JP2003033186A - リボヌクレオペプチドリセプター - Google Patents
リボヌクレオペプチドリセプターInfo
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- JP2003033186A JP2003033186A JP2001223818A JP2001223818A JP2003033186A JP 2003033186 A JP2003033186 A JP 2003033186A JP 2001223818 A JP2001223818 A JP 2001223818A JP 2001223818 A JP2001223818 A JP 2001223818A JP 2003033186 A JP2003033186 A JP 2003033186A
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- ribonucleopeptide
- subunit
- peptide
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Abstract
(57)【要約】
【課題】これまでの人工酵素設計では着目されなかった
天然の酵素の特徴の一つである「協同性の発揮」に注目
して、複数のサブユニットからなる機能性ドメインを合
目的に設計し協同性を発揮することにより、より効率的
に目的とする基質に対して高い分子認識能を提供する分
子認識場を作製すること。 【解決手段】 ペプチドサブユニットと特異的に相互作
用して結合するペプチド結合領域、及び基質と特異的に
結合する領域を形成する基質結合領域を含むＲＮＡサブ
ユニットとペプチドサブユニットの複合体（リボヌクレ
オペプチド）から成るリボヌクレオペプチドリセプタ
ー。
天然の酵素の特徴の一つである「協同性の発揮」に注目
して、複数のサブユニットからなる機能性ドメインを合
目的に設計し協同性を発揮することにより、より効率的
に目的とする基質に対して高い分子認識能を提供する分
子認識場を作製すること。 【解決手段】 ペプチドサブユニットと特異的に相互作
用して結合するペプチド結合領域、及び基質と特異的に
結合する領域を形成する基質結合領域を含むＲＮＡサブ
ユニットとペプチドサブユニットの複合体（リボヌクレ
オペプチド）から成るリボヌクレオペプチドリセプタ
ー。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、高い活性及び基質
選択性を有し、任意の基質に対する結合部位を作成する
ことが可能なリボヌクレオペプチド複合体である、リボ
ヌクレオペプチドリセプターに関する。
選択性を有し、任意の基質に対する結合部位を作成する
ことが可能なリボヌクレオペプチド複合体である、リボ
ヌクレオペプチドリセプターに関する。
【０００２】
【従来の技術】生体内では酵素により多くの化学反応が
温和な条件のもとで、基質特異的に効率よく進行してい
る。この優れた機能を人工的に構築して「任意の基質に
対して、望み通りの化学反応を行う」ことは、化学・生
物学領域における非常に大きな目的である。
温和な条件のもとで、基質特異的に効率よく進行してい
る。この優れた機能を人工的に構築して「任意の基質に
対して、望み通りの化学反応を行う」ことは、化学・生
物学領域における非常に大きな目的である。
【０００３】しかしながら、天然の酵素に匹敵する機能
を作り出すのは難しく、タンパク質や核酸から成る酵素
の三次元構造が数多く解明されて原子レベルで構造と機
能を議論できるようになってきた現在においても、望み
通りの機能を持った三次元構造体の一般的な構築法は確
立されていない。
を作り出すのは難しく、タンパク質や核酸から成る酵素
の三次元構造が数多く解明されて原子レベルで構造と機
能を議論できるようになってきた現在においても、望み
通りの機能を持った三次元構造体の一般的な構築法は確
立されていない。
【０００４】酵素反応の特徴としては、基質特異的で
あること、温和な条件で反応が進行すること、そして
触媒的に機能することが挙げられるが、これらの機能
を支えているのが酵素の「活性中心」である。活性中心
は安定な三次元構造をもったドメインの中にあり、基質
のかたちに適合し、化学反応を効率よく進行させるため
の官能基が配置されていると同時に、化学反応の進行に
従って変化しうる柔らかな構造により形成されている。
あること、温和な条件で反応が進行すること、そして
触媒的に機能することが挙げられるが、これらの機能
を支えているのが酵素の「活性中心」である。活性中心
は安定な三次元構造をもったドメインの中にあり、基質
のかたちに適合し、化学反応を効率よく進行させるため
の官能基が配置されていると同時に、化学反応の進行に
従って変化しうる柔らかな構造により形成されている。
【０００５】即ち、精密な分子認識能を持つ反応場を反
応の各ステップで最適化した柔軟性のある立体構造を設
計することが人工的に酵素を作製するための必要条件で
あると考えられる。
応の各ステップで最適化した柔軟性のある立体構造を設
計することが人工的に酵素を作製するための必要条件で
あると考えられる。
【０００６】天然の酵素では限られたパーツ（アミノ酸
・核酸）を用いて、多くの官能基と疎水的な部分からな
る活性中心を進化させてきたが、「多様な分子種の中か
ら目的に応じた最適なものを選び出す」方法は、今では
生物の進化に任せて何億年もかけなくとも実験室で実現
可能な手法になっている。
・核酸）を用いて、多くの官能基と疎水的な部分からな
る活性中心を進化させてきたが、「多様な分子種の中か
ら目的に応じた最適なものを選び出す」方法は、今では
生物の進化に任せて何億年もかけなくとも実験室で実現
可能な手法になっている。
【０００７】しかしながら、例えば無作為に100アミノ
酸をつなぎあわせたタンパク質の混合物（約103000種
類）から望みの機能を持ったものを選び出すのは非効率
的な方法である。そこで、「活性中心のおおまかなかた
ち」は既知の三次構造を利用してコンピューターにより
分子をデザインする Structure−based design の手法
で設計したのち、構造ドメインの一部を多様化させた分
子種（ライブラリー）中から目的の機能をもった分子を
選び出すコンビナトリアルな手法を組み合わせる、とい
う方法が人工酵素を作る上で有効である。
酸をつなぎあわせたタンパク質の混合物（約103000種
類）から望みの機能を持ったものを選び出すのは非効率
的な方法である。そこで、「活性中心のおおまかなかた
ち」は既知の三次構造を利用してコンピューターにより
分子をデザインする Structure−based design の手法
で設計したのち、構造ドメインの一部を多様化させた分
子種（ライブラリー）中から目的の機能をもった分子を
選び出すコンビナトリアルな手法を組み合わせる、とい
う方法が人工酵素を作る上で有効である。
【０００８】したがって、人工酵素をつくるための第一
段階として、酵素の活性部位をはじめとする既知のタン
パク質や核酸の立体構造をもとにしながら、安定な三次
元構造を形成する新しい活性中心の前駆体、即ち、「機
能性ドメイン前駆体」を持った機能性ドメインのデザイ
ンが重要である。
段階として、酵素の活性部位をはじめとする既知のタン
パク質や核酸の立体構造をもとにしながら、安定な三次
元構造を形成する新しい活性中心の前駆体、即ち、「機
能性ドメイン前駆体」を持った機能性ドメインのデザイ
ンが重要である。
【０００９】コンピューターによるデザイン (Structur
e−based Design) を用いると、望みの機能を持った安
定な三次元構造の前駆体を設計することは可能である。
しかしながら、前駆体の機能を合目的に最適化していく
ために、機能性ドメイン前駆体には予めいくつかの特性
を持たせておくことが必要となる。
e−based Design) を用いると、望みの機能を持った安
定な三次元構造の前駆体を設計することは可能である。
しかしながら、前駆体の機能を合目的に最適化していく
ために、機能性ドメイン前駆体には予めいくつかの特性
を持たせておくことが必要となる。
【００１０】即ち、機能性ドメインへと変換していくた
めには機能性ドメイン前駆体は協同性を発揮するために
柔軟な構造をとり得ること、そしてコンビナトリアルな
手法によって多様な分子種を作製できることが必要であ
る。
めには機能性ドメイン前駆体は協同性を発揮するために
柔軟な構造をとり得ること、そしてコンビナトリアルな
手法によって多様な分子種を作製できることが必要であ
る。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】これまでに、化学反応
中間体の類似化合物に対するモノクローナル抗体を利用
する抗体触媒法や、RNA分子にコンビナトリアルな手法
を応用するRNAアプタマー法を用いて多くの人工リセプ
ターや人工酵素が作製されてきた。しかしながら、これ
らは天然リセプターや酵素に比べて低い活性しか示すこ
とが出来なかった。又、いずれの場合も望みの基質に対
して反応を行う人工酵素を作製するための一般的手法と
しては用いることができない。
中間体の類似化合物に対するモノクローナル抗体を利用
する抗体触媒法や、RNA分子にコンビナトリアルな手法
を応用するRNAアプタマー法を用いて多くの人工リセプ
ターや人工酵素が作製されてきた。しかしながら、これ
らは天然リセプターや酵素に比べて低い活性しか示すこ
とが出来なかった。又、いずれの場合も望みの基質に対
して反応を行う人工酵素を作製するための一般的手法と
しては用いることができない。
【００１２】そこで、本発明者は、これまでの人工酵素
設計では着目されなかった天然の酵素の特徴の一つであ
る「協同性の発揮」に注目して、複数のサブユニットか
らなる機能性ドメインを合目的に設計し協同性を発揮す
ることにより、より効率的に目的とする基質に対して高
い分子認識能を提供する分子認識場を作製することに成
功し、本発明を完成した。
設計では着目されなかった天然の酵素の特徴の一つであ
る「協同性の発揮」に注目して、複数のサブユニットか
らなる機能性ドメインを合目的に設計し協同性を発揮す
ることにより、より効率的に目的とする基質に対して高
い分子認識能を提供する分子認識場を作製することに成
功し、本発明を完成した。
【００１３】即ち、本発明は、ＲＮＡサブユニットとペ
プチドサブユニットの複合体（リボヌクレオペプチド）
から成るリボヌクレオペプチドリセプターに係る。
プチドサブユニットの複合体（リボヌクレオペプチド）
から成るリボヌクレオペプチドリセプターに係る。
【００１４】ＲＮＡサブユニットは、ペプチドサブユニ
ットと特異的に相互作用して結合するペプチド結合領
域、及び基質と特異的に結合する領域を形成する基質結
合領域を含むものである。更に、本発明のリボヌクレオ
ペプチドリセプターにおいて、ＲＮＡサブユニットの基
質結合領域とペプチドサブユニットの両者によって基質
と特異的に結合する領域が形成されていることが好まし
い。
ットと特異的に相互作用して結合するペプチド結合領
域、及び基質と特異的に結合する領域を形成する基質結
合領域を含むものである。更に、本発明のリボヌクレオ
ペプチドリセプターにおいて、ＲＮＡサブユニットの基
質結合領域とペプチドサブユニットの両者によって基質
と特異的に結合する領域が形成されていることが好まし
い。
【００１５】ＲＮＡサブユニットのペプチド結合領域及
びペプチドサブユニットは、ＲＮＡとペプチドとの空間
的配置、分子間の相互作用様式が構造解析により既に解
明されているものから、目的とする基質の種類などに基
づき、当業者が適宜選択することができる。
びペプチドサブユニットは、ＲＮＡとペプチドとの空間
的配置、分子間の相互作用様式が構造解析により既に解
明されているものから、目的とする基質の種類などに基
づき、当業者が適宜選択することができる。
【００１６】一方、ＲＮＡサブユニットの基質結合領域
は、ＲＮＡサブユニットのペプチド結合領域とペプチド
サブユニットとの特異的な相互作用に影響を与えないよ
うな塩基配列を選択する。
は、ＲＮＡサブユニットのペプチド結合領域とペプチド
サブユニットとの特異的な相互作用に影響を与えないよ
うな塩基配列を選択する。
【００１７】例えば、ＲＮＡサブユニットの好適例とし
て、ヒト後天性免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）の逆転写
酵素（Ｒｅｖ）由来のＲＮＡがある。特に、以下の塩基
配列： ggucugggcgca-(N)n-ugacgguacaggcc （塩基配列において(N)nは基質結合領域を示し、「N」
はアデニン、ウラシル、グアニン及びシトシンから任意
に選択される一種類の塩基を示し、「n」は１５〜３０
の整数、好ましくは、２０である）を含むＲＮＡを挙げ
ることができる。
て、ヒト後天性免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）の逆転写
酵素（Ｒｅｖ）由来のＲＮＡがある。特に、以下の塩基
配列： ggucugggcgca-(N)n-ugacgguacaggcc （塩基配列において(N)nは基質結合領域を示し、「N」
はアデニン、ウラシル、グアニン及びシトシンから任意
に選択される一種類の塩基を示し、「n」は１５〜３０
の整数、好ましくは、２０である）を含むＲＮＡを挙げ
ることができる。
【００１８】塩基数が２０である(N)nの例として、以下
の塩基配列を上げることが出来る。 （１）5'-nguguannnnnnnuanncun-3' （２）5'-uggaauggcguacuccnnnn-3' （３）5'-nnuugucnngugguannnnn-3' 上記塩基配列の一端または両端に、ペプチドサブユニッ
トとの相互作用を阻害しない限り、適宜、任意の種類及
び数の塩基を付加することも可能である。
の塩基配列を上げることが出来る。 （１）5'-nguguannnnnnnuanncun-3' （２）5'-uggaauggcguacuccnnnn-3' （３）5'-nnuugucnngugguannnnn-3' 上記塩基配列の一端または両端に、ペプチドサブユニッ
トとの相互作用を阻害しない限り、適宜、任意の種類及
び数の塩基を付加することも可能である。
【００１９】例えば、ペプチドサブユニットの好適例と
して、上記ヒト後天性免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）の
逆転写酵素（Ｒｅｖ）由来のＲＮＡサブユニットと組み
合わせて使用できる、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）
由来のペプチドを挙げることが出来る。特に、以下の１
７個のアミノ酸から成るアミノ酸配列： ＴＲ（Ｘ）２ＲＲＮ（Ｘ）３Ｒ（Ｘ）６ （アミノ酸配列において（Ｘ）は任意に選択されるアミ
ノ酸を示す）を含むペプチドが好ましい。上記アミノ酸
配列の一端または両端に、ＲＮＡサブユニットとの相互
作用を阻害しない限り、適宜、任意の種類及び数のアミ
ノ酸又は酢酸残基（Ａｃ）を付加することも可能であ
る。
して、上記ヒト後天性免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）の
逆転写酵素（Ｒｅｖ）由来のＲＮＡサブユニットと組み
合わせて使用できる、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）
由来のペプチドを挙げることが出来る。特に、以下の１
７個のアミノ酸から成るアミノ酸配列： ＴＲ（Ｘ）２ＲＲＮ（Ｘ）３Ｒ（Ｘ）６ （アミノ酸配列において（Ｘ）は任意に選択されるアミ
ノ酸を示す）を含むペプチドが好ましい。上記アミノ酸
配列の一端または両端に、ＲＮＡサブユニットとの相互
作用を阻害しない限り、適宜、任意の種類及び数のアミ
ノ酸又は酢酸残基（Ａｃ）を付加することも可能であ
る。
【００２０】アデノシントリリン酸（ＡＴＰ）結合性で
ある本発明のリボヌクレオペプチドリセプターの一例と
しては、以下の塩基配列を有するＲＮＡサブユニット： ggucugggcgca-gguguacuggggguauucuc-ugacgguacaggcc 、及び、以下のアミノ酸配列を有するペプチドサブユニ
ット： ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ が好ましい。
ある本発明のリボヌクレオペプチドリセプターの一例と
しては、以下の塩基配列を有するＲＮＡサブユニット： ggucugggcgca-gguguacuggggguauucuc-ugacgguacaggcc 、及び、以下のアミノ酸配列を有するペプチドサブユニ
ット： ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ が好ましい。
【００２１】本発明は、又、インビトロセレクション法
を利用した、本発明リボヌクレオペプチドリセプターの
製造方法に係る。特に、ペプチド結合領域とランダムな
塩基配列を有する基質結合領域が結合したＲＮＡサブユ
ニットを作成し、該ＲＮＡサブユニットとペプチドサブ
ユニットとの複合体を形成させ、インビトロセレクショ
ン法によって、該複合体と目的の基質を反応させた後に
該基質に対する結合能を有する複合体を選択することか
ら成る、リボヌクレオペプチドリセプターの製造方法に
係る。
を利用した、本発明リボヌクレオペプチドリセプターの
製造方法に係る。特に、ペプチド結合領域とランダムな
塩基配列を有する基質結合領域が結合したＲＮＡサブユ
ニットを作成し、該ＲＮＡサブユニットとペプチドサブ
ユニットとの複合体を形成させ、インビトロセレクショ
ン法によって、該複合体と目的の基質を反応させた後に
該基質に対する結合能を有する複合体を選択することか
ら成る、リボヌクレオペプチドリセプターの製造方法に
係る。
【００２２】本発明の製造法において、選択された複合
体からＲＮＡを回収し、回収したＲＮＡを逆転写反応に
よりＤＮＡに変換し、これをＰＣＲにより増幅させるこ
とにより新たなＲＮＡサブユニットを作成し、該ＲＮＡ
サブユニットに基づき、再び、ペプチドサブユニットと
の複合体を形成させ、インビトロセレクション法によっ
て該基質に対する結合能を有する複合体を選択する操作
を繰り返すことによって、基質に対するより高い親和性
を有する複合体を得ることが出来る。
体からＲＮＡを回収し、回収したＲＮＡを逆転写反応に
よりＤＮＡに変換し、これをＰＣＲにより増幅させるこ
とにより新たなＲＮＡサブユニットを作成し、該ＲＮＡ
サブユニットに基づき、再び、ペプチドサブユニットと
の複合体を形成させ、インビトロセレクション法によっ
て該基質に対する結合能を有する複合体を選択する操作
を繰り返すことによって、基質に対するより高い親和性
を有する複合体を得ることが出来る。
【００２３】基質としては任意の物質を使用することが
可能であり、例えば、アデノシントリリン酸（ＡＴＰ）
等の生体内の重要な代謝反応等に関わる分子を挙げるこ
とが出来る。 このような基質と複合体との反応系及び
その反応条件等は、それらの種類等に応じては当業者が
適宜選択することが出来る。
可能であり、例えば、アデノシントリリン酸（ＡＴＰ）
等の生体内の重要な代謝反応等に関わる分子を挙げるこ
とが出来る。 このような基質と複合体との反応系及び
その反応条件等は、それらの種類等に応じては当業者が
適宜選択することが出来る。
【００２４】例えば、基質に結合した複合体を選択し、
そこからＲＮＡを回収する等の操作が容易と成るため
に、アガロース等のに公知である適当な樹脂に該基質が
固定化された基質状態で複合体との反応を行うことが好
ましい。
そこからＲＮＡを回収する等の操作が容易と成るため
に、アガロース等のに公知である適当な樹脂に該基質が
固定化された基質状態で複合体との反応を行うことが好
ましい。
【００２５】本発明方法に使用する転写反応、逆転写反
応、ＰＣＲ等の各反応における手順及び反応条件は当業
者には周知のものである。
応、ＰＣＲ等の各反応における手順及び反応条件は当業
者には周知のものである。
【００２６】更に、本発明は、上記リボヌクレオペプチ
ドリセプターを含む機能性ドメイン、及び、該リセプタ
ーを基質結合部位として有する人工酵素にも係る。
ドリセプターを含む機能性ドメイン、及び、該リセプタ
ーを基質結合部位として有する人工酵素にも係る。
【００２７】
【発明の実施の形態】本発明において、任意の基質認識
能および化学反応性をもつ人工酵素の一般的な設計法を
確立する上での第一段階の目標として、複数のサブユニ
ットからなり、基質結合部位として機能するリボヌクレ
ペプチドリセプターを作製する。空間的配置、分子間の
相互作用様式が、構造解析により解明されたＲＮＡとペ
プチドの複合体をもとに、本発明のリボヌクレオペプチ
ドを構成する複合体ＲＮＡ及びペプチドを夫々のサブユ
ニットとして設計する。
能および化学反応性をもつ人工酵素の一般的な設計法を
確立する上での第一段階の目標として、複数のサブユニ
ットからなり、基質結合部位として機能するリボヌクレ
ペプチドリセプターを作製する。空間的配置、分子間の
相互作用様式が、構造解析により解明されたＲＮＡとペ
プチドの複合体をもとに、本発明のリボヌクレオペプチ
ドを構成する複合体ＲＮＡ及びペプチドを夫々のサブユ
ニットとして設計する。
【００２８】ペプチドとの特異的な結合に影響が及ばな
いと推定されるＲＮＡの領域にランダムな塩基配列を導
入し、この塩基配列を基質との結合領域としたＲＮＡ分
子を第一のサブユニットであるＲＮＡサブユニットとす
る。次に、ＲＮＡとの結合部位を保存しながら基質と相
互作用しうるようにデザインしたペプチドを第二のサブ
ユニットであるペプチドサブユニットとして合成し、Ｒ
ＮＡサブユニットとの複合体（リボヌクレオペプチド）
を形成させる。
いと推定されるＲＮＡの領域にランダムな塩基配列を導
入し、この塩基配列を基質との結合領域としたＲＮＡ分
子を第一のサブユニットであるＲＮＡサブユニットとす
る。次に、ＲＮＡとの結合部位を保存しながら基質と相
互作用しうるようにデザインしたペプチドを第二のサブ
ユニットであるペプチドサブユニットとして合成し、Ｒ
ＮＡサブユニットとの複合体（リボヌクレオペプチド）
を形成させる。
【００２９】ランダムなＲＮＡ塩基配列部分により多様
性のあるリボヌクレオペプチドのライブラリーの中か
ら、インビトロ（in vitro）セレクション法を用いて、
例えば、ＡＴＰ(アデノシン５'−３リン酸) のような、
目的の基質に対し結合能を有するリボヌクレオペプチド
分子を選択し、これらを増幅することで新たなリボヌク
レオペプチドライブラリーを作製する。このようにし
て、多種類の分子種から選択を繰り返すことで合目的
に、目的の基質に対してより選択的に結合する結合能の
高いリボヌクレオペプチド複合体を選択することができ
る。
性のあるリボヌクレオペプチドのライブラリーの中か
ら、インビトロ（in vitro）セレクション法を用いて、
例えば、ＡＴＰ(アデノシン５'−３リン酸) のような、
目的の基質に対し結合能を有するリボヌクレオペプチド
分子を選択し、これらを増幅することで新たなリボヌク
レオペプチドライブラリーを作製する。このようにし
て、多種類の分子種から選択を繰り返すことで合目的
に、目的の基質に対してより選択的に結合する結合能の
高いリボヌクレオペプチド複合体を選択することができ
る。
【００３０】
【実施例】以下、実施例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定される
ものではない。
明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定される
ものではない。
【００３１】
【実施例１】本発明のリボヌクレオペプチドレセプタ−
の調製 ＲＮＡ−ペプチド複合体の設計は、ＲＮＡとペプチドの
空間的配置と相互作用様式がＮＭＲ構造解析により解明
されたＨＩＶ RevペプチドとRRE (Rev Response Elemen
t) ＲＮＡとの複合体（Battiste, J. L.; Mao, H.; Ra
o, N.S.; Tan, R.; Muhandiram, D. R.; Kay, L.E.; Fr
ankel, A. D.; Williamson, J. R. Science 1996, 273,
1547−1551）を基にして行った。以下に記載するよう
にＤＮＡライブラリー及びＲＮＡライブラリーを調製
し、ペプチドとの特異的な結合に影響を及ぼさないと推
定されるＲＮＡ領域に２０塩基のランダムな塩基配列が
導入された、ＲＮＡサブユニットを作成した。
の調製 ＲＮＡ−ペプチド複合体の設計は、ＲＮＡとペプチドの
空間的配置と相互作用様式がＮＭＲ構造解析により解明
されたＨＩＶ RevペプチドとRRE (Rev Response Elemen
t) ＲＮＡとの複合体（Battiste, J. L.; Mao, H.; Ra
o, N.S.; Tan, R.; Muhandiram, D. R.; Kay, L.E.; Fr
ankel, A. D.; Williamson, J. R. Science 1996, 273,
1547−1551）を基にして行った。以下に記載するよう
にＤＮＡライブラリー及びＲＮＡライブラリーを調製
し、ペプチドとの特異的な結合に影響を及ぼさないと推
定されるＲＮＡ領域に２０塩基のランダムな塩基配列が
導入された、ＲＮＡサブユニットを作成した。
【００３２】ＤＮＡライブラリ−の調製
２０塩基のランダム領域を含んだ鋳型ＤＮＡ（temp−0
1：5'-ggaataggtctgggcgca-(N)２０-tgacggtacaggcgaaa
g-3'）、プライマーrev−01 (5'-ctttcggcctgtaccgtca-
3')を含む溶液をアニーリングした後、Klenowポリメラ
ーゼにより２本鎖ＤＮＡを調製した後、プライマーfor
−01 （5'-tcaatacgactcactataggaataggtctgggcgca-
3'） とプライマーrev−01を用いてＰＣＲによりプロモ
ーターを含むＤＮＡライブラリーを調製した。ＰＣＲ反
応液はフェノール−クロロホルム処理により除タンパ
ク、酢酸アンモニウムを用いてエタノール沈殿した後、
ＴＥに溶解し、ＮＩＣＫカラム（ファルマシア社）を用
い、ｄＮＴＰｓ、及びプライマーを除去し精製した。
1：5'-ggaataggtctgggcgca-(N)２０-tgacggtacaggcgaaa
g-3'）、プライマーrev−01 (5'-ctttcggcctgtaccgtca-
3')を含む溶液をアニーリングした後、Klenowポリメラ
ーゼにより２本鎖ＤＮＡを調製した後、プライマーfor
−01 （5'-tcaatacgactcactataggaataggtctgggcgca-
3'） とプライマーrev−01を用いてＰＣＲによりプロモ
ーターを含むＤＮＡライブラリーを調製した。ＰＣＲ反
応液はフェノール−クロロホルム処理により除タンパ
ク、酢酸アンモニウムを用いてエタノール沈殿した後、
ＴＥに溶解し、ＮＩＣＫカラム（ファルマシア社）を用
い、ｄＮＴＰｓ、及びプライマーを除去し精製した。
【００３３】ＲＮＡライブラリ−の作製
こうして得られたdsＤＮＡライブラリ−を鋳型としてＴ
７ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡの転写反応を行っ
た。Epicentre社のキット（AmpliScribe T7 Transcript
ion Kits）のプロトコ−ルに従い、1 μｇ の鋳型dsＤ
ＮＡを用い37℃、３時間反応させた。37℃、15分間のＤ
ＮＡse処理後フェノール・クロロホルム処理、エタノー
ル沈殿、ＮＡＰ−５カラムを用いて精製し、5'-ggaauag
gucugggcgca-(N)２０-ugacgguacaggccgaaag-3'を得た。
１００μＭとなるように20ｍＭ Tris−HCl （ｐＨ７．
６）、150 ｍＭ ＮａＣｌを含んだバッファーに希釈し
80℃３分加熱後２時間かけてフォールディングさせた。
７ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡの転写反応を行っ
た。Epicentre社のキット（AmpliScribe T7 Transcript
ion Kits）のプロトコ−ルに従い、1 μｇ の鋳型dsＤ
ＮＡを用い37℃、３時間反応させた。37℃、15分間のＤ
ＮＡse処理後フェノール・クロロホルム処理、エタノー
ル沈殿、ＮＡＰ−５カラムを用いて精製し、5'-ggaauag
gucugggcgca-(N)２０-ugacgguacaggccgaaag-3'を得た。
１００μＭとなるように20ｍＭ Tris−HCl （ｐＨ７．
６）、150 ｍＭ ＮａＣｌを含んだバッファーに希釈し
80℃３分加熱後２時間かけてフォールディングさせた。
【００３４】次に、ＲＮＡとの結合部位を保存しながら
基質と相互作用しうるようにデザインしたペプチドを第
二のサブユニットとして合成し、ＲＮＡサブユニットと
の複合体（リボヌクレオペプチド）ライブラリーを形成
させた。尚、上記ペプチドとしては、天然のＨＩＶ Rev
タンパク質がＲＲＥ配列へ結合するために必須である34
から50番目のアミノ酸をとりだし、化学合成により作成
したものを使用した。また、ペプチドの安定性を向上さ
せるため、Ｎ末端はアセチル化し、Ｃ末端はアミド化し
た。以上の化学合成反応は当業者に周知の方法で行うこ
とが出来る。
基質と相互作用しうるようにデザインしたペプチドを第
二のサブユニットとして合成し、ＲＮＡサブユニットと
の複合体（リボヌクレオペプチド）ライブラリーを形成
させた。尚、上記ペプチドとしては、天然のＨＩＶ Rev
タンパク質がＲＲＥ配列へ結合するために必須である34
から50番目のアミノ酸をとりだし、化学合成により作成
したものを使用した。また、ペプチドの安定性を向上さ
せるため、Ｎ末端はアセチル化し、Ｃ末端はアミド化し
た。以上の化学合成反応は当業者に周知の方法で行うこ
とが出来る。
【００３５】In vitro selection 法
次に、インビトロセレクション法（Ellington, A. D.;
Szostak, J. W. Nature 1990, 346, 818−822) を用い
て本発明のリボヌクレオペプチドリセプターを選択し
た。インビトロセレクション法は20塩基のランダムなＲ
ＮＡ塩基配列部分からなるＲＮＡ （RREN20）とＲＥＶ
ペプチドを用いて作製したリボヌクレオペプチドライブ
ラリーの中から、ＡＴＰが固定化された樹脂に結合する
リボヌクレオペプチドを選択し、それを回収し増幅した
後、ふたたび選択する、という方法をとった。
Szostak, J. W. Nature 1990, 346, 818−822) を用い
て本発明のリボヌクレオペプチドリセプターを選択し
た。インビトロセレクション法は20塩基のランダムなＲ
ＮＡ塩基配列部分からなるＲＮＡ （RREN20）とＲＥＶ
ペプチドを用いて作製したリボヌクレオペプチドライブ
ラリーの中から、ＡＴＰが固定化された樹脂に結合する
リボヌクレオペプチドを選択し、それを回収し増幅した
後、ふたたび選択する、という方法をとった。
【００３６】回収したＲＮＡ分子は逆転写反応によりＤ
ＮＡ分子に変換し、さらにＰＣＲ反応により増幅した
後、転写反応により新たなＲＮＡプールを作製し、これ
をもとにして新たなリボヌクレオペプチドライブラリー
を作成し、再び、ＡＴＰに対するインビトロセレクショ
ン法を用いて、ＡＴＰに対し選択的に結合するリボヌク
レオペプチドリセプターを選択した。ＡＴＰに対し、こ
のようなインビトロセレクション法のサイクルを繰り返
すことにより、リボヌクレオペプチドライブラリーにつ
いて、ＡＴＰに対する親和性の増強が認められた。尚、
インビトロセレクション法の具体的な手順及び反応条件
は以下の通りである。
ＮＡ分子に変換し、さらにＰＣＲ反応により増幅した
後、転写反応により新たなＲＮＡプールを作製し、これ
をもとにして新たなリボヌクレオペプチドライブラリー
を作成し、再び、ＡＴＰに対するインビトロセレクショ
ン法を用いて、ＡＴＰに対し選択的に結合するリボヌク
レオペプチドリセプターを選択した。ＡＴＰに対し、こ
のようなインビトロセレクション法のサイクルを繰り返
すことにより、リボヌクレオペプチドライブラリーにつ
いて、ＡＴＰに対する親和性の増強が認められた。尚、
インビトロセレクション法の具体的な手順及び反応条件
は以下の通りである。
【００３７】結合実験には４％ beadedアガロース固定
されたＡＴＰ樹脂（2.6 μmol/ml樹脂容量）と、４％
beadedアガロース固定されたグルコース樹脂（0.147 μ
mol/ml樹脂容量）を用いた。樹脂はあらかじめ、結合バ
ッファー（10 ｍＭ Tris−ＨＣｌ ｐＨ７．６、100 ｍ
Ｍ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）に平衡化した。ＡＴ
Ｐの糖部分に結合する複合体を予め除去するためのグル
コースプレセレクションとして50 μｌ容量のグルコー
ス樹脂に、10μＭのＲＮＡ（ＲＮＡサブユニット）、15
μＭ ac−Rev−am （Ac−ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲ
ＥＲＱＲ−NH ２） （ペプチドサブユニット）を加え氷
上で30分時々攪拌しながら結合させた。反応後、上清を
50μｌ容量のＡＴＰ樹脂に加え、時々攪拌しながら氷上
で30分結合させた。結合反応後上清を除いた後、300 μ
ｌの結合バッファー（ペプチド存在下選択を行ったもの
は１μＭ Revペプチドを含んだ結合バッファー）で３回
洗浄した。固定化されたリガンドに結合したＲＮＡは、
10ｍＭ ＡＴＰを含んだ結合バッファー100μｌで溶出
させこれを３回繰り返した。
されたＡＴＰ樹脂（2.6 μmol/ml樹脂容量）と、４％
beadedアガロース固定されたグルコース樹脂（0.147 μ
mol/ml樹脂容量）を用いた。樹脂はあらかじめ、結合バ
ッファー（10 ｍＭ Tris−ＨＣｌ ｐＨ７．６、100 ｍ
Ｍ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）に平衡化した。ＡＴ
Ｐの糖部分に結合する複合体を予め除去するためのグル
コースプレセレクションとして50 μｌ容量のグルコー
ス樹脂に、10μＭのＲＮＡ（ＲＮＡサブユニット）、15
μＭ ac−Rev−am （Ac−ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲ
ＥＲＱＲ−NH ２） （ペプチドサブユニット）を加え氷
上で30分時々攪拌しながら結合させた。反応後、上清を
50μｌ容量のＡＴＰ樹脂に加え、時々攪拌しながら氷上
で30分結合させた。結合反応後上清を除いた後、300 μ
ｌの結合バッファー（ペプチド存在下選択を行ったもの
は１μＭ Revペプチドを含んだ結合バッファー）で３回
洗浄した。固定化されたリガンドに結合したＲＮＡは、
10ｍＭ ＡＴＰを含んだ結合バッファー100μｌで溶出
させこれを３回繰り返した。
【００３８】リボヌクレオチド複合体を300 mM NaCl を
含んだ結合バッファ−に溶解した後、フェノ−ル抽出を
行ない、ＲＮＡサブユニットを分離・単離した。こうし
て回収したＲＮＡは10μｌ TEに溶解し、1.5μｌのＲ
ＮＡを鋳型として、プライマーrev−01とのアニーリン
グについては80 ℃３分加熱後30分かけるところ以外はP
romega社のキット（Reverse Transcription System）の
プロトコールに従い、逆転写反応（42℃、30分間反応）
を行った。反応液を99℃５分間加熱処理し逆転写酵素を
失活させた後、反応液の一部について94 ℃ 30sec、55
℃ 30sec、72℃ 1minの条件でＰＣＲを行い、５サイク
ル毎に反応液を分取し、８％ PAGE により増幅ＤＮＡ量
を分析した。PAGEでの分析により、指数的にＤＮＡの増
幅が確認されるサイクル数でＰＣＲを行い、dsＤＮＡを
精製し次のサイクルに用いた。
含んだ結合バッファ−に溶解した後、フェノ−ル抽出を
行ない、ＲＮＡサブユニットを分離・単離した。こうし
て回収したＲＮＡは10μｌ TEに溶解し、1.5μｌのＲ
ＮＡを鋳型として、プライマーrev−01とのアニーリン
グについては80 ℃３分加熱後30分かけるところ以外はP
romega社のキット（Reverse Transcription System）の
プロトコールに従い、逆転写反応（42℃、30分間反応）
を行った。反応液を99℃５分間加熱処理し逆転写酵素を
失活させた後、反応液の一部について94 ℃ 30sec、55
℃ 30sec、72℃ 1minの条件でＰＣＲを行い、５サイク
ル毎に反応液を分取し、８％ PAGE により増幅ＤＮＡ量
を分析した。PAGEでの分析により、指数的にＤＮＡの増
幅が確認されるサイクル数でＰＣＲを行い、dsＤＮＡを
精製し次のサイクルに用いた。
【００３９】クローニングおよび塩基配列決定
［制限酵素認識部位付加用ＰＣＲ］逆転写−ＰＣＲ反応
により得られたＤＮＡをBamHI、EcoRI認識領域を含むよ
うに設計したＰＣＲプライマー（for−02：5'-gcgggatc
ctttcggcctgtaccgtca-3'、rev−02：5'-cggaattctaatac
gactcactatagg-3'）により増幅した。ＰＣＲ反応液は、
フェノール−クロロホルム処理により除タンパク、酢酸
アンモニウムを用いてエタノール沈殿した後、EcoRI反
応用緩衝液中でBamHI、EcoRIにより同時に切断した。反
応液はフェノール−クロロホルムにより除タンパクした
後、エタノール沈殿により精製した。 ［クローニング用ベクターの調製］pUC19 (10μｇ)をEc
oRI反応用緩衝液中でBamHI、EcoRIにより同時に切断し
た。反応液はフェノール−クロロホルムにより除タンパ
ク後、エタノール沈殿により精製した。 ［ライゲーションと形質転換］BamHI、EcoRIにより切断
したpUC19 にクローニング用インサートＤＮＡをモル比
で３倍量加え、TaKaRaライゲーションキットver.1のプ
ロトコールに従い16℃、30分間ライゲ−ションを行っ
た。反応液を直接ＤＨ５αコンピーテントセル（ライブ
ラリーエフィシエンシーGibco BRL）に加え、プロトコ
ールに従い形質転換を行った。
により得られたＤＮＡをBamHI、EcoRI認識領域を含むよ
うに設計したＰＣＲプライマー（for−02：5'-gcgggatc
ctttcggcctgtaccgtca-3'、rev−02：5'-cggaattctaatac
gactcactatagg-3'）により増幅した。ＰＣＲ反応液は、
フェノール−クロロホルム処理により除タンパク、酢酸
アンモニウムを用いてエタノール沈殿した後、EcoRI反
応用緩衝液中でBamHI、EcoRIにより同時に切断した。反
応液はフェノール−クロロホルムにより除タンパクした
後、エタノール沈殿により精製した。 ［クローニング用ベクターの調製］pUC19 (10μｇ)をEc
oRI反応用緩衝液中でBamHI、EcoRIにより同時に切断し
た。反応液はフェノール−クロロホルムにより除タンパ
ク後、エタノール沈殿により精製した。 ［ライゲーションと形質転換］BamHI、EcoRIにより切断
したpUC19 にクローニング用インサートＤＮＡをモル比
で３倍量加え、TaKaRaライゲーションキットver.1のプ
ロトコールに従い16℃、30分間ライゲ−ションを行っ
た。反応液を直接ＤＨ５αコンピーテントセル（ライブ
ラリーエフィシエンシーGibco BRL）に加え、プロトコ
ールに従い形質転換を行った。
【００４０】シークエンスはＡＢＩのBigDyeTerminator
法を用い、キットのプロトコールに従いＰＣＲ反応を行
った。ＰＣＲサンプルからの未反応ddNTPsの除去にはCT
AB（cetyl−trimethyl ammonium bromide）沈殿法を用
いた。
法を用い、キットのプロトコールに従いＰＣＲ反応を行
った。ＰＣＲサンプルからの未反応ddNTPsの除去にはCT
AB（cetyl−trimethyl ammonium bromide）沈殿法を用
いた。
【００４１】
【実施例２】ＡＴＰとリボヌクレオペプチドリセプター
の結合試験 (1)各ＲＮＡクローンの調製 クローニングし、配列解析を行ったプラスミドＤＮＡ１
ngを鋳型として、Ｔ７プロモーターを含んだプライマー
を用いてＰＣＲにより転写用の２本鎖ＤＮＡを増幅し
（ＰＣＲ反応は94 ℃、30 sec、55 ℃、30 sec、72
℃、1 minの条件で30サイクル行った）、鋳型ＤＮＡを
調製したのち前述のプロトコールに従ってＲＮＡを転写
精製して実験に用いた。
の結合試験 (1)各ＲＮＡクローンの調製 クローニングし、配列解析を行ったプラスミドＤＮＡ１
ngを鋳型として、Ｔ７プロモーターを含んだプライマー
を用いてＰＣＲにより転写用の２本鎖ＤＮＡを増幅し
（ＰＣＲ反応は94 ℃、30 sec、55 ℃、30 sec、72
℃、1 minの条件で30サイクル行った）、鋳型ＤＮＡを
調製したのち前述のプロトコールに従ってＲＮＡを転写
精製して実験に用いた。
【００４２】(2)結合試験（各種ペプチド）
樹脂50μｌを結合バッファー（10ｍＭ Tris−HCl, 100
ｍＭ ＫＣｌ,5 ｍＭＭｇＣｌ２ ｐＨ７．６）で平衡化
し、10％ DMSO存在下[３２Ｐ]ｐＣｐ、ＲＮＡ Ligase
(ＮＥＢ)で３’末端標識を行った各RNA10 μＭ、ペプチ
ド15 μＭの条件で結合試験を行った。結合反応はＲＮ
Ａ、樹脂、ペプチドを氷上30分間インキュベート後、30
0 μｌ 1×結合バッファーで樹脂を３回洗浄した後150
μｌ 10ｍ Ｍ ＡＴＰを含む１×結合バッファーで３回
溶出し、ＡＴＰにより溶出されたＲＮＡの放射活性とト
ータルＲＮＡの放射活性との比から結合活性（％）を算
出した。
ｍＭ ＫＣｌ,5 ｍＭＭｇＣｌ２ ｐＨ７．６）で平衡化
し、10％ DMSO存在下[３２Ｐ]ｐＣｐ、ＲＮＡ Ligase
(ＮＥＢ)で３’末端標識を行った各RNA10 μＭ、ペプチ
ド15 μＭの条件で結合試験を行った。結合反応はＲＮ
Ａ、樹脂、ペプチドを氷上30分間インキュベート後、30
0 μｌ 1×結合バッファーで樹脂を３回洗浄した後150
μｌ 10ｍ Ｍ ＡＴＰを含む１×結合バッファーで３回
溶出し、ＡＴＰにより溶出されたＲＮＡの放射活性とト
ータルＲＮＡの放射活性との比から結合活性（％）を算
出した。
【００４３】ペプチド存在下に９回の選択を行ったＲＮ
Ａの配列解析を行ったところ、得られたＲＮＡ配列は３
種類の相同性の高い配列 (class I, II, III) が認めら
れた。これらを以下の表１に示した。尚、表１の各配列
において、ハイフン「−」で示された部分は、クローン
０２の塩基と同一の塩基である為省略したものである。
Ａの配列解析を行ったところ、得られたＲＮＡ配列は３
種類の相同性の高い配列 (class I, II, III) が認めら
れた。これらを以下の表１に示した。尚、表１の各配列
において、ハイフン「−」で示された部分は、クローン
０２の塩基と同一の塩基である為省略したものである。
【００４４】
【表１】
【００４５】各クラスのＲＮＡについてリボヌクレオペ
プチド複合体を形成させＡＴＰとの結合活性を評価した
結果によれば、上記の各クラスごとにＡＴＰ結合におけ
るペプチド分子の影響は異なるものであった。即ち、cl
ass II, III のＲＮＡについてはペプチド非存在下につ
いてもＡＴＰ結合活性を示したが、class IのＲＮＡを
含んだリボヌクレオペプチド複合体については、ペプチ
ド存在下についてのみＡＴＰ結合活性を示したことか
ら、class I のＲＮＡにおいてはＲＮＡ分子とペプチド
分子によりＡＴＰに対する基質結合領域が形成されたこ
とが示唆された。
プチド複合体を形成させＡＴＰとの結合活性を評価した
結果によれば、上記の各クラスごとにＡＴＰ結合におけ
るペプチド分子の影響は異なるものであった。即ち、cl
ass II, III のＲＮＡについてはペプチド非存在下につ
いてもＡＴＰ結合活性を示したが、class IのＲＮＡを
含んだリボヌクレオペプチド複合体については、ペプチ
ド存在下についてのみＡＴＰ結合活性を示したことか
ら、class I のＲＮＡにおいてはＲＮＡ分子とペプチド
分子によりＡＴＰに対する基質結合領域が形成されたこ
とが示唆された。
【００４６】具体的には、class I に属するクローン02
の結合活性はペプチド非存在下1.2±0.1%、ペプチド存
在下20.1±4.7%であった。class II に属するクローン0
6の結合活性はペプチド非存在下28.4±2.1%、ペプチド
存在下21.6±1.2%であった。class III に属するクロー
ン30の結合活性はペプチド非存在下17.0±2.4%、ペプチ
ド存在下25.6±3.3%であった。同様の条件で、すでに報
告されているＡＴＰアプタマーの解離定数は３μＭであ
り、樹脂に対する結合（％）が40％であったことから、
class IリボヌクレオペプチドのＡＴＰに対する解離定
数は約10μＭであると考えられる。
の結合活性はペプチド非存在下1.2±0.1%、ペプチド存
在下20.1±4.7%であった。class II に属するクローン0
6の結合活性はペプチド非存在下28.4±2.1%、ペプチド
存在下21.6±1.2%であった。class III に属するクロー
ン30の結合活性はペプチド非存在下17.0±2.4%、ペプチ
ド存在下25.6±3.3%であった。同様の条件で、すでに報
告されているＡＴＰアプタマーの解離定数は３μＭであ
り、樹脂に対する結合（％）が40％であったことから、
class IリボヌクレオペプチドのＡＴＰに対する解離定
数は約10μＭであると考えられる。
【００４７】（3）競合試験（ＡＴＰ誘導体）
次に、ＡＴＰへの選択性を評価する目的で結合系にＮＴ
Ｐを添加し競合試験を行った。樹脂50μｌを結合バッフ
ァー（10ｍＭ Tris−HCl, 100ｍＭ KCl, 50ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２, ｐＨ7.6）で平衡化し、[３２Ｐ]ｐＣｐ、ＲＮＡ
Ligase(ＮＥＢ)で３’末端標識を行った各ＲＮＡ10μ
Ｍ、ペプチド15μＭの条件で結合試験を行った。あらか
じめ中性になるように調製したＡＴＰ誘導体を添加し、
結合反応はＲＮＡ、樹脂、ペプチドを氷上30分間インキ
ュベ−ト後、300μｌ 1×結合バッファーで樹脂を３回
洗浄した後150μｌ 10ｍＭ ＡＴＰを含む１×結合バッ
ファーで３回溶出し、ＡＴＰにより溶出されたＲＮＡの
放射活性とトータルＲＮＡの放射活性との比から結合割
合（％）を算出した。
Ｐを添加し競合試験を行った。樹脂50μｌを結合バッフ
ァー（10ｍＭ Tris−HCl, 100ｍＭ KCl, 50ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２, ｐＨ7.6）で平衡化し、[３２Ｐ]ｐＣｐ、ＲＮＡ
Ligase(ＮＥＢ)で３’末端標識を行った各ＲＮＡ10μ
Ｍ、ペプチド15μＭの条件で結合試験を行った。あらか
じめ中性になるように調製したＡＴＰ誘導体を添加し、
結合反応はＲＮＡ、樹脂、ペプチドを氷上30分間インキ
ュベ−ト後、300μｌ 1×結合バッファーで樹脂を３回
洗浄した後150μｌ 10ｍＭ ＡＴＰを含む１×結合バッ
ファーで３回溶出し、ＡＴＰにより溶出されたＲＮＡの
放射活性とトータルＲＮＡの放射活性との比から結合割
合（％）を算出した。
【００４８】その結果を以下の表２に示す。ＧＴＰに関
しては20ｍＭで白濁が起こり10ｍＭまでしか評価できな
かった。ＡＴＰ については濃度の増加に応じて競合阻
害が起こったが、ＣＴＰ、ＵＴＰについては用いた濃度
範囲で競合阻害は認められず、いずれのクラスのリボヌ
クレオペプチドリセプターについてもＡＴＰに対して選
択的に結合することがわかった。
しては20ｍＭで白濁が起こり10ｍＭまでしか評価できな
かった。ＡＴＰ については濃度の増加に応じて競合阻
害が起こったが、ＣＴＰ、ＵＴＰについては用いた濃度
範囲で競合阻害は認められず、いずれのクラスのリボヌ
クレオペプチドリセプターについてもＡＴＰに対して選
択的に結合することがわかった。
【００４９】
【表２】
【００５０】
【発明の効果】本発明のリボヌクレオペプチドリセプタ
ーにおいては、機能性ドメインの前駆体として三次元構
造が明らかになっている「ＲＮＡ−ペプチド複合体」を
利用している。こうして得られた本発明のリボヌクレオ
ペプチドリセプターは、二つのサブユニット（ＲＮＡ
とペプチド）を組み合わせることにより柔軟な構造が形
成され、協同性の発揮が期待される、ＲＮＡ、ペプチ
ド両サブユニット共に化学的もしくは分子生物学的にラ
イブラリー化できる、非天然アミノ酸を導入すること
が容易である等の点から、理想的な機能性ドメイン前駆
体であるのみならず、多様な分子種を作製して望みの機
能性ドメインへと発展させることが可能である。
ーにおいては、機能性ドメインの前駆体として三次元構
造が明らかになっている「ＲＮＡ−ペプチド複合体」を
利用している。こうして得られた本発明のリボヌクレオ
ペプチドリセプターは、二つのサブユニット（ＲＮＡ
とペプチド）を組み合わせることにより柔軟な構造が形
成され、協同性の発揮が期待される、ＲＮＡ、ペプチ
ド両サブユニット共に化学的もしくは分子生物学的にラ
イブラリー化できる、非天然アミノ酸を導入すること
が容易である等の点から、理想的な機能性ドメイン前駆
体であるのみならず、多様な分子種を作製して望みの機
能性ドメインへと発展させることが可能である。
【００５１】本発明を利用することによって、コンビナ
トリアルな手法を多段階に用いて、例えば酵素反応の出
発物質と反応中間体に対しては親和性が高く、生成物に
対しては親和性が低い、という特性がある分子種をＲＮ
Ａ−ペプチド複合体ライブラリーから選び出すことが出
来るため、より高機能な人工酵素が作製できると期待さ
れる。
トリアルな手法を多段階に用いて、例えば酵素反応の出
発物質と反応中間体に対しては親和性が高く、生成物に
対しては親和性が低い、という特性がある分子種をＲＮ
Ａ−ペプチド複合体ライブラリーから選び出すことが出
来るため、より高機能な人工酵素が作製できると期待さ
れる。
【図１】 本発明のリボヌクレオペプチドリセプターの
基本骨格を示す。ＲＮＡの塩基配列は、例えば、5'-ggu
cugggcgca(N)２０ugacgguacaggccであり、図１のＲＮＡ
中、黒い部分がＡ、Ｕ、Ｇ、Ｃすべての塩基からなる混
合２０塩基配列である。下線部はペプチド結合部位であ
る。ペプチドのアミノ酸配列は、例えば、Ａｃ−ＴＲＱ
ＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲである。
基本骨格を示す。ＲＮＡの塩基配列は、例えば、5'-ggu
cugggcgca(N)２０ugacgguacaggccであり、図１のＲＮＡ
中、黒い部分がＡ、Ｕ、Ｇ、Ｃすべての塩基からなる混
合２０塩基配列である。下線部はペプチド結合部位であ
る。ペプチドのアミノ酸配列は、例えば、Ａｃ−ＴＲＱ
ＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲである。
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フロントページの続き
Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA11 CA20 HA20
4B050 CC10 LL05
4H045 AA10 AA20 AA30 BA17 BA54
CA05 DA89 FA20 FA51
Claims (17)
- 【請求項１】 ＲＮＡサブユニットとペプチドサブユニ
ットの複合体から成るリボヌクレオペプチドリセプタ
ー。 - 【請求項２】 ＲＮＡサブユニットがペプチド結合領域
及び基質結合領域を含むことを特徴とする、請求項１記
載のリボヌクレオペプチドリセプター。 - 【請求項３】 ＲＮＡサブユニットの基質結合領域とペ
プチドサブユニットとによって基質と特異的に結合する
領域が形成されていることを特徴とする、請求項１又は
２記載のリボヌクレオペプチドリセプター。 - 【請求項４】 ペプチド結合領域がステム部分を形成
し、基質結合領域ががペプチド結合領域に挟まれた中央
ループ部分を形成することを特徴とする、請求項１、２
又は３記載のリボヌクレオペプチドリセプター。 - 【請求項５】 ＲＮＡサブユニットのペプチド結合領域
がヒト後天性免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）の逆転写酵
素（Ｒｅｖ）由来であり、ペプチドサブユニットがＲｅ
ｖ応答エレメント（ＲＲＥ）由来であることを特徴とす
る、請求項１ないし４のいずれか一項に記載のリボヌク
レオペプチドリセプタ−。 - 【請求項６】 ＲＮＡサブユニットが以下の塩基配列： ggucugggcgca-(N)n-ugacgguacaggcc （塩基配列において(N)nは基質結合領域を示し、「N」
はアデニン、ウラシル、グアニン及びシトシンから任意
に選択される一種類の塩基を示し、「n」は１５〜３０
の整数である）を含むことを特徴とする、請求項１ない
し５項のいずれか一項に記載のリボヌクレオペプチドリ
セプター。 - 【請求項７】 塩基配列において、「n」が２０である
ことを特徴とする請求項６記載のリボヌクレオペプチド
リセプター。 - 【請求項８】 (N)nが以下の塩基配列： 5'-nguguannnnnnnuanncun-3' から成ることを特徴とする請求項７記載のリボヌクレオ
ペプチドリセプター。 - 【請求項９】 ペプチドサブユニットが以下の１７個の
アミノ酸から成るアミノ酸配列： ＴＲ（Ｘ）２ＲＲＮ（Ｘ）３Ｒ（Ｘ）６ （アミノ酸配列において（Ｘ）は任意に選択される一種
類のアミノ酸を示す）を含むことを特徴とする、請求項
１ないし８のいずれか一項に記載のリボヌクレオペプチ
ドリセプター。 - 【請求項１０】 ペプチドサブユニットが以下のアミノ
酸配列： ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ から成ることを特徴とする、請求項９記載のリボヌクレ
オペプチドリセプター。 - 【請求項１１】 ＲＮＡサブユニットが以下の塩基配
列： ggucugggcgca-gguguacuggggguauucuc-ugacgguacaggcc から成り、アデノシントリリン酸（ＡＴＰ）結合能を有
することを特徴とする、請求項１ないし１０のいずれか
一項に記載のリボヌクレオペプチドリセプター。 - 【請求項１２】 ペプチド結合領域とランダムな塩基配
列を有する基質結合領域が結合したＲＮＡサブユニット
を作成し、該ＲＮＡサブユニットとペプチドサブユニッ
トとの複合体を形成させ、インビトロセレクション法に
よって、該複合体と目的の基質を反応させた後に該基質
に対する結合能を有する複合体を選択することから成
る、請求項１ないし１１のいずれか一項に記載のリボヌ
クレオペプチドリセプターの製造方法。 - 【請求項１３】 選択された複合体からＲＮＡを回収
し、回収したＲＮＡを逆転写反応によりＤＮＡに変換
し、これをＰＣＲにより増幅させることにより新たなＲ
ＮＡサブユニットを作成し、該ＲＮＡサブユニットに基
づき、再び、ペプチドサブユニットとの複合体を形成さ
せ、インビトロセレクション法によって該基質に対する
結合能を有する複合体を選択する操作を繰り返すことに
よって、該基質に対するより高い親和性を有する複合体
を得ることから成る、請求項１２に記載のリボヌクレオ
ペプチドリセプターの製造方法。 - 【請求項１４】 基質が固定化された樹脂を使用して、
複合体と基質との反応を行うことを特徴とする、請求項
１１又は１３に記載のリボヌクレオペプチドリセプター
の製造方法。 - 【請求項１５】 基質がアデノシントリリン酸（ＡＴ
Ｐ）であることを特徴とする、請求項１０ないし１４の
いずれか一項に記載のリボヌクレオペプチドリセプター
の製造方法。 - 【請求項１６】 請求項１ないし１１のいずれか一項に
記載のリボヌクレオペプチドリセプターを含む機能性ド
メイン。 - 【請求項１７】 請求項１ないし１１のいずれか一項に
記載のリボヌクレオペプチドリセプターを基質結合部位
として有する人工酵素。
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