JPH11507219A

JPH11507219A - 触媒ｄｎａ

Info

Publication number: JPH11507219A
Application number: JP9501695A
Authority: JP
Inventors: ジャックダブリュー．スゾスタック; バーナードクエナウド; デビッドイー．フイゼンガ
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-04
Publication date: 1999-06-29
Also published as: IL122528A0; EP0836614A4; AU6097196A; CA2223771A1; WO1996040723A1; EP0836614A1; NO975731L; US5910408A; KR19990022724A; ZA964136B; AR002373A1; NO975731D0

Abstract

(57)【要約】本発明は、核酸分子、特に触媒活性をもつＤＮＡ分子ならびにこのような核酸分子の獲得及び使用方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】触媒ＤＮＡ発明の背景本発明は、触媒活性をもつＤＮＡ分子及びこのようなＤＮＡ分子を獲得し使用する方法に関する。リボザイムは、往々にして、大部分の工学処理された酵素のものに匹敵する運動効率を伴い、特異的化学反応（例えばＲＮＡの分割、ＤＮＡの分割、ＲＮＡの重合及びＲＮＡの複製）を実施する高度に構造化されたＲＮＡ分子である。発明の概要本発明は、触媒活性をもつ核酸分子ならびにこのような核酸分子を獲得し使用するための方法に関する。本発明の方法は、ランダム配列を含む１本鎖核酸分子（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ又はその修飾物又は組合せ）のプールから望ましい特性（例えばリガーゼ活性といったような触媒活性）をもつ核酸分子の逐次的インビトロ選択及び分離を必然的に伴っている。分離された核酸分子は次に、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることにより増幅される。選択及び増幅は１つ又はそれ以上のラウンドをくり返すことができ、各ラウンドの後に分子のプールは、望ましい活性をもつ分子について富化されている。初期プール内の望ましい分子の数は非常に少ない可能性があるが、逐次的選択スキームは望まれる分子について反復的に富化することによりこの問題を克服する。本発明で利用される１本鎖核酸分子のプールは「ランダム核酸分子」として又は「ランダム配列」を含有するものとして言及されている。これらの一般的用語は、「完全にランダムな配列」の１つ又はそれ以上の領域をもつ分子又は配列を記述するのに用いられる。完全にランダムな配列においては、配列内の各位置にＡ、Ｔ/Ｕ、Ｃ、又はＧが存在する確率はほぼ等しい。当然のことながら、核酸分子を作り上げるのに用いられるいくつかの方法がもつ制限条件のため、各位置において各ヌクレオチドが出現する確率が絶対的に等しい完全ランダム配列を合成することはかなり難しい。したがって、確率がおおよそ等しい配列は、完全ランダム配列とみなされる。「部分的にランダムな配列」又は「部分的にランダム化された配列」内では、各位置において、Ａ、Ｔ/Ｕ、Ｃ又はＧが存在する可能性が２５％あるのではなく、むしろ不等な確率が存在する。例えば、部分的にランダムな配列においては、Ａが一定の与えられた位置に存在する可能性は７０％、その位置にＴ/Ｕ、Ｃ又はＧの各々が存在する可能性は１０％であり得る。さらに、確率は、部分的にランダム化された領域内で各位置において同じでもあり得るし異なる可能性もある。したがって、部分的にランダムな配列は、配列が完全にランダムである１つ又はそれ以上の位置、配列が部分的にランダムである１つ又はそれ以上の位置及び／又は、配列が規定されている１つ又はそれ以上の位置を含むことができる。部分的にランダムな配列は、既知の配列の異形を作りたい場合に特に有用である。例えば、特定の５０ヌクレオチド配列が望ましい触媒活性を有すること、そして位置５、７、８及び９がこの活性についてきわめて重要であることがわかっている場合、位置５、７、８及び９にある塩基が触媒活性配列内のものと同じでありその他の位置が完全にランダム化されているような５０ヌクレオチド配列の部分的にランダムなバージョンを調製することができる。あるいは、位置５、７、８及び９が部分的にランダム化されているものの、もとの分子内の各位置にみられる塩基に向かっての強い偏向を伴い、その他の位置がすべて完全にランダム化されているような、部分的にランダムな配列を調製することができる。このタイプの部分的にランダムな配列は、触媒核酸がそこから選択されている分子プールにおいて望ましい。任意のランダム化された領域の配列は、１つ又はそれ以上の増幅段階中に突然変異誘発によってさらにランダム化させることができる。ランダム又は部分的にランダムな配列に加えて、「規定配列」の領域を１つ又はそれ以上有することが望ましい可能性もある。規定配列というのは、分子の作者が選択したか又は知っている配列である。規定配列領域は、規定された相補的プライマーによって認識され得るため、核酸分子を分離又はＰＣＲ増幅するために有用である。規定配列領域は、ランダム領域にフランキングすることもできるし、あるいはランダム領域と混ぜ合わせることもできる。規定領域は、望まれる任意の長さであってよく、そして当業者の知識を用いて容易に設計される（例えば、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology「分子クローニングにおける現行プロトコル」，Greene Publishing，New York，New York(１９９４ )； Ehrlich，PCR Technology「ＰＣＲ技術」，Stockton Press，New York，New York（１９８９）；及び Innisら、PCR Protocols，A Guide to Methods and A pplications「ＰＣＲプロトコル、方法及び応用ガイド」，Academic Press，Inc .，San Diego，CA(１９９０)を参照のこと）。本発明の選択方法には、触媒活性にとって有利な条件（例えば核酸分子濃度、温度、ｐＨ及び塩）の下で望ましい触媒活性のための基質と、ランダム配列を含む核酸分子プールを接触させる段階が関与している。触媒活性をもつ核酸分子は、それをもたない分子から隔絶され、次に、触媒活性をもつ隔絶された核酸分子は、例えばＰＣＲなどを用いて増幅される。接触、隔絶及び増幅段階は、望まれるだけ何回でも反復できる。各ラウンドの後、プールは望まれる触媒核酸についてより富化されているため、数回の選択サイクル（接触、隔絶及び増幅）が望ましくなる可能性がある。さらなる選択時点で触媒活性の実質的な改善が全く観察されなくなるほどの回数の選択サイクルを実施することを選んでもよいし、あるいははるかに少ない回数の選択サイクルしか実施しないことも可能である。この選択及び分離手順の特定の段階において、当業者に既知の方法を使用することができ、当業者は、Ellington 及び Szostak，Nature ３４６；８１８−８２２，１９９０；Lorsch 及び Szostak，Nature ３７１：３１−３６，１９９４；Tuerk 及び Gold，Science ２４９：５０５−５１０，１９９０及びそこに記述されている方法を参照されたい。さらに、改善された触媒活性をを示す分子を生成し、その後分離するために、分離された触媒核酸を突然変異誘発することができる。例えば、特定の触媒核酸配列に基づいて一本鎖核酸の縮合プールを調製することもできるし、あるいはまず触媒核酸配列内の重要な領域を同定し（例えば標準的な欠失分析により）、次にこれらの重要な領域において縮合配列を含む候補の触媒核酸のプールを調製することもできる。当業者であれば、一定数の触媒核酸分子を配列決定し、その配列を比較することにより、触媒核酸共通配列を容易に同定することが可能である。いくつかの場合では、このような配列決定及び比較は、一定数の保存された異なる配列の存在を明らかにすることになる。このような状況下では、大部分の又はすべての分離された配列に共通であるコア配列を同定することができる。このコア配列又はその変異体は、改良型解媒の選択のための出発点として用いることができる。１つの配列の「変異体」というのは、その配列を部分的にランダム化することによって作り出される配列のことである。利用されるランダム化された領域のサイズは、触媒部位を提供するのに適したものでなくてはならない。したがって、初期選択において用いられるランダム化された領域は、好ましくは１０〜３００個のヌクレオチド、例えば２５〜１８０個のヌクレオチドを内含する。より多くの分子を分離するため、選択段階の厳密度を増大させることが望ましいであろう。選択段階の厳密度は、基質の濃度を減少させることによって高めることができる。触媒選択段階の厳密度は、リガンド濃度又は反応時間を減少させることによって高めることができる。したがって、１つの形態において、本発明は、リガーゼ活性をもつ核酸分子を得るための方法を特徴とする。この方法の第１の段階において、各々がランダム配列の領域を有する候補核酸配列の集団を、基質核酸分子及び外部鋳型と接触させる。外部鋳型は、基質核酸分子の３'領域の一部分及び集団中の候補核酸分子の各々の５'領域の一部分に対して相補的である。あるいは、外部鋳型は、基質核酸分子の５'領域の一部分及び集団内の候補核酸分子の各々の３'領域の一部分に対し相補的であってよい。基質核酸分子及び集団からの一候補核酸分子に対する外部鋳型の結合は、分子の１つの３'領域をもう１つの分子の５'領域と並置する。並置された領域の末端ヌクレオチドの１つ（５'又は３'ヌクレオチドのいずれか）は、活性化された基を含有している可能性がある。本発明の方法の中で使用され得る活性化された基には、５'−ホスホロ（２−メチル）イミダゾリド、５' −ホスホルイミジゾリド、臭化シアン及びカルボジイミド（例えば、１−エチル −３−（３'−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＣＤＩ）、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４）−エチル）−カルボジイミドメト −Ｐ−トルエンスルホネート、ＣＤＩ−１及びＣＤＩ−２）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。具体例としては、活性化された基は、基質の３' 末端ヌクレオチド上の３'−ホスホルイミダゾリドである。当業者に既知の方法を用いることによって、本発明の方法において使用される核酸分子に対し、活性化用の基が添加される。あるいは、望まれる場合、この第１段階の外部鋳型処理を削除することが可能である。これは、本発明の選択方法にとって不可欠なものではない。本発明のこの方法の第２段階において、リガーゼ活性をもつ核酸分子の下位集団が集団から分離される。これは、例えばアフィニティークロマトグラフィーとそれに続く選択的ＰＣＲ増幅によって達成できる。例えば、集団からの核酸及び／又は基質核酸は、特異的結合対の第１の構成要素（例えばビオチン）を含有できる。具体例としては、基質核酸の末端ヌクレオチド（例えば基質核酸の５'末端ヌクレオチド）及び／又は外部鋳型により並置されていない集団からの核酸分子を、ビオチンで標識することができる。ビオチンを含有する分子の分離は、固定化されたアビジン、例えばストレプトアビジンアガロースアフィニティーカラムと分子を接触させることによって達成できる。本発明の方法においては、当業者に既知のその他の特異的結合対を使用することができる。分離された下位集団は、例えばＰＣＲなどを用いてインビトロで増幅可能である。選択的ＰＣＲにおいては、第１のプライマーは、基質核酸分子の一配列に対して相補的であり、第２のプライマーは、集団中の１つの配列の相対する鎖に対して相補的である。したがって、これらのプライマーを使用すると、集団からの核酸分子に対する基質の連結の産物であるような核酸分子のみを増幅する結果となる。さらなる選択ラウンドのための核酸分子の一集団を生成するために、好ましくは基質核酸に連結された集団からの核酸の末端ヌクレオチドを含むプライマーを用いて、入れ子式のＰＣＲ増幅を実施することができる。上述の接触、分離及び増幅段階は、得られた核酸分子の下位集団について反復することができる。付加的な選択ラウンドは、外部鋳型の存在又は不在下で実施可能である。上述の方法を用いて分離された核酸分子を１つのベクター（例えばプラスミド）内にサブクローニングし、さらに例えば配列分析などによって特徴づけすることが可能である。第２の形態においては、本発明は、触媒として作用する能力をもつＤＮＡ分子を特徴とする。触媒というのは、その他の形で可能であるものとは異なる条件（例えば、より低い温度、とそれに伴うより低い反応物濃度又は増大した反応速度）の下で化学反応が進行できるようにする分子のことである。第３の形態においては、本発明は、核酸基質に対する触媒として作用する能力をもつＤＮＡ分子を特徴とする。この触媒作用には、核酸基質内のリボヌクレオチドの存在は必要とされない。第４の形態においては、本発明は、リガーゼ活性、例えばＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼ活性をもつ核酸分子を特徴とする。核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はその組合せ又は修飾されたものであり得る。第５の形態においては、本発明は、第２の基質核酸に対して第１の基質核酸を連結させることのできる核酸分子を特徴とする。本発明の核酸分子による触媒作用を受けた連結の速度は、例えば基質濃度、鋳型／酵素濃度、基質と鋳型／酵素の間の塩基対合相互反応の性質及び量、活性化基のタイプ、塩、ｐＨ及び温度などの変異性を含む同じ反応条件下での鋳型処理による基質核酸の連結速度よりも高いものである。鋳型処理というのは、「鋳型」核酸鎖の隣接する領域に対してハイブリッド形成された時点での２つの基質核酸分子の接合のことである。第６の形態においては、本発明は、第１の基質核酸を第２の基質核酸に連結する能力をもつ触媒ＤＮＡ分子を特徴とする。第１の基質核酸は、配列３'−Ｓ¹− Ｓ²−５'を含有し、第２の基質核酸は配列３'−Ｓ³−Ｓ⁴−５'を含有し、触媒ＤＮＡ分子は配列５'−Ｅ¹−ＴＴＴ−Ｅ²−ＡＧＡ−Ｅ³−Ｅ⁴−Ｅ⁵−Ｅ⁶−３'を含有する。これらの基質及び触媒ＤＮＡ分子については、Ｓ¹は、Ｓ²の３'末端に隣接して位置づけされた２個以上（例えば、２〜１００、４〜１６又は８〜１２個）のヌクレオチドを含んでいる。Ｓ¹ヌクレオチドは、ＴＴＴの５'末端に隣接して位置づけされるＥ¹内の同等の数のヌクレオチドに対して相補的である。Ｓ²は１〜３個（例えば１個）のヌクレオチドを含有し、Ｓ³は１〜６個（例えば３個）のヌクレオチドを含有し、Ｓ²の５'末端ヌクレオチド及びＳ³の３'末端ヌクレオチドは、活性化された基又はヒドロキシル基を交互に含有する。Ｓ⁴は、Ｓ³の５'末端に隣接して位置づけされた２個以上（例えば２〜１００、４〜１６又は８〜１２個）のヌクレオチドを含有する。Ｓ⁴ヌクレオチドは、Ｅ⁵の３'末端に隣接して位置づけされたＥ⁶内の同等の数のヌクレオチドに対して相補的である。Ｅ¹は、ＴＴＴの５'末端に隣接して位置づけされた２個以上（例えば２〜１００、４〜１６又は８〜１２個）のヌクレオチドを含有する。Ｅ¹ヌクレオチドは、Ｓ²の３'末端に隣接して位置づけされるＳ¹内の同等の数のヌクレオチドに対して相補的である。Ｅ²は、０〜１２個（例えば３〜４個）のヌクレオチドを含有する。Ｅ³は、該ＡＧＡの３'末端に隣接して位置づけされた２個以上（例えば２〜１００、３〜５０、５〜２０又は５個）のヌクレオチドを含有し、このＥ³ヌクレオチドは、Ｅ⁶の５'末端に隣接して位置づけされたＥ⁵内の同等の数のヌクレオチドに対して相補的である。Ｅ⁴は３個以上のヌクレオチド（例えば３〜２００、３〜３０、３〜８、４〜６又は５個）のヌクレオチドを含有する。あるいは、Ｅ⁴はヌクレオチドを全く含有しない。この場合、Ｅ³の３'末端及びＥ⁵の５'末端はもう１つの核酸セグメント（例えばＥ⁴）に連鎖されず、したがって酵素は２つの別々の核酸（第１のものは５'−Ｅ¹−ＴＴＴ−Ｅ²−ＡＧＡ−Ｅ³−３'を含み、第２のものは５'−Ｅ⁵ −Ｅ⁶−３'を含む）で構成されることになる。Ｅ⁵は、Ｅ⁶の５'末端に隣接して位置づけされた２個以上（例えば２〜１００、３〜５０、５〜２０又は５個）のヌクレオチドを含有する。Ｅ⁵ヌクレオチドは、ＡＧＡの３'末端に隣接して位置づけされたＥ³内の同等の数のヌクレオチドに対して相補的である。Ｅ⁶は、Ｅ⁵の３'末端に隣接して位置づけされた２個以上（例えば２〜１００、４〜１６、又は８〜１２）のヌクレオチドを含有する。Ｅ⁶ヌクレオチドは、Ｓ³の５'末端に隣接して位置づけされたＳ⁴内の同等の数のヌクレオチドに対し相補的である。例えば、Ｓ¹及びＥ¹、Ｓ⁴及びＦ⁶、又はＥ³及びＥ⁵によって形成される長いステム構造の場合、このステム構造は、ステム構造が維持されることを条件としてミスマッチを含んでいてよい。Ｓ²の最５'ヌクレオチド、Ｓ³の最３'のヌクレオチド及びＳ³の最も３'から２番目のヌクレオチドは、Ｅ²の最５'ヌクレオチド、Ｅ²の最も５'から２番目のヌクレオチド及びＥ²の最も５'から３番目のヌクレオチドに対してそれぞれ相補的であり得る。さらに、Ｅ²は４つのヌクレオチドを含むことができ、Ｓ³の最も３ 'から３番目のヌクレオチドはＥ²の最も５'から４番目のヌクレオチドと相補的であってよい。第７の形態においては、本発明は、第２の核酸分子に対して第１の核酸分子を連結させる方法を特徴とする。この方法においては、第１及び第２の核酸分子は、リガーゼ活性（例えばＤＮＡリガーゼ活性）をもつ核酸分子と接触させられる。リガーゼ活性をもつ核酸分子ならびに第１及び第２の核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はその修飾物又は組合せを含有することができる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを容易に合成できること、そしてその安定性が比較的高いことが、例えば産業、研究及び治療といった利用分野にとって、タンパク質及びＲＮＡといったその他の生体高分子と比べての主要な利点となっている。本発明のその他の特徴及び利点は、その好ましい態様についての以下の説明及び請求の範囲から明らかになることだろう。詳細な説明まず最初に図面について説明する。図面図１は、ＤＮＡリガーゼ活性をもつＤＮＡ分子を分離するのに用いられるインビトロ選択戦略の概略図である。１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）プール内の各々の分子は、ＰＣＲプライマー５'−ＧＧＡＡＣＡＣＴＡＴＣＣＧＡＣＴＧＧＣＡＣＣ−３'（配列番号２９）及び５'−ビオチン−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＧＡＣＣＡＡＧＧ−３'（配列番号３０）に対して相補的な配列をもつ定常領域によりフランキングされた１１６のランダム塩基を含有していた。プールは、固相ホスホルアミダイト化学により調製され、ＰＣＲ（Ellingtonら、Nature３５５：８５０−８５２，１９９２）により増幅されて３.５×１０¹⁴の異なる分子の約３２のコピーを生成した。Bockら(Nature ３５５：５６４−５６６，１９９２）により記述されている通りに、増幅されたプールから１本鎖ＤＮＡを調製した（Nature３５５：５６４−５６６，１９９２）。活性化された基質（５'−ビチオン−ＡＡＧＣＡＴＣＴＡＡＧＣＡＴＣＴＣＡＡＧＣ−ｐ−Im（配列番号３１）は、５'−ビチオン基及び３'−ホスホルイミダゾリドを含有していた（Chuら、Nucleic Acid Res.１４：５５９１−５６０３，１９８６）。ＤＮＡプール（０.５μＭ）の８つのコピーを、活性化された基質の３'末端及びプールの５'末端に対して相補的な外部鋳型（５'−ＣＧＧＡＴＡＧＴＧＴＴＣＣＧＣＴＴＧＡＧＡＴＧＣＴＴ− ３'（配列番号３２））１μＭと活性化された基質１μＭと共に、選択緩衝液（３０ｍＭ Hepes，ｐＨ７.４，６００ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのＺｎＣｌ₂）の中でインキュベートした。２時間のインキュベートの後、ＥＤＴＡの添加により反応を停止した。２４時間後に０.５％の連結産物が存在していた。外部鋳型がない状態ではいかなる産物の形成も観察されなかった。サイクル７では、プール活性は、外部鋳型と無関係であり、残りのプール分子が内部基質結合部位を使用していることを表わしていた。サイクル８及び９では、いかなる外部鋳型も添加せず、選択の厳密度を高めるため反応時間をそれぞれ２分及び０.５分まで短縮した。連結された分子を分離するため、反応済みプールを、ストレプタビジンアガロースアフィニティーカラム（Pierce，Rockford，IL）内に通し、未連結のプールを変性条件下（３Ｍの尿素とそれに続く１５０ｍＭのＮａＯＨ、各々４０カラム体積）でカラムから洗い去り、連結されたプールを過剰の遊離ビオチンで特異的に溶出させた（Wilsonら、Nature，印刷中，１９９５）。プール分子の５'−ヒドロキシルに対する基質の連結について選択するために、分離されたＤＮＡを基質配列に対応する第１のプライマー及びプールの３'定常領域に対して相補的な第２のプライマーで選択的にＰＣＲ増幅させ（サイクル６〜９のみで）、ゲル精製した。次にこのプールを、第１のプライマーセットを用いて入れ子式ＰＣＲに付し、ゲル精製し、ｓｓＤＮＡ分離のために再増幅させた（Bockら、Nature ３５５：５６４−５６６，１９９２）。選択−増幅のサイクルを９回実施し、その後プール活性は一定にとどまっていた。図２Ａは、プール９ｓｓＤＮＡによる触媒作用を受けた連結反応の時間的経移の変性アクリルアミドゲル分析である。内部に標識されたプール９ＤＮＡ（０．５μＭ）を指示された時間だけ選択緩衝液内で、活性化された基板（1μＭ）とともにインキュベートした。対照反応においては、基質は活性化されなかった（レーン５）。６％ポリアクリルアミド／８Ｍ尿素ゲル内で電気泳動によりＤＮＡを分離した。Molecular Dinamics Phosphorimager を用いて、放射能を検出した。図２Ｂは、プール９ＤＮＡから分離されたクローンの配列の概略的表示である。プール９からのＤＮＡを、ＰＣＲにより増幅させ、ｐＴ７ Blue Ｔ−ベクター（Novagen，Madison，WI）にクローニングした。分析されたクローンの各々を、標準的なジデオキシ配列決定方法を用いて両方の方向に配列決定した。図の中で示されている２１の配列（配列番号１〜２１）は、２つの保存されたドメイン（配列番号２２及び２３）からなる共通配列を共有している。共通配列内の大文字及び小文字はそれぞれ、保存度が高度の位置及び中等度の位置を表わしている。Ｘ及びＺは保存されていないが、相補的である塩基対を表わす。ドメインＩ内のボールド体のＴは、５０％のクローンの中に存在する。図３Ａは、プール９ＤＮＡから分離されたＤＮＡリガーゼ活性をもつＤＮＡ分子の共通配列のために提案された二次構造の概略的表示である。ドメインＩの５ '末端及びドメインIIの３'末端は、プール（配列番号２５）の５'定常領域及び活性化された基質（配列番号２４）とそれぞれ塩基対合する。２つの相補的領域（配列番号２６の「ＮＮＮＮ」及び配列番号２７の「ＮＮＮＮ」）は、ステム構造を形成し、フランキングドメインを密に近接させる。点線は、連結接合部にある塩基と、２つの囲みの中の配列ＴＴＴ及びＡＧＡの間の配列との間に考えられる相互作用を表わしている。図３Ｂは、最小のＤＮＡ触媒（配列番号２８）の概略的表示である。図３Ａの中に示されたＤＮＡ構造内の保存されていない領域は、３'ホスホルイミダゾリド基質Ｓ１と５'−ヒドロキシル基質Ｓ２の間のホスホジエステル結合の形成が４７ヌクレオチド金属酵素Ｅ４７による触媒作用を受けている３フラグメント複合体を生成する目的で欠失させられた。図３Ｃは、触媒Ｅ４７による放射性標識された基質Ｓ２と活性化された基質Ｓ１の結合の時間的経移の変性アクリルアミドゲル分析である。活性化されたＳ１（レーン１及び５）又はＥ４７（レーン６）が不在である場合、いかなる反応も検出不能であった。図３Ｄは、Ｅ４７、Ｅ４７−３Ｔ、Ｅ４７−ＡＧＡ、Ｅ４７−ヘアピン及びプール９ｓｓＤＮＡによる触媒作用を受けた連結の初期速度を示す表である。活性化された基質Ｓ１（１μＭ）及び放射性標識されたＳ２（０.５μＭ；Ｓ２は〔 α−³²Ｐ〕−コルジセピン−５'−三リン酸塩（ＮＥＮ Dupont，Boston，ＭＡ）及び末端トランスフェラーゼ（Promega，Madison，ＷＩ）を用いて３'−末端を標識した）を、２５℃で異なる触媒（０.７５μＭ）と共にインキュベートした。反応条件は図１に示したとおりであるが、以下の点が変更された：３０ｍＭ Hepes、ｐＨ７.２、及び４ｍＭのＺｎＣｌ₂。１２％のポリアクリルアミド／８Ｍの尿素ゲル上でＤＮＡを分離した。Kaleida Graph を用いて、連結された分画と時間の関係を一次方程式に合わせることによって K_obs値を決定したが、これらの値は、２０％未満の産物形成で測定された２つの独立した実験の平均である。Ｅ４７−３Ｔ及びＥ４７−ＡＧＡは、保存されたＴＴＴ及びＡＧＡ配列がそれぞれ欠失させられているＥ４７誘導体である。Ｅ４７−ヘヤピンは、ヘヤピンが５'ＣＣＡＴＧ−３'によって置換されたＥ４７誘導体である。外部鋳型を含むバックグラウンド反応（図１参照）を、６時間のインキュベーション全体にわたって測定した。２×１０^-5時間^-1の最大速度に対応する産物は、鋳型の不在下では全く検出されなかった。図４Ａは、触媒反応に対するＭｇ²⁺、Ｚｎ²⁺、及びＣｕ²⁺の効果を示す１つの実験の変性アクリルアミドゲル分析である。指示された２価の金属イオン濃度で２０分間、反応をインキュベートした。Ｚｎ²⁺及びＭｇ²⁺が不在である場合（レーン２）又はＭｇ²⁺のみの場合（レーン３）、いかなる反応も検出されなかった。Ｍｇ²⁺は活性のために必要とされるものではなく、単独のＺｎ²⁺（レーン４）は、Ｚｎ²⁺とＭｇ²⁺を合わせた場合と同じ効率で反応に触媒作用を及ぼす。Ｃｕ²⁺ は、Ｚｎ²⁺（レーン５）と置換できることが見出された唯一の２価の金属である；これは、活性のためにＭｇ²⁺を必要としない。連結速度は、一価の金属イオンと無関係である。塩化カリウムはリチウム、塩化ナトリウム又は塩化セシウムで置換することも除去することもでき、産物形成に対する有意な影響はない。図４Ｂは、産物形成に対する亜鉛（○）及び銅（●）の濃度の影響を示すグラフである。反応インキュベーション時間は７分であった。図４Ｃは、log(K_obs)とｐＨの関係を示すグラフである。１０μＭのＣｕＣｌ₂ の存在下で、K_obsの対数とｐＨの間には、最高ｐＨ６.８まで０.７の勾配で線形の相関関係が存在する。それ以上のｐＨ値では、活性は−０.７の勾配で線形的に減少する。＋１に近い勾配は、反応の速度決定段階に陽子の引抜きが関与していることを示唆するが、−１の勾配は、陽子供与を表わす（Fersht,Enzyme Stru cture and Mechanism「酵素の構造及びメカニズム」（Freeman，New York,１９８５））。観察された速度は、３０〜１５０ｍＭの間の緩衝液濃度とは無関係である。同様の効果は、ｐＨ７.４まで４ｍＭでのＺｎ²⁺で観察された。それ以上のｐＨでは、活性が、おそらくは不溶性金属酸化物又は水酸化物の形成に起因して著しく低下する（Bailar，Jr.ら、Comprehensive Inorganic Chemistry 総合無機化学（Pergamon Press Ltd.,１９７３））。反応条件は、図３の説明中で規定される通りである。ＤＮＡリガーゼ活性をもつＤＮＡ分子の分離１本鎖（Naylorら、Biochemistry ５：２７２２−２７２８，１９６６）又は２本鎖（Luebkeら、J．Am．Chem，Soc.１１１：８７３３−８７３５，１９８９）ＤＮＡ鋳型のいずれに対してもオリゴデオキシヌクレオチドを非酵素的に連結させることが可能である。本発明者らは、非酵素的鋳型処理よりもさらに効率良くＤＮＡ連結の触媒として作用するＤＮＡ配列をランダム配列の大きなプール（図１）から分離できるか否かを決定するために、インビトロ選択戦略を設計した（Szostak，Trends Biochem．Sci．１７：８９−９３，１９９２；Chapmanら、C urr．Opin．Struct．Biol．４：６１８−６２２，１９９４；Breakerら、Trends Biotechnol.１２：２６８−２７５，１９９４；Joyce，Curr．Opin．Struct．B iol.４：３３１−３３６，１９９４）。この戦略を用いて、Ｚｎ²⁺／Ｃｕ²⁺依存性の金属酵素である小さい１本鎖ＤＮＡを分離した。酵素は、１つのオリゴデオキシヌクレオチドの５'−ヒドロキシル基及びもう１つのオリゴデオキシヌクレオチド上の３'ホスホルイミダゾリド基の縮合による新しいホスホジエステル結合の形成に触媒として作用し、複数の回転置換連結を示す。選択戦略の詳細は、図１に例示されている。９回の選択及び増幅サイクルの後、ＤＮＡプール（プール９）は効率の良い連結活性を表わした（図２Ａ）。活性化された基質と共にプール９ＤＮＡをインキュベートすると、連結接合部の予想通りのヌクレオチド配列及び適正な分子量を有する連結産物が生成される。選択された配列をさらに分析するために、プール９からのＤＮＡをクローニングし配列決定した。大部分のクローンは、可変的な長さ及び配列のスペーサ領域により分離された２つの小さなドメインからなる共通配列を含有している（図２Ｂ）。２つの小さなドメインは、全く異なるフランキング配列の中に埋め込まれており、もとのプールの中のいくつかの独立した配列が選択プロセスを通して実施されたことを表わしている。共通配列を点検すると、単純な鋳型よりも複雑であるが、それでも５'−ヒドロキシル基及び３'−ホスホルイミダゾリド基を近接させるような二次構造が示唆されている（図３Ａ）。共通配列に基づいて、２つの別々なＤＮＡ基質Ｓ１及びＳ２を連結する小さな４７ｎｔのｓｓＤＮＡ触媒（Ｅ４７）を設計した（図３Ｂ）。活性化された基板Ｓ１及びＥ４７触媒と共に放射性標識されたＳ２をインキュベートすると、予想通りの連結産物が結果として出現する（図３Ｃ）。産物形成には、反応中に３つの成分すべてが存在することが必要である。さらに、Ｓ１の３'−リン酸塩基は活性化されなくてはならない。Ｅ４７は、プール９よりも２倍の速さで連結反応の触媒として作用する。Ｅ４７内の小さい欠失は、触媒効率の重大な損失を結果としてもたらし（図３Ｄ）、触媒のために中央共通配列が必要であることを表わしている。Ｅ４７によるＳ１及びＳ２の連結の初期速度は、同じ条件下で単一の相補的鋳型による触媒作用を受けた同じ反応の速度よりも３４００倍高いものであり、鋳型処理されていないバックグラウンド連結よりも少なくとも１０⁵倍速い（図３Ｄ）。この速度増加は、インビトロ選択により得られるリボザイム（Sz ostak，Trends Biochem．Sci．１７：８９−９３，１９９２；Chapmanら、Curr ．Opin．Struct．Biol．４：６１８−６２２，１９９４；Breakerら、Trends Bi otechnol.１２：２６８−２７５，１９９４；Joyce，Curr．Opin．Struct．Biol .４：３３１−３３６，１９９４）及び触媒抗体（Lernerら、Science ２５２：６５９−６６７，１９９１）について得られた値に匹敵する。触媒は、反応の中で消費されないため、連結された産物が酵素から解離できることを条件として、Ｅ４７が数モル当量の基質Ｓ１及びＳ２の連結に触媒として作用できるようになると予想された。飽和濃度（１４０μＭ）の両基質と１μＭのＥ４７で、２５℃で０.６６時間^-1及び３５℃で２．４時間^-1の速度での多数の回転置換触媒作用が観察された（１０の回転置換が観察された）。これらの温度では、反応の最初の１０分以内でほぼ１当量の産物形成の急速な初期バーストが見られたことから、産物放出は速度を制限するものであると思われる。このバースト段階での初期連結速度は、飽和基質濃度で酵素について予想されたとおり、３０倍の範囲にわたり、Ｅ４７の濃度と正比例していた（Fersht，Enzyme Str ucture and Mechanism「酵素の構造とメカニズム」（Freeman，New York,１９８５））。K_obsと〔Ｅ４７〕の関係のプロットは、２５℃で３２時間^-1（０.０７分^-1）のK_catを生成した。２価の金属イオンは、リボザイム（Pyle，Science ２６１：７０９−７１４，１９９３）及び数多くのタンパク質酵素（Karlin，Science ２６１：７０１−７０８，１９９３）において非常に重要な役割を果たすことから、Ｍｇ²⁺及び／又はＺｎ²⁺が選択緩衝液中に存在していたため、ＤＮＡ触媒がこれらのイオンのいずれかを活性のために必要とすることになる、ということが予想された。実際には、連結反応はＺｎ²⁺（図４Ａ）に依存しているが、Ｍｇ²⁺を必要としない。アービングウイリアムズ系列(Ｂａ²⁺、Ｓｒ²⁺、Ｃａ²⁺、Ｍｇ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｆｅ²⁺ 、Ｃｏ²⁺、Ｎｉ²⁺、Ｃｕ²⁺、Ｚｎ²⁺)のすべてのメンバーならびにＰｂ²⁺及びＣｄ²⁺を、１０μＭ〜１０ｍＭの濃度で試験し、Ｃｕ²⁺のみがＺｎ²⁺に置換しうることがわかった。連結反応の効率は、２価金属イオン濃度に著しく依存している（図４Ｂ）。４ｍＭまでＺｎ²⁺の濃度を増大させると、活性が増強されたが、それ以上の濃度では、活性は急激に下降し、許容しがたい金属結合部位の存在を示唆している。銅についても類似の濃度依存性が見られたが、４００分の１低い濃度でのことであった。金属イオン特異性は、幾何形状及び／又はサイズの厳しい必要条件をもつ１つ又はそれ以上の金属イオン結合部位の存在を示唆している。連結メカニズムを洞察するため、定常状態前（単一回転置換）条件下での反応のｐＨ速度プロフィールを決定した（図４Ｃ）。Ｃｕ²⁺で表示された釣鐘型プロフィールは、連結反応の速度制限段階が部分的に、２つのイオン化可能な基（１つは酸性であり、もう１つは塩基性である）に依存しており、こうして、銅錯体が陽子トランスファーに関与している一般的な酸−塩基メカニズム（Fersht、En zyme Structure and Mechanism 「酵素の構造とメカニズム」(Freeman，New Yo rk，１９８５)の可能性が上昇しているということを示唆している。金属イオン水酸化物が、いくつかのリボザイム媒介ＲＮＡ分割反応において一般的な塩基として作用するものと考えられている（Pyle，Science ２６１：７０９−７１４，１９９３；Dahmら、Biochemistry３２：１３０４０−１３０４５，１９９３；Pa nら、Biochemistry３３：９５６１−９５６５，１９９４）。ｐＨ依存型折り畳み効果といったようなその他の可能性も同様にこれらの観察事実を説明することができる（Kaoら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA７７：３３６０−３３６４，１９８０）。修飾された酵素による修飾された基質の連結が、修飾された酵素の配列をもつ連結産物の形成を結果としてもたらすような形で、Ｅ４７及び基質Ｓ１及びＳ２を修飾した。このような３つの酵素（Ｅ）及びその対応する基質（Ｓ１及びＳ２）の配列は以下の通りである：これらの酵素とＥ４７の間の差は、（１）Ｅ４７と５'−ヒドロキシル含有基質Ｓ２の間に形成されたステム、（２）Ｅ４７と活性化された基質Ｓ１の間に形成されたステム、（３）Ｅ４７内の分子内ステム及び（４）Ｅ４７内のループにある。連結部位の推定上のコアの配列は変わらなかった。修飾された酵素は、酵素と基質の間の塩基対の数においてのみ互いに異なっている。修飾された酵素はそのそれぞれの基質の連結に触媒として作用し、このことは、図３Ｂに描かれたステム及びループ構造の少なくとも一部分の一次ヌクレオチド配列が酵素活性のために必要とされないこと、さらには、Ｓ¹−Ｅ¹及びＳ⁴−Ｅ⁶によって規定されたステム構造の存在下でリガーゼ活性を維持するためには酵素の未変更領域で充分であることを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者フイゼンガデビッドイー. アメリカ合衆国マサチューセッツ州ウィンスロップフォレストストリート 38 アパートメント３アール.

Claims

【特許請求の範囲】１．リガーゼ活性をもつ核酸分子を得るための方法において、ａ）各々がランダム配列領域をもつ、候補核酸分子の集団を提供する段階；ｂ）該集団を、（ｉ）基質核酸分子；及び（ii）該基質核酸分子の３'領域の一部分及び該集団内の候補核酸分子の各々の５'領域の一部分に対し相補的であり、かつ該集団からの候補核酸分子及び該基質核酸分子に対するその結合が該３'及び５'領域を並置し、該３'又は該５' 領域のいずれかの末端ヌクレオチドが活性化された基を含んでいる外部鋳型；と接触させる段階；ｃ）該集団からリガーゼ活性をもつ核酸分子の下位集団を分離する段階；ｄ）インビトロで該下位集団を増幅させる段階；ｅ）該増幅された下位集団について任意に段階ｂ〜ｄを反復する段階；及びｆ）該増幅された下位集団からリガーゼ活性をもつ該核酸分子を分離する段階；からなる方法。２．段階ｂ〜ｄの任意の反復が外部鋳型の非存在下で実施される請求項１に記載の方法。３．リガーゼ活性をもつ核酸分子又は基質核酸分子がＤＮＡである請求項１に記載の方法。４．基質核酸の５'末端ヌクレオチドがビオチン部分を含有する請求項１に記載の方法。５．活性化された基が基質の３'末端ヌクレオチド上の３'−ホスホルイミダゾリドである請求項１に記載の方法。６．リガーゼ活性をもつＤＮＡ分子を得るための方法において、ａ）各々がランダム配列領域をもつ、候補ＤＮＡ分子の集団を提供する段階；ｂ）基質核酸分子と該集団を接触させる段階；ｃ）該集団からリガーゼ活性をもつＤＮＡ分子の下位集団を分離する段階；ｄ）該下位集団をインビトロで増幅する段階；ｅ）該増幅された下位集団のために任意に段階ｂ〜ｄを反復する段階；及びｆ）該増幅された下位集団からリガーゼ活性をもつ該ＤＮＡ分子を分離する段階；からなる方法。７．基質核酸分子がＤＮＡである請求項６に記載の方法。８．基質核酸の５'末端ヌクレオチドがビチオン部分を含有する請求項６に記載の方法。９．活性化された基が、基質の３'末端ヌクレオチド上の３'−ホスホルイミダゾリドである請求項６に記載の方法。１０．触媒として作用できるＤＮＡ分子。１１．核酸基質内のリボヌクレオチドの存在を必要としない触媒として核酸基質に対し作用することのできるＤＮＡ分子。１２．リガーゼ活性を有する核酸分子。１３．核酸分子がＤＮＡである請求項１２に記載の核酸分子。１４．リガーゼ活性がＤＮＡリガーゼ活性である請求項１２に記載の核酸分子。１５．第２の基質核酸に対して第１の基質核酸を連結する能力をもつ核酸分子において、該連結の速度が、同じ反応条件下で鋳型処理することにより該基質核酸を連結する速度よりも速い核酸分子。１６．第１の基質核酸を第２の基質核酸に連結する能力をもつ触媒ＤＮＡ分子において、該第１の基質核酸が配列３'−Ｓ¹−Ｓ²−５'を含み、該第２の基質核酸が配列３'−Ｓ³−Ｓ⁴−５'を含み、それ自体配列５'−Ｅ'−ＴＴＴ−Ｅ²−ＡＧＡ−Ｅ³−Ｅ⁴−Ｅ⁵−Ｅ⁶−３'を含む触媒ＤＮＡ分子であって、ここで、Ｓ¹は、Ｓ²の３'末端に隣接して位置づけされた２個以上のヌクレオチドを含み、このＳ¹ヌクレオチドは、該ＴＴＴの５'末端に隣接して位置づけされたＥ¹ 内の同等の数のヌクレオチドに対し相補的であり；Ｓ²は、１〜３個のヌクレオチドを含み、Ｓ³は１〜６個のヌクレオチドを含み、Ｓ²の５'末端ヌクレオチド及びＳ³の３'末端ヌクレオチドが交互に活性化された基又はヒドロキシル基を含んでおり；Ｓ⁴は、Ｓ³の５'末端に隣接して位置づけされた２個以上のヌクレオチドを含み、このＳ⁴ヌクレオチドはＥ⁵の３'末端に隣接して位置づけされたＥ⁶内の同等の数のヌクレオチドに対して相補的であり；Ｅ¹は、該ＴＴＴの５'末端に隣接して位置づけされた２個以上のヌクレオチドを含み、このＥ¹ヌクレオチドはＳ²の３'末端に隣接して位置づけされたＳ¹内の同等の数のヌクレオチドに対して相補的であり；Ｅ²は、０〜１２個のヌクレオチドを含み；Ｅ³は、該ＡＧＡの３'末端に隣接して位置づけされた２個以上のヌクレオチドを含み、該Ｅ³ヌクレオチドは、Ｅ⁶の５'末端に隣接して位置づけされたＥ⁵内の同等の数のヌクレオチドに対し相補的であり；Ｅ⁴は、３〜２００個のヌクレオチドを含み；Ｅ⁵は、Ｅ⁶の５'末端に隣接して位置づけされた２個以上のヌクレオチドを含み、該Ｅ⁵ヌクレオチドは、該ＡＧＡの３'末端に隣接して位置づけされたＥ³内の同等のヌクレオチド数に対して相補的であり、Ｅ⁶は、Ｅ⁵の３'末端に隣接して位置づけされた２個以上のヌクレオチドを含み、該Ｅ⁶ヌクレオチドは、Ｓ³の５'末端に隣接して位置づけされたＳ⁴内の同等の数のヌクレオチドに対して相補的である、触媒ＤＮＡ分子。１７．Ｅ²が３〜４個のヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の触媒ＤＮＡ分子。１８．Ｓ²の最５'ヌクレオチドがＥ²の最５'ヌクレオチドと相補的であり；Ｓ³ の最３'ヌクレオチドがＥ²の最も５'から２番目のヌクレオチドに対して相補的であり、Ｓ³の最も３'から２番目のヌクレオチドがＥ²の最も５'から３番目のヌクレオチドに相補的である、請求項１７に記載の触媒ＤＮＡ分子。１９．Ｅ²が４つのヌクレオチドを含み、Ｓ³の最も３'から３番目のヌクレオチドがＥ²の最も５'から４番目のヌクレオチドに対し相補的である、請求項１８に記載の触媒ＤＮＡ分子。２０．ａ）Ｓ²が１つのヌクレオチドを含み；ｂ）Ｓ³が３つのヌクレオチドを含み；ｃ）Ｅ⁴が５つのヌクレオチドを含み；ｄ）Ｅ⁵及びＥ³が各々５つのヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の触媒ＤＮＡ分子。２１．第２の核酸分子に対して第１の核酸分子を連結する方法において、該第１及び第２の核酸分子をリガーゼ活性をもつ核酸分子と接触させる段階を含む方法。２２．リガーゼ活性をもつ該核酸分子がＤＮＡである、請求項２１に記載の方法。２３．リガーゼ活性がＤＮＡリガーゼ活性である請求項２１に記載の方法。２４．ａ）各々がランダム配列領域をもつ、候補核酸分子の集団を提供する段階；ｂ）該集団を、（ｉ）基質核酸分子：及び（ii）該基質核酸分子の３'領域の一部分及び該集団からの候補核酸分子の各々の５'領域の一部分に対し相補的であり、かつ該集団内の候補核酸分子及び該基質核酸分子に対するその結合が該３'及び５'領域を並置し、該３'又は該５' 領域のいずれかの末端ヌクレオチドが活性化された基を含んでいる外部鋳型；と接触させる段階；ｃ）該集団からリガーゼ活性をもつ核酸分子の下位集団を分離する段階；ｄ）インビトロで該下位集団を増幅させる段階；ｅ）該増幅された下位集団について任意に段階ｂ〜ｄを反復する段階；及びｆ）該増幅された下位集団からリガーゼ活性をもつ該核酸分子を分離する段階；により得られるリガーゼ活性をもつ核酸分子。２５．段階ｂ−ｄの任意の反復が外部鋳型の非存在下で実施される請求項２４に記載の核酸。２６．リガーゼ活性をもつ核酸分子がＤＮＡである請求項２４に記載のリガーゼ活性をもつ核酸分子。２７．ａ）基質核酸の５'末端ヌクレオチドがビオチン部分を含むか；又はｂ）活性化された基が該基質の３'末端ヌクレオチド上の３'−ホスホルイミダゾリドである；請求項２４に記載のリガーゼ活性をもつ核酸分子。２８．ａ）各々がランダム配列領域をもつ、候補ＤＮＡ分子の集団を提供する段階；ｂ）基質核酸分子と該集団を接触させる段階；ｃ）該集団からリガーゼ活性をもつＤＮＡ分子の下位集団を分離する段階；ｄ）該下位集団をインビトロで増幅する段階；ｅ）該増幅された下位集団のために任意に段階ｂ〜ｄを反復する段階；及びｆ）該増幅された下位集団からリガーゼ活性をもつ該ＤＮＡ分子を分離する段階；によって得られるリガーゼ活性をもつＤＮＡ分子。２９．ａ）基質核酸の５'末端ヌクレオチドがビオチン部分を含むか、又はｂ）活性化された基が該基質の３'末端ヌクレオチド上の３'−ホスホルイミダゾリドである請求項２８に記載のリガーゼ活性をもつＤＮＡ分子。