KR19990022724A - 촉매 ｄｎａ - Google Patents

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KR19990022724A
KR19990022724A KR1019970709166A KR19970709166A KR19990022724A KR 19990022724 A KR19990022724 A KR 19990022724A KR 1019970709166 A KR1019970709166 A KR 1019970709166A KR 19970709166 A KR19970709166 A KR 19970709166A KR 19990022724 A KR19990022724 A KR 19990022724A
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버나드 쿠엔우드
데이비드 이 휘잰가
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어니스트 엠. 해데드
더 제너럴 하스피털 코포레이션
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Abstract

본 발명은 핵산 분자, 더욱 상세하게 촉매 활성을 갖는 DNA 및 이러한 핵산 분자의 수득방법 및 이용방법을 특징으로 한다.

Description

촉매 ＤＮＡ
본 발명은 촉매 활성을 갖는 DNA 분자 및 이러한 DNA 분자의 수득방법 및 이용방법에 관계한다.
리보자임(ribozyme)은 특수한 화학반응(예컨대, RNA의 절단, DNA의 절단, RNA의 중합, 및 RNA의 복제)을 수행하는 고도로 구조화된 RNA 분자로서, 흔히 대부분의 유전자조작 효소들의 분자속도론적 효율과 대등한 분자속도론적 효율을 갖는다.
[발명의 요약]
본 발명은 촉매 활성을 갖는 핵산 분자, 및 이러한 핵산 분자의 수득방법 및 이용방법을 특징으로 한다.
본 발명의 방법들은 무작위 서열(random sequences)들을 포함하는 단일-가닥 핵산분자들(예컨대, DNA, RNA, 또는 이들의 변형 또는 조합)의 풀(pool)로 부터 목적 특성(예컨대, 리가제(ligase) 활성과 같은 촉매 활성)을 갖는 핵산분자들의 연속적인 생체외(in vitro) 선별(selection) 및 분리(isolation) 과정을 포함한다. 이어서 분리된 핵산 분자들은 예컨대, 폴리메라제 연쇄반응법(PCR)에 의해 증폭된다.
선별 및 증폭의 라운드는 1회 이상 반복되고, 각각의 라운드 이후에, 분자들의 풀은 목적 활성을 갖는 분자들에 대해 농축된다. 최초의 풀내의 목적 분자의 수가 매우 작을 수 있지만, 연속적인 선별 스킴은 목적 분자의 반복적인 농축에 의해 이러한 문제점을 극복한다.
본 발명에 이용된 단일-가닥 핵산 분자들의 풀은 무작위 핵산 분자(random nucleic acid molecules) 또는 무작위 서열(random sequences)을 포함하는 것으로 불릴 수 있다. 이러한 일반적인 용어는 하나 이상의 완전 무작위 서열(fully random sequence)의 지역들을 갖는 분자 또는 서열을 설명하는데 이용된다. 완전 무작위 서열에서는, 서열내의 각 위치에 A, T/U, C, 또는 G가 나타날 확률이 거의 같다. 물론, 핵산 분자의 제조에 이용된 일부 방법상의 제한이 각 위치에서 각각의 뉴클레오티드가 나타날 확률이 완전히 동일한 완전 무작위 서열의 합성을 다소 어렵게 한다. 따라서, 확률이 대강 동일한 서열들을 완전 무작위 서열로 간주한다.
불완전 무작위 서열(partially random sequences) 및 불완전 무작위화 서열(partially randomized sequences)에서는 각 위치에서 A, T/U, C, 또는 G가 존재한 확률이 25%가 아니고, 대신에 같지 않은 확률로 존재한다. 예를 들어, 불완전 무작위 서열에 있어서, 일정한 위치에 A가 존재할 확률은 70%이고 그 위치에서 T/U, C, 또는 G가 존재한 확률은 각각 10%일 수 있다. 더욱이, 확률은 불완전 무작위화 지역내의 각 위치에서 동일하거나 상이할 수 있다. 따라서, 불완전 무작위 서열은 서열이 완전히 무작위인 하나 이상의 위치들, 서열이 불완전 무작위인 하나 이상의 위치들 및/또는 서열이 규정된 하나 이상의 위치를 포함할 수 있다.
불완전 무작위 서열들은 공지의 서열의 변이체를 만들기를 원하는 경우에 특히 유용하다. 예를 들어, 특정한 50 뉴클레오티드 서열이 목적으로 하는 촉매 활성을 갖고 위치 5, 7, 8, 및 9가 이러한 촉매 활성에 매우 중요하다는 것을 안다면, 위치 5, 7, 8, 및 9의 염기들은 촉매 활성 서열과 동일하고 다른 위치들은 완전히 무작위화된 50 뉴클레오티드 서열의 불완전 무작위 버전(partially random version)을 만들 수 있다. 그 대신에, 위치 5, 7, 8, 및 9는 불완전 무작위화되었지만, 원래 분자의 각 위치에서 발견되는 염기들에 강하게 편향되어 있으며, 나머지 모든 위치들은 완전히 무작위환된 불완전 무작위 서열을 만들 수 있다. 이러한 유형의 불완전 무작위 서열은 그로부터 촉매 핵산 분자들이 선별되는 풀(pool)에서 바람직하다. 임의의 무작위화된 지역의 서열은 하나 이상의 증폭 단계 중의 돌연변이 유발과정에 의해 추가로 무작위화 될 수 있다.
무작위 또는 불완전 무작위 서열 이외에, 하나 이상의 규정 서열(defined sequence)의 지역을 갖는 것이 바람직할 수 있다. 규정 서열은 그 분자의 창작자에 의해 선택되었거나 또는 공지된 서열이다. 규정 서열 지역은 그들이 규정된 상보성 프라이머(defined complementary primers)에 의해 인식될 수 있기 때문에 핵산 분자의 분리 또는 PCR 증폭에 유용하다. 규정 서열 지역은 무작위 지역에 측접해 있거나 또는 무작위 지역과 혼재될 수 있다. 규정 서열은 원하는 임의의 길이일 수 있고 본 발명이 속하는 기술분야의 지식을 이용하여 손쉽게 설계될 수 있다 (예컨대, Ausuvel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, New York, New York (1994); Ehrlich, PCR Technology, Stockton Press, New York, New York (1989); 및 Innis et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., San Diego, CA (1990) 참조).
본 발명의 선별 방법(selection method)은 무작위 서열들을 포함하는 핵산 분자들의 풀을 촉매 활성에 유리한 조건(예컨대, 핵산 분자 농도, 온도, pH 및 염 포함)하에서 목적으로 하는 촉매 활성에 대한 기질과 접촉시키는 과정을 포함한다. 촉매 활성을 갖는 핵산 분자들은 촉매 활성을 갖지 않는 분자들로부터 분리되고, 이어서 촉매 활성을 갖는 분리된 핵산 분자들은 PCR 등을 이용해서 증폭된다.
접촉(contacting), 분리(partitioning) 및 증폭(amplification)은 원하는 횟수 만큼 반복될 수 있다. 각 라운드 이후에 풀에는 촉매 핵산 분자들이 더욱 농축되기 때문에, 여러 사이클의 선별(접촉, 분리 및 증폭)이 바람직할 수 있다. 사람들은 추가로 선별해도 촉매 활성의 실질적인 증가가 더 이상 관찰되지 않을 만큼 많은 사이클의 선별을 선택하거나 또는 훨씬 적은 사이클의 선별을 행할 수 있다.
본 발명이 속하는 기술분야에 공지된 방법들이 이러한 선별 및 분리 과정의 특정한 단계에서 이용될 수 있고, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자들은 Ellington and Szostak, Nature 346:818-822, 1990; Lorsch and Szostak, Nature 371:31-36, 1994; Tuerk and Gold, Science 249:505-510, 1990; 및 본원에 기술된 방법을 참고할 수 있다.
또한, 향상된 촉매 활성을 시현하는 분자들을 생성하고 분리하기 위하여 분리된 촉매 활성 핵산들에 돌연변이를 유발할 수 있다. 예를 들어, 특정한 촉매 활성 핵산 서열에 기초한 단일-가닥 핵산 서열의 변성 풀(degenerate pool)을 만들거나, 우선 촉매 핵산 서열에서 중요한 지역을 확인하고나서(예를 들어, 표준 결실 분석(standard deletion analysis)에 의해), 그러한 중요한 지역에서 변성 서열들을 포함하는 후보 촉매 핵산 분자들의 풀을 만들 수 있다.
당업자들은 다수의 촉매 핵산 분자들의 서열을 결정(sequencing)하고 이들 서열들을 비교(comparing)함으로써 촉매 활성 핵산 공동서열(consensus sequences)을 용이하게 확인할 수 있다. 몇몇 경우에, 이러한 서열결정 및 비교에 의해 다수의 상이한 보존 서열(conserved sequences)들의 존재가 드러날 것이다. 이 경우에, 분리된 서열들 전부 또는 대부분에서 공통적으로 존재하는 코어 서열(core sequence)을 확인할 수 있다. 이러한 코어 서열 또는 그의 변이체들은 개량된 촉매(improved catalysis)를 선별하기 위한 출발점으로 이용될 수 있다. 서열의 변이체(variant)라 함은 서열의 불완전 무작위화(partially randomizing)에 의해 만들어진 서열을 의미한다.
이용된 무작위화 지역(randomized regions)의 크기는 촉매 부위(catalytic site)를 제공하기에 충분한 것이어야 한다. 따라서, 최초의 선별에 이용된 무작위화 지역은 바람직하게 10과 300 사이의 뉴클레오티드, 예컨대, 25와 180 사이의 뉴클레오티들을 포함한다.
더 많은 분자들을 분리하기 위해서는 선별 단계의 엄격성(stringency)을 높이는 것이 바람직할 수 있다. 선별 단계의 엄격성은 기질 농도를 낮춤으로써 증가시킬 수 있다. 촉매 선별 단계의 엄격성은 리간드 농도 또는 반응 시간을 줄임으로써 증가시킬 수 있다.
따라서, 하나의 양상에서, 본 발명은 리가제 활성을 갖는 핵산 분자의 수득방법을 특징으로 한다. 이러한 방법의 제 1 단계에서, 각각 무작위 서열의 지역을 포함하는, 후보 핵산 분자들의 집단은 기질 핵산 분자 및 외부 주형(external template)과 접촉된다. 외부 주형은 기질 핵산 분자의 3' 지역의 일부분 및 집단내의 각각의 후보 핵산 분자들의 5' 지역의 일부분에 대해 상보적이다. 그렇지않으면, 외부 주형은 기질 핵산 분자의 5' 지역의 일부분 및 집단내의 각각의 후보 핵산 분자들의 3' 지역의 일부분에 대해 상보적일 수 있다. 기질 핵산 분자 및 집단으로 부터의 후보 핵산 분자에 대한 외부 주형의 결합은 분자들 중 하나의 3' 지역과 나머지 분자의 5' 지역을 병치시킨다.
병치된 지역의 말단 뉴클레오티드들중 하나(5' 또는 3' 뉴클레오티드)는 활성화 기(activated group)를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 이용될 수 있는 활성화 기들은 5'-포스포로(2-메틸)이미다졸리드, 5'-포스포르이미다졸리드, 시아노겐 브로마이드, 및 카르보디이미드(예컨대, 1-에틸-3-(3'-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(CDI), 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리닐-(4)-에틸)-카르보디이미드 메토-p-톨루엔술포네이트, CDI-1, 및 CDI-2)를 포함하나, 반드시 이들로 국한되는 것은 아니다. 구체적인 예로, 활성화 기는 기질의 3' 말단 뉴클레오티드의 3'-포스포르이미다졸리드이다. 활성화 기들은 본 발명이 속하는 기술분야에 공지된 방법을 이용함으로써 본 발명의 방법에 이용된 핵산 분자들에 첨가된다.
대안으로, 바람직한 경우, 이러한 제 1 단계 외부 주형화(external templating)은 생략될 수 있다. 외부 주형화는 본 발명의 선별 방법에 필수적인 것은 아니다.
본 발명 방법의 제 2 단계에서는, 리가제 활성을 갖는 핵산 분자들의 2차집단(subpopulation)이 집단으로 부터 분리된다. 이것은 예컨대, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)에 이은 선택성 PCR 증폭(selective PCR amplification)에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 기질 핵산 및/또는 집단으로 부터의 핵산은 특이적인 결합 쌍[specific binding pair]의 첫 번째 구성원(예컨대, 비오틴)을 포함할 수 있다. 구체적인 예로, 기질 핵산의 말단 뉴클레오티드(예컨대, 기질 핵산의 5' 말단 뉴클레오티드) 및/또는 외부 주형과 병치되지 않은 집단으로부터의 핵산 분자가 비오틴에 의해 표지될 수 있다. 비오틴을 포함하는 분자의 분리는 분자들을 고정된 아비딘, 예컨대 스트렙트아비딘 아가로오스 친화성 컬럼과 접촉시킴으로써 이루어질 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자들에게 공지된 다른 특이적인 결합 쌍들이 본 발명의 방법에 이용될 수 있다.
분리된 2차집단은 예컨대, PCR을 이용함으로써 생체외에서 증폭될 수 있다. 선택성 PCR(selective PCR)에서, 제 1의 프라이머는 기질 핵산 분자의 서열에 대해 상보적이고, 제 2의 프라이머는 집단내의 서열의 반대 가닥(opposite strand)에 대해 상보적이다. 따라서 이들 프라이머들의 이용은 집단으로부터의 핵산 분자에 대한 기질의 연결의 생성물인 핵산 분자들만의 증폭을 초래한다. 추가 라운드의 선별을 위한 핵산 분자들의 집단을 만들기 위해, 네스티드 PCR 증폭(nested PCR amplification)이 기질 핵산에 연결된 집단으로부터의 핵산의 말단 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머를 이용하여 수행될 수 있다.
접촉, 분리 및 증폭의 상술한 단계들은 수득된 핵산 분자들의 2차집단에 대해 반복될 수 있다. 추가 라운드의 선별이 외부 주형의 존재 또는 부재하에서 수행될 수 있다. 상술한 방법을 이용하여 분리된 핵산 분자들은 벡터(예컨대, 플라스미드)내에 2차클로닝되고 서열분석(sequence analysis) 등에 의해 추가로 특성화될 수 있다.
두 번째 양상에 있어서, 본 발명은 촉매로 기능할 수 있는 DNA 분자를 특징으로 한다. 촉매는 촉매가 없었다면 화학반응이 곤란한 조건(에컨대, 저온, 낮은 반응물 농도 또는 증가된 반응속도)하에서 화학반응이 진행될 수 있게 하는 분자이다.
세 번째 양상에 있어서, 본 발명은 핵산 기질에 대해서 촉매로 기능할 수 있는 DNA 분자를 특징으로 한다. 이러한 촉매작용은 핵산 기질내의 리보뉴클레오티드의 존재를 필요로 하지 않는다.
네 번째 양상에 있어서, 본 발명은 DNA 또는 RNA 리가제 활성과 같은 리가제 활성을 갖는 핵산 분자를 특징으로 한다. 핵산 분자는 DNA, RNA 또는 이들의 조합 또는 변형일 수 있다.
다섯 번째 양상에 있어서, 본 발명은 제 1 기질 핵산을 제 2 기질 핵산에 연결(ligating)할 수 있는 핵산 분자를 특징으로 한다. 본 발명의 핵산 분자에 의해 촉매된 연결의 속도는 예컨대, 기질 농도, 주형/효소 농도, 기질과 주형/효소 사이의 염기-쌍 상호작용의 특성과 양(quantity), 활성화 기의 타입 및 염, pH, 및 온도와 같은 변수를 포함하는 동일한 반응조건하의 주형화(templating)에 의한 기질 핵산의 연결 속도 보다 빠르다. 주형화는 주형 핵산 가닥의 인접 지역에 혼성화될 때 두 개의 기질 핵산 분자들을 연결하는 과정이다.
여섯 번째 양상에서, 본 발명은 제 1 기질 핵산과 제 2 기질 핵산을 연결시킬 수 있는 촉매 DNA 분자를 특징으로 한다. 제 1 기질 핵산은 서열 3'-S1-S2-5'을 포함하고, 제 2 기질 핵산은 서열 3'-S3-S4-5'을 포함하며, 촉매 DNA 분자는 서열 5'-E1-TTT-E2-AGA-E3-E4-E5-E6-3'을 포함한다.
이러한 기질 및 촉매 DNA 분자에 있어서, S1은 S2의 3' 말단에 인접하여 위치된 적어도 두 개(예컨대, 2-100, 4-16, 또는 8-12)의 뉴클레오티드들을 포함한다. S1뉴클레오티드들은 TTT의 5' 말단에 인접하여 위치된 E1에 있는 동등한 수의 뉴클레오티드들에 대해 상보적이다.
S2은 1-3(예컨대, 1) 뉴클레오티드들을 포함하고, S3은 1-6(예컨대, 3) 뉴클레오티드들을 포함하며, S2의 5' 말단 뉴클레오티드와 S3의 3' 말단 뉴클레오티드는 선택적으로 활성화 기 또는 히드록시기를 포함한다.
S4는 S3의 5' 말단에 인접하여 위치된 적어도 두 개(예컨대, 2-100, 4-16, 또는 8-12)의 뉴클레오티드들을 포함한다. S4뉴클레오티드는 E5의 3' 말단에 인접하여 위치된 E6에 있는 동등한 수의 뉴클레오티드들에 대해 상보적이다.
E1은 TTT의 5' 말단에 인접하여 위치된 적어도 두 개(예컨대, 2-100, 4-16, 또는 8-12)의 뉴클레오티드들을 포함한다. E1뉴클레오티드는 S2의 3' 말단에 인접하여 위치된 S1에 있는 동등한 수의 뉴클레오티드들에 대해 상보적이다.
E2는 0-12 뉴클레오티드들을 포함하는데, 예를 들어 3-4 뉴클레오티드들을 포함한다.
E3은 상기 AGA의 3' 말단에 인접하여 위치된 적어도 두 개(예컨대, 2-100, 3-50, 5-20 또는 5)의 뉴클레오티드들을 포함하고, 상기 E3뉴클레오티드는 E6의 5' 말단에 인접하여 위치된 E5에 있는 동등한 수의 뉴클레오티드들에 대해 상보적이다.
E4는 적어도 세 개(예컨대, 3-200, 3-30, 3-8, 4-6 또는 5)의 뉴클레오티드들을 포함한다. 그렇지 않으면, E4는 0개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이 경우에, E3의 3' 말단과 E5의 5' 말단은 다른 핵산 분절(예컨대, E4)에 연결되지 않을 것이고, 따라서 효소는 두 개의 떨어진 핵산 분자들(첫 번째는 5'-E1-TTT-E2-AGA-E3-3'을 포함하고, 두 번째는 5'-E5-E6-3'을 포함)로 구성될 것이다.
E5는 E6의 5' 말단에 인접하여 위치된 적어도 두 개(예컨대, 2-100, 3-50, 5-20 또는 5)의 뉴클레오티드들을 포함한다. E5뉴클레오티드는 AGA의 3' 말단에 인접하여 위치된 E3에 있는 동등한 수의 뉴클레오티드들에 대해 상보적이다.
E6은 E5의 3' 말단에 인접하여 위치된 적어도 두 개(예컨대, 2-100, 4-16 또는 8-12)의 뉴클레오티드들을 포함한다. E6뉴클레오티드는 S3의 5' 말단에 인접하여 위치된 S4에 있는 동등한 수의 뉴클레오티드들에 대해 상보적이다.
예컨대, S1및 E1, S4및 E6, 또는 E3및 E5에 의해 형성된 긴 스템 구조(long stem structure)의 경우에, 스템 구조들은 스템 구조가 유지된다면 부정합(mismatch)을 포함할 수 있다.
S2의 5' 모스트 뉴클레오티드(5' most nucleotide), S3의 3' 모스트 뉴클레오티드, 및 S3의 두 번째 3' 모스트 뉴클레오티드(second 3' most nucleotide)는 각각 E2의 5' 모스트 뉴클레오티드, E2의 두 번째 5' 모스트 뉴클레오티드, 및 E2의 세 번째 5' 모스트 뉴클레오티드에 상보적이다. 또한, E2는 4개의 뉴클레오티드들을 포함할 수 있고, S3의 세 번째 3' 모스트 뉴클레오티드는 E2의 네 번째 5' 모스트 뉴클레오티드에 대해 상보적일 수 있다.
일곱 번째 양상에서, 본 발명은 제 1 핵산 분자를 제 2 핵산 분자에 연결하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법에서, 제 1 및 제 2 핵산 분자들은 리가제 활성(예컨대, DNA 리간제 활성)을 갖는 핵산 분자와 접촉된다. 리가제 활성을 갖는 핵산 분자 및 제 1 및 제 2 핵산 분자들은 DNA, RNA 또는 이들의 변형 또는 조합을 포함할 수 있다.
DNA 올리고뉴클레오티드 합성의 용이성 및 이들의 비교적 높은 안정성은 예컨대, 산업, 연구 및 치료 용도의 단백질, 및 RNA와 같은 다른 바이오폴리머 촉매를 능가하는 중요한 이점이다. 본 발명의 다른 특징들 및 이점들은 이하의 바람직한 실시예의 상세한 설명 및 청구의 범위로 부터 자명해질 것이다.
도 1은 DNA 리가제 활성을 갖는 DNA 분자를 분리하는데 이용된 생체외 선별 방법(in vitro selection strategy)의 개략도이다. 단일 가닥 DNA(ssDNA) 풀내의 각 분자는 PCR 프라이머 5' GGAACACTATCCGACTGGCACC-3'(서열 29) 및 5'-비오틴-CGGGATCCTAATGACCAAGG-3' (서열 30)에 대해 상보적인 서열을 갖는 불변 부위(constant region)에 의해 측접되는 116 무작위 염기들을 포함하였다. 풀을 고상 포스포라미다이트 케미스트리(solid-phase phosphoramidite chemistry)에 의해 제조하고 PCR(Ellington et al., Nature 355:850-852, 1992)에 의해 증폭하여 약 32 카피의 3.5×1014의 상이한 분자들을 수득하였다. 단일 가닥 DNA를 복 등 (Bock et al., Nature 355:564-566, 1992)에 의해 기술된 방법대로 증폭된 풀로부터 마련하였다. 활성화 기질(5'-비오틴-AAGCATCTAAGCATCTCAAGC-p-Im (서열 31)은 5' 비오틴 기와 3'-포스포르이미다졸리드(Chu et al., Nucleic Acids Res. 14:5591-5603, 1986)를 포함하였다. DNA 풀(0.5 μM)의 8 카피들을 선별 완충액(30 mM Hepes, pH 7.4, 600 mM KCl, 50 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2)내에서 1 μM 활성화 기질 및 풀의 5' 말단 및 활성화 기질의 3' 말단에 대해 상보적인 1 μM 외부 주형(5'-CGGATAGTGTTCCGCTTGAGATGCTT-3')과 함께 인큐베이션하였다. 2시간 동안 인큐베이션한 후, EDTA를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 24시간 후 0.5% 연결 생성물(ligated product)이 존재하였다. 외부 주형이 없는 상태에서는 생성물 형성이 관찰되지 않았다. 사이클 7에서는, 풀 활성이 외부 주형에 대해 독립적이었는데, 이것은 나머지 풀 분자들이 내부 기질 결합 부위(internal substrate binding site)로 이용되었다는 것을 가리킨다. 사이클 8 및 9에서는, 외부 주형이 첨가되지 않았고 선별 엄격성(selection stringency)을 증가시키기 위해, 반응시간은 각각 2 및 0.5분으로 감소되었다. 연결된 분자들을 분리하기 위해, 반응된 풀을 스트렙트아비딘 아가로오스 친화성 컬럼(Pierce, Rockford, IL)을 통과시키고, 연결되지 않은 풀은 변성 조건(3 M 요소에 이어 150 mM NaOH, 각각 40 컬럼 용적)하에서 컬럼 밖으로 씻어내었고, 연결된 분자들은 과량의 유리 비오틴으로 특이적으로 용출하였다 (Wilson et al., Nature, in press, 1995). 풀 분자들의 5'히드록시에 대한 기질 연결에 대해 선별하기 위해, 분리된 DNA를 기질 서열에 대해 상보적인 제 1 프라이머와 풀의 3' 불변 부위에 대해 상보적인 제 2의 프라이머를 이용하여 선택적으로 PCR 증폭(사이클 6-9에서만)하여 겔 정제하였다. 이어서 이 풀을 제 1 세트의 프라이머에 의해 네스티드 PCR하고, 겔 정제한 후 ssDNA 분리를 위해 재-증폭하였다 (Bock et al., Nature 355:564-566, 1992). 9 사이클의 선별-증폭이 수행된 후, 풀 활성(pool activity)은 일정하게 유지되었다.
도 2a는 풀 9 ssDNA에 의해 촉매된 연결 반응의 시간 경과에 따른 변성 아크릴아마이드 겔 분석(denaturing acrylamide gel analysis) 결과를 도시한 것이다. 내부 표지된 풀 9 DNA(0.5 μM)를 표기된 시간 동안 선별 완충액내에서 활성화 기질(1 μM)과 함께 인큐베이션하였다. 대조군 반응에서, 기질은 활성화되지 않았다 (레인 5). DNA들을 6% 폴리아크릴아마이드/8M 요소 겔에서 전기영동하여 분리하였다. 몰레큘러 다이내믹스 포스포르이메이져(Molecular Dynamics Phosphorimager)를 이용하여 방사성을 검출하였다.
도 2b는 풀 9 DNA로부터 분리된 클론들의 서열들의 개략도이다. 풀 9로부터의 DNA를 PCR에 의해 증폭시키고 pT7Blue T-Vector(Novagen, Madison, WI)내에 클로닝하였다. 분석된 각각의 클론들을 표준 디데옥시 서열결정방법을 이용하여 양 방향으로 서열결정하였다. 도면에 도시된 21 서열들(서열 1-21)은 두 개의 보존 도메인(서열 22 및 23)으로 구성된 공통 서열(consensus sequence)을 공유한다. 공통서열내의 대문자 활자 및 소문자 활자들은 각각 고도로 및 중간 정도로 보존된 위치들을 가리킨다. X 및 Z은 비보존되었지만 상보적인 염기들을 나타낸다. 도메인 I의 굵은 T는 클론의 50%에서 존재한다.
도 3a는 풀 9 DNA로 부터 분리된 DNA 리가제 활성을 갖는 DNA 분자들의 공통 서열에 대한 제안된 2차 구조의 개략도이다. 도메인 Ⅰ의 5'말단과 도메인 Ⅱ의 3' 말단은 풀의 5' 불변 부위(각각 서열 25 및 활성화 기질 (서열 24))와 염기쌍을 형성한다. 두 개의 상보성 지역(서열 26의 NNNN 및 서열 27의 NNNN)들은 스템 구조를 형성하고 측접하는 도메인들(flanking domains)을 가까이 모아준다. 점선은 연결 접합부에 있는 염기들 사이 및 두 개의 박스안의 서열들, TTT 및 AGA 사이의 가능한 상호작용을 가리킨다.
도 3b는 최소 DNA 촉매[minimum DNA catalysis](서열 28)의 개략도이다. 3' 포스포르이미다졸리드 기질 S1과 5'-히드록시 기질 S2 사이의 포스포다이에스테르 결합의 형성이 47 뉴클레오티드 메탈로엔자임 E47에 의해 촉매되는 3-단편 복합체를 만들기 위해서 도 3a에 도시된 DNA 구조내의 비-보존된 지역들은 결실시켰다.
도 3c는 활성화 기질 S1과 방사성 표지된 기질 S2의 촉매 E47에 의한 연결의 시간 경과에 따른 변성 아크릴아마이드 겔 분석 결과이다. 활성화 S1(레인 1 및 5) 또는 E47(레인 6)이 없는 경우에는 반응이 검출되지 않았다.
도 3d는 E47, E47-3T, E47-AGA, E47-헤어핀 및 풀 9 DNA에 의해 촉매된 연결의 최초 속도를 도시한 표이다. 활성화 기질 S1 (1μM) 및 방사성 표지된 S2 (0.5μM; S2는 [α-32P]-코르디세핀-5'-트리포스페이트(NEN Dupont, Boston, MA) 및 터미널 트랜스페라제(Promega, Madison, WI)를 이용하여 3'-말단 표지되었다)를 25℃에서 여러 가지 상이한 촉매들(0.75μM)과 함께 인큐베이션하였다. 반응조건은 다음의 변경을 가한 것을 제외하고는 도 1에서와 같다: 30 mM Hepes, pH 7.2, 및 4 mM ZnCl2. DNA를 12% 폴리아크릴아마이드/8M 요소 겔에 의해 분리하였다. Kobs값은 연결된 분율들 대 시간을 KaleidaGraph를 이용하여 1차 방정식(linear equation)으로 피팅함으로써 구하였고, 20% 생성물 형성 미만에서 측정된 두 개의 독립적인 실험의 평균값이다. E47-3T 및 E47-AGA는 각각 보존된 TTT 및 AGA 서열이 결실된 E47 유도체들이다. E47-헤어핀은 헤어핀이 5'-CCATG-3'로 대체된 E47 유도체이다. 외부 주형을 포함하는 기초 반응(background reaction)(도 1 참조)은 6시간 인큐베이션 기간까지 측정되었다. 주형이 없는 상태에서는 생성물이 검출되지 않았는데, 이것은 2×10-5hr-1의 최대속도(maximum rate)에 해당한다.
도 4a는 Mg2+, Zn2+및 Cu2+의 촉매작용에 대한 효과를 보여주는 실험의 변성 아크릴아마이드 겔 분석이다. 반응물들은 표시된 2가 금속 이온 농도에서 20분간 인큐베이션되었다. Zn2+및 Mg2+가 없는 상태(레인 2) 또는 Mg2+만 존재하는 상태(레인 3)에서는 반응은 검출되지 않았다. Mg2+는 활성을 위해 요구되지 않았고, Zn2+단독(레인 4)은 Zn2+및 Mg2+가 공존하는 경우와 동일한 효율로 반응을 촉매한다. Cu2+는 Zn2+를 대체할 수 있는 것으로 밝혀진 유일한 2가 금속이다(레인 5); 그것은 활성을 위해 Mg2+를 필요로 하지 않는다. 연결의 속도는 1가 금속이온과는 무관하다. 염화칼륨은 리튬, 염화나트륨, 또는 염화세슘에 의해 대체되거나 생성물 형성에 큰 영향 없이 제거될 수 있다.
도 4b는 아연(○) 및 구리(●) 농도의 생성물 형성에 대한 영향을 도시한 그래프도이다. 반응 인큐베이션 시간은 7분이었다.
도 4c는 로그 Kobs값 대 pH를 도시한 그래프도이다. 10 μM CuCl2의 존재하에서, Kobs값과 pH 사이에는 pH 6.8 까지 경사 0.7의 일차적인 관계(linear correlation)가 있다. 높은 수소이온농도에서, 활성은 경사 -0.7로 일차적으로 감소한다. 경사가 +1에 근접한다는 것은 양성자 추출(proton abstraction)이 반응의 속도 결정단계에 관여한다는 것을 시사하는 반면에, -1의 경사는 양성자 공여(proton donation)를 가리킨다(Fersht, Enzyme Structure, and Mechanism (Freeman, New York, 1985). 관찰된 속도는 30-150 mM 사이의 완충액 농도와는 무관하였다. 유사한 효과가 4 mM의 Zn2+에서 pH 7.4 까지 관찰되었다. 높은 수소이온농도에서, 활성은 급격하게 감소하였는데, 이것은 아마도 불용성 금속 산화물 또는 수산화물의 생성에 기인할 것이다 (Bailar, Jr. et al., Comprehensive Inorganic Chemistry (Pergamon Press Ltd., 1973)). 반응조건은 도 3의 설명에서 특정한 바와 같았다.
DNA 리가제 활성을 갖는 DNA 분자의 분리
올리고데옥시뉴클레오티드들은 단일가닥(Naylor et al., Biochemistry 5:2722-2728, 1966) 또는 2중가닥(Luebke et al, J. Am. Chem. Soc. 111:8733-8735, 1989) DNA 주형에 비효소적으로 연결될 수 있다. 우리는 비-효소적 주형화(non-enzymatic templating) 보다 더 효과적으로 DNA 연결을 촉매하는 DNA 서열들이 무작위 서열들의 큰 풀로부터 분리될 수 있는지를 확인하기 위해서 생체외 선별 방법(Szostak Trends Biochem. Sci. 17:89-93, 1992; Chapman et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 4:618-622,1994; Breaker et al., Trends Biotechnol. 12:268-275, 1994; Joyce, Curr. Opin. Struct. Biol. 4:331-336, 1994)을 설계하였다 (도 1 참조). 이러한 방법을 이용하여, Zn2+/Cu2+-의존성 메탈로엔자임인 작은 단일-가닥 DNA를 분리하였다. 상기 효소는 하나의 올리고데옥시뉴클레오티드의 5'히드록시기와 다른 올리고데옥시뉴클레오티드의 3'-포스포르이미다졸리드기의 축합에 의해 새로운 포스포다이에스테르 결합의 형성을 촉매하고, 다수 회전 연결(multiple turnover ligation)을 보여준다.
선별 방법의 자세한 사항은 도 1에 설명하였다. 9 사이클의 선별 및 증폭 이후에, DNA 풀(풀 9)은 효율적인 연결 활성을 시현하였다(도 2a). 풀 9 DNA를 활성화 기질과 함께 인큐베이션하여 정확한 분자량을 갖고 연결 접합부에서 예상대로의 뉴클레오티드 서열을 갖는 연결 생성물을 수득하였다. 선별된 서열을 추가로 분석하기 위해서, 풀 9로부터의 DNA를 클로닝하고 서열결정하였다. 대다수의 클론들은 다양한 길이 및 서열의 스페이서 지역에 의해 서로 분리되어 있는 두 개의 작은 도메인들로 구성된 공통 서열을 포함한다(도 2b). 두 개의 작은 도메인들은 완전히 상이한 측접 서열(flanking sequences)들에 삽입되었는데, 이것은 최초의 풀내의 몇 개의 독립된 서열들이 선별과정을 거쳤다는 것을 가리킨다. 공통서열의 정밀조사는 단순 주형 보다 복잡하지만, 그럼에도불구하고 5' 히드록시기와 3'-포스포르이미다졸리드기를 근접시키는 2차 구조를 시사한다 (도 3a).
공통서열에 기초하여, 두 개의 서로 분리된 DNA 기질, S1 및 S2들을 연결시키는 작은 47 nt ssDNA 촉매(E47)가 설계되었다(도 3b). 방사성 표지된 S2를 활성화 기질 S1 및 E47 촉매와 함께 인큐베이션하였더니 예상의 연결된 생성물이 나타났다(도 3c). 생성물 형성은 모든 세 가지 성분들이 반응물내에 존재하는 것을 요구한다. 또한, S1의 3'-인산기는 활성화되어야만 한다. E47은 풀 9 보다 2배 빨리 연결을 촉매한다. E47내의 작은 결실은 촉매 활성을 심하게 상실시키는데(도 3d), 이것은 중심 공통 서열이 촉매작용에 필요하다는 것을 가리킨다. E47에 의한 S1 및 S2의 연결의 최초 속도는 동일한 조건하에서 단순 상보성 주형(simple complementary template)에 의해 촉매되는 동일한 반응의 속도 보다 3400-배 크고, 주형화되지 않은 기초 연결(untemplated background ligation)에 비해 적어도 105-배 빠르다(도 3d). 이러한 속도 향상은 생체외 선별(Szostak, Trends Biochem. Sci. 17:89-93, 1992; Chapman et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 4:618-622,1994; Breaker et al., Trends Biotechnol. 12:268-275, 1994; Joyce, Curr. Opin. Struct. Biol. 4:331-336, 1994)에 의해 수득된 리보자임 및 촉매 항체(Lerner et al., Science 252:659-667, 1991)에 대해 수득된 값과 동등한 값이다.
촉매는 반응에서 소진되지 않기 때문에, 연결된 생성물이 효소로부터 해리될 수 있다면, E47은 수 몰 당량(several molar equivalents)의 기질 S1 및 S2의 연결을 촉매할 수 있을 것으로 예상되었다. 양자의 기질의 포화농도(40 μM) 및 1 μM E47에서, 25℃에서의 0.66 hr-1및 35℃에서, 2.4hr-1의 속도로의 다수 회전 촉매작용이 관찰되었다(10회 회전이 관찰됨). 이러한 온도에서, 약 1 당량의 생성물의 빠른 초기 폭발(rapid initial burst)이 반응의 처음 10분 이내에 관찰되었기 때문에, 생성물 방출은 속도 제한적인 것으로 보였다. 이러한 폭발기(burst phase)에서 연결의 최초 속도는 포화 기질 농도에서 효소에 대해서 예상되는 바와 마찬가지로 30-배 범위까지의 E47의 농도에 직접적으로 비례하였다(Fersht, Enzyme Structure and Mechanism (Fredman, New York, 1985). Kobs대 [E47]의 플로팅은 25℃에서 3.2 hr-1의 kcat를 나타내었다.
2가 금속이온이 리보자임(Pyle, Science 261:709-714, 1993) 및 다수의 단백질 효소(Karlin, Science 261:701-714, 1993)에서 결정적인 역할을 하기 때문에, Mg2+및/또는 Zn2+이온들이 선별 배지에 존재하였기 때문에, DNA 촉매가 활성에 Mg2+및/또는 Zn2+를 요구할 것으로 예상되었다. 실제로, 연결 반응은 Zn2+의존성이었지만(도 4a), Mg2+는 필요로 하지 않았다. Iriving-WIlliams 시리즈의 모든 구성원들(Ba2+, Sr2+, Ca2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+)은 물론 Pb2+및 Cd2+도 10μM과 10 mM 사이의 농도에서 시험되었는데, 단지 Cu2+만이 Zn2+를 대체할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 연결 반응의 효율성(efficiency)은 2가 금속이온의 농도에 크게 의존한다(도 4b). 4 mM 까지의 Zn2+의 증가하는 농도는 활성을 향상시켰지만, 높은 농도에서는 활성이 급격하게 감소되었는데, 이는 억제 금속 결합 부위(inhibitory metal binding site)의 존재를 암시해준다. 유사한 농도 의존성이 구리에 대해서도 관찰되었지만, 400-배 낮은 농도에서 였다. 금속 이온 특이성은 엄격한 기하학(stringent geometrical) 및/또는 크기 요구(size requirements)를 갖는 하나 이상의 금속 이온 결합 부위의 존재를 암시한다.
연결 메카니즘에 대한 통찰을 얻기 위해서, 정상 상태-이전 (pre-steady -state) 조건(단일 회전)하에서의 반응의 pH-속도 거동(pH-rate profile)을 측정하였다(도 4 c). Cu2+에 의해 시현된 종 모양의 거동(bell shaped profile)은 연결 반응의 속도 제한 단계가 부분적으로 하나는 산성이고 나머지 하나는 염기성인 두 개의 이온화가능한 기(ionizable groups)에 의존한다는 것을 시사하는데, 이것은 구리 복합체가 양성자 전이(proton transfer)에 관여하는 일반적인 산-염기 메카니즘(Fersht, Enzyme Structure, and Mechanism (Freeman, New York, 1985)의 가능성을 높인다. 금속-이온 수산화물들은 몇몇 리보자임-매개 RNA 절단 반응에서 일반적인 염기(general bases)로 기능하는 것으로 생각된다(Pyle, Science 261:709-714, 1993; Dahm et al., Biochemistry 32:13040-13045, 1993: Pan et al., Biochemistry 33:9561-9565, 1994). pH-의존성 접힘 효과(pH-dependent folding effect)와 같은 다른 가능성도 이러한 관찰을 설명할 수 있다(Kao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3360-3364, 1980).
변형된 효소에 의한 변형된 기질의 연결에 의해 변형된 효소의 서열을 갖는 연결 생성물이 생성되도록, E47 및 기질 S1 및 S2는 변형되었다. 이러한 효소(E)들 및 이들의 대응하는 기질(S1 및 S2)의 서열은 다음과 같다:
이들 효소들과 E47 사이의 차이점은 (1) E47과 5'-히드록시-포함 기질(S2) 사이에 형성된 스템, (2) E47과 활성화 기질 S1 사이에 형성된 스템, (3) E47내의 분자내 스템 및 (4) E47내의 루프. 연결 부위의 추론 코어의 서열은 변화되지 않았다. 변형된 효소들은 효소와 기질 사이의 염기쌍의 수만 서로 상이하였다. 변형된 효소들은 그들 각각의 기질의 연결을 촉매하는데, 이것은 도 3b에 도시된 스템 및 루프 구조의 적어도 일부분의 일차 뉴클레오티드 서열들이 효소 활성에 요구되지 않고, 더 나아가 S1-E1및 S4-E6으로 정해지는 스템 구조의 존재하에서 효소의 변화되지 않은 지역이 리가제 활성의 유지에 충분하다는 것을 나타낸다.
[서열 목록]
(1) 일반 정보:
(ⅰ) 출원인: 더 제너럴 허스피털 코퍼레이션
(ⅱ) 발명의 명칭: 촉매 DNA
(ⅲ) 서열의 수: 39
(ⅳ) 통신주소:
(A) 수신인: 피시 앤드 리차드슨 피. 씨.
(B) 거리: 프랭클린 스트리트 225
(C) 도시: 보스톤
(D) 주: 메사추세츠
(E) 나라: 미합중국
(F) 우편번호: 02110-2804
(ⅴ) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 미디엄 타입: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, 버전 #1.30
(ⅶ) 이전 출원 데이타
(A) 출원번호: 08/487,867
(B) 출원일: 1995. 6. 7
(ⅷ) 변호사/대리인 정보:
(A) 성명: 리치, 카렌 에프.
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(ⅸ) 전기통신 정보:
(A) 전화번호: (617) 542-5070
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(2) 서열 번호 1에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 115 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 2에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 115 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 3에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 116 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
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(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 4에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 117 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
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(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 5에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 116 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
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(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 6에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 116 염기쌍
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(2) 서열 번호 7에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 116 염기쌍
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(2) 서열 번호 8에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 116 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
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(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 9에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 116 염기쌍
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(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 10에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 116 염기쌍
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(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 11에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 116 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
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(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 12에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 116 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
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(2) 서열 번호 13에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
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(2) 서열 번호 14에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 116 염기쌍
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(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 15에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
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(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 16에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 116 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 17에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 116 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 18에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 114 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 19에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 117 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 20에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 116 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 21에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 115 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 22에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 27 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 23에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 15 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 24에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 13 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 25에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 13 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 26에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 26 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 27에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 14 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 28에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 47 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 29에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 22 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 30에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 20 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 31에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 21 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 32에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 26 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 33에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 50 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 34에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 31 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 35에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 19 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 36에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 47 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 37에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 16 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 38에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 45 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 분자 유형: DNA
(2) 서열 번호 39에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 29 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 분자 유형: DNA
먼저 도면에 관하여 설명한다.

Claims (29)

  1. 리가제 활성을 갖는 핵산 분자의 수득방법으로서, 상기 방법이 다음의 단계들을 포함하는 방법:
    a) 각각 무작위 서열의 지역을 갖는, 후보 핵산 분자들의 집단을 제공하는 단계;
    b) 상기 집단을
    (ⅰ) 기질 핵산 분자; 및
    (ⅱ) 상기 기질 핵산 분자의 3' 지역의 일부분 및 상기 집단으로부터의 후보 핵산 분자들 각각의 5' 지역의 일부분에 대해 상보적인 외부 주형과 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 기질 핵산 분자 및 상기 집단으로부터의 후보 핵산 분자들에 대한 상기 외부 주형의 결합이 상기 3' 및 5' 지역을 병치시키고 상기 3' 또는 상기 5' 지역의 말단 뉴클레오티드가 활성화 기를 포함하며;
    c) 상기 집단으로부터 리가제 활성을 갖는 핵산 분자들의 2차집단을 분리하는 단계;
    d) 상기 2차집단을생체외에서 증폭시키는 단계;
    e) 상기 증폭된 2차집단에 대해서 단계 b-d를 선택적으로 반복하는 단계; 및
    f) 상기 증폭된 2차집단으로부터 리가제 활성을 갖는 상기 핵산분자를 분리하는 단계.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 단계 b-d의 선택적 반복이 상기 외부 주형이 없는 상태에서 수행되는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 리가제 활성을 갖는 핵산 분자 또는 상기 기질 핵산 분자가 DNA인 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 기질 핵산의 상기 5' 말단 뉴클레오티드가 비오틴 부분을 포함하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 활성화 기가 상기 기질의 3'말단 뉴클레오티드상의 3'-포스포르이미다졸리드인 방법.
  6. 리가제 활성을 갖는 DNA 분자의 수득방법으로서, 상기 방법이 다음의 단계들을 포함하는 방법:
    a) 각각 무작위 서열의 지역을 갖는, 후보 DNA 분자들의 집단을 제공하는 단계;
    b) 상기 집단을 기질 핵산 분자와 접촉시키는 단계;
    c) 상기 집단으로부터 리가제 활성을 갖는 DNA 분자들의 2차집단을 분리하는 단계;
    d) 상기 2차집단을생체외에서 증폭시키는 단계;
    e) 상기 증폭된 2차집단에 대해서 단계 b-d를 선택적으로 반복하는 단계; 및
    f) 상기 증폭된 2차집단으로부터 리가제 활성을 갖는 상기 DNA 분자를 분리하는 단계.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 기질 핵산 분자가 DNA인 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 기질 핵산의 5' 말단 뉴클레오티드가 비오틴 부분을 포함하는 방법.
  9. 제 6항에 있어서, 상기 활성화 기가 상기 기질의 3'말단 뉴클레오티드상의 3'-포스포르이미다졸리드인 방법.
  10. 촉매로 기능할 수 있는 DNA.
  11. 핵산 기질에 대하여 촉매로 기능할 수 있는 DNA 분자로서, 상기 촉매가 상기 핵산 기질상의 리보뉴클레오티드의 존재를 필요로 하지 않는 DNA 분자.
  12. 리가제 활성을 갖는 핵산 분자.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 핵산 분자가 DNA인 핵산 분자.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 리가제 활성이 DNA 리가제 활성인 핵산 분자.
  15. 제 2 기질 핵산에 제 1 기질 핵산을 연결할 수 있는 핵산 분자로서, 여기서 상기 연결 속도가 동일한 반응조건하에서의 주형화에 의한 상기 기질 핵산들의 연결의 속도 보다 큰 핵산 분자.
  16. 제 2 기질 핵산에 제 1 기질 핵산을 연결할 수 있는 촉매 DNA 분자로서, 여기서 제 1 기질 핵산은 서열 3'-S1-S2-5'을 포함하고, 상기 제 2 기질 핵산은 서열 3'-S3-S4-5'을 포함하며, 상기 촉매 DNA 분자는 서열 5'-E1-TTT-E2-AGA-E3-E4-E5-E6-3'을 포함하고,여기서
    S1은 S2의 3' 말단에 인접하여 위치된 적어도 두 개의 뉴클레오티드들을 포함하고, 상기 S1뉴클레오티드들은 상기 TTT의 5' 말단에 인접하여 위치된 E1에 있는 동등한 수의 뉴클레오티드들에 대해 상보적이며;
    S2은 1-3 뉴클레오티드들을 포함하고, S3은 1-6 뉴클레오티드들을 포함하며, 및 S2의 5' 말단 뉴클레오티드와 S3의 3' 말단 뉴클레오티드는 선택적으로 활성화 기 또는 히드록시기를 포함하며;
    S4는 S3의 5' 말단에 인접하여 위치된 적어도 두 개의 뉴클레오티드들을 포함하고, 상기 S4뉴클레오티드는 E5의 3' 말단에 인접하여 위치된 E6에 있는 동등한 수의 뉴클레오티드들에 대해 상보적이며;
    E1은 상기 TTT의 5' 말단에 인접하여 위치된 적어도 두 개의 뉴클레오티드들을 포함하고, 상기 E1뉴클레오티드는 S2의 3' 말단에 인접하여 위치된 S1에 있는 동등한 수의 뉴클레오티드들에 대해 상보적이며;
    E2는 0-12 뉴클레오티드들을 포함하고;
    E3은 상기 AGA의 3' 말단에 인접하여 위치된 적어도 두 개의 뉴클레오티드들을 포함하고, 상기 E3뉴클레오티드는 E6의 5' 말단에 인접하여 위치된 E5에 있는 동등한 수의 뉴클레오티드들에 대해 상보적이며;
    E4는 3-200 뉴클레오티드들을 포함하고;
    E5는 E6의 5' 말단에 인접하여 위치된 적어도 두 개의 뉴클레오티드들을 포함하고, 상기 E5뉴클레오티드는 상기 AGA의 3' 말단에 인접하여 위치된 E3에 있는 동등한 수의 뉴클레오티드들에 대해 상보적이며; 및
    E6은 E5의 3' 말단에 인접하여 위치된 적어도 두 개의 뉴클레오티드들을 포함하고, 상기 E6뉴클레오티드는 S3의 5' 말단에 인접하여 위치된 S4에 있는 동등한 수 뉴클레오티드들에 대해 상보적인 촉매 DNA 분자.
  17. 제 16항에 있어서, E2는 3-4 뉴클레오티드들을 포함하는 촉매 DNA 분자.
  18. 제 17항에 있어서, S2의 5' 모스트 뉴클레오티드는 E2의 5' 모스트 뉴클레오티드에 대해 상보적이고; S3의 3' 모스트 뉴클레오티드는 E2의 두 번째 5' 모스트 뉴클레오티드에 대해 상보적이며; S3의 두 번째 3' 모스트 뉴클레오티드는 E2의 세 번째 5' 모스트 뉴클레오티드에 대해 상보적인 촉매 DNA 분자.
  19. 제 18항에 있어서, E2는 4개의 뉴클레오티드들을 포함하고, S3의 세 번째 3' 모스트 뉴클레오티드는 E2의 네 번째 5' 모스트 뉴클레오티드에 대해 상보적인 촉매 DNA 분자.
  20. 제 16항에 있어서,
    a) S2는 하나의 뉴클레오티드를 포함하고;
    b) S3는 3 뉴클레오티드들을 포함하며;
    c) E4는 5 뉴클레오티드들을 포함하고; 또는
    d) E5및 E3는 각각 5 뉴클레오티드들을 포함하는 촉매 DNA 분자.
  21. 제 2의 핵산 분자에 제 1 핵산 분자를 연결하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 제 1 핵산 분자와 상기 제 2 핵산 분자를 리가제 활성을 갖는 핵산 분자와 접촉시키는 과정을 포함하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 리가제 활성을 갖는 상기 핵산 분자가 DNA인 방법.
  23. 제 21항에 있어서, 상기 리가제 활성이 DNA 리가제 활성인 방법.
  24. 다음 단계에 의해 수득되는 리가제 활성을 갖는 핵산 분자:
    a) 각각 무작위 서열의 지역을 갖는, 후보 핵산 분자들의 집단을 제공하는 단계;
    b) 상기 집단을
    (ⅰ) 기질 핵산 분자; 및
    (ⅱ) 상기 기질 핵산 분자의 3' 지역의 일부분 및 상기 집단으로부터의 후보 핵산 분자들의 각각의 5' 지역의 일부분에 대해 상보적인 외부 주형과 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 기질 핵산 분자 및 상기 집단내의 후보 핵산 분자들에 대한 상기 외부 주형의 결합이 상기 3' 및 5' 지역을 병치시키고 상기 3' 또는 상기 5' 지역의 말단 뉴클레오티드가 활성화 기를 포함하며;
    c) 상기 집단으로부터 리가제 활성을 갖는 핵산 분자의 2차집단을 분리하는 단계;
    d) 상기 2차집단을생체외에서 증폭시키는 단계;
    e) 상기 증폭된 2차집단에 대해서 단계 b-d를 선택적으로 반복하는 단계; 및
    f) 상기 증폭된 2차집단으로부터 리가제 활성을 갖는 상기 핵산분자를 분리하는 단계.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 단계 b-d의 선택적인 반복이 상기 외부 주형이 존재하지 않는 상태에서 수행되는 핵산 분자.
  26. 제 24항에 있어서, 상기 리가제 활성을 갖는 핵산 분자가 DNA인 핵산 분자.
  27. 제 24항에 있어서,
    a) 상기 기질 핵산의 5' 말단 뉴클레오티드가 비오틴 부분을 포함하거나; 또는
    b) 상기 활성화 기가 상기 기질의 3' 말단 뉴클레오티드상의 3'-포스포르이미다졸리드인 핵산 분자.
  28. 다음의 단계에 의해 수득된 리가제 활성을 갖는 DNA 분자:
    a) 각각 무작위 서열의 지역을 갖는, 후보 DNA 분자들의 집단을 제공하는 단계;
    b) 상기 집단을 기질 핵산 분자와 접촉시키는 단계;
    c) 상기 집단으로부터 리가제 활성을 갖는 DNA 분자의 2차집단을 분리하는 단계;
    d) 상기 2차집단을생체외에서 증폭시키는 단계;
    e) 상기 증폭된 2차집단에 대해서 단계 b-d를 선택적으로 반복하는 단계; 및
    f) 상기 증폭된 2차집단으로부터 리가제 활성을 갖는 상기 DNA 분자를 분리하는 단계.
  29. 제 28항에 있어서,
    a) 상기 기질 핵산의 5' 말단 뉴클레오티드가 비오틴 부분을 포함하거나; 또는
    b) 상기 활성화 기가 상기 기질의 3' 말단 뉴클레오티드상의 3'-포스포르이미다졸리드인 DNA 분자.
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