JP2003034696A - 蛍光ヌクレオチド及びそれを用いた標識法 - Google Patents
蛍光ヌクレオチド及びそれを用いた標識法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 核酸の標識のために有用な新規な蛍光ヌクレ
オチドを提供する。 【解決手段】 式：Ｘ−Ｙ−Ｚ［Ｘは天然又は非天然
のヌクレオチドなどの残基を示し、上記残基中の塩基部
分でＹと結合し；Ｙは２価の連結基又は単結合を示し；
Ｚは式（Ｉ）（Ｒ1〜Ｒ4はアルキル基を示し；Ｖ1〜Ｖ6
は水素原子又は置換基を示し；Ｌ1〜Ｌ7はメチン基を示
し；Ｗは酸素原子、硫黄原子、−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ4)−又は−
Ｎ(Ｒ5)−、（Ｒ3〜Ｒ5はアルキル基を示す）を示し；
Ｑは窒素原子又は−Ｃ(Ｖ7)−（Ｖ7は水素原子又は一価
の置換基を示す）を示し；Ｍは対イオンを示し；mは分
子の電荷を中和するのに必要な数を示し；ｓ、ｔ、又は
ｕは０又は１を示す）で表される化合物などから誘導さ
れる１価の基であり、Ｒ1又はＲ2中に存在する反応性基
でＹと結合する］で表される蛍光ヌクレオチド。 【化１】
オチドを提供する。 【解決手段】 式：Ｘ−Ｙ−Ｚ［Ｘは天然又は非天然
のヌクレオチドなどの残基を示し、上記残基中の塩基部
分でＹと結合し；Ｙは２価の連結基又は単結合を示し；
Ｚは式（Ｉ）（Ｒ1〜Ｒ4はアルキル基を示し；Ｖ1〜Ｖ6
は水素原子又は置換基を示し；Ｌ1〜Ｌ7はメチン基を示
し；Ｗは酸素原子、硫黄原子、−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ4)−又は−
Ｎ(Ｒ5)−、（Ｒ3〜Ｒ5はアルキル基を示す）を示し；
Ｑは窒素原子又は−Ｃ(Ｖ7)−（Ｖ7は水素原子又は一価
の置換基を示す）を示し；Ｍは対イオンを示し；mは分
子の電荷を中和するのに必要な数を示し；ｓ、ｔ、又は
ｕは０又は１を示す）で表される化合物などから誘導さ
れる１価の基であり、Ｒ1又はＲ2中に存在する反応性基
でＹと結合する］で表される蛍光ヌクレオチド。 【化１】
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、蛍光標識試薬とし
て有用なアザメチン化合物及びそれを含む蛍光ヌクレオ
チド並びにその利用に関するものである。
て有用なアザメチン化合物及びそれを含む蛍光ヌクレオ
チド並びにその利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】相同核酸配列の検出のために最も多く用
いられる分子生物学的方法の１つはＤＮＡ／ＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成であ
る。この方法ではプローブとして用いる核酸（ＤＮＡ又
はＲＮＡ）を標識し、この標識された核酸を検出すべき
核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）とハイブリダイゼーションさ
せる。プローブとして用いた核酸と検出すべき核酸の間
に相同性が存在する場合、それぞれの相補的な１本鎖の
核酸がハイブリダイゼーションし、２本鎖が形成され、
その２本鎖をプローブの標識により検出する。
いられる分子生物学的方法の１つはＤＮＡ／ＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成であ
る。この方法ではプローブとして用いる核酸（ＤＮＡ又
はＲＮＡ）を標識し、この標識された核酸を検出すべき
核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）とハイブリダイゼーションさ
せる。プローブとして用いた核酸と検出すべき核酸の間
に相同性が存在する場合、それぞれの相補的な１本鎖の
核酸がハイブリダイゼーションし、２本鎖が形成され、
その２本鎖をプローブの標識により検出する。
【０００３】従来より核酸をプローブとして用いる場
合、ラジオアイソトープでプローブを標識する方法が用
いられ、プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーショ
ンの有無はオートラジオグラフィーにより検出されてい
た。遺伝子プローブを標識する際にラジオアイソトープ
を利用する方法は特に感度が高い点で優れているが、ラ
ジオアイソトープの取り扱いに付随して実験室の安全性
の確保及び放射性化合物の廃棄の問題という繁雑さが存
在していた。また、ラジオアイソトープは半減期を有す
るため、一定期間しか用いることができないという問題
点もあった。
合、ラジオアイソトープでプローブを標識する方法が用
いられ、プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーショ
ンの有無はオートラジオグラフィーにより検出されてい
た。遺伝子プローブを標識する際にラジオアイソトープ
を利用する方法は特に感度が高い点で優れているが、ラ
ジオアイソトープの取り扱いに付随して実験室の安全性
の確保及び放射性化合物の廃棄の問題という繁雑さが存
在していた。また、ラジオアイソトープは半減期を有す
るため、一定期間しか用いることができないという問題
点もあった。
【０００４】上記理由から、より簡便な方法として非放
射性標識法が開発されてきており、例えば、遺伝子プロ
ーブをビオチン分子（欧州特許第６３８７９号明細書）
又はジゴキシゲニン分子（欧州特許公開第３２４４７４
Ａ１号）を用いて標識する方法が知られている。標識核
酸プローブと検出すべき核酸配列とのハイブリダイゼー
ションを行った後、形成された２本鎖核酸の中にはビオ
チン分子又はジゴキシゲニン分子が存在する。ハイブリ
ダイゼーション後、これらに対して（ストレプト）アビ
ジン−マーカー酵素複合体又はジゴキシゲニンへの抗ジ
ゴキシゲニン抗体−マーカー酵素複合体を結合すること
によって、プローブがハイブリダイゼーションした核酸
を検出することができる。しかしながら、このような酵
素を用いた検出法は、感度や特異性の面で十分なもので
はなかった。
射性標識法が開発されてきており、例えば、遺伝子プロ
ーブをビオチン分子（欧州特許第６３８７９号明細書）
又はジゴキシゲニン分子（欧州特許公開第３２４４７４
Ａ１号）を用いて標識する方法が知られている。標識核
酸プローブと検出すべき核酸配列とのハイブリダイゼー
ションを行った後、形成された２本鎖核酸の中にはビオ
チン分子又はジゴキシゲニン分子が存在する。ハイブリ
ダイゼーション後、これらに対して（ストレプト）アビ
ジン−マーカー酵素複合体又はジゴキシゲニンへの抗ジ
ゴキシゲニン抗体−マーカー酵素複合体を結合すること
によって、プローブがハイブリダイゼーションした核酸
を検出することができる。しかしながら、このような酵
素を用いた検出法は、感度や特異性の面で十分なもので
はなかった。
【０００５】また、上記方法以外にも、蛍光色素で標的
物質を標識する方法が種々研究されている。蛍光標識試
薬に求められる性能としては、（１）高い蛍光量子収率
を有すること、（２）高い分子吸光係数を有すること、
（３）水溶性で、かつ水性溶媒中で凝集して自己消光を
起こさないこと、（４）加水分解を受けにくいこと、
（５）光分解が起こりにくいこと、（６）バックグラウ
ンド蛍光の影響を受けにくいこと、（７）標的物質と共
有結合を生じさせる反応性置換基が導入されていること
などが挙げられる。蛍光標識試薬として古くから知られ
ているフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴ
Ｃ）、ローダミンイソチオシアネートは高い蛍光量子収
率を有するものの、分子吸光係数が低く、また励起及び
発光波長が５００ｎｍ−６００ｎｍであるため、例えば
ブロッティングに用いるメンブレンのバックグラウンド
蛍光の影響を受けやすいという欠点がある。
物質を標識する方法が種々研究されている。蛍光標識試
薬に求められる性能としては、（１）高い蛍光量子収率
を有すること、（２）高い分子吸光係数を有すること、
（３）水溶性で、かつ水性溶媒中で凝集して自己消光を
起こさないこと、（４）加水分解を受けにくいこと、
（５）光分解が起こりにくいこと、（６）バックグラウ
ンド蛍光の影響を受けにくいこと、（７）標的物質と共
有結合を生じさせる反応性置換基が導入されていること
などが挙げられる。蛍光標識試薬として古くから知られ
ているフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴ
Ｃ）、ローダミンイソチオシアネートは高い蛍光量子収
率を有するものの、分子吸光係数が低く、また励起及び
発光波長が５００ｎｍ−６００ｎｍであるため、例えば
ブロッティングに用いるメンブレンのバックグラウンド
蛍光の影響を受けやすいという欠点がある。
【０００６】分子吸光係数の高い色素としては、例えば
米国特許第５４８６６１６号明細書、特開平２−１９１
６７４号公報、同５−２８７２０９号公報、同５−２８
７２６６号公報、同８−４７４００号公報、同９−１２
７１１５号公報、同７−１４５１４８号公報、同６−２
２２０５９号公報に記載されたシアニン色素、Journalo
f Fluorescence, 5, 231ページ（1995年）に記載された
バルビツール酸オキソノール等のポリメチン色素が知ら
れているが、これらは水に溶けにくく、また溶解しても
加水分解が生じる等の問題がある。また、色素同士の分
子間相互作用が強いために水性媒体中で凝集体を生じ、
そのため蛍光の自己消光が観測される場合が多い。ま
た、特開平２−１９１６７４号公報等に記載されている
シアニン色素は比較的安定な発色団にスルホン酸基を導
入することで水溶性を付与し、かつ凝集体の形成を抑制
した優れた色素であるが、蛍光量子収率が充分に高いと
は言えず、またスルホン酸基の導入により色素の合成が
困難になるという問題点があった。このような状況か
ら、蛍光が強い特性に加えて、水溶性が高く安定で凝集
による蛍光消光が起こらない蛍光色素の開発が求められ
ていた。
米国特許第５４８６６１６号明細書、特開平２−１９１
６７４号公報、同５−２８７２０９号公報、同５−２８
７２６６号公報、同８−４７４００号公報、同９−１２
７１１５号公報、同７−１４５１４８号公報、同６−２
２２０５９号公報に記載されたシアニン色素、Journalo
f Fluorescence, 5, 231ページ（1995年）に記載された
バルビツール酸オキソノール等のポリメチン色素が知ら
れているが、これらは水に溶けにくく、また溶解しても
加水分解が生じる等の問題がある。また、色素同士の分
子間相互作用が強いために水性媒体中で凝集体を生じ、
そのため蛍光の自己消光が観測される場合が多い。ま
た、特開平２−１９１６７４号公報等に記載されている
シアニン色素は比較的安定な発色団にスルホン酸基を導
入することで水溶性を付与し、かつ凝集体の形成を抑制
した優れた色素であるが、蛍光量子収率が充分に高いと
は言えず、またスルホン酸基の導入により色素の合成が
困難になるという問題点があった。このような状況か
ら、蛍光が強い特性に加えて、水溶性が高く安定で凝集
による蛍光消光が起こらない蛍光色素の開発が求められ
ていた。
【０００７】蛍光が強いその他の色素骨格として、英国
特許第８７０，７５３号明細書に記載されたアザインド
レニンシアニン色素の例があるが、該特許には水溶性、
凝集性、水溶液安定性等、蛍光標識試薬に必須の特性に
関する記載が無く、さらには標的物質と共有結合を生じ
させる反応性置換基を導入した例も記載されていないこ
とから、このアザインドレニンシアニン色素の蛍光標識
試薬としての適性は全く未知であった。また、特開平４
−３５８１４３号公報、同３−１３５５５３号公報、同
１−２８０７５０号公報、欧州特許第３４１９５８号公
報には、アザインドレニンシアニンを写真用途に適用し
た例が示されているが、これらはアザインドレニンシア
ニンの吸収特性を利用したものであり、発光特性に着目
してそれらを積極的に利用したものではなかった。
特許第８７０，７５３号明細書に記載されたアザインド
レニンシアニン色素の例があるが、該特許には水溶性、
凝集性、水溶液安定性等、蛍光標識試薬に必須の特性に
関する記載が無く、さらには標的物質と共有結合を生じ
させる反応性置換基を導入した例も記載されていないこ
とから、このアザインドレニンシアニン色素の蛍光標識
試薬としての適性は全く未知であった。また、特開平４
−３５８１４３号公報、同３−１３５５５３号公報、同
１−２８０７５０号公報、欧州特許第３４１９５８号公
報には、アザインドレニンシアニンを写真用途に適用し
た例が示されているが、これらはアザインドレニンシア
ニンの吸収特性を利用したものであり、発光特性に着目
してそれらを積極的に利用したものではなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するため
の手段】本発明の課題は、核酸の標識のために有用な新
規な蛍光ヌクレオチドを提供することにあり、より具体
的には、上記の従来技術の問題点を回避可能な蛍光ヌク
レオチドを提供することを課題としている。本発明者ら
は上記の課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、
蛍光標識試薬として最近開発されたアザアメチン化合物
を用いてヌクレオチドとの複合体を形成し、その複合体
を用いて核酸を標識及び検出すると、核酸への取り込み
率及び検出の際の蛍光強度が優れていることを見出し、
本発明を完成するに至った。
の手段】本発明の課題は、核酸の標識のために有用な新
規な蛍光ヌクレオチドを提供することにあり、より具体
的には、上記の従来技術の問題点を回避可能な蛍光ヌク
レオチドを提供することを課題としている。本発明者ら
は上記の課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、
蛍光標識試薬として最近開発されたアザアメチン化合物
を用いてヌクレオチドとの複合体を形成し、その複合体
を用いて核酸を標識及び検出すると、核酸への取り込み
率及び検出の際の蛍光強度が優れていることを見出し、
本発明を完成するに至った。
【０００９】すなわち、本発明は、式：Ｘ−Ｙ−Ｚ
［式中、Ｘは天然又は非天然のヌクレオチド、オリゴヌ
クレオチド又はポリヌクレオチドあるいはそれらの誘導
体の残基を示し、上記残基中の塩基部分でＹと結合し；
Ｙは２価の連結基又は単結合を示し；Ｚは下記の一般式
（Ｉ）：
クレオチド又はポリヌクレオチドあるいはそれらの誘導
体の残基を示し、上記残基中の塩基部分でＹと結合し；
Ｙは２価の連結基又は単結合を示し；Ｚは下記の一般式
（Ｉ）：
【化４】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ4はそれぞれ独立に置換
もしくは無置換のアルキル基を示し、Ｒ3及びＲ4は互い
に連結して飽和又は不飽和の環を形成してもよく；
Ｖ1、Ｖ2、Ｖ3、Ｖ4、Ｖ5、及びＶ6は水素原子又は置換
基を示し、Ｖ1とＶ2、Ｖ2とＶ3、Ｖ4とＶ5、及び／又は
Ｖ5とＶ6は互いに連結して飽和又は不飽和の環を形成し
てもよく；Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ6、及びＬ7は
それぞれ独立に置換又は無置換のメチン基を示し；Ｗは
酸素原子、硫黄原子、−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ4)−又は−Ｎ(Ｒ5)
−、（Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5はそれぞれ独立に置換若しく
は無置換のアルキル基を示す）を示し；Ｑは窒素原子又
は−Ｃ(Ｖ7)−（Ｖ7は水素原子又は一価の置換基を示
し、Ｖ6と互いに連結して飽和又は不飽和の環を形成し
てもよい）を示し；Ｍは対イオンを示し；mは分子の電
荷を中和するのに必要な数を示し；ｓは０又は１を示
し；ｔは０又は１を示し；ｕは０又は１を示す）で表さ
れる化合物；下記の一般式（II）：
もしくは無置換のアルキル基を示し、Ｒ3及びＲ4は互い
に連結して飽和又は不飽和の環を形成してもよく；
Ｖ1、Ｖ2、Ｖ3、Ｖ4、Ｖ5、及びＶ6は水素原子又は置換
基を示し、Ｖ1とＶ2、Ｖ2とＶ3、Ｖ4とＶ5、及び／又は
Ｖ5とＶ6は互いに連結して飽和又は不飽和の環を形成し
てもよく；Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ6、及びＬ7は
それぞれ独立に置換又は無置換のメチン基を示し；Ｗは
酸素原子、硫黄原子、−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ4)−又は−Ｎ(Ｒ5)
−、（Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5はそれぞれ独立に置換若しく
は無置換のアルキル基を示す）を示し；Ｑは窒素原子又
は−Ｃ(Ｖ7)−（Ｖ7は水素原子又は一価の置換基を示
し、Ｖ6と互いに連結して飽和又は不飽和の環を形成し
てもよい）を示し；Ｍは対イオンを示し；mは分子の電
荷を中和するのに必要な数を示し；ｓは０又は１を示
し；ｔは０又は１を示し；ｕは０又は１を示す）で表さ
れる化合物；下記の一般式（II）：
【化５】
（式中、 Ｖ1、Ｖ2、Ｖ3、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｌ1、
Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ6、Ｌ7、Ｗ、Ｍ、ｍ、ｓ、ｔ、
及びｕは上記定義と同義であり；Ｖ8は水素原子又は一
価の置換基を示すが、Ｗが−Ｎ(Ｒ5)−又は−Ｃ(Ｒ3)
(Ｒ4)−の場合にはＶ8はＷ上の置換基と連結して飽和又
は不飽和の環を形成してもよい）で表される化合物；又
は下記の一般式（III）：
Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ6、Ｌ7、Ｗ、Ｍ、ｍ、ｓ、ｔ、
及びｕは上記定義と同義であり；Ｖ8は水素原子又は一
価の置換基を示すが、Ｗが−Ｎ(Ｒ5)−又は−Ｃ(Ｒ3)
(Ｒ4)−の場合にはＶ8はＷ上の置換基と連結して飽和又
は不飽和の環を形成してもよい）で表される化合物；又
は下記の一般式（III）：
【化６】
（式中、 Ｖ1、Ｖ2、Ｖ3、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｌ1、
Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ6、Ｌ7、Ｗ、Ｍ、ｍ、ｓ、ｔ、
及びｕは上記定義と同義であり；Ｅは窒素原子又は−Ｃ
(Ｒ6)＝（Ｒ6は水素原子又は一価の置換基を示す）を示
し；Ｖ9は水素原子又は一価の置換基を示すが、Ｖ9はＲ
6と連結して飽和又は不飽和の環を形成してもよい）で
表される化合物から誘導される１価の基であり、Ｒ1又
はＲ2中に存在する反応性基でＹと結合する］で表され
る蛍光ヌクレオチドを提供するものである。
Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ6、Ｌ7、Ｗ、Ｍ、ｍ、ｓ、ｔ、
及びｕは上記定義と同義であり；Ｅは窒素原子又は−Ｃ
(Ｒ6)＝（Ｒ6は水素原子又は一価の置換基を示す）を示
し；Ｖ9は水素原子又は一価の置換基を示すが、Ｖ9はＲ
6と連結して飽和又は不飽和の環を形成してもよい）で
表される化合物から誘導される１価の基であり、Ｒ1又
はＲ2中に存在する反応性基でＹと結合する］で表され
る蛍光ヌクレオチドを提供するものである。
【００１０】本発明の好ましい態様によれば、Ｒ1及び
Ｒ2のうち少なくとも一つがＹ中の活性エステル基（該
活性エステル基はアミノ基、ヒドロキシル基、又はチオ
ール基と共有結合し得る）で置換されたアルキル基であ
る上記の蛍光ヌクレオチド；Ｒ1及びＲ2のうち少なくと
も一つがＹ中のカルボキシル基で置換されたアルキル基
である上記の蛍光ヌクレオチド；及びＸがヌクレオチド
あるいはそれらの誘導体の残基である上記の蛍光ヌクレ
オチドが提供される。
Ｒ2のうち少なくとも一つがＹ中の活性エステル基（該
活性エステル基はアミノ基、ヒドロキシル基、又はチオ
ール基と共有結合し得る）で置換されたアルキル基であ
る上記の蛍光ヌクレオチド；Ｒ1及びＲ2のうち少なくと
も一つがＹ中のカルボキシル基で置換されたアルキル基
である上記の蛍光ヌクレオチド；及びＸがヌクレオチド
あるいはそれらの誘導体の残基である上記の蛍光ヌクレ
オチドが提供される。
【００１１】より好ましい態様によれば、Ｘが
（１）ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＧＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴ
Ｐ、ＣＭＰ、ＣＤＰ、ＣＴＰ、ＵＭＰ、ＵＤＰ ＵＴ
Ｐ、ＴＭＰ、ＴＤＰ、ＴＴＰ、２−Ｍｅ−ＡＭＰ、２−
Ｍｅ−ＡＤＰ、２−Ｍｅ−ＡＴＰ、１−Ｍｅ−ＧＭＰ、
１−Ｍｅ−ＧＤＰ、１−Ｍｅ−ＧＴＰ、５−Ｍｅ−ＣＭ
Ｐ、５−Ｍｅ−ＣＤＰ、５−Ｍｅ−ＣＴＰ、５−ＭｅＯ
−ＣＭＰ、５−ＭｅＯ−ＣＤＰ、５−ＭｅＯ−ＣＴＰ
（Ｍｅはメチル基、ＭｅＯはメトキシ基を示し、Ｍｅ又
はＭｅＯの前の数字は置換位置を示す）からなる群から
選ばれるヌクレオチド、（２）上記の（１）に記載のヌ
クレオチドに対応するデオキシヌクレオチド及びジデオ
キシヌクレオチドからなる群から選ばれるヌクレオチ
ド；及び（３）上記の（１）及び（２）に記載のヌクレ
オチドから誘導されるヌクレオチド誘導体からなる群か
ら選ばれるヌクレオチド又はその誘導体の残基である上
記の蛍光ヌクレオチド；Ｙが−ＣＨ2−、−ＣＨ＝ＣＨ
−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ
−、又はこれらの基の任意の組み合わせからなるなる連
結基（該連結基上の水素原子は他の置換基で置換されて
いてもよい）である上記の蛍光ヌクレオチド；及びＹが
アミノアリル基である上記の蛍光ヌクレオチドが提供さ
れる。
Ｐ、ＣＭＰ、ＣＤＰ、ＣＴＰ、ＵＭＰ、ＵＤＰ ＵＴ
Ｐ、ＴＭＰ、ＴＤＰ、ＴＴＰ、２−Ｍｅ−ＡＭＰ、２−
Ｍｅ−ＡＤＰ、２−Ｍｅ−ＡＴＰ、１−Ｍｅ−ＧＭＰ、
１−Ｍｅ−ＧＤＰ、１−Ｍｅ−ＧＴＰ、５−Ｍｅ−ＣＭ
Ｐ、５−Ｍｅ−ＣＤＰ、５−Ｍｅ−ＣＴＰ、５−ＭｅＯ
−ＣＭＰ、５−ＭｅＯ−ＣＤＰ、５−ＭｅＯ−ＣＴＰ
（Ｍｅはメチル基、ＭｅＯはメトキシ基を示し、Ｍｅ又
はＭｅＯの前の数字は置換位置を示す）からなる群から
選ばれるヌクレオチド、（２）上記の（１）に記載のヌ
クレオチドに対応するデオキシヌクレオチド及びジデオ
キシヌクレオチドからなる群から選ばれるヌクレオチ
ド；及び（３）上記の（１）及び（２）に記載のヌクレ
オチドから誘導されるヌクレオチド誘導体からなる群か
ら選ばれるヌクレオチド又はその誘導体の残基である上
記の蛍光ヌクレオチド；Ｙが−ＣＨ2−、−ＣＨ＝ＣＨ
−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ
−、又はこれらの基の任意の組み合わせからなるなる連
結基（該連結基上の水素原子は他の置換基で置換されて
いてもよい）である上記の蛍光ヌクレオチド；及びＹが
アミノアリル基である上記の蛍光ヌクレオチドが提供さ
れる。
【００１２】別の観点からは、核酸合成酵素、鋳型核
酸、及び上記の蛍光ヌクレオチドを用いて核酸合成反応
を行う工程を含む蛍光標識された核酸の製造方法が本発
明により提供される。この方法の好ましい態様によれ
ば、核酸合成反応が逆転写反応、ターミナルトランスフ
ェラーゼ反応、ランダムプライム法、ＰＣＲ法、及びニ
ックトランスレーション法からなる群から選ばれる１又
は２以上の反応である上記の方法が提供される。
酸、及び上記の蛍光ヌクレオチドを用いて核酸合成反応
を行う工程を含む蛍光標識された核酸の製造方法が本発
明により提供される。この方法の好ましい態様によれ
ば、核酸合成反応が逆転写反応、ターミナルトランスフ
ェラーゼ反応、ランダムプライム法、ＰＣＲ法、及びニ
ックトランスレーション法からなる群から選ばれる１又
は２以上の反応である上記の方法が提供される。
【００１３】さらに別の観点からは、上記の蛍光ヌクレ
オチドで標識された核酸プローブ又はプライマー；上記
の核酸プローブ又はプライマーからなる核酸検出用試
薬；病気の診断に用いるための上記の核酸検出用試薬；
及び核酸検出用キットであって、（１）上記の蛍光ヌク
レオチド、（２）核酸合成酵素、及び（３）緩衝液を含
むキットが提供される。
オチドで標識された核酸プローブ又はプライマー；上記
の核酸プローブ又はプライマーからなる核酸検出用試
薬；病気の診断に用いるための上記の核酸検出用試薬；
及び核酸検出用キットであって、（１）上記の蛍光ヌク
レオチド、（２）核酸合成酵素、及び（３）緩衝液を含
むキットが提供される。
【００１４】また、本発明により、上記の一般式（Ｉ）
で表されるアザメチン色素（好ましくはＷが−Ｃ(Ｒ3)
(Ｒ4)−又は酸素原子である上記アザメチン色素、およ
びＷが−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ4)−であり、Ｙが窒素原子である上
記アザメチン色素）；上記の一般式（II）で表されるア
ザメチン色素（好ましくはＷが−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ4)−又は硫
黄原子である上記アザメチン色素）；及び上記の一般式
（III）で表されるアザメチン色素（好ましくはＷが酸
素原子である上記アザメチン色素）が提供される。ま
た、一般式（Ｉ）、（II）、及び（III）で表されるア
ザメチン色素において、Ｒ1及びＲ2のうち少なくとも一
つが被標識化合物と共有結合し得る反応性基で置換され
たアルキル基であるアザメチン色素；一般式（Ｉ）、
（II）、及び（III）で表されるアザメチン色素におい
て、Ｒ1及びＲ2のうち少なくとも一つが活性エステル基
（該活性エステル基は被標識化合物中のアミノ基、ヒド
ロキシル基又はチオール基と共有結合し得る）で置換さ
れたアルキル基である上記のアザメチン色素；及び、一
般式（Ｉ）、（II）、及び（III）で表されるアザメチ
ン色素において、Ｒ1及びＲ2のうち少なくとも一つがカ
ルボキシル基で置換されたアルキル基である上記のアザ
メチン色素が提供される。
で表されるアザメチン色素（好ましくはＷが−Ｃ(Ｒ3)
(Ｒ4)−又は酸素原子である上記アザメチン色素、およ
びＷが−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ4)−であり、Ｙが窒素原子である上
記アザメチン色素）；上記の一般式（II）で表されるア
ザメチン色素（好ましくはＷが−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ4)−又は硫
黄原子である上記アザメチン色素）；及び上記の一般式
（III）で表されるアザメチン色素（好ましくはＷが酸
素原子である上記アザメチン色素）が提供される。ま
た、一般式（Ｉ）、（II）、及び（III）で表されるア
ザメチン色素において、Ｒ1及びＲ2のうち少なくとも一
つが被標識化合物と共有結合し得る反応性基で置換され
たアルキル基であるアザメチン色素；一般式（Ｉ）、
（II）、及び（III）で表されるアザメチン色素におい
て、Ｒ1及びＲ2のうち少なくとも一つが活性エステル基
（該活性エステル基は被標識化合物中のアミノ基、ヒド
ロキシル基又はチオール基と共有結合し得る）で置換さ
れたアルキル基である上記のアザメチン色素；及び、一
般式（Ｉ）、（II）、及び（III）で表されるアザメチ
ン色素において、Ｒ1及びＲ2のうち少なくとも一つがカ
ルボキシル基で置換されたアルキル基である上記のアザ
メチン色素が提供される。
【００１５】さらに、上記の蛍光ヌクレオチドの製造の
ための上記一般式（Ｉ）、一般式（II）、又は一般式
（III）で表される化合物の使用；上記の核酸プローブ
又はプライマーの製造のための上記一般式（Ｉ）、一般
式（II）、又は一般式（III）で表される化合物の使
用；上記の核酸検出用試薬の製造のための上記一般式
（Ｉ）、一般式（II）、又は一般式（III）で表される
化合物の使用；及び病気の診断方法であって、ヒトを含
む哺乳類動物から採取された生体試料に上記の核酸検出
用試薬を接触させる工程を含む方法が本発明により提供
される。
ための上記一般式（Ｉ）、一般式（II）、又は一般式
（III）で表される化合物の使用；上記の核酸プローブ
又はプライマーの製造のための上記一般式（Ｉ）、一般
式（II）、又は一般式（III）で表される化合物の使
用；上記の核酸検出用試薬の製造のための上記一般式
（Ｉ）、一般式（II）、又は一般式（III）で表される
化合物の使用；及び病気の診断方法であって、ヒトを含
む哺乳類動物から採取された生体試料に上記の核酸検出
用試薬を接触させる工程を含む方法が本発明により提供
される。
【００１６】
【発明の実施の形態】Ｘが示す天然又は非天然のヌクレ
オチドとしては、例えば、（１）ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴ
Ｐ、ＧＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴＰ、ＣＭＰ、ＣＤＰ、ＣＴ
Ｐ、ＵＭＰ、ＵＤＰ ＵＴＰ、ＴＭＰ、ＴＤＰ、ＴＴ
Ｐ、２−Ｍｅ−ＡＭＰ、２−Ｍｅ−ＡＤＰ、２−Ｍｅ−
ＡＴＰ、１−Ｍｅ−ＧＭＰ、１−Ｍｅ−ＧＤＰ、１−Ｍ
ｅ−ＧＴＰ、５−Ｍｅ−ＣＭＰ、５−Ｍｅ−ＣＤＰ、５
−Ｍｅ−ＣＴＰ、５−ＭｅＯ−ＣＭＰ、５−ＭｅＯ−Ｃ
ＤＰ、５−ＭｅＯ−ＣＴＰ（Ｍｅはメチル基、ＭｅＯは
メトキシ基を示し、Ｍｅ又はＭｅＯの前の数字は置換位
置を示す）で表されるヌクレオチド、（２）前記ヌクレ
オチドに対応するデオキシヌクレオチド、及び前記ヌク
レオチドに対応するジデオキシヌクレオチド、並びに
（３）前記（１）及び（２）に記載のヌクレオチドから
さらに誘導される誘導体などを挙げることができるが、
これらに限定されることはない。天然又は非天然のヌク
レオチドの具体例としては、例えば、ＡＴＰ、ＣＴＰ、
ＧＴＰ、ＴＴＰ、ＵＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄ
ｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＵＴＰ、又はこれらの誘導
体などを挙げることができるが、これらに限定されるこ
とはない。
オチドとしては、例えば、（１）ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴ
Ｐ、ＧＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴＰ、ＣＭＰ、ＣＤＰ、ＣＴ
Ｐ、ＵＭＰ、ＵＤＰ ＵＴＰ、ＴＭＰ、ＴＤＰ、ＴＴ
Ｐ、２−Ｍｅ−ＡＭＰ、２−Ｍｅ−ＡＤＰ、２−Ｍｅ−
ＡＴＰ、１−Ｍｅ−ＧＭＰ、１−Ｍｅ−ＧＤＰ、１−Ｍ
ｅ−ＧＴＰ、５−Ｍｅ−ＣＭＰ、５−Ｍｅ−ＣＤＰ、５
−Ｍｅ−ＣＴＰ、５−ＭｅＯ−ＣＭＰ、５−ＭｅＯ−Ｃ
ＤＰ、５−ＭｅＯ−ＣＴＰ（Ｍｅはメチル基、ＭｅＯは
メトキシ基を示し、Ｍｅ又はＭｅＯの前の数字は置換位
置を示す）で表されるヌクレオチド、（２）前記ヌクレ
オチドに対応するデオキシヌクレオチド、及び前記ヌク
レオチドに対応するジデオキシヌクレオチド、並びに
（３）前記（１）及び（２）に記載のヌクレオチドから
さらに誘導される誘導体などを挙げることができるが、
これらに限定されることはない。天然又は非天然のヌク
レオチドの具体例としては、例えば、ＡＴＰ、ＣＴＰ、
ＧＴＰ、ＴＴＰ、ＵＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄ
ｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＵＴＰ、又はこれらの誘導
体などを挙げることができるが、これらに限定されるこ
とはない。
【００１７】オリゴヌクレオチドとしては、例えば、上
記のヌクレオチド又はその誘導体が１から５０個程度、
好ましくは１から３０個程度、さらに好ましくは１から
２０個程度重合したオリゴヌクレオチドを挙げることが
でき、構成単位の各ヌクレオチドは同一でも相違してい
てもよい。ポリヌクレオチドとは、上記ヌクレオチド又
はその誘導体が多数重合した重合体であり、その大きさ
（長さ）は特に限定されないが、例えば塩基数として数
ｂｐから数ｋｂに至るものでもよい。本明細書で用いる
蛍光ヌクレオチドと言う用語は、核酸成分が上記したよ
うなヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレ
オチドである場合の全てを包含し、最も広義に解釈しな
ければならない。
記のヌクレオチド又はその誘導体が１から５０個程度、
好ましくは１から３０個程度、さらに好ましくは１から
２０個程度重合したオリゴヌクレオチドを挙げることが
でき、構成単位の各ヌクレオチドは同一でも相違してい
てもよい。ポリヌクレオチドとは、上記ヌクレオチド又
はその誘導体が多数重合した重合体であり、その大きさ
（長さ）は特に限定されないが、例えば塩基数として数
ｂｐから数ｋｂに至るものでもよい。本明細書で用いる
蛍光ヌクレオチドと言う用語は、核酸成分が上記したよ
うなヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレ
オチドである場合の全てを包含し、最も広義に解釈しな
ければならない。
【００１８】Ｘはヌクレオチド残基中の塩基部分でＹと
結合する。ヌクレオチド残基の塩基部分としては、プリ
ン誘導体とピリミジン誘導体が挙げられる。プリン塩基
中における連結基Ｙとの結合部位は、糖成分と結合する
９位以外であれば特に制限されない。例えば、プリン塩
基がアデニンの場合には２位又は８位で結合することが
でき、あるいは６位に存在するアミノ基で連結基Ｙと結
合することができる。プリン塩基がグアニンの場合には
１位又は８位で結合することができ、あるいは２位に存
在するアミノ基で連結基Ｙと結合することができる。ピ
リミジン塩基中における連結基Ｙとの結合部位は、糖成
分と結合する１位以外であれば特に限定されない。例え
ばピリミジン塩基がシトシンの場合には５位又は６位で
結合することができ、あるいは４位に存在するアミノ基
で連結基Ｙと結合することができ、ピリミジン塩基がチ
ミンの場合には３位又は６位で結合することができ、あ
るいは５位に存在するメチル基で連結基Ｙと結合するこ
とができる。また、ピリミジン塩基がウラシルの場合に
は３位、５位又は６位で連結基Ｙと結合することができ
る。
結合する。ヌクレオチド残基の塩基部分としては、プリ
ン誘導体とピリミジン誘導体が挙げられる。プリン塩基
中における連結基Ｙとの結合部位は、糖成分と結合する
９位以外であれば特に制限されない。例えば、プリン塩
基がアデニンの場合には２位又は８位で結合することが
でき、あるいは６位に存在するアミノ基で連結基Ｙと結
合することができる。プリン塩基がグアニンの場合には
１位又は８位で結合することができ、あるいは２位に存
在するアミノ基で連結基Ｙと結合することができる。ピ
リミジン塩基中における連結基Ｙとの結合部位は、糖成
分と結合する１位以外であれば特に限定されない。例え
ばピリミジン塩基がシトシンの場合には５位又は６位で
結合することができ、あるいは４位に存在するアミノ基
で連結基Ｙと結合することができ、ピリミジン塩基がチ
ミンの場合には３位又は６位で結合することができ、あ
るいは５位に存在するメチル基で連結基Ｙと結合するこ
とができる。また、ピリミジン塩基がウラシルの場合に
は３位、５位又は６位で連結基Ｙと結合することができ
る。
【００１９】上記式中、Ｙは２価の連結基又は単結合を
示す。連結基の種類は、本発明の蛍光ヌクレオチドの性
質、例えば蛍光ヌクレオチドの化合物としての安定性、
水溶性、核酸への取込み率、又は蛍光強度などに大きな
影響をもたらさない限り、特に限定されない。当業者は
Ｘで表されるヌクレオチド部分とＺで表される蛍光化合
物部分とを連結するために適した２価の連結基を適宜選
択することができる。連結基Ｙとしては、例えば、−Ｃ
Ｈ2−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＯ−、−Ｏ
−、−Ｓ−、−ＮＨ−又はこれらの組み合わせからなる
連結基を挙げることができ、これらの連結基上の１個又
は２個以上の水素原子は他の置換基で置換されていても
よい。連結基の主鎖の炭素数は特に限定されないが、一
般的には１から５０、好ましくは１から２０、より好ま
しくは１から１０、特に好ましくは１から５程度であ
る。
示す。連結基の種類は、本発明の蛍光ヌクレオチドの性
質、例えば蛍光ヌクレオチドの化合物としての安定性、
水溶性、核酸への取込み率、又は蛍光強度などに大きな
影響をもたらさない限り、特に限定されない。当業者は
Ｘで表されるヌクレオチド部分とＺで表される蛍光化合
物部分とを連結するために適した２価の連結基を適宜選
択することができる。連結基Ｙとしては、例えば、−Ｃ
Ｈ2−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＯ−、−Ｏ
−、−Ｓ−、−ＮＨ−又はこれらの組み合わせからなる
連結基を挙げることができ、これらの連結基上の１個又
は２個以上の水素原子は他の置換基で置換されていても
よい。連結基の主鎖の炭素数は特に限定されないが、一
般的には１から５０、好ましくは１から２０、より好ま
しくは１から１０、特に好ましくは１から５程度であ
る。
【００２０】Ｚは上記一般式（Ｉ）、一般式（II）、又
は一般式（III）で表されるアザメチン色素から誘導さ
れる１価の基であり、Ｒ1又はＲ2中に存在する反応性基
でＹと結合する。
は一般式（III）で表されるアザメチン色素から誘導さ
れる１価の基であり、Ｒ1又はＲ2中に存在する反応性基
でＹと結合する。
【００２１】一般式（Ｉ）、（II）、及び（III）にお
いて、Ｒ1及びＲ2は互いに同一でも異なっていてもよ
く、好ましくは炭素原子数が１から２０のアルキル基を
示す。アルキル基は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれ
らの組み合わせのいずれでもよい（本明細書において、
他のアルキル基、又はアルキル部分を有する他の置換基
のアルキル部分についても同様である）。例えば、メチ
ル基、エチル基、n−プロピル基、ブチル基、シクロヘ
キシル基などを挙げることができる。上記のアルキル基
は任意の位置に置換基を有していてもよい。アルキル基
上の置換基は特に制限はないが、色素を抗体、タンパ
ク、ペプチド、酵素基質、ホルモン、リンフォカイン、
代謝産物、レセプター、抗原、ハプテン、レクチン、ア
ビジン、ストレプタビジン、トキシン、炭水化物、多糖
類、核酸、デオキシ核酸、誘導核酸、誘導デオキシ核
酸、DNAフラグメント、RNAフラグメント、誘導DNAフラ
グメント、誘導RNAフラグメント、天然薬物、ウイルス
粒子、バクテリア粒子、ウイルス成分、イースト成分、
血液細胞、血液細胞成分、バクテリア、バクテリア成
分、天然から合成脂質、合成薬物、毒薬、環境汚染物
質、重合体、重合体粒子、ガラス粒子、プラスチック粒
子、重合体膜等を含む物質上に共有結合、イオン結合、
水素結合等により標識するための反応性置換基が導入さ
れていることが好ましい。
いて、Ｒ1及びＲ2は互いに同一でも異なっていてもよ
く、好ましくは炭素原子数が１から２０のアルキル基を
示す。アルキル基は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれ
らの組み合わせのいずれでもよい（本明細書において、
他のアルキル基、又はアルキル部分を有する他の置換基
のアルキル部分についても同様である）。例えば、メチ
ル基、エチル基、n−プロピル基、ブチル基、シクロヘ
キシル基などを挙げることができる。上記のアルキル基
は任意の位置に置換基を有していてもよい。アルキル基
上の置換基は特に制限はないが、色素を抗体、タンパ
ク、ペプチド、酵素基質、ホルモン、リンフォカイン、
代謝産物、レセプター、抗原、ハプテン、レクチン、ア
ビジン、ストレプタビジン、トキシン、炭水化物、多糖
類、核酸、デオキシ核酸、誘導核酸、誘導デオキシ核
酸、DNAフラグメント、RNAフラグメント、誘導DNAフラ
グメント、誘導RNAフラグメント、天然薬物、ウイルス
粒子、バクテリア粒子、ウイルス成分、イースト成分、
血液細胞、血液細胞成分、バクテリア、バクテリア成
分、天然から合成脂質、合成薬物、毒薬、環境汚染物
質、重合体、重合体粒子、ガラス粒子、プラスチック粒
子、重合体膜等を含む物質上に共有結合、イオン結合、
水素結合等により標識するための反応性置換基が導入さ
れていることが好ましい。
【００２２】反応性置換基の種類は特に限定されない
が、例えば、サクシンイミジルエステル基、ハロゲン置
換トリアジニル基、ハロゲン置換ピリミジニル基、スル
ホニルハライド基、α−ハロアセチル基、マレイミジル
基、アジリジニル基等である。その他の置換基として
は、例えば、ハロゲン原子（例えば、フッ素、塩素、臭
素、ヨウ素）、メルカプト基、シアノ基、ニトロ基、カ
ルボキシル基、リン酸基、スルホ基、ヒドロキシ基、ア
ミノ基、イソチオシアナート基、イソシアナート基、炭
素原子数が１から８程度のアルコキシ基（例えば、メト
キシ基、エトキシ基など）、炭素原子数が６から２０程
度のアリールオキシ基（例えば、フェノキシ基、ナフト
キシ基など）、炭素原子数が２から１０程度のアルコキ
シカルボニル基（例えば、メトキシカルボニル基、エト
キシカルボニル基）、炭素原子数６から２０程度のアリ
ーロキシカルボニル基（例えば、フェノキシカルボニル
基など）、炭素原子数が２から１０程度のアシル基（例
えば、アセチル基、ピバロイル基など）、炭素原子数が
２から８程度のアシルオキシ基（例えば、アセチルオキ
シ基、ベンゾイルオキシ基など）、炭素原子数が２から
８程度のアシルアミノ基（例えば、アセチルアミノ基な
ど）、炭素原子数１から８程度のスルホニル基（例え
ば、メタンスルホニル基、エタンスルホニル基、ベンゼ
ンスルホニル基など）、炭素原子数が１から２０程度の
スルフィニル基（例えば、メタンスルフィニル基、エタ
ンスルフィニル基、ベンゼンスルフィニル基など）、炭
素原子数が１から８程度のスルホニルアミノ基（例え
ば、メタンスルホニルアミノ基、エタンスルホニルアミ
ノ基、ベンゼンスルホニルアミノ基など）、炭素原子数
が１から１０程度のカルバモイル基（例えば、カルバモ
イル基、メチルカルバモイル基、モリホリノカルバモイ
ル基など）、炭素原子数が１から２０程度の置換アミノ
基（例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、ベン
ジルアミノ基、アニリノ基、ジフェニルアミノ基な
ど）、
が、例えば、サクシンイミジルエステル基、ハロゲン置
換トリアジニル基、ハロゲン置換ピリミジニル基、スル
ホニルハライド基、α−ハロアセチル基、マレイミジル
基、アジリジニル基等である。その他の置換基として
は、例えば、ハロゲン原子（例えば、フッ素、塩素、臭
素、ヨウ素）、メルカプト基、シアノ基、ニトロ基、カ
ルボキシル基、リン酸基、スルホ基、ヒドロキシ基、ア
ミノ基、イソチオシアナート基、イソシアナート基、炭
素原子数が１から８程度のアルコキシ基（例えば、メト
キシ基、エトキシ基など）、炭素原子数が６から２０程
度のアリールオキシ基（例えば、フェノキシ基、ナフト
キシ基など）、炭素原子数が２から１０程度のアルコキ
シカルボニル基（例えば、メトキシカルボニル基、エト
キシカルボニル基）、炭素原子数６から２０程度のアリ
ーロキシカルボニル基（例えば、フェノキシカルボニル
基など）、炭素原子数が２から１０程度のアシル基（例
えば、アセチル基、ピバロイル基など）、炭素原子数が
２から８程度のアシルオキシ基（例えば、アセチルオキ
シ基、ベンゾイルオキシ基など）、炭素原子数が２から
８程度のアシルアミノ基（例えば、アセチルアミノ基な
ど）、炭素原子数１から８程度のスルホニル基（例え
ば、メタンスルホニル基、エタンスルホニル基、ベンゼ
ンスルホニル基など）、炭素原子数が１から２０程度の
スルフィニル基（例えば、メタンスルフィニル基、エタ
ンスルフィニル基、ベンゼンスルフィニル基など）、炭
素原子数が１から８程度のスルホニルアミノ基（例え
ば、メタンスルホニルアミノ基、エタンスルホニルアミ
ノ基、ベンゼンスルホニルアミノ基など）、炭素原子数
が１から１０程度のカルバモイル基（例えば、カルバモ
イル基、メチルカルバモイル基、モリホリノカルバモイ
ル基など）、炭素原子数が１から２０程度の置換アミノ
基（例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、ベン
ジルアミノ基、アニリノ基、ジフェニルアミノ基な
ど）、
【００２３】炭素数２から１０程度のスルファモイル基
（例えば、メチルスルファモイル基、エチルスルファモ
イル基、ピペリジノスルファモイル基など）、炭素原子
数が０から１５程度のアンモニウム基（例えば、トリメ
チルアンモニウム基、トリエチルアンモニウム基な
ど）、炭素原子数が０から１５程度のヒドラジノ基（例
えば、トリメチルヒドラジノ基など）、炭素原子数が１
から１５程度のウレイド基（例えば、ウレイド基、N,N-
ジメチルウレイド基など）、炭素原子数が１から１５程
度のイミド基（例えば、スクシンイミド基など）、炭素
原子数が１から２０程度のアルキルチオ基（例えば、メ
チルチオ基、エチルチオ基など）、炭素原子数６から２
０のアリールチオ基（例えば、フェニルチオ基、p-メチ
ルフェニルチオ基、p-クロロフェニルチオ基、２−ピリ
ジルチオ基、ナフチルチオ基など）、炭素原子数が１か
ら２０程度の置換又は無置換のヘテロ環基（例えば、ピ
リジル基、５−メチルピリジル基、チエニル基、フリル
基、モルホリノ基、テトラヒドロフリル基、２−ピラジ
ル基など）、炭素原子数が２から１８程度の不飽和炭化
水素基（例えば、ビニル基、エチニル基、１−シクロヘ
キセニル基、ベンジリジン基、ベンジリデン基など）、
炭素原子数が６から２０程度のアリール基（例えば、フ
ェニル基、４−スルホフェニル基、２，５−ジスルホフ
ェニル基、４−カルボキシフェニル基、ナフチル基な
ど）、炭素原子数が１から２０程度のアルキル基（例え
ば、メチル基、エチル基、プロピル基など）が挙げられ
る。
（例えば、メチルスルファモイル基、エチルスルファモ
イル基、ピペリジノスルファモイル基など）、炭素原子
数が０から１５程度のアンモニウム基（例えば、トリメ
チルアンモニウム基、トリエチルアンモニウム基な
ど）、炭素原子数が０から１５程度のヒドラジノ基（例
えば、トリメチルヒドラジノ基など）、炭素原子数が１
から１５程度のウレイド基（例えば、ウレイド基、N,N-
ジメチルウレイド基など）、炭素原子数が１から１５程
度のイミド基（例えば、スクシンイミド基など）、炭素
原子数が１から２０程度のアルキルチオ基（例えば、メ
チルチオ基、エチルチオ基など）、炭素原子数６から２
０のアリールチオ基（例えば、フェニルチオ基、p-メチ
ルフェニルチオ基、p-クロロフェニルチオ基、２−ピリ
ジルチオ基、ナフチルチオ基など）、炭素原子数が１か
ら２０程度の置換又は無置換のヘテロ環基（例えば、ピ
リジル基、５−メチルピリジル基、チエニル基、フリル
基、モルホリノ基、テトラヒドロフリル基、２−ピラジ
ル基など）、炭素原子数が２から１８程度の不飽和炭化
水素基（例えば、ビニル基、エチニル基、１−シクロヘ
キセニル基、ベンジリジン基、ベンジリデン基など）、
炭素原子数が６から２０程度のアリール基（例えば、フ
ェニル基、４−スルホフェニル基、２，５−ジスルホフ
ェニル基、４−カルボキシフェニル基、ナフチル基な
ど）、炭素原子数が１から２０程度のアルキル基（例え
ば、メチル基、エチル基、プロピル基など）が挙げられ
る。
【００２４】Ｒ1及びＲ2として、カルボキシル基、イソ
チオシアナート基、サクシンイミジルエステル基、スル
ホニルハライド基、α−ハロアセチル基、マレイミジル
基、スルホン酸基又はその塩が置換した炭素原子数１か
ら１０のアルキル基が好ましく、さらに好ましくはカル
ボキシル基、イソチオシアナート基、サクシンイミジル
エステル基、スルホン酸基又はその塩が置換した炭素原
子数１から６のアルキル基、あるいはスルホ基、カルボ
キシル基、イソチオシアナート基、サクシンイミジルエ
ステル基、スルホニルハライド基、α−ハロアセチル
基、又はマレイミジル基が置換した炭素原子数７から２
０のアリールアルキル基である。
チオシアナート基、サクシンイミジルエステル基、スル
ホニルハライド基、α−ハロアセチル基、マレイミジル
基、スルホン酸基又はその塩が置換した炭素原子数１か
ら１０のアルキル基が好ましく、さらに好ましくはカル
ボキシル基、イソチオシアナート基、サクシンイミジル
エステル基、スルホン酸基又はその塩が置換した炭素原
子数１から６のアルキル基、あるいはスルホ基、カルボ
キシル基、イソチオシアナート基、サクシンイミジルエ
ステル基、スルホニルハライド基、α−ハロアセチル
基、又はマレイミジル基が置換した炭素原子数７から２
０のアリールアルキル基である。
【００２５】一般式（Ｉ）、（II）、及び（III）にお
いて、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6は好ましくは炭素原子数
が１から２０のアルキル基であり、アルキル基上の任意
の位置にＲ1及びＲ2で例示した置換基を有していてもよ
い。また、Ｒ3とＲ4は互いに連結して飽和の炭素環を形
成してもよい。Ｒ3、Ｒ4及びＲ5としては炭素原子数1か
ら６のアルキル基が好ましく、さらに好ましくは炭素原
子数１から３のアルキル基である。
いて、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6は好ましくは炭素原子数
が１から２０のアルキル基であり、アルキル基上の任意
の位置にＲ1及びＲ2で例示した置換基を有していてもよ
い。また、Ｒ3とＲ4は互いに連結して飽和の炭素環を形
成してもよい。Ｒ3、Ｒ4及びＲ5としては炭素原子数1か
ら６のアルキル基が好ましく、さらに好ましくは炭素原
子数１から３のアルキル基である。
【００２６】一般式（Ｉ）、（II）、及び（III）中の
Ｖ1、Ｖ2、Ｖ3、Ｖ4、Ｖ5、Ｖ6、Ｖ7、Ｖ8、及びＶ9は
同一又は異なって水素原子又は一価の置換基を表わす。
Ｖ1、Ｖ 2、Ｖ3、Ｖ4、Ｖ5、Ｖ6、Ｖ7、Ｖ8、及びＶ9で
表わされる置換基は特に制限はないが、Ｒ1及びＲ2でア
ルキル基上の置換基として例示したものが挙げられる。
Ｖ1、Ｖ2、Ｖ3、Ｖ4、Ｖ5、Ｖ6、Ｖ7、Ｖ8、及びＶ9は
同一又は異なって水素原子又は一価の置換基を表わす。
Ｖ1、Ｖ 2、Ｖ3、Ｖ4、Ｖ5、Ｖ6、Ｖ7、Ｖ8、及びＶ9で
表わされる置換基は特に制限はないが、Ｒ1及びＲ2でア
ルキル基上の置換基として例示したものが挙げられる。
【００２７】Ｖ1とＶ2、Ｖ2とＶ3、Ｖ4とＶ5、Ｖ5と
Ｖ6、及び／又はＶ6とＶ7はそれぞれ互いに連結して、
例えば５員、６員又は７員の飽和又は不飽和の環を形成
してもよい。上記の不飽和環は酸素原子、窒素原子、又
は硫黄原子等の任意のヘテロ原子を１個又は２個以上含
んでいてもよい。形成される環の任意の位置には、Ｒ1
及びＲ2でアルキル基上の置換基として例示した置換基
（以下、この置換基を「例示置換基」と呼ぶ。）が１個
又は２個以上置換していてもよい。
Ｖ6、及び／又はＶ6とＶ7はそれぞれ互いに連結して、
例えば５員、６員又は７員の飽和又は不飽和の環を形成
してもよい。上記の不飽和環は酸素原子、窒素原子、又
は硫黄原子等の任意のヘテロ原子を１個又は２個以上含
んでいてもよい。形成される環の任意の位置には、Ｒ1
及びＲ2でアルキル基上の置換基として例示した置換基
（以下、この置換基を「例示置換基」と呼ぶ。）が１個
又は２個以上置換していてもよい。
【００２８】Ｖ1、Ｖ2、Ｖ3、Ｖ4、Ｖ5、Ｖ6、Ｖ7、
Ｖ8、及びＶ9としては、炭素数１から６のアルキル基
（該アルキル基上の任意の位置に例示置換基が１個又は
２個以上存在していてもよい）、炭素数６から２０のア
リール基（アリール基上の任意の位置に例示置換基が１
個又は２個以上存在していてもよい）、ハロゲン原子、
炭素数１から１０のチオアルキル基、炭素数１から１０
のアルキルスルホン基、ホスホン酸基、カルボキシル
基、炭素数1から１０のアルコキシ基、シアノ基、置換
アミノ基、イソチオシアナート基、イソシアナート基、
サクシンイミジルエステル基、ハロゲン置換トリアジニ
ル基、ハロゲン置換ピリミジニル基、スルホニルハライ
ド基、α−ハロアセチル基、マレイミジル基、アジリジ
ニル基を挙げることができる。さらに好ましくは、ハロ
ゲン原子、カルボキシル基、ホスホン酸基のほか、ハロ
ゲン原子、カルボキシル基、スルホン酸基、又はホスホ
ン酸基が置換した炭素数６から２０のアリール基、カル
ボキシル基又はスルホ基が置換した炭素数１から１０の
アルコキシ基、カルボキシル基、スルホン酸基、又はホ
スホン酸基が置換した炭素数１から１０のアルキルチオ
基を挙げることができる。
Ｖ8、及びＶ9としては、炭素数１から６のアルキル基
（該アルキル基上の任意の位置に例示置換基が１個又は
２個以上存在していてもよい）、炭素数６から２０のア
リール基（アリール基上の任意の位置に例示置換基が１
個又は２個以上存在していてもよい）、ハロゲン原子、
炭素数１から１０のチオアルキル基、炭素数１から１０
のアルキルスルホン基、ホスホン酸基、カルボキシル
基、炭素数1から１０のアルコキシ基、シアノ基、置換
アミノ基、イソチオシアナート基、イソシアナート基、
サクシンイミジルエステル基、ハロゲン置換トリアジニ
ル基、ハロゲン置換ピリミジニル基、スルホニルハライ
ド基、α−ハロアセチル基、マレイミジル基、アジリジ
ニル基を挙げることができる。さらに好ましくは、ハロ
ゲン原子、カルボキシル基、ホスホン酸基のほか、ハロ
ゲン原子、カルボキシル基、スルホン酸基、又はホスホ
ン酸基が置換した炭素数６から２０のアリール基、カル
ボキシル基又はスルホ基が置換した炭素数１から１０の
アルコキシ基、カルボキシル基、スルホン酸基、又はホ
スホン酸基が置換した炭素数１から１０のアルキルチオ
基を挙げることができる。
【００２９】一般式（Ｉ）、（II）、及び（III）中の
Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ6、及びＬ7はそれぞれ独
立に置換又は無置換のメチン基を表わす。置換基として
は例えば、置換又は無置換の炭素原子数１から１５、好
ましくは炭素原子数１から１０、特に好ましくは炭素原
子数１から５のアルキル基（例えば、メチル基、エチル
基、カルボキシエチル基など）、置換又は無置換の炭素
原子数６から３０、好ましくは炭素原子数６から２０、
さらに好ましくは炭素原子数６から１５のアリール基
（例えば、フェニル基、o-カルボキシフェニル基な
ど）、置換又は無置換の炭素原子数３から２０、好まし
くは炭素原子数４から１５、さらに好ましくは炭素原子
数６から１０の複素環基（例えば、N,N−ジメチルバル
ビツール酸基など）、ハロゲン原子（例えば、塩素、臭
素、ヨウ素、フッ素など）、炭素原子数１から２０、好
ましくは１から１５、さらに好ましくは１から１０のア
ルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基など）、
炭素原子数０から２０、好ましくは炭素原子数２から１
５、さらに好ましくは炭素原子数４から１５のアミノ基
（例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、N-メチ
ル-N-フェニルアミノ基、N-メチルピペラジノ基な
ど）、炭素原子数１から１５、好ましくは炭素原子数１
から１０、さらに好ましくは炭素数１から８のアルキル
チオ基（例えば、メチルチオ基、エチルチオ基など）、
炭素原子数６から２０、好ましくは炭素原子数６から１
８、さらに好ましくは炭素原子数６から１５のアリール
チオ基（例えば、フェニルチオ基、p-メチルチオ基な
ど）等が挙げられる。ｓ、ｔ、及びｕはそれぞれ独立に
０又は１を示す。ｓが０であり、ｔ及びｕが１である場
合、又はｓ及びｔが０であり、ｕが１である場合が好ま
しい。
Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ6、及びＬ7はそれぞれ独
立に置換又は無置換のメチン基を表わす。置換基として
は例えば、置換又は無置換の炭素原子数１から１５、好
ましくは炭素原子数１から１０、特に好ましくは炭素原
子数１から５のアルキル基（例えば、メチル基、エチル
基、カルボキシエチル基など）、置換又は無置換の炭素
原子数６から３０、好ましくは炭素原子数６から２０、
さらに好ましくは炭素原子数６から１５のアリール基
（例えば、フェニル基、o-カルボキシフェニル基な
ど）、置換又は無置換の炭素原子数３から２０、好まし
くは炭素原子数４から１５、さらに好ましくは炭素原子
数６から１０の複素環基（例えば、N,N−ジメチルバル
ビツール酸基など）、ハロゲン原子（例えば、塩素、臭
素、ヨウ素、フッ素など）、炭素原子数１から２０、好
ましくは１から１５、さらに好ましくは１から１０のア
ルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基など）、
炭素原子数０から２０、好ましくは炭素原子数２から１
５、さらに好ましくは炭素原子数４から１５のアミノ基
（例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、N-メチ
ル-N-フェニルアミノ基、N-メチルピペラジノ基な
ど）、炭素原子数１から１５、好ましくは炭素原子数１
から１０、さらに好ましくは炭素数１から８のアルキル
チオ基（例えば、メチルチオ基、エチルチオ基など）、
炭素原子数６から２０、好ましくは炭素原子数６から１
８、さらに好ましくは炭素原子数６から１５のアリール
チオ基（例えば、フェニルチオ基、p-メチルチオ基な
ど）等が挙げられる。ｓ、ｔ、及びｕはそれぞれ独立に
０又は１を示す。ｓが０であり、ｔ及びｕが１である場
合、又はｓ及びｔが０であり、ｕが１である場合が好ま
しい。
【００３０】Ｍは対イオンを表わす。Ｍは陽イオンでも
陰イオンでもよく、陽イオンとしてはナトリウムイオ
ン、カリウムイオン、リチウムイオンなどのアルカリ金
属イオン、テトラアルキルアンモニウムイオン、ピリジ
ニウムイオンなどの有機イオンが挙げられる。陰イオン
は無機陰イオンあるいは有機陰イオンのいずれであって
もよく、ハロゲン陰イオン（例えば、フッ素イオン、塩
素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオンなど）、置換アリ
ールスルホン酸イオン（例えば、p-トルエンスルホン酸
イオン、p-クロルベンゼンスルホン酸イオンなど）、ア
リールジスルホン酸イオン（例えば、1,3-ベンゼンジス
ルホン酸イオン、1,5-ナフタレンジスルホン酸イオンな
ど）、アルキル硫酸イオン（例えば、メチル硫酸イオン
など）、硫酸イオン、チオシアン酸イオン、過塩素酸イ
オン、テトラフルオロホウ酸イオン、ピクリン酸イオ
ン、酢酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イオン
などが挙げられる。また、Ｍは水素イオンでもよい。陽
イオンとして、好ましくはアンモニウムイオン、アルカ
リ金属イオン、ハロゲン陰イオン、置換アリールスルホ
ン酸イオンを挙げることができ、さらに好ましくはアル
カリ金属イオン、ハロゲン陰イオン、置換アリールスル
ホン酸イオンを挙げることができる。ｍは分子の電荷を
中和するのに必要な数を表わす。
陰イオンでもよく、陽イオンとしてはナトリウムイオ
ン、カリウムイオン、リチウムイオンなどのアルカリ金
属イオン、テトラアルキルアンモニウムイオン、ピリジ
ニウムイオンなどの有機イオンが挙げられる。陰イオン
は無機陰イオンあるいは有機陰イオンのいずれであって
もよく、ハロゲン陰イオン（例えば、フッ素イオン、塩
素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオンなど）、置換アリ
ールスルホン酸イオン（例えば、p-トルエンスルホン酸
イオン、p-クロルベンゼンスルホン酸イオンなど）、ア
リールジスルホン酸イオン（例えば、1,3-ベンゼンジス
ルホン酸イオン、1,5-ナフタレンジスルホン酸イオンな
ど）、アルキル硫酸イオン（例えば、メチル硫酸イオン
など）、硫酸イオン、チオシアン酸イオン、過塩素酸イ
オン、テトラフルオロホウ酸イオン、ピクリン酸イオ
ン、酢酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イオン
などが挙げられる。また、Ｍは水素イオンでもよい。陽
イオンとして、好ましくはアンモニウムイオン、アルカ
リ金属イオン、ハロゲン陰イオン、置換アリールスルホ
ン酸イオンを挙げることができ、さらに好ましくはアル
カリ金属イオン、ハロゲン陰イオン、置換アリールスル
ホン酸イオンを挙げることができる。ｍは分子の電荷を
中和するのに必要な数を表わす。
【００３１】一般式（Ｉ）において、Ｗとしては酸素原
子、硫黄原子、又は−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ4)−が好ましく、酸素
原子及び−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ4)−がさらに好ましい。一般式
（II）において、Ｗとしては硫黄原子又は−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ
4)−が好ましく、−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ4)−がさらに好ましい。
一般式（III）において、Ｗとしては酸素原子又は−Ｃ
(Ｒ 3)(Ｒ4)−が好ましく、酸素原子がより好ましい。一
般式（III）におけるＥは窒素原子又は−Ｃ(Ｒ6)＝を表
し、Ｒ6は水素原子又は置換基を示す。Ｒ6で表される置
換基としては上記の「例示置換基」が挙げられる。Ｒ6
はＶ9と連結して飽和又は不飽和の環を形成している場
合が好ましい。さらに好ましくは、下記一般式（IV）に
示したごとく、ベンゾイソオキサゾール環を形成する場
合である。
子、硫黄原子、又は−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ4)−が好ましく、酸素
原子及び−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ4)−がさらに好ましい。一般式
（II）において、Ｗとしては硫黄原子又は−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ
4)−が好ましく、−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ4)−がさらに好ましい。
一般式（III）において、Ｗとしては酸素原子又は−Ｃ
(Ｒ 3)(Ｒ4)−が好ましく、酸素原子がより好ましい。一
般式（III）におけるＥは窒素原子又は−Ｃ(Ｒ6)＝を表
し、Ｒ6は水素原子又は置換基を示す。Ｒ6で表される置
換基としては上記の「例示置換基」が挙げられる。Ｒ6
はＶ9と連結して飽和又は不飽和の環を形成している場
合が好ましい。さらに好ましくは、下記一般式（IV）に
示したごとく、ベンゾイソオキサゾール環を形成する場
合である。
【００３２】
【化７】
（Ｖ1、Ｖ2、Ｖ3、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｌ1、Ｌ2、
Ｌ3、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ6、Ｌ7、Ｍ、ｍ、ｓ、ｔ、及びｕは
上記定義と同義であり、Ｖ11、Ｖ12、Ｖ13、Ｖ14として
はＶ1からＶ9について例示したものが挙げられ、好まし
い態様もＶ1からＶ9と同様である。）
Ｌ3、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ6、Ｌ7、Ｍ、ｍ、ｓ、ｔ、及びｕは
上記定義と同義であり、Ｖ11、Ｖ12、Ｖ13、Ｖ14として
はＶ1からＶ9について例示したものが挙げられ、好まし
い態様もＶ1からＶ9と同様である。）
【００３３】一般式（Ｉ）、一般式（II）、及び一般式
（III）で表される化合物は置換基の種類に応じて１以
上の不斉炭素を有する場合があるが、光学異性体やジア
ステレオ異性体などの立体異性体、立体異性体の混合
物、ラセミ体などのいずれの場合も本発明の範囲に包含
される。また、一般式（Ｉ）、一般式（II）、及び一般
式（III）で表される化合物は水和物又は溶媒和物を形
成する場合があるが、これらの物質はいずれも本発明の
範囲に包含される。
（III）で表される化合物は置換基の種類に応じて１以
上の不斉炭素を有する場合があるが、光学異性体やジア
ステレオ異性体などの立体異性体、立体異性体の混合
物、ラセミ体などのいずれの場合も本発明の範囲に包含
される。また、一般式（Ｉ）、一般式（II）、及び一般
式（III）で表される化合物は水和物又は溶媒和物を形
成する場合があるが、これらの物質はいずれも本発明の
範囲に包含される。
【００３４】上記一般式（Ｉ）、一般式（II）、及び一
般式（III）で表される化合物の好ましい例を以下に示
すが、本発明の範囲は下記の具体的化合物によって限定
されることはない。
般式（III）で表される化合物の好ましい例を以下に示
すが、本発明の範囲は下記の具体的化合物によって限定
されることはない。
【００３５】
【化８】
【００３６】
【化９】
【００３７】
【化１０】
【００３８】
【化１１】
【００３９】
【化１２】
【００４０】
【化１３】
【００４１】
【化１４】
【００４２】
【化１５】
【００４３】
【化１６】
【００４４】
【化１７】
【００４５】
【化１８】
【００４６】本明細書の実施例に代表的化合物の製造方
法を具体的に示したので、当業者は下記の実施例の具体
的説明を参照しつつ、原料化合物、反応条件、試薬など
を適宜選択し、必要に応じて実施例に記載した方法に修
飾ないし改変を加えることによって、上記一般式
（Ｉ）、（II）、及び（III）に包含される任意の化合
物を製造することが可能である。もっとも、上記一般式
Ｉ）、（II）、及び（III）で表される化合物の製造方
法は特に限定されず、いかなる方法により製造したもの
も本発明で使用できることは言うまでもない。
法を具体的に示したので、当業者は下記の実施例の具体
的説明を参照しつつ、原料化合物、反応条件、試薬など
を適宜選択し、必要に応じて実施例に記載した方法に修
飾ないし改変を加えることによって、上記一般式
（Ｉ）、（II）、及び（III）に包含される任意の化合
物を製造することが可能である。もっとも、上記一般式
Ｉ）、（II）、及び（III）で表される化合物の製造方
法は特に限定されず、いかなる方法により製造したもの
も本発明で使用できることは言うまでもない。
【００４７】上記一般式（Ｉ）、（II）、及び（III）
で表される化合物は、本発明の蛍光ヌクレオチドにおい
て蛍光標識成分として使用される。ヌクレオチドに一般
式（Ｉ）、（II）、及び（III）で表される化合物を蛍
光標識として導入するための手法は種々知られており、
当業者に利用可能な手段を適宜選択して利用することが
可能である。例えば、ヌクレオチド中のアミノ基、水酸
基などの官能基と一般式（Ｉ）、（II）、及び（III）
で表される化合物中のカルボキシル基、活性エステル基
等の反応性置換基をイオン結合的又は共有結合的に直接
結合させるか、あるいはヌクレオチドの一部に連結基を
導入するなどの化学修飾を行った後に一般式（Ｉ）、
（II）、及び（III）の化合物を反応させればよい。反
応後に生成した蛍光ヌクレオチドは、クロマトグラフィ
ー、電気泳動、再結晶などの汎用の分離技術により精製
することができる。
で表される化合物は、本発明の蛍光ヌクレオチドにおい
て蛍光標識成分として使用される。ヌクレオチドに一般
式（Ｉ）、（II）、及び（III）で表される化合物を蛍
光標識として導入するための手法は種々知られており、
当業者に利用可能な手段を適宜選択して利用することが
可能である。例えば、ヌクレオチド中のアミノ基、水酸
基などの官能基と一般式（Ｉ）、（II）、及び（III）
で表される化合物中のカルボキシル基、活性エステル基
等の反応性置換基をイオン結合的又は共有結合的に直接
結合させるか、あるいはヌクレオチドの一部に連結基を
導入するなどの化学修飾を行った後に一般式（Ｉ）、
（II）、及び（III）の化合物を反応させればよい。反
応後に生成した蛍光ヌクレオチドは、クロマトグラフィ
ー、電気泳動、再結晶などの汎用の分離技術により精製
することができる。
【００４８】本発明はさらに、本発明の蛍光ヌクレオチ
ドの利用にも関する。すなわち、本発明の蛍光ヌクレオ
チドは核酸の検出のために利用することができる。本発
明の蛍光ヌクレオチドを核酸の検出などのＤＮＡ解析に
用いる場合には、例えば、ルース（Jerry L. Ruth, DN
A, 3, 123 (1984)）に記載の方法でプローブ又はプライ
マーに本発明の蛍光ヌクレオチドを取り込ませることが
できる。すなわち、本発明により、核酸合成酵素と鋳型
核酸と本発明の蛍光ヌクレオチドとを用いて核酸合成反
応を行う工程を含む蛍光標識された核酸の調製方法が提
供される。
ドの利用にも関する。すなわち、本発明の蛍光ヌクレオ
チドは核酸の検出のために利用することができる。本発
明の蛍光ヌクレオチドを核酸の検出などのＤＮＡ解析に
用いる場合には、例えば、ルース（Jerry L. Ruth, DN
A, 3, 123 (1984)）に記載の方法でプローブ又はプライ
マーに本発明の蛍光ヌクレオチドを取り込ませることが
できる。すなわち、本発明により、核酸合成酵素と鋳型
核酸と本発明の蛍光ヌクレオチドとを用いて核酸合成反
応を行う工程を含む蛍光標識された核酸の調製方法が提
供される。
【００４９】本発明の方法において用いられる核酸合成
酵素としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ（Klenow酵
素、TaqＤＮＡポリメラーゼなど任意のＤＮＡポリメラ
ーゼを含む）、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素又はタ
ーミナルトランスフェラーゼなどが挙げられるが、これ
らに限定されることはない。鋳型核酸の種類は特に限定
されず、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれでもよい。天然由
来のＤＮＡ又はＲＮＡのほか、組み換えＤＮＡ又はＲＮ
Ａあるいは化学合成ＤＮＡ又はＲＮＡなどの非天然型Ｄ
ＮＡ又はＲＮＡであってもよい（本明細書において「核
酸」と言う場合にも同様である）。核酸合成反応は、例
えば、鋳型ＤＮＡ、非蛍光のヌクレオチド混合物、本発
明の蛍光ヌクレオチド、及び核酸合成酵素を用いて、酵
素反応に適した条件下（塩濃度、ｐＨ、温度などの条件
を含む）において行うことができる。このような核酸合
成法は当業者に周知であり、標識の目的などに応じて、
使用する材料や試薬などは当業者ならば適宜選択するこ
とができる。
酵素としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ（Klenow酵
素、TaqＤＮＡポリメラーゼなど任意のＤＮＡポリメラ
ーゼを含む）、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素又はタ
ーミナルトランスフェラーゼなどが挙げられるが、これ
らに限定されることはない。鋳型核酸の種類は特に限定
されず、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれでもよい。天然由
来のＤＮＡ又はＲＮＡのほか、組み換えＤＮＡ又はＲＮ
Ａあるいは化学合成ＤＮＡ又はＲＮＡなどの非天然型Ｄ
ＮＡ又はＲＮＡであってもよい（本明細書において「核
酸」と言う場合にも同様である）。核酸合成反応は、例
えば、鋳型ＤＮＡ、非蛍光のヌクレオチド混合物、本発
明の蛍光ヌクレオチド、及び核酸合成酵素を用いて、酵
素反応に適した条件下（塩濃度、ｐＨ、温度などの条件
を含む）において行うことができる。このような核酸合
成法は当業者に周知であり、標識の目的などに応じて、
使用する材料や試薬などは当業者ならば適宜選択するこ
とができる。
【００５０】本発明の蛍光ヌクレオチドを用いて種々の
手段により核酸を標識することができる。ランダムプラ
イム法はＤＮＡを標識するための一つ方法であり、任意
の組み合わせのヘキサヌクレオチド配列の混合物をプラ
イマー（ランダムプライマー）として使用し、このラン
ダムプライマーを標識すべき核酸にハイブリダイゼーシ
ョンさせる工程を含む。このランダムプライマーの3'-O
H末端から出発し、１本鎖に相補的な鎖をKlenow酵素な
どのＤＮＡポリメラーゼ又は他のＤＮＡポリメラーゼを
用いて合成するが、その際ＤＮＡポリメラーゼの基質で
ある４種のデオキシリボヌクレオチドが相補鎖中に挿入
される。これらのデオキシリボヌクレオチドの少なくと
も１種として本発明の蛍光ヌクレオチドを用いることに
より、蛍光ヌクレオチドで標識された相補的ＤＮＡが合
成される。
手段により核酸を標識することができる。ランダムプラ
イム法はＤＮＡを標識するための一つ方法であり、任意
の組み合わせのヘキサヌクレオチド配列の混合物をプラ
イマー（ランダムプライマー）として使用し、このラン
ダムプライマーを標識すべき核酸にハイブリダイゼーシ
ョンさせる工程を含む。このランダムプライマーの3'-O
H末端から出発し、１本鎖に相補的な鎖をKlenow酵素な
どのＤＮＡポリメラーゼ又は他のＤＮＡポリメラーゼを
用いて合成するが、その際ＤＮＡポリメラーゼの基質で
ある４種のデオキシリボヌクレオチドが相補鎖中に挿入
される。これらのデオキシリボヌクレオチドの少なくと
も１種として本発明の蛍光ヌクレオチドを用いることに
より、蛍光ヌクレオチドで標識された相補的ＤＮＡが合
成される。
【００５１】ランダムプライマーの代わりに、特異的配
列を有するオリゴＤＮＡ（特異的プライマー）を用いる
ことができる。特異的プライマーは鋳型ＤＮＡ中の相補
的領域に結合し、鋳型ＤＮＡに対する相補的ＤＮＡの合
成は特異的プライマーの3'-OH末端から開始される。ラ
ンダムプライム法の場合と同様に、相補的ＤＮＡが合成
される際に本発明の蛍光ヌクレオチドが取込まれること
により、蛍光標識された相補的ＤＮＡが合成される。
列を有するオリゴＤＮＡ（特異的プライマー）を用いる
ことができる。特異的プライマーは鋳型ＤＮＡ中の相補
的領域に結合し、鋳型ＤＮＡに対する相補的ＤＮＡの合
成は特異的プライマーの3'-OH末端から開始される。ラ
ンダムプライム法の場合と同様に、相補的ＤＮＡが合成
される際に本発明の蛍光ヌクレオチドが取込まれること
により、蛍光標識された相補的ＤＮＡが合成される。
【００５２】ニックトランスレーション法は、ＤＮアー
ゼＩの２本鎖ＤＮＡへの作用を利用した方法である。Ｄ
ＮアーゼＩの作用により鋳型２本鎖ＤＮＡの１本鎖に切
断される箇所が生じる。同時に大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼＩと、この酵素の基質である４種のデオキシリボヌク
レオチドと、本発明の蛍光ヌクレオチドとを反応混合物
中に添加しておく。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩは、切
断された１本鎖の５’−末端デオキシリボヌクレオシド
を切断し、同時に基質のデオキシリボヌクレオチド１個
を遊離している3'-OH末端の隣接に挿入する。この過程
を繰り返すことにより切断部位が３’末端に移動してい
く。基質のヌクレオチド中に本発明の蛍光ヌクレオチド
を含めることによって、ニックトランスレーション法を
用いて蛍光ＤＮＡを合成することができる。
ゼＩの２本鎖ＤＮＡへの作用を利用した方法である。Ｄ
ＮアーゼＩの作用により鋳型２本鎖ＤＮＡの１本鎖に切
断される箇所が生じる。同時に大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼＩと、この酵素の基質である４種のデオキシリボヌク
レオチドと、本発明の蛍光ヌクレオチドとを反応混合物
中に添加しておく。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩは、切
断された１本鎖の５’−末端デオキシリボヌクレオシド
を切断し、同時に基質のデオキシリボヌクレオチド１個
を遊離している3'-OH末端の隣接に挿入する。この過程
を繰り返すことにより切断部位が３’末端に移動してい
く。基質のヌクレオチド中に本発明の蛍光ヌクレオチド
を含めることによって、ニックトランスレーション法を
用いて蛍光ＤＮＡを合成することができる。
【００５３】２本鎖又は１本鎖ＤＮＡの３’末端を標識
する場合には、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌク
レオチドを3'-OH末端に結合する酵素であるターミナル
トランスフェラーゼを用いることができる。ターミナル
トランスフェラーゼは少なくとも１種のデオキシリボヌ
クレオチド又はリボヌクレオチドを基質として必要とす
る。本発明の蛍光ヌクレオチドをターミナルトランスフ
ェラーゼの基質として用いることによって、3'-OH末端
で伸長された蛍光標識核酸を合成することができる。
する場合には、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌク
レオチドを3'-OH末端に結合する酵素であるターミナル
トランスフェラーゼを用いることができる。ターミナル
トランスフェラーゼは少なくとも１種のデオキシリボヌ
クレオチド又はリボヌクレオチドを基質として必要とす
る。本発明の蛍光ヌクレオチドをターミナルトランスフ
ェラーゼの基質として用いることによって、3'-OH末端
で伸長された蛍光標識核酸を合成することができる。
【００５４】逆転写反応法は１本鎖ＲＮＡから相補的Ｄ
ＮＡを合成する反応である。先ず、プライマーとしてオ
リゴデオキシリボヌクレオチドをＲＮＡの相補的部分に
アニーリングさせた後に、逆転写酵素を用いて伸長反応
を行うことによって、ＲＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖がプ
ライマーの3'-OH末端から出発して合成される。このＤ
ＮＡ合成においても４種のデオキシリボヌクレオチドが
酵素基質として使用され、本発明の蛍光ヌクレオチドを
その中に添加しておくことによって逆転写反応中に蛍光
ヌクレオチドが伸長していくＤＮＡ鎖に挿入され、蛍光
標識ＤＮＡが合成される。
ＮＡを合成する反応である。先ず、プライマーとしてオ
リゴデオキシリボヌクレオチドをＲＮＡの相補的部分に
アニーリングさせた後に、逆転写酵素を用いて伸長反応
を行うことによって、ＲＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖がプ
ライマーの3'-OH末端から出発して合成される。このＤ
ＮＡ合成においても４種のデオキシリボヌクレオチドが
酵素基質として使用され、本発明の蛍光ヌクレオチドを
その中に添加しておくことによって逆転写反応中に蛍光
ヌクレオチドが伸長していくＤＮＡ鎖に挿入され、蛍光
標識ＤＮＡが合成される。
【００５５】ＤＮＡからＲＮＡを合成する酵素を用い
て、本発明の蛍光ヌクレオチドで標識されたＲＮＡを合
成することもできる。ＤＮＡからＲＮＡを合成する酵素
としては、ＳＰ６、Ｔ３又はＴ７ＲＮＡポリメラーゼな
どのファージによりコードされるＲＮＡポリメラーゼを
挙げることができる。これらの酵素はＳＰ６、Ｔ３又は
Ｔ７プロモーターを含む２本鎖ＤＮＡならびにＲＮＡ合
成のための酵素であり、基質としての４種類のリボヌク
レオチドが使用される。基質の一つとして本発明の蛍光
ヌクレオチドを使用することによって、蛍光標識された
ＲＮＡを合成することができる。
て、本発明の蛍光ヌクレオチドで標識されたＲＮＡを合
成することもできる。ＤＮＡからＲＮＡを合成する酵素
としては、ＳＰ６、Ｔ３又はＴ７ＲＮＡポリメラーゼな
どのファージによりコードされるＲＮＡポリメラーゼを
挙げることができる。これらの酵素はＳＰ６、Ｔ３又は
Ｔ７プロモーターを含む２本鎖ＤＮＡならびにＲＮＡ合
成のための酵素であり、基質としての４種類のリボヌク
レオチドが使用される。基質の一つとして本発明の蛍光
ヌクレオチドを使用することによって、蛍光標識された
ＲＮＡを合成することができる。
【００５６】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて
本発明の蛍光ヌクレオチドで標識された核酸を合成する
こともできる。ＰＣＲでは、生物試料中の検出すべき核
酸は１本鎖に変性され、２種のプライマーがこの一本鎖
核酸にアニーリングする。アニーリング後、ポリメラー
ゼ(好ましくはTaqＤＮＡポリメラーゼ)及び酵素基質と
してのデオキシリボヌクレオチドにより伸長反応を行
う。プライマーの3'-OH末端から出発して相補的ＤＮＡ
が合成され、二本鎖ＤＮＡが形成される。この工程を繰
り返すことにより、試料中に含まれる検出すべきＤＮＡ
を増幅することができる。TaqＤＮＡポリメラーゼによ
る伸長反応の際に、基質の一つとして本発明の蛍光ヌク
レオチドを用いることにより、蛍光標識された増幅核酸
が得られる。
本発明の蛍光ヌクレオチドで標識された核酸を合成する
こともできる。ＰＣＲでは、生物試料中の検出すべき核
酸は１本鎖に変性され、２種のプライマーがこの一本鎖
核酸にアニーリングする。アニーリング後、ポリメラー
ゼ(好ましくはTaqＤＮＡポリメラーゼ)及び酵素基質と
してのデオキシリボヌクレオチドにより伸長反応を行
う。プライマーの3'-OH末端から出発して相補的ＤＮＡ
が合成され、二本鎖ＤＮＡが形成される。この工程を繰
り返すことにより、試料中に含まれる検出すべきＤＮＡ
を増幅することができる。TaqＤＮＡポリメラーゼによ
る伸長反応の際に、基質の一つとして本発明の蛍光ヌク
レオチドを用いることにより、蛍光標識された増幅核酸
が得られる。
【００５７】上記のようにして調製された、本発明の蛍
光ヌクレオチドで標識された蛍光核酸は、ハイブリダイ
ゼーションによる相同核酸配列の検出のための遺伝子プ
ローブとして用いることができる。標的核酸のハイブリ
ダイズした蛍光ヌクレオチドは、蛍光強度計で蛍光強度
を測定することにより容易に検出することができる。
光ヌクレオチドで標識された蛍光核酸は、ハイブリダイ
ゼーションによる相同核酸配列の検出のための遺伝子プ
ローブとして用いることができる。標的核酸のハイブリ
ダイズした蛍光ヌクレオチドは、蛍光強度計で蛍光強度
を測定することにより容易に検出することができる。
【００５８】本発明の蛍光ヌクレオチドは遺伝子プロー
ブの標識のために用いることができ、該プローブは核酸
検出用の試薬、とりわけヒトを含む哺乳類動物の病気を
診断するための診断薬として有用である。本発明の蛍光
ヌクレオチドで標識されたプローブを核酸検出用の試薬
又は診断薬として用いる場合には、１種又は２種以上の
添加物を配合して試薬組成物の形態で供給することがで
きる。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、防腐
剤など適宜の添加物を用いて、溶液剤などの所望の形態
の試薬を調製することができる。試薬の形態及びその製
造方法は、当業者が適宜選択可能である。上記の診断薬
はヒトを含む哺乳類動物に経口的又は非経口的に投与す
ることもできるが、ヒトを含む哺乳類動物から分離・採
取された血液、尿、唾液などの生体試料を上記診断薬に
接触させることにより、遺伝子異常を伴う疾患の診断な
どが可能になる。
ブの標識のために用いることができ、該プローブは核酸
検出用の試薬、とりわけヒトを含む哺乳類動物の病気を
診断するための診断薬として有用である。本発明の蛍光
ヌクレオチドで標識されたプローブを核酸検出用の試薬
又は診断薬として用いる場合には、１種又は２種以上の
添加物を配合して試薬組成物の形態で供給することがで
きる。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、防腐
剤など適宜の添加物を用いて、溶液剤などの所望の形態
の試薬を調製することができる。試薬の形態及びその製
造方法は、当業者が適宜選択可能である。上記の診断薬
はヒトを含む哺乳類動物に経口的又は非経口的に投与す
ることもできるが、ヒトを含む哺乳類動物から分離・採
取された血液、尿、唾液などの生体試料を上記診断薬に
接触させることにより、遺伝子異常を伴う疾患の診断な
どが可能になる。
【００５９】本発明の蛍光ヌクレオチドは、上記した核
酸合成反応に使用する酵素、並びに緩衝液などと一緒
に、核酸検出用キットの形態で供給することもできる。
キットに含めるべき試薬の種類はキットの目的に応じて
適宜選択することができ、蛍光ヌクレオチド、核酸合成
酵素、及び緩衝液に加えて、必要に応じて１種類以上
（好ましくは４種類）の非蛍光のヌクレオチド混合物、
精製水などをキットに含めてもよい。ランダムプライマ
ー、オリゴｄＴプライマー、あるいは目的に応じた特異
的プライマーなどのプライマーをキットに含めることも
できる。
酸合成反応に使用する酵素、並びに緩衝液などと一緒
に、核酸検出用キットの形態で供給することもできる。
キットに含めるべき試薬の種類はキットの目的に応じて
適宜選択することができ、蛍光ヌクレオチド、核酸合成
酵素、及び緩衝液に加えて、必要に応じて１種類以上
（好ましくは４種類）の非蛍光のヌクレオチド混合物、
精製水などをキットに含めてもよい。ランダムプライマ
ー、オリゴｄＴプライマー、あるいは目的に応じた特異
的プライマーなどのプライマーをキットに含めることも
できる。
【００６０】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定される
ことはない。 合成例１：化合物Ｉ−１の合成 化合物Ｉ−１は以下に示すルートにより合成した。
説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定される
ことはない。 合成例１：化合物Ｉ−１の合成 化合物Ｉ−１は以下に示すルートにより合成した。
【化１９】
【００６１】（化合物Ｉ−１ｃの合成）化合物Ｉ−１ｄ
(1.6 g, 10 mmol)に6-ブロモヘキサン酸エチル(2.4 g,
10.8 mmol)を加えて１３０℃にて３０分反応させた。本
反応では目的部位の以外のヘテロ環窒素原子（インドー
ル環部分）へのアルキル化も進行するが、反応液に反応
後酢酸エチル(50 ml)とヘキサン(50 ml)を加えて生じる
オイル成分をデカンテーションにより分離させることに
より目的とするピリジン環窒素４級化生成物である化合
物Ｉ−１ｃのみを分離することができた。 収量：2.7g、収率：70％ mass(posi):303
(1.6 g, 10 mmol)に6-ブロモヘキサン酸エチル(2.4 g,
10.8 mmol)を加えて１３０℃にて３０分反応させた。本
反応では目的部位の以外のヘテロ環窒素原子（インドー
ル環部分）へのアルキル化も進行するが、反応液に反応
後酢酸エチル(50 ml)とヘキサン(50 ml)を加えて生じる
オイル成分をデカンテーションにより分離させることに
より目的とするピリジン環窒素４級化生成物である化合
物Ｉ−１ｃのみを分離することができた。 収量：2.7g、収率：70％ mass(posi):303
【００６２】（化合物Ｉ−１ｂ（アニル体）の合成）化
合物Ｉ−１ｄ(1.6 g, 10 mmol)をジメチルホルムアミド
（5 ml）に溶解させ、プロパンサルトン(1.2 g, 10 mmo
l)を加えて１００℃にて２時間反応させた。反応液に酢
酸エチル(50 ml)を加えて得られた固体(2.8 g)をろ過に
より取り出した。この固体全量に無水酢酸(10 ml)とN,
N'-ジフェニルホルムアミジン(3.9 g, 20mmol)を加えて
１００℃にて３０分反応させた。反応液に反応後酢酸エ
チル(50ml)とヘキサン(50 ml)を加えて生じるオイル成
分をデカンテーションにより分離させ、シリカゲルカラ
ムクロマトグラフィーにより化合物Ｉ−１ｂ（アニル
体）を単離した。 収量：1.5g、収率：40％ mass(posi):385
合物Ｉ−１ｄ(1.6 g, 10 mmol)をジメチルホルムアミド
（5 ml）に溶解させ、プロパンサルトン(1.2 g, 10 mmo
l)を加えて１００℃にて２時間反応させた。反応液に酢
酸エチル(50 ml)を加えて得られた固体(2.8 g)をろ過に
より取り出した。この固体全量に無水酢酸(10 ml)とN,
N'-ジフェニルホルムアミジン(3.9 g, 20mmol)を加えて
１００℃にて３０分反応させた。反応液に反応後酢酸エ
チル(50ml)とヘキサン(50 ml)を加えて生じるオイル成
分をデカンテーションにより分離させ、シリカゲルカラ
ムクロマトグラフィーにより化合物Ｉ−１ｂ（アニル
体）を単離した。 収量：1.5g、収率：40％ mass(posi):385
【００６３】（化合物Ｉ−１ａの合成）化合物Ｉ−１ｂ
(0.39 g, 1 mmol)と化合物Ｉ−１ｃ(0.38 g, 1 mmol)を
DMF(5 ml)に溶解しトリエチルアミン(0.5 ml)および無
水酢酸(0.5 ml)を加え、60℃で1時間反応させた。反応
液に酢酸エチル(50 ml)を加えると結晶が析出した。そ
の粗結晶をゲル濾過（SEPHADEX LH-20）により精製し、
化合物Ｉ−１ａを得た。 mass(posi):594 吸収極大（メタノール）：557nm 分子吸光係数：81000
(0.39 g, 1 mmol)と化合物Ｉ−１ｃ(0.38 g, 1 mmol)を
DMF(5 ml)に溶解しトリエチルアミン(0.5 ml)および無
水酢酸(0.5 ml)を加え、60℃で1時間反応させた。反応
液に酢酸エチル(50 ml)を加えると結晶が析出した。そ
の粗結晶をゲル濾過（SEPHADEX LH-20）により精製し、
化合物Ｉ−１ａを得た。 mass(posi):594 吸収極大（メタノール）：557nm 分子吸光係数：81000
【００６４】（化合物Ｉ−１の合成）前記化合物Ｉ−１
ａ全量をメタノール(10 ml)に溶解し、５%水酸化リチウ
ム水溶液(5 ml)を加えて室温で2時間反応させた。反応
液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(10 ml)を加えた後
メタノールを減圧濃縮すると化合物Ｉ−１の粗結晶が析
出した。粗結晶をゲル濾過（SEPHADEX LH-20）により脱
塩し、化合物Ｉ−１を得た。 収量：0.20g、収率：35%（I-1bより） mass(posi):566 吸収極大（メタノール）：557nm 分子吸光係数：82000
ａ全量をメタノール(10 ml)に溶解し、５%水酸化リチウ
ム水溶液(5 ml)を加えて室温で2時間反応させた。反応
液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(10 ml)を加えた後
メタノールを減圧濃縮すると化合物Ｉ−１の粗結晶が析
出した。粗結晶をゲル濾過（SEPHADEX LH-20）により脱
塩し、化合物Ｉ−１を得た。 収量：0.20g、収率：35%（I-1bより） mass(posi):566 吸収極大（メタノール）：557nm 分子吸光係数：82000
【００６５】合成例２：化合物Ｉ−２〜化合物Ｉ−５の
合成 化合物Ｉ−２、化合物Ｉ−３、化合物Ｉ−４、化合物Ｉ
−５は化合物Ｉ−１の合成法に準じて合成した。表１に
それぞれのメタノール中での吸収特性を示す。
合成 化合物Ｉ−２、化合物Ｉ−３、化合物Ｉ−４、化合物Ｉ
−５は化合物Ｉ−１の合成法に準じて合成した。表１に
それぞれのメタノール中での吸収特性を示す。
【００６６】
【表１】
【００６７】合成例３：化合物Ｉ−６の合成
化合物Ｉ−１(0.57 g, 1 mmol)をDMF(5 ml)に溶解さ
せ、ピリジン(0.5 ml)とN,N'-ジスクシンイミジルカー
ボネート(1.0 g)を加えて40℃で4時間反応させた。反応
液に酢酸エチル(50 ml)を加え、生じるオイルをデカン
テーションにより分離した。オイルをジエチルエーテル
から結晶化させ、化合物I-６を得た。 収量：0.5g、収率：74% mass(posi)：663 吸収極大（メタノール）：557nm 分子吸光係数：88000
せ、ピリジン(0.5 ml)とN,N'-ジスクシンイミジルカー
ボネート(1.0 g)を加えて40℃で4時間反応させた。反応
液に酢酸エチル(50 ml)を加え、生じるオイルをデカン
テーションにより分離した。オイルをジエチルエーテル
から結晶化させ、化合物I-６を得た。 収量：0.5g、収率：74% mass(posi)：663 吸収極大（メタノール）：557nm 分子吸光係数：88000
【００６８】化合物Ｉ−７から化合物Ｉ−９も対応する
カルボン酸から化合物Ｉ−６の方法に準じて合成した。
生成物の構造は全てマススペクトルによって同定した。
カルボン酸から化合物Ｉ−６の方法に準じて合成した。
生成物の構造は全てマススペクトルによって同定した。
【００６９】合成例４：化合物Ｉ−１０〜化合物Ｉ−１
３の合成 ベンゾオキサゾール、インドレニン、ベンゾチアゾー
ル、ベンゾイミダゾールから公知の方法で誘導されるア
ニル体と化合物Ｉ−１ｃから化合物Ｉ−１ａ、Ｉ−１及
びＩ−６の合成法に準じて化合物Ｉ−１０から化合物Ｉ
−１３を合成した。化合物Ｉ−１０から化合物Ｉ−１３
の合成ではアニル体合成の最適条件が異なっていたた
め、表２にアニル体合成条件の詳細を示す。また、表３
に化合物Ｉ−１０から化合物Ｉ−１３のメタノール中で
の吸収特性を示す。
３の合成 ベンゾオキサゾール、インドレニン、ベンゾチアゾー
ル、ベンゾイミダゾールから公知の方法で誘導されるア
ニル体と化合物Ｉ−１ｃから化合物Ｉ−１ａ、Ｉ−１及
びＩ−６の合成法に準じて化合物Ｉ−１０から化合物Ｉ
−１３を合成した。化合物Ｉ−１０から化合物Ｉ−１３
の合成ではアニル体合成の最適条件が異なっていたた
め、表２にアニル体合成条件の詳細を示す。また、表３
に化合物Ｉ−１０から化合物Ｉ−１３のメタノール中で
の吸収特性を示す。
【００７０】
【化２０】
【００７１】
【表２】
【００７２】
【表３】
【００７３】合成例５：化合物Ｉ−１４の合成
化合物Ｉ−１ｄ(1.6 g, 10 mmol)をジメチルホルムアミ
ド（5 ml）に溶解させ、プロパンサルトン(1.2 g, 10 m
mol)を加えて１００℃にて２時間反応させた。反応液に
酢酸エチル(50 ml)を加えて得られた固体(2.8 g)をろ過
により取り出した。この固体全量に無水酢酸(10 ml)と3
-アニリノ−アクリルアルデヒドフェニルイミン(4.4 g,
20 mmol)を加えて１００℃にて３０分反応させた。反
応液に酢酸エチル(50 ml) を加えて生じるオイルをデカ
ンテーションにより分離した。続いて、化合物Ｉ−１ｃ
(2.7 g, 7 mmol)、ジメチルホルムアミド(10 ml)、トリ
エチルアミン(1 ml)、無水酢酸(1 ml)を加え、６0℃に
て1時間加熱した。反応液に酢酸エチル(50 ml) を加え
て生じる粗結晶を取り出し、シリカゲルカラムクロマト
グラフィーにて精製して化合物Ｉ−１４のエチルエステ
ル体を得た。次に、エチルエステル体の全量をI-1で行
ったエステル加水分解の条件に付し、シリカゲルカラム
クロマトグラフィーにて精製して化合物Ｉ−１４を得
た。 収量：0.5g、収率：8％（化合物Ｉ−ｄより） mass(posi):608 吸収極大（メタノール）：639nm 分子吸光係数：90000
ド（5 ml）に溶解させ、プロパンサルトン(1.2 g, 10 m
mol)を加えて１００℃にて２時間反応させた。反応液に
酢酸エチル(50 ml)を加えて得られた固体(2.8 g)をろ過
により取り出した。この固体全量に無水酢酸(10 ml)と3
-アニリノ−アクリルアルデヒドフェニルイミン(4.4 g,
20 mmol)を加えて１００℃にて３０分反応させた。反
応液に酢酸エチル(50 ml) を加えて生じるオイルをデカ
ンテーションにより分離した。続いて、化合物Ｉ−１ｃ
(2.7 g, 7 mmol)、ジメチルホルムアミド(10 ml)、トリ
エチルアミン(1 ml)、無水酢酸(1 ml)を加え、６0℃に
て1時間加熱した。反応液に酢酸エチル(50 ml) を加え
て生じる粗結晶を取り出し、シリカゲルカラムクロマト
グラフィーにて精製して化合物Ｉ−１４のエチルエステ
ル体を得た。次に、エチルエステル体の全量をI-1で行
ったエステル加水分解の条件に付し、シリカゲルカラム
クロマトグラフィーにて精製して化合物Ｉ−１４を得
た。 収量：0.5g、収率：8％（化合物Ｉ−ｄより） mass(posi):608 吸収極大（メタノール）：639nm 分子吸光係数：90000
【００７４】合成例６：化合物Ｉ−１５〜化合物Ｉ−１
８の合成 化合物Ｉ−１５、化合物Ｉ−１６、化合物Ｉ−１７、及
び化合物Ｉ−１８は化合物Ｉ−１４の製造方法に準じて
合成した。色素構造はマススペクトルおよび吸収スペク
トルで確認した。
８の合成 化合物Ｉ−１５、化合物Ｉ−１６、化合物Ｉ−１７、及
び化合物Ｉ−１８は化合物Ｉ−１４の製造方法に準じて
合成した。色素構造はマススペクトルおよび吸収スペク
トルで確認した。
【００７５】合成例７：化合物Ｉ−１９〜化合物Ｉ−２
３の合成 化合物Ｉ−１４の合成において使用した3-アニリノ−ア
クリルアルデヒドフェニルイミンをグルタコンアルデヒ
ドジアニル誘導体に置き換えて化合物Ｉ−１４と同様の
条件で表題の化合物を合成した。ただし、化合物Ｉ−２
２の合成では最終工程のエステル加水分解において色素
分解が認められたため低収率であった。
３の合成 化合物Ｉ−１４の合成において使用した3-アニリノ−ア
クリルアルデヒドフェニルイミンをグルタコンアルデヒ
ドジアニル誘導体に置き換えて化合物Ｉ−１４と同様の
条件で表題の化合物を合成した。ただし、化合物Ｉ−２
２の合成では最終工程のエステル加水分解において色素
分解が認められたため低収率であった。
【００７６】合成例８：化合物II−１の合成
化合物II−１は下記のルートで合成した。
【化２１】
【００７７】化合物II−１ａ(12.4 g, 0.1 mol)とプロ
パンサルトン(12.2 g, 0.1 mol)をトルエン30 mlに溶解
し、4時間加熱還流を行って反応液に析出する４級塩を
ろ取した（定量的）。その全量にアセトニトリル(100 m
l)、 N,N'-ジフェニルホルムアミジン(19.6 g, 0.1 mo
l)、無水酢酸(10.2 g, 0.1 mol)を加え、４時間加熱還
流を行ってアニル体（収率９６％）を得た。 アニル体
(0.35 g, 1 mmol)と化合物Ｉ−１ｃ(0.38 g, 1 mmol)を
DMF(5 ml)に溶解しトリエチルアミン(0.5 ml)および無
水酢酸(0.5 ml)を加え、60℃で1時間反応させた。反応
液に酢酸エチル(50 ml)を加えるとエチルエステル体の
結晶が析出した。そのエチルエステル体をクロロホルム
とメタノールの混合溶媒から再結晶した。次にメタノー
ル(10 ml)と５%水酸化リチウム水溶液(5 ml)によりエス
テル加水分解を行い（室温、２時間）、メタノールより
再結晶を行って化合物II−１を得た。 mass(posi):530 吸収極大（メタノール）：561nm 分子吸光係数：125000
パンサルトン(12.2 g, 0.1 mol)をトルエン30 mlに溶解
し、4時間加熱還流を行って反応液に析出する４級塩を
ろ取した（定量的）。その全量にアセトニトリル(100 m
l)、 N,N'-ジフェニルホルムアミジン(19.6 g, 0.1 mo
l)、無水酢酸(10.2 g, 0.1 mol)を加え、４時間加熱還
流を行ってアニル体（収率９６％）を得た。 アニル体
(0.35 g, 1 mmol)と化合物Ｉ−１ｃ(0.38 g, 1 mmol)を
DMF(5 ml)に溶解しトリエチルアミン(0.5 ml)および無
水酢酸(0.5 ml)を加え、60℃で1時間反応させた。反応
液に酢酸エチル(50 ml)を加えるとエチルエステル体の
結晶が析出した。そのエチルエステル体をクロロホルム
とメタノールの混合溶媒から再結晶した。次にメタノー
ル(10 ml)と５%水酸化リチウム水溶液(5 ml)によりエス
テル加水分解を行い（室温、２時間）、メタノールより
再結晶を行って化合物II−１を得た。 mass(posi):530 吸収極大（メタノール）：561nm 分子吸光係数：125000
【００７８】合成例９：化合物II−２〜化合物II−１７
の合成 化合物II−２から化合物II−１７はこれまでに例示した
方法に準じて合成した。色素構造はマススペクトルおよ
び吸収スペクトルで確認した。表４に各化合物のメタノ
ール中での吸収特性を示す。
の合成 化合物II−２から化合物II−１７はこれまでに例示した
方法に準じて合成した。色素構造はマススペクトルおよ
び吸収スペクトルで確認した。表４に各化合物のメタノ
ール中での吸収特性を示す。
【００７９】
【表４】
【００８０】合成例１０：化合物III−１の合成
上記に示した化合物II−１の合成において、出発原料の
II−１ａを3-メチル-ベンゾ[d]イソオキサゾールに置き
換えることで化合物II−１と同様の反応条件により化合
物III−１を得た。 mass(posi):636 吸収極大（メタノール）：549nm 分子吸光係数：145000
II−１ａを3-メチル-ベンゾ[d]イソオキサゾールに置き
換えることで化合物II−１と同様の反応条件により化合
物III−１を得た。 mass(posi):636 吸収極大（メタノール）：549nm 分子吸光係数：145000
【００８１】合成例１１：化合物III−３の合成
Can.J.Chem., 66, 1405-1409 (1988)に記載の方法に従
い、3-メチル-ベンゾ[d]イソチアゾールを合成し、III
−１と同様に合成した。 mass(nega):747 吸収極大（メタノール）：555nm 分子吸光係数：145000
い、3-メチル-ベンゾ[d]イソチアゾールを合成し、III
−１と同様に合成した。 mass(nega):747 吸収極大（メタノール）：555nm 分子吸光係数：145000
【００８２】合成例１２：化合物III−５の合成
上記に示した化合物II−１の合成において、出発原料の
II−１ａをAldrich社製２−メチル−１−ピロリンに置
き換えることで化合物II−１と同様の反応条件により化
合物III−５を得た。 mass(posi):586 吸収極大（メタノール）：520nm 分子吸光係数：110000
II−１ａをAldrich社製２−メチル−１−ピロリンに置
き換えることで化合物II−１と同様の反応条件により化
合物III−５を得た。 mass(posi):586 吸収極大（メタノール）：520nm 分子吸光係数：110000
【００８３】（蛍光強度の比較）本発明の色素の励起波
長と蛍光強度を下記に示す従来の色素と比較した。溶媒
はメタノールを用い、色素濃度は1.0×10-6Mとした。測
定は島津製作所製分光蛍光光度計RF-5300PCを使用し
た。結果を表５から表７に示す。表から明らかなよう
に、本発明の色素は蛍光強度が強く、特に表５及び表６
に示した色素においては従来色素と際立った差を有して
いることがわかる。
長と蛍光強度を下記に示す従来の色素と比較した。溶媒
はメタノールを用い、色素濃度は1.0×10-6Mとした。測
定は島津製作所製分光蛍光光度計RF-5300PCを使用し
た。結果を表５から表７に示す。表から明らかなよう
に、本発明の色素は蛍光強度が強く、特に表５及び表６
に示した色素においては従来色素と際立った差を有して
いることがわかる。
【００８４】
【化２２】
【００８５】
【表５】
【００８６】
【表６】
【００８７】
【表７】
【００８８】実施例１：化合物I-1-dUTP結合体の合成
5 mg(2.5部)の化合物Ｉ−１を0.1Mの MES緩衝液2mlに溶
解し、WSC塩酸塩3.66mg(5部)及びSulfo-NHS 4.20mg(5
部)を加え室温で15分間攪拌した。これに、アミノアリ
ル-dUTP(Sigma)2.2mgを200μlの0.1MのMESに溶解して添
加し、室温で2時間反応させた。1MのTris緩衝液(pH7.5)
100μlを加え反応を停止させた後、8gのODSシリカ(YMC-
ODS-AQ 120A)を充填したカラムに吸着させ、30%メタノ
ール水溶液で溶離した。溶離液を濃縮後さらに中圧分取
クロマトグラフィー(YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B)
により精製し純度95%の目的物を得た(収率71%)。 MS分析値：M- 1072
解し、WSC塩酸塩3.66mg(5部)及びSulfo-NHS 4.20mg(5
部)を加え室温で15分間攪拌した。これに、アミノアリ
ル-dUTP(Sigma)2.2mgを200μlの0.1MのMESに溶解して添
加し、室温で2時間反応させた。1MのTris緩衝液(pH7.5)
100μlを加え反応を停止させた後、8gのODSシリカ(YMC-
ODS-AQ 120A)を充填したカラムに吸着させ、30%メタノ
ール水溶液で溶離した。溶離液を濃縮後さらに中圧分取
クロマトグラフィー(YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B)
により精製し純度95%の目的物を得た(収率71%)。 MS分析値：M- 1072
【００８９】
【化２３】
【００９０】実施例２：化合物Ｉ-14-dUTP結合体の合成
5.5 mg(2.5部)の化合物Ｉ−１４を200μlのDMSOに溶解
し、WSC塩酸塩3.1 mg (5部)及びSulfo-NHS 3.55 mg(5
部)を加え室温で15分間攪拌した。これに、2 mlの0.1M
MESに溶解したアミノアリル-dUTP(Sigma)2.2 mgを添
加し、室温で2時間反応させた。1MのTris緩衝液(pH7.5)
100μlを加え反応を停止させた後、8gのODSシリカ(YMC-
ODS-AQ 120A)を充填したカラムに吸着させ、45%メタノ
ール水溶液で溶離した。溶離液を濃縮後さらに中圧分取
クロマトグラフィー(YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B)
により精製し純度94%の目的物を得た(収率68%)。 MS分析値：M- 1098
し、WSC塩酸塩3.1 mg (5部)及びSulfo-NHS 3.55 mg(5
部)を加え室温で15分間攪拌した。これに、2 mlの0.1M
MESに溶解したアミノアリル-dUTP(Sigma)2.2 mgを添
加し、室温で2時間反応させた。1MのTris緩衝液(pH7.5)
100μlを加え反応を停止させた後、8gのODSシリカ(YMC-
ODS-AQ 120A)を充填したカラムに吸着させ、45%メタノ
ール水溶液で溶離した。溶離液を濃縮後さらに中圧分取
クロマトグラフィー(YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B)
により精製し純度94%の目的物を得た(収率68%)。 MS分析値：M- 1098
【００９１】実施例３：化合物II-1-dUTP結合体の合成
6.00 mg(2.5部)の化合物II-1を200μlのDMSOに溶解し、
WSC塩酸塩3.1 mg(5部)及びSulfo-NHS 3.55 mg(5部)を
加え室温で30分間攪拌した。これに、2 mlの0.1MMESに
溶解したアミノアリル-dUTP(Sigma) 2.2 mgを添加し、
室温で2時間反応させた。1MのTris緩衝液(pH7.5) 100μ
lを加え反応を停止させた後、8 gのODSシリカ(YMC-ODS-
AQ 120A)を充填したカラムに吸着させ、50%メタノール
水溶液で溶離した。溶離液を濃縮後さらに中圧分取クロ
マトグラフィー(YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B)により
精製し純度92%の目的物を得た(収率74%)。 MS分析値：M- 1036
WSC塩酸塩3.1 mg(5部)及びSulfo-NHS 3.55 mg(5部)を
加え室温で30分間攪拌した。これに、2 mlの0.1MMESに
溶解したアミノアリル-dUTP(Sigma) 2.2 mgを添加し、
室温で2時間反応させた。1MのTris緩衝液(pH7.5) 100μ
lを加え反応を停止させた後、8 gのODSシリカ(YMC-ODS-
AQ 120A)を充填したカラムに吸着させ、50%メタノール
水溶液で溶離した。溶離液を濃縮後さらに中圧分取クロ
マトグラフィー(YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B)により
精製し純度92%の目的物を得た(収率74%)。 MS分析値：M- 1036
【００９２】実施例４：化合物II-12-dUTP結合体の合成
3.27 mg(1.0部)の化合物II-12を200μlのDMSOに溶解
し、これに2 mlの0.1MのMESに溶解したアミノアリル-dU
TP(Sigma)2.2 mgを添加し、室温で2時間反応させた。1M
のTris緩衝液(pH7.5)100μlを加え反応を停止させた
後、8gのODSシリカ(YMC-ODS-AQ 120A)を充填したカラム
に吸着させ、40%メタノール水溶液で溶離した。溶離液
を濃縮後さらに中圧分取クロマトグラフィー(YAMAZEN
Ultrapack ODS-S-40B)により精製し純度95%の目的物を
得た。(収率77%) MS分析値：M- 1062
し、これに2 mlの0.1MのMESに溶解したアミノアリル-dU
TP(Sigma)2.2 mgを添加し、室温で2時間反応させた。1M
のTris緩衝液(pH7.5)100μlを加え反応を停止させた
後、8gのODSシリカ(YMC-ODS-AQ 120A)を充填したカラム
に吸着させ、40%メタノール水溶液で溶離した。溶離液
を濃縮後さらに中圧分取クロマトグラフィー(YAMAZEN
Ultrapack ODS-S-40B)により精製し純度95%の目的物を
得た。(収率77%) MS分析値：M- 1062
【００９３】実施例５：化合物III-1-dUTP結合体の合成
1.00 mg(1.0部)の化合物III-1を300μlの0.1M MESに溶
解し、これに0.25 mg（0.4部）のアミノアリル-dUTP(Si
gma)を加え、さらに1M炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）３００
μｌを添加して室温で一晩反応させた。1MのTris緩衝液
(pH7.5) 100μlを加え反応を停止させた後、中圧分取ク
ロマトグラフィー(YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B)に
より精製し純度90%の目的物を得た。(収率62%) MS分析値：M- 1044
解し、これに0.25 mg（0.4部）のアミノアリル-dUTP(Si
gma)を加え、さらに1M炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）３００
μｌを添加して室温で一晩反応させた。1MのTris緩衝液
(pH7.5) 100μlを加え反応を停止させた後、中圧分取ク
ロマトグラフィー(YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B)に
より精製し純度90%の目的物を得た。(収率62%) MS分析値：M- 1044
【００９４】実施例６：化合物III-7-dUTP結合体の合成
1.00 mg(1.0部)の化合物III-7を300μlの0.1M MESに溶
解し、これに0.66 mg（1.0部）のアミノアリル-dUTP(Si
gma)を加え、さらに1M炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）３００
μｌを添加して室温で一晩反応させた。1MのTris緩衝液
(pH7.5)100μlを加え反応を停止させた後、中圧分取ク
ロマトグラフィー(YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B)に
より精製し純度96%の目的物を得た。(収率44%) MS分析値：M- 1070
解し、これに0.66 mg（1.0部）のアミノアリル-dUTP(Si
gma)を加え、さらに1M炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）３００
μｌを添加して室温で一晩反応させた。1MのTris緩衝液
(pH7.5)100μlを加え反応を停止させた後、中圧分取ク
ロマトグラフィー(YAMAZEN Ultrapack ODS-S-40B)に
より精製し純度96%の目的物を得た。(収率44%) MS分析値：M- 1070
【００９５】使用例１：転写反応を用いた蛍光標識ＤＮ
Ａプローブの作製 ヒト肝臓ｍＲＮＡ（Clontech社）（０．５μｇ）および
オリゴｄＴプライマー（ｄＴ18-21、 Gibco BRL）
（０．５μｇ）を混合し、７０℃で１０分間加熱した
後、氷上で急冷した。この混合物に、ＲＮａｓｅＯＵＴ
（Gibco BRL）（４０Ｕ）、ｄＡＴＰ（５００μＭ）、
ｄＧＴＰ（５００μＭ）、ｄＣＴＰ（５００μＭ）、ｄ
ＴＴＰ（２００μＭ）、実施例１で得た化合物Ｉ-1-dUT
P結合体（１００μＭ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ
逆転写酵素(Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ)（４００Ｕ）、ＤＥＰ
Ｃ処理水（全量２０μｌになる量）を添加し、４２℃で
２時間反応させた。反応終了後、ＥＤＴＡ及びＮａＯＨ
を添加し６５℃で１時間インキュベートすることで、反
応の停止とｍＲＮＡの分解を行った。反応液をＣｅｎｔ
ｒｉＳｅｐカラム(ＰＲＩＮＣＥＴＯＮ ＳＥＰＡＲＡ
ＴＩＯＮ，ＩＮＣ)に通し、未反応の化合物Ｉ-1-dUTP結
合体などを除去して精製した。
Ａプローブの作製 ヒト肝臓ｍＲＮＡ（Clontech社）（０．５μｇ）および
オリゴｄＴプライマー（ｄＴ18-21、 Gibco BRL）
（０．５μｇ）を混合し、７０℃で１０分間加熱した
後、氷上で急冷した。この混合物に、ＲＮａｓｅＯＵＴ
（Gibco BRL）（４０Ｕ）、ｄＡＴＰ（５００μＭ）、
ｄＧＴＰ（５００μＭ）、ｄＣＴＰ（５００μＭ）、ｄ
ＴＴＰ（２００μＭ）、実施例１で得た化合物Ｉ-1-dUT
P結合体（１００μＭ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ
逆転写酵素(Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ)（４００Ｕ）、ＤＥＰ
Ｃ処理水（全量２０μｌになる量）を添加し、４２℃で
２時間反応させた。反応終了後、ＥＤＴＡ及びＮａＯＨ
を添加し６５℃で１時間インキュベートすることで、反
応の停止とｍＲＮＡの分解を行った。反応液をＣｅｎｔ
ｒｉＳｅｐカラム(ＰＲＩＮＣＥＴＯＮ ＳＥＰＡＲＡ
ＴＩＯＮ，ＩＮＣ)に通し、未反応の化合物Ｉ-1-dUTP結
合体などを除去して精製した。
【００９６】比較用として、化合物Ｉ-1-dUTP結合体の
代わりに色素（Ｃｙ３）で標識した比較用の蛍光ヌクレ
オチド（Cy3-AP3-dUTP；Amersham pharmacia biotech）
を使用して上記と同様に逆転写反応を行い、反応物を精
製した。精製後の反応液をそれぞれアガロースゲル電気
泳動し、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で染色後ＦＬＡ２０００(富士写真
フイルム製)でスキャンした。その結果、本発明の化合
物Ｉ-1-dUTP結合体を使用した方が蛍光強度が強く、よ
り鮮明に検出できることが判明した。また、蛍光光度計
で蛍光強度を測定し、２６０ｎｍの吸光度よりＤＮＡ量
を測定し、それらの結果から計算した取り込み率及びプ
ローブ１μＭ当たりの蛍光強度を計算した。これらの結
果を表８に示す。表８から分かるように、本発明の化合
物Ｉ-1-dUTP結合体を使用した場合の方が取り込み率お
よび蛍光強度が高かった。
代わりに色素（Ｃｙ３）で標識した比較用の蛍光ヌクレ
オチド（Cy3-AP3-dUTP；Amersham pharmacia biotech）
を使用して上記と同様に逆転写反応を行い、反応物を精
製した。精製後の反応液をそれぞれアガロースゲル電気
泳動し、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で染色後ＦＬＡ２０００(富士写真
フイルム製)でスキャンした。その結果、本発明の化合
物Ｉ-1-dUTP結合体を使用した方が蛍光強度が強く、よ
り鮮明に検出できることが判明した。また、蛍光光度計
で蛍光強度を測定し、２６０ｎｍの吸光度よりＤＮＡ量
を測定し、それらの結果から計算した取り込み率及びプ
ローブ１μＭ当たりの蛍光強度を計算した。これらの結
果を表８に示す。表８から分かるように、本発明の化合
物Ｉ-1-dUTP結合体を使用した場合の方が取り込み率お
よび蛍光強度が高かった。
【００９７】
【表８】
【００９８】使用例２：ＰＣＲ法による蛍光色素ラベル
化ＤＮＡプローブの作製 ＰＣＲ反応液の組成： 鋳型ＤＮＡ：１０ｐｇ プライマー１および２：各０．５μＭ ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ：各２００μＭ ｄＴＴＰ：各１５０μＭ 化合物II-1-dUTP結合体またはCy3-AP3-dUTP：５０μＭ Pyrobest DNA polymerase （ＴＡＫＡＲＡ）：０．５ｕ
ｎｉｔ 減菌水：全量で２０μｌ（注：鋳型ＤＮＡとしては、PC
R-ScriptTMＳＫ（＋）（STRATAGENE社）にα-2-HS-グリ
コプロテイン遺伝子を組み込んだものを使用し、プライ
マー１および２の配列は各々配列表１および２に示す）
化ＤＮＡプローブの作製 ＰＣＲ反応液の組成： 鋳型ＤＮＡ：１０ｐｇ プライマー１および２：各０．５μＭ ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ：各２００μＭ ｄＴＴＰ：各１５０μＭ 化合物II-1-dUTP結合体またはCy3-AP3-dUTP：５０μＭ Pyrobest DNA polymerase （ＴＡＫＡＲＡ）：０．５ｕ
ｎｉｔ 減菌水：全量で２０μｌ（注：鋳型ＤＮＡとしては、PC
R-ScriptTMＳＫ（＋）（STRATAGENE社）にα-2-HS-グリ
コプロテイン遺伝子を組み込んだものを使用し、プライ
マー１および２の配列は各々配列表１および２に示す）
【００９９】上記組成液をＰＣＲ反応液として使用し、
９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒のサ
イクルを３０サイクル行い、ＰＣＲ反応を行った。反応
液をＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラム(ＰＲＩＮＣＥＴＯＮ
ＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮ，ＩＮＣ)に通し、未反応の蛍光
ヌクレオチドなどを除去し、生成物を精製した。精製後
の反応液をアガロースゲル電気泳動し、ＳＹＢＲ Ｇｒ
ｅｅｎＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で染
色後ＦＬＡ２０００(富士写真フイルム製)でスキャンし
た。その結果、本発明の化合物II-1-dUTP結合体を使用
した方が蛍光強度が強く、より鮮明に検出できることが
判明した。また、蛍光光度計で蛍光強度を測定し、２６
０ｎｍの吸光度よりＤＮＡ量を測定し、それらの結果か
ら計算した取り込み率及びプローブ１μＭ当たりの蛍光
強度を計算した。これらの結果を表９に示す。表９から
分かるように、本発明の化合物II-1-dUTP結合体を使用
した場合の方が取り込み率および蛍光強度が高かった。
９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒のサ
イクルを３０サイクル行い、ＰＣＲ反応を行った。反応
液をＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラム(ＰＲＩＮＣＥＴＯＮ
ＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮ，ＩＮＣ)に通し、未反応の蛍光
ヌクレオチドなどを除去し、生成物を精製した。精製後
の反応液をアガロースゲル電気泳動し、ＳＹＢＲ Ｇｒ
ｅｅｎＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で染
色後ＦＬＡ２０００(富士写真フイルム製)でスキャンし
た。その結果、本発明の化合物II-1-dUTP結合体を使用
した方が蛍光強度が強く、より鮮明に検出できることが
判明した。また、蛍光光度計で蛍光強度を測定し、２６
０ｎｍの吸光度よりＤＮＡ量を測定し、それらの結果か
ら計算した取り込み率及びプローブ１μＭ当たりの蛍光
強度を計算した。これらの結果を表９に示す。表９から
分かるように、本発明の化合物II-1-dUTP結合体を使用
した場合の方が取り込み率および蛍光強度が高かった。
【０１００】
【表９】
【０１０１】
【発明の効果】本発明の蛍光ヌクレオチドは、ＤＮＡ合
成の際の取り込み率および取り込み後の蛍光強度に優れ
ており、核酸の標識物質として有用である。
成の際の取り込み率および取り込み後の蛍光強度に優れ
ており、核酸の標識物質として有用である。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Fuji Photo Film Co. Ltd.
<120> Fluorescent nucleotide and method for labeling by using the same
<130> A11318M
<160> 2
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
tggccgcctt caacgctcag 20
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
tcaggcactt tcattaacag gcacat 26
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ０７Ｈ 21/02 Ｃ０７Ｈ 21/02
21/04 21/04 Ｂ
Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ
Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ
Ｇ０１Ｎ 33/53 33/533
33/533 33/566
33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(72)発明者 竹内 和也
神奈川県南足柄市中沼210番地 富士写真
フイルム株式会社内
(72)発明者 猪股 弘子
埼玉県朝霞市泉水３丁目11番46号 富士写
真フイルム株式会社朝霞研究所内
(72)発明者 小島 政芳
埼玉県朝霞市泉水３丁目11番46号 富士写
真フイルム株式会社朝霞研究所内
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA09 CA20 HA08
HA13
4B063 QA01 QQ41 QR31 QR41 QR56
QR62 QR66 QS34 QS36 QX02
4C057 AA18 DD01 LL09 LL10 LL14
LL17 LL18 LL19 LL21 LL22
LL29 LL33 LL40 LL41 LL42
LL44 LL45 MM01 MM02 MM04
4C065 AA04 BB04 CC01 DD02 EE02
HH01 JJ01 KK06 KK09 LL01
PP05
4C072 AA01 BB02 CC02 CC11 CC16
EE03 EE13 GG01 HH07 MM02
UU10
Claims (16)
- 【請求項１】 式：Ｘ−Ｙ−Ｚ ［式中、Ｘは天然又は非天然のヌクレオチド、オリゴヌ
クレオチド又はポリヌクレオチドあるいはそれらの誘導
体の残基を示し、上記残基中の塩基部分でＹと結合し；
Ｙは２価の連結基又は単結合を示し；Ｚは下記の一般式
（Ｉ）： 【化１】 （式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ4はそれぞれ独立に置換
もしくは無置換のアルキル基を示し、Ｒ3及びＲ4は互い
に連結して飽和又は不飽和の環を形成してもよく；
Ｖ1、Ｖ2、Ｖ3、Ｖ4、Ｖ5、及びＶ6は水素原子又は置換
基を示し、Ｖ1とＶ2、Ｖ2とＶ3、Ｖ4とＶ5、及び／又は
Ｖ5とＶ6は互いに連結して飽和又は不飽和の環を形成し
てもよく；Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ6、及びＬ7は
それぞれ独立に置換又は無置換のメチン基を示し；Ｗは
酸素原子、硫黄原子、−Ｃ(Ｒ3)(Ｒ4)−又は−Ｎ(Ｒ5)
−、（Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5はそれぞれ独立に置換若しく
は無置換のアルキル基を示す）を示し；Ｑは窒素原子又
は−Ｃ(Ｖ7)−（Ｖ7は水素原子又は一価の置換基を示
し、Ｖ6と互いに連結して飽和又は不飽和の環を形成し
てもよい）を示し；Ｍは対イオンを示し；mは分子の電
荷を中和するのに必要な数を示し；ｓは０又は１を示
し；ｔは０又は１を示し；ｕは０又は１を示す）で表さ
れる化合物；下記の一般式（II）： 【化２】 （式中、 Ｖ1、Ｖ2、Ｖ3、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｌ1、
Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ6、Ｌ7、Ｗ、Ｍ、ｍ、ｓ、ｔ、
及びｕは上記定義と同義であり；Ｖ8は水素原子又は一
価の置換基を示すが、Ｗが−Ｎ(Ｒ5)−又は−Ｃ(Ｒ3)
(Ｒ4)−の場合にはＶ8はＷ上の置換基と連結して飽和又
は不飽和の環を形成してもよい）で表される化合物；又
は下記の一般式（III）： 【化３】 （式中、 Ｖ1、Ｖ2、Ｖ3、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｌ1、
Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ6、Ｌ7、Ｗ、Ｍ、ｍ、ｓ、ｔ、
及びｕは上記定義と同義であり；Ｅは窒素原子又は−Ｃ
(Ｒ6)＝（Ｒ6は水素原子又は一価の置換基を示す）を示
し；Ｖ9は水素原子又は一価の置換基を示すが、Ｖ9はＲ
6と連結して飽和又は不飽和の環を形成してもよい）で
表される化合物から誘導される１価の基であり、Ｒ1又
はＲ2中に存在する反応性基でＹと結合する］で表され
る蛍光ヌクレオチド。 - 【請求項２】 Ｒ1及びＲ2のうち少なくとも一つがＹ中
の活性エステル基（該活性エステル基はアミノ基、ヒド
ロキシル基、又はチオール基と共有結合し得る）で置換
されたアルキル基である請求項１に記載の蛍光ヌクレオ
チド。 - 【請求項３】 Ｒ1及びＲ2のうち少なくとも一つがＹ中
のカルボキシル基で置換されたアルキル基である請求項
１又は２に記載の蛍光ヌクレオチド。 - 【請求項４】 Ｘがヌクレオチドあるいはそれらの誘導
体の残基である、請求項１から３のいずれか１項に記載
の蛍光ヌクレオチド。 - 【請求項５】 Ｘが（１）ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、Ｇ
ＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴＰ、ＣＭＰ、ＣＤＰ、ＣＴＰ、ＵＭ
Ｐ、ＵＤＰ ＵＴＰ、ＴＭＰ、ＴＤＰ、ＴＴＰ、２−Ｍ
ｅ−ＡＭＰ、２−Ｍｅ−ＡＤＰ、２−Ｍｅ−ＡＴＰ、１
−Ｍｅ−ＧＭＰ、１−Ｍｅ−ＧＤＰ、１−Ｍｅ−ＧＴ
Ｐ、５−Ｍｅ−ＣＭＰ、５−Ｍｅ−ＣＤＰ、５−Ｍｅ−
ＣＴＰ、５−ＭｅＯ−ＣＭＰ、５−ＭｅＯ−ＣＤＰ、５
−ＭｅＯ−ＣＴＰ（Ｍｅはメチル基、ＭｅＯはメトキシ
基を示し、Ｍｅ又はＭｅＯの前の数字は置換位置を示
す）からなる群から選ばれるヌクレオチド、（２）上記
の（１）に記載のヌクレオチドに対応するデオキシヌク
レオチド及びジデオキシヌクレオチドからなる群から選
ばれるヌクレオチド；及び（３）上記の（１）及び
（２）に記載のヌクレオチドから誘導されるヌクレオチ
ド誘導体からなる群から選ばれるヌクレオチド又はその
誘導体の残基である請求項１から４のいずれか１項に記
載の蛍光ヌクレオチド。 - 【請求項６】 Ｙが−ＣＨ2−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ
≡Ｃ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、又はこ
れらの基の任意の組み合わせからなるなる連結基（該連
結基上の水素原子は他の置換基で置換されていてもよ
い）である請求項１から５のいずれか１項に記載の蛍光
ヌクレオチド。 - 【請求項７】 Ｙがアミノアリル基である請求項１から
５のいずれか１項に記載の蛍光ヌクレオチド。 - 【請求項８】 核酸合成酵素、鋳型核酸、及び請求項１
から７のいずれか１項に記載の蛍光ヌクレオチドを用い
て核酸合成反応を行う工程を含む蛍光標識された核酸の
製造方法。 - 【請求項９】 核酸合成反応が逆転写反応、ターミナル
トランスフェラーゼ反応、ランダムプライム法、ＰＣＲ
法、及びニックトランスレーション法からなる群から選
ばれる１又は２以上の反応である請求項８に記載の方
法。 - 【請求項１０】 請求項１から７のいずれか１項に記載
の蛍光ヌクレオチドで標識された核酸プローブ又はプラ
イマー。 - 【請求項１１】 請求項１０に記載の核酸プローブ又は
プライマーからなる核酸検出用試薬。 - 【請求項１２】 病気の診断に用いるための請求項１１
に記載の試薬。 - 【請求項１３】 核酸検出用キットであって、（１）請
求項１から７のいずれか１項に記載の蛍光ヌクレオチ
ド、（２）核酸合成酵素、及び（３）緩衝液を含むキッ
ト。 - 【請求項１４】 請求項１に記載の一般式（Ｉ）で表さ
れるアザメチン色素。 - 【請求項１５】 請求項２に記載の一般式（II）で表さ
れるアザメチン色素。 - 【請求項１６】 請求項２に記載の一般式（III）で表
されるアザメチン色素。
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007114398A1 (ja) | 2006-03-31 | 2007-10-11 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | ピラゾール系シアニン色素 |
| WO2010126045A1 (ja) | 2009-04-28 | 2010-11-04 | 和光純薬工業株式会社 | 第４級アンモニウムカチオン含有ピラゾール系シアニン色素 |
| CN102414559A (zh) * | 2009-04-28 | 2012-04-11 | 和光纯药工业株式会社 | 使用内标物质的测定方法 |
| WO2018043150A1 (ja) * | 2016-08-29 | 2018-03-08 | 富士フイルム株式会社 | 発色組成物、平版印刷版原版、平版印刷版の作製方法、及び、化合物 |
| JPWO2021215514A1 (ja) * | 2020-04-24 | 2021-10-28 |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1781675B1 (en) | 2004-08-13 | 2014-03-26 | Epoch Biosciences, Inc. | Phosphonate fluorescent dyes and conjugates |
| WO2011028533A2 (en) * | 2009-08-24 | 2011-03-10 | Perkinelmer Health Sciences, Inc. | Methods for detecting dna methylation using encoded particles |
| WO2012054784A1 (en) | 2010-10-20 | 2012-04-26 | Li-Cor, Inc. | Fluorescent imaging with substituted cyanine dyes |
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| CA2912666A1 (en) * | 2013-05-28 | 2014-12-04 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Detection of hydroxymethylcytosine bases |
| JP2021520424A (ja) * | 2018-03-21 | 2021-08-19 | エコール・ポリテクニーク・フェデラル・ドゥ・ローザンヌ（ウペエフエル）Ｅｃｏｌｅ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｑｕｅ Ｆｅｄｅｒａｌｅ ｄｅ Ｌａｕｓａｎｎｅ （ＥＰＦＬ） | アザシアニン色素及びその使用 |
| US10633542B2 (en) | 2018-03-21 | 2020-04-28 | Ecole polytechnique fédérale de Lausanne (EPFL) | Azacyanine dyes and use thereof |
| CN111560026B (zh) * | 2020-05-11 | 2021-08-27 | 苏州大学 | 高光学稳定性细胞膜荧光标记物及其制备方法与应用 |
| CN115286627A (zh) * | 2022-06-24 | 2022-11-04 | 大连理工大学 | 一类氮杂吲哚半花菁类染料、其合成方法和应用 |
| WO2024170742A1 (en) | 2023-02-17 | 2024-08-22 | Danmarks Tekniske Universitet | Copolymer-drug conjugate for treatment of tumours |
Citations (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB870753A (en) * | 1957-07-04 | 1961-06-21 | Ilford Ltd | Improvements in or relating to methine dyes |
| JPH01280750A (ja) * | 1988-05-07 | 1989-11-10 | Konica Corp | ハロゲン化銀写真感光材料 |
| JPH0480747A (ja) * | 1990-07-23 | 1992-03-13 | Konica Corp | ハロゲン化銀写真感光材料の処理方法 |
| JPH06122696A (ja) * | 1992-10-12 | 1994-05-06 | Canon Inc | Ｄｎａ（ｒｎａ）プローブ用モノヌクレオチド類似色素およびｄｎａ（ｒｎａ）プローブ |
| JPH0727768A (ja) * | 1993-07-08 | 1995-01-31 | Canon Inc | 色素標識化核酸プローブの製造方法及び該核酸プローブ形成用中間体 |
| JPH0859689A (ja) * | 1994-07-18 | 1996-03-05 | Becton Dickinson & Co | 共有シアニン染料オリゴヌクレオチド結合体 |
| JPH09124599A (ja) * | 1995-01-30 | 1997-05-13 | Doujin Kagaku Kenkyusho:Kk | インドシアニン化合物 |
| JPH09127115A (ja) * | 1995-01-30 | 1997-05-16 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | 診断用マーカー |
| WO1998030992A2 (en) * | 1997-01-10 | 1998-07-16 | Li-Cor, Inc. | Fluorescent cyanine dyes |
| WO1998058942A1 (en) * | 1997-06-20 | 1998-12-30 | Amersham Pharmacia Biotech Inc. | Non-sulfonated cyanine dyes for labeling nucleosides and nucleotides |
| WO1999037717A1 (en) * | 1998-01-23 | 1999-07-29 | The Perkin-Elmer Corporation | Asymmetric cyanine dye quenchers |
| WO1999040223A1 (en) * | 1998-02-04 | 1999-08-12 | Amersham Pharmacia Biotech, Inc. | Dideoxy dye terminators |
| WO2001021624A1 (fr) * | 1999-09-20 | 2001-03-29 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Composes destines au marquage par fluorescence |
| JP2001163895A (ja) * | 1999-12-07 | 2001-06-19 | Fuji Photo Film Co Ltd | 蛍光ヌクレオチド |
| WO2002026891A1 (en) * | 2000-09-29 | 2002-04-04 | Molecular Probes, Inc. | Modified carbocyanine dyes and their conjugates |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4711955A (en) | 1981-04-17 | 1987-12-08 | Yale University | Modified nucleotides and methods of preparing and using same |
| US5569587A (en) | 1986-04-18 | 1996-10-29 | Carnegie Mellon University | Method for labeling and detecting materials employing luminescent arysulfonate cyanine dyes |
| DE3912046B4 (de) | 1988-09-02 | 2004-03-25 | Carnegie Mellon University | Verfahren zum Markieren einer Komponente einer wäßrigen Flüssigkeit und lumineszenzphotostabiles Reaktionsprodukt |
| JP2961549B2 (ja) * | 1989-11-01 | 1999-10-12 | コニカ株式会社 | シアニン染料及びこれを含有する光学記録媒体 |
-
2001
- 2001-07-19 JP JP2001219211A patent/JP4676654B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-07-17 US US10/196,223 patent/US7087744B2/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB870753A (en) * | 1957-07-04 | 1961-06-21 | Ilford Ltd | Improvements in or relating to methine dyes |
| JPH01280750A (ja) * | 1988-05-07 | 1989-11-10 | Konica Corp | ハロゲン化銀写真感光材料 |
| JPH0480747A (ja) * | 1990-07-23 | 1992-03-13 | Konica Corp | ハロゲン化銀写真感光材料の処理方法 |
| JPH06122696A (ja) * | 1992-10-12 | 1994-05-06 | Canon Inc | Ｄｎａ（ｒｎａ）プローブ用モノヌクレオチド類似色素およびｄｎａ（ｒｎａ）プローブ |
| JPH0727768A (ja) * | 1993-07-08 | 1995-01-31 | Canon Inc | 色素標識化核酸プローブの製造方法及び該核酸プローブ形成用中間体 |
| JPH0859689A (ja) * | 1994-07-18 | 1996-03-05 | Becton Dickinson & Co | 共有シアニン染料オリゴヌクレオチド結合体 |
| JPH09124599A (ja) * | 1995-01-30 | 1997-05-13 | Doujin Kagaku Kenkyusho:Kk | インドシアニン化合物 |
| JPH09127115A (ja) * | 1995-01-30 | 1997-05-16 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | 診断用マーカー |
| WO1998030992A2 (en) * | 1997-01-10 | 1998-07-16 | Li-Cor, Inc. | Fluorescent cyanine dyes |
| WO1998058942A1 (en) * | 1997-06-20 | 1998-12-30 | Amersham Pharmacia Biotech Inc. | Non-sulfonated cyanine dyes for labeling nucleosides and nucleotides |
| WO1999037717A1 (en) * | 1998-01-23 | 1999-07-29 | The Perkin-Elmer Corporation | Asymmetric cyanine dye quenchers |
| WO1999040223A1 (en) * | 1998-02-04 | 1999-08-12 | Amersham Pharmacia Biotech, Inc. | Dideoxy dye terminators |
| WO2001021624A1 (fr) * | 1999-09-20 | 2001-03-29 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Composes destines au marquage par fluorescence |
| JP2001163895A (ja) * | 1999-12-07 | 2001-06-19 | Fuji Photo Film Co Ltd | 蛍光ヌクレオチド |
| WO2002026891A1 (en) * | 2000-09-29 | 2002-04-04 | Molecular Probes, Inc. | Modified carbocyanine dyes and their conjugates |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007114398A1 (ja) | 2006-03-31 | 2007-10-11 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | ピラゾール系シアニン色素 |
| JP5391691B2 (ja) * | 2006-03-31 | 2014-01-15 | 和光純薬工業株式会社 | ピラゾール系シアニン色素 |
| JP2014012846A (ja) * | 2006-03-31 | 2014-01-23 | Wako Pure Chem Ind Ltd | ピラゾール系シアニン色素 |
| US8921124B2 (en) | 2006-03-31 | 2014-12-30 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Pyrazole-based cyanine dye |
| WO2010126045A1 (ja) | 2009-04-28 | 2010-11-04 | 和光純薬工業株式会社 | 第４級アンモニウムカチオン含有ピラゾール系シアニン色素 |
| CN102414559A (zh) * | 2009-04-28 | 2012-04-11 | 和光纯药工业株式会社 | 使用内标物质的测定方法 |
| US8546586B2 (en) | 2009-04-28 | 2013-10-01 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Pyrazole-based cyanine dye containing quaternary ammonium cation |
| WO2018043150A1 (ja) * | 2016-08-29 | 2018-03-08 | 富士フイルム株式会社 | 発色組成物、平版印刷版原版、平版印刷版の作製方法、及び、化合物 |
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