JP2003024086A - インテグリンリガンドであるヒトMindin - Google Patents

インテグリンリガンドであるヒトMindin

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JP2003024086A JP2002111158A JP2002111158A JP2003024086A JP 2003024086 A JP2003024086 A JP 2003024086A JP 2002111158 A JP2002111158 A JP 2002111158A JP 2002111158 A JP2002111158 A JP 2002111158A JP 2003024086 A JP2003024086 A JP 2003024086A
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ジョナック,ズデンカ,エル.
Stephen H Trulli
トルーリ,ステファン,エイチ.
Ping Tsui
ツイ,ピン
Pamela A Lane
レーン,パメラ,エイ.
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SmithKline Beecham Corp
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Abstract

(57)【要約】 (修正有) 【課題】 ヒトMindinポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドならびに組換え技術によりこのようなポリペプチド
を生産する方法を提供する。 【解決手段】 以下の(i)〜(iii)からなる群から選択さ
れる単離されたポリペプチド:(i) 特定の配列の全長に
わたる特定の配列のアミノ酸配列に対して少なくとも
(a) 70%の同一性、(b) 80%の同一性、(c) 90%
の同一性、もしくは(d) 95%の同一性、を有するアミ
ノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド、(i
i) 特定の配列のアミノ酸配列を含んでなる単離され
たポリペプチド、または(iii) 特定の配列のアミノ酸配
列からなる単離されたポリペプチド。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本出願は米国仮出願第60/04
6,106号(1997年5月9日出願)の恩恵を主張するものであ
り、その記載内容は全て引用により本明細書中に含まれ
るものとする。
【0002】本発明は、新たに同定されたポリペプチ
ド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該
ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの治療の際のまた
は治療に有効でありうるアゴニスト、アンタゴニストお
よび/またはインヒビターである化合物を同定する際の
使用、並びに該ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの
生産方法に関する。
【0003】
【従来の技術】薬物探索プロセスには目下根本的な大変
化が生じている。というのは、それが「機能性遺伝子科
学」(functional genomics) 、すなわちハイスループッ
ト(高効率)のゲノムまたは遺伝子ベースの生物学に及
んでいるからである。このアプローチは「ポジショナル
クローニング」に基づいた比較的初期のアプローチに急
速に取って代わりつつある。表現型、つまり生物学的機
能または遺伝病、が同定され、続いてその遺伝子地図の
位置を手がかりとして病因遺伝子が突き止められるだろ
う。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】機能性遺伝子科学は、
現在入手できる多くの分子生物学データベースから興味
のもてそうな遺伝子配列を同定するための生物情報科学
(bioinformatics)の様々なツールに大きく依存してい
る。依然として、まだ未解明の遺伝子およびその関連ポ
リペプチド/タンパク質を薬物探索の標的として同定し
特性づける必要性が存在している。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明は、ヒトMindin、
特にヒトMindinポリペプチドおよびヒトMindinポリヌク
レオチド、組換え物質、並びにその生産方法に関する。
もう一つの態様において、本発明は、脈管形成性疾患
(癌、癌転移、慢性炎症性障害、慢性関節リウマチ、ア
テローム性動脈硬化、黄斑変性、糖尿病性網膜症)、再
狭窄、アルツハイマー病、神経障害および組織リモデリ
ング(以後まとめて「前記疾患」という)の治療をはじ
めとする、前記ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの
使用方法に関する。他の態様では、本発明は、本発明に
より提供される物質を用いてアゴニストおよびアンタゴ
ニスト/インヒビターを同定する方法、並びに同定され
た化合物を用いてヒトMindin平衡異常と関連した症状を
治療することに関する。さらに他の態様において、本発
明は不適当なヒトMindin活性またはヒトMindinレベルと
関連した疾病を検出するための診断アッセイに関する。
【0006】
【発明の実施の形態】一つの態様において、本発明はヒ
トMindinポリペプチドに関する。この種のペプチドに
は、配列番号2の全長にわたる配列番号2のアミノ酸配
列に対して少なくとも70%の同一性、好ましくは少な
くとも80%の同一性、より好ましくは少なくとも90
%の同一性、さらに好ましくは少なくとも95%の同一
性、最も好ましくは少なくとも97〜99%の同一性を
有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチ
ドが含まれる。こうしたポリペプチドには配列番号2の
アミノ酸配列からなるポリペプチドが含まれる。
【0007】本発明の他のペプチドには、そのアミノ酸
配列が配列番号2の全長にわたる配列番号2のアミノ酸
配列に対して少なくとも70%の同一性、好ましくは少
なくとも80%の同一性、より好ましくは少なくとも9
0%の同一性、さらに好ましくは少なくとも95%の同
一性、最も好ましくは少なくとも97〜99%の同一性
を有する単離されたポリペプチドが含まれる。こうした
ポリペプチドとしては配列番号2のアミノ酸配列からな
るポリペプチドがある。
【0008】本発明の更なるペプチドには、配列番号1
に含まれるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオ
チドによりコードされる単離されたポリペプチドが含ま
れる。
【0009】本発明のポリペプチドはポリペプチドのト
ロンボスポンジンファミリーのメンバーであると考えら
れる。それゆえ、それらには興味がもてる。なぜなら、
ヒトMindinは脈管形成性疾患(すなわち癌、癌転移、慢
性炎症性障害、慢性関節リウマチ、アテローム性動脈硬
化、黄斑変性、糖尿病性網膜症)、再狭窄、アルツハイ
マー病、神経障害および組織リモデリングを治療するた
めのアンタゴニストを同定する際の良好な治療標的であ
りうるからである。これらの特性を以後「ヒトMindin活
性」または「ヒトMindinポリペプチド活性」または「ヒ
トMindinの生物学的活性」という。これらの活性の中に
は、前記ヒトMindinポリペプチドの抗原活性および免疫
活性、特に配列番号2のポリペプチドの抗原活性および
免疫活性も含まれる。本発明のポリペプチドはヒトMind
inの少なくとも1つの生物学的活性を示すことが好まし
い。
【0010】ヒトMindinは正常な状態および疾患状態に
おいて多機能的活性を有しうる新規F-スポンジン様遺
伝子である。F-スポンジンはトロンボスポンジン(TS
P)として知られるドメインの存在を示すアミノ酸配列
を有する。F-スポンジンとの相同性により、ヒトMindi
nは該F-スポンジンと同様の機能を有すると推定され
る。F-スポンジンは細胞-細胞および/または細胞-マ
トリックス間の相互作用をモジュレートするものであ
り、このことは培養神経細胞において観察される抗凝集
効果、血小板の凝集、フィブリンの形成および溶解、細
胞の接着および移動ならびに増殖サイクル中の細胞の進
行によりさらに支持される。F-スポンジンは神経細胞
接着、ニューライト伸長および脊髄分化の潜在的なレギ
ュレーターとして関与している。神経細胞の増殖、接着
および誘導に及ぼすF-スポンジンの効果は、腫瘍の増
殖および転移にも係わっているだろう。F-スポンジン
の過剰発現は「神経細胞」起源の「増大した、または抑
制された」腫瘍増殖を引き起こしうる。重要な機能の1
つは、aVb3,aIIbb3等のインテグリンおよび他の未知の
インテグリン受容体に結合するその能力である。
【0011】インテグリンは細胞-細胞および細胞−マ
トリックス間の接着を仲介する細胞表面受容体のラージ
ファミリーである。インテグリンはその細胞外マトリッ
クスタンパク質リガンド中の R-G-D配列を認識する。ヒ
トMindinは種々の疾患において重要な役割を担いうるこ
のような新規リガンドでありうる。構造的には、インテ
グリンはαおよびβ鎖のヘテロ二量体からなる。各サブ
ユニットは大きいN末端細胞外ドメインとそれに続く膜
貫通ドメインおよび短いC末端細胞質領域を有する。幾
つかの受容体は共通のβ鎖を共有する一方で異なるα鎖
を有している。インテグリンリガンドとしてのヒトMind
inの役割は、脈管形成ならびに神経の成長および分化に
おけるその潜在的な機能のため非常に興味深い。多くの
脈管形成関連障害および神経関連障害が記載されている
が、F-スポンジンの役割は癌、特に癌転移に関与して
いるようである。ヒトMindinが多くの組織(例えば、前
立腺、子宮、末梢血リンパ球、乳腺、膀胱、小脳、後頭
葉、卵巣、心臓、肝臓、虫垂、およびその他)において
「過剰発現」されることが分かっている。また、F-ス
ポンジンとの相同性により、ヒトMindinがタンパク質分
解作用(細胞外マトリックスまたは基底膜タンパク質を
分解する)を有しうることが示唆される。タンパク質分
解活性を有する、インテグリン受容体に対するリガンド
としてのヒトMindinの役割は、神経成長、分化、脈管形
成および組織リモデリングにおけるその特定された役割
に適合している。
【0012】本発明のポリペプチドは「成熟」タンパク
質の形であっても、融合タンパク質のような、より大き
いタンパク質の一部であってもよい。しばしば、追加の
アミノ酸配列を含めることが有利であり、このようなア
ミノ酸配列としては、分泌すなわちリーダー配列、プロ
配列、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、
または組換え生産の間の安定性を確保する付加的配列な
どがある。
【0013】また、前記ポリペプチドの変異体、すなわ
ち保存的アミノ酸置換(ある残基が性質の似ている他の
残基により置換される)により基準ポリペプチドと相違
しているポリペプチドも本発明に含まれる。典型的なこ
うした置換は、Ala, Val, Leu および Ileの間;Ser と
Thr の間;酸性残基 AspとGlu の間;Asn とGln の間;
塩基性残基 LysとArg の間;または芳香族残基 PheとTy
r の間で起こる。特に、数個、5〜10個、1〜5個、
1〜3個、1〜2個または1個のアミノ酸が任意の組合
せで置換、欠失または付加されている変異体が好適であ
る。
【0014】本発明のポリペプチドは任意の適当な方法
で製造することができる。このようなポリペプチドに
は、単離された天然のポリペプチド、組換え的に生産さ
れたポリペプチド、合成的に製造されたポリペプチド、
またはこれらの方法の組合せにより製造されたポリペプ
チドが含まれる。こうしたポリペプチドを製造するため
の手段は当業界でよく理解されている。
【0015】本発明の更なる態様において、本発明は、
ヒトMindinポリヌクレオチドに関する。このようなポリ
ヌクレオチドには、配列番号2の全長にわたる配列番号
2のアミノ酸配列に対して少なくとも70%の同一性、
好ましくは少なくとも80%の同一性、より好ましくは
少なくとも90%の同一性、さらに好ましくは少なくと
も95%の同一性を有するポリペプチドをコードするヌ
クレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチ
ドが含まれる。これに関して、少なくとも97%の同一
性を有するポリペプチドが一層好ましいが、少なくとも
98〜99%の同一性を有するものがより一層好まし
く、少なくとも99%の同一性を有するポリペプチドが
最も好ましいものである。かかるポリヌクレオチドとし
て、配列番号2のポリペプチドをコードする配列番号1
に含まれるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオ
チドが挙げられる。
【0016】本発明の更なるポリヌクレオチドには、配
列番号2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
に対して、その全コード領域にわたって、少なくとも7
0%の同一性、好ましくは少なくとも80%の同一性、
より好ましくは少なくとも90%の同一性、さらに好ま
しくは少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド
配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドが含まれ
る。これに関して、少なくとも97%の同一性を有する
ポリヌクレオチドが一層好ましいが、少なくとも98〜
99%の同一性を有するものがより一層好ましく、少な
くとも99%の同一性を有するポリヌクレオチドが最も
好ましいものである。
【0017】本発明の更なるポリヌクレオチドには、配
列番号1の全長にわたる配列番号1のポリヌクレオチド
に対して少なくとも70%の同一性、好ましくは少なく
とも80%の同一性、より好ましくは少なくとも90%
の同一性、さらに好ましくは少なくとも95%の同一性
を有するヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリ
ヌクレオチドが含まれる。これに関して、少なくとも9
7%の同一性を有するポリヌクレオチドが一層好ましい
が、少なくとも98〜99%の同一性を有するものがよ
り一層好ましく、少なくとも99%の同一性を有するポ
リヌクレオチドが最も好ましいものである。かかるポリ
ヌクレオチドとして、配列番号1のポリヌクレオチドを
含んでなるポリヌクレオチドおよび配列番号1のポリヌ
クレオチドが挙げられる。
【0018】本発明はまた、上記の全てのポリヌクレオ
チドに対して相補的なポリヌクレオチドを提供する。
【0019】配列番号1のヌクレオチド配列はゼブラフ
ィッシュ(Zebrafish)の Mindin2(S.Higashijimaら、De
v.Biol.192:211-27,1997)との相同性を示す。配列番号
1のヌクレオチド配列はcDNA配列であり、配列番号
2のポリペプチドである331個のアミノ酸からなるポリ
ペプチドをコードするポリペプチドコード配列(ヌクレ
オチド番号 1〜996)を含む。配列番号2のポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列は、配列番号1に含まれ
るポリペプチドコード配列と同一であっても、遺伝子コ
ードの重複性(縮重)のため、やはり配列番号2のポリ
ペプチドをコードする、配列番号1に含まれる配列以外
の配列であってもよい。配列番号2のポリペプチドはト
ロンボスポンジンファミリーの他のタンパク質と構造的
に関連しており、ゼブラフィッシュの Mindin2(S.Higa
shijimaら、Dev.Biol.192:211-27,1997)との相同性お
よび/または構造類似性を有する。
【0020】本発明の好適なポリペプチドおよびポリヌ
クレオチドは、とりわけ、それと相同なポリペプチドお
よびポリヌクレオチドと同様の生物学的機能/性質をも
つことが期待される。さらに、本発明の好ましいポリペ
プチドおよびポリヌクレオチドは少なくとも1つのヒト
Mindin活性を有する。
【0021】また、本発明は、配列番号1および配列番
号2の対応する全長配列の決定に先立って最初に同定さ
れた部分的なまたは他のポリヌクレオチドおよびポリペ
プチドに関する。
【0022】したがって、更なる態様において、本発明
は、(a) 配列番号3の全長にわたる配列番号3のヌクレ
オチド配列に対して少なくとも70%の同一性、好まし
くは少なくとも80%の同一性、より好ましくは少なく
とも90%の同一性、さらに好ましくは少なくとも95
%の同一性、最も好ましくは97〜99%の同一性を有
するヌクレオチド配列、(b) 配列番号3の全長にわたる
配列番号3のヌクレオチド配列に対して少なくとも70
%の同一性、好ましくは少なくとも80%の同一性、よ
り好ましくは少なくとも90%の同一性、さらに好まし
くは少なくとも95%の同一性、最も好ましくは97〜
99%の同一性を有するヌクレオチド配列、(c) 配列番
号3のポリヌクレオチド、または(d) 配列番号4の全長
にわたる配列番号4のアミノ酸配列に対して少なくとも
70%の同一性、好ましくは少なくとも80%の同一
性、より好ましくは少なくとも90%の同一性、さらに
好ましくは少なくとも95%の同一性、最も好ましくは
97〜99%の同一性を有するアミノ酸配列からなるポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列、を含んでな
る単離されたポリヌクレオチド、および配列番号3のポ
リヌクレオチドを提供する。
【0023】さらに、本発明は、(a) 配列番号4の全長
にわたる配列番号4のアミノ酸配列に対して少なくとも
70%の同一性、好ましくは少なくとも80%の同一
性、より好ましくは少なくとも90%の同一性、さらに
好ましくは少なくとも95%の同一性、最も好ましくは
97〜99%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでな
るポリペプチド、(b) 配列番号4の全長にわたる配列番
号4のアミノ酸配列に対して少なくとも70%の同一
性、好ましくは少なくとも80%の同一性、より好まし
くは少なくとも90%の同一性、さらに好ましくは少な
くとも95%の同一性、最も好ましくは97〜99%の
同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(c) 配列番号4のアミノ酸を含んでなるポリペプチド、
および(d) 配列番号4のポリペプチドであるポリペプチ
ド、並びに配列番号3に含まれるヌクレオチド配列を含
んでなるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプ
チド、を提供する。
【0024】配列番号3のヌクレオチド配列およびそれ
によりコードされるペプチド配列はエクスプレスド・シ
ーケンス・タグ(Expressed Sequence Tag:EST)配
列から誘導される。当業者であれば、EST配列中に若
干のヌクレオチド配列読み取り誤差が必然的に存在する
ことを理解するであろう(Adams, M.D.ら, Nature 377
(supp)3, 1995を参照のこと)。したがって、配列番号
3のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるペ
プチド配列は配列精度において同一の固有の限界を受け
る。さらに、配列番号3によりコードされるペプチド配
列は、最も相同性または構造類似性が高いタンパク質と
同一の領域、または高い相同性および/または構造類似
性(例えば、保存的アミノ酸の差異)の領域を含んでい
る。
【0025】本発明のポリヌクレオチドは、標準的なク
ローニングおよびスクリーニング技術により、ヒト上皮
肉腫の細胞中のmRNAから誘導されたcDNAライブ
ラリーから、EST分析(Adams, M.D.ら, Science (19
91) 252:1651-1656; Adams,M.D.ら, Nature (1992) 35
5:632-634; Adams, M.D.ら, Nature (1995) 377 Supp:3
-174)を用いて得ることができる。また、本発明のポリ
ヌクレオチドはゲノムDNAライブラリーのような天然
源から得ることができ、商業的に入手可能な公知の技法
を用いて合成することもできる。
【0026】本発明のポリヌクレオチドを本発明のポリ
ペプチドの組換え体生産のために用いる場合、そのポリ
ヌクレオチドには、成熟ポリペプチドのコード配列単
独、または他のコード配列(例えば、リーダーもしくは
分泌配列、プレ−、プロ−もしくはプレプロ−タンパク
質配列、または他の融合ペプチド部分をコードするも
の)と同じリーディングフレーム内にある成熟ポリペプ
チドのコード配列が含まれる。例えば、融合ポリペプチ
ドの精製を容易にするマーカー配列がコードされ得る。
本発明のこの態様の好ましい具体例として、マーカー配
列は、pQEベクター(Qiagen, Inc.)により提供されか
つ Gentzら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:8
21-824に記載されるような、ヘキサ−ヒスチジンペプチ
ド、またはHAタグである。また、このポリヌクレオチ
ドは5'および3'非コード配列、例えば、転写されるが翻
訳されない配列、スプライシングおよびポリアデニル化
シグナル、リボソーム結合部位、およびmRNA安定化
配列を含んでいてもよい。
【0027】本発明の更なる具体例としては、数個、例
えば5〜10個、1〜5個、1〜3個、1〜2個、また
は1個のアミノ酸残基が任意の組合せで置換、欠失また
は付加されている、配列番号2のアミノ酸配列を含んで
なるポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチド
がある。
【0028】配列番号1に含まれるヌクレオチド配列と
同一であるか十分に同一であるポリヌクレオチドは、本
発明のポリペプチドをコードする全長cDNAおよびゲ
ノムクローンを単離するために、また、配列番号1に対
して高い配列類似性を有する他の遺伝子(ヒト以外の種
に由来する相同体およびオーソログ体(ortholog)をコー
ドする遺伝子を含む)のcDNAおよびゲノムクローン
を単離するために、cDNAおよびゲノムDNA用のハ
イブリダイゼーションプローブとして、または核酸増幅
(PCR)反応用のプライマーとして用いることができ
る。一般的に、これらのヌクレオチド配列は基準のヌク
レオチド配列と70%、好ましくは80%、より好まし
くは90%、最も好ましくは95%同一である。プロー
ブまたはプライマーはたいてい15個以上のヌクレオチ
ドを含み、好ましくは30個以上を含み、50個以上の
ヌクレオチドを有していてもよい。特に好ましいプロー
ブは30〜50個の範囲のヌクレオチドを有するもので
ある。
【0029】本発明のポリペプチド(ヒト以外の種に由
来する相同体およびオーソログ体を含む)をコードする
ポリヌクレオチドは、配列番号1の配列またはその断片
を有する標識プローブを用いて、ストリンジェントなハ
イブリダイゼーション条件下で適当なライブラリーをス
クリーニングし、該ポリヌクレオチド配列を含む全長c
DNAおよびゲノムクローンを単離する各工程を含んで
なる方法により得られる。このようなハイブリダイゼー
ション技法は当業者に公知である。好ましいストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション条件は、50% ホルムア
ミド、5×SSC(150mM NaCl, 15mM クエン酸三ナトリウ
ム) 、50mMリン酸ナトリウム (pH7.6)、5×Denhardt溶
液、10% デキストラン硫酸および20μg/mlの変性し剪断
したサケ精子DNAを含有する溶液中42℃で一夜イン
キュベートし、次いでフィルターを 0.1×SSC 中約65
℃で洗浄することを含む。かくして、本発明は、配列番
号1の配列またはその断片を有する標識プローブを用い
て、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下
で適当なライブラリーをスクリーニングすることにより
得られるポリヌクレオチドをも包含する。
【0030】当業者には理解されるように、多くの場
合、ポリペプチドをコードする領域がそのcDNAの5'
末端で短く切断されることから、単離されたcDNA配
列は不完全であるだろう。それは逆転写酵素のためであ
り、この酵素はもともと「プロセシビティ」(processi
vity:重合反応中に鋳型に結合した状態でいる該酵素の
能力の尺度)が低く、第一鎖cDNA合成の間にmRN
A鋳型のDNAコピーを完成させることができない。
【0031】全長cDNAを得るための、または短鎖c
DNAを伸長させるための、当業者に公知で利用可能な
方法がいくつかあり、例えば、cDNA末端高速増幅法
(RACE)に基づいた方法がある(例えば、Frohman
ら, PNAS USA 85, 8998-9002,1988を参照のこと)。例
えばMarathonTM技術(Clontech Laboratories Inc.)によ
り示されるような、上記技法の最近の改良により、より
長いcDNAの検索が大いに簡便化された。MarathonTM
技術では、所定の組織より抽出されたmRNAからcD
NAを作製し、各末端に「アダプター」配列を連結す
る。続いて、遺伝子特異的およびアダプター特異的なオ
リゴヌクレオチドプライマーの組合せを用いて核酸増幅
(PCR)を行い、cDNAの「欠失」5'末端を増幅す
る。次に、「nested」プライマー、すなわち増幅産物の
内部にアニールするように設計されたプライマー(典型
的には、アダプター配列のさらに3'側にアニールするア
ダプター特異的プライマーおよび既知遺伝子配列のさら
に5'側にアニールする遺伝子特異的プライマー)を用い
てPCR反応を繰り返す。その後、この反応の産物をD
NA塩基配列決定により解析し、この産物を既存のcD
NAに直接結合して完全な配列とするか、または5'プラ
イマー設計用の新たな配列情報を用いて別の全長PCR
を行うことにより、全長cDNAを構築することができ
る。
【0032】本発明の組換え体ポリペプチドは、当業界
で公知の方法を用いて、発現系を含有する遺伝子操作宿
主細胞から生産することができる。したがって、更なる
態様において、本発明は、本発明の1以上のポリヌクレ
オチドを含有する発現系、該発現系により遺伝子操作さ
れた宿主細胞、および組換え法による本発明ポリペプチ
ドの生産に関する。本発明のDNA構築物から誘導され
たRNAを用いてこの種のタンパク質を生産するため
に、無細胞翻訳系を使用することもできる。
【0033】組換え体生産に関しては、本発明のポリヌ
クレオチドの発現系またはその一部を組み込むために宿
主細胞を遺伝子操作する。宿主細胞へのポリヌクレオチ
ドの導入は、Davisら, Basic Methods in Molecular Bi
ology (1986) および Sambrookら, Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)
などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載された方
法により行うことができる。好適なこうした方法とし
て、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、
DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション、ト
ランスベクション(transvection)、マイクロインジェク
ション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エ
レクトロポレーション、形質導入、スクレープローディ
ング(scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduct
ion)または感染などがある。
【0034】適当な宿主の代表的な例として、細菌細胞
(例:ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸
菌、ストレプトミセス、枯草菌)、真菌細胞(例:酵
母、アスペルギルス)、昆虫細胞(例:ドロソフィラS
2、スポドプテラSf9)、動物細胞(例:CHO、C
OS、HeLa、C 127、3T3、BHK、HEK 29
3、Bowes メラノーマ細胞)および植物細胞が挙げられ
る。
【0035】多種多様な発現系を使用することができ
る。こうした発現系として、例えば、染色体、エピソー
ムおよびウイルス由来の系、例えば、細菌プラスミド由
来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵
母エピソーム由来、挿入因子由来、酵母染色体エレメン
ト由来、ウイルス(例:バキュロウイルス、SV40の
ようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウ
イルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウ
イルス)由来のベクター、およびこれらの組合せに由来
するベクター、例えば、コスミドやファージミドのよう
なプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来
するものがある。これらの発現系は発現を起こさせるだ
けでなく発現を調節する制御領域を含んでいてもよい。
一般的に、宿主内でのポリペプチドの産生のためにポリ
ヌクレオチドを維持し、増やし、発現することができる
系またはベクターはどれも使用しうる。Sambrookら, Mo
lecular Cloning: A Laboratory Manual (前掲) に記載
されるような、日常的に用いられる公知の技法のいずれ
かにより、適当なヌクレオチド配列を発現系に挿入する
ことができる。翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔
に、細胞周辺腔に、または細胞外の環境に分泌させるた
めに、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに組み
込むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプ
チドに対して内因性であっても、異種シグナルであって
もよい。
【0036】スクリーニングアッセイで使用するため本
発明のポリペプチドを発現させようとする場合、一般に
そのポリペプチドを細胞の表面に産生させることが好適
である。その場合は、スクリーニングアッセイでの使用
に先立って細胞を回収する。該ポリペプチドが培地に分
泌される場合は、そのポリペプチドを回収し精製するた
めに培地を回収する。細胞内に産生される場合は、その
細胞をまず溶解し、その後にポリペプチドを回収する必
要がある。
【0037】組換え細胞培養物から本発明のポリペプチ
ドを回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタ
ノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロ
マトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィ
ー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティ
ークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマ
トグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含め
た公知の方法を用いることができる。最も好ましくは、
高性能液体クロマトグラフィーが精製に用いられる。ポ
リペプチドが細胞内合成、単離および/または精製中に
変性されるときは、タンパク質を再生させるための公知
の技法を用いて、活性のあるコンフォメーションを復元
することが可能である。
【0038】本発明はまた、診断薬としての本発明のポ
リヌクレオチドの使用に関する。機能障害と関連した、
配列番号1のポリヌクレオチドにより特徴づけられる遺
伝子の変異型の検出は、該遺伝子の過少発現、過剰発現
または変化した発現により生ずる疾病またはその疾病へ
の罹りやすさの診断に追加しうる、またはその診断を下
しうる診断用ツールを提供するだろう。該遺伝子に突然
変異がある個体を、さまざまな技法によりDNAレベル
で見つけ出すことができる。
【0039】診断用の核酸は、被験者の細胞、例えば血
液、尿、唾液、組織の生検または剖検材料由来の細胞か
ら得ることができる。検出のためにゲノムDNAを直接
使用してもよいし、分析前にPCRまたは他の増幅法を
使ってゲノムDNAを酵素的に増幅してもよい。同様の
方法でRNAまたはcDNAを使用することもできる。
欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較したときの増
幅産物のサイズの変化により検出できる。点突然変異は
増幅DNAを標識ヒトMindinヌクレオチド配列とハイブ
リダイズさせることで同定できる。完全にマッチした配
列とミスマッチの二重鎖とはRNアーゼ消化により、ま
たは融解温度の差異により区別できる。また、DNA配
列の差異は、変性剤を含むもしくは含まないゲルでのD
NA断片の電気泳動の移動度の変化により、または直接
DNA塩基配列決定によっても検出できる(例えば、My
ersら, Science (1985) 230:1242 を参照のこと)。特
定位置での配列変化はヌクレアーゼプロテクションアッ
セイ(例えば、RNアーゼおよびS1プロテクション)
または化学的開裂法によっても確認できる(Cottonら,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 85:4397-4401を参
照のこと)。別の実施態様では、例えば、遺伝子変異の
効率のよいスクリーニングを行うため、ヒトMindinヌク
レオチド配列またはその断片を含むオリゴヌクレオチド
プローブのアレイ(array)を構築することができる。ア
レイ技法は公知で、一般的な適用可能性を有し、遺伝子
発現、遺伝的連鎖および遺伝的変異性を含めた分子遺伝
学のさまざまな問題を解きあかすために用いられている
(例えば、M. Cheeら, Science, Vol.274, pp.610-613
(1996) を参照のこと)。
【0040】診断アッセイは、前記の方法によりヒトMi
ndin遺伝子の変異を検出することで、前記疾患への罹り
やすさを診断または判定する方法を提供する。さらに、
被験者から得られたサンプルからポリペプチドまたはm
RNAのレベルの異常な低下または増加を測定する方法
により、前記疾患の診断を下すことができる。発現の低
下または増加は、当業界で公知のポリヌクレオチドの定
量法、例えば核酸増幅(例:PCR、RT−PCR)、
RNアーゼプロテクション、ノーザンブロッティング、
その他のハイブリダイゼーション法のいずれかによりR
NAレベルで測定することができる。宿主から得られた
サンプル中の本発明ポリペプチドのようなタンパク質の
レベルを測定するために使用できるアッセイ法は当業者
によく知られている。こうしたアッセイ法として、ラジ
オイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロ
ット分析、ELISAアッセイなどがある。
【0041】かくして、もう一つの態様において、本発
明は、(a) 本発明のポリヌクレオチド(好ましくは、配
列番号1のヌクレオチド配列)もしくはその断片、(b)
(a) のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
(c) 本発明のポリペプチド(好ましくは、配列番号2の
ポリペプチド)もしくはその断片、または(d) 本発明の
ポリペプチド(好ましくは、配列番号2のポリペプチ
ド)に対する抗体、を含んでなる診断用キットに関す
る。
【0042】このようなキットにおいて、(a) 、(b) 、
(c) または (d)が実質的な構成成分であることが理解さ
れよう。かかるキットは疾患または疾患への罹りやす
さ、特に脈管形成性疾患(癌、癌転移、慢性炎症性障
害、慢性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化、黄斑変
性、糖尿病性網膜症)、再狭窄、アルツハイマー病、神
経障害および組織リモデリング等を診断するうえで有用
である。
【0043】また、本発明のヌクレオチド配列は染色体
の同定にも有用である。この配列は個々のヒト染色体上
の特定の位置を特異的にターゲッティングし、その特定
位置とハイブリダイズすることができる。本発明に従っ
て関連配列の染色体地図を作成することは、これらの配
列と遺伝子関連疾患とを相関させるうえで重要な第一段
階である。ひとたび配列が正確な染色体位置にマップさ
れたら、その染色体上のその配列の物理的位置を遺伝地
図データと相関させることができる。この種のデータ
は、例えば、V. McKusick, Mendelian Inheritance in
Man (Johns Hopkins University Welch Medical Librar
y からオンラインで入手可能) 中に見いだせる。その
後、同一の染色体領域にマップされた遺伝子と疾患との
関係を連鎖解析(物理的に隣接した遺伝子の共遺伝)に
より確認する。
【0044】罹患個体と非罹患個体とのcDNAまたは
ゲノム配列の差異も調べることができる。罹患個体の一
部または全部に突然変異が観察されるが、どの正常個体
にも観察されない場合は、その突然変異が疾患の原因で
ある可能性がある。
【0045】本発明のポリペプチド、その断片もしくは
類似体、またはそれらを発現する細胞は、本発明のポリ
ペプチドに免疫特異的な抗体を生産するための免疫原と
しても使用することができる。「免疫特異的」とは、そ
の抗体が従来技術における他の関連ポリペプチドに対す
るその親和性よりも本発明のポリペプチドに対して実質
的に高い親和性を示すことを意味する。
【0046】本発明のポリペプチドに対する抗体は、慣
用のプロトコールを用いて、動物(好ましくはヒト以外
の動物)に該ポリペプチドまたはエピトープを含む断
片、類似体もしくは細胞を投与することにより得られ
る。モノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養
物から抗体を産生させる任意の技法を用いることができ
る。例を挙げると、ハイブリドーマ法 (Kohler, G.およ
びMilstein, C., Nature (1975) 256:495-497)、トリオ
ーマ法、ヒトB細胞ハイブリドーマ法 (Kozborら,Immun
ology Today (1983) 4:72) およびEBV−ハイブリド
ーマ法 (Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer T
herapy, pp.77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985) などが
ある。
【0047】本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体
をつくるために、米国特許第4,946,778号に記載される
ような一本鎖抗体の調製法を適応させることができる。
また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニ
ックマウスまたは他の哺乳動物を含む他の生物を利用す
ることができる。
【0048】前記の抗体を用いて、そのポリペプチドを
発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティー
クロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製すること
もできる。
【0049】本発明のポリペプチドに対する抗体は、と
りわけ、前記疾患の治療に使用できる可能性がある。
【0050】本発明の更なる態様において、本発明は、
本発明のポリペプチドまたはその断片と、各種サブクラ
ス(IgG、IgM、IgA、IgE)の免疫グロブリ
ンのH鎖またはL鎖の定常領域の様々な部分と、を含ん
でなる遺伝子工学的に作製された可溶性融合タンパク質
に関する。免疫グロブリンとしてはヒトIgG、特にI
gG1のH鎖の定常部が好ましく、その場合は融合がヒ
ンジ領域で起こる。特定例では、血液凝固因子Xaで開
裂され得る開裂配列を組み込むことで、Fc部分を簡単
に除去できる。さらに、本発明は、これら融合タンパク
質の遺伝子工学的作製方法、並びに薬物スクリーニン
グ、診断および治療におけるそれらの使用に関する。ま
た、本発明の更なる態様はこのような融合タンパク質を
コードするポリヌクレオチドに関する。融合タンパク質
技術の例は国際特許出願 WO94/29458 およびWO94/22914
に見いだせる。
【0051】本発明の更なる態様は哺乳動物において免
疫学的応答を引き出す方法に関し、この方法は、特に前
記疾患から該動物を防御するための抗体および/または
T細胞免疫応答を生ずるのに十分な本発明のポリペプチ
ドを哺乳動物に接種することを含んでなる。本発明のさ
らに別の態様は、哺乳動物を前記疾患から防御する抗体
を産生させるような免疫学的応答を引き出すために、in
vivo で本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドの発現を指令するベクターを介して該ポリペプチ
ドを供給することを含んでなる、哺乳動物において免疫
学的応答を引き出す方法に関する。
【0052】本発明の更なる態様は、哺乳動物宿主に導
入したとき、その哺乳動物において本発明のポリペプチ
ドに対する免疫学的応答を引き出す免疫学的/ワクチン
製剤(組成物)に関し、この組成物は本発明のポリペプ
チドまたはポリヌクレオチドを含有する。ワクチン製剤
は適当な担体をさらに含んでいてもよい。ポリペプチド
は胃の中で分解される可能性があるので、非経口的に
(例えば、皮下、筋肉内、静脈内または皮内注射によ
り)投与することが好ましい。非経口投与に適した製剤
としては、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤およびこの製剤
を受容者の血液と等張にする溶質を含みうる水性および
非水性の無菌注射液、並びに懸濁化剤または増粘剤を含
みうる水性および非水性の無菌懸濁液がある。こうした
製剤は1回量容器または数回量容器(例えば、密閉アン
プルおよびバイアル)で提供することができ、また、使
用直前に無菌の液状担体を添加するだけでよい凍結乾燥
状態で保管することもできる。ワクチン製剤はこの製剤
の免疫原性を増強するためのアジュバント系、例えば水
中油型のアジュバント系や当業界で公知の他のアジュバ
ント系を含んでいてもよい。投与量はワクチンの比活性
により変化するが、ルーチンな実験操作により簡単に決
定できる。
【0053】本発明のポリペプチドは、多くの病的状
態、特に前記疾患を含めて、さまざまな生物学的機能に
関与している。それゆえ、このポリペプチドの機能を刺
激または抑制する化合物を同定するスクリーニング法を
開発することが望ましい。したがって、更なる態様にお
いて、本発明は、このポリペプチドを刺激または抑制す
る化合物を同定するための化合物のスクリーニング法を
提供する。一般的には、前記疾患の治療および予防目的
のためにアゴニストまたはアンタゴニストが使用され
る。種々の供給源、例えば、細胞、無細胞調製物、化学
物質ライブラリーおよび天然産物の混合物から化合物を
同定することができる。このように同定されたアゴニス
ト、アンタゴニストまたはインヒビターは、場合によ
り、該ポリペプチドの天然のまたは修飾された基質、リ
ガンド、受容体、酵素などであってよく、また、その構
造的または機能的なミメティックであってもよい(Coli
ganら, Current Protocols in Immunology 1(2): Chapt
er 5 (1991)を参照のこと)。
【0054】スクリーニング法では、本発明のポリペプ
チド、または該ポリペプチドを担持する細胞もしくは
膜、またはその融合タンパク質への候補化合物の結合
を、候補化合物に直接または間接的に結合された標識を
用いて簡単に測定できる。あるいはまた、スクリーニン
グ法では標識した競合物質との競合を用いることもあ
る。さらに、こうしたスクリーニング法では、候補化合
物がポリペプチドの活性化または抑制により生ずるシグ
ナルを結果的にもたらすか否かを、該ポリペプチドを担
持する細胞に適した検出系を用いて試験することができ
る。一般的には、既知のアゴニストの存在下で活性化の
インヒビターをアッセイして、アゴニストによる活性化
に候補化合物の存在が与える影響を調べる。アゴニスト
またはインヒビターの不在下で、候補化合物がポリペプ
チドの活性化を抑制するか否かを調べることによる逆ア
ゴニストまたはインヒビターのスクリーニング法では、
構成的に活性のあるポリペプチドが用いられる。さら
に、これらのスクリーニング法は、候補化合物と本発明
のポリペプチドを含む溶液とを混ぜ合わせて混合物をつ
くり、この混合物中のヒトMindin活性を測定し、そして
この混合物のヒトMindin活性をスタンダードと比較する
各ステップを単に含むだけでよい。本発明のポリペプチ
ドのアンタゴニストを同定するハイスループットスクリ
ーニングアッセイでは、上記のようなFc部分とヒトMi
ndinポリペプチドから作製されるような融合タンパク質
も使用することができる(D. Bennettら, J. Mol. Recog
nition, 8:52-58 (1995) およびK. Johansonら, J. Bio
l. Chem., 270(16):9459-9471 (1995)を参照のこと)。
【0055】また、本発明のポリヌクレオチド、ポリペ
プチドまたは該ポリペプチドに対する抗体を用いて、細
胞内でのmRNAまたはポリペプチドの産生に及ぼす添
加化合物の作用を検出するためのスクリーニング法を組
み立てることができる。例えば、当業界で公知の標準方
法によりモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用
いて、ポリペプチドの分泌レベルまたは細胞結合レベル
を測定するためのELISAアッセイを構築することが
でき、これは適切に操作された細胞または組織からのポ
リペプチドの産生を抑制または増強する物質(それぞれ
アンタゴニストまたはアゴニストともいう)の探索に用
いることができる。
【0056】膜に結合した受容体または可溶性の受容体
が存在するのであれば、当業界で公知の標準的な受容体
結合法によりこの種の受容体を同定するために本発明の
ポリペプチドを用いることができる。こうした受容体結
合法には、限定するものではないが、リガンド結合アッ
セイおよび架橋アッセイがあり、これらのアッセイで
は、ポリペプチドを放射性アイソトープ(例:125I)で
標識するか、化学的に修飾(例:ビオチン化)するか、
または検出や精製に適したペプチド配列に融合させ、そ
して推定上の受容体源(細胞、細胞膜、細胞上清、組織
抽出物、体液など)とインキュベートする。その他の方
法としては、表面プラズモン共鳴および分光学のような
生物物理的方法がある。これらのスクリーニング法は、
該ポリペプチドまたは(存在するのであれば)その受容
体への結合と競合する該ポリペプチドのアゴニストまた
はアンタゴニストを同定するために用いることもでき
る。スクリーニングアッセイを行うための標準的な方法
は当業界でよく理解されている。
【0057】本発明のポリペプチドの潜在的なアンタゴ
ニストの例としては、抗体、ある場合には、該ポリペプ
チドのリガンド、基質、受容体、酵素などと密接な関係
があるオリゴヌクレオチドもしくはタンパク質(例え
ば、リガンド、基質、受容体、酵素などの断片)、また
は本発明のポリペプチドと結合するが応答を誘導しない
(それゆえ該ポリペプチドの活性を妨げる)小分子など
がある。
【0058】かくして、他の態様において、本発明は、
本発明のポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニスト、
リガンド、受容体、基質、酵素など、またはこの種のポ
リペプチドの産生を低下または増加させる化合物を同定
するためのスクリーニングキットに関し、このキット
は、(a) 本発明のポリペプチド、(b) 本発明のポリペプ
チドを発現している組換え細胞、(c) 本発明のポリペプ
チドを発現している細胞膜、または(d) 本発明のポリペ
プチドに対する抗体、を含んでなり、前記ポリペプチド
は好ましくは配列番号2のポリペプチドである。 この
ようなキットにおいて、(a) 、(b) 、(c) または (d)が
実質的な構成成分であることが理解されよう。
【0059】当業者であれば、本発明のポリペプチド
は、その構造に基づいて該ポリペプチドのアゴニスト、
アンタゴニストまたはインヒビターを設計する方法にも
使用できることが容易に理解されよう。この方法は、
(a) 最初に該ポリペプチドの三次元構造を解析し、(b)
アゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターの確実
と思われる反応部位または結合部位の三次元構造を想定
し、(c) 想定された反応部位または結合部位と結合また
は反応すると予想される候補化合物を合成し、そして
(d) その候補化合物が実際にアゴニスト、アンタゴニス
トまたはインヒビターであるか否かを調べる、ことを含
んでなる。これは通常相互作用プロセスであることがさ
らに理解されよう。
【0060】更なる態様において、本発明は、ヒトMind
inポリペプチド活性の過剰量と不足量のいずれかに関係
した、例えば脈管形成性疾患(癌、癌転移、慢性炎症性
障害、慢性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化、黄斑
変性、糖尿病性網膜症)、再狭窄、アルツハイマー病、
神経障害および組織リモデリングなどの異常な状態の治
療法を提供する。
【0061】該ポリペプチドの活性が過剰である場合
は、いくつかのアプローチが利用可能である。一つのア
プローチは、例えば、リガンド、基質、受容体、酵素な
どの結合をブロックすることにより、または第2のシグ
ナルを抑制することで異常な状態を軽減することによ
り、該ポリペプチドの機能を抑制するのに有効な量で、
上記のインヒビター化合物(アンタゴニスト)を製剤学
上許容される担体とともに患者に投与することを含んで
なる。もう一つのアプローチでは、内因性のポリペプチ
ドとの競合状態でリガンド、基質、酵素、受容体などと
結合する能力がまだある可溶性形態のポリペプチドを投
与することができる。このような競合物質の典型的な例
はヒトMindinポリペプチドの断片である。
【0062】さらに別のアプローチでは、発現阻止法を
使って内因性ヒトMindinポリペプチドをコードする遺伝
子の発現を抑制することができる。こうした公知技術
は、体内で産生されるか別個に投与されるアンチセンス
配列の使用を必要とする(例えば、Oligodeoxynucleoti
des as Antisense Inhibitors of Gene Expression (遺
伝子発現のアンチセンスインヒビターとしてのオリゴデ
オキシヌクレオチド), CRC Press, Boca Raton, FL (19
88) 中のO'Connor, J. Neurochem (1991) 56:560を参照
のこと)。あるいはまた、この遺伝子と共に三重らせん
を形成するオリゴヌクレオチドを供給することもできる
(例えば、Leeら, Nucleic Acids Res (1979) 6:3073;
Cooneyら, Science (1988) 241:456; Dervanら, Scienc
e (1991) 251:1360 を参照のこと)。これらのオリゴマ
ーはそれ自体を投与することもできるし、関連オリゴマ
ーをin vivo で発現させることもできる。
【0063】ヒトMindinおよびその活性の過少発現に関
係した異常な状態を治療する場合も、いくつかのアプロ
ーチを取ることができる。一つのアプローチは、治療に
有効な量の本発明ポリペプチドを活性化する化合物(す
なわち、前記アゴニスト)を製剤学上許容される担体と
ともに患者に投与して、異常な状態を緩和することを含
んでなる。別法として、患者の関連細胞においてヒトMi
ndinを内因的に産生させるために遺伝子治療を用いるこ
とができる。例えば、上で述べたような複製欠損レトロ
ウイルスベクターによる発現のために本発明のポリヌク
レオチドを遺伝子操作する。次にレトロウイルス発現構
築物を単離し、本発明のポリペプチドをコードするRN
Aを含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質
導入されたパッケージング細胞に導入する。その結果、
パッケージング細胞は対象の遺伝子を含有する感染性の
ウイルス粒子を産生するようになる。in vivo 細胞操作
およびin vivo ポリペプチド発現のために、これらのプ
ロデューサー細胞を患者に投与する。遺伝子治療の概論
に関しては、Human Molecular Genetics, T Strachan a
nd A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd (1996)
中のChapter 20, Gene Therapy and other Molecular G
enetic-based Therapeutic Approaches(およびその中の
引用文献) を参照のこと。もう一つのアプローチは治療
量の本発明のポリペプチドを適当な製剤学上の担体とと
もに投与することである。
【0064】更なる態様において、本発明は、治療に有
効な量のポリペプチド(例えば、可溶性形態の本発明ポ
リペプチド)、アゴニストもしくはアンタゴニストペプ
チド、または小分子化合物を製剤学上許容される担体ま
たは賦形剤と共に含有する医薬組成物を提供する。この
種の担体としては、食塩水、生理食塩水、デキストロー
ス、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組
合せがあるが、これらに限らない。本発明はさらに、上
記の本発明組成物の1以上の成分を充填した1以上の容
器を含んでなる医薬パックおよびキットに関する。本発
明のポリペプチドおよび他の化合物は単独で使用して
も、他の化合物、例えば治療用化合物と一緒に使用して
もよい。
【0065】医薬組成物は投与経路、例えば全身または
経口による投与経路に適合させることができる。全身投
与に適した形態は、注入(注射)、典型的には静注であ
る。皮下、筋肉内または腹腔内のような他の注入経路も
使用できる。全身投与の別の手段には、胆汁酸塩、フシ
ジン酸、その他の界面活性剤などの浸透剤を用いた経粘
膜および経皮投与がある。さらに、本発明のポリペプチ
ドまたは他の化合物を腸溶剤またはカプセル剤として製
剤化し得るのであれば、経口投与も可能である。これら
の化合物を軟膏、ペースト、ゲルなどの剤形で局所に投
与しても、かつ/または局在化させてもよい。
【0066】必要な投与量範囲は、本発明のペプチドま
たは他の化合物の選択、投与経路、製剤の性質、患者の
状態、そして医師の判断に左右される。しかし、適当な
投与量は患者の体重1kgあたり0.1〜100μgの範囲であ
る。入手可能な化合物が多様であること、投与経路の効
率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広
範に変動することが予測される。例えば、経口投与は静
注による投与よりも高い投与量を必要とすると予想され
よう。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理
解されているような、標準的経験的な最適化手順を用い
て調整することができる。
【0067】治療に用いるポリペプチドは、上述したよ
うな「遺伝子治療」と称する治療法において、患者の体
内で産生させることもできる。例えば、患者由来の細胞
を、ポリペプチドをコードするDNAまたはRNAのよ
うなポリヌクレオチドにより、例えばレトロウイルスプ
ラスミドベクターを用いて、ex vivo で遺伝子工学的に
操作する。その後、これらの細胞を患者に導入する。
【0068】ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配
列は、類似の相同性を有する別の配列を同定する際の価
値ある情報源を提供する。これは、こうした配列をコン
ピュータ読み取り可能媒体中に保存し、次に保存したデ
ータを用いてGCGのような公知の検索ツールにより配
列データベースを検索することで最大限促進される。し
たがって、更なる態様において、本発明は、配列番号1
の配列を含んでなるポリヌクレオチドおよび/またはそ
れによりコードされるポリペプチドを保存したコンピュ
ータ読み取り可能媒体を提供する。
【0069】以下の定義は上記の説明中でしばしば用い
られた用語を理解しやすくするためのものである。
【0070】本明細書中で用いる「抗体」には、ポリク
ローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ抗体、一本
鎖抗体、ヒト化抗体、さらにFabまたは他の免疫グロ
ブリン発現ライブラリーの産物を含むFabフラグメン
トが含まれる。
【0071】「単離された」とは、天然の状態から「人
間の手によって」改変されたことを意味する。「単離さ
れた」組成物または物質が天然に存在するのであれば、
それはそのもとの環境から変化しているか分離されてお
り、またはその両方である。例えば、生存している動物
の体内に自然界で存在するポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドは「単離された」ものではないが、その天然状
態の共存物質から分離されたポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドは、本明細書中で用いられるように、「単離
された」ものである。
【0072】「ポリヌクレオチド」とは、一般に任意の
ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオ
チドをさし、これは修飾されていないRNAもしくはD
NA、または修飾されたRNAもしくはDNAであり得
る。「ポリヌクレオチド」には、制限するものではない
が、一本鎖および二本鎖DNA、一本鎖領域と二本鎖領
域が混じり合ったDNA、一本鎖および二本鎖RNA、
一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合ったRNA、DNA
とRNAを含むハイブリッド分子(一本鎖でも、または
より典型的には二本鎖でもよく、一本鎖領域と二本鎖領
域が混じり合ったものでもよい)が含まれる。加えて、
「ポリヌクレオチド」はRNAまたはDNAまたはRN
AとDNAの両方からなる三重鎖領域を意味する。「ポ
リヌクレオチド」という用語はまた、1個以上の修飾塩
基を含有するDNAまたはRNA、および安定性または
他の理由のために修飾された骨格を有するDNAまたは
RNAも含む。「修飾」塩基としては、例えば、トリチ
ル化された塩基およびイノシンのような特殊な塩基があ
る。DNAおよびRNAに対してさまざまな修飾を行う
ことができる。こうして、「ポリヌクレオチド」は、自
然界に一般的に存在するポリヌクレオチドの化学的、酵
素的または代謝的に修飾された形態、並びにウイルスお
よび細胞に特徴的なDNAおよびRNAの化学的形態を
包含する。また、「ポリヌクレオチド」は、しばしばオ
リゴヌクレオチドと称される比較的短いポリヌクレオチ
ドも包含する。
【0073】「ポリペプチド」とは、ペプチド結合また
は修飾されたペプチド結合(すなわち、ペプチドアイソ
スター)により連結された2個以上のアミノ酸を含むペ
プチドまたはタンパク質を意味する。「ポリペプチド」
は短鎖(通常はペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴ
マーという)と長鎖(一般的にはタンパク質という)の
両方をさす。ポリペプチドは20種類の遺伝子コード化
アミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。「ポリペプチ
ド」は、翻訳後プロセシングのような天然のプロセス
で、または当業界で公知の化学的修飾法のいずれかで修
飾されたアミノ酸配列を含む。このような修飾は基本的
な教科書、より詳細な学術論文および研究文献に詳述さ
れている。修飾はペプチド骨格、アミノ酸側鎖、アミノ
またはカルボキシル末端を含めてポリペプチドのどこで
も行うことができる。同じタイプの修飾が所定のポリペ
プチドのいくつかの部位に同程度でまたはさまざまに異
なる程度で存在してもよい。また、所定のポリペプチド
が多くのタイプの修飾を含んでいてもよい。ポリペプチ
ドはユビキチン化のために分枝していても、分枝のある
又はない環状であってもよい。環状の、分枝した、また
は分枝した環状のポリペプチドは翻訳後の天然プロセス
から生じることがあり、また、合成法によって製造する
こともできる。修飾としては、アセチル化、アシル化、
ADP−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、
ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド
誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、
ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、
ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合架橋の
形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホル
ミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、GPIア
ンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミ
リストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リ
ン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸
化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸の転
移RNA媒介付加、ユビキチン化などがある(例えば、
Proteins - Structure and Molecular Properties 2nd
Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, Ne
w York, 1993; Posttranslational Covalent Modificat
ion of Proteins, B.C. Johnson編, Academic Press, N
ew York,1983中のWold, F., Post-translational Prote
in Modifications: Perspectives and Prospects, pgs.
1-12; Seifterら, “Analysis for protein modificat
ions and nonprotein cofactors", Meth Enzymol (199
0) 182:626-646; および Rattanら, “Protein Synthes
is: Post-translational Modifications and Aging", A
nn NY Acad Sci (1992) 663:48-62 を参照のこと)。
【0074】本明細書中で用いる「変異体」とは、基準
のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なるが、不
可欠な性質を保持しているポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドのことである。典型的なポリヌクレオチドの変
異体は基準ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列の点で
相違する。この変異体のヌクレオチド配列の変化は、基
準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
のアミノ酸配列を変更しても、しなくてもよい。ヌクレ
オチドの変化は、以下で述べるように、基準配列により
コードされるポリペプチドのアミノ酸の置換、欠失、付
加、融合および末端切断(トランケーション)をもたら
しうる。典型的なポリペプチドの変異体は基準ポリペプ
チドとアミノ酸配列の点で相違する。一般的には、基準
ポリペプチドの配列と変異体の配列が全般的によく類似
しており、多くの領域で同一となるような相違に限られ
る。変異体と基準ポリペプチドは任意に組み合わせた1
以上の置換、欠失、付加によりアミノ酸配列が相違して
いてよい。置換または付加されるアミノ酸残基は遺伝子
コードによりコードされるものであっても、なくてもよ
い。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体はア
レル変異体のように天然に存在するものでも、天然に存
在することが知られていない変異体であってもよい。ポ
リヌクレオチドおよびポリペプチドの天然に存在しない
変異体は、突然変異誘発法または直接合成により作製す
ることができる。
【0075】当技術分野で知られた「同一性」とは、ポ
リペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の比較によ
り決定された、2以上のかかる配列間の関連性のことで
ある。当技術分野ではまた、「同一性」はポリペプチド
配列またはポリヌクレオチド配列の鎖間のマッチ(matc
h)により決定された、このような配列間の配列関連性の
程度を意味する。「同一性」は公知の方法により難なく
算出することができ、こうした方法として、例えば Com
putational Molecular Biology, Lesk, A.M.編, Oxford
University Press, New York, 1988; Biocomputing: I
nformatics andGenome Projects, Smith, D.W. 編, Aca
demic Press, New York, 1993; Computer Analysis of
Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. and Griffin,
H.G. 編, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence
Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Aca
demic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribs
kov, M. and Devereux, J. 編, M Stockton Press, New
York, 1991; および Carillo, H. and Lipman, D., SI
AM J. Applied Math., 48: 1073 (1988) に記載された
方法があるが、これらに限らない。同一性を決定するた
めの方法は、検討する配列間で最大級のマッチが得られ
るように設計される。さらに、同一性を決定する方法は
一般に入手可能なコンピュータプログラムに編集されて
いる。2配列間の同一性を決定するコンピュータプログ
ラム法としては、GCGプログラムパッケージ (Devere
ux, J.ら, Nucleic Acids Research 12(1):387 (198
4))、BLASTP、BLASTNおよびFASTA (A
tschul, S.F.ら, J. Molec. Biol.215:403-410 (1990))
があるが、これらに限らない。BLAST Xプログラ
ムはNCBIおよび他のソースから一般に入手可能であ
る (BLAST Manual, Altschul, S.ら, NCBI NLM NIH Bet
hesda, MD 20894; Altschul, S.ら, J. Mol. Biol.215:
403-410 (1990))。公知のSmith Watermanアルゴリズム
も同一性の決定に使用することができる。
【0076】ポリペプチド配列を比較するためのパラメ
ーターは次のものを含む: 1)アルゴリズム:Needleman & Wunsch, J. Mol. Bio
l. 48: 443-453 (1970) 比較マトリックス:BLOSSUM62 、Hentikoff and Hentik
off, Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 89: 10915-10919 (1
992) ギャップペナルティー:12 ギャップ長ペナルティー:4 これらのパラメーターと共に役に立つプログラムは Gen
etics Computer Group(Madison WI)から「gap」プ
ログラムとして一般に入手可能である。前記のパラメー
ターはペプチド比較のためのデフォルトパラメーター(d
efault parameter) である(末端ギャップのペナルティ
ーは無し)。
【0077】ポリヌクレオチド配列を比較するためのパ
ラメーターは次のものを含む: 1)アルゴリズム:Needleman & Wunsch, J. Mol. Bio
l. 48: 443-453 (1970); 比較マトリックス:マッチ=+10、ミスマッチ=0 ギャップペナルティー:50 ギャップ長ペナルティー:3 これらのパラメーターと共に役に立つプログラムは Gen
etics Computer Group(Madison WI)から「gap」プロ
グラムとして入手可能である。これらは核酸比較のため
のデフォルトパラメーターである。
【0078】ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの
「同一性」についての好適な意味は、場合により下記
(1)および(2)において提供される。 (1) ポリヌクレオチドの具体例は、配列番号1の基
準配列に対して少なくとも50、60、70、80、85、90、9
5、97または100%の同一性を有するポリヌクレオチド配
列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドをさらに含
む。前記ポリヌクレオチド配列は配列番号1の基準配列
と同一であっても、該基準配列に対して、ある整数個ま
でのヌクレオチド変異を含んでいてもよい。前記変異は
少なくとも1個のヌクレオチドの欠失、置換(トランジ
ションおよびトランスバージョンを含む)または挿入よ
りなる群から選択され、こうした変異は基準ヌクレオチ
ド配列の 5'もしくは 3'末端位置、またはこれらの末端
位置の間のどこに存在してもよく、基準配列中のヌクレ
オチドの間に個々に、または基準配列内に1以上の連続
するグループとして介在することができる。ヌクレオチ
ド変異の数は、配列番号1のヌクレオチドの総数に、そ
れぞれの(100で割った)同一性%値を掛け、その積を
配列番号1のヌクレオチドの総数から差し引くことによ
り、すなわち、次式: nn ≦xn −(xn・y) により求めることができる。式中、nnはヌクレオチド
変異の数であり、xnは配列番号1のヌクレオチドの総
数であり、yは50%については0.50、60%については0.
60、70%については0.70、80%については0.80、85%に
ついては0.85、90%については0.90、95%については0.
95、97%については0.97または100%については1.00で
あり、・は乗法演算子を表す記号であり、xnとyの非
整数の積は、その積をxnから引く前に、最も近似する
整数に切り下げる。配列番号2のポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド配列の改変は、そのコード配列に
ナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異
を生じさせ、それにより、こうした変異後に該ポリヌク
レオチドによりコードされたポリペプチドを改変させる
ことができる。
【0079】例として、本発明のポリヌクレオチド配列
は、配列番号2の基準配列と同一である、すなわち基準
配列に対して100%の同一性を有するか、または同一性
%が100%未満となるように基準配列に対してある整数
個までのアミノ酸変異を含むことができる。前記変異は
少なくとも1個の核酸の欠失、置換(トランジションお
よびトランスバージョンを含む)または挿入よりなる群
から選択され、こうした変異は基準ポリヌクレオチド配
列の 5'もしくは 3'末端位置、またはこれらの末端位置
の間のどこに存在してもよく、基準配列中の核酸の間に
個々に、または基準配列内に1以上の連続するグループ
として介在することができる。核酸変異の数は、配列番
号2のアミノ酸の総数に、それぞれの(100で割った)
同一性%値を掛け、その積を配列番号2のアミノ酸の総
数から差し引くことにより、すなわち、次式: nn ≦xn −(xn・y) により求めることができる。式中、nnはアミノ酸変異
の数であり、xnは配列番号2中のアミノ酸の総数であ
り、yは例えば70%については0.70、80%については0.
80、85%については0.85などであり、・は乗法演算子を
表す記号であり、x nとyの非整数の積は、その積をxn
から引く前に、最も近似する整数に切り下げる。 (2) ポリペプチドの具体例は、配列番号2の基準配
列に対して少なくとも50、60、70、80、85、90、95、97
または100%の同一性を有するポリペプチドを含んでな
る単離されたポリペプチドをさらに含む。前記ポリペプ
チド配列は配列番号2の基準配列と同一であっても、該
基準配列に対して、ある整数個までのアミノ酸変異を含
んでいてもよい。このような変異は少なくとも1個のア
ミノ酸の欠失、置換(保存的および非保存的アミノ酸置
換を含む)または挿入よりなる群から選択され、これら
の変異は基準ポリペプチド配列のアミノもしくはカルボ
キシ末端位置、またはこれらの末端位置の間のどこに存
在してもよく、基準配列中のアミノ酸の間に個々に、ま
たは基準配列内に1以上の連続したグループとして点在
することができる。アミノ酸変異の数は、配列番号2中
のアミノ酸の総数にそれぞれの(100で割った)同一性
%の数値を掛け、その積を配列番号2中のアミノ酸の総
数から引くことにより、すなわち次式により求められ
る。
【0080】na ≦xa −(xa・y) 式中、naはアミノ酸変異の数であり、xaは配列番号2
中のアミノ酸の総数であり、yは50%については0.50、
60%については0.60、70%については0.70、80%につい
ては0.80、85%については0.85、90%については0.90、
95%については0.95、97%については0.97または100%
については1.00であり、・は乗法演算子を表す記号であ
り、xaとyの非整数の積は、その積をxaから引く前
に、最も近似する整数に切り下げる。
【0081】例として、本発明のポリペプチド配列は、
配列番号2の基準配列と同一である、すなわち基準配列
に対して100%の同一性を有するか、または同一性%が1
00%未満となるように基準配列に対してある整数個まで
のアミノ酸変異を含むことができる。このような変異は
少なくとも1個のアミノ酸の欠失、置換(保存的および
非保存的アミノ酸置換を含む)または挿入よりなる群か
ら選択され、これらの変異は基準ポリペプチド配列のア
ミノもしくはカルボキシ末端位置、またはこれらの末端
位置の間のどこに存在してもよく、基準配列中のアミノ
酸の間に個々に、または基準配列内に1以上の連続した
グループとして点在することができる。アミノ酸変異の
数は、配列番号2中のアミノ酸の総数にそれぞれの(10
0で割った)同一性%の数値を掛け、その積を配列番号
2中のアミノ酸の総数から引くことにより、すなわち次
式により求められる。
【0082】na ≦xa −(xa・y) 式中、naはアミノ酸変異の数であり、xaは配列番号2
中のアミノ酸の総数であり、yは例えば70%については
0.70、80%については0.80、85%については0.85等であ
り、・は乗法演算子を表す記号であり、xaとyの非整
数の積は、その積をxaから引く前に、最も近似する整
数に切り下げる。
【0083】「融合タンパク質」とは、2つの、しばし
ば無関係の、融合された遺伝子またはその断片によりコ
ードされるタンパク質のことである。一例として、EP-A
-0 464には、免疫グロブリン分子の定常領域の様々な部
分と他のヒトタンパク質またはその一部とを含んでなる
融合タンパク質が記載されている。多くの場合、治療お
よび診断における使用には、融合タンパク質の一部とし
て免疫グロブリンFc領域を使用することが有利であ
り、これにより例えば薬物速度論的性質が向上する(例
えば、EP-A- 0232 262を参照のこと)。一方、いくつか
の使用にとっては、その融合タンパク質を発現させ、検
出し、精製した後でFc部分を除去することが望ましい
だろう。
【0084】本明細書中に引用された、特許および特許
出願明細書を含めた全ての刊行物は、あたかも各刊行物
が明確にかつ個々に示されているかのように、その全体
を参考としてここに組み入れるものとする。 配列情報 配列番号1
【0085】配列番号2
【0086】配列番号3および4
【0087】
【0088】配列表 配列番号:1 配列の長さ:996塩基対 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA 配列
【0089】配列番号:2 配列の長さ:331アミノ酸 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:タンパク質 配列
【0090】配列番号:3 配列の長さ:1020塩基対 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA 配列
【0091】配列番号:4 配列の長さ:290アミノ酸 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:タンパク質 配列
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61P 9/00 A61P 19/02 9/10 25/28 19/02 27/02 25/28 29/00 27/02 35/00 29/00 35/04 35/00 43/00 105 35/04 111 43/00 105 C07K 14/47 111 16/18 C07K 14/47 C12N 1/15 16/18 1/19 C12N 1/15 1/21 1/19 C12P 21/02 C 1/21 C12Q 1/68 A 5/10 G01N 33/15 Z C12P 21/02 33/50 Z C12Q 1/68 C12N 15/00 ZNAA G01N 33/15 5/00 A 33/50 A61K 37/02 (72)発明者 トルーリ,ステファン,エイチ. アメリカ合衆国 19083 ペンシルベニア 州, ハーヴァータウン,ベルヴェデーレ アベニュー 2015 (72)発明者 ツイ,ピン アメリカ合衆国 19312 ペンシルベニア 州, バーウィン,バーウィン パオリ ロード 1237 (72)発明者 レーン,パメラ,エイ. アメリカ合衆国 19401 ペンシルベニア 州, ノリスタウン,コルトン ドライブ 31

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 以下の(i)〜(iii)からなる群から選択さ
    れる単離されたポリペプチド: (i) 配列番号2の全長にわたる配列番号2のアミノ酸配
    列に対して少なくとも (a) 70%の同一性、 (b) 80%の同一性、 (c) 90%の同一性、もしくは (d) 95%の同一性、 を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプ
    チド、 (ii) 配列番号2のアミノ酸配列を含んでなる単離され
    たポリペプチド、または (iii) 配列番号2のアミノ酸配列からなる単離されたポ
    リペプチド。
  2. 【請求項2】 以下の(i)〜(vi)からなる群から選択さ
    れる単離されたポリヌクレオチド、またはその単離され
    たポリヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列: (i) 配列番号2の全長にわたる配列番号2のアミノ酸配
    列に対して少なくとも (a) 70%の同一性、 (b) 80%の同一性、 (c) 90%の同一性、もしくは (d) 95%の同一性、 を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
    含んでなる単離されたポリヌクレオチド、 (ii) 配列番号2のポリペプチドをコードするヌクレオ
    チド配列に対して、その全長にわたって、少なくとも (a) 70%の同一性、 (b) 80%の同一性、 (c) 90%の同一性、もしくは (d) 95%の同一性、 を有するヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリ
    ヌクレオチド、 (iii) 配列番号1の全長にわたる配列番号1のヌクレオ
    チド配列に対して少なくとも (a) 70%の同一性、 (b) 80%の同一性、 (c) 90%の同一性、もしくは (d) 95%の同一性、 を有するヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリ
    ヌクレオチド、 (iv) 配列番号2のポリペプチドをコードするヌクレオ
    チド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド、 (vi) 配列番号1のポリヌクレオチド配列からなる単離
    されたポリヌクレオチド、 および (vi) 適当なライブラリーを、ストリンジェントなハイ
    ブリダイゼーション条件下で、配列番号1の配列または
    その断片を有する標識プローブでスクリーニングするこ
    とにより得られる単離されたポリヌクレオチド。
  3. 【請求項3】 請求項1に記載のポリペプチドに対して
    免疫特異的な抗体。
  4. 【請求項4】 被験者を治療する方法であって、 (i) 該被験者が請求項1に記載のポリペプチドの活性ま
    たは発現の増加を必要とする場合には、 (a) 前記ポリペプチドに対する治療上有効な量のアゴニ
    ストを該被験者に投与すること、および/または(b) 前
    記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで
    なる単離されたポリヌクレオチドを、in vivo で該ポリ
    ペプチド活性を産生させるような形態で被験者に投与す
    ること、を含んでなり、 (ii)該被験者が請求項1に記載のポリペプチドの活性ま
    たは発現の抑制を必要とする場合には、 (a) 前記ポリペプチドに対する治療上有効な量のアンタ
    ゴニストを被験者に投与すること、および/または(b)
    前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現
    を抑制する核酸分子を被験者に投与すること、および/
    または(c) 前記ポリペプチドと、そのリガンド、基質、
    もしくは受容体について競合する治療上有効な量のポリ
    ペプチドを被験者に投与すること、を含んでなる、上記
    被験者を治療する方法。
  5. 【請求項5】 被験者における請求項1に記載のポリペ
    プチドの発現または活性に関連した 該被験者の疾病ま
    たは該疾病への罹りやすさを診断する方法であって、 (a) 該被験者のゲノム内の該ポリペプチドをコードする
    ヌクレオチド配列中に突然変異が存在するか否かを調べ
    ること、および/または(b) 該被験者から得られたサン
    プル中の該ポリペプチド発現の存在または量を分析する
    こと、を含んでなる方法。
  6. 【請求項6】 請求項1に記載のポリペプチドの機能を
    刺激または抑制する化合物を同定するためのスクリーニ
    ング法であって、 (a) 候補化合物と、該ポリペプチド(または該ポリペプ
    チドを担持している細胞もしくはその膜)またはその融
    合タンパク質と、の結合を、該候補化合物に直接または
    間接的に結合させた標識により測定すること、 (b) 候補化合物と、該ポリペプチド(または該ポリペプ
    チドを担持している細胞もしくはその膜)またはその融
    合タンパク質と、の結合を、標識競合物質の存在下で測
    定すること、 (c) 候補化合物が該ポリペプチドの活性化または抑制に
    より生ずるシグナルをもたらすか否かを、該ポリペプチ
    ドを担持している細胞または細胞膜に適した検出系を用
    いて調べること、 (d) 候補化合物と、該ポリペプチドを含有する溶液と、
    を一緒にして混合物を調製し、該混合物中の該ポリペプ
    チドの活性を測定して、該混合物の活性をスタンダード
    と比較すること、および (e) 候補化合物が細胞における該ポリペプチドをコード
    するmRNAおよび該ポリペプチドの産生に及ぼす効果
    を例えばELISAアッセイを用いて検出すること、よりな
    る群から選択される方法を含んでなるスクリーニング
    法。
  7. 【請求項7】 請求項1に記載のポリペプチドのアンタ
    ゴニスト。
  8. 【請求項8】 下記発現系が適合性の宿主細胞内に存在
    するとき請求項1に記載のポリペプチドを産生し得るポ
    リヌクレオチドを含有する発現系。
  9. 【請求項9】 宿主細胞が適当な培養条件下で配列番号
    2の全長にわたる配列番号2のアミノ酸配列に対して少
    なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで
    なるポリペプチドを産生するように、請求項8に記載の
    発現系を用いて細胞を形質転換またはトランスフェクシ
    ョンすることを含んでなる、組換え宿主細胞の作製方
    法。
  10. 【請求項10】 請求項9に記載の方法により得られる
    組換え宿主細胞。
  11. 【請求項11】 配列番号2の全長にわたる配列番号2
    のアミノ酸配列に対して少なくとも70%の同一性を有
    するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを発現して
    いる請求項10に記載の組換え宿主細胞の膜。
  12. 【請求項12】 請求項10に記載の宿主細胞を前記ポ
    リペプチドを産生させるのに十分な条件下で培養し、そ
    の培養培地から該ポリペプチドを回収することを含んで
    なる、前記ポリペプチドの生産方法。
  13. 【請求項13】 以下の(a)〜(d)からなる群から選択さ
    れる単離されたポリヌクレオチド: (a) 配列番号3の全長にわたる配列番号3のヌクレオチ
    ド配列に対して少なくとも70%、80%、90%、9
    5%、97%の同一性を有するヌクレオチド配列を含ん
    でなる単離されたポリヌクレオチド、 (b) 配列番号3のポリヌクレオチドを含んでなる単離さ
    れたポリヌクレオチド、 (c) 配列番号3のポリヌクレオチド、または (d) 配列番号4の全長にわたる配列番号4のアミノ酸配
    列に対して少なくとも70%、80%、90%、95
    %、97〜99%の同一性を有するポリペプチドをコー
    ドするヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌ
    クレオチド。
  14. 【請求項14】 以下の(a)〜(e)からなる群から選択さ
    れるポリペプチド: (a) 配列番号4の全長にわたる配列番号4のアミノ酸配
    列に対して少なくとも70%、80%、90%、95
    %、97〜99%の同一性を有するアミノ酸配列を含ん
    でなるポリペプチド、 (b) 配列番号4の全長にわたる配列番号4のアミノ酸配
    列に対して少なくとも70%、80%、90%、95
    %、97〜99%の同一性を有するアミノ酸配列を有す
    るポリペプチド、 (c) 配列番号4のアミノ酸を含んでなるポリペプチド、 (d)配列番号4のポリペプチドからなるポリペプチ
    ド、 (e) 配列番号3に含まれる配列を含んでなるポリヌクレ
    オチドによりコードされるポリペプチド。
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