有プ
ラスミドの構築）シャトルベクターを用いて、ヒドロゲ
ナーゼ遺伝子含有プラスミドを以下のように構築した。

【００６２】プラスミドを構築するために、大腸菌とC.
perfringens のシャトルベクターであるpJIR751 を用
いた。具体的には、pJIR751 をXbaI（TAKARA）による制
限酵素消化し、アルカリフォスファターゼ（TAKARA）処
理を施したＤＮＡ断片と、ヒドロゲナーゼ遺伝子および
調節遺伝子領域を含むSpeI、XbaI断片を混合し、ライゲ
ーション、形質転換を行った。

【００６３】形質転換体は、５０μｇ／ｍＬ（終濃度）
のアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（Sigma 社；BROTH
EZMix ２０．６ｇおよび水１Ｌ（液体培地）、寒天培地
の場合寒天を１．５％となるように添加）で３７°Ｃに
て２０時間培養することにより、アンピシリン耐性を有
する大腸菌として得られた。得られたプラスミドをpJIR
751-hyd とした。以上のプロセスを図２に示す。

【００６４】（実施例６：Ｍ株へのヒドロゲナーゼ遺伝
子の導入）前記Ｍ株を、１％Ｎ−アセチルグルコサミン
を炭素源とするＧＳ改変培地（５ｍＬ）で培養した。Ｏ
Ｄ_６００ は０．４〜１．０の範囲で可能であるが、
０．６〜０．８の範囲が望ましい。以下の操作は嫌気ボ
ックス内で行った。５分間遠心してＭ株の菌体を集め
た。氷で冷却しておいたETB 溶液（２７２ｍＭスクロー
ス、１％Resazurin 、窒素で脱気済）で菌体を２回洗浄
した後、菌体を、９５μＬのETB 溶液に再懸濁した。

【００６５】この懸濁液にプラスミドＤＮＡの量を変え
て加え、氷上で２分間放置した。プラスミドpJIR751-hy
d と菌の混合液を、冷やしておいた幅０．１ｃｍのジー
ンパルサー用のキュベット（Bio-Rad ）に移し、４００
Ω、０．５ｋＶ、２５μＦでエレクトロポレーションを
行った。その後、直ぐにＧＳ改変培地１ｍＬを加えた。
これをマイクロチューブに移し、３７°Ｃで１時間イン
キュベーションした。その間に、１％の寒天を含むＧＳ
改変培地２０ｍＬに、エリスロマイシンを終濃度１０μ
ｇ／ｍＬとなるように加え、プレートに分注し、冷やし
固めた。

【００６６】上記のインキュベーションが終わった菌と
プラスミドの混合液を、０．５％の寒天を含むＧＳ改変
培地１０ｍＬと混ぜ、１％の寒天培地の上に重層した。
このプレートを３７°Ｃで培養し、コロニーを形成させ
ることでプラスミドを保持した組換え体が得られた。

【００６７】（実施例７：ヒドロゲナーゼ遺伝子を導入
した組換え体の評価）実施例６で得られた組換え体を、
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを炭素源として調製し
たＧＳ改変培地で培養し、発生する水素ガスの量を測定
した。Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンはエビ殻やカニ
殻に豊富に含まれる多糖類である。又、前記Ｍ株の非形
質転換体（ヒドロゲナーゼ遺伝子の導入操作を行ってい
ないＭ株）についても、同じ条件で培養し、発生する水
素ガスの量を測定した。

【００６８】培養は丸菱バイオエンジニアリング（株）
の卓上型培養装置タイプMDL1.0L （ジャーファーメンタ
ー）を用い、条件は４５°Ｃ、培地容量５００ｍＬ、撹
拌速度２５０ｒｐｍ、ｐＨ５．８にアルカリ剤を用いて
調整しながら行った。ガス発生量は株式会社シナガワ製
の湿式ガスメーター（W-NK Da-0.5A）で測定した。

【００６９】この結果、非形質転換体は総水素ガス発生
量が培養液１Ｌ当たり２．０Ｌであったのに対して、ヒ
ドロゲナーゼ組換え体は総水素ガス発生量が培養液１Ｌ
当たり３．０〜３．５Ｌであり、約１．５〜１．８倍の
量が生産された。前者のデータを図３（ａ）に示し、後
者のデータを図３（ｂ）に示す。

【００７０】以上のように、本発明に係るヒドロゲナー
ゼ遺伝子を導入した組換え体によって、より効率的に水
素ガスを生産させることができる。

【配列表】 ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ <110> Japan Science and Technology Corporation <110> Mie University <120> 遺伝子導入法及び組換え体 <130> POK-01-013 <160> 3 <210> 1 <211> 2347 <212> DNA <213> Clostridium paraputrificum <400> 1 actagtttct tttttataat taattctgta aggcttttac caataggcga ttcataacac 60 cactttatat attttgatcc agctactttt tctatctcat aagaatcttt ttttctatca 120 taaattttta tcatatatta cctcgcacaa atattaaaat attctattct aaattaaagt 180 ttaccacata gttttattgt aaacaaaatt tataatccta ttaaataaag aaaaatgaag 240 ttatttataa aattcaatta tattattatg aaaattttac ttaaacaaca ttgggtttaa 300 ttcacattga actaaatctt ttttagcgtt aaaataaagg tgataagcag tttgataaaa 360 atttaacgaa ttatctgaaa attataggtt tttcaaattt atatggtaaa ctataggaag 420 aaaatagaat ttttatttac aagaagaaat ttatggaggt acagg 465 atg aag aat atc ata att aat gat aag gtg tgc aaa gca gcg gaa ggt 513 Met Lys Asn Ile Ile Ile Asn Asp Lys Val Cys Lys Ala Ala Glu Gly 5 10 15 aaa aca gtg tta gaa gtt gcc aga gaa aat gga att gac ata cct act 561 Lys Thr Val Leu Glu Val Ala Arg Glu Asn Gly Ile Asp Ile Pro Thr 20 25 30 tta tgc tac tta aag gaa tgc ggt aat gtt ggt aaa tgt ggt gta tgc 609 Leu Cys Tyr Leu Lys Glu Cys Gly Asn Val Gly Lys Cys Gly Val Cys 35 40 45 gca gtt gaa ata gaa ggg aaa aac aat tta gct ttg gct tgt tta aca 657 Ala Val Glu Ile Glu Gly Lys Asn Asn Leu Ala Leu Ala Cys Leu Thr 50 55 60 aaa gtt gaa gat gga atg gtt gta aga act gat aca gaa aaa gtt caa 705 Lys Val Glu Asp Gly Met Val Val Arg Thr Asp Thr Glu Lys Val Gln 65 70 75 80 gaa aga gta aaa tca aga gtt tca aca ata ctt aat aag cat gaa ttt 753 Glu Arg Val Lys Ser Arg Val Ser Thr Ile Leu Asn Lys His Glu Phe 85 90 95 aag tgc ggt cct tgc cct aga aga gaa aat tgt gaa ttg tta aag tta 801 Lys Cys Gly Pro Cys Pro Arg Arg Glu Asn Cys Glu Leu Leu Lys Leu 100 105 110 gtt ata aaa act aaa gct aaa gca act act cct ttt gtt gta gaa aat 849 Val Ile Lys Thr Lys Ala Lys Ala Thr Thr Pro Phe Val Val Glu Asn 115 120 125 aaa gaa gag tat gtt gat att aga agt aag tct ata aca ata gat aga 897 Lys Glu Glu Tyr Val Asp Ile Arg Ser Lys Ser Ile Thr Ile Asp Arg 130 135 140 tca aaa tgt att tta tgt gga aga tgt gca gca gca tgt act gaa aaa 945 Ser Lys Cys Ile Leu Cys Gly Arg Cys Ala Ala Ala Cys Thr Glu Lys 145 150 155 160 aca ggt aca agt tct att aaa tta gta aat gtt aat ggt aaa aga ata 993 Thr Gly Thr Ser Ser Ile Lys Leu Val Asn Val Asn Gly Lys Arg Ile 165 170 175 gtt act cca gaa gaa caa aaa tgt ttt gat gaa aca aat tgt tta tta 1041 Val Thr Pro Glu Glu Gln Lys Cys Phe Asp Glu Thr Asn Cys Leu Leu 180 185 190 tgt gga caa tgt gta gct gct tgt cca gtt ggt gct tta tca gaa aaa 1089 Cys Gly Gln Cys Val Ala Ala Cys Pro Val Gly Ala Leu Ser Glu Lys 195 200 205 act cat att gat aga gta aaa gaa gct tta gaa gac cca gaa aag cat 1137 Thr His Ile Asp Arg Val Lys Glu Ala Leu Glu Asp Pro Glu Lys His 210 215 220 gta ata gta gct atg gct cca gct gta aga aca gca atg gga gaa cta 1185 Val Ile Val Ala Met Ala Pro Ala Val Arg Thr Ala Met Gly Glu Leu 225 230 235 240 ttt aat atg ggt tat gga gta gat gta act ggt aaa tta tat act gca 1233 Phe Asn Met Gly Tyr Gly Val Asp Val Thr Gly Lys Leu Tyr Thr Ala 245 250 255 tta aga gaa tta gga ttt gat aga ata ttt gat ata aat ttt ggt gcc 1281 Leu Arg Glu Leu Gly Phe Asp Arg Ile Phe Asp Ile Asn Phe Gly Ala 260 265 270 gat atg act att atg gaa gaa gct act gaa ctt tta gaa aga ata gag 1329 Asp Met Thr Ile Met Glu Glu Ala Thr Glu Leu Leu Glu Arg Ile Glu 275 280 285 aaa aaa ggc cca ttc cct atg ttt aca tca tgt tgt cca ggt tgg gtg 1377 Lys Lys Gly Pro Phe Pro Met Phe Thr Ser Cys Cys Pro Gly Trp Val 290 295 300 aga caa gtt gaa aat tat tat cca gag tta tta gaa aat tta tct tct 1425 Arg Gln Val Glu Asn Tyr Tyr Pro Glu Leu Leu Glu Asn Leu Ser Ser 305 310 315 320 gct aag tca cct caa caa att ttt ggt aca gca agt aag aca tac tat 1473 Ala Lys Ser Pro Gln Gln Ile Phe Gly Thr Ala Ser Lys Thr Tyr Tyr 325 330 335 cct cat ata gct gga ata gat cca gaa aag ata ttt aca gta aca att 1521 Pro His Ile Ala Gly Ile Asp Pro Glu Lys Ile Phe Thr Val Thr Ile 340 345 350 atg cca tgt aca gct aag aag ttt gaa gca gat agg gaa gac atg gaa 1569 Met Pro Cys Thr Ala Lys Lys Phe Glu Ala Asp Arg Glu Asp Met Glu 355 360 365 ctt gat gga tta aga aat ata gat gca gtt tta act aca aga gag tta 1617 Leu Asp Gly Leu Arg Asn Ile Asp Ala Val Leu Thr Thr Arg Glu Leu 370 375 380 gct aaa ttt ata aag gaa aag aaa att gct ttt gct aag cta gaa gat 1665 Ala Lys Phe Ile Lys Glu Lys Lys Ile Ala Phe Ala Lys Leu Glu Asp 385 390 395 400 agc gag gct gat cct gca atg gga gaa tat act ggg gca gga gtt ata 1713 Ser Glu Ala Asp Pro Ala Met Gly Glu Tyr Thr Gly Ala Gly Val Ile 405 410 415 ttt gga gct act ggt gga gta atg gaa gca gct ata aga act gca aaa 1761 Phe Gly Ala Thr Gly Gly Val Met Glu Ala Ala Ile Arg Thr Ala Lys 420 425 430 gaa ttt gtt gaa aag aaa gaa cta gaa aac tta gat tat aca gaa gta 1809 Glu Phe Val Glu Lys Lys Glu Leu Glu Asn Leu Asp Tyr Thr Glu Val 435 440 445 aga ggg tta aat gga att aaa gaa gct tct gta aat ata ggt gga gaa 1857 Arg Gly Leu Asn Gly Ile Lys Glu Ala Ser Val Asn Ile Gly Gly Glu 450 455 460 gac tat aat gtt gca gta att aat gga tct gct aac tta ttt gaa ttc 1905 Asp Tyr Asn Val Ala Val Ile Asn Gly Ser Ala Asn Leu Phe Glu Phe 465 470 475 480 att gaa agt gga aga atg aat agt aag gaa tat cac ttt atc gaa gtt 1953 Ile Glu Ser Gly Arg Met Asn Ser Lys Glu Tyr His Phe Ile Glu Val 485 490 495 atg aca tgt cca ggt gga tgt gta aat ggt ggt gga caa cct cat gtt 2001 Met Thr Cys Pro Gly Gly Cys Val Asn Gly Gly Gly Gln Pro His Val 500 505 510 aat aat tta gaa aga gaa aag att gat att aaa tca gta agg gcc tct 2049 Asn Asn Leu Glu Arg Glu Lys Ile Asp Ile Lys Ser Val Arg Ala Ser 515 520 525 gtt ctt tat aat caa gat aag agt gct aaa aag aga aag tca cat gaa 2097 Val Leu Tyr Asn Gln Asp Lys Ser Ala Lys Lys Arg Lys Ser His Glu 530 535 540 aat gtt gct tta atg aaa atg tat gat gaa tat atg gga caa cca ggt 2145 Asn Val Ala Leu Met Lys Met Tyr Asp Glu Tyr Met Gly Gln Pro Gly 545 550 555 560 cgt gga aaa gct cat gaa cta tta cat tac aaa tat aag aaa aaa gaa 2193 Arg Gly Lys Ala His Glu Leu Leu His Tyr Lys Tyr Lys Lys Lys Glu 565 570 575 act tca gaa gaa gtt att 2211 Thr Ser Glu Glu Val Ile*** 580 582 taatataaaa atgtgaactt gaacatacta ttaatgttaa tttgtgaaaa ggagaaatag 2271 ttatgaatag agttcattat gaagtaaata atttagttaa ttcaacaagt aaaacgcagc 2331 ttaagaatgc tctaga 2347 <210> 2 <211> <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 hyd-forward : 5'-TTYGGNGCNGAYATGACNATHATGGARGA-3' <210> 3 <211> <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 hyd-reverse:5'-CANCCNCCNKGRCANGCCAT NACYTC-3'

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係るヒドロゲナーゼ遺伝子の制限酵素
地図である。

【図２】シャトルベクターへのヒドロゲナーゼ遺伝子の
連結を示す図である。

【図３】比較例及び実施例での水素ガス発生量を示すグ
ラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 木村 哲哉 三重県鈴鹿市白子駅前11−18 ロイヤルハ イツ白子駅402 (72)発明者 森本 兼司 三重県津市栗真町屋町1625−39 Ｍハイツ 2103号 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA17 BA08 CA03 CA20 DA05 EA04 FA02 GA14 GA19 GA27 4B050 CC03 DD02 LL05 4B064 AA03 CA02 CA19 CC01 CC03 CC06 CC07 CC12 CD09 CD30 DA16 4B065 AA23X AA23Y AB01 AC14 BA02 BA03 BA25 BB01 BB15 BC02 BC03 BC05 BC09 CA01 CA28 CA54 CA60

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に示す塩基配列における塩基
   番号４６６〜２２１１の塩基配列を有することを特徴と
   する遺伝子。
2. 【請求項２】 配列番号１に示す塩基配列における塩基
   番号４６６〜２２１１の塩基配列と相補的な塩基配列の
   ＤＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブリダ
   イズし、ヒドロゲナーゼ遺伝子として機能し得ることを
   特徴とする遺伝子。
3. 【請求項３】 前記遺伝子の上流に、配列番号１に示す
   塩基配列における塩基番号１〜４６５のプロモータ領域
   を連結したことを特徴とする請求項１又は請求項２に記
   載の遺伝子。
4. 【請求項４】 請求項１又は請求項２に記載の遺伝子に
   よってコードされるアミノ酸配列を有することを特徴と
   するタンパク質。
5. 【請求項５】 配列番号１に示すアミノ酸番号１〜５８
   ２のアミノ酸配列を有することを特徴とするタンパク
   質。
6. 【請求項６】 配列番号１に示すアミノ酸番号１〜５８
   ２のアミノ酸配列において１個〜５個のアミノ酸が置
   換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を有し、ヒドロゲ
   ナーゼ活性を示すことを特徴とするタンパク質。
7. 【請求項７】 請求項１〜請求項３のいずれかに記載の
   遺伝子を宿主に導入したことを特徴とする組み換え体。
8. 【請求項８】 前記宿主が、絶対嫌気性細菌，通性嫌気
   性細菌及び好気性細菌を含む原核細胞、又は真核細胞で
   あることを特徴とする請求項７に記載の組み換え体。
9. 【請求項９】 前記宿主が Clostridium paraputrific
   um Ｍ株（ＦＥＲＭＰ−１６３９０）であることを特徴
   とする請求項７に記載の組み換え体。
10. 【請求項１０】 請求項７〜請求項９のいずれかに記載
    の組み換え体を用いて水素源材料の分解を行い、水素ガ
    スを高効率に得ることを特徴とする水素生産方法。
11. 【請求項１１】 前記水素源材料がキチン質材料又はデ
    ンプン質材料であることを特徴とする請求項１０に記載
    の水素生産方法。